KR20190142775A - 조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포 - Google Patents

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KR20190142775A
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immune cell
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케이티 레즈바니
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Abstract

항원 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체 및 T 세포 수용체를 발현하는 면역 세포가 본원에 제공된다. 항원 특이적 면역 세포를 투여하는 것에 의해 면역 관련 장애를 치료하는 방법이 본원에 더 제공된다.

Description

조작된 항원 수용체를 발현하는 면역 세포
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 4월 19일에 제출한 미국 특허 가출원 번호 제62/487,248호의 우선권을 주장하며, 두 출원의 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록의 포함
2018년 4월 18일에 생성되고, (마이크로소프트 윈도우에서 측정된) 2KB 크기의 파일명 “UTFCP1321WO_ST25.txt”에 포함된 서열 목록은 본 출원서와 함께 전자 제출되었고 본원에 참조로서 포함된다.
기술 분야
본 발명은 대체로 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 동일한 세포 유형 내에서 키메라 항원 수용체 및 T 세포 수용체와 같은 항원 수용체를 발현하는 면역 세포에 관한 것이다.
암으로 진단받은 환자가 이용할 수 있는 진단 및 치료 방법의 기술적 진보에도 불구하고, 여전히 예후가 좋지 않고 많은 환자들이 치유될 수 없는 상황이다. 면역요법은 여러가지 종양으로 진단된 환자들에게, 정상 조직에 해를 끼치지 않으면서 악성 종양 세포를 제거할 수 있는 강력하지만 표적화된 치료를 제공해줄 가능성을 갖는다. 이론상, 면역 체계의 T 세포는 종양 세포의 특이적인 단백질 패턴을 인식할 수 있고 다양한 효과기 메커니즘을 통해 종양 세포의 파괴를 매개하여 이루어낼 수 있다. 입양 T 세포 요법(adoptive T cell therapy)은 환자 자신의 T 세포의 종양 제거 능력을 이용하여 증폭시켜서, 효과적으로 남은 종양을 제거하되, 건강한 조직에는 해를 끼치지 않는 상태에서 환자에게 이들 효과기를 다시 주입하는 방식을 시도한다. 이 접근법이 종양 면역학 분야에서 새로운 것은 아니지만, 입양 T 세포 요법의 임상적 사용에서의 많은 문제점들이 암 치료에 있어서 이 요법의 완전한 사용을 저해한다.
자기유래 또는 인간 백혈구 항원(HLA)-일치(matched) 동종이계 공여자 세포를 이용하는 세포 요법은 암을 비롯한 많은 질환 유형에 그리고 재생 의학에 있어서 유망한 치료법이다. 많은 그룹이 고친화도 인공 TCR을 발현하도록 T 세포를 조작함으로써 T 세포의 항원 특이성을 전용하는 전략을 연구해왔다. 하지만, 추가 TCR 쇄의 T 세포로의 도입은 내인성 도입 TCR 쇄들 간의 혼합된 이량체를 형성하게 하고, 이는 미지의 특이성 및 독성을 가진 T 세포를 생성할 가능성이 있다. 이로 인해 이 전략의 임상으로의 이행은 상당히 제한되어 왔다. 따라서, 종양의 이중 표적화뿐 아니라 증강된 특이성을 갖는 입양 세포 요법을 위한 개선된 면역 세포 조작 방법을 개발할 필요가 있다.
제1 구현예에서, 본 개시는 인간 IL-15(hIL-15) 및 적어도 두 개의 항원 수용체를 발현하도록 조작된 면역 세포를 제공하며, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체(TCR)를 포함한다. 일 구현예에서, CAR, TCR, 및 hIL-15를 발현하도록 조작된 면역 세포를 제공한다. 다른 구현예에서, hIL-15 및 두 개의 CAR을 발현하도록 조작된 면역 세포를 제공한다. 또 다른 구현예에서, hIL-15 및 두 개의 TCR을 발현하도록 조작된 면역 세포를 제공한다. 추가 구현예에서, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 항원 수용체를 발현하도록 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 면역 세포는 동종이계이다. 특정 양태에서, 면역 세포는 자기유래이다.
일부 양태에서, 면역 세포는 T 세포, 말초 혈액 림프구, NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 또는 줄기세포로 추가로 정의된다. 특정 양태에서, 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC) 또는 유도만능줄기(iPS) 세포이다. 일부 양태에서, 면역 세포는 iPS 세포에서 유래한다. 특정 양태에서, T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포이다. 하나의 특정 양태에서, T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL)이다. 특정 양태에서, 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
특정 양태에서, 면역 세포는 하나 이상의 추가 사이토카인을 발현하도록 조작된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 추가 사이토카인은 IL-21 및/또는 IL-2이다.
추가 양태에서, 면역 세포는 본질적으로 글루코코르티코이드 수용체, TGFβ 수용체, 및/또는 CISH의 발현이 없도록 조작된다. 일부 양태에서, 상기 면역 세포는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 이용하여 조작된다. 특정 양태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 예를 들어 GR을 침묵시키기 위하여 서열 번호 1~2를 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 예를 들어 TGFβ를 침묵시키기 위하여 서열 번호 3~4를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 예를 들어 GR 및 TGFβ를 표적하기 위하여 서열 번호 1~4를 포함한다. 특정 양태에서, TGFβ 수용체는 TGFβ-RII로 추가로 정의된다.
일부 양태에서, 면역 세포는 말초 혈액, 제대혈, 또는 골수에서 분리된다. 특정 양태에서, 면역 세포는 제대혈 예를 들어, 2 이상의 개별 제대혈 단위로부터 모인 제대혈에서 분리된다.
추가 양태에서, 면역 세포는 자살 유전자를 추가로 발현한다. 특정 양태에서, 자살 유전자는 CD20, CD52, EGFRv3, 또는 유도성 카스파제 9이다. 특정 양태에서, 자살 유전자는 유도성 카스파제 9이다.
일부 양태에서, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR은 F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, 및 scFv로 이루어진 군에서 선택된 항원 결합 영역을 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR의 항원 결합 영역은 하나 이상의 종양 관련 항원과 결합한다. 특정 양태에서, 종양 관련 항원은 CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen), 알파태아단백(alphafetoprotein), CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 변이 p53, 변이 ras, HER2/Neu, ERBB2, 엽산 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린(mesothelin), GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, WT-1, EGFRvIII, TRAIL/DR4, 및/또는 VEGFR2이다. 특정 양태에서, 제1 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 영역은 제2 항원 수용체, 예를 들어 TCR의 항원 결합 영역과 별개이다. 특정 양태에서, 제1 항원 수용체, 예를 들어 CAR의 항원 결합 영역은 제1 항원에 결합하고, 제2 항원 수용체, 예를 들어 TCR의 항원 결합 영역은 제2 항원에 결합한다. 특정 양태에서, 제1 항원은 EGFRvIII이고 제2 항원은 NY-ESO이다. 특정 양태에서, 제1 항원은 HER2/Neu이고 제2 항원은 MUC-1이다. 특정 양태에서, 제1 항원은 CA-125이고 제2 항원은 MUC-1이다. 특정 양태에서, 제1 항원은 CA-125이고 제2 항원은 WT-1이다. 일부 양태에서, 제1 항원은 EGFRvIII이고, 제2 항원은 Mage-A3, Mage-A4, 또는 Mage-A10이다. 특정 양태에서, 제1 항원은 EGFRvIII이고 제2 항원은 TRAIL/DR4이다. 특정 양태에서, 제1 항원은 CEA-CAR이고, 제2 항원은 Mage-A3-TCR, Mage-A4-TCR, 또는 Mage-A10이다. 일부 양태에서, 제1 항원은 HER2/Neu, CEA-CAR, 및/또는 CA-125, EGFRvIII이고, 제2 항원은 MUC-1, WT-1, TRAIL/DR4, Mage-A3-TCR, Mage-A4-TCR 및/또는 Mage-A10이다.
일부 양태에서, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR은 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 T-림프구 활성화 도메인이다. 일부 양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP12, CD70, CD40, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ, CD28, 4-1BB-L, 및/또는 DAP12를 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR은 하나 이상의 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인, IgG4Fc 힌지, Fc 영역, CD4 막관통 도메인, CD3ξ 막관통 도메인, 시스테인 변이 인간 CD3ξ 도메인, CD16 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, 및/또는 에리스로포이에틴(erythropoietin) 수용체 막관통 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR을 인코딩하는 DNA는 세포의 게놈에 통합된다.
추가 구현예는 (예컨대, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR을 발현하는) 구현예의 면역 세포의 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 대상의 면역 관련 장애를 치료하기 위하여 (예컨대, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR을 발현하는) 구현예의 면역 세포의 면역 세포 유효량을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 구현예에서, 대상에게 (예컨대, 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR을 발현하는) 구현예의 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상의 면역 관련 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
일부 양태에서, 면역 관련 장애는 암, 자가면역 질환, 이식편대숙주 질환, 동종이식편 거부반응 또는 염증성 병태이다. 특정 양태에서, 면역 관련 장애는 염증성 병태이고, 면역 세포는 본질적으로 글루코코르티코이드 수용체의 발현이 없다. 일부 양태에서, 대상은 스테로이드 요법을 받았거나 받는 중이다. 일부 양태에서, 면역 세포는 자기유래이다. 특정 양태에서, 면역 세포는 동종이계이다.
특정 양태에서, 면역 관련 장애는 암이다. 특정 양태에서, 암은 고형암이거나 혈액암이다. 일부 양태에서, 암은 난소암이고 면역 세포는 MUC-1, CA-125, 및/또는 WT-1에 대해 항원 특이성을 갖는다. 특정 양태에서, 암은 폐암이고 면역 세포는 NY-ESO, EGFR-vIII, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, 및/또는 TRAIL/DR4에 대해 항원 특이성을 갖는다. 특정 양태에서, 암은 췌장암 또는 대장암이고 면역 세포는 Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, 및/또는 CEA에 대해 항원 특이성을 갖는다. 일부 양태에서, 암은 유방암이고 면역 세포는 MUC-1, 및 HER2/Neu에 대해 항원 특이성을 갖는다. 특정 양태에서, 암은 교모세포종이고 면역 세포는 Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10v, 및/또는 EGFRvIII에 대해 항원 특이성을 갖는다. 일부 양태에서, 암은 육종이고 면역 세포는 NY-ESO 및 EGFR-vIII에 대해 항원 특이성을 갖는다.
추가 양태에서, 상기 방법은 적어도 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 제2 치료제는 화학요법, 면역요법, 수술, 방사선요법, 또는 생물요법을 포함한다. 특정 양태에서, 면역 세포 및/또는 적어도 제2 치료제는 정맥 내로, 복강 내로, 기관 내로, 종양 내로, 근육 내로, 내시경을 통해, 병소 내로, 경피로, 피하로, 국소적으로 또는 직접 주사 또는 관류에 의해 투여된다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 하지만, 본 발명의 사상 및 범주 내에서 다양한 변형 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이므로, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만 오직 예시의 방식으로 주어짐을 이해해야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 부분을 이루며 본 발명의 특정 양태를 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 이 도면들 중 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1a~1c: 제대혈-유래 NK 세포에서의 CS1 CAR의 형질 도입 효율 (도 1a) 서로 다른 두 공여자로부터 얻은 NK 세포에서의 CAR 발현의 유동 세포 분석 (도 1b) iC9/CAR.CS1/IL-15-형질 도입 NK 세포는 CS1 발현 골수종 세포주에 대한 우수한 살해능을 발휘한다. (도 1c) iC9/CAR.CS1/IL-15-형질 도입 NK 세포는 CS1 발현 골수종 세포주에 반응하여 보다 많은 효과기 사이토카인을 생산한다.
도 2a~2b: IL-15는 종양의 NK-CAR 매개 사멸을 강화하고(도 2a) 생존을 연장시킨다(도 2b).
도 3: 조혈 세포에서의 글루코코르티코이드 수용체(GR) 녹아웃의 PCR 기반 스크리닝.
도 4a~4b: NK 세포는 덱사메타손 사멸에 민감하다. (도 4a) 서로 다른 세 공여자로부터 얻은 NK 세포에 덱사메타손을 처리하고 4시간 지난 후의 아넥신(Annexin) V 발현을 나타낸다. (도 4b) 서로 다른 세 공여자로부터 얻은 NK 세포에 덱사메타손을 처리하고 24시간 지난 후의 아넥신 V 발현을 나타낸다. 덱사메타손 500 μM을 처리하고 24시간 째에 모든 세포가 사멸되었다.
도 5: CAR NK 세포에서의 GR 녹아웃은 덱사메타손 사멸을 방지한다. 200 μM 덱사메타손으로 12시간 동안 처리한 CAR NK 대조군 세포 또는 GR 녹아웃 세포의 아넥신 V 염색.
도 6a~6c: TFGβ CRISPR-매개 녹아웃은 CAR NK 세포가 외인성 TGFβ의 면역억제 효과에 대해 내성을 갖게 한다. (도 6a) CRISPR/CAS9 기술(TGFβ-RII의 엑손 3의 Cas9 플러스 gRNA 표적화)을 이용한 TGFβ-RII의 성공적인 녹아웃. (도 6b) 야생형 및 TGF-β-RII 녹아웃 NK 세포를 재조합 TGF-β 10 ng/ml로 48시간 동안 처리하였고 K562 표적에 대한 이의 반응을 평가하였다. TGF-β-RII 녹아웃 NK 세포는 외인성 TGF-β의 면역억제 효과에 대해 내성이 있다. (도 6c) CRISPR/CAS9 기술에 의한 TGFβ-RII 녹아웃은 CAS9 단독으로 처리한 NK 세포와 비교하여 재조합 TGF-β 10 ng/ml와 반응하여 하류의 Smad-2/3 인산화를 저해한다.
도 7a~7d: (도 7a) 두 개의 CAR 및 hIL-15를 발현하는 NK 세포와 같은 면역 세포를 도시하는 개략도. (도 7b) CAR, TCR, 및 hIL-15를 발현하는 NK 세포와 같은 면역 세포를 도시하는 개략도. (도 7c) 두 개의 TCR 및 hIL-15를 발현하는 NK 세포와 같은 면역 세포를 도시하는 개략도. (도 7d) CAR-CAR, TCR-CAR, 또는 TCR-TCR 및 hIL-15를 발현하는 작제물의 개략도.
본 개시는 면역 요법, 예를 들어 이에 제한되지 않지만 CMV, EBV, 및 HIV와 같은 바이러스를 포함한 감염증뿐 아니라 암 및 자가면역 질환을 비롯한 면역-관련 질환의 치료에 있어서 항원-특이적 면역 세포(예컨대, T 세포 및 NK 세포)를 제공함으로써 현재 기술과 연관된 문제점을 극복한다. 일 구현예에서, 본 개시는 하나 이상의 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 NK 세포를 제공한다. 전통적인 항체-유도 표적 항원에 반해, TCR에 의해 인식된 항원은 펩티드/MHC 복합체와 같은 세포 표면에 이동하여 전달되는 잠재 세포내 단백질의 전체 배열을 포함할 수 있다. NK 세포가 내인성 TCR을 발현하지 않으므로, NK 세포에서 고친화도 TCR의 도입은 외인성 및 내인성 TCR을 발현하는 T 세포에서 보이는 것과 같이 혼합 이량체를 생성할 위험 없이 NK 세포의 항원 특이성을 전용하게 한다. NK 세포에서 최적으로 기능하는 더 많은 강력한 수용체를 생성하기 위하여, 수용체는 벡터 내 CD3ζ 신호전달 도메인뿐 아니라, (이에 제한되지 않지만 CD28, 41BB 리간드, DAP12, DAP10 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는) 공자극 도메인을 가질 수 있다(도 7d). 따라서, 본 개시는 또한 보통 T 세포에 의해서만 인식되는 종양 및 병원체에서 유래된 항원을 표적하는 NK 세포 면역요법의 적용 방법을 제공한다. 또한, T 세포와 달리, 동종이계의 공급원으로부터 얻은 NK 세포는 이식편대숙주 질환을 유발할 위험을 증가시키지 않으므로, TCR을 갖는 동종이계 NK 세포의 사용은 입양 요법에 TCR 조작 NK 세포의 잠재 공급원을 제공한다.
게다가, 본 개시는 종양의 이중 표적화를 위해 적어도 두 개의 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및 TCR의 조합, 두 개의 CAR, 또는 두 개의 TCR을 포함하는, 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 및 T 세포를 추가로 제공한다. 두 개의 다중 항원 수용체, 예를 들어 TCR 및 CAR 둘 모두를 단일 세포 유형에 넣는 본 방법은 CAR을 통한 표면 항원 인식 및 TCR을 통한 펩티드/MHC 복합체 인식을 포함하여 두 가지 완전히 다른 항원 인식 메커니즘을 이용하여 둘 이상의 항원의 표적화를 가능하게 한다. NK 세포의 생체내 지속성을 강화하기 위하여, 세포는 IL-15를 발현하도록 조작될 수 있다. 따라서, 세포는 IL-15 또는 다른 사이토카인을 추가로 발현할 수 있는 두 개의 CAR, 하나의 CAR + 하나의 TCR, 두 개의 TCR, 또는 CAR 및 TCR의 임의의 조합을 발현할 수 있다. 이 방법은 또한 항원-음성 종양 회피의 위험이 감소하게 한다. 면역 세포는 말초 혈액, 제대혈, 골수, 줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC 세포), 및 이에 제한되지 않지만 NK-92 세포주와 같은 NK 세포주를 포함하는 몇몇 공급원으로부터 유래할 수 있다.
