PT1509230E - Gefitinib ( iressa ) para o tratamento do cancro - Google Patents

Description

ΡΕ1509230 ι DESCRIÇÃO "GEFITINIB (IRESSA) PARA O TRATAMENTO DO CANCRO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Julga-se que o cancro em seres humanos esteja ligado à actividade de oncogenes endógenos, não virais, e que uma parte significativa destes oncogenes codifique proteina tirosina-cinases. Os inibidores dos receptores tirosina cinase (RTKs) mediados por ligando, em particular, constituem um grupo significativo destes oncogenes, e julga-se que funcionem como "interruptores" para uma rede de comunicação celular coordenada que regula a proliferação normal de células eucariotas. Até à data foram identificados aproximadamente sessenta RTKs; os respectivos percursos de sinalização celular foram estudados em pormenor. Além disso foi observada uma desregulação dos percursos de sinalização do RTK em vários tipos de cancro humano, sugerindo que a terapia de transdução de sinais pode ser uma modalidade terapêutica útil para o tratamento de cancro. Outros estados patológicos nos quais os RTKs desempenham um papel central também podem beneficiar dessa terapia. Um sucesso digno de nota nesta área é o mesilato de imatinib (disponível de Novartis Pharmaceuticals Corporation sob o nome comercial GLEEVEC; doravante "GLEEVEC"); é eficaz no tratamento da leucemia mielóide crónica (CML) positiva para 2 ΡΕ1509230 o cromossoma de Filadélfia (Ph+) pela inibição da translocação do gene de fusão responsável pela tirosina-cinase BCR-ABL.

Um conjunto promissor de alvos para prevenção terapêutica no tratamento de cancro inclui os membros do eixo da HER-cinase. Estes estão frequentemente regulados positivamente em tumores epiteliais sólidos, a título de exemplo, da próstata, pulmão e mama, e estão também regulados positivamente em tumores do tipo glioblastoma. O receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é um membro do eixo das HER-cinase, e tem sido o alvo de eleição para o desenvolvimento de várias terapias de cancro diferentes. Os inibidores das EGFR tirosina-cinases inhibitors (EGFR-TKIs) estão entre estas terapias, uma vez que é requerida a fosforilação reversível de resíduos de tirosina para activação do percurdo do EGFR. Por outras palavras, os EGFR-TKIs bloqueiam um receptor da superfície celular responsável por activar e/ou manter o percurso de sinalização celular que induz o crescimento e a divisão de células tumorais. Especificamente, julga-se que estes inibidores interferem com o domínio EGFR cinase, designado por HER-1. Entre os EGFR-TKIs mais promissores dos encontram-se três séries de compostos: quinazolinas, piridopirimidinas and pirrolopirimidinas.

Dois dos compostos mais avançados em desenvolvimento clinico incluem Gefitinib (composto ZD1839 desenvolvido pela AstraZeneca UK Ltd.; disponível com o 3 ΡΕ1509230 nome comercial IRESSA; doravante "IRESSA") e Erlotinib (composto OSI-774 desenvolvido pela Genentech, Inc. e OSI Pharmaceuticals, Inc.; disponível com o nome comercial TARCEVA; doravante "TARCEVA"); ambos originaram resultados clínicos encorajadores. O tratamento convencional do cancro da próstata com as IRESSA e TARCEVA envolvem a administração oral diária de não mais do que 500 mg dos compostos respectivos. Em Maio, 2003, a IRESSA foi o primeiro destes produtos a atingir o mercado nos Estados Unidos, quando foi aprovado para o tratamento de doentes com cancro do pulmão de células não pequenas. A IRESSA é uma quinazolina activa por via oral que actua inibindo directamente a fosforilação da tirosina-cinase phosphorylation da molécula do EGFR. Ela compete para o sítio de ligação de adenosina-trifosfato (ATP), levando à supressão do eixo da HER-cinase. O mecanismo exacto da resposta da IRESSA não é totalmente compreendido, contudo, estudos sugerem que a presença de EGFR é um pré-requisito necessário à sua acção.

