ES2376978T3 - Método para predecir la respuesta de pacientes de NSCLC al tratamiento por parte de un inhibidor de EGFR-TK - Google Patents

Abstract

Un método para determinar si un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es un respondedor a tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermal-tirosina quinasa (EGFR-TK) que comprende: a. obtener un perfil de expresión de proteínas de una muestra de tejido de cáncer de pulmón o células procedentes del paciente al que se le ha diagnosticado NSCLC; y b. determinar el nivel de expresión en el tejido o las células de las siguientes proteínas: p70S6K (SEQ ID NO.17), fosfo-S6 (SEQ ID NO.18), fosfo-AKT (SEQ ID NO. 19), fosfo-mTOR (SEQ ID NO.20), fosfo-pTEN (SEQ ID NO. 21), EGFR (SEQ ID NO. 25), fosfo-ER (SEQ ID NO. 27), fosfo-AR (SEQ ID NO. 28), AIK (SEQ ID NO.29), osteopontina (SEQ ID NO. 30), MMP11 (SEQ ID NO. 31), GFAP (SEQ ID NO. 32), fosfo-p70S6K (SEQ ID NO. 17), fosfo MEK (SEQ ID NO. 22), fosfo MAPK (SEQ ID NO. 23), fosfo-IGFR/InR (SEQ ID NO. 24), fosfo-EGFR (SEQ ID NO. 25) y fosfo-HER2 (ErbB2) (SEQ ID NO. 26); c. en donde la sobre-expresión en el tejido de cáncer de pulmón o en las células en comparación con la expresión en tejido de pulmón normal o células de p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP; y la sub-expresión en el tejido o células de cáncer de pulmón en comparación con la expresión en tejido o células de pulmón normales de fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2 (ErbB2) indica que el paciente responde al tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK.

Description

Método para predecir la respuesta de pacientes de NSCLC al tratamiento por parte de un inhibidor de EGFR-TK

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica la prioridad bajo el artículo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de EE.UU. nº de serie 60/903.684, presentada el 27 de febrero de 2007.

Antecedentes de la invención

Pacientes a quienes se ha diagnosticado cáncer se enfrentan con opciones de tratamiento costosas y, a menudo, dolorosas. Estos tratamientos pueden no ser eficaces en una sub-población de pacientes y, como resultado de ello, estos pacientes sobrellevan estos tratamientos sin beneficio pequeño alguno o sin ningún beneficio terapéutico. Algunos pacientes pueden reaccionar adversamente a determinados agentes, provocando un sufrimiento adicional y, posiblemente, la muerte.

El tratamiento ineficaz es también problemático, dado que el tiempo es una variable clave cuando se trata el cáncer. Un proveedor de tratamiento tiene una posibilidad mucho mayor de contener y controlar la enfermedad si el cáncer es diagnosticado en una fase temprana y es tratado con un agente terapéuticamente eficaz. Un agente puede proporcionar grandes beneficios terapéuticos si se administra en una fase temprana de la enfermedad; sin embargo, con el paso del tiempo, este mismo agente puede dejar de ser eficaz.

El cáncer de pulmón es un ejemplo de un estado en el que el diagnóstico temprano es clave para un tratamiento eficaz. La mayoría de los cánceres de pulmón caen dentro de una de dos categorías: cáncer de pulmón de células pequeñas y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC – siglas en inglés). NSCLC es el tipo de cáncer de pulmón más común. Existen tres subgrupos principales de NSCLC: adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma indiferenciado de células grandes.

La quimioterapia se utiliza a menudo para tratar NSCLC. Erlotinib (TARCEVA®) es un agente quimioterapéutico indicado para la terapia de segunda línea de NSCLC después de fracasar al menos un régimen de quimioterapia previo, y gefitinib (IRESSA®) está indicado para el tratamiento continuo de NSCLC después de fracasar quimioterapias basadas en platino y docetaxel. Al igual que con muchos agentes quimioterapéuticos, la administración de estos fármacos provoca, a menudo, efectos secundarios perjudiciales para el paciente, y algunos pacientes no responden bien o no responden en absoluto al tratamiento. Así, algunos pacientes son sometidos a tratamiento con erlotinib o gefitinib y padecen los efectos secundarios dolorosos únicamente para reconocer posteriormente que el agente no ha sido terapéuticamente beneficioso para su afección. Además de un sufrimiento innecesario, se pierde tiempo crítico para determinar un tratamiento alternativo.

Han et al., Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Downstream Molecules as Response Predictive Markers for Gefitinib (Iressa®, ZD1839) in Chemotherapy Resistant Non-Small Cell Lung Cancer, Int. J. Cancer 113:109-115 (2005) describe un método para determinar si un paciente al que se le ha diagnosticado NSCLC es un paciente respondedor al tratamiento con el inhibidor de EGFR-TK gefitinib, basado en un perfil de expresión de proteínas que consiste en fosfo-AKT y fosfo-ERK, en donde la fosfo-AKT supra-regulada y la fosfo-ERK sub-regulada indican que el paciente responde al tratamiento con gefitinib. Además de ello, describe que ni el estado de EGFR ni el estado fosfo-EGRF se correlaciona con la respuesta.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para utilizar la expresión de proteínas para identificar aquellos pacientes que probablemente respondan al tratamiento con compuestos que inhiban la fosforilación intracelular de tirosina quinasa (TK – siglas en inglés) asociada con el receptor del factor del crecimiento epidermal (EGFR – siglas en inglés), incluidos erlotinib y gefitinib (a estos pacientes se les alude como “respondedores”), así como aquellos pacientes que no es probable que se beneficien de un tratamiento de este tipo (a estos pacientes se les alude como “no respondedores”). La presente invención permite que un proveedor de tratamiento identifique a aquellos pacientes que son respondedores al tratamiento con compuestos que inhiben la fosforilación intracelular de tirosina quinasa asociada EGFR, incluidos erlotinib y gefitinib, y aquellos que no son respondedores a este tipo de tratamiento, antes de la administración del agente. A compuestos tales como erlotinib y gefitinib que inhiben la fosforilación intracelular de tirosina quinasa asociada a EGFR se les alude en esta memoria como inhibidores de EGFR-TK.

La presente memoria descriptiva comprende perfiles de expresión de proteínas, así como los correspondientes perfiles de expresión de genes (a los que se alude también como “firmas genéticas”) que son indicativos de la tendencia de un paciente que padece cáncer de pulmón, particularmente NSCLC, de responder al tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK. El perfil de expresión de proteínas comprende al menos una y, preferiblemente, una pluralidad de proteínas seleccionadas del grupo que consiste en p70S6K, fosfo-p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfomTOR, fosfo-pTEN, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGRF/InR, EGRF, fosfo-EGFR, fosfo-HER2/ErbB2, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP. A este grupo de proteínas se alude en esta memoria como las “proteínas respondedoras del inhibidor de EGFR-TK”. De acuerdo con la invención, la totalidad de estas proteínas se expresan diferencialmente (p. ej. se supra-regulan o sub-regulan) en pacientes que son respondedores a la terapia con inhibidores de EGFR-TK.

Específicamente p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP están supra-reguladas (sobre-expresadas) y fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGRF y fosfo-HER2/ErbB2 están sub-reguladas (sub-expresadas) en pacientes que son respondedores a inhibidores de EGFR-TK.

La presente memoria descriptiva comprende, además, perfiles de expresión de genes (a los que se alude también como “firmas de genes”) que son indicativos de la tendencia de un paciente que padece NSCLC a responder al tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK. El perfil de expresión de genes comprende al menos uno y, preferiblemente, una pluralidad de genes que codifican las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en p70S6K, p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR, fosfo-HER2/ErbB2, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP. A este grupo de genes se le alude en esta memoria como los “genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK”. De acuerdo con la memoria descriptiva, algunos o la totalidad de estos genes son diferencialmente expresados (p. ej. supra-regulados o subregulados) en pacientes que son respondedores a una terapia con inhibidor de EGFR-TK. Específicamente, los genes que codifican p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP están supra-regulados (sobre-expresados), y los genes que codifican fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2/ErbB2 están sub-regulados (sub-expresados) en pacientes que son respondedores a inhibidores de EGFR-TK.

La presente invención comprende un método para determinar si un paciente es un respondedor o un no respondedor a tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK, según se define por la reivindicación 1.

La presente memoria descriptiva comprende, además, un ensayo para determinar el perfil de expresión de proteínas y/o genes en una muestra de un paciente, e instrucciones para utilizar el ensayo.

Descripción detallada

La presente memoria descriptiva proporciona perfiles de expresión de genes y proteínas (GPEPs – siglas en inglés) y su uso para predecir una capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento de cáncer. Más específicamente, los presentes perfiles de expresión de genes y proteínas son indicativos de si un paciente que padece cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es un respondedor o un no respondedor al tratamiento con un compuesto que es un inhibidor de EGFR-TK, en particular erlotinib (TARCEVA®) o gefitinib (IRESSA®).

Erlotinib y gefitinib son agentes quimioterapéuticos que pertenecen al grupo de medicinas denominadas antineoplásicos. Estos compuestos actúan inhibiendo la fosforilación intracelular de tirosina quinasa asociada con receptores de la superficie de células de transmembrana, incluido EGFR, un receptor expresado sobre la superficie celular de células normales y células cancerígenas. Estos compuestos interfieren en el crecimiento de células cancerígenas, las cuales son finalmente destruidas.

Se han reseñado mejoras significativas en los resultados de NSCLC en algunos pacientes tratados con erlotinib o gefitinib. Sin embargo, el crecimiento de células normales se ve a menudo afectado por estas medicinas, provocando efectos indeseados y/o desagradables. Estos otros efectos pueden incluir diarrea, sarpullido, acné, piel seca, náuseas (encontrarse mal) y vómitos, pérdida del apetito y pérdida de peso, astenia y pruritis y dolor abdominal. La presente memoria descriptiva proporciona biomarcadores que están asociados con aquellos pacientes que se han beneficiado de un tratamiento con erlotinib y/o gefitinib. De esta forma, la presente invención permite al proveedor del tratamiento determinar por adelantado qué pacientes de NSCLC tienen posibilidad de beneficiarse del tratamiento con erlotinib o genfitinib y considerar opciones de tratamiento alternativo para no respondedores.