추가 구현예는 면역 세포, 예를 들어 CAR- 및/또는 TCR-조작 면역 세포의 효능을 강화하기 위하여 유전자 편집에 의한 글루코코르티코이드 수용체(GR), TGFβ 수용체 2(TGFβRII), 및/또는 면역 관문 유전자 CISH의 표적화에 관한 것이다. 특히, GR 표적화는 면역 세포가 코르티코스테로이드의 림프구세포독성 효과에 대해 내성이 있게 하고, TGFβRII의 표적화는 면역 세포가 면역억제 종양 미세환경에 대해 내성이 있게 한다. 예를 들어, 면역 세포는 CRISPR-CAS 시스템, 또는 TALEN 또는 징크 핑거 뉴클레아제와 같은 기타 유전자 편집 시스템을 이용하여 스테로이드-내성 및/또는 TGFB-내성이 있도록 조작될 수 있다.
또한, 본 개시에서 사용된 항원 수용체는 인간 IL-15와 같은 IL-15, 또는 이에 제한되지 않지만 IL-21 또는 IL-2를 포함하는 기타 지지(supportive) 사이토카인을 함유할 수 있다. 항원 수용체 작제물(TCR 또는 CAR)은 CD3ζ, 4-1BB-L, DAP12, DAP10과 같은 공자극성 분자, 또는 기타 공자극성 분자를 더 포함할 수 있다. 본 개시의 면역 세포는 항원의 임의의 조합에 표적화될 수 있는 반면, CAR 및/또는 TCR에 대한 예시적인 항원은 이에 제한되지 않지만, CS1, BCMA, CD38, CD19, CD123, CD33, CD99, CLL1, CD5, CD7, 메소텔린 및 ROR1을 포함한다. 특정 양태에서, 면역 세포는 EBNA 펩티드에 대한 (예컨대, EBV 림프종을 위한) CD19-CAR 및 TCR; (예컨대, 골수 악성 종양(예컨대, AML, MDS, CML)의 치료를 위한) WT1 및 CD123; (예컨대, 육종 및 폐암을 위한) NY-ESO TCR 플러스 EGFRvIII-NK-CAR; (예컨대, 유방암을 위한) Muc-1-TCR 및 Her-2-neu-NK-CAR; (예컨대, 난소암을 위한) Muc-1-TCR 및 CA-125-NK-CAR; (예컨대, 난소암을 위한) WT1-TCR 및 CA-125-NK-CAR; (예컨대, 폐암 및 교모세포종을 위한) Mage-A3-TCR, Mage-A4-TCR 또는 Mage-A10-TCR 플러스 EGFRVII-NK-CAR; (예컨대, 폐암을 위한) TRAIL/DR4-TCR 플러스 EGFRv3-CAR; 및 (예컨대, 대장암 및 췌장암을 위한) Mage-A3-TCR, Mage-A4-TCR 또는 Mage-A10-TCR 플러스 CEA-CAR를 포함하는 항원 조합에 이중으로 표적화된다.
추가 구현예에서, 면역 세포, 특히 NK 세포는 두 개의 CAR(예컨대, CD99 및 CD33, 또는 CD123 및 CD33, 또는 CD19 및 ROR1, 또는 CD38 및 BCMA 또는 CS1 또는 기타 조합들)을 가지는 벡터로 형질도입되어 면역 세포 및 IL-15 또는 다른 사이토카인에 대한 이중 특이성을 제공하고 이들의 생체내 지속성을 강화시킨다. 본 방법은 표적을 벗어난 독성을 제한함으로써 NK-CAR의 증가된 특이성을 제공하여 생체내 증식 및 지속을 강화시킬 뿐 아니라 두 항원 모두 종양상에 발현될 때 사멸시키도록 오직 NK 세포에만 신호가 주어지게 된다. 따라서, 하나의 항원만 발현하는 정상 세포는 표적화되지 않는 것이다. 이 전략은 이에 제한되지 않지만, NK 세포, T 세포, 감마 델타 T 세포, 및 iNKT 세포를 포함하는 면역 세포의 임의의 아집단에 적용가능하다.
입양 암 면역요법을 위한, NK 세포 및 T 세포와 같은 면역 세포의 유전적 재프로그램화는 1) 민감화에 대한 사전 필요 없는 선천적 항-종양 감시기구 2) NK 세포의 경우 이식편대숙주 반응성 없는 동종이계 효험 및 3) 표적 종양의 직접 세포 매개 세포독성 및 세포 용해와 같은 임상적으로 유의미한 적용 및 이점을 갖는다. 따라서, 본 개시는 또한 본원에 제공된 조작된 면역 세포 중 임의의 것을 이용한 입양 세포 면역요법을 포함하는 암과 같은 면역 관련 장애의 치료 방법을 제공한다.
I. 정의
본원에서 사용된 바와 같이, 특정 성분에 대하여 “본질적으로 없는”이라는 말은 특정 성분이 조성물에 의도적으로 제형화되지 않았고/않았거나 단지 오염물질로서 존재하거나 극소량 존재한다는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 그러므로 조성물의 임의의 의도치않은 오염물질로부터 기인한 특정 성분의 총량은 0.05% 보다 훨씬 아래이고, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 상기 특정 성분의 함량이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 단수 표현(“a” 또는 “an")은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, 단어 “포함하는”과 함께 사용될 때, 단수 표현(“a” 또는 “an)은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
청구항에서 용어 “또는”의 사용은 본 개시 내용이 오직 대안 그리고 “및/또는”을 의미하는 정의를 지지하더라도, 대안만 의미하거나 대안이 상호 배타적이라고 명확하게 나타내지 않는 한, “및/또는”을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에서 사용된 “다른(another)”은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.
본원 전체에 걸쳐서, 용어 “약”은 값이 장치, 값을 측정하는 데 사용된 방법, 또는 연구 대상 중에 존재하는 편차에 있어서 오차의 내재 편차를 포함하는 것을 나타내는 데 사용된다.
세포 또는 생물체에서 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 용어 “외인성”은 세포나 생물체 내로 인공적인 또는 자연적인 수단에 의해 도입된 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 의미하고, 또는 세포와 관련해서 사용될 때 이 용어는 분리된 후 다른 세포나 생물체에 인공적인 또는 자연적인 수단에 의해 도입된 세포를 의미한다. 외인성 핵산은 상이한 생물체 또는 세포로부터 온 것일 수 있고, 또는 생물체 또는 세포내에서 자연적으로 발생한 핵산의 하나 이상의 추가 복제물일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 생물체로부터 온 것일 수 있고, 또는 동일한 생물체로부터 온 것일 수 있다. 비제한적인 예로서, 외인성 핵산은 자연 세포에 위치한 곳과 상이한 염색체 위치에 있는 핵산이거나 그렇지 않으면 자연 상태에서 발견되는 것과 상이한 핵산 서열의 측면에 배치된 핵산이다.
“발현 작제물” 또는 “발현 카세트”는 전사를 유도할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 발현 작제물은 하나 이상의 원하는 세포 유형, 조직, 또는 기관에서 유전자 발현을 유도하는 최소한 하나 이상의 전사 조절 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서, 또는 이와 기능적으로 동일한 구조물)를 포함한다. 또한 추가 요소, 예를 들어 전사 종결 신호를 포함할 수 있다.
“벡터” 또는 “작제물”(때때로 유전자 전달 시스템 또는 유전자 도입 “비히클”로도 불림)은 시험관내 또는 생체내 둘 중 하나로 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자의 거대분자 또는 복합체를 의미한다.
벡터의 일반적인 형태인 “플라스미드”는 염색체 DNA를 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별개의 염색체외 DNA 분자이다. 어떤 경우에, 플라스미드는 환형이고 이중 가닥이다.
“복제의 기점”(“ori”) 또는 “복제 기점”은 세포에 있는 플라스미드에 존재할 때 상기 플라스미드에 또는 DNA 합성이 시작되는 부위에 또는 그 근처 부위에 있는 연결된 서열을 유지할 수 있는, 예컨대 백혈병 헤르페스 바이러스에 있는, DNA 서열이다. 일 예로서, EBV(엡스타인-바 바이러스)의 ori는 FR 서열(30 bp 반복의 20개의 불완전한 카피), 바람직하게는 DS 서열을 포함하지만, EBV의 다른 부위는 EBNA-1에 결합하는데, 예를 들어 Rep* 서열은 복제의 기점으로서 DS를 대신할 수 있다(Kirshmaier 및 Sugden, 1998) 따라서, EBV의 복제 기점은 FR, DS, 또는 Rep* 서열 또는 핵산 변형을 통한 기능적으로 동등한 임의의 서열 또는 이들로부터 유래된 합성 조합을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 방법은 또한 개별 요소의 삽입 또는 변이에 의해 EBV의 유전자 조작 복제 기점을 사용할 수 있다.
특정 단백질을 “암호화”하는 “유전자”, “폴리뉴클레오티드”, “코딩 영역”, “서열”, “절편”, “단편”, 또는 “전이유전자”는 적절한 조절 서열의 제어하에 놓였을 때 생체내 또는 시험관내에서 전사되고 또한 선택적으로 유전 물질, 예컨대 폴리펩티드로 번역되는 핵산 분자이다. 코딩 영역은 cDNA, 게놈 DNA, 또는 RNA 형태 중 하나로 존재할 수 있다. DNA 형태로 존재할 때, 핵산 분자는 단일 가닥(즉, 센스 가닥) 또는 이중 가닥일 수 있다. 코딩 영역의 경계는 5’ (아미노) 말단의 개시 코돈과 3’ (카복시) 말단의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 유전자는 이에 제한되지 않지만, 원핵 또는 진핵 mRNA로부터 cDNA, 원핵 또는 진핵 DNA로부터 게놈 DNA 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있다. 전사 종결 서열은 보통 유전자 서열의 3’에 위치될 것이다.
용어 “조절 요소”는 프로모터 영역, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상류 조절 도메인, 복제의 기점, 내부리보솜 도입서열(IRES), 인핸서, 스플라이스 연접부 등을 총칭하며, 이는 수용 세포(recipient cell)에서 복제, 전사, 전사후 처리, 및 코딩 서열의 번역을 총체적으로 제공한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사, 및 번역될 수 있는 한, 이들 조절 요소 모두 다 존재할 필요가 있는 것은 아니다.
용어 “프로모터”는 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오티드 영역을 나타내는 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, 상기 조절 서열은 RNA 중합효소를 결합할 수 있고 하류 (3’ 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래한다. 조절 단백질 및 분자가 결합할 수 있는 유전 요소들, 예를 들어 RNA 중합효소 및 기타 전사 인자들을 포함하여 핵산 서열의 특정 전사를 개시할 수 있다. “작동가능하게 위치된”, “작동가능하게 연결된”, “제어하에”, 및 “전사 제어하에”라는 어구는 프로모터가 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하는 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있는 것을 의미한다.
“인핸서”는 프로모터에 가장 가까이 위치했을 때, 인핸서 도메인이 없을 때의 프로모터로부터 기인한 전사 활성과 비교하여 전사 활성을 증가시켜주는 핵산 서열을 의미한다.
핵산 분자와 관련하여 “작동가능하게 연결된” 또는 “공동으로 발현된”은 두 개 이상의 핵산 분자(예컨대, 전사되는 핵산 분자, 프로모터, 인핸서 요소)가 핵산 분자의 전사를 허용하는 방식으로 연결되는 것을 의미한다. 펩티드 및/또는 폴리펩티드와 관련하여 “작동가능하게 연결된” 또는 “공동으로 발현된”은 융합체의 각각의 펩티드 및/또는 폴리펩티드 성분 중 적어도 하나의 성질을 갖는 단일 폴리펩티드 쇄, 즉 융합 폴리펩티드를 두 개 이상의 펩티드 및/또는 폴리펩티드가 생산하는 방식으로 연결된다. 융합 폴리펩티드는 바람직하게는 키메라, 즉, 이종 분자로 구성된 것이다.
“상동성”은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 간의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 서열과 다른 서열간의 유사성은 당해 기술 분야에 알려진 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 상동성은 서열 정보를 조정하고 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 두 개의 폴리펩티드 분자간의 서열 정보의 직접 비교에 의해 측정될 수 있다. 대안으로, 상동성은 상동 영역 사이의 안정한 이중부위의 형성을 촉진하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화 한 후, 단일 가닥-특이적 뉴클레아제(들)의 절단 및 절단된 단편들의 크기를 측정함으로써 측정될 수 있다. 두 개의 DNA, 또는 두 개의 폴리펩티드, 서열은 상기 방법을 사용하여 측정했을 때, 정해진 길이의 분자에 대해 각각 적어도 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 일치할 때 서로 “실질적으로 상동”이다.
용어 “세포”는 당해 기술 분야에서 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되며, 다세포 생물체의 조직의 구조 단위이고, 외부로부터 분리되는 막 구조에 의해 둘러싸여 있으며, 자가복제의 능력이 있고, 유전 정보와 그를 발현하는 메커니즘을 갖는 생체(living body)를 의미한다. 본원에서 사용된 세포는 자연 발생 세포이거나 인공적으로 변형된 세포(예컨대, 융합 세포, 유전자 변형 세포 등)일 수 있다.
용어 “줄기세포”는 본원에서 적합한 조건하에서 다양한 범위의 특수화된 세포 형태로 분화할 수 있는 반면, 다른 적합한 조건하에서는 자기 재생하여 본질적으로 미분화 다능성 상태로 남아있을 수 있는 세포를 의미한다. 또한 용어 “줄기세포”는 만능 세포, 다능성 세포, 전구 세포 및 선조 세포를 포함한다. 예시적인 인간 줄기세포는 골수 조직에서 수득한 조혈 또는 중간엽 줄기세포, 배아 조직에서 수득한 배아 줄기세포, 또는 태아의 생식 조직에서 수득한 배아 생식 세포에서 수득할 수 있다. 또한 예시적인 만능 줄기세포는 만능성과 관련된 특정 전사 인자들의 발현에 의해 만능 상태로 재프로그램함으로써 체세포로부터 생산될 수 있으며, 이러한 세포를 “유도만능 줄기세포” 또는 “iPSc” 또는 “iPS 세포”라고 부른다.
“배아 줄기(ES) 세포”는 초기 단계의 배아, 예를 들어 배반포 단계의 속세포덩이(inner cell mass)로부터 수득되거나 인공적인 수단(예컨대 핵이식)에 의해 생산되고 배아 또는 성인에서 임의의 분화된 세포 형태를 만들 수 있는 생식 세포(예컨대, 정자 및 난자)를 비롯한, 미분화된 만능 세포이다.
“유도만능 줄기세포(iPSc 또는 iPS 세포)”는 (본원에서 재프로그래밍 인자라고 부르는) 인자들의 조합을 발현하거나 발현을 유도하여 체세포를 재프로그램함으로써 생성된 세포이다. iPS는 태아 체세포, 출생후 체세포, 신생아 체세포, 청소년 체세포 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, 체세포를 만능 줄기세포로 재프로그램하는 데 사용될 수 있는 인자들은 예를 들어, Oct4(때때로 Oct 3/4로 불림), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, 및 Lin28을 포함한다. 일부 구현예에서, 체세포는 적어도 두 개의 재프로그래밍 인자, 적어도 세 개의 재프로그래밍 인자, 적어도 네 개의 재프로그래밍 인자, 적어도 다섯 개의 재프로그래밍 인자, 적어도 여섯 개의 재프로그래밍 인자, 또는 적어도 일곱 개의 재프로그래밍 인자를 발현함으로써 재프로그램되어 체세포를 만능 줄기세포로 재프로그램한다.
“조혈 선조 세포” 또는 “조혈 전구 세포"는 조혈 계통에 관련되지만 추가로 조혈 분화를 할 수 있고, 조혈 줄기세포, 다능성 조혈 줄기세포, 일반 골수 선조, 거핵구 선조, 적혈구 선조, 및 림프구 선조를 포함한다. 조혈 줄기세포(HSC)는 골수(단핵구 및 마크로파지, 과립구(호중성구, 호염기성구, 호산구, 및 거대 세포), 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포), 및 림프구 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)을 포함하는 모든 혈액 세포 형태가 되는 다능성 줄기세포이다(예컨대, 문헌[Doulatov et al., 2012; Notta et al., 2015] 참조). “다능성 림프구 선조”(multilymphoid progenitor, MLP)는 모든 림프구 계통(B, T, 및 NK 세포)이 되는 임의의 선조를 기술하는 것으로 정의되지만, 다른 (골수) 잠재성을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있고(Doulatov et al., 2010), CD45RA+, /CD10+/CD7-이다. 임의의 B, T, 및 NK 선조가 MLP로서 지칭될 수 있다. “일반 골수 선조”(common myeloid progenitor, CMP)는 과립구, 단핵구, 거핵구, 및 적혈구가 될 수 있는 CD45RA-/CD135+/CD10-/CD7- 세포를 말한다.