Uma limitação significativa na utilização destes compostos é que os respectivos receptores podem desenvolver resistência aos seus efeitos terapêuticos depois de terem inicialmente respondido à terapia ou eles podem não responder aos EGFR-TKIs em qualquer grau mensurável ab initio. Na realidade, apenas 10-15 por cento dos doentes com cancro do pulmão de células não pequenas avançado respondem aos inibidores da EGFR cinase. Assim, embora os 4 ΡΕ1509230 compostos possam inicialmente exibir propriedades antitumorais fortes, eles tornam-se rapidamente menos potentes ou totalmente ineficazes no tratamento do cancro. Além disso, uma vez que a investigação clinica não elucidou até à data o mecanismo biomolecular ou patológico responsável por esta resistência, aos doentes que apresentavam uma tal resistência até à data eram deixadas poucas alternativas terapêuticas para tratar a sua doença. Para os doentes que desenvolviam resistência, este mecanismo terapêutico potencialmente salvador de vidas não atingia o seu objectivo e aqueles necessitavam desesperadamente de uma terapia activa para o cancro.

Na técnica existe uma necessidade significativa para um tratamento satisfatório do cancro e, especifica-mente, dos cancros do pulmão, ovário, mama, cérebro, cólon e próstata, que incorpore os benefícios da terapia com TKI, ao mesmo tempo que obvia a resistência desenvolvida por muitos doentes em resposta ao tratamento e ultrapassa ainda a falta de reacção apresentada por outros doentes. Um tal tratamento poderia ter um impacto acetuado na saúde dos indivíduos, e em especial dos indivíduos mais idosos, entre os quais o cancro é especialmente comum.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As formas de realização da presente invenção proporcionam uma terapia para o tratamento de indivíduos que desenvolveram resistência à terapia convencional com 5 ΡΕ1509230 TKI ou que lhe são insensíveis ab initio. A invenção proporciona a utilização de Gefitinib (IRESSA) no fabrico de um medicamento para tartar cancro num doente resistente ou insensível à terapia convencional com inibidores da cinase, em que o medicamento compreende uma quantidade superadora da resistência ao TKI de Gefitinib de 500 mg até 3.000 mg, e em que o medicamento é para ser administrado num intervalo de tempo seleccionado do grupo consistindo de uma vez por semana até duas vezes por semana. Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria, julga-se que esta variante de regímen de tratamento bloqueia eficazmente vários membros da família da HER-cinase. A dose corrente de um TKI é eficaz para bloquear a activação do EGFR, mas doses intermitentes, crescentes de um TKI pode bloquear o HER-2, assim como o EGFR; trazendo desse modo benefícios clínicos (í.e., resposta do tumor) a doentes que são insensíveis à posologia diária corrente de um TKI.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS A Figura 1 representa uma comparação gráfica (incluindo o erro padrão matemático) da dosagem bolus (1 g/kg) de um TKI (IRESSA) uma vez por semana relativamente a uma dosagem do mesmo TKI cinco vezes por semana num regímen de dosagem convencional de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Também está graficamente representado um controlo (í.e., sem administração de TKI). Esta experiência foi realizada num modelo de xenoenxerto da próstata independente de androgénio. Foi observada uma 6 ΡΕ1509230 inibição equivalente do crescimento com dosagem diária ou bolus. A dosagem diária foi efectuada à dosagem máxima tolerada em ratinhos. A Figura 2 representa uma comparação gráfica (incluindo o desvio padrão matemático) da dosagem bolus (1 g/kg) de um TKI (IRESSA) uma vez por semana relativamente a uma dosagem do mesmo TKI cinco vezes por semana num regimen de dosagem convencional de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Também está graficamente representado um controlo (í.e., sem administração de TKI) . Esta experiência foi realizada num modelo de xenoenxerto da próstata independente de androgénio. Foi observada uma inibição equivalente do crescimento com dosagem diária ou bolus. A dosagem diária foi efectuada à dosagem máxima tolerada em ratinhos. A Figura 3 representa uma comparação gráfica do volume tumoral do xenoenxerto subcutâneo em animais tratados com um TKI (IRESSA) em contraste com animais de controlo que não receberam terapia de TKI segundo uma forma de realização da presente invenção. Observou-se uma redução de aproximadamente 51% no volume do tumor dependente de androgénios (CWR22) (Fig. 3A) e aproximadamente 66,4% no volume do tumor independente de androgénios (CWR22R) (Fig. 3B) nos animais que receberam terapia de TKI.