La presente memoria descriptiva proporciona perfiles de expresión de proteínas que son indicativos de si un paciente tiene probabilidades de ser un respondedor o un no respondedor a una terapia con inhibidor de EGFR-TK. Las proteínas que comprenden el perfil de expresión descrito en esta memoria se seleccionan del grupo que consiste en p70S6K, fosfo-p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGRF/InR, EGFR, fosfo-EGFR, fosfo-HER2/ErbB2, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP. A este grupo de proteínas se le alude en esta memoria como las “proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK”. De acuerdo con la invención, la totalidad de estas proteínas son expresadas diferencialmente (p. ej. supra-reguladas o subreguladas) en pacientes que son respondedores a una terapia con inhibidor de EGFR-TK. Específicamente, p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP están

5 supra-reguladas (sobre-expresadas) y fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGRF y fosfoHER2/ErbB2 están sub-reguladas (sub-expresadas) en pacientes que son respondedores a inhibidores de EGFR-TK.

La Tabla 1 identifica las proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK, e indica si la expresión de estas 10 proteínas está supra- o sub-regulada en pacientes que son respondedores a la terapia con un inhibidor de EGFR-TK

Proteína Nº acceso

Sobre-expresión Sub-expresión SEQ ID Nº de proteína

P70S6K total NP_003152

Pos 17

Fosfo-p70S6K Misma que arriba

Pos

Fosfo-S6 NP_001001

Pos 18

Fosfo-AKT NP_005154

Pos 19

Fosfo-mTOR NP_004949

Pos 20

Fosfo-pTEN NP_000305

Pos 21

Fosfo-MEK NP_002746

Pos 22

Fosfo MAPK NP_002736

Pos 23

Fosfo-IGFR1/InR NP_000557

Pos 24

EGFR total NP_005219

Pos 25

Fosfo-EGFR Misma que arriba

Pos

Fosfo-HER2(ErbB2) NP_001005862

Pos 26

Fosfo-ER NP_000116

Pos 27

Fosfo-AR NP_000035

Pos 28

AIK NP_940835

Pos 29

Osteopontina NP_000573

Pos 30

MMP11 NP_005931

Pos 31

GFAP NP_002046

Pos 32

* Nº de acceso se refiere a proteína no fosforilada

15 La presente memoria descriptiva comprende, además, perfiles de expresión de genes que son indicativos de la tendencia de un paciente que padece NSCLC a responder a un tratamiento con inhibidores de EGFR-TK. El perfil de expresión de genes comprende al menos uno y, preferiblemente, una pluralidad de genes que codifican las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en p70S6K, fosfo-p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGRF/InR, EGFR, fosfo-EGFR, fosfo-HER2/ErbB2, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK,

20 osteopontina, MMP11 y GFAP. A este grupo de proteínas se le alude en esta memoria como los “genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK”. De acuerdo con la memoria descriptiva, algunos o la totalidad de estos genes son diferencialmente expresados (p. ej. supra-regulados o sub-regulados) en pacientes que son respondedores a una terapia con inhibidor de EGFR-TK. Específicamente, los genes que codifican p70S6K, fosfoS6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP están supra-regulado (sobre-expresados) y los genes que codifican fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfoIGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2/ErbB2 están sub-regulados (sub-expresados) en pacientes que son respondedores a inhibidores de EGFR-TK. Por consiguiente, es posible determinar de antemano si es probable que

5 un paciente se beneficie de una terapia de este tipo, obteniendo un perfil de expresión de genes del tejido del paciente, y determinar si uno o más de los genes en los genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK está supra- o sub-regulado.

La Tabla 2 identifica los genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK e indica si la expresión de estos genes está

10 supra- o sub-regulada en pacientes que son respondedores a una terapia con un inhibidor de EGFR-TK. La Tabla 2 recoge también el número de acceso NCBI de al menos una variante de estos genes

Tabla 2

Gen Número de acceso

Proteína codificada Sobre-expresión Sub-expresión SEQ ID Nº de genes

RPS6KB1 NM_003161

p70S6K total Pos 1

Mismo que arriba

Fosfo-p70S6 Pos

RPS6 NM_001010

Fosfo-S6 Pos 2

AKT1 NM_005163

Fosfo-AKT Pos 3

FRAP1 NM_004958

Fosfo-mTOR Pos 4

PTEN NM_000314

Fosfo-pTEN Pos 5

MAP2K1 NM_002755

Fosfo-MEK Pos 6

MAPK1 NM_002745

Fosfo-MAPK Pos 7

FCGR1A NM_000566

Fosfo-IGFR1/InR Pos 8

EGFR NM_005228

EGFR total Pos 9

Mismo que arriba

Fosfo-EGFR Pos

ERBB2 NM_001005862

Fosfo-HER2(ErbB2) Pos 10

ESR1 NM_000125

Fosfo-ER Pos 11

AR NM_000044

Fosfo-AR Pos 12

AURKA NM_198433

AIK Pos 13

SPP1 NM_000582

Osteopontina Pos 14

MMP11 NM_005940

MMP11 Pos 15

GFAP NM_002055

GFAP Pos 16

15 Existen otras variantes de esto genes (p. ej., véanse las bases de datos de genes disponibles a través de la página web de NCBI Entrez (www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery), y estas variantes están abarcadas por la presente memoria descriptiva.

En un aspecto preferido de la presente memoria descriptiva, los perfiles de expresión de proteínas de la presente

20 memoria descriptiva comprenden al menos cuatro, preferiblemente entre aproximadamente cuatro y nueve y, lo más preferiblemente, entre aproximadamente nueve y dieciocho de las proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK que están supra- o sub-reguladas, según sea aplicable. En un aspecto actualmente preferido, el perfil de expresión de proteínas comprende al menos aproximadamente cuatro y, de preferencia aproximadamente seis a doce de las proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK que están supra-reguladas y, al menos aproximadamente dos y,

25 de preferencia, aproximadamente cuatro a seis de las proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK que están sub-reguladas.

En un aspecto preferido de la presente memoria descriptiva, los perfiles de expresión de genes de la presente memoria descriptiva comprenden al menos cuatro, preferiblemente entre aproximadamente cuatro y nueve y, lo más preferiblemente, entre aproximadamente nueve y dieciocho de los genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK que están supra- o sub-regulados, según sea aplicable. En un aspecto actualmente preferido, el perfil de expresión de genes comprende al menos aproximadamente cuatro y, de preferencia, aproximadamente seis a doce de los genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK que están supra-regulados y, al menos aproximadamente dos y, de preferencia, aproximadamente cuatro a seis de los genes respondedores al inhibidor de EGFR-TK que están subregulados.

Los perfiles de expresión de proteínas y/o genes de la memoria descriptiva se pueden utilizar para predecir la capacidad de respuesta de un paciente de NSCLC a una terapia con un inhibidor de EGFR-TK, en particular erlotinib

o gefitinib. El presente método comprende (a) obtener un perfil de expresión de proteínas procedentes de una muestra de un tumor de un paciente que padece NSCLC; (b) determinar, a partir del perfil de expresión de proteínas, si la expresión de la totalidad de las siguientes proteínas está supra-regulada (sobre-expresada): p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP; y si la expresión de la totalidad de las siguientes proteínas está sub-regulada (sub-expresada): fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2(ErbB2).

Definiciones:

Por conveniencia, se proporciona en lo que sigue el significado de determinados términos y frases empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones anejas. Las definiciones no pretenden ser limitativas por naturaleza y sirven para proporcionar una comprensión más clara de determinados aspectos de la presente invención.

El término “genoma” pretende incluir el complemento de ADN completo de un organismo, incluido el componente de ADN nuclear, ADN cromosómico o extracromosómico, así como el dominio citoplásmico (p. ej. ADN mitocondrial).

El término “gen” se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende secuencias de control y codificadoras, necesarias para producir un polipéptido o precursor. El polipéptido puede ser codificado por una secuencia codificadora de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificadora. El gen se puede derivar, en su totalidad o en parte, de cualquier fuente conocida en la técnica, incluida una planta, un hongo, un animal, un genoma bacteriano o episoma, ADN eucariótico, nuclear o de plásmido, ADNc, ADN viral o ADN químicamente sintetizado. Un gen puede contener una o más modificaciones en cualquiera de las regiones codificadoras o las no traducidas que podrían afectar a la actividad biológica o a la estructura química del producto de expresión, a la tasa de expresión o a la manera de controlar la expresión. Modificaciones de este tipo incluyen, pero no se limitan a mutaciones, inserciones, deleciones y sustituciones de uno o más nucleótidos. El gen puede constituir una secuencia codificadora ininterrumpida, o puede incluir uno o más intrones, unidos por las uniones de corte y empalme apropiadas. El término “gen”, tal como se utiliza en esta memoria, incluye variantes de los genes identificados en la Tabla 1.

La expresión “expresión de genes” se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de ácidos nucleicos sufre una transcripción y traducción con éxito de modo que se expresan niveles detectables de la secuencia de nucleótidos.

Las expresiones “perfil de expresión de genes” o “firma de genes” se refieren a un grupo de genes expresados por un tipo de célula o tejido particular, en donde la presencia de los genes considerados juntos o la expresión diferencial de dichos genes, es indicativa/predictiva de un determinado estado.