“만능 줄기세포”는 하나 이상의 조직 또는 장기를 구성하는 모든 세포 또는 바람직하게는 세 개의 배엽: 내배엽(위 내막, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽(상피 조직 및 신경계) 중 어느 하나로 분화되는 잠재력을 가진 줄기세포를 말한다.
본원에서 사용되는 용어 “체세포”는 난자 또는 정자 등과 같은 생식 세포 이외의 임의의 세포를 나타내고, 이는 이의 DNA를 다음 세대로 직접 전달하지 않는다. 전형적으로, 체세포는 제한된 만능성을 갖거나 만능성을 갖지 않는다. 본원에서 사용된 체세포는 자연 발생일 수 있거나 유전적으로 변형된 것일 수 있다.
"프로그래밍"은 세포가 생산할 수 있는 자손의 유형을 변경시키는 프로세스이다. 예를 들면, 세포는 프로그래밍이 없는 동일한 조건하에 형성될 수 있었던 것과 비교하여 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성할 수 있도록 변경된 경우에 배양물에서 또는 생체내에서 프로그래밍되었다. 이는 본질적으로 프로그래밍 전에 이러한 자손이 형성될 수 없으면 충분한 증식 후 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 측정가능한 비율의 자손이 관찰되고; 대안으로는 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율은 프로그래밍 전보다 더 측정가능하게 높음을 의미한다. 이러한 프로세스는 분화, 탈분화(dedifferentiation) 및 전환분화(transdifferentiation)를 포함한다.
"분화"는 분화에 의해 덜 특화된 세포가 더 특화된 세포 유형이 되는 프로세스이다. "탈분화"는 부분 분화된 세포 또는 최종 분화된 세포가 만능성 또는 다능성과 같은 초기 발달 단계로 되돌아가는 세포 프로세스이다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형을 다른 분화된 세포 유형으로 형질전환시키는 프로세스이다. 전형적으로, 프로그래밍에 의한 전환분화는 중간의 만능성 단계를 통과하는 세포의 부재시에 발생한다 -즉, 상기 세포는 하나의 분화된 세포 유형에서 다른 분화된 세포 유형으로 직접적으로 프로그래밍된다. 소정 조건하에, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 증가하는 선호도 순서로 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 그 이상일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상" 또는 "이를 필요로 하는 대상"은 포유동물, 바람직하게는 세포 또는 조직 이식을 필요로 하는 임의의 연령의 남성 또는 여성인 인간을 말한다. 전형적으로, 상기 대상(본원에서 수용자로도 언급됨)은 장애, 또는 병리학적 또는 바람직하지 않은 병태, 상태 또는 증후군, 또는 세포 또는 조직 이식을 통한 치료에 순응하는 육체적, 형태학적 또는 생리학적 이상으로 인하여 세포 또는 조직 이식을 필요로 한다.
본원에 사용된 유전자의 “분열” 또는 “변형”은 변형의 부재하에 유전자 산물의 발현 수준과 비교하여 세포에서 대상 유전자에 의해 암호화되는 하나 이상의 유전자 산물의 발현의 제거 또는 감소를 말한다. 예시적인 유전자 산물은 mRNA 및 유전자에 의해 암호화되는 단백질 생산물을 포함한다. 일부 경우 변형은 일시적 또는 가역적이고, 다른 경우 불변적이다. 일부 경우 변형은 절단된 또는 비기능성 산물이 생산될 수 있다는 사실에도 불구하고 기능성 또는 전장 단백질 또는 mRNA이다. 본원의 일부 구현예에서, 유전자 활성 또는 기능이, 발현과 대조적으로, 방해된다. 유전자 변형은 일반적으로 인공 방법에 의해, 즉, 화합물, 분자, 복합체, 또는 조성물의 첨가 또는 도입에 의해, 및/또는 핵산의 변형 또는 유전자 관련된 변형, 예를 들면, DNA 수준에서의 변형에 의해 유도된다. 유전자 변형을 위한 예시적인 방법은 유전자 사일런싱, 녹다운, 녹아웃, 및/또는 유전자 변형 기술, 예를 들면, 유전자 편집을 포함한다. 이의 예는 예컨대, 끊어짐의 유도 및/또는 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 비활성화 또는 변형을 야기하는 유전자 편집 기술뿐만 아니라 일반적으로 일시적인 발현의 감소를 야기하는 RNAi, siRNA, shRNA, 및/또는 리보자임과 같은 안티센스 기술을 포함한다. 이의 예는 삽입, 변이, 및 결실을 포함한다. 변형은 전형적으로 유전자에 의해 암호화되는 정상 또는 "야생형" 산물의 발현의 억압 및/또는 완전 부재를 야기한다. 이러한 유전자 변형의 예는 전체 유전자의 결실을 비롯하여, 유전자 또는 유전자 부분의 삽입, 프레임시프트 및 미스센스 변이, 결실, 녹인, 및 녹아웃이다. 이러한 변형은 코딩 영역에서, 예컨대, 하나 이상의 엑손에서 일어날 수 있고, 이는 예를 들면, 종결 코돈의 삽입에 의한 전장 산물, 기능성 산물, 또는 임의의 산물의 생산 불능을 야기한다. 이러한 변형은 또한 유전자의 전사를 방지하기 위해 프로모터 또는 인핸서 또는 전사 활성화에 영향을 주는 다른 영역에서 변형에 의해 발생할 수 있다. 유전자 변형은 상동 재조합에 의한 표적화된 유전자 비활성화를 비롯하여, 유전자 표적화를 포함한다.
“면역 장애”, “면역 관련 장애” 또는 “면역 매개 장애”는 면역 반응이 질환의 발병 또는 진행에 있어서 중요한 역할을 하는 장애이다. 면역 매개 장애는 자가면역 질환, 동종이식편 거부반응, 이식편대숙주 질환, 및 염증성 및 알레르기 병태를 포함한다.
“면역 반응”은 면역 체계의 세포, 예를 들어 B 세포, 또는 T 세포, 또는 자극에 대한 고유 면역 세포의 반응이다. 일 구현예에서, 반응은 특정 항원에 특이적이다(“항원 특이적 반응”).
본원에서 사용된 용어 “항원”은 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 일반적으로 B 및/또는 T 림프구의 생산을 야기하는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 데 사용될 수 있다.
용어 “종양 관련 항원”, “종양 항원” 및 “암세포 항원”은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 각각의 경우에, 용어는 암세포에 의해 특이적으로 또는 선택적으로 발현되는 단백질, 당단백질, 탄수화물을 말한다.
“에피토프”는 아미노산 서열의 특이성에 의해 결정되는 항체에 의해 인식되는 항원상의 부위이다. 경쟁 결합 분석에서 측정된 바와 같이 두 개의 항체가 항원에 각각 경쟁적으로 다른 항체의 결합을 저해(차단)한다면 동일한 에피토프에 결합한다고 말한다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원의 대부분의 아미노산 변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면 두 개의 항체는 동일한 에피토프를 갖는다. 두 개의 항체가 각각이 항원에 다른 항체가 결합하는 것을 부분적으로 저해한다면 및/또는 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 제거한다면 두 개의 항체는 중첩하는 에피토프를 갖는다고 말한다.
“자가 면역 질환”은 면역 체계가 정상 숙주의 부분인 항원(즉, 자기 항원)에 대해 면역 반응(예를 들어, B 세포 또는 T 세포 반응)을 일으켜 조직에 그로 인한 손상이 있는 질환을 말한다. 자기 항원은 숙주 세포로부터 유래할 수 있거나 보통 점막 표면에 콜로니를 이루는 (공생 생물이라고 알려진) 미생물과 같은 공생 생물로부터 유래할 수 있다.
용어 “이식편대숙주 질환(Graft-Versus-Host Disease, GVHD)”은 이식 수용자 자신의 조직에 대한 기증 받은 면역학적으로 반응력이 있는 림프구의 반응이 있는, 골수 또는 기타 조직 이식의 일반적이고 심각한 합병증을 말한다. GVHD는 관련 공여자 또는 비관련 공여자 중 하나로부터 받은 줄기세포를 사용하거나 포함하는 임의의 이식에서 가능한 합병증이다. 일부 구현예에서 GVHD는 만성 GVHD(cGVHD)이다.
“면역 반응의 파라미터”는 이에 제한되지 않지만, 사이토카인 분비(IL-6, IL-10, IFN-γ, 등), 케모카인 분비, 변형된 이동 또는 세포 축적, 면역 글로불린 생산, 수지상 세포 성숙, 조절 활성, 수많은 면역 세포, 및 면역 체계의 임의의 세포의 증식을 포함하는 면역 반응의 임의의 측정 가능한 특정 양상이다. 면역 반응의 다른 파라미터는 면역학적 공격으로 인한 임의의 기관의 구조적인 손상 또는 기능적 열화이다. 당업자는 공지의 실험실 분석을 사용하여 이들 파라미터 중 어느 하나의 증가를 손쉽게 측정할 수 있다. 하나의 비제한적인 특정한 예에서, 세포 증식을 평가하기 위해, 3H-티미딘의 혼입을 평가할 수 있다. 면역 반응의 파라미터에서 “실질적인” 증가는 대조군과 비교하여 이 파라미터에서 유의미한 증가이다. 실질적인 증가의 비제한적인 특정한 예시들은 적어도 약 50% 증가, 적어도 약 75% 증가, 적어도 약 90% 증가, 적어도 약 100% 증가, 적어도 약 200% 증가, 적어도 약 300% 증가, 및 적어도 약 500% 증가이다. 유사하게, 면역 반응의 파라미터에서 억제 또는 감소는 대조군과 비교하여 이 파라미터에서 유의미한 감소이다. 실질적인 감소의 비제한적인 특정한 예시들은 적어도 약 50% 감소, 적어도 약 75% 감소, 적어도 약 90% 감소, 적어도 약 100% 감소, 적어도 약 200% 감소, 적어도 약 300% 감소, 및 적어도 약 500% 감소이다. 비파라미터 ANOVA 또는 T-검정과 같은 통계적인 검정이 제2 제제를 사용하여 반응하는 샘플의 퍼센트와 비교하여 하나의 제제에 의해 유도된 반응의 크기의 차이를 비교하는 데 사용될 수 있다. 일부 예시에서, p
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0.05는 유의미하고, 임의의 관찰된 파라미터에서 증가 또는 감소가 무작위 변동에 의한 것일 가능성이 5% 미만임을 나타낸다. 당업자는 유용한 다른 통계적 분석을 손쉽게 확인할 수 있다.
질환 또는 병태의 “치료하기” 또는 치료는 해당 질환의 징후나 증상을 경감하려는 노력의 일환으로, 환자에게 하나 이상의 약을 투여하는 것을 포함할 수 있는, 프로토콜을 시행하는 것을 말한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행률을 감소시키는 것과 질환 상태를 경감하거나 증상을 완화시키는 것, 그리고 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 경감은 질환 또는 병태의 징후나 증상이 나타난 후뿐 아니라 나타나기 전에도 발생할 수 있다. 따라서, “치료하기” 또는 “치료”는 질환 또는 원치않는 병태의 “예방하기” 또는 “예방”을 포함할 수 있다. 또한, “치료하기” 또는 “치료”는 징후나 증상의 완전한 경감을 요구하지 않고, 치유를 요구하지 않으며, 환자에게 미미한 효과만을 갖는 프로토콜을 특별히 포함한다.
본 출원 전체에서 사용된 용어 “치료 이점” 또는 “치료적으로 유효한”은 이 병태의 의학적 치료에 대하여 대상의 건강을 촉진하거나 증진시키는 임의의 것을 말한다. 이는 질환의 징후나 증상의 빈도나 중증도의 감소를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, 암의 치료는 예를 들어, 종양의 크기 감소, 종양의 침윤성 감소, 암의 성장률 감소, 또는 전이의 예방을 포함할 수 있다. 암의 치료는 또한 암을 가진 대상의 생존의 연장을 말할 수 있다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며, (전장 단클론 항체를 포함하여) 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 특히 포함한다.
본원에서 사용된 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 말한다. 예컨대, 집단을 구성하는 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 변이, 예컨대 자연 발생 변이를 제외하면 동일하다. 따라서, 수식어 “단클론”은 개별 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 이러한 단클론 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선택을 포함하는 공정에 의해 수득되었다. 예를 들면, 선택 공정은 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 복수의 클론으로부터의 독특한 클론의 선택일 수 있다. 선택된 표적 결합 서열은 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 증가시키거나, 표적 결합 서열을 인간화하거나, 세포 배양물에서의 생산을 개선하거나, 생체내 면역원성을 감소시키거나, 다중특이적 항체를 생산하는 등 추가로 변형될 수 있고, 변형된 표적 결합 서열을 포함하는 항체가 또한 본 발명의 단클론 항체임을 이해해야 한다. 상이한 결정기(에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각 단클론 항체는 항원상의 단일 결정기에 대해 유도된다. 그들의 특이성에 더하여, 단클론 항체 제제는 다른 면역글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 이점이 있다.
어구 “약학적으로 또는 약물학적으로 허용되는”은 적절하게 인간과 같은 동물에게 투여될 때, 부작용, 알레르기, 또는 다른 반작용을 일으키지 않는 분자성 물질 및 조성물을 의미한다. 항체 또는 추가 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 제제는 본 개시 내용에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 게다가, 동물(예컨대, 인간) 투여를 위하여, 제제는 FDA Office of Biological Standards에서 요구하는 멸균성, 발열성, 전체적인 안전성, 및 순도 기준을 만족시켜야 함을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 “약학적으로 허용되는 담체”는 임의의 및 모든 수성 용매(예컨대, 물, 알코올성/수성 용액, 식염수, 염화나트륨, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose)와 같은 비경구 비히클 등), 비수성 용매(예컨대, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름, 및 올레인산에틸과 같은 주사 가능한 유기 에스테르), 분산매, 코팅제, 계면활성제, 산화방지제, 방부제(예컨대, 항균제 또는 항진균제, 산화방지제, 킬레이트화제, 및 비활성 기체), 등장화제, 흡수지연제, 염, 약물, 약 안정화제, 겔, 바인더, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 염료, 체액 및 영양 보충제, 이러한 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함하며, 이는 당업자에게 공지된 것이다. 약학 조성물에 있는 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 공지의 파라미터에 따라 조정된다.
용어 “T 세포”는 T 림프구를 의미하며, 이에 제한되지 않지만, γ:δ+ T 세포, NK, T 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. CD4+ T세포는 조절 T 세포 (Treg)뿐만 아니라 TH0, TH1 및 TH2 세포를 포함한다. 적어도 다음 세 유형의 조절 T 세포가 있다: CD4+ CD25+ Treg, CD25 TH3 Treg, 및 CD25 TR1 Treg. “세포독성 T 세포”는 다른 세포를 사멸할 수 있는 T 세포를 말한다. 대다수의 세포독성 T 세포는 CD8+ MHC 클래스 I-제한 T 세포이지만, 일부 세포독성 T 세포는 CD4+이다. 바람직한 구현예에서, 본 개시의 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+이다.
T 세포의 활성화 상태는 T 세포가 “휴면 중”(즉, 세포 주기 중 G0기)인지 또는 “활성화되어” 특정 항원의 인식과 같은 적절한 자극 후에, 또는 OKT3 항체, PHA, 또는 PMA 등으로 자극되어 증식하게 되는 지를 정의한다. T 세포의 “표현형”(예컨대, 미접촉(naive), 중심 기억, 효과기 기억, 용해 효과기, 보조 효과기(TH1 및 TH2 세포), 및 조절 효과기)은 활성화되었을 때 세포가 발휘하는 기능을 나타낸다. 건강한 공여자는 이들 표현형 각각의 T 세포를 가지는데, 휴면 상태가 지배적이다. 미접촉 T 세포는 활성화 시 증식된 후, 기억 T 세포 또는 효과기 T 세포로 분화할 것이다. 그런 다음, 새로운 기능을 발휘하기 위해 다음 번에 활성화될 때까지 휴면 상태로 다시 돌아올 수 있고 표현형을 다시 바꿀 수 있다. 효과기 T 세포는 활성화 및 항원 특이적 효과기 기능으로 나누어질 것이다.
본원에서 사용된 용어 “키메라 항원 수용체(CAR)”는 예를 들어 인공 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 또는 키메라 면역수용체를 의미할 수 있고, 특정 면역 효과기 세포에 인공적 특이성을 이식시킨 조작된 수용체를 포함할 수 있다. CAR을 이용하여 단클론 항체의 특이성을 T 세포에 부여함으로써, 예를 들어, 입양 세포 요법에 사용하기 위해, 수많은 특이적 T 세포가 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 예를 들어, 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 유도한다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 도메인, 막관통 도메인, 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 CD3-제타에 융합된, 단클론 항체에서 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv), 막과통 도메인 및 엔도도메인을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체(예컨대, 펩티드)의 리간드에서. 또는 덱틴(Dectin)과 같은 패턴-인식 수용체에서 유래할 수 있다. 어떤 경우에, 항원 인식 도메인의 간격은 활성화-유도 세포 사멸을 감소시키도록 변형될 수 있다. 어떤 경우에, CAR은 CD3ζ, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 Ox40과 같은 추가의 공자극 신호 전달을 위한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 분자들은 공자극 분자, 이미징(예컨대, 양전자 방사 단층 촬영)을 위한 리포터 유전자, 전구약물의 첨가로 T 세포를 조건부로 제거하는 유전자 산물, 귀소수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 및 사이토카인 수용체를 포함하여, CAR와 함께 공발현(co-express)될 수 있다.