A Figura 4A representa um esquema para desenvolver duas linhas tumorais separadas resistentes à IRESSA 7 ΡΕ1509230 (IR) (CWR22R, CWRSA6) por passagem em série de tumores de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 4B retrata uma representação gráfica de uma prova clinica de resistência à IRESSA de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Os tumores IR tratados com IRESSA apresentaram um crescimento semelhante ao dos tumores parentais não tratados. A Figura 5 retrata uma representação gráfica de tumores IR tratados com o anticorpo monoclonal 2C4 (disponível de Genentech, Inc.; doravante "2C4") e que apresentam 81% de inibição do crescimento relativamente a tumores IR que receberam terapia de IRESSA de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Além disso, os tumores tratados com uma combinação de IRESSA e 2C4 originaram uma curva de crescimento tumoral semelhante ao 2C4 sozinho (diferença estatisticamente não significativa). A Figura 6A ilustra a capacidade do EGF para activar a MAPK a níveis equivalentes em tumores sensíveis a IRESSA e tumores IR de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 6B ilustra a inibição de p-MAPK pela IRESSA em células IR estimuladas com TGF-α de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 6C ilustra o efeito directo da IRESSA no p-EGFR de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 7A ilustra que a proteína EGFR total permaneceu inalterada em tumores IR de acordo com uma forma ΡΕ1509230 de realização da presente invenção. A Figura 7B ilustra que os ARNm dos EGFR e HER-2 permaneceram inalterados em tumores IR de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Figura 8 representa uma resposta clinica caso a caso à terapia com TKI (IRESSA) relativamente ao nível de expressão da EMP-1 no doente de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Estes dados são de doentes com cancro pulmonar de células não pequenas tratados com IRESSA; a sua resposta clínica estava correlacionada com o nível de expressão da EMP-1. A probabilidade de resposta à terapia com TKI (IRESSA) foi menor do que 10% em indivíduos cujo nível de expressão da EMP-1 estava acima do limiar (í.e., linha a tracejado) indicado (i.e., o gene foi "detectável" ao nível do ARNm ou das proteínas, como avaliado pela tecnologia TAQMAN). A Figura 9 retrata uma comparação gráfica da probabilidade de resposta à terapia com TKI (IRESSA) em relação ao nível de expressão da EMP-1 no doente de acordo com uma forma de realização da presente invenção. Estes dados são de doentes com cancro do pulmão de células não pequenas tratados com IRESSA; a sua resposta clínica correlacionou com o nível de expressão da EMP-1.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

As terapias com TKI convencionais, tais como IRESSA e TARCEVA, como discutidas acima, são indicadas para 9 ΡΕ1509230 administração a doentes num regímen diário para o tratamento de cancro a dosagens destinadas a bloquear a activação do EGFR. No entanto, também como se discutiu acima, os doentes desenvolvem frequentemente uma resistência a este tratamento. A presente invenção baseia-se na descoberta supreendente pelo inventor que uma quantidade de Gefitinib de 500 mg até 3.000 mg pode ser administrada num intervalo de tempo seleccionado do grupo consistindo de uma vez por semana e duas vezes por semana a doentes resistentes para vencer a sua resistência, ou a doentes que sejam insensíveis à terapia com TKI ab initio para vencer a sua insensibilidade (ambas as indicações estão daqui em diante incluídas no termo "resistente" quando utilizado para descrever indivíduos com cancro). Este esquema de dosagem é surpreendentemente bem tolerado; dosagens crescentes diárias de TKI não são geralmente bem toleradas.

Mais especificamente, os estudos experimentais do inventor demonstraram actividade clínica do TKI Gefitinib nos regímenes de dosagem diários nos seus modelos de xenoenxerto, e estudos moleculares nestes tumores demonstraram uma inibição eficaz da cascata de sinalização do EGFR. Isto confirmou que os modelos de xenoenxerto refletem de modo adequado o comportamento destes TKI como observado noutros sistemas modelo. O inventor também demonstrou surpreendentemente que administrações semanais de IRESSA numa quantidade significativamente superior à dose diária recomendada eram bem toleradas e que podfiam 10 ΡΕ1509230 inibir eficazmente o crescimento de tumores nos modelos de xenoenxerto - até mesmo em tumores que exibem uma resistência à terapia convencional com TKI. Embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria, julga-se que estas doses semanais mais elevadas inibam a HER-2 cinase e o EGFR, ou a HER-1 cinase; enquanto a administração convencional apenas inibe a HER-1 cinase. Uma vez que se julga ainda que é necessário o efeito co-estimulador (i.e., heterodimerização) da HER-2 cinase com um outro membro da família cinase (e.g., HER-1, HER-3 ou HER-4) para estimulação dos percursos de sinalização celular responsáveis pela proliferação celular, acredita-se também que a inibição adicional da HER-2 cinase pelo regímen de dosagem diferente da presente invenção seja eficaz na inibição ou regulação negativa desta sinalização celular. Além do mais, até mesmo aqueles doentes que sejam resistentes à terapia convencional com TKI (a qual afecta apenas o HER-1) podem obter um efeito antitumoral benéfico porque a HER-2 cinase é simultaneamente inibida. As maiores dosagens da presente invenção podem estar associadas com uma falta de especificidade inibidora, que resulta num bloqueio do estado patológico nos casos em que as outras terapias falharam. Os métodos da presente invenção podem, desse modo, vencer a resistência ou insensibilidade à terapia com TKI actuando de modo diferente aos métodos convencionais ao nível celular e molecular.