La expresión “ácido nucleico” tal como se utiliza en esta memoria se refiere a una molécula constituida por uno o más nucleótidos, es decir, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, o ambos. La expresión incluye monómeros y polímeros de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, estando los ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos unidos entre sí, en el caso de los polímeros, a través de enlaces 5’ a 3’. Los polímeros de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos pueden ser de cadena sencilla o doble. Sin embargo, los enlaces pueden incluir cualquiera de los enlaces conocidos en la técnica, incluidos, por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden enlaces 5’ a 3’. Los nucleótidos pueden presentarse en la naturaleza o pueden ser análogos producidos de forma sintética que son capaces de formar relaciones de pares de bases con pares de bases que se presentan en la naturaleza. Ejemplos de bases que se presentan de forma no natural, que son capaces de formar relaciones de apareamiento de bases, incluyen, pero no se limitan a análogos de aza y deaza pirimidina, análogos de aza y deaza purina y otros análogos de bases herocíclicas, en donde uno o más de los átomos de carbono y nitrógeno de los anillos de pirimidina han sido sustituidos por heteroátomos, p. ej., oxígeno, azufre, selenio, fósforo y similares. Además, la expresión “secuencias de ácidos nucleicos” contempla la secuencia complementaria e incluye específicamente cualquier secuencia de ácidos nucleicos que sea esencialmente homóloga tanto a la secuencia de ácidos nucleicos como a su complemento.

Los términos “disposición ordenada” y “microdisposición ordenada” se refieren al tipo de genes o proteínas representado por una disposición ordenada de oligonucleótidos o agentes de captura de proteínas, y en donde el tipo de genes o proteínas representado en la disposición ordenada depende del fin pretendido de la disposición ordenada

(p. ej. para vigilar la expresión de genes o proteínas humanos). Los oligonucleótidos o agentes de captura de proteínas en una disposición ordenada dada pueden corresponder al mismo tipo, categoría o grupo de genes o proteínas. Genes o proteínas se pueden considerar del mismo tipo si comparten algunas características comunes tales como la especie de origen (p. ej. ser humano, ratón, rata); estado patológico (p. ej. cáncer); funciones (p. ej. proteína quinasas, supresores de tumores); o el mismo proceso biológico (p. ej. apoptosis, transducción de señales, regulación, proliferación y diferenciación del ciclo celular). Por ejemplo, un tipo de disposición ordenada puede ser una “disposición ordenada de cáncer” en la que cada uno de los oligonucleótidos o agentes de captura de proteínas de la disposición ordenada corresponde a un gen o proteína asociado con un cáncer. Una “disposición ordenada epitelial” puede ser una disposición ordenada de oligonucleótidos o agentes de captura de proteínas que corresponde a genes o proteínas epiteliales únicas. De manera similar, una “disposición ordenada del ciclo celular” puede ser un tipo de disposición ordenada en la que los oligonucleótidos o agentes de captura de proteínas correspondes a genes o proteínas únicos asociados con el ciclo celular.

La expresión “tipo de célula” se refiere a una célula procedente de una fuente dada (p. ej. un tejido, órgano) o una célula en un estado de diferenciación dado, o una célula asociada con una patología o estructura genética dada.

El término “activación” tal como se utiliza en esta memoria se refiere a cualquier alteración de una vía de señalización o respuesta biológica que incluye, por ejemplo, aumentos por encima de los niveles basales, restauración a los niveles basales a partir de un estado inhibido y estimulación de la vía por encima de los niveles basales.

La expresión “expresión diferencial” se refiere tanto a diferencias cuantitativas como cualitativas en los modelos de expresión temporales y de tejidos de un gen o una proteína en tejidos o células enfermos frente a tejido adyacente normal. Por ejemplo, un gen diferencialmente expresado puede tener su expresión activada o inactivada por completo en estados normales frente a estados patológicos, o puede estar supra-regulado (sobre-expresado) o subregulado (sub-expresado) en un estado patológico frente a un estado normal. Un gen cualitativamente regulado de este tipo puede exhibir un modelo de expresión dentro de un tejido o tipo de célula dado que sea detectable en estados de control o patológicos, pero que no sea detectable en ambos. Dicho de otra manera, un gen o proteína está diferencialmente expresado cuando la expresión del gen o de la proteína se produce a un nivel superior o inferior en los tejidos o células enfermos de un paciente con respecto al nivel de su expresión en los tejidos o células normales (libres de enfermedades) del paciente y/o tejidos o células control.

El término “detectable” se refiere a un modelo de expresión de ARN que puede ser detectado a través de las técnicas convencionales de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR – siglas en inglés), PCR con transcriptasa inversa (RT – siglas en inglés), representación diferencial y análisis Northern, todos los cuales son bien conocidos por los expertos en la técnica. De manera similar, modelos de expresión de proteínas se pueden “detectar” a través de técnicas convencionales tales como transferencias Western.

El término “complementario” se refiere a la compatibilidad o emparejamiento conjunto topológico de las superficies interactuantes de una molécula sonda y su diana. La diana y su sonda se pueden describir como complementarias y, además, las características de la superficie de contacto son complementarias una con otra. La hibridación o el apareamiento de bases entre nucleótidos o ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, entre las dos cadenas de una molécula de ADN de doble cadena o entre una sonda de oligonucleótido y una diana son complementarios.

La expresión “muestra biológica” se refiere a una muestra obtenida de un organismo (p. ej. un paciente humano) o de componentes (p. ej. células) de un organismo. La muestra puede ser de cualquier tejido o fluido biológico. La muestra puede ser una “muestra clínica” que es una muestra derivada de un paciente. Muestras de este tipo incluyen, pero no se limitan a esputo, sangre, células de la sangre (p. ej. leucocitos), fluido amniótico, plasma, semen, médula ósea, y muestras de tejido o de biopsia con aguja fina, orina, fluido peritoneal y fluido pleural, o células procedentes de ellos. Muestras biológicas pueden incluir también secciones de tejidos tales como secciones congeladas tomadas para fines histológicos. A una muestra biológica se la puede aludir también como una “muestra de un paciente”.

Una “proteína” significa un polímero de residuos aminoácidos enlazados entre sí por enlaces péptido. El término, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a proteínas, polipéptidos y péptidos de cualquier tamaño, estructura o función. Sin embargo, típicamente, una proteína tendrá al menos una longitud de seis aminoácidos. Si la proteína es un péptido corto, éste será de una longitud de al menos aproximadamente 10 residuos aminoácidos. Una proteína puede ser que se presenta en la naturaleza, recombinante o sintética, o cualquier combinación de éstas. Una proteína puede comprender también un fragmento de una proteína o péptido que se presenta en la naturaleza. Una proteína puede ser una molécula sencilla o puede ser un complejo multi-molecular. El término proteína también se puede aplicar a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido que se presenta en la naturaleza correspondiente.

Un “fragmento de una proteína”, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una proteína que es una parte de otra proteína. Por ejemplo, fragmentos de proteínas pueden comprender polipéptidos obtenidos al digerir proteína de longitud completa aislada de células cultivadas. En una realización, un fragmento de proteína comprende al menos seis aminoácidos. En otra realización, el fragmente comprende al menos diez aminoácidos. Todavía en otra realización, el fragmento de proteína comprende al menos aproximadamente dieciséis aminoácidos.

Tal como se utiliza en esta memoria, un “producto de expresión” es una biomolécula tal como una proteína, que se produce cuando un gen se expresa en un organismo. Un producto de expresión puede comprender modificaciones post-traducción.

La expresión “expresión de proteínas” se refiere al proceso mediante el cual una secuencia de ácidos nucleicos sufre una transcripción y traducción con éxito, de modo que se expresan niveles detectables de la secuencia de aminoácidos o de la proteína.

La expresión “perfil de expresión de proteínas” o “firma de expresión de proteínas” se refiere a un grupo de proteínas expresado por un tipo de célula o tejido particular (p. ej. neurona, endotelio de arteria coronaria o tejido patológico) en donde la presencia de las proteínas consideradas juntas o la expresión diferencial de este tipo de proteínas es indicativo/predictivo de un determinado estado.

El término “anticuerpo” significa una inmunoglobulina, ya sea natural o producida de forma sintética parcial o totalmente. Todos sus derivados que conservan su capacidad de unión específica están incluidos también en el término. El término cubre también cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo o ampliamente homólogo a un dominio de unión de inmunoglobulina. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluida cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.

La expresión “fragmento de anticuerpo” se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que tiene una longitud que es menor que la longitud completa. En un aspecto, el fragmento de anticuerpo conserva al menos una porción importante de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa; específicamente en calidad de un participante en la unión. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, Fv, diacuerpo de dsFv y fragmentos Fd. El fragmento de anticuerpo se puede producir por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede aliarse enzimáticamente o producirse químicamente mediante fragmentación de un anticuerpo intacto o puede ser producido de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia parcial del anticuerpo. Alternativamente, el fragmento de anticuerpo puede ser producido de forma sintética en su totalidad o en parte. El fragmento de anticuerpo puede comprender un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. En otra realización, el fragmento puede comprender cadenas múltiples que están enlazadas entre sí, por ejemplo mediante enlaces disulfuro. El fragmento también puede comprender un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional puede comprender, típicamente, al menos aproximadamente 50 aminoácidos y, más típicamente, comprenderá al menos aproximadamente 200 aminoácidos.

Determinación de los perfiles de expresión de genes

Se utilizó el siguiente método para identificar y validar los perfiles de expresión de genes, indicativos de si el paciente respondería a tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK. Se conocen otros métodos para identificar los perfiles de expresión de genes y/o proteínas; también podrían utilizarse cualquiera de estos métodos alternativos. Véase, p. ej., Chen et al., NEJM, 356(1):11-20 (2007); Lu et al., PLOS Med., 3(12):e467 (2006); Golub et al., Science, 286 :531537 (1999).