용어 “항원 제시 세포(APC)”는 면역 체계의 특이적 효과기 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드-MHC 복합체의 형태로 하나 이상의 항원을 제시하여 항원 또는 제시되는 항원에 대한 효과적인 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 세포의 부류를 의미한다. APC는 마크로파지, B 세포, 상피 세포, 활성화 T 세포, 및 수지상 세포와 같은 온전한 전체 세포; 또는 자연 발생 또는 합성인 다른 분자들, 예를 들어 β2-마이크로글로불린에 복합체화된 정제된 MHC 클래스 I 분자일 수 있다. 많은 유형의 세포가 T 세포 인식을 위해 세포 표면상에 항원을 제시할 수 있지만, 수지상 세포만 세포독성 T-림프구(CTL) 반응에 대해 미접촉 T 세포를 활성화시키기에 효율적인 양으로 항원을 제시하는 능력을 가지고 있다.
용어 “배양”은 적합한 배지에서 세포의 시험관내 유지, 분화 및/또는 증식을 의미한다. “보강된”은 생물체에 존재하는 조직에서 발견되는 것보다 총 세포의 백분율이 더 큰 세포를 포함하는 조성물을 의미한다.
“항암”제는 예를 들어, 암세포의 사멸을 촉진시키거나, 암세포에서 아포토시스를 유도하거나, 암세포의 성장율을 감소시키거나, 전이의 수나 발생을 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 성장을 억제하거나, 종양 또는 암세포에 혈액 공급을 감소시키거나, 암세포 또는 종양에 대한 면역 반응을 촉진하거나, 암의 진행을 방지 또는 억제하거나, 또는 암이 있는 대상의 수명을 증가시킴으로써 대상에서 암세포/종양에 부정적인 영향을 끼칠 수 있다.
II. 면역 세포
본 개시의 특정 구현예는 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 면역 세포에 관한 것이다. 면역 세포는 T 세포(예컨대, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 줄기세포(예컨대, 중배엽 줄기세포(MSC) 또는 유도만능 줄기(iPSC)세포)일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 단핵구 또는 과립구, 예컨대, 골수세포, 마크로파지, 호중성구, 수지상 세포, 거대 세포, 적혈구, 및/또는 호염기성구이다. 또한 입양 세포 요법을 위해 세포를 사용하고 투여하는 방법뿐 아니라 면역 세포를 생산하고 조작하는 방법이 본원에서 제공되며, 이 경우 세포는 자기유래이거나 동종이계일 수 있다. 따라서, 면역 세포는 예를 들어 암세포를 표적하는 면역요법으로 사용될 수 있다.
면역 세포는 대상, 특히 인간 대상으로부터 분리될 수 있다. 면역 세포는 목적하는 대상, 예를 들어 특정 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 대상, 특정 질환 또는 병태에 대한 소인을 갖는 것으로 의심되는 대상, 또는 특정 질환 또는 병태에 대해 치료를 받는 중인 대상으로부터 수득할 수 있다. 면역 세포는 이에 제한되지 않지만, 혈액, 제대혈, 비장, 흉선, 림프절, 및 골수를 포함하여 대상에 있는 임의의 곳에서 수거될 수 있다. 분리된 면역 세포는 바로 사용될 수 있거나, 예를 들어 냉동하여 일정 기간동안 저장될 수 있다.
면역 세포는 이에 제한되지 않지만, 혈액(혈액 은행 또는 제대혈 은행에 수집된 혈액 포함), 비장, 골수, 외과 수술 동안 제거되고/되거나 노출된 조직, 및 생검 절차를 통해 수득된 조직을 포함하여 면역 세포가 있는 임의의 조직에서 보강/정제될 수 있다. 면역 세포가 보강, 분리, 및/또는 정제되는 조직/장기는 살아있는 대상 및 살아있지 않은 대상(장기 기증자) 둘 다로부터 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 혈액, 예를 들어 말초 혈액 또는 제대혈에서 분리된다. 일부 양태에서, 제대혈에서 분리된 면역 세포는 예를 들어 CD4- 또는 CD8-양성 T 세포 억제로 측정된 면역조절 능력을 강화시켰다. 특정 양태에서, 면역 세포는 강화된 면역조절 능력을 위해 혼합 혈액(pooled blood), 특히 혼합 제대혈(pooled cord blood)에서 분리된다. 혼합 혈액은 2개 이상의 공급원, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상의 공급원(예컨대, 공여자 대상)에서 온 것일 수 있다.
면역 세포의 집단은 요법을 받을 필요가 있는 대상 또는 감소된 면역 세포 활성과 관련된 질환을 앓는 대상으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 세포는 요법을 받을 필요가 있는 대상에게 자기유래일 것이다. 대안으로, 면역 세포의 집단은 공여자, 바람직하게는 조직접합성이 맞는 공여자로부터 수득될 수 있다. 면역 세포 집단은 면역 세포가 상기 대상 또는 공여자에 있는 말초 혈액, 제대혈, 골수, 비장, 또는 임의의 다른 장기/조직에서 채취될 수 있다. 면역 세포는 대상 및/또는 공여자의 풀에서 예를 들어, 혼합 제대혈에서 분리될 수 있다.
면역 세포의 집단이 대상과 별개의 공여자로부터 수득될 때, 세포가 대상에 도입될 수 있다는 점에서 수득된 세포가 대상과 융화성이 있는 경우, 공여자는 바람직하게는 동종이계이다. 동종이계 공여자 세포는 인간 림프구 항원(HLA)과 융화성이 있을 수 있거나 없을 수 있다. 대상-융화성이 되기 위하여, 동종이계 세포는 면역원성을 감소시키도록 처리될 수 있다.
A. T 세포
일부 양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 기능성 항-종양 효과기 세포의 유도, 활성화 및 확장에 대한 몇몇 기본적인 접근법이 지난 20여 년 동안 기술되어왔다. 이는 다음을 포함한다: 종양 침윤 림프구(TIL)와 같은 자기유래 세포; 자기유래 DC, 림프구, 인공 항원 제시 세포(APC) 또는 T 세포 리간드 및 활성화 항체로 코팅된 비드, 또는 표적 세포막을 포획하여 분리된 세포를 이용하여 생체외 활성화된 T 세포; 항 숙주 종양 TCR을 자연적으로 발현하는 동종이계 세포; 및 “T-바디(T-bodies)”라고 알려진, 항체-유사 종양 인식 능력을 나타내는 종양 반응 TCR 또는 키메라 TCR 분자를 발현하도록 유전적으로 재프로그램되거나 “전용된” 비종양 특이적 자기유래 또는 동종이계 세포. 이러한 접근법은 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 T 세포 제제 및 면역화를 위한 수많은 프로토콜을 생기게 했다.
일부 구현예에서, T 세포는 혈액, 골수, 림프, 탯줄, 또는 림프 기관에서 유래한다. 일부 양태에서, 세포는 인간 세포이다. 세포는 전형적으로 1차 세포, 예를 들어 대상에서 바로 분리된 세포 및/또는 대상에서 분리되고 냉동된 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 예를 들어 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화, 확장, 재순환, 국지성, 및/또는 지속 능력에 대한 가능성, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 장기 또는 구획에 존재함, 마커나 사이토카인 분비 프로파일, 및/또는 분화 정도로 정의되는, T 세포, 또는 다른 세포 유형, 예를 들어 전체 T 세포 집단, CD4+ 세포, CD8+ 세포, 및 이들의 부분 모집단의 하나 이상의 아집단을 포함한다. 치료받을 대상에 대하여, 세포는 동종이계이고/이거나 자기유래일 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어 상용 기술에 있어서, 세포는 만능성 및/또는 다능성, 예를 들어 줄기세포, 예를 들어 유도 만능 줄기세포(iPSC)이다. 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 바와 같이, 대상에서 세포를 분리하고 준비, 프로세싱, 배양 및/또는 조작하고, 냉동보존 전 또는 후에 이 세포를 동일 대상에게 재주입하는 것을 포함한다.
T 세포(CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)의 아형 및 아집단 중에는 미접촉 T(TN) 세포, 효과기 T 세포(TEFF), 기억 T 세포 및 이의 아형(예컨대, 줄기세포 기억 T(TSCM), 중심 기억 T(TCM), 효과기 기억 T(TEM), 또는 최종 분화 효과기 기억 T 세포), 종양 침윤 림프구(TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 보조 T 세포, 세포독성 T 세포, 점막 관련 불변 T(MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절 T(Treg) 세포, 보조 T 세포(예컨대, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포, 여포 보조 T 세포), 알파/베타 T 세포, 및 델타/감마 T 세포가 있다.
일부 구현예에서, T 세포 집단 중 하나 이상은 특정 마커, 예를 들어 표면 마커에 대해 양성이거나 음성인 세포에 대해 강화되거나 고갈된다. 일부 경우에, 이러한 마커는 T 세포(예컨대, 비기억 세포)의 특정 집단에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현되거나 부재하지만, T 세포의 다른 특정 집단(예컨대, 기억 세포)에서는 상대적으로 높은 수준으로 발현되거나 존재하는 마커이다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예를 들어 B 세포, 단핵구, 또는 CD14와 같은 기타 백혈구 상에 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플에서 분리된다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는 CD4+ 보조 T 세포와 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하는 데 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 미접촉, 기억, 및/또는 효과기 T 세포 아집단에 상대적으로 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대해 양성 또는 음성 선택에 의해 아집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 예를 들어 각각의 아집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해 미접촉, 중심 기억, 효과기 기억, 및/또는 중심 기억 줄기세포에 대해 더 강화되거나 더 고갈된다.
일부 양태에서, T 세포는 자기유래 T 세포이다. 본 방법에서, 종양 샘플은 환자에게서 수득되고, 단일 세포 현탁액이 수득된다. 단일 세포 현탁액은 임의의 적합한 방법, 예컨대 기계로(예컨대 gentleMACS™ Dissociator, Miltenyi Biotec, Auburn, Calif.를 사용하여 종양을 분해함) 또는 효소로(예컨대, 콜라겐 분해효소 또는 Dnase) 수득될 수 있다. 종양 효소 소화로 얻은 단일 세포 현탁액이 인터루킨-2(IL-2)가 있는 곳에서 배양된다.
배양된 T 세포는 모여서 빠르게 증식(expansion)될 수 있다. 빠른 증식이 약 10일 내지 약 14일의 기간에 걸쳐서 적어도 약 50배(예컨대, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배, 또는 그 이상)의 항원 특이적 T 세포의 수의 증가를 제공한다. 더 바람직하게는, 빠른 증식이 약 10일 내지 약 14일의 기간에 걸쳐서 적어도 약 200배(예컨대, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 또는 그 이상)의 증가를 제공한다.
증식은 당해 기술 분야에 공지된 많은 방법 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 배양 보조 림프구(feeder lymphocyte) 및 인터루킨-2(IL-2) 또는 인터루킨-15(IL-15) 중 하나(IL-2가 더 선호됨)의 존재하에 비특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 빠르게 확장될 수 있다. 비특이적 T 세포 수용체 자극은 약 30 ng/ml의 마우스 단클론 항-CD3 항체인 OKT3(Ortho-McNeil®, Raritan, N.J.에서 구입)을 포함할 수 있다. 대안으로, T 세포는 T-세포 성장 인자, 예컨대 300 lU/ml IL-2 또는 IL-15(IL-2가 더 선호됨)의 존재하에 암의 하나 이상의 항원(이의 항원부, 예컨대 에피토프(들), 또는 세포를 포함), 이는 벡터로부터 임의로 발현될 수 있는데, 예컨대 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2) 결합 펩티드로 시험관내 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 자극에 의해 빠르게 증식될 수 있다. 시험관내-유도 T 세포는 HLA-A2-발현 항원-제시 세포상에서 펄싱된(pulsed) 암의 동일한 항원(들)을 사용한 재자극에 의해 빠르게 증식된다. 대안으로, T 세포는 예를 들어, 조사된 자기유래 림프구 또는 조사된 HLA-A2+ 동종이계 림프구 및 IL-2를 사용하여 재자극될 수 있다.
자기유래 T 세포는 자기유래 T 세포의 성장 및 활성화를 촉진시키는 T 세포 성장 인자를 발현하도록 변형될 수 있다. 적합한 T 세포 성장 인자는 예를 들어 인터루킨(IL)-2, IL-7, IL-15 및 IL-12를 포함한다. 변형의 적합한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001]; 및 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994]을 참조한다. 특정 양태에서, 변형 자기유래 T 세포는 높은 수준으로 T 세포 성장 인자를 발현한다. T 세포 성장 인자 코딩 서열, 예컨대 IL-12의 서열은 프로모터로서 당해 기술 분야에서 쉽게 구할 수 있으며, T 세포 성장 인자 코딩 서열에 대한 작동가능한 연결이 높은 수준의 발현을 촉진한다.
B. NK 세포
일부 양태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. NK 세포는 다양한 종양 세포, 바이러스 감염 세포, 및 골수 및 흉선의 일부 정상 세포에 대한 자연적 세포 독성을 갖는 림프구의 아집단이다. NK 세포는 형질 전환 세포 및 바이러스 감염 세포에 대해 초기 선천성 면역 반응의 대단히 중요한 효과기이다. NK 세포는 인간 말초 혈액에서 림프구의 약 10%를 차지한다. 림프구가 IL-2의 존재하에 배양될 때, 강한 세포독성 반응성이 발달한다. NK 세포는 그의 세포질에 특유의 아주르친화성 과립의 존재 및 거대한 크기로 인해 거대 과립 림프구로 알려진 효과기 세포이다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도선, 및 흉선에서 분화하고 성숙한다. NK 세포는 인간에서 CD16, CD56, 및 CD8과 같은 특정한 표면 마커에 의해 감지될 수 있다. NK 세포는 T 세포 항원 수용체, 팬(pan) T 마커 CD3, 또는 표면 면역글로불린 B 세포 수용체를 발현하지 않는다.
NK 세포의 자극은 세포 표면 활성화 및 억제 수용체에서 유래된 신호의 누화(crosstalk)를 통해 달성된다. NK 세포의 활성화 상태는 암호화된 생식세포 활성화 및 억제 수용체의 배열로부터 세포내 신호의 균형에 의해 조절된다(Campbell, 2006). NK 세포가 비정상 세포(예컨대, 종양 또는 바이러스 감염 세포)를 만나고 활성화 신호가 지배적일 때, NK 세포는 퍼포린 및 그랜자임을 함유하는 세포용해 과립의 직접 분비 또는 사멸 도메인 함유 수용체의 참여를 통해 표적 세포의 아포토시스를 빠르게 유도할 수 있다. 활성화 NK 세포는 기타 사이토카인 및 케모카인뿐 아니라 선천 및 적응 면역 세포 둘 다 활성화시키는, I형 사이토카인, 예를 들어 인터페론-γ, 종양 네크로시스 인자-α 및 과립구-마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF)를 또한 분비할 수 있다. 초기 선천성 면역 반응에서 NK 세포에 의한 이들 가용성 인자들의 생산은 다른 조혈 세포의 채용 및 기능에 영향을 미친다. 또한, 사이토카인의 물리적 접촉 및 생산을 통해, NK 세포는 면역 반응을 촉진시키거나 억제하는, 수지상 세포와 호중성구와 함께 조절 누화 네트워크에서 중심 역할을 한다.
특정 구현예에서, NK 세포는 당해 기술 분야에 공지되어 있는 방법으로 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 미자극 백혈구성분채집술 산물(PBSC), 인간 배아 줄기세포(hESC), 유도만능 줄기세포(iPSC), 골수 또는 제대혈로부터 유도된다. 특히, 탯줄 CB는 NK 세포를 유도하는 데 사용된다. 특정 양태에서, NK 세포는 NK 세포의 생체외 증식의 전술된 방법에 의해 분리되고 증식된다(Shah et al., 2013). 이 방법에서, CB 단핵 세포는 피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되고 IL-2 및 인공 항원 제시 세포(aAPC)와 함께 생물반응기에서 배양된다. 7일 후에, 세포 배양물은 CD3을 발현하는 임의의 세포가 고갈되고 추가로 7일 동안 재배양된다. 세포는 다시 CD3가 고갈되고, CD56+/CD3- 세포 또는 NK 세포의 백분율을 결정하도록 특징지어진다. 다른 방법에서, 탯줄 CB는 SCF, IL-7, IL-15, 및 IL-2를 함유하는 배지에서 배양함으로써 CD34+ 세포의 분리 및 CD56+/CD3- 세포로의 분화에 의해 NK 세포를 유도하는 데 사용된다.
C. 줄기세포
일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포는 줄기세포, 예를 들어 유도만능 줄기세포(PSC), 중간엽 줄기세포(MSC), 또는 조혈 줄기세포(HSC)일 수 있다.