Uma maior dosagem uma ou duas vezes por semana pode ser eficaz no tratamento do cancro, e em especial do 11 ΡΕ1509230 cancro do pulmão, mama e próstata, num indivíduo que seja resistente à terapia convencional com TKI. Outras formas de cancro que podem ser tratadas com os métodos da presente invenção incluem, mas não estão de forma alguma limitadas ao cancro gástrico, colorrectal e do ovário, bem como os tumores de tipo glioblastoma. Cada uma destas formas de cancro exibe uma expressão significativa de EGFR, tornando-os alvos adequados para tratamento de acordo com os métodos da presente invenção.

Na presente invenção, o Gefitinib pode ser administrado a um doente que seja resistente à terapia convencional com TKI numa "quantidade superadora da resistência" a qual, para efeitos da presente invenção, é definida como uma quantidade desde cerca de 500 mg até cerca de 3.000 mg, administrada como um "bolus" uma ou duaz vezes por semana. A dosagem específica apropriada de Gefitinib depende da idade e peso do indivíduo a ser tratado, do composto ser utilizado como agente único ou em terapia adjuvante, do tipo de cancro (e.g., se se trata de um adenocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma ductal transitório ou outro cancro da próstata), da progressão do cancro (e.g., se já originou metástases ou está localizado), da(s) natureza(s) do tumor(es) a ser(em) tratado(s) (e.g., tamanho, localização, etc.) e outros factores bem conhecidos dos especialistas na técnica de oncologia. Em geral pode utilizar-se doses não contínuas (í.e., semanalmente ou semi-semanalmente) entre cerca de 500 mg e 3.000 mg; sendo preferidas na maior parte dos 12 ΡΕ1509230 casos doses entre cerca de 1.500 mg e 3.000 mg; sendo ainda mais preferidas doses de cerca de 2.000 mg. A administração de IRESSA a uma dose única de cerca de 2.000 mg por semana pode ser especialmente eficaz. A selecção de uma posologia apropriada pode ser facilmente efectuada por um especialista na técnica.

Funcionalmente, a posologia particular pode ser seleccionada para conseguir pelo menos uma de várias condições biológicas internas. Em primeiro lugar, a dosagem pode ser seleccionada para bloquear a HER-2 cinase, para além ou em vez do bloqueamento da HER-1, ou EGFR, cinase. Em segundo lugar, a dosagem pode ser seleccionada para produzir uma concentração no soro maior do que cerca de 800 μΜ do TKI. Em terceiro lugar, a dosagem pode ser seleccionada para bloquear um receptor cinase para além do EGFR ou HER-2 para produzir uma modalidade de tratamento antineoplásico. Uma dosagem dentro da gama descrita acima pode conseguir pelo menos uma destas condições biológicas; no entanto será facilmente compreendido por um especialista na técnica que nem todas estas condições têm de ser satisfeitas para os métodos da presente invenção serem eficazes no tratamento de cancro.

Pode administrar-se o Gefitinib (IRESSA) por via oral embora eles também possam ser administrados por injecção intravenosa e intramuscular. Numa forma de realização, a IRESSA é administrada por via oral num "bolus" de cerca de 2.000 mg uma vez por semana. 13 ΡΕ1509230

Mais uma vez, embora não se pretenda ficar limitado por qualquer teoria, julga-se ainda que o mecanismo responsável pela resistência possa ser a expressão ou expressão excessiva de EMP-1; observou-se que este gene está mais fortemente expressado em animais resistentes à terapia TKI convencional, como se discute com mais detalhe na secção de Exemplos abaixo. Um indivíduo com um nível de expressão relativamente maior de EMP-1 tem probabilidade de ser resistente ou insensível ou de desenvolver resistência ou insensibilidade à terapia com TKI. Contrariamente, um indivíduo com um nível de expressão de EMP-1 relativamente mais baixo tem menos probabilidade de ser resistente ou insensível ou de desenvolver uma resistência ou insensibilidade à terapia com TKI. Isto está graficamente ilustrado na Fig. 9; embora os dados ali apresentados se refiram à expressão de ARN em tumores de doentes com cancro do pulmão aos quais foi administrada IRESSA e cuja resposta estava correlacionada com o nível de expressão de EMP-1. Os indivíduos com probabilidade de serem resistentes ou insensíveis à terapia com TKI podem ser candidatos particularmente bons para administração da quantidade superadora da resistência da terapia com TKI uma ou duas vezes por semana, como se descreveu acima. Em particular, os indivíduos com um nível de expressão quantificável de EMP-1 (í.e., o gene é "detectável" ou está "ligado") têm uma probobilidade inferior a 10% de responder à terapia com TKI (Fig. 8). 14 ΡΕ1509230