El presente método utiliza un ensayo paralelo en el que, en una pista, se identifican aquellos genes que están sobre/sub-expresados en comparación con muestras de tejido normal (no canceroso) y, en una segunda pista, se identifican aquellos genes que comprenden inserciones o deleciones cromosómicas en comparación con muestras normales, procedentes de las mismas muestras. Estas dos pistas de análisis producen dos conjuntos de datos. Los datos se analizan utilizando un algoritmo que identifica los genes del perfil de expresión de genes (es decir, los genes que son diferencialmente expresados en tejido cancerígeno). Para normalizar los resultados se pueden emplear controles positivos y negativos, incluyendo eliminar aquellos genes y proteínas que también son expresados diferencialmente en tejidos normales procedentes de los mismos pacientes y confirmando que el perfil de expresión de genes es único para el cáncer de interés.

En el presente caso, como una etapa inicial, se adquirieron muestras biológicas de aproximadamente doscientos cincuenta (250) pacientes que padecían NSCLC. Se utilizaron aproximadamente quinientas (500) muestras de tejido obtenidas de pacientes con cáncer de NSCLC, incluido tejido tumoral y tejido de pulmón normal (no enfermo) adyacente. Las muestras de tejido se obtuvieron de pacientes que padecían diversas fases de cáncer de NSCLC. Las muestras incluían tejido tumoral procedente de pacientes quienes habían sido tratados con erlotinib o gefitinib; algunos de los pacientes eran respondedores a estos compuestos y otros eran no respondedores. En una base de datos se registró la información clínica asociada con cada muestra, incluido el tratamiento con erlotinib o gefitinib, y el resultado del tratamiento (es decir, el tiempo de supervivencia). La información clínica incluye también información tal como edad, sexo, historial médico, historial del tratamiento, síntomas, historial familiar, recurrencia (si/no), etc. También se adquirieron muestras control, que incluían muestras de tejido pulmonar normal (no canceroso) procedente de los mismos pacientes y otros tipos de tejido canceroso procedente de otros pacientes (p. ej. de un repositorio de tejidos). Como controles positivos se utilizaron muestras de tejido pulmonar no enfermo normal procedente de un conjunto de individuos sanos, y como controles negativos se utilizaron muestras de tumores procedentes de pacientes de NSCLC quienes eran no respondedores a la terapia con erlotinib o gefitinib.

Después se generaron perfiles de expresión de genes (GEPs – siglas en inglés) a partir de las muestras biológicas en base al ARN total de acuerdo con métodos bien establecidos. En síntesis, un método típico implica aislar ARN total procedente de la muestra biológica, amplificar el ARN, sintetizar ADNc, marcar el ADNc con un marcador detectable, hibridar el ADNc con una disposición ordenada genómica tal como GeneChip de Affymetrix U133 y determinar la unión del ADNc marcado con la disposición ordenada genómica midiendo la intensidad de la señal procedente del marcador detectable unido a la disposición ordenada. Véanse, p. ej., los métodos descritos en Lu, et al., Chen, et al. y Golub et al., supra, y las referencias citadas en los mismos. Los datos de expresión resultantes se introducen en una base de datos.

ARNms en las muestras de tejidos se pueden analizar utilizando sondas comercialmente disponibles o adaptadas según las necesidades del cliente o disposiciones ordenadas de oligonucleótidos tales como disposiciones ordenadas de ADNc o de oligonucleótidos. El uso de estas disposiciones ordenadas permite la medición simultánea de niveles de ARNm de estado estable de miles de genes, representando con ello una herramienta poderosa para identificar efectos tales como el brote, la detención o la modulación de la proliferación incontrolada de células. La hibridación y/o unión de las sondas en las disposiciones ordenadas a los ácidos nucleicos de interés procedentes de las células se puede determinar detectando y/o midiendo la localización e intensidad de la señal recibida de la sonda marcada o utilizada para detectar una secuencia de ADN/ARN procedente de la muestra que se hibrida a una secuencia de ácidos nucleicos en una localización conocida en la microdisposición ordenada. La intensidad de las señales es proporcional a la cantidad de ADNc o de ARNm presente en el tejido de la muestra. Están disponibles y son útiles numerosas disposiciones ordenadas y técnicas. Métodos para determinar la expresión de genes y/o proteínas en tejidos de muestra se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nº 6.271.002; patente de EE.UU. nº 6.218.122; patente de EE.UU. nº 6.218.114; y patente de EE.UU. nº 6.004.755; y en Wang et al., J. Clin. Oncol., 22(9):1564-1671 (2004); Golub et al, (supra); y Schena et al., Science, 270:467-470 (1995).

El aspecto del análisis de genes utilizado en el presente método investiga la expresión de genes así como datos de inserción/deleción. Como una primera etapa, el ARN se aisló de las muestras de tejido y se marcó. Se realizaron procesos paralelos en la muestra para desarrollar dos conjuntos de datos: (1) la sobre-/sub-expresión de genes basada en niveles de ARNm; y (2) datos de inserción/deleción cromosómica. Estos dos conjuntos de datos se correlacionaron luego por medio de un algoritmo. La sobre-/sub-expresión de los genes en cada una de las muestras de tejido cancerígeno se comparó con la expresión de genes en las muestras normales (no cancerosas), y se identificó un subconjunto de genes que se expresaron diferencialmente en el tejido cancerígeno. Preferiblemente, niveles de supra- y sub-regulación se distinguen en base a cambios múltiples de las mediciones de intensidad de las sondas de la microdisposición ordenada hibridadas. Se prefiere una diferencia de aproximadamente 2,0 veces o mayor para realizar este tipo de distinciones, o un valor p menor que aproximadamente 0,05. Es decir, antes de que se diga que un gen está diferencialmente expresado en células enfermas frente a normales, se encuentra que la célula enferma proporciona una intensidad de expresión al menos aproximadamente 2 veces mayor o menor que las células normales. Generalmente, cuanto mayor sea el múltiplo de diferencia (o menor sea el valor p), tanto más se preferirá el gen para uso como una herramienta de diagnóstico o pronóstico. Genes seleccionados para las firmas de genes de la presente memoria descriptiva tienen niveles de expresión que resultan en la generación de una señal que es distinguible de las de los genes normales o no modulados en una cantidad que excede el fondo utilizando instrumentación de laboratorio clínico.

Se pueden utilizar valores estadísticos para distinguir con seguridad genes modulados de no modulados y el ruido.

Ensayos estadísticos pueden identificar los genes expresados diferencialmente de la manera más significativa entre diversos grupos de muestras. El test t de Student es un ejemplo de un test estadístico robusto que puede utilizarse para encontrar diferencias significativas entre dos grupos. Cuando menor sea el valor p, tanto más convincente será la evidencia de que el gen está mostrando una diferencia entre los diferentes grupos. No obstante, dado que las microdisposiciones ordenadas permiten la medición de más de un gen a la vez, se pueden consultar a la vez decenas de miles de test estadísticos. Debido a ello, no es probable observar pequeños valores p al azar, y se pueden realizar ajustes utilizando una corrección de Sidak o etapa similar así como un experimento de aleatoriedad/permutación. Un valor p menor que aproximadamente 0,05 por parte del test t es una evidencia de que el nivel de expresión del gen es significativamente diferente. Una evidencia más convincente es un valor p menor que aproximadamente 0,05 después de haber tenido en cuenta la corrección de Sidak. Para un gran número de muestras en cada grupo, un valor p menor que aproximadamente 0,05 después del test de aleatoriedad/permutación es la evidencia más convincente de una diferencia significativa.

Otro parámetro que se puede utilizar para seleccionar genes que generan una señal que es mayor que la del gen no modulado o ruido es la medición de la diferencia de señales absoluta. Preferiblemente, la señal generada por los genes diferencialmente expresados difiere en al menos aproximadamente 20% de las del gen normal o no modulado (sobre una base absoluta). Se prefiere incluso más que este tipo de genes produzcan modelos de expresión que sean al menos aproximadamente 30% diferentes de los de genes normales o no modulados.

Este análisis de expresión diferencial se puede realizar utilizando disposiciones ordenadas comercialmente disponibles, por ejemplo disposiciones GeneChip® de Affymetrix U133 (Affymetrix, Inc., www.affymetrix.com). Estas disposiciones ordenadas tienen conjuntos de sondas para el genoma humano completo inmovilizado en el chip y se pueden utilizar para determinar la supra- y sub-regulación de genes en muestras de ensayo. También se pueden utilizar otros sustratos que tengan fijados sobre los mismos ADN genómico humano o sondas capaces de detectar productos de expresión tales como los disponibles de Affymetrix, Agilent Technologies, Inc. (www.agilent.com) o Illumina, Inc. (www.illumina.com). Microdisposiciones ordenadas de genes actualmente preferidas para uso en la presente memoria descriptiva incluyen disposiciones ordenadas GeneChip® de Affymetrix U133 y microdisposiciones ordenadas de ADN genómico de Agilent Technologies. Instrumentos y reactivos para llevar a cabo el análisis de la expresión de genes están comercialmente disponibles. Véase, p. ej., el sistema GeneChip® de Affymetrix (www.affymetrix.com). Los datos de expresión obtenidos del análisis se introducen entonces en la base de datos.

En el segundo brazo del presente método se obtuvieron datos de inserción/deleción cromosómica para los genes de cada una de las muestras en comparación con muestras de tejido normal. El análisis de inserción/deleción se generó utilizando una hibridación genómica comparativa (“CGH” – siglas en inglés) basada en disposiciones ordenadas. La CGH basada en disposiciones ordenadas mide las variaciones en el número de copias en múltiples loci simultáneamente, proporcionando una importante herramienta para estudiar el cáncer y trastornos de desarrollo y para desarrollar dianas diagnósticas y terapéuticas. Microchips para llevar a cabo la CGH basada en disposiciones ordenadas están comercialmente disponibles, p. ej., de Agilent Technologies. El chip de Agilent es una disposición ordenada cromosómica que muestra la localización de genes en los cromosomas y proporciona datos adicionales para la firma de genes. Los datos de inserción/deleción procedentes de este ensayo se introducen en la base de datos.