본원에서 사용된 만능 줄기세포는 유도만능 줄기(iPS)세포(보통 줄여서 iPS 세포 또는 iPSC)일 수 있다. 만능성의 유도는 만능성과 연관된 전사 인자의 도입을 통해서 체세포의 재프로그램에 의해, 마우스 세포를 사용하여 2006년에 처음 달성되었고(Yamanaka et al. 2006), 인간 세포를 사용하여 2007년에 달성되었다(Yu et al. 2007; Takahashi et al. 2007). iPSC의 사용은 ES 세포의 대규모 임상적 사용과 관련된 윤리적이고 실제적인 문제를 대부분 피해가며, iPSC 유래 자가 이식을 한 환자들이 이식편 거부반응을 방지하기 위해 평생 동안의 면역억제 치료를 필요로 하지 않을 수 있다.
생식 세포는 제외하고, 임의의 세포가 iPSC의 시작점으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 유형은 케라티노사이트(keratinocyte), 섬유아세포, 조혈세포, 중간엽세포, 간세포 또는 위장 세포일 수 있다. 세포 분화의 정도나 세포가 수거된 동물의 연령에 제한이 없다. 심지어, 미분화 선조 세포(신체 줄기세포 포함) 및 최종적으로 분화된 성숙 세포도 본원에 개시된 방법에서 체세포의 공급원으로서 사용될 수 있다.
체세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 iPS 세포를 제조하도록 재프로그램될 수 있다. 당업자는 손쉽게 iPS 세포를 제조할 수 있으며, 예를 들어 참조로서 본원에 포함되는, 미국 특허 공개번호 2009/0246875호, 미국 특허 공개번호 2010/0210014호; 미국 특허 공개번호 2012/0276636호; 미국 특허 번호 8,058,065호; 미국 특허 번호 8,129,187호; PCT 공개 번호 WO 2007/069666 A1호, 미국 특허 번호 8,268,620호; 미국 특허 번호 8,546,140호; 미국 특허 번호 9,175,268호; 미국 특허 번호 8,741,648호; 미국 특허 공개번호 2011/0104125호, 및 미국 특허 번호 8,691,574호를 참조한다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자는 체세포로부터 만능 줄기세포를 제조하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28 중 적어도 세 개, 또는 적어도 네 개가 이용된다. 다른 구현예에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 이용되거나 Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28이 이용된다.
이들 핵 재프로그래밍 물질의 마우스 및 인간 cDNA 서열은 본원에 참조로서 포함된 WO 2007/069666호 및 미국 특허 번호 8,183,038호에 언급된 NCBI 수탁 번호를 참고하여 이용가능하다. 하나 이상의 재프로그래밍 물질 또는 이들 재프로그래밍 물질을 암호화하는 핵산을 도입하는 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 본원에 참조로서 포함된, 미국 특허 번호 8,268,620호, 8,691,574호, 8,741,648호, 8,546,140호, 공개된 미국 특허 번호 8,900,871호 및 미국 특허 번호 8,071,369호에 개시되어 있다.
일단 유도되면, iPSC는 만능성을 유지하기에 충분한 배지에서 배양될 수 있다. iPSC는 미국 특허 번호 7,442,548호 및 미국 특허 공개번호 2003/0211603호에 기술된 바와 같이, 만능 줄기세포, 더 구체적으로는 배아 줄기세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기술과 함께 사용될 수 있다. 마우스 세포의 경우, 배양은 일반 배지에 분화 억제 인자로서 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)를 첨가하여 수행된다. 인간 세포의 경우, 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)를 LIF 대신 첨가하는 것이 바람직하다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, iPSC의 배양 및 유지를 위한 다른 방법이 본원에 개시된 방법과 함께 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 한정되지 않은 조건이 사용될 수 있다, 예를 들면 만능 세포는 섬유아세포 배양보조 세포(feeder cell) 또는 미분화 상태에서 줄기세포를 유지하기 위하여 섬유아세포 배양보조 세포에 노출된 배지상에서 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 배양보조세포로서, 세포 분열을 종결시키기 위해 방사선 또는 항생제 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 공동 존재하에 배양된다. 대안으로, 만능 세포는 TESR™ 배지 또는 E8™/Essential 8™ 배지와 같은 명확한, 배양보조세포-독립적인 배양 시스템을 사용하여 본질적으로 미분화된 상태에서 배양되고 유지될 수 있다.
플라스미드는 조절된 높은 복제 수를 달성하고, 박테리아에서 플라스미스 불안정성의 가능한 원인을 피하고, 인간을 포함한 포유류 세포에서 사용에 거부 반응이 없는 플라스미드 선택을 위한 수단을 제공하는 것 등과 같은 많은 목표를 가지고 설계되어 왔다. 특히 인간 세포에서 사용하기 위한 플라스미드의 두 가지 요건에 주목하였다. 첫째, 플라스미드는 E.coli에서의 유지 및 발효에 적합하여 많은 양의 DNA가 제조되고 정제될 수 있다. 둘째, 플라스미드는 인간 환자 및 동물에서 사용하는 데 안전하고 적합하다. 제1 요건은 박테리아 발효 중에 비교적 쉽게 안정적으로 유지되고 선택될 수 있는 높은 복제 수의 플라스미드를 요구한다. 제2 요건은 선택 마커 및 다른 코딩 서열과 같은 요소에 대한 집중을 요구한다. 일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 플라스미드는 다음으로 구성된다: (1) 높은 복제 수의 복제 기점, (2) 선택 마커, 예를 들어, 이에 제한되지 않지만 카나마이신으로 항생제 선택을 위한 네오 유전자, (3) 티로시나아제 인핸서를 비롯한 전사 종결 서열, (4) 다양한 핵산 카세트의 혼입을 위한 다중 클로닝 부위, 및 (5) 티로시나아제 프로모터에 작동가능하게 연결된 마커를 암호화하는 핵산 서열. 특정 양태에서, 플라스미드는 티로시나아제 인핸서 또는 프로모터를 포함하지 않는다. 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하여 당해 기술 분야에 공지된 수많은 플라스미드 벡터가 있다. 이들은 이에 제한되지 않지만 본원에 참조로서 포함되는 미국 특허 번호 6,103,470호; 미국 특허 번호 7,598,364호; 미국 특허 번호 7,989,425호; 및 미국 특허 번호 6,416,998호, 및 미국 출원 번호 12/478,154호에 개시된 벡터들을 포함한다.
에피솜 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인-바 바이러스(EBV)-기반 에피솜 벡터, 효모-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 시미안 바이러스 40(Sv40)-기반 에피솜 벡터, 소 유두종 바이러스(BPV)-기반 벡터, 또는 렌티 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA-기반 또는 DNA-기반 바이러스 벡터일 수 있다.
D. 유전자 조작된 항원 수용체
면역 세포(예컨대, 자기유래 또는 동종이계 T 세포(예컨대, 조절 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포), NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 줄기세포(예컨대, MSC 또는 iPS 세포)는 항원 수용체, 예를 들어 조작된 TCR 및/또는 CAR을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포(예컨대, 자기유래 또는 동종이계 T 세포)는 암 항원에 대해 항원 특이성을 갖는 TCR을 발현하도록 변형된다. 특정 구현예에서, NK 세포는 TCR을 발현하도록 조작된다. NK 세포는 CAR을 발현하도록 추가로 조작될 수 있다. 예를 들어 상이한 항원들에 대한 다중 CAR 및/또는 TCR이 단일 세포 유형, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포에 첨가될 수 있다.
변형의 적합한 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 앞의 Sambrook 및 Ausubel을 참조한다. 예를 들면, 세포는 문헌[Heemskerk et al., 2008 및 Johnson et al., 2009]에 설명된 형질 도입 기술을 사용하여 암 항원에 대한 항원 특이성을 가지는 TCR을 발현하도록 형질도입될 수 있다.
전장 TCR α 및 β (또는 γ 및 δ) 쇄의 유전 암호를 지정하는 RNA의 전기 천공법이 레트로바이러스에 의해 형질도입된 내인성 TCR 쇄의 쌍에 의해 유발된 자가반응성을 갖는 장기적인 문제를 극복하기 위한 대안으로서 사용될 수 있다. 이러한 대안 쌍이 일시적인 트랜스펙션 전략에서 발생하더라도, 가능한 생성 자가반응 T 세포는 일정 시간 후에 자가반응성을 잃는데 왜냐하면 도입 TCR α 및 β 쇄가 오직 일시적으로 발현되기 때문이다. 도입 TCR α 및 β 쇄 발현이 감소될 때, 오직 정상 자기유래 T 세포만 남는다. 이는 환자에서 항상 존재하는 자가반응성을 야기하는 도입 TCR 쇄를 결코 잃지 않는, 안정한 레트로바이러스 형질도입에 의해 전장 TCR 쇄가 도입되는 경우가 아니다.
일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 항원 수용체를 암호화하는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산 및 이러한 핵산의 유전자 조작 산물을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이종유래이다. 즉, 예를 들어 조작될 세포에 보통 발견되지 않는 다른 생물체 또는 세포에서 수득된 세포, 및/또는 이러한 세포가 유래된 생물체와 같은 세포나 세포로부터 수득된 샘플에 정상적으로는 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산, 예를 들어 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산(예컨대, 키메라)은 자연 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, CAR은 항원에 특이적으로 결합하는 세포외 항원 인식 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 항원은 세포의 표면상에 발현된 단백질이다. 일부 구현예에서, CAR은 TCR-유사 CAR이고, 항원은 가공된 펩티드 항원, 예를 들어 세포내 단백질의 펩티드 항원이며, 이는 TCR과 유사하게, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자의 환경하에 세포 표면상에서 인식된다.
세포 내로 수용체를 조작하고 도입하는 방법뿐 아니라 CAR 및 재조합 TCR을 포함하는, 예시적인 항원 수용체는 예를 들어 국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257호, WO2013126726호, WO2012/129514호, WO2014031687호, WO2013/166321호, WO2013/071154호, Wo2013/123061호, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002131960호, US2013287748호, Us20130149337호, 미국 특허 번호 6,451,995호, 7,446,190호, 8,252,592호, 8,339,645호, 8,398,282호, 7,446,179호, 6,410,319호, 7,070,995호, 7,265,209호, 7,354,762호, 7,446,191호, 8,324,353호, 및 8,479,118호, 및 유럽 특허 출원 번호 Ep2537416호에 기술된 것들 및/또는, 문헌[Sadelain et al., 2013; Davila et al., 2013; Turtle et al., 2012; Wu et al., 2012]에 기술된 것들을 포함한다. 일부 양태에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 미국 특허 번호 7,446,190호에 기술된 CAR 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO/2014055668 Al호에 기술된 것들을 포함한다.
1. 키메라 항원 수용체
일부 구현예에서, CAR은 a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막관통 도메인, 및 c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 조작된 항원 수용체는 활성화 또는 자극 CAR, 공자극 CAR(WO2014/055668호 참조), 및/또는 억제 CAR(iCAR, 문헌[Fedorov et al., 2013] 참조)을 비롯하여, CAR을 포함한다. CAR은, 일부 양태에서 링커 및/또는 막관통 도메인(들)을 통해 일반적으로 세포내 신호전달 성분에 연결된 세포외 항원(또는 리간드) 결합 도메인을 포함한다. 이러한 분자는 전형적으로 자연 항원 수용체를 통한 신호, 공자극 수용체와 조합한 이러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공자극 수용체만을 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷해진다.
본 개시의 특정 구현예는 세포내 신호전달 도메인, 막관통 도메인, 및 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성(hCAR)을 감소시키도록 인간화된 CAR을 포함하는 항원 특이적 CAR 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산의 사용에 관한 것이다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이에 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 단클론 항체의 상보성 결정 영역, 단클론 항체의 가변 영역, 및/또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 특이성은 수용체와 결합하는 펩티드(예컨대, 사이토카인)으로부터 유래한다.
인간 CAR 핵산은 인간 환자에 대해 세포 면역요법을 강화시키는 데 사용된 인간 유전자일 수 있음이 고려된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전장 CAR, cDNA, 또는 코잉 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 특정 인간 단클론 항체에서 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 VH 및 VL 쇄의 단편, 예를 들어 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 7,109,304호에 기술된 것들을 포함할 수 있다. 단편은 또한 인간 항원 특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 더 많은 특정 구현예에서, 단편은 인간 세포에서 발현을 위한 인간 코돈 사용에 최적화된 서열에 의해 암호화된 항원 특이적 scFv이다.
배열은 디아바디(diabody) 또는 다량체와 같이 다량체적일 수 있다. 다량체는 디아바디 내에 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차 쌍에 의해 형성될 가능성이 가장 높다. 작제물의 힌지 부분은 완전히 제거되는 것부터 세린 치환 보다는 프롤린에 유지된 첫번째 시스테인을 갖는 것, 첫번째 시스테인까지 잘리는 것까지 여러 대안을 가질 수 있다. Fc 부분은 삭제될 수 있다. 안정하고/하거나 이량체화된 임의의 단백질이 이 목적을 수행할 수 있다. 하나는 Fc 도메인 중 단지 하나, 예컨대 인간 면역글로불린으로부터 CH2 또는 CH3 도메인 중 하나를 사용할 수 있다. 하나는 또한 이량체화를 개선하도록 변형된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 하나는 또한 단지 면역글로불린의 힌지 부분을 사용할 수 있다. 하나는 또한 CD8알파의 부분들을 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, CAR 핵산은 다른 공자극 수용체, 예를 들어 막관통 도메인 및 변형 CD28 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 공자극 수용체는 이에 제한되지 않지만, CD28, CD27, OX-40(CD134), DAP10, 및 4-1BB(CD137) 중 하나 이상을 포함한다. CD3ζ에 의해 개시된 일차 신호에 더하여, 인간 CAR에 삽입된 인간 공자극 수용체에 의해 제공된 추가 신호는 NK 세포의 완전 활성화에 있어서 중요하고, 생체내 지속성 및 입양 면역요법의 치료 성공율을 개선하는 것을 도울 수 있다.
일부 구현예에서, CAR은 입양 요법에 의해 표적화되는 특정 세포 유형에서 발현된 항원, 예컨대, 암 마커, 및/또는 약한(dampening) 반응을 유도하도록 의도된 항원, 예를 들어 정상 세포 또는 비질환 세포 유형에 발현된 항원과 같은 특정 항원(또는 마커 또는 리간드)에 대한 특이성을 가지고 작제된다. 따라서, CAR은 전형적으로 그의 세포외 부분에 하나 이상의 항원 결합 분자, 예를 들어 하나 이상의 항원 결합 단편, 도메인, 또는 부분, 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인, 및/또는 항체 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 항원 결합 부분 또는 항체 분자의 부분, 예를 들어 단클론 항체(mAb)의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)에서 유래된 단일쇄 항체 단편(scFv)을 포함한다.
키메라 항원 수용체의 특정 구현예에서, (항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인이라 지칭될 수 있는) 수용체의 항원 특이적 부분은 종양 관련 항원 또는 병원체 특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원은 Dectin-1과 같은 패턴 인식 수용체에 의해 인식된 탄수화물 항원을 포함한다. 종양 관련 항원은 종양 세포의 세포 표면상에 발현되는 한 임의의 종류일 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적 구현예는 CD19, CD20, 암배아 항원, 알파태아단백, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 변이 p53, 변이 ras 등을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 적은 양의 종양 관련 항원이 있을 때 지속성을 개선하기 위하여 사이토카인과 함께 공발현될 수 있다. 예를 들면, CAR은 IL-15와 함께 공발현될 수 있다.
키메라 수용체를 암호화하는 열린 해독틀의 서열은 게놈 DNA 공급원, cDNA 공급원으로부터 수득될 수 있거나 (예컨대, PCR을 통해) 합성될 수 있거나 이들을 조합하여 수득될 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 따라서, 인트론이 mRNA를 안정화한다고 밝혀졌으므로, cDNA 또는 이들의 조합을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, mRNA를 안정화하기 위해 내인성 또는 외인성 비코딩 영역을 사용하는 것이 추가로 이점이 있을 수 있다.
키메라 작제물은 노출 DNA(naked DNA)로서 면역 세포 내로 또는 적합한 벡터에 도입될 수 있다. 노출 DNA를 사용하여 전기 천공에 의해 세포를 안정적으로 트랜스펙션하는 방법이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 미국 특허 번호 6,410,319호를 참조한다. 노출 DNA는 일반적으로 발현을 위해 적절한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 포함된 키메라 수용체를 암호화하는 DNA를 의미한다.
대안으로, 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 또는 렌티 바이러스 벡터)는 면역 세포내로 키메라 작제물을 도입하는 데 사용될 수 있다. 본 개시의 방법에 따라 사용하기 적합한 벡터는 면역 세포에서 복제되지 않는다. 바이러스에 기반한 수많은 벡터가 알려져있고, 세포에서 유지되는 이 바이러스의 복제 수는 세포의 생존력을 유지하기에 충분히 낮으며 예를 들어, HIV, SV40, EBV, HSV, 또는 BPV에 기반한 벡터가 있다.
일부 양태에서, 항원 특이적 결합 또는 인식 성분은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, CAR은 CAR의 세포내 도메인에 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, CAR의 도메인 중 하나와 자연적으로 결합된 막관통 도메인이 사용된다. 일부 예시에서, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 이러한 도메인의 결합을 피하도록 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 구현예에서 막관통 도메인은 자연 공급원 또는 합성 공급원 중 하나로부터 유래된다. 공급원이 자연 발생인 경우, 일부 양태에서 도메인은 임의의 막결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막관통 영역은 T 세포 수용체의 알파, 베타, 또는 제타 쇄, CD28, CD3 제타, CD3 엡실론, CD3 감마, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154, ICOS/CD278, GITR/CD357, NKG2D, 및 DAP 분자로부터 유래된 것들을 포함한다(즉, 이들의 적어도 막관통 영역(들)을 포함한다). 대안으로, 일부 구현예에서 막관통 도메인은 합성이다. 일부 양태에서, 합성 막관통 도메인은 대부분 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 양태에서, 페닐알라닌, 트립토판, 및 발린의 삼중항이 합성 막관통 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다.