Para avaliar o nível de expressão de EMP-1 de um indivíduo pode utilizar-se qualquer método convencional conhecido dos especialistas na técnica. A título de exemplo, pode utilizar-se PCR quantitativo de TAQMAN de tecido congelado para investigar a expressão de ARN ou PCR quantitativo de TAQMAN de ARN extraído de blocos de parafina para investigar a expressão de ARN (TAQMAN está disponível de Applied Biosystems; Foster City, CA) . Alternativamente pode utilizar-se imuno-histoquímica de secções de parafina reveladas com anticorpos marcados para a EMP-1 para pesquisar a expressão de proteína. Os procedimentos para utilizar qualquer uma destas metodologias ilustrativas, assim como outras metodologias convencionais que não estão aqui especificamente enumeradas, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e podem ser facilmente implementados sem experiências excessivas.

EXEMPLOS

Os Exemplos seguintes mostram que os animais podem desenvolver uma resistência à terapia convencional com TKI, mas que uma posologia diferente de Gefitinib pode vencer esta resistência. Em particular, uma quantidade superadora da resistência do TKI Gefitinib administrada uma ou duas vezes por semana pode ser eficaz para vencer a resistência e tratar o estado patológico subjacente. Isto está graficamente representado nas Fig. 1 e 2, cada uma das quais ilustra uma comparação da medicação com 100 mg/kg de 15 ΡΕ1509230 IRESSA cinco vezes por semana em relação a uma medicação "bolus" semanal com 1 g/kg de IRESSA uma vez por semana (a Fig. 1 inclui o erro padrão e a Fig. 2 inclui a informação do desvio padrão).

Os Exemplos demonstram a eficácia dos métodos da presente invenção relativamente a xenoenxertos de cancro da próstata independentes de androgénios, embora tenham sido realizadas experiências semelhantes em relação aos modelos de xenoenxertos de cancro da mama, cancro do ovário e cancro do pulmão. EXEMPLO 1

Preparação de Xenoenxertos de Cancro da Próstata A IRESSA tem como alvo o eixo da HER-cinase ao competir para o sítio de ligação do ATP na molécula de EGFR, como se descreveu acima. Foi anteriormente demonstrada a inibição do crescimento de xenoenxertos de cancros epiteliais, incluindo de tumores da próstata. Para validar aquelas observação, e também para confirmar um modelo de trabalho de tratamento com a IRESSA, ratinhos glabros atimicos com 8-10 semanas de idade portadores de xenoenxertos de tumores dependentes de androgénios (CWR22) ou independentes de androgénios (CWR22R) foram administrados com um tratamento oral diário de IRESSA a uma dose de 100 mg/kg durante três semanas. Observou-se uma redução significativa nos volumes tumorais (Fig. 1 e 2) para os modelos de CWR22 (cerca de 50%) e CWR22R (cerca de 66,4%); 16 ΡΕ1509230 validabdo desse modo a eficácia da IRESSA no cancro da próstata independente de androgénios.

Avaliou-se secções embebidas em parafina dos tumores tratados com IRESSA para uma diminuição na proliferação celular e/ou um aumento na apoptose celular (dados não apresentados), uma vez que estes foram anteriormente descritos como resultados possíveis do tratamento com IRESSA. Não se observou nenhuma diferença dramática entre controlos tratados e não tratados em qualquer um dos dois ensaios, embora houvesse uma diminuição estatisticamente significativa no volume do tumor após tratamento com IRESSA. Isto pode ter sido devido ao facto da diminuição de 50-70% no volume do tumor neste modelo ser o resultado liquido tanto da velocidade de proliferação celular como na apoptose a ocorrerem em simultâneo. No entanto, ao nível molecular, a IRESSA provocou uma inibição acentuada da fosforilação do EGFR e da fosforilação subsequente da ERK-1/2, como esperado. EXEMPLO 2

Desenvolvimento de um Modelo Resistente à IRESSA in vivo

Tendo-se identificado um modelo de cancro da próstata independente de androgénios que é sensível ao tratamento com IRESSA, desenvolveu-se um modelo resistente à IRESSA (IR) correspondente para avaliar os mecanismos de resistência com este fármaco. Isto foi efectuado passando sucessivamente tumores CWR22R tratados com IRESSA em 17 ΡΕ1509230 ratinhos glabros atímicos fêmeas ao longo de doze gerações (Fig. 4A).