Los análisis se llevan a cabo en las mismas muestras de los mismos pacientes para generar datos paralelos. Para reducir la variabilidad se utilizan los mismos chips y la misma preparación de muestras.

También se determina la expresión de determinados genes conocidos como “genes de referencia”, “genes control” o “genes de control interno”, preferiblemente al mismo tiempo, como medios para asegurar la veracidad del perfil de expresión. Genes de referencia son genes que se expresan de forma consistente en muchos tipos de tejidos, incluidos tejidos cancerosos y normales y, así, son útiles para normalizar los perfiles de la expresión de genes. Véase, p. ej., Silvia et al., BCM Cancer, 6:200 (2006); Lee et al., Genome Research, 12(2):292-297 (2002); Zhang et al., BMC Mol. Biol., 6:4 (2005). La determinación de la expresión de genes de referencia en paralelo con los genes en el perfil de expresión de genes único proporciona una garantía adicional de que las técnicas utilizadas para la determinación del perfil de expresión de genes están actuando adecuadamente. En el presente método y ensayo se pueden utilizar cualesquiera genes de referencia incluidos, por ejemplos, ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0 y/o TRFC.

Correlación de datos

Los datos de la expresión diferencial y los datos de inserción/deleción en la base de datos se correlacionan con la información de los resultados clínicos asociada con cada muestra de tejido también en la base de datos por medio de un algoritmo para determinar un perfil de expresión de genes para determinar la eficacia terapéutica de irinotecan, así como la recurrencia tardía de la enfermedad y/o la muerte relacionada con la enfermedad asociada con la terapia con irinotecan. Están disponibles diversos algoritmos que son útiles para correlacionar los datos e identificar las firmas de genes predictivas. Por ejemplo, se pueden utilizar algoritmos tales como los identificados en Xu et al., A Smooth Response Surface Algoritm For Constructing A Gene Regulatory Network, Physiol. Genomics 11:11-20 (2002).

Otro método para identificar perfiles de expresión de genes es a través del uso de algoritmos de optimización tal como el algoritmo de media-varianza ampliamente utilizado para establecer portafolios de acciones. Un método de este tipo se describe en detalle en la solicitud de patente de EE.UU. con número de publicación 2003/0194734. En esencia, el método exige el establecimiento de un conjunto de entradas (la expresión según se mide por la intensidad) que optimizarán el retorno (señal que se genera) que se recibe para utilizarlo, al tiempo que se minimiza la variabilidad del retorno. También se puede utilizar el algoritmo descrito en Irizarry et al., Nucleic Acids Res., 31:e15 (2003). El algoritmo actualmente preferido es el algoritmo de JMP Genomics disponible de JMP Software (www.jmp.com).

El proceso para seleccionar perfiles de expresión de genes también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Tales reglas se formulan en base a la biología y a una comprensión de la tecnología utilizada para producir resultados clínicos, y se aplican para extraer el resultado del método de optimización. Por ejemplo, el método de la media-varianza para la identificación de la firma de genes se puede aplicar a datos de la microdisposición ordenada para un cierto número de genes diferencialmente expresados en sujetos con cáncer. El resultado del método sería un conjunto optimizado de genes que podría incluir algunos genes que se expresan en la sangre periférica así como en tejido enfermo. Si muestras utilizadas en el método de ensayo se obtienen de la sangre periférica y determinados genes diferencialmente expresados en casos de cáncer también podrían ser diferencialmente expresados en la sangre periférica, entonces se puede aplicar una regla heurística en la que se selecciona un portafolio de la frontera eficiente que excluye aquellos que son diferencialmente expresados en la sangre periférica. Naturalmente, la regla se puede aplicar antes de la formación de la frontera eficiente, por ejemplo aplicando la pre-selección de datos durante la regla.

Se pueden aplicar otras reglas heurísticas que no estén necesariamente relacionadas con la biología en cuestión. Por ejemplo, se puede aplicar una regla de que sólo pueda ser representado un determinado porcentaje del portafolio por parte de un gen o grupo de genes particular. Software comercialmente disponible tal como el software de Wagner alberga fácilmente este tipo de heurísticas (Wagner Associates Mean-Variance Optimization Application, www.wagner.com). Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando factores distintos de la seguridad y precisión tengan un impacto sobre el deseo de incluir uno o más genes.

Como un ejemplo, el algoritmo se puede utilizar para comparar perfiles de expresión de genes para diversos genes (o portafolios) para atribuir pronósticos. Los perfiles de expresión de genes de cada uno de los genes que comprenden el portafolio se fijan en un medio tal como un medio legible por ordenador. Éste puede adoptar un cierto número de formas. Por ejemplo, se puede establecer una tabla en la que se introduzcan el intervalo de señales (p. ej. mediciones de intensidad) indicativas de la enfermedad. Los datos reales del paciente se pueden luego comparar con los valores en la tabla para determinar si las muestras del paciente son normales o enfermas. En un aspecto más sofisticado, se registran digital o gráficamente modelos de las señales de expresión (p. ej. intensidad fluorescente). Los modelos de expresión de genes procedentes de los portafolios de genes utilizados en unión con las muestras de los pacientes se comparan entonces con los modelos de expresión. Software de comparación de modelos se puede luego utilizar para determinar si las muestras del paciente tienen un modelo indicativo de recurrencia de la enfermedad. Naturalmente, estas comparaciones también se pueden utilizar para determinar si no es probable que el paciente experimente recurrencia de la enfermedad. Estos perfiles de expresión de las muestras se comparan entonces con el perfil de una célula control. Si los modelos de expresión de las muestras son consistentes con los modelos de expresión para la recurrencia del cáncer, entonces (en ausencia de consideraciones médicas compensatorias) el paciente es tratado como se trataría a un paciente de recaída. Si los modelos de expresión de las muestras son consistentes con el modelo de expresión procedente de la célula normal/control, entonces al paciente se le diagnostica negativo para el cáncer.

Un método para analizar las firmas de genes de un paciente para determinar el pronóstico de cáncer es a través del uso de un programa de análisis de riesgo Cox. El análisis se puede realizar utilizando el software S-Plus (comercialmente disponible de Insightful Corporation, www.insightful.com). Al utilizar métodos de este tipo, un perfil de expresión de genes se compara con un perfil que representa con seguridad la recaída (es decir, los niveles de expresión para la combinación de genes en el perfil es indicativa de la recaída). El modelo de riesgo de Cox con el umbral establecido se utiliza para comparar la similitud de los dos perfiles (recaída conocida frente a paciente) y luego determina si el perfil del paciente excede del umbral. Si lo hace, entonces el paciente se clasifica como alguien que recaerá y se le acuerda tratamiento tal como terapia adyuvante. Si el perfil del paciente no excede del umbral, entonces estos se clasifican como un paciente de no recaída. Otras herramientas analíticas también se pueden utilizar para responder la misma cuestión tales como análisis discriminativo lineal, regresión logística y enfoques de red neuronales. Véase, p. ej., el software disponible de JMP statistical software (www.jmp.com).

Están disponibles numerosos otros métodos bien conocidos del reconocimiento de modelos. Las siguientes referencias proporcionan algunos ejemplos:

Votación ponderada: Golub, T R., Slonim, D K., Tamaya, P., Huard, C., Gaasenbeek, M., Mesirov, J P., Coller, H., Loh, L., Downing, J R, Caligiuri, M A., Bloomfield, C D., Lander, E S. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science 286:531-537, 1999.

Máquinas de vectores de apoyo: Su, A I., Welsh, J B., Sapinoso, L M., Kern, S G., Dimitrov, P., Lapp, H., Schultz, P G., Powell, S M., Moskaluk, C A., Frierson, H F. Jr., Hampton, G M. Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Research 61:7388-93, 2001. Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, C H., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, J P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, E S., Gould, T R. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98:15149-15154, 2001.

Vecinos más próximos a K: Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, C H., Angelo, M., Ladd, C., Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, J P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, E S., Gould, T R. Multiclass cancer diagnosis using tumor gene expression signatures Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98:15149-15154, 2001.

Coeficientes de correlación: van’t Veer L J, Dai H, van de Vijver M J, He Y D, Hart A, Mao M, Peterse H L, van der Kooy K, Marton M J, Witteveen A T, Schreiber G J, Kerkhoven R M, Roberts C, Linsley P S, Bernards R, Friend S H. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer, Nature. Enero de 2002 31; 415(6871):530-6.

El análisis de expresión de genes identifica un perfil de expresión de genes (GEP) único para las muestras de cáncer, es decir, los genes que son diferencialmente expresados por las células cancerígenas. Este GEP se valida luego, por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), que se puede llevar a cabo utilizando instrumentos y reactivos comercialmente disponibles, tales como los disponibles de Applied Biosystems (www.appliedbiosystems.com).

En el presente caso, los resultados de los análisis de la expresión de genes demostraron que en pacientes de cáncer de NSCLC, quienes respondían al tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK, los genes que codifican p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP están supra-regulados (sobre-expresados) y los genes que codifican fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfoIGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2/ErbB2 están sub-regulados (sub-expresados) en pacientes que son respondedores a inhibidores de EGFR-TK, en comparación con la expresión de estos genes en muestras de tejido de pulmón normal procedentes de estos pacientes, y procedentes de los pacientes control negativos, es decir, las muestras de tejido de pacientes que habían experimentado una recurrencia de su cáncer después de tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK. Los genes de referencia utilizados en la presente memoria descriptiva, ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0 y TRFC estaban todos supra-regulados.

Determinación de los perfiles de expresión de proteínas

No todos los genes expresados por una célula son traducidos en proteínas y, por lo tanto, una vez que se ha identificado un GEP, es deseable confirmar si las proteínas que corresponden a alguno o a todos los genes diferencialmente expresados en el GEP son también diferencialmente expresadas por parte de las mismas células o tejido. Por lo tanto, se generan perfiles de expresión de proteínas (PEPs) procedentes de los mismos tejidos cancerígenos y de control utilizados para identificar los GEPs. Los PEPs también se utilizan para validar el GEP en otros pacientes de cáncer de colon.