특정 구현예에서, NK 세포와 같은 면역 세포를 유전적으로 변형하는 본원에 기술된 플랫폼 기술은 (i) 전기 천공 장치(예컨대, 뉴클레오펙터(nucleofector))를 이용한 비바이러스성 유전자 전이, (ii) 엔도도메인을 통해 신호전달하는 CAR(예컨대, CD28/CD3-ζ, CD137/CD3-ζ, 또는 다른 조합), (iii) 세포 표면에 하원 인식 도메인을 연결하는 다양한 길이의 세포외 도메인을 갖는 CAR, 및 일부 경우에 (iv) CAR+ 면역 세포를 강력하게 수적으로 증식시킬 수 있는 K562에서 유래된 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 포함한다(문헌 [Singh et al., 2008; Singh et al., 2011]).
2. T 세포 수용체(TCR)
일부 구현예에서, 유전자 조작 항원 수용체는 재조합 TCR 및/또는 자연 발생 T 세포에서 클로닝된 TCR을 포함한다. “T 세포 수용체” 또는 “TCR”은 가변 α 및 β쇄(각각, TCRα 및 TCRβ로도 알려짐) 또는 가변 γ 및 δ 쇄(각각, TCRγ 및 TCRδ로도 알려짐)를 포함하는 분자를 말하며, 이는 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태로 있다.
전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 보통 구조적으로 유사하지만, 이들을 발현하는 T 세포는 해부학적으로 별개의 위치 또는 기능을 갖는다. TCR은 세포의 표면상에서 또는 가용(soluble) 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 T 세포(또는 T 림프구)의 표면상에서 발견되며, 보통 주조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것을 담당한다. 일부 구현예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막관통 도메인, 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 포함할 수 있다(예컨대, 문헌 [Janeway et al, 1997] 참조). 예를 들면, 일부 양태에서, TCR의 각각의 쇄는 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 C-말단 엔드에서 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호전달을 매개하는 데 참여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 결합된다. 달리 명시하지 않는 한, 용어 “TCR”은 그의 기능성 TCR 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 이 용어는 또한 αβ 형태 또는 γδ 형태로 TCR을 포함하는 온전한 또는 전장 TCR을 포함한다.
따라서, 본원에서의 목적을 위하여, TCR에 대한 언급은 MHC 분자, 즉 MHC-펩티드 복합체에 결합된 특이적 항원 펩티드와 결합하는 TCR의 항원 결합 부분과 같은 임의의 TCR 또는 기능성 단편을 포함한다. 상호 교환적으로 사용될 수 있는, TCR의 “항원 결합 부분” 또는 “항원 결합 단편”은 TCR의 구조 도메인의 한 부분을 포함하지만, 전체 TCR이 결합하는 항원(예컨대, MHC-펩티드 복합체)과 결합하는 분자를 의미한다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은, 예를 들어 일반적으로 각각의 쇄가 세 개의 상보성 결정 영역을 함유하는, 특이적 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 α쇄 및 가변 β쇄와 같은 TCR의 가변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR 쇄의 가변 도메인은 결합하여 루프, 또는 면역글로불린과 유사한 상보성 결정 영역(CDR)을 형성하고, 이는 항원 인식을 부여하고 TCR 분자의 결합 부위를 형성함으로써 펩티드 특이성을 결정하고 펩티드 특이성을 결정한다. 전형적으로, 면역글로불린과 유사하게, CDR은 프레임워크 영역(framework region, FR)으로 나누어진다(예컨대, 문헌[Jores et al., 1990; Chothia et al., 1988; Lefranc et al., 2003]을 참조). 일부 구현예에서, 알파 쇄의 CDR1이 또한 항원 펩티드의 N 말단 부분과 상호작용하는 것으로 보이는 한편, 베타 쇄의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용하지만, CDR3은 프로세싱된 항원의 인식을 담당하는 주요 CDR이다. CDR2는 MHC 분자를 인식하는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, β-쇄의 가변 영역은 추가 초가변(HV4) 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, TCR 쇄는 불변 도메인을 포함한다. 예를 들면, 면역글로불린과 유사하게, TCR 쇄(예컨대, α-쇄, β-쇄)의 세포외 부분은 두 개의 면역글로불린 도메인, N-말단에서의 가변 도메인(예컨대, Va 또는 Vp; 전형적으로 카밧 넘버링에 기초한 아미노산 1 내지 116, 문헌[Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.]), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인(예컨대, α-쇄 불변 도메인 또는 Ca, 카밧에 기초하여 전형적으로 아미노산 117 내지 259, β-쇄 불변 도메인 또는 Cp, 카밧에 기초하여 전형적으로 아미노산 117 내지 295)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에, 두 개의 쇄로 형성된 TCR의 세포외 부분은 두 개의 막 근위 불변 도메인, 및 CDR을 포함하는 두 개의 막 원위 가변 도메인을 포함한다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하고 두 개의 쇄 사이의 연결을 형성하는 짧은 연결 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TCR은 불변 도메인에 두 개의 이황화 결합을 포함하도록 α 및 β 쇄의 각각에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 쇄는 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양하전된다. 일부 경우에, TCR 쇄는 세포질 꼬리를 포함한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3과 같은 다른 분자와 결합하게 한다. 예를 들면, 막관통 영역이 있는 불변 도메인을 포함하는 TCR은 세포막에 단백질을 고정시킬 수 있고 CD3 신호전달 기구 또는 복합체의 불변 소단위와 결합할 수 있다.
일반적으로, CD3은 포유류에서 3개의 별개의 쇄(γ, δ, 및 ε) 및 ζ-쇄를 가질 수 있는 다중-단백질 복합체이다. 예를 들면, 포유류에서 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 두 개의 CD3ε 쇄, 및 CD3ζ 쇄의 동종이량체를 포함할 수 있다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄는 단일 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 상과(superfamily)의 세포 표면 단백질과 고도로 연관된다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 막관통 영역은 음하전되고, 이는 이들 쇄가 양으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 결합하게 하는 특성이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 세포내 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 단일 보존 모티프를 각각 포함하는 반면 각각의 Cd3ζ는 세 개를 갖는다. 일반적으로, ITAM은 TCR 복합체의 신호전달 능력에 관련된다. 이들 보조 분자(accessory molecule)는 음으로 하전된 막관통 영역을 가지며 TCR로부터 세포내로 신호를 전달하는 역할을 한다. CD3- 및 ζ-쇄는 TCR과 함께 T 세포 수용체 복합체로 알려진 것을 형성한다.
일부 구현예에서, TCR은 두 개의 쇄 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 이종이량체일 수 있거나 단일 쇄 TCR 작제물일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 예를 들어 하나의 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의해 연결된 두 개의 개별 쇄(α 및 β 쇄 또는 γ 및 δ 쇄)를 포함하는 이종이량체이다. 일부 구현예에서, 표적 항원(예컨대, 암 항원)에 대한 TCR이 동정되고 세포내로 도입된다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 다양한 공급원, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 TCR DNA 서열의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭에 의해 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 생물학적 공급원, 예를 들어 T 세포(예컨대 세포독성 T 세포), T 세포 하이브리도마와 같은 세포, 또는 다른 공개적으로 이용가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 생체내 분리된 세포로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 고친화성 T 세포 클론은 환자로부터 분리될 수 있고, TCR이 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, T 세포는 배양된 T 세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역 체계 유전자(예컨대, 인간 백혈구 항원 체계, 또는 HLA)로 조작된 유전자도입 마우스에서 생성되었다. 예컨대, 종양 항원(예컨대, 문헌[Parkhurst et al., 2009 및 Cohen et al., 2005]을 참조)을 참조한다. 일부 구현예에서, 파지 표시는 표적 항원에 대해 TCR을 분리하는 데 사용된다(예컨대, 문헌[Varela-Rohena et al., 2008 and Li, 2005]을 참조). 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 TCR 서열의 지식으로부터 합성하여 생성될 수 있다.
3. 항원 제시 세포
마크로파지, B 림프구, 및 수지상 세포를 포함하는 항원 제시 세포는 특정 MHC 분자의 발현에 의해 구별된다. APC는 항원을 내재화하고 항원의 부분을 MHC 분자와 함께 그들의 외부 세포막에 재발현한다. MHC는 다중 유전자좌를 갖는 거대 유전자 복합체이다. MHC 유전자좌는 클래스 I 및 클래스 II MHC라고 불리는 MHC 막 분자의 두 개의 주요 클래스를 암호화한다. T 보조 림프구는 일반적으로 MHC 클래스 II 분자와 결합된 항원을 인식하고 T 세포독성 림프구는 MHC 클래스 I 분자와 결합된 항원을 인식한다. 인간에서 MHC는 HLA 복합체라고 불리고 마우스에서는 H-2 복합체라고 불린다.
일부 경우에, aAPC는 구현예들의 치료 조성물 및 세포 치료 산물을 제조하는 데 유용하다. 항원 제시 시스템의 제제 및 사용에 관한 전반적인 가이드를 위해, 예컨대, 미국 특허 번호 6,225,042호, 6,355,479호, 6,362,001호 및 6,790,662호; 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0017000호 및 2009/0004142호; 및 국제 공개 번호 Wo2007/103009호를 참조한다.
aAPC 시스템은 적어도 하나의 외인성 보조(assisting) 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 수 및 조합이 이용될 수 있다. 보조 분자는 공자극 분자 및 접착 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 공자극 분자의 예는 CD86, CD64(FcγRI), 41BB 리간드, 및 IL-21을 포함한다. 접착 분자는 셀렉틴과 같은 탄수화물 결합 당단백질, 인테그린과 같은 막관통 결합 당단백질, 카드헤린(cadherin)과 같은 칼슘-의존성 단백질, 및 세포내 접착 단백질(ICAM)과 같은 단일-통과 막관통 면역글로불린(Ig) 상과 단백질을 포함할 수 있고, 이는 예를 들어 세포-대-세포 또는 세포-대-기질 접촉을 촉진한다. 접착 분자의 예는 LFA-3, 및 ICAM-1과 같은 ICAM을 포함한다. 공자극 분자 및 접착 분자를 포함하는, 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제제, 및 발현을 위해 유용한 기술, 방법, 및 시약은 예컨대 미국 특허 번호 6,225,042호, 6,355,479호, 및 6,362,001호에 예시되어 있다.
4. 인터루킨-15
인터루킨-15(IL-15)는 제한된 조직이고, 오직 병에 걸린 상태에서만 혈청에서 또는 전신에서 임의의 수준으로 관찰된다. IL-15는 입양 요법에 바람직한 몇몇 속성을 갖는다. IL-15는 자연 살해 세포의 발달과 세포 증식을 유도하고 종양-상주(tumor-resident) 세포의 기능 억제를 완화하여 정착 종양(established tumor)의 제거를 촉진하고, AICID를 억제하는 항상성 사이토카인이다.
일 구현예에서, 본 개시는 IL-15와 함께 CAR 및/또는 TCR 면역 세포를 공동 변형하는 것과 관련된 것이다. IL-15 이외에, 다른 사이토카인이 고려된다. 이에 제한되지 않지만, 사이토카인, 케모카인, 및 인간에 적용하기 위해 사용된 세포의 활성화 및 증식에 기여하는 기타 분자들을 포함한다. IL-15를 발현하는 NK 세포 또는 T 세포는 이들의 주입후 생존에 매우 중요한, 계속되는 보조 사이토카인 신호전달을 할 수 있다.
특정 구현예에서, K562 aAPC가 발달되었고 지속된 CAR-매개 증식을 할 수 있는 시험관내 면역 세포(예컨대, NK 세포)의 선택을 위하여, CD28, IL-15, 및 CD3ζ와 같은 공자극 분자와 함께 원하는 항원(예컨대, CD19)을 발현하였다. 이 강력한 기술은 인간에게 적용하기에 적합한 CAR+NK 세포의 임상적으로 의의가 있는 수(최대 1010)의 제조를 가능하게 한다. 필요에 따라, 추가 자극 사이클이 더 많은 수의 유전적으로 변형된 NK 세포를 생성하는 일을 맡을 수 있다. 전형적으로, 증식된 NK 세포의 적어도 90%가 CAR을 발현하고 주입을 위해 냉동보존될 수 있다. 또한, 이 접근법은 aAPC상의 CAR에 의해 인식된 종양 관련 항원(TAA)의 발현으로 도입 CAR의 특이성을 짝지음으로써 다양한 종양 유형으로 NK 세포를 생성하는 데 이용될 수 있다.
유전자 변형 후에 세포는 바로 주입되거나 저장될 수 있다. 특정 양태에서, 유전자 변형 후에, 세포는 세포내 유전자 도입 후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 이상내에 벌크 집단으로서 며칠, 몇 주, 또는 몇 달간 생체외 증식될 수 있다. 추가 양태에서, 감염체는 클로닝되고 단일 통합 또는 에피솜 유지 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재 및 키메라 수용체의 발현을 나타내는 클론은 생체외 증식된다. 증식을 위해 선택된 클론은 표적 세포를 발현하는 CD19를 특이적으로 인식하고 용해하는 능력을 나타낸다. 재조합 면역 세포는 IL-2 또는 공통 감마-쇄와 결합하는 다른 사이토카인(예컨대, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 및 기타)으로 자극되어 증식될 수 있다. 재조합 면역 세포는 인공 항원 제시 세포로 자극되어 증식될 수 있다. 추가 양태에서, 유저자 변형 세포는 냉동보존될 수 있다.
5. 항원
유전자 조작된 항원 수용체에 의해 표적되는 항원들 중에는 질환, 병태, 또는 면역 세포 요법을 통해 표적화되는 세포 유형의 환경에서 발현되는 것들이 있다. 질환 및 병태 중에는 혈액암, 면역 체계의 암, 예를 들어 림프종, 백혈병, 및/또는 골수종, 예를 들어 B, T, 및 골수성 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종을 비롯하여 암 및 종양을 포함하는 증식성, 종양, 및 악성 질환 및 장애가 있다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비표적 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 병태, 예컨대, 종양 또는 병원체 세포의 세포상에 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 종상 세포상에 발현되고/되거나 조작된 세포상에 발현된다.
임의의 적합한 항원은 본 방법에서의 용도를 발견할 수 있다. 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 감염원으로부터의 항원 분자, 자가-/자기-항원, 종양-/암-관련 항원, 및 종양 신생항원(neoantigen)을 포함한다(문헌[Linnemann et al., 2015]). 특정 양태에서, 항원은 NY-ESO, EGFRvIII, Muc-1, Her2, CA-125, WT-1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4, 및 CEA를 포함한다. 특정 양태에서, 두개 이상의 항원 수용체에 대한 항원은 이에 제한되지 않지만, CD19, EBNA, WT1, CD123, NY-ESO, EGFRvIII, MUC1, HER2, CA-125, WT1, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, TRAIL/DR4, 및/또는 CEA를 포함한다. 이들 항원의 서열은 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 CD19(수탁 번호 NG_007275.1), EBNA(수탁 번호 NG_002392.2), WT1(수탁 번호 NG_009272.1), CD123(수탁 번호 NC_000023.11), NY-ESO(수탁 번호 NC_000023.11), EGFRvIII(수탁 번호 NG_007726.3), MUC1(수탁 번호 NG_029383.1), HER2(수탁 번호 NG_007503.1), CA-125(수탁 번호 NG_055257.1), WT1(수탁 번호 NG_009272.1), Mage-A3(수탁 번호 NG_013244.1), Mage-A4(수탁 번호 NG_013245.1), Mage-A10(수탁 번호 NC_000023.11), TRAIL/DR4(수탁 번호 NC_000003.12), 및/또는 CEA(수탁 번호 NC_000019.10)이다.
종양 관련 항원은 전립선암, 유방암, 대장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 중피종, 난소암, 또는 흑색종 암에서 유래할 수 있다. 종양 관련 항원 또는 종양 세포 유래 항원의 예는 MAGE 1, 3, 및 MAGE 4(기타 국제 특허 공개 번호 Wo99/40188호에 개시된 것과 같은 기타 MAGE 항원); PRAME; BAGE; RAGE, Lage(NY ESO 1으로도 알려짐); SAGE; 및 HAGE 또는 GAGE를 포함한다. 종양 항원의 이들 비제한적인 예는 흑색종, 폐 암종, 육종, 및 방광 암종과 같은 종양 유형의 넓은 범위 안에서 발현된다. 예컨대, 미국 특허 번호 6,544,518호를 참조한다. 전립선 암 종양 관련 항원은 예를 들어, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 전립선-특이적 항원(PSA), 전립선 산 포스파타제, NKX3.1, 및 전립선의 여섯개의 막관통 상피 항원(STEAP)을 포함한다.