Os tumores CWR22R, que receberam em primeiro lugar tratamento com IRESSA no inicio da série, foram designados "geração F0." A geração F0-F3 apresentou sensibilidade à IRESSA após três semanas de tratamento (como avaliado pelas curvas de crescimento do tumor); semelhante aos dos tumores CWR22R nativos. No entanto, pela geração F4, os tumores exibiram crescimento apesar da presença de IRESSA. À geração F8, os tumores foram caracterizados como "resistentes" depois de uma experiência ter demonstrado que a IRESSA era ineficaz na inibição do crescimento do tumor em duas linhas IR independentemente derivadas em relação aos tumores FO parentais (Fig. 4B) . Desenvolveu-se duas linhas IR separadamente derivadas. EXEMPLO 3

Tumores IR e Tumores CWR22R são Sensíveis ao 2C4

Era possível que a passagem sucessiva dos tumores associada à presença contínua de IRESSA tivesse provocado danos irreversíveis ao eixo da HER-cinase (í.e., um percurso EGFR não funcional e daí a resistência observada). Para excluir esta possibilidade como uma razão para a resistência neste modelo, o tumor IR à geração F12 foi tratado com IRESSA (100 mg/kg/dia) ou 2C4 (20 mg/kg/2x/semana). O 2C4 é um anticorpo monoclonal contra o HER-2 que impede a respectiva dimerização com o HER-1, HER-3 ou HER-4, e, consequentemente, inibe o crescimento 18 ΡΕ1509230 tumoral pela eliminação da sinalização mediada por ligando. Extraordinariamente, após um período de tratamento de duas semanas, os tumores IR que receberam 2C4 apresentaram 81% de inibição do crescimento relativamente aos que receberam IRESSA (Fig. 5).

Uma combinação de 2C4 e IRESSA originou uma curva de crescimento semelhante à do 2C4 sozinho, sugerindo que a IRESSA foi incapaz de potenciar o efeito do 2C4. Estes resultados demonstram convincentemente que o eixo da HER-cinase estava ainda em fundionamento neste modelo IR, e que a resistência adquirida à IRESSA não era devida à falta de sinalização via este percurso. Eles também reforçam o paradigma de que a IRESSA e o 2C4 têm como alvo moléculas diferentes no percurso do EGFR. EXEMPLO 4 0 Tumor IR CWR22R tem EGFR Funcional

Para verificar se os xenoenxertos tinham um EGFR funcional (í.e., se o marcador sucedâneo, proteína-cinase activada por mitógenio fosforilado (p-MAPK), poderia ser estimulado com um ligando apropriado), cultivou-se células tumorais (de tumores sensíveis a IRESSA e tumores IR) ex vivo na ausência de factores de crescimento durante 18-24 horas. Tratou-se então com uma curve de dose de IRESSA ou veículo, e estimulou-se com o factor de crescimento epidérmico (EGF) . Como se mostra na Fig. 6A, o EGF foi capaz de activar MAPK até níveis equivalentes em ambos os tipos de tumor, sugerindo que a molécula de EGFR estava 19 ΡΕ1509230 funcional. As doses crescentes de IRESSA suprimiram a MAPK estimulada por ligando aos 100-1000 nM em células provenientes do modelo sensível CWR22R. Surpreendentemente, as células IR ex vivo seguiram o mesmo padrão de inibição da MAPK que as células sensíveis; corroborando desse modo que o percurso EGFR estava intacto no modelo IR; que a IC50 para inibição da p-MAPK não tinha aumentado na linha resistente; e que a resistência não levou a uma activação constitutiva deste mecanismo de sinalização. A inibição da p-MAPK pela IRESSA em células IR também foi evidente nas células estimuladas pelo factor de crescimento-α (TGF-a) (Fig. 6B) ; um outro ligando para o EGFR. Utilizou-se uma linha celular proveniente do xenoenxerto CWR22R, 22Rvl, como um controlo.