El método preferido para generar PEPs de acuerdo con la presente memoria descriptiva es mediante análisis de inmunohistoquímica (IHC – siglas en inglés). En este método, se utilizan anticuerpos específicos para las proteínas en el PEP para interrogar muestras de tejido procedentes de pacientes de cáncer. Se conocen otros métodos para identificar PEPs, p. ej. hibridación in situ (ISH – siglas en inglés) utilizando sondas de ácidos nucleicos específicos para proteínas. Véase, p. ej. Hofer et al., Clin. Can. Res., 11(16):5722 (2005); Volm et al., Clin. Exp. Metas.,

19(5) :385 (2002). También podría utilizarse cualquiera de estos métodos alternativos.

En el presente caso, muestras de tejido tumoral y de tejido normal se obtuvieron de pacientes que padecían NSCLC y que habían sido sometidos a tratamiento con éxito con gefitinib o con 5-FU, docetaxal o cisplatino, estas son las mismas muestras que las utilizadas para identificar el GEP. Las muestras de tejido se dispusieron ordenadamente en microdisposiciones ordenadas de tejidos (TMAs – siglas en inglés) para permitir el análisis simultáneo. Las TMAs consisten en sustratos tales como portaobjetos de vidrio, sobre los cuales se reúnen de una forma en disposición ordenada hasta aproximadamente 1000 muestras de tejido separadas para permitir el análisis histológico simultáneo. Las muestras de tejido pueden comprender tejido obtenido de muestras de biopsia conservadas, p. ej. tejidos embebidos en parafina o congelados. Técnicas para producir microdisposiciones ordenadas de tejido son bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej. Simon et al., BioTechniques, 36(1):98-105 (2004); Kallioniemi et al., documento WO 99/44062 ; Kononen et al., Nat Med., 4 :844-847 (1998). En el presente caso, se utilizó una aguja hueca para separar núcleos de tejido tan pequeños como de 0,6 mm de diámetro de regiones de interés en tejidos embebidos en parafina. Las “regiones de interés” son aquellas que han sido identificadas por un patólogo como que contienen el tejido enfermo o normal deseado. Estos núcleos de tejido se insertaron entonces en un bloque de parafina receptor en un modelo de disposición ordenada espaciada con precisión. Se cortaron secciones de este bloque utilizando un microtomo, montado sobre un portaobjetos de microscopio, y luego se analizaron mediante análisis histológico estándar. Cada uno de los bloques de disposición ordenada se puede cortar en aproximadamente 100 a aproximadamente 500 secciones que pueden ser sometidas a test independientes.

Las TMAs se prepararon utilizando dos muestras de tejido de cada uno de los pacientes: una de tejido tumoral de NSCLC y otra de tejido pulmonar normal. También se prepararon disposiciones ordenadas control; en una realización actualmente preferida, se utilizaron las siguientes TMAs de control: una disposición ordenada que contenía muestras de tejido pulmonar normal procedente de individuos sanos y exentos de cáncer; una disposición ordenada de “controles positivos” que contenían tejidos tumorales procedentes de pacientes de cáncer que padecían cánceres distintos a NSCLC, p. ej. cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de próstata; y una disposición ordenada de “controles negativos” que contenían muestras de tumores procedentes de pacientes de cáncer de NSCLC que habían experimentado recurrencias del cáncer después del tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK – es decir, pacientes que eran “no respondedores” a la terapia.

Proteínas en las muestras de tejidos se pueden analizar interrogando las TMAs utilizando agentes específicos para proteínas tales como anticuerpos o sondas de ácidos nucleicos tales como aptámeros. Para este fin se prefieren anticuerpos debido a su especificidad y disponibilidad. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales, fragmentos de anticuerpos y/o diversos tipos de anticuerpos sintéticos, incluidos anticuerpos quiméricos

o fragmentos de los mismos. Los anticuerpos están comercialmente disponibles de un cierto número de fuentes (p. ej. Abcam (www.abcam.com), Cell Signaling Technology (www.cellsignal.com), Santa Cruz Biotechnology (www.santacruz.com)) o se pueden generar utilizando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Típicamente, los anticuerpos están equipados con marcadores detectables tales como enzimas, cromógenos o puntos cuánticos que permiten detectar a los anticuerpos. Los anticuerpos se pueden conjugar o marcar directamente con un marcador detectable, o indirectamente con un miembro de un par de unión, de los que el otro miembro contiene un marcador detectable. Sistemas de detección para uso con los mismos se describen, por ejemplo, en la página web de Ventana Medical Systems, Inc. (www.ventanamed.com). Los puntos cuánticos son particularmente adecuados como marcadores detectables. El uso de puntos cuánticos se describe, por ejemplo, en las siguientes referencias: Jaiswal et al., Nat. Biotechnol., 21:47-51 (2003); Chan et al., Curr.Opin Biotechnol., 13:4046 (2002); Chan et al., Science, 281:435-446 (1998).

El uso de anticuerpos para identificar proteínas de interés en las células de un tejido, al que se alude como inmunohistoquímica (IHC), está bien establecido. Véase, p. ej. Simon et al., BioTechniques, 36(1):98 (2004); Haedicke et al., BioTechniques, 35(1) : 164 (2003). El ensayo de IHC se puede automatizar utilizando instrumentos comercialmente disponibles tales como los instrumentos Benchmark disponibles de Ventana Medical Systems Inc. (www.ventanamed.com).

En el presente caso, las TMAs se pusieron en contacto con anticuerpos específicos para las proteínas codificadas por los genes identificados en el estudio de expresión de genes como supra- o sub-regulados en pacientes de cáncer de NSCLC quienes eran respondedores a la terapia con un inhibidor de EGFR-TK con el fin de determinar la expresión de estas proteínas en cada uno de los tipos de tejido. Los resultados del ensayo inmunohistoquímico demostraron lo siguiente:

En pacientes de NSCLC que respondían al tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK, las siguientes proteínas estaban supra-reguladas: p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP; y las siguientes proteínas estaban sub-reguladas: fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2, en comparación con una expresión de las proteínas en tejido pulmonar normal procedente de estos pacientes y de tejido pulmonar normal de otros pacientes;

una mayoría de las proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK no estaban supra- ni sub-reguladas en las muestras de tejido control positivo; y

las proteínas respondedoras al inhibidor de EGFR-TK no estaban supra- o sub-reguladas en el tejido control negativo, es decir, las muestras de tejido procedentes de pacientes de NSCLC que habían experimentado una recurrencia de su cáncer después de tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK, específicamente gefitinib (IRESSA®).

Estos resultados demuestran que los presentes perfiles de expresión de proteínas son indicativos de una eficacia terapéutica de erlotinib o gefitinib en aquellos pacientes de NSCLC con tumores consistentes con el perfil de expresión.

Utilizando las técnicas descritas anteriormente, se generaron perfiles de expresión de proteínas y de genes a partir de muestras de pacientes de NSCLC y se identificaron perfiles de expresión únicos de pacientes que respondían a la terapia con erlotinib o gefitinib. En la Tabla 1 anterior se listan quince proteínas identificadas como asociadas con eficacia terapéutica de estos compuestos.

Ensayos

La presente invención comprende métodos para determinar si es probable que un paciente de NSCLC responda a un tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK, incluido erlotinib o gefitinib. De acuerdo con un aspecto, se puede utilizar un ensayo IHC formateado para determinar si un tumor de cáncer de un paciente de NSCLC exhibe el presente GPEP. Los ensayos se pueden formular en kits que incluyen la totalidad o algunos de los materiales necesarios para realizar el análisis, incluidos reactivos (anticuerpos, marcadores detectables, etc.) e instrucciones.

El método de ensayo de la invención comprende poner en contacto una muestra de un tumor de un paciente de NSCLC con un grupo de anticuerpos específicos para la totalidad de las proteínas en el presente GPEP, y determinar la aparición de una supra- o sub-regulación de estas proteínas en las muestras. El uso de TMAs permite que simultáneamente se analicen numerosas muestras, incluidas muestras control.

En una realización preferida, el método comprende poner en contacto una muestra de un tumor procedente de un paciente de NSCLC con un grupo de anticuerpos específicos para la totalidad de las proteínas en el presente GPEP, y determinar la aparición de una supra- o sub-regulación de estas proteínas. La supra-regulación de la totalidad de las siguientes proteínas: p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP; y la sub-regulación de la totalidad de las siguientes proteínas: fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2 son indicativas de la capacidad de respuesta de un paciente a un inhibidor de EGFR-TK tal como erlotinib o gefitinib.

Preferiblemente, el método incluye también detectar y/o cuantificar proteínas control o “proteínas de referencia”. La detección y/o cuantificación de las proteínas de referencia en las muestras normaliza los resultados y, así, proporciona una garantía adicional de que el ensayo está funcionando adecuadamente. En una realización actualmente preferida, se incluyen anticuerpos específicos para una o más de las siguientes proteínas de referencia: ACTB, GAPD, GUSB, RPLP0 y/o TRFC.

La presente memoria descriptiva comprende, además, un kit que contiene reactivos para llevar a cabo un análisis por IHC de muestras de tejido o células procedentes de pacientes de cáncer de NSCLC, incluidos anticuerpos específicos para al menos aproximadamente cuatro de las proteínas en el GPEP y para cualesquiera proteínas de referencia. Los anticuerpos están preferiblemente marcados con medios para detectar la unión de los anticuerpos a las proteínas de interés, p. ej., marcadores detectables. Marcadores detectables preferidos incluyen compuestos fluorescentes o puntos cuánticos, pero se pueden utilizar otros tipos de marcadores detectables. Marcadores detectables para anticuerpos están comercialmente disponibles p. ej., de Ventana Medical Systems, Inc. (www.ventanmed.com).