기타 종양 관련 항원은 Plu-1, HASH-1, HasH-2, Cripto 및 Criptin을 포함한다. 추가로, 종양 항원은 많은 암 치료에 유용한, 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬(GnRH)과 같은 자가 펩티드 호르몬, 짧은 10개 아미노산 길이의 펩티드일 수 있다.
종양 항원은 HER-2/neu 발현과 같은 종양 관련 항원 발현을 특징으로 하는 암에서 유래된 종양 항원을 포함한다. 목적하는 종양 관련 항원은 계통 특이적 종양 항원, 예를 들어 멜라닌세포-흑색종 계통 항원 MART-1/Melan-A, gp100, gp75, mda-7, 티로시나아제 및 티로시나아제-관련 단백질을 포함한다. 예시적인 종양 관련 항원은 이에 제한되지 않지만, p53, Ras, c-Myc, 세포질 세린/트레오닌 키나아제(예컨대, A-Raf, B-Raf, 및 C-Raf, 사이클린 의존성 키나아제), MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MART-1, BAGE, DAM-6, -10, GAGE-1, -2, -8, GAGE-3, -4, -5, -6, -7B, NA88-A, MART-1, MC1R, Gp100, PSA, PSM, 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, ART-4, CAMEL, CEA, Cyp-B, hTERT, hTRT, iCE, MUC1, MUC2, 포스포이노시티드 3-키나아제(PI3Ks), TRK 수용체, PRAME, P15, RU1, RU2, SART-1, SART-3, 빌름스 종양 항원(Wilms' tumor antigen, WT1), AFP, -카테닌/m, 카스파제-8/m, CEA, CDK-4/m, ELF2M, GnT-V, G250, HSP70-2M, HST-2, KIAA0205, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신/m, RAGE, SART-2, TRP-2/INT2, 707-AP, 아넥신(Annexin) II, CDC27/m, TPI/mbcr-abl, BCR-ABL, 인터페론 조절 인자 4 (IRF4), ETV6/AML, LDLR/FUT, Pml/RAR, 종양 관련 칼슘 신호 전달자(Tumor-associated calcium signal transducer 1, TACSTD1), TACSTD2, 수용체 티로신 키나아제(예컨대, 표피 성장 인자 수용체(EGFR)(특히, EGFRvIII), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR)), 세포질 티로신 키나아제(예컨대, src-과(family), syk-ZAP70 과), 인테그린-연결 키나아제(ILK), 신호 전달자 및 전사 활성제(signal transducers and activators of transcription) STAT3, STATS, 및 STATE, 저산소증 유도 인자(예컨대, HIF-1 및 HIF-2), 핵인자-카파 B(NF-B), 노치(Notch) 수용체(예컨대, 노치1-4), c-Met, 라파마이신(rapamycin)의 포유류 표적(mTOR), WNT, 세포외 신호조절 키나아제(ERKs), 및 이들의 조절 소단위, PMSA, PR-3, MDM2, 메소텔린, 신세포 암종-5T4, SM22-알파, 탄산 무수화효소 I(CAI) 및 IX (CAIX)(또한 G250으로 알려짐), STEAD, TEL/AML1, GD2, 단백분해효소3, hTERT, 육종 전좌 파열점(sarcoma translocation breakpoints), EphA2, ML-IAP, EpCAM, ERG (TMPRSS2 ETS 융합 유전자), NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체, 사이클린 B1, 폴리시알산, MYCN, RhoC, GD3, 푸코실(fucosyl) GM1, 중피(mesothelian), PSCA, sLe, PLAC1, GM3, BORIS, Tn, GLoboH, NY-BR-1, RGsS, SART3, STn, PAX5, OY-TES1, 정자 단백질 17, LCK, HMWMAA, AKAP-4, SSX2, XAGE 1, B7H3, 레구마인(legumain), TIE2, Page4, MAD-CT-1, FAP, MAD-CT-2, fos 관련 항원 1, CBX2, CLDN6, SPANX, TPTE, ACTL8, ANKRD30A, CDKN2A, MAD2L1, CTAG1B, SUNC1, LRRN1 및 유전형을 포함한다.
항원은 종양 세포에서 돌연변이된 유전자에서 유래된 또는 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 상이한 수준으로 전사된 유전자에서 유래된 항원 결정기 영역 또는 항원 결정기 펩티드를 포함할 수 있고, 예를 들어 텔로머라제 효소, 서비빈(survivin), 메소텔린, 변이 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 변이 또는 야생형 p53, 시토크롬 P450 1B1, 및 비정상적으로 발현된 인트론 서열, 예를 들어 N-아세틸글루코사민전이효소(acetylglucosaminyltransferase)-V; 골수종 및 B-세포 림프구에서 고유한 유전형을 생성하는 면역글로불린 유전자의 클론 재배열; 종양바이러스 프로세스에서 유래한 항원 결정기 영역 또는 항원 결정기 펩티드를 포함하는 종양 항원, 예를 들어 인간 유두종 바이러스 단백질 E6 및 E7; 엡스타인 바 바이러스 단백질 LMP2; 종양-선택적 발현이 있는 비변이성 태아 종양 단백질, 예를 들어 암배아 항원 및 알파태아단백을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 항원은 병원성 미생물에서 수득되거나 유래되고, 또는 기회 병원성 미생물(본원에서 감염성 질환 미생물이라고도 불림), 예를 들어 바이러스, 진균류, 기생충, 및 박테리아에서 수득되거나 유래된다. 특정 구현예에서, 이러한 미생물에서 유래된 항원은 전장 단백질을 포함한다.
그의 항원이 본원에서 기술된 방법에서 사용하기 위해 상정되는 예시적 병원체는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 인플루엔자 A, B, 및 C, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 폴리오마바이러스(예컨대, BK 바이러스 및 JC 바이러스), 아데노바이러스, 메티실린 저항성 황색 포도 구균(MRSA)을 포함하는 포도상구균종, 및 폐렴연쇄상구균을 포함하는 연쇄상구균종을 포함한다. 당업자에게 이해되는 것처럼, 본원에 기술된 바와 같은 항원으로서 사용하기 위하여 이들 및 다른 병원성 미생물로부터 유래된 단백질 및 이 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 공개적으로 그리고 공용 데이터베이스 예를 들어 GENBANK®, SWISS-PROT®, 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 항원은 HIV 비리온 구조 단백질(예컨대, gp120, gp41, p17, p24), 프로테아제, 역전사효소, 또는 tat, rev, nef, vif, vpr 및 vpu로 암호화된 HIV 단백질 중 임의의 것을 포함한다.
단순 헤르페스 바이러스(예컨대, HSV 1 및 HSV2)에서 유래된 항원은 이에 제한되지 않지만, HSV 늦발현유전자(late gene)에서 발현된 단백질을 포함한다. 늦발현유전자 군은 비리온 입자를 형성하는 단백질을 암호화한다. 이러한 단백질은 각각 본원에 기술된 항원으로 사용될 수 있는, 바이러스 캡시드: UL6, UL18, UL35, UL38 및 주요 캡시드 단백질 UL19, UL45, 및 UL27을 형성하는 (UL) 중 다섯 개의 단백질을 포함한다. 본원에서 항원으로 상용하기 위하여 상정된 다른 예시적 HSV 단백질은 ICP27(H1, H2), 당단백질 B(gB) 및 당단백질 D(gD) 단백질을 포함한다. HSV 게놈은 적어도 74개의 유전자를 포함하고, 잠재적으로 항원으로 이용될 수 있는 단백질을 각각 암호화한다.
시토메갈로바이러스(CMV)에서 유래된 항원은 CMV 구조 단백질, 바이러스 복제의 전초기 및 초기 중에 발현된 바이러스 항원, 당단백질 I 및 III, 캡시드 단백질, 코트 단백질, 저기질(lower matrix) 단백질 pp65(ppUL83), p52(ppUL44), IE1 및 1E2(UL123 및 UL122), UL128-UL150의 유전자 클러스터로부터 얻은 단백질 산물(문헌[Rykman, et al., 2006]), 외피 당단백질 B(gB), gH, gN, 및 pp150을 포함한다. 당업자에게 이해되는 것처럼, 본원에 기술된 항원으로 사용하기 위한 CMV 단백질은 GENBANK®, SWISS-PROT®, 및 TREMBL®와 같은 공용 데이터베이스에서 확인될 수 있다(예컨대, 문헌[Bennekov et al., 2004; Loewendorf et al., 2010; Marschall et al., 2009] 참조).
특정 구현예에서 사용하기 위해 고려되는 엡스타인-바 바이러스(EBV)에서 유래된 항원은 EBV 용해 단백질 gp 350 및 gp 110, 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)-1, EBNA-2, EBNA-3A, EBNA-3B, EBNA-3C, EBNA-선도 단백질(EBNA-LP)을 포함하는 잠복기 감염 중에 생산된 EBV 단백질, 및 잠복 막 단백질(LMP)-1, LMP-2A 및 LMP-2B를 포함한다(예컨대, 문헌[Lockey et al., 2008]을 참조).
본원에서 사용하기 위해 고려되는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에서 유래된 항원은 RSV 게놈에 의해 암호화되는 11개의 단백질, 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것을 포함한다: NS1, NS2, N(뉴클레오캡시드 단백질), M(기질 단백질) SH, G 및 F(바이러스 외피 단백질), M2(제2 기질 단백질), M2-1(신장 인자), M2-2(전사 조절), RNA 중합효소, 및 인단백질 P.
사용하기 위해 고려되는 수포성 구내염 바이러스(VSV)에서 유래된 항원은 VSV 게놈에 의해 암호화되는 다섯 개의 주요 단백질, 또는 이들의 항원 단편 중 임의의 것을 포함한다: 거대 단백질(L), 당단백질(G), 핵단백질(N), 인단백질(P), 및 기질 단백질(M)(예컨대, 문헌[Rieder et al., 1999]을 참조).
특정 구현예에서 사용하기 위해 고려되는 인플루엔자 바이러스에서 유래된 항원은 적혈구응집소(HA), 뉴라미니다아제(NA), 핵단백질(NP), 기질 단백질 M1 및 M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2, 및 PB2를 포함한다.
또한 예시적인 바이러스 항원은 이에 제한되지 않지만, 아데노바이러스 폴리펩티드, 알파바이러스 폴리펩티드, 칼리시바이러스 폴리펩티드(예컨대, 칼리시바이러스 캡시드 항원), 코로나바이러스 폴리펩티드, 디스템퍼(distemper) 바이러스 폴리펩티드, 에볼라 바이러스 폴리펩티드, 엔테로바이러스 폴리펩티드, 플라비바이러스 폴리펩티드, 간염 바이러스(AE) 폴리펩티드(B형 간염 핵심 또는 표면 항원, C형 간염 바이러스 E1 또는 E2 당단백질, 핵심, 또는 비구조 단백질), (단순 헤르페스 바이러스 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질을 포함하는) 헤르페스바이러스 폴리펩티드, 전염성 복막염 바이러스 폴리펩티드, 백혈병 바이러스 폴리펩티드, 마르부르그(Marburg) 바이러스 폴리펩티드, 오르토믹소(orthomyxo)바이러스 폴리펩티드, 유두종 바이러스 폴리펩티드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩티드(예컨대, 적혈구응집소 및 뉴라미니다아제 폴리펩티드), 파라믹소바이러스 폴리펩티드, 파보(parvo)바이러스 폴리펩티드, 페스티바이러스 폴리펩티드, 피코르나(picorna) 바이러스 폴리펩티드 (예컨대, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드), 폭스(pox) 바이러스 폴리펩티드(예컨대, 우두 바이러스 폴리펩티드), 광견병 바이러스 폴리펩티드(예컨대, 광견병 바이러스 당단백질(G), 레오바이러스 폴리펩티드, 레트로바이러스 폴리펩티드, 및 로터바이러스 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원은 박테리아 항원일 수 있다. 특정 구현예에서, 목적하는 박테리아 항원은 분비된 폴리펩티드일 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 박테리아 항원은 박테리아의 외부 세포 표면상에 노출된 폴리펩티드의 일부분 또는 부분들을 가지는 항원을 포함한다.
사용하기 위해 고려되는 메티실린 저항성 황색 포도 구균(MRSA)을 포함하는 포도상구균종에서 유래된 항원은 독성 조절자, 예를 들어 Agr 시스템, Sar 및 Sae, Arl 시스템, Sar 동족체(Rot, MgrA, SarS, SarR, SarT, SarU, SarV, SarX, SarZ 및 TcaR), Srr 시스템 및 TRAP을 포함한다. 항원으로 작용하는 다른 포도상구균 단백질은 Clp 단백질, HtrA, MsrR, 아코니타제(aconitase), CcpA, SvrA, Msa, CfvA 및 CfvB(예컨대, 문헌[Staphylococcus: Molecular Genetics, 2008 Caister Academic Press, Ed. Jodi Lindsay] 참조)를 포함한다. 황색포도상구균의 두 종(N315 및 Mu50)의 게놈은 시퀀싱되었고 예를 들면 PATRIC(문헌[PATRIC: The VBI PathoSystems Resource Integration Center, Snyder et al., 2007])에서 공개적으로 이용가능하다. 당업자에게 이해되는 것처럼, 항원으로 사용하기 위한 황색포도상구균 단백질은 또한 다른 공용 데이터베이스, 예를 들어 GenBank®, Swiss-Prot®, 및 TrEMBL®에서 확인될 수 있다.
본원에 기술된 특정 구현예에서 사용하기 위하여 고려되는 폐렴연쇄상구균에서 유래된 항원은 폐렴구균용혈소, PspA, 콜린-결합 단백질 A(CbpA), NanA, NanB, SpnHL, PavA, LytA, Pht, 및 필린(pilin) 단백질(RrgA; RrgB; RrgC)을 포함한다. 폐렴연쇄상구균의 항원 단백질은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있고 일부 구현예에서 항원으로 사용될 수 있다(예컨대, 문헌[Zysk et al., 2000]을 참조). 당업자에게 이해되는 것처럼, 폐렴연쇄상구균의 악성 변종의 완전 게놈 서열은 시퀀싱되었고, 본원에서 사용하기 위한 폐렴연쇄상구균 단백질은 또한 다른 공용 데이터베이스, 예를 들어 GENBANK®, SWISS-PROT®, 및 TREMBL®에서 확인될 수 있다. 본 개시에 따른 항원으로서 특히 목적하는 단백질은 폐렴쌍구균의 표면에서 노출될 것으로 예상되는 독성 인자 및 단백질을 포함한다(예컨대, 문헌[Frolet et al., 2010]을 참조).
항원으로 사용될 수 있는 박테리아 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 방선균 폴리펩티드, 바실루스 폴리펩티드, 박테로이드 폴리펩티드, 보르데텔라 폴리펩티드, 바르토넬라 폴리펩티드, 보렐리아 폴리펩티드(예컨대, B. 부르그도르페리(burgdorferi) OspA), 브루셀라 폴리펩티드, 캄필로박터 폴리펩티드, 카프노사이토파가 폴리펩티드, 클라미디아 폴리펩티드, 코리네박테륨 폴리펩티드, 콕시엘라 폴리펩티드, 더마토필러스 폴리펩티드, 장구균 폴리펩티드, 에를리히아(Ehrlichia) 폴리펩티드, 대장균 폴리펩티드, 프란시엘라 폴리펩티드, 푸소박테륨 폴리펩티드, 헤모바르토넬라 폴리펩티드, 헤모필루스 폴리펩티드(예컨대, b형 H. 인플루엔자 외부막 단백질), 헬리코박터 폴리펩티드, 클레브시엘라 폴리펩티드, L-형 박테리아 폴리펩티드, 렙토스피라 폴리펩티드, 리스테리아 폴리펩티드, 마이코박테리아 폴리펩티드, 마이코플라스마 폴리펩티드, 나이세리아 폴리펩티드, 네오리케치아 폴리펩티드, 노카르디아 폴리펩티드, 파스퇴렐라 폴리펩티드, 펩토코커스 폴리펩티드, 펩토스트렙토코커스 폴리펩티드, 폐렴연쇄구균 폴리펩티드(즉, 폐렴연쇄상구균 폴리펩티드)(본원 명세서 참조), 프로테우스 폴리펩티드, 슈도모나스 폴리펩티드, 리케치아 폴리펩티드, 로칼리메아 폴리펩티드, 살모넬라 폴리펩티드, 시겔라 폴리펩티드, 포도상구균 폴리펩티드, A군 연쇄상구균 폴리펩티드(예컨대, 화농성 연쇄상구균 M 단백질), B군 연쇄상구균(S. 아갈락티에(agalactiae)) 폴리펩티드, 트레포네마 폴리펩티드, 및 예르시니아 폴리펩티드(예컨대, Y 페스티스(pestis) F1 및 V 항원)를 포함한다.