Também foi avaliado o efeito directo da IRESSA no EGFR fosforilado (p-EGFR). Este foi realizado primeiramente em células 22Rvl (Fig. 6C) . O p-EGFR estava claramente regulado positivamente após estimulação pelo EGF, e este efeito podia ser completamente bloqueado com IRESSA 10 nM (IC50 para o EGFR é < 0,015-0,05 μΜ) . EXEMPLO 5 A Resistência à Iressa Não é o Resultado da Aplificação ou Regulação Positiva do Gene Alvo do Mutante EGFRvIII Constitutivamente Activo A expressão excessiva do EGFR em malignidades humanas tem sido objecto de muitos estudos, nos quais se 20 ΡΕ1509230 tem tornado cada vez mais evidente que a amplificação do EGFR pode ser importante no que se refere aos efeitos oncogénicos; foi demonstrado que estas alterações correlacionam com um diagnóstico mau. Além disso, a amplificação de genes alvo é frequentemente utilizada como um mecanismo para produzir resistência ao fármaco em células neoplásicas (Goker et al., Blood, vol. 86:677-684 (1995)). Por exemplo, a expressão excessiva de BCR-ABL devido à amplificação do gene foi sugerida como um dos mecanismos para resistência ao GLEEVEC (Vários Autores, Science: Technical Comments, vol. 293:2163a (2001)). Estas observações levaram de imediato o autor a questionar-se se ocorria a expressão excessiva de EGFR na linha IR. A proteína total de EGFR permaneceu inalterada nos tumores IR, como se mostra na Fig. 7A. O ARNm do EGFR (HER-1) e o ARNm do HER-2 (o alvo secundário para a IRESSA), também permaneceram inalterados como se determinou pela análise de reacção em cadeia da polimerase de transcrição inversa quantitativa em tempo real (RT-PCR) (Fig. 7B) .

Uma vez que se observaram níveis semelhantes dos ARNm dos receptores nas duas linhas, foi excluída a possibilidade de amplificação do gene EGFR (HER-1) ou HER-2 no modelo IR. Também se examinou os níveis de expressão de outros membros do eixo HER-cinase, nomeadamente, HER-3, HER-4, EGF, TGF-α e heregulina (HRG). Eles foram equivalentes nas linhas sensível e resistente (dados não apresentados) . 21 ΡΕ1509230

Outra possibilidade para o mecanismo de resistência pode ter sido a regulação positiva da variante EGFR da classe III constitutivamente activa, EGFRvlll. O EGFRvIII carece de 267 aminoácido no seu domínio extracelular e foi descrito em carcinomas do tipo glioblastoma multiforme, mama, ovário, próstata e do pulmão. A probabilidade desta molécula estar regulada positivamente no modelo IR era pequena, porque não existe nenhuma evidência para a regulação do EGFRvIII pelo EGF e TGF-α. No entanto, as células ex vivo provenientes da linha IR demonstraram claramente estimulação pelo ligando ao nível molecular (Fig. 6A) . Não obstante não se observou nenhuma diferença na expressão de EGFRvIII entre os tumores sensíveis e IR através da análise por PCR de TAQMAN (dados não apresentados). EXEMPLO 6

Resistência à Iressa e MDR1

Os transportadores multifármaco principais, MDRl e MRPl, estão envolvidos na resistência ao fármaco no cancro através da expulsão de uma grande variedade de compostos hidrófobos. Avaliou-se a expressão excessiva de MDRl na linha IR tanto ao nível do ARNm como ao nível da proteína. A expressão de MDRl no tumor IR foi equivalente à do tumor sensível. Obteve-se resultados semelhantes quando se analisou o MDRl em células ex vivo provenientes dos respectivos tumores. No modelo do xenoenxerto, as células 22 ΡΕ1509230 IR foram ainda capazes de responder ao EGF, como se determinou pela estimulação da MAPK; apoiando ainda mais a ausência de expressão excessiva de MDRl. O facto deste efeito poder ser suprimido pela IRESSA a uma concentração equivalente à das células sensíveis argumenta contra a presença de uma bomba de efluxo de fármaco nas células resistentes. EXEMPLO 7 A Resistência Não é uma Consequência de Mutações na Região de Ligação de ATP nos Domínios Tirosina-cinase do EGFR e HER-2 O mecanismo de resistência de GLEEVEC tem sido objecto de muitos estudos nos últimos anos. Embora se pense que o necanismo de resistência possa ser multifactorial, um componente do mecanismo de resistência foi descrito como uma mutação pontual (T3151) na bolsa de ligação do ATP do seu gene alvo, BCR-ABL (Shah et al., Câncer Cell, vol. 2(2):117-25 (2002)). Esta mutação foi inicialmente descrita em doentes CML que tinham doença insubmissa ao GLEEVEC ou quer tinham uma recaída durante o tratamento (Roumiantsev et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 99(16):10700-05 (2002) ) .