Métodos inmunohistoquímicos para detectar la expresión de proteínas en muestras de tejido son bien conocidos. Se puede utilizar cualquier método que permita la determinación de la expresión de varias proteínas diferentes. Véase,

p. ej., “Her-2-neu Expression and Progression Toward Androgen Independence in Human Prostate Cancer, “ J. Natl. Cancer Instit., 92(23):1918-25 (2000); Gu et al., “Prostate stem cell antigen (PSCA) expression increases with high gleason score, advanced stage and bone metastasis in prostate cancer, “ Oncogene, 19:1288-96 (2000). Este tipo de métodos se pueden llevar a cabo eficazmente utilizando instrumentos automatizados diseñados para el análisis inmunohistoquímico (IHC). Instrumentos para llevar a cabo rápidamente dichos ensayos están comercialmente disponibles, p. ej, de Ventana Molecular Discovery Systems (www.ventanadiscovery.com) o Lab Vision Corporation (www.labvision.com). Métodos de acuerdo con la presente invención que utilizan este tipo de instrumentos se llevan a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5 Anticuerpos específicos para proteínas para uso en este tipo de métodos o ensayos están disponibles fácilmente o pueden prepararse utilizando técnicas bien establecidas. Anticuerpos específicos para las proteínas en el presente GPEP se pueden obtener, por ejemplo, de Cell Signaling Technology, Inc. (www.cellsignal.com) o Santa Cruz Biotechnology, Inc. (www.santacruzbiotechnology.com). Un catálogo completo de anticuerpos comercialmente disponibles se encuentra a disposición en www.abcam.com.

10 La presente invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente Ejemplo no limitante.

EJEMPLO

15 Estudios clínicos

Un ensayo clínico multicentro en los Estados Unidos de América evaluó la tasa de respuesta del tumor de gefinitib (IRESSA®) a dosis de 250 y 500 mg/día en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) avanzado, cuya enfermedad había progresado después de al menos dos regímenes de quimioterapia anteriores que

20 incluían un fármaco de platino y docetaxel. IRESSA® fue ingerida una vez al día a aproximadamente la misma hora cada día.

Doscientos sesenta pacientes recibieron IRESSA®; 102 (47%) recibieron una dosis de 250 mg y 114 (53%) recibieron una dosis diaria de 500 mg. En la Tabla A se resumen la demografía de pacientes del estudio y las

25 características de la enfermedad.

Tabla A

Números de muestras de pacientes

Tratamiento

102 pacientes (47%)

250 mg de Iressa

114 pacientes (53%)

500 mg de Iressa

142 pacientes

terapias con platino y docetaxel

142 pacientes

progreso positivo de la enfermedad

30 Cuarenta y un por ciento de los pacientes habían recibido dos regímenes de tratamiento previo, 33% habían recibido tres regímenes de tratamiento previo y 25% había recibido cuatro o más regímenes de tratamiento previo. La eficacia de IRESSA® como terapia de tercera línea se determinó en los 142 pacientes evaluables con el progreso de la enfermedad documentado en terapias con platino y docetaxel o quienes habían tenido una toxicidad inaceptable con estos agentes.

35 Microdisposiciones ordenadas de tejidos

Muestras de tejidos obtenidas de los pacientes de NSCLC en el estudio clínico se obtuvieron y utilizaron para preparar microdisposiciones ordenadas de tejidos (TMAs); otras TMAs se prepararon como controles. Las TMAs

40 utilizadas en este estudio se describen en la Tabla B:

Tabla B Microdisposiciones ordenadas de tejidos Las TMAs se construyeron de acuerdo con el siguiente proceso:

Disposición ordenada de rastreo normal

Esta disposición ordenada contenía muestras de tejido pulmonar normal (no canceroso) procedente de 200 pacientes (2 muestras por paciente)

EGFR para tratamiento de los pulmones

Esta disposición ordenada contenía 500 muestras de pacientes obtenidas de los pacientes de NSCLC quienes habían sido tratados con IRESSA®: 250 muestras de tumores y 250 muestras de tejido pulmonar normal porcedentes de los mismos pacientes.

Disposición ordenada de supervivencia de rastreo de cáncer

Disposición ordenada de control positiva. Esta disposición ordenada contenía 200 muestras de tumores para cánceres distintos de cáncer de pulmón: 50 cáncer de mama, 50 cáncer de colon, 50 cáncer de próstata y 50 cáncer de pulmón.

Progreso del pulmón

Disposición ordenada de control negativa. Esta

disposición ordenada contenía muestras de los pacientes de NSCLC quienes progresaron a la

siguiente fase del cáncer de pulmón o experimentaron una recurrencia de NSCLC después de tratamiento

con gefitinib (IRESSA®).

Núcleos de tejido procedente de un bloque de donantes que contenían las muestras de tejido de los pacientes se

5 insertaron en un bloque de parafina del receptor. Estos núcleos de tejidos se perforan con una broca afilada de paredes delgadas. Una guía de precisión X-Y permitió la colocación ordenada de estas muestras de tejido en un formado de disposición ordenada.

Presentación: Secciones de TMA se cortaron con espesores de 4 micras y se montaron en micro-portaobjetos de

10 vidrio cargados positivamente. Los elementos individuales tenían un diámetro de 0,6 mm y estaban separados 0,2 mm.

Elementos: Además de TMAs que contenían las muestras de NSCLC, se produjeron disposiciones ordenadas de rastreo constituidas por muestras de tejido de cánceres pancreáticos, linfoma, cáncer de cabeza y cuello, cánceres

15 de mama y cánceres de colon, cada 2 de un paciente diferente. Para fines de control de calidad se incluyeron muestras de tejido normal adicionales.

Especificidad: Las TMAs se diseñaron para uso con los métodos de tinción especializada e inmunohistoquímicos descritos más abajo para fines de rastreo de la expresión de genes utilizando anticuerpos monoclonales y

20 policlonales a lo largo de una amplia gama de tipos de tejidos caracterizados.

Acompañando a cada disposición ordenada se encontraba un mapa localizador de disposiciones ordenadas y una hoja de cálculo que contenía el diagnóstico del paciente, datos histológicos y demográficos para cada uno de los elementos.

25 Tinción inmunohistoquímica

Se utilizaron técnicas de tinción inmunohistoquímica para la visualización de proteínas (células) de tejidos presentes en las muestras de tejidos. Estas técnicas se basaron en la inmunorreactividad de anticuerpos y en las propiedades

30 químicas de enzimas o complejos enzimáticos que reaccionan con cromógenos de sustrato incoloros para producir un producto final coloreado. Manchas inmunoenzimáticas iniciales utilizaban el método directo, el cual conjugaba directamente a un anticuerpo con especificidad antigénica conocida (anticuerpo primario).

Se empleó una técnica de avidina-biotina marcada modificada, en la que un anticuerpo secundario biotinilado

35 formaba un complejo con moléculas de estreptavidina conjugadas con peroxidasa. La actividad de peroxidasa endógena se mitigó mediante la adición de peróxido de hidrógeno al 3%. Las probetas se incubaron después con los anticuerpos primarios, seguido de incubaciones secuenciales con el anticuerpo de enlace secundario biotinilado (que contiene inmunoglobulinas anti-conejo o anti-ratón) y estreptavidina marcada con peroxidasa. El anticuerpo primario, el anticuerpo secundario y el complejo avidina-enzima se visualizan después utilizando un cromógeno del sustrato

40 que produce un pigmento pardo en el lugar del antígeno que es visible mediante microscopía óptica. La Tabla C muestra los anticuerpos utilizados en este ejemplo.

TABLA C

Anticuerpo

CST nº

Fosfo-p70S6

CST nº 9206

P70S6 quinasa total

CST nº 9202

Fosfo-S6

CST nº 2211

Fosfo-AKT

CST nº 3787

Fosfo-mTOR

CST nº 2971

Fosfo-pTEN

CST nº 9554

Fosfo MEK

CST nº 9121

Fosfo MAPK

CST nº 9106

Fosfo-IGFR/InR

CST nº 3021

EGFR total

CST nº 2232

Fosfo-EGFR

CST nº 2234

Fosfo-HER2(ErbB2)

CST nº 2241

Fosfo-AR

SC nº 26406-R

AIK

CST nº 4718

Fosfo-ER

CST nº 2511

CST se refiere a Cell Signaling Technology, Inc. SC se refiere a Santa Cruz Biotechnology, Inc.

5 Proceso de tinción inmunohistoquímica (IHC) automatizado:

1. La recuperación del epítopo inducida por calor (HIER) utilizando disolución de tampón citrato 10 mM, pH 6,0, se realizó como sigue:

10 a. Secciones desparafinadas y rehidratadas se colocaron en un bastidor para la tinción de portaobjetos.

b.

El bastidor se colocó en una estufa a presión que funcionaba con microondas; para cubrir los portaobjetos se añadieron 750 ml de tampón citrato 10 mM, pH 6,0.

c.

La estufa a presión cubierta se colocó en el microondas en elevada potencia durante 15 minutos.

15 d. La estufa a presión se retiró del microondas y se enfrió hasta que el indicador de la presión había caído y la tapa podía ser retirada con seguridad.

e. Se dejó que los portaobjetos se enfriaran hasta la temperatura ambiente y se llevó a cabo una tinción inmunohistoquímica.

20 2. Los portaobjetos se trataron con H2O2 al 3% durante 10 min a TA para mitigar la actividad de peroxidasa endógena.

3. Los portaobjetos se aclararon suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS – siglas en

inglés). 25

4. Los anticuerpos primarios se aplicaron a la dilución predeterminada (de acuerdo con las especificaciones de Cell Signaling Technology) durante 30 min a la temperatura ambiente. Suero normal de ratón o conejo en la dilución

1:750 se aplicó a portaobjetos control negativos.