Uma vez que a IRESSA também é um inibidor competitivo dos sitios de ligação do ATP nos domínios tirosina-cinase dos EGFR e HER-2 (IC50 para o EGFR é < 0,015-0,05 μΜ 23 ΡΕ1509230 e IC50 para o HER-2 é 1,2-3,7 μΜ), foi colocada a hipótese de que a resistência poderia ser devida a mutações na região cinase dos receptores alvo necessários para ligação da IRESSA e, desse modo, à inibição. Os domínios tirosina-cinase dos HER-2 e EGFR foram sequenciados utilizando os iniciadores de sequenciação definidos no Quadro 1.

Quadro 1: Iniciadores de Sequenciação

CAGCAGAAGATCCGGAAG iniciador directo para a extremidade 51 do gene do HER-2 AGCCCGAAGTCTGTAATTT iniciador inverso para a extremidade 5' do gene do HER-2 GTGCTGAACTGGTGTATG iniciador directo para a extremidade 31 do gene do HER-2 TCCAGCAGTGAGCGGTAG iniciador inverso para a extremidade 3' do gene do HER-2 CCAAGCTCTCTTGAGGATC iniciador directo para a extremidade 5' do gene do EGFR AAGCGACGGTCCTCCAAG iniciador inverso para a extremidade 5' do gene do EGFR CTGGACTATGTCGGGGAA iniciador directo para a extremidade 3' do gene do EGFR GGCCATTTTGGAGAATTCG iniciador inverso para a extremidade 3' do gene do EGFR

Estas regiões também incluem os sítios de ligação de ATP para os respectivos receptores. A análise dos dados de sequência para os tumores F0-F9 não identificaram quaisquer mutações consistentes nos tumores resistentes; excluindo assim a possibilidade de quaisquer mutações na região cinase que contribuam para o mecanismo de resistência. Os domínios catalíticos de tirosina-cinase dos tumores resistentes também foram subclonados em vectores de clonagem TOPO (disponíveis de Invitrogen Corporation; Carlsbad, CA.) e ressequenciados para confirmar a ausência de mutações. 24 ΡΕ1509230 EXEMPLO 8

Os Perfis de Expressão Génica de Tumores IR Revelam EMP-1

Analisou-se os perfis de expressão génica de tumores IR através da análise de gene em chip, utilizando as matrizes de genes descritas em Alon et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 96(12):6745-50 (1999). Analisou-se em chip tumores nativos e tumores da geração F8 de ambas as linhas IR assim como tumores nativos tratados com IRESSA durante 12 horas. Após análise estatística, identificou-se 96 genes nos tumores IR que soifreram uma alteração superior a 20 vezes relativamente aos tumores nativos (dados não apresentados). Foi demonstrada uma correlação forte entre a ausência de resposta clínica à IRESSA e a presença de ARN de EMP-1 (Fig. 8). Avaliou-se a presença de ARN de EMP-1 com TAQMAN a partir de amostras de parafina. Além disso, a probabilidade de um indivíduo responder à terapia com TKI diminui à medida que aumenta o nível de expressão da EMP-1 (Fig. 9).

Lisboa, 1 de Março de 2007

Claims (8)

1. ΡΕ1509230 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de Gefitinib (IRESSA) no fabrico de um medicamento para tratar cancro num doente resistente ou insensível à terapia convencional com inibidores da ci-nase, em que o medicamento compreende uma quantidade supe-radora da resistência ao TKI de Gefitinib de 500 mg até 3.000 mg, e em que o medicamento é para ser administrado num intervalo de tempo seleccionado do grupo consistindo de uma vez por semana e duas vezes por semana.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento é para tratar a sinalização da HER-2 cinase no cancro.
3. 3. Utilização de acordo com qualquer reivindicação 1, em que a quantidade superadora da resistência do inibidor da cinase é uma quantidade suficiente para bloquear a HER-2 cinase num doente.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que quantidade superadora da resistência do inibidor é desde 1.500 mg até 3.000 mg de Gefitinib.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade superadora da resistência do inibidor é de cerca de 2.000 mg de Gefitinib. 2 ΡΕ1509230
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade superadora da resistência de Gefitinib é uma quantidade suficiente para produzir uma concentração no soro de pelo menos 800 μΜ num doente.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o Gefitinib é para administração por via oral, por injecção intravenosa ou por injecção intramuscular.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é um tipo de cancro seleccionado do grupo consistindo de cancro da próstata, cancro do pulmão, cancro da mama, cancro gástrico, cancro colorrectal, cancro do pâncreas, cancro do ovário e um tumor de tipo glioblastoma. Lisboa, 1 de Março de 2007