30 5. Los portaobjetos se aclararon con solución salina tamponada con fosfato (PBS).

6. Anticuerpos de enlace biotinilados secundarios* se aplicaron durante 30 min a la temperatura ambiente.

7.

Los portaobjetos se aclararon con solución salina tamponada con fosfato (PBS). 35

8. Los portaobjetos se trataron estreptavidina-HRP (estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano picante)** durante 30 min a la temperatura ambiente.

9.

Los portaobjetos se aclararon con solución salina tamponada con fosfato (PBS). 40

10. Los portaobjetos se trataron con sustrato/cromógeno*** durante 10 min a la temperatura ambiente.

11.

Los portaobjetos se aclararon con agua destilada. 45 12. Una contratinción en hematoxilina se aplicó durante 1 min.

13. Los portaobjetos se lavaron en agua corriente durante 2 min.

14.

Los portaobjetos se deshidrataron después, se aclararon y se montó el cubreobjetos. 50

* Anticuerpo secundario: inmunoglobulinas anti-pollo y anti-ratón biotiniladas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía proteína soporte y azida de sodio 15 mM.

** Estreptavidina-HRP en PBS que contenía proteína soporte y agentes antimicrobianos procedentes de Ventana,

*** Sustrato-cromógeno en tampón sustrato-imidazol-HCl pH 7,5 que contenía H2O2 y agentes antimicrobianos, DAB-3,3’-diaminobenzidina en disolución cromógena procedente de Ventana.

Notas experimentales:

Todos los anticuerpos primarios se titularon a diluciones de acuerdo con las especificaciones del fabricante. La tinción de portaobjetos de disposiciones ordenadas de ensayo TE30 (descritos más abajo) se realizó con y sin la recuperación del epítopo (HIER). Los portaobjetos se rastrearon por parte de un patólogo para determinar la dilución de funcionamiento óptima. El tratamiento previo con HIER proporcionó una fuerte tinción específica con un pequeño fondo o sin fondo. La tinción inmunohistoquímica anterior se llevó a cabo utilizando un instrumento Benchmark de Ventana Medical Systems, Inc.

Criterios de puntuación:

La tinción se puntuó en una escala de 0-3+ con 0 = sin tinción y siendo traza (tr) menor que 1+ pero mayor que 0. Los procesos de puntuación se describen en Signoretti et al., J. Nat. Cancer Inst., Vol. 92, Nº.23, p. 1918 (diciembre 2000) y Gu et al., Oncogene, 19, 1288-1296 (2000). Las categorías de 1+ a 3+ representan una intensidad incrementada de tinción, siendo 3+ una tinción parda oscura intensa. Los criterios de puntuación se basaron también en el porcentaje total de tinción 0 = 0%, 1 = menos de 25%, 2 = 25-50% y 3 = mayor que 50%. Se analizaron la positividad en porcentaje y la intensidad de tinción tanto para componentes nucleares como citoplásmicos así como sub-celulares. Las puntuaciones tanto de la intensidad como de porcentaje positivas se multiplicaron para producir un número del 0-9. La tinción 3+ se determinó a partir de la expresión conocida del antígeno procedente del adenocarcionoma de mama y/o células LNCAP de controles positivos.

Controles positivo, negativo y de isotipo emparejados y reproducibilidad:

Controles de tejido positivos se definieron a través de análisis de transferencia Western utilizando los anticuerpos listados en la Tabla C. Este experimento se realizó para confirmar el nivel de expresión de proteínas en cada uno de los controles dados. Los controles negativos se definieron también por el mismo análisis. Los controles positivos consistían en muestras de cáncer de mama, próstata, colon y pulmón.

La expresión positiva se confirmó también utilizando una disposición ordenada Xenograft. Para producir esta disposición ordenada, a ratones SCID se les inyectaron células tumorales derivadas de tumores NSCLC de pacientes que demostraron responder a gefitinib (IRESSA®) y se dejó que los tumores se desarrollaran. Después, a los ratones se les inyectaron 200 mg/kg de IRESSA®, y los ratones fueron vigilados para observar la capacidad de respuesta al fármaco.

Como resultado del tratamiento con IRESSA®, los tumores formados en los ratones SCID se redujeron o eliminaron. Se encontró que los tumores tenían el mismo perfil de expresión de genes que el identificado en pacientes humanos que eran respondedores a una terapia con gefitinib.

Reproducibilidad:

Todas las tandas se agruparon por disposiciones ordenadas de anticuerpos y tejidos que aseguraban que las tandas fueran normalizadas, significando que la totalidad de las disposiciones ordenadas de tejidos se tiñeron bajo las mismas condiciones con el mismo anticuerpo en la misma tanda. También se proporcionó una disposición ordenada de ensayo que contenía treinta muestras control negativas (TE 30) que comprendían tejidos no cancerosos derivados de diferentes órganos (no pulmones). Estas TE 30 se compararon con la tanda de anticuerpos previa y se puntuó de forma correspondiente. La reproducibilidad se comparó y validó.

Resultados:

En muestras de tumores obtenidas de aquellos pacientes de NSCLC que respondían a tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK, gefitinib, se supra-regularon las siguientes proteínas: p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfopTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK; y las siguientes proteínas se sub-regularon: fosfo-p70S6, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR1/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2, y se compararon con una expresión de estas proteínas en tejido de pulmón normal procedentes de estos pacientes y de tejido de pulmón normal procedente de otros pacientes. En contraposición, la mayoría de estas proteínas no se supra- ni sub-regularon en las muestras de tejido control positivas. Estas proteínas tampoco se supra- o sub-regularon en el tejido control negativo, es decir, en las muestras de tejido de pacientes de NSCLC que habían experimentado una recurrencia de su cáncer después de tratamiento con gefitinib. Pacientes de NSCLC con tumores que exhibían los presentes perfiles de expresión de genes y/o proteínas habían sobrevivido durante un período de tiempo mayor después de tratamiento con gefitinib en comparación con pacientes de NSCLC, cuyos tumores no exhibían los presentes perfiles de expresión de genes y/o proteínas.

Estos resultados demuestran que el presente perfil de expresión de las proteínas es indicativo de una eficacia

5 terapéutica de erlotinib o gefitinib en aquellos pacientes de NSCLC con tumores consistentes con el perfil de expresión. Estos datos sustentan un papel potencial para esta firma como un determinante de la actividad de EGFR en células tumorales de NSCLC y una expresión como nuevos biomarcadores para predecir la actividad clínica de los inhibidores de EGFR erlotinib y gefitinib en pacientes de NSCLC.

LISTADO DE SECUENCIAS

5

<110> <120> Nuclea Biomarkers, LLC Muraca, Patrick J. PERFILES DE EXPRESIÓN DE GENES Y PROTE�?NAS ASOCIADOS CON LA EFICACIA TERAPÉUTICA DE INHIBIDORES DE EGFR-TK

10

<130> <150> <151> NUC-003-PCT 60/903.694

15

<160><170> 32 PatentIn versión 3.4

20

<210><211><212> <213> 1 5332 DNA Homo sapiens

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un método para determinar si un paciente al que se le ha diagnosticado cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) es un respondedor a tratamiento con un inhibidor del receptor del factor de crecimiento epidermal-tirosina quinasa (EGFR-TK) que comprende:

   a.

   obtener un perfil de expresión de proteínas de una muestra de tejido de cáncer de pulmón o células procedentes del paciente al que se le ha diagnosticado NSCLC; y

   b.

   determinar el nivel de expresión en el tejido o las células de las siguientes proteínas: p70S6K (SEQ ID NO.17), fosfo-S6 (SEQ ID NO.18), fosfo-AKT (SEQ ID NO. 19), fosfo-mTOR (SEQ ID NO.20), fosfo-pTEN (SEQ ID NO. 21), EGFR (SEQ ID NO. 25), fosfo-ER (SEQ ID NO. 27), fosfo-AR (SEQ ID NO. 28), AIK (SEQ ID NO.29), osteopontina (SEQ ID NO. 30), MMP11 (SEQ ID NO. 31), GFAP (SEQ ID NO. 32), fosfo-p70S6K (SEQ ID NO. 17), fosfo MEK (SEQ ID NO. 22), fosfo MAPK (SEQ ID NO. 23), fosfo-IGFR/InR (SEQ ID NO. 24), fosfo-EGFR (SEQ ID NO. 25) y fosfo-HER2 (ErbB2) (SEQ ID NO. 26);

   c.

   en donde la sobre-expresión en el tejido de cáncer de pulmón o en las células en comparación con la expresión en tejido de pulmón normal o células de p70S6K, fosfo-S6, fosfo-AKT, fosfo-mTOR, fosfo-pTEN, EGFR, fosfo-ER, fosfo-AR, AIK, osteopontina, MMP11 y GFAP; y la sub-expresión en el tejido o células de cáncer de pulmón en comparación con la expresión en tejido o células de pulmón normales de fosfo-p70S6K, fosfo MEK, fosfo MAPK, fosfo-IGFR/InR, fosfo-EGFR y fosfo-HER2 (ErbB2) indica que el paciente responde al tratamiento con un inhibidor de EGFR-TK.

2. 2.- El método de la reivindicación 1, que comprende, además, determinar el nivel de expresión de una proteína de referencia en dicho tejido o células de cáncer de pulmón y en dicho tejido o células de pulmón normal, en donde la proteína de referencia se selecciona del grupo que consiste en: beta-actina (ACTB), gliceraldehído-3-fosfatodeshidrogenasa (GAPD), beta-D-glucoamidasa) (GUSB), proteína ribosomal de carácter ácido GOS (RPLP0) y receptor de transferina (TRFC).
3. 3.- El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que la etapa (b) se realiza utilizando inmunohistoquímica.
4. 4.- El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de EGFR-TK es erlotinib o gefitinib.