진균 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 압시디아 폴리펩티드, 아크레모늄 폴리펩티드, 알터나리아 폴리펩티드, 아스페르길루스(Aspergillus) 폴리펩티드, 바시디오볼루스(Basidiobolus) 폴리펩티드, 바이폴라리스 폴리펩티드, 분아진균 폴리펩티드, 칸디다 폴리펩티드, 콕시디오이디즈(Coccidioides) 폴리펩티드, 코니디오볼루스 폴리펩티드, 크립토코커스(Cryptococcus) 폴리펩티드, 쿠르불라리아 폴리펩티드, 표피사상균 폴리펩티드, 엑소피알라 폴리펩티드, 지오트리쿰 폴리펩티드, 히스토플라스마 폴리펩티드, 마두렐라 폴리펩티드, 말라세지아 폴리펩티드, 소포자균 폴리펩티드, 모니리엘라(Moniliella) 폴리펩티드, 모르티에렐라(Mortierella) 폴리펩티드, 털곰팡이 폴리펩티드, 패실로마이세스(Paecilomyces) 폴리펩티드, 페니실륨 폴리펩티드, 피알레모늄(Phialemonium) 폴리펩티드, 피알로포라 폴리펩티드, 프로토테카 폴리펩티드, 슈달레쉐리아(Pseudallescheria) 폴리펩티드, 슈도마이크로도키움(Pseudomicrodochium) 폴리펩티드, 파이티움(Pythium) 폴리펩티드, 리노스포리듐(Rhinosporidium) 폴리펩티드, 리조푸스(Rhizopus) 폴리펩티드, 스콜레코바시듐(Scolecobasidium) 폴리펩티드, 스포로트릭스(Sporothrix) 폴리펩티드, 스템파일리움(Stemphylium) 폴리펩티드, 트리코파이톤(Trichophyton) 폴리펩티드, 트리코스포론(Trichosporon) 폴리펩티드, 및 크실로하이파(Xylohypha) 폴리펩티드를 포함한다.
원생 기생충 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 바베시아(Babesia) 폴리펩티드, 발란티듐(Balantidium) 폴리펩티드, 베스노이티아(Besnoitia) 폴리펩티드, 크립토스포리듐(Cryptosporidium) 폴리펩티드, 에이메리아(Eimeria) 폴리펩티드, 엔세팔리토조온(Encephalitozoon) 폴리펩티드, 엔타모에바(Entamoeba) 폴리펩티드, 기아르디아(Giardia) 폴리펩티드, 함몬디아(Hammondia) 폴리펩티드, 헤파토조온(Hepatozoon) 폴리펩티드, 이소스포라(Isospora) 폴리펩티드, 레이쉬마니아(Leishmania) 폴리펩티드, 마이크로스포리디아(Microsporidia) 폴리펩티드, 네오스포라(Neospora) 폴리펩티드, 노세마(Nosema) 폴리펩티드, 펜타트리코모나스(Pentatrichomonas) 폴리펩티드, 플라스모듐(Plasmodium) 폴리펩티드를 포함한다. 장내 기생충 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 아칸소케일로네마(Acanthocheilonema) 폴리펩티드, 앨루로스트론길루스(Aelurostrongylus) 폴리펩티드, 안실로스토마(Ancylostoma) 폴리펩티드, 안지오스트론길루스(Angiostrongylus) 폴리펩티드, 아스카리스(Ascaris) 폴리펩티드, 브루기아(Brugia) 폴리펩티드, 부노스토뭄(Bunostomum) 폴리펩티드, 캐필라리아(Capillaria) 폴리펩티드, 차베르티아(Chabertia) 폴리펩티드, 코오페리아(Cooperia) 폴리펩티드, 크레노소마(Crenosoma) 폴리펩티드, 딕티오카울루스(Dictyocaulus) 폴리펩티드, 디옥토파임(Dioctophyme) 폴리펩티드, 디페탈로네마(Dipetalonema) 폴리펩티드, 디파일로보스륨(Diphyllobothrium) 폴리펩티드, 디플라이듐(Diplydium) 폴리펩티드, 디로필라리아(Dirofilaria) 폴리펩티드, 드라쿤쿨러스(Dracunculus) 폴리펩티드, 엔테로비우스(Enterobius) 폴리펩티드, 필라로이데스(Filaroides) 폴리펩티드, 해몬쿠스(Haemonchus) 폴리펩티드, 라고킬라스카리스(Lagochilascaris) 폴리펩티드, 로아(Loa) 폴리펩티드 폴리펩티드, 만소넬라(Mansonella) 폴리펩티드, 무엘레리우스(Muellerius) 폴리펩티드, 나노파이에투스(Nanophyetus) 폴리펩티드, 네카토르(Necator) 폴리펩티드, 네마토디루스(Nematodirus) 폴리펩티드, 오에소파고스토뭄(Oesophagostomum) 폴리펩티드, 온코세르카(Onchocerca) 폴리펩티드, 오피스토르키스(Opisthorchis) 폴리펩티드, 오스터타기아(Ostertagia) 폴리펩티드, 파라필라리아(Parafilaria) 폴리펩티드, 파라고니무스(Paragonimus) 폴리펩티드, 파라스카리스(Parascaris) 폴리펩티드, 파이살로프테라(Physaloptera) 폴리펩티드, 프로토스트론길루스(Protostrongylus) 폴리펩티드, 세타리아(Setaria) 폴리펩티드, 스피로세르카(Spirocerca) 폴리펩티드, 스피로메트라(Spirometra) 폴리펩티드, 스테파노필라리아(Stephanofilaria) 폴리펩티드, 스트론길로이데스(Strongyloides) 폴리펩티드, 스트론길루스(Strongylus) 폴리펩티드, 텔라지아(Thelazia) 폴리펩티드, 톡사스카리스(Toxascaris) 폴리펩티드, 톡소카라(Toxocara) 폴리펩티드, 트리키넬라(Trichinella) 폴리펩티드, 트리코스트론길루스(Trichostrongylus) 폴리펩티드, 트리쿠리스(Trichuris) 폴리펩티드, 운시나리아(Uncinaria) 또는 우케레리아(Wuchereria) 폴리펩티드(예컨대, P. 팔시파룸(falciparum) 포자소체(circumsporozoite)(PfCSP)), 포자소체(sporozoite) 표면 단백질 2(PfSSP2), 간 상태 항원 1의 카르복시 말단(PfLSA1 c-말단), 및 외수송 단백질 1(PfExp-1), 뉴모시스티스(Pneumocystis) 폴리펩티드, 사코시스티스(Sarcocystis) 폴리펩티드, 스키스토소마(Schistosoma) 폴리펩티드, 테일레리아(Theileria) 폴리펩티드, 톡소플라스마(Toxoplasma) 폴리펩티드, 트립파노소마(Trypanosoma) 폴리펩티드를 포함한다.
외부기생충 항원의 예는 이에 제한되지 않지만, 벼룩; 참진드기 및 물렁진드기를 포함하는 진드기; 파리류, 예컨대 깔따구, 모기, 모래 파리, 먹파리, 말파리, 뿔파리, 사슴파리, 체체(tsetse)파리, 침파리, 구더기증 유발 파리 및 각다귀; 개미; 거미, 이; 등에; 및 참 벌레, 예컨대 빈대 및 키스 벌레(kissing bug) 유래 폴리펩티드(알레르겐뿐 아니라 항원을 포함)를 포함한다.
6. 자살 유전자
본 개시의 면역 세포의 CAR 및/또는 TCR은 하나 이상의 자살 유전자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 “자살 유전자”는 전구 약물의 투여 시, 숙주 세포를 죽이는 화합물에 유전자 산물의 전이를 일으키는 유전자로 정의된다. 사용될 수 있는 자살 유전자/전구약물 조합의 예는 단순 헤르페스 바이러스-티미딘 키나아제(HSV-tk) 및 간시클로비르(ganciclovir), 아시클로비르(acyclovir), 또는 FIAU; 산화환원효소 및 시클로헥시미드(cycloheximide); 시토신 데아미나아제(cytosine deaminase) 및 5-플루오로시토신; 티미딘 키나아제 티미딜산 키나아제(Tdk::Tmk) 및 AZT; 및 디옥시시티딘 키나아제 및 시토신 아라비노시드이다.
E.coli 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제는 전구 약물 6-메틸퓨린 데옥시리보시드를 독성 퓨린 6-메틸퓨린으로 변환시키는 소위 자살 유전자이다. 전구약물 요법과 함께 사용되는 자살 유전자의 다른 예는 E. coli 시토신 데아미나아제 유전자 및 HSV 티미딘 키나아제 유전자이다.
예시적인 자살 유전자는 CD20, CD52, EGFRv3, 또는 유도성 카스파제 9를 포함한다. 일 구현예에서, EGFR 변이체 III(EGFRv3)의 절단된 버전이 세툭시맙(Cetuximab)에 의해 제거될 수 있는 자살 유전자로 사용될 수 있다. 본 개시에서 사용될 수 있는 당해 기술 분야에 알려진 추가 자살 유전자는 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제(pnp), 시토크롬 p450 효소(cyp), 카복시펩티다아제(CP), 카복실에스테라아제(CE), 니트로환원효소(Nitroreductase, NTR), 구아닌 리보실전이효소(Guanine Ribosyltransferase, XGRTP), 글리코시다아제 효소, 메티오닌-α,γ-리아제(MET), 및 티미딘 포스포릴라아제(TP)를 포함한다.
7. 전달 방법
당업자는 본 개시의 항원 수용체의 발현을 위해 표준 재조합 기술(예를 들면, 둘 다 본원에 참조로서 포함된 문헌[Sambrook et al., 2001] 및 문헌[Ausubel et al., 1996]을 참조)을 통해 벡터를 작제하는 데 필요한 소양을 갖추고 있을 것이다. 벡터는 이에 제한되지 않지만, 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예컨대, YAC), 예를 들어 레트로바이러스 벡터(예컨대, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 벡터(Moloney murine leukemia virus vectors, MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등에서 유래), 렌티바이러스 벡터(예컨대, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등에서 유래), 복제 가능, 복제 결핍 및 부재(gutless) 형을 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 시미안 바이러스 40(SV-40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터, 하비 쥐 육종 바이러스 벡터(Harvey murine sarcoma virus vector), 쥐 유방 종양 바이러스 벡터, 라우스 육종 바이러스 벡터, 파보바이러스 벡터, 폴리오 바이러스 벡터, 수포성 구내염 바이러스 벡터, 마라바(maraba) 바이러스 벡터 및 B군 아데노바이러스 에나데노투시레브(enadenotucirev) 벡터를 포함한다.
a. 바이러스 벡터
항원 수용체를 암호화하는 바이러스 벡터는 본 개시의 특정 양태에서 제공될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 생성할 때, 비본질적인 유전자는 일반적으로 이종(또는 비고유) 단백질에 대한 유전자 또는 코딩 서열로 치환된다. 바이러스 벡터는 핵산 및 가능한 단백질을 세포내로 도입하는 데 바이러스 서열을 사용하는 일종의 발현 작제물이다. 세포를 감염시키거나 수용체-매개 엔도시토시스를 통해 세포로 들어가고, 숙주 세포 게놈에 통합되고 바이러스 유전자를 안정적이고 효율적으로 발현하는 특정 바이러스의 능력은 외부 핵산을 세포(예컨대, 포유류 세포)내로 전이하는 데 해당 바이러스를 매력적인 후보자로 만든다. 본 발명의 특정 양태의 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기에 기술된다.
렌티바이러스는 통상적인 레트로바이러스 유전자인 gag, pol, 및 env에 더하여 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복잡한 레트로바이러스이다. 렌티바이러스 벡터는 당해 기술 분야에 잘 알려져있다(예를 들면, 미국 특허 6,013,516호 및 5,994,136호 참조).
재조합 렌티바이러스 벡터는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 전이 둘 모두와 핵산 서열의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들면, 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스(적합한 숙주 세포가 패키지 기능, 즉 rev 및 tat뿐 아니라 gag, pol 및 env를 지니는 둘 이상의 벡터로 트랜스펙션됨)가 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 5,994,136호에 기술되어 있다.
b. 조절 요소
본 개시에 유용한 벡터에 포함된 발현 카세트는 특히 (5’에서 3’ 방향으로) 단백질 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 진핵 전사 프로모터, 개재 서열을 포함하는 스플라이스 신호, 및 전사 종결/폴리아데닐화 서열을 포함한다. 진핵 세포에서 유전자를 암호화하는 단백질의 전사를 조절하는 프로모터 및 인핸서는 여러 유전자 요소로 구성된다. 세포 기구는 상이한 유전자가 전사 조절의 뚜렷한, 종종 복잡한 패턴을 진전시키게 하는, 각각의 요소에 의해 전달된 조절 정보를 모으고 통합할 수 있다. 본 개시의 문맥에서 사용된 프로모터는 유도가능한 조직 특이적 구성 프로모터를 포함한다.
(i) 프로모터/인핸서
본원에 제공된 발현 작제물은 항원 수용체의 발현을 추진하는 프로모터를 포함한다. 프로모터는 일반적으로 RNA 합성을 위한 개시 부위에 위치하는 기능을 하는 서열을 포함한다. 이의 가장 잘 알려진 예는 TATA 상자가 있지만, 일부 TATA 상자가 결핍된 프로모터, 예를 들어 포유류 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소 유전자에 대한 프로모터 및 SV40 늦발현 유전자에 대한 프로모터에서, 그 자체의 개시 부위와 중첩되는 별개의 요소가 개시 위치를 바로잡는 데 도움을 준다. 추가 프로모터 요소는 전사 개시의 빈도수를 조절한다. 전형적으로, 프로모터 요소는 개시 부위의 30110 bp 상류 영역에 위치하지만, 많은 프로모터가 개시 부위의 하류에도 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났다. 코딩 서열을 프로모터의 “조절 하에” 놓기 위하여, 코딩 서열은 선택된 프로모터의 “하류”(즉, 3') 전사 해독틀의 전사 개시 부위의 5' 말단에 위치한다. “상류” 프로모터는 DNA의 전사를 자극하고 암호화된 RNA의 발현을 촉진한다.
프로모터 요소들 사이의 공간은 흔히 유연해서, 요소들이 서로에 대해 역위되거나 이동될 때도 프로모터 기능이 보존된다. tk 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 공간은 활성의 감소가 시작되기 전 50 bp까지 떨어지도록 증가될 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성하하기 위하여 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다. 프로모터는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스-작용(cis-acting) 조절 서열이라 불리는 “인핸서”와 함께 사용되거나 사용되지 않을 수 있다.
프로모터는 핵산 서열과 자연적으로 결합될 수 있고, 코딩 절편 및/또는 엑손의 상류에 위치한 5' 비코딩 서열을 분리함으로써 수득될 수 있다. 이러한 프로모터를 “내인성”이라고 할 수 있다. 유사하게, 인핸서는 핵산 서열과 자연적으로 결합될 수 있고, 그 서열의 하류 또는 상류에 위치될 수 있다. 대안으로, 자연 환경 속에서 핵산 서열과 정상적으로 결합하지 않는 프로모터를 의미하는, 재조합 또는 이종 프로모터의 제어하에 코딩 핵산 절편을 위치시킴으로써 특정 이점이 얻어질 것이다. 재조합 또는 이종 인핸서는 또한 자연 환경 속에서 핵산 서열과 정상적으로 결합하지 않는 인핸서를 의미한다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서, 및 임의의 다른 바이러스, 또는 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 분리된 프로모터 또는 인핸서, 및 “자연 발생”하지 않는, 즉 상이한 전사 조절 영역의 상이한 요소 및/또는 발현을 변형시키는 돌연변이를 포함하는 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 DNA 작제에서 가장 흔하게 사용되는 프로모터는 β락타마아제(페니실리나아제), 락토스, 및 트립토판(trp-) 프로모터 시스템을 포함한다. 프로모터 및 인핸서의 핵산 서열을 합성하여 제조할 뿐 아니라, 본원에 개시된 조성물과 관련되어. 재조합 클로닝 및/또는 PCR™을 비롯한 핵산 증폭 기술을 사용하여 서열이 제조될 수 있다. 또한, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비핵성 세포 소기관내의 서열의 전사 및/또는 발현을 유도하는 제어 서열 또한 사용될 수 있음이 고려된다.
물론, 발현을 위해 선택된 세포 소기관, 세포 유형, 조직, 장기, 또는 생물체에서의 DNA 절편의 발현을 효율적으로 유도하는 프로모터 및/또는 인핸서를 사용하는 것이 중요할 것이다. 분자생물학의 당업자는 단백질 발현을 위한 프로모터, 인핸서 및 세포 유형의 조합의 사용을 알고 있다(예를 들면, 본원에 참조로서 포함된 문헌[Sambrook et al. 1989]을 참조). 사용된 프로모터는 도입 DNA 절편의 고발현 수준을 유도하기에 적절한 조건하에 구성적이고, 조직-특이적이고, 유도가능하고/하거나 유용할 수 있으며, 예를 들어 재조합 단백질 및/또는 펩티드의 대량 생산에 많은 이점이 있다. 프로모터는 이종유래이거나 내인성일 수 있다.
또한, (예를 들면, www.epd.isb-sib.ch/를 통해 EPDB(Eukaryotic Promoter Data Base)를 따라) 임의의 프로모터/인핸서 조합은 또한 발현을 추진하는 데 사용될 수 있다. T3, T7, 또는 SP6 세포질 발현 시스템의 사용은 또 다른 가능한 구현예이다. 진핵 세포는 적절한 박테리아 중합효소가 제공되는 경우, 전달 복합체의 부분으로서 또는 추가 유전자 발현 작제물로서 특정 박테리아 프로모터로부터 세포질 전사를 보조할 수 있다.
프로모터의 비제한적인 예는 초기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예를 들어 SV 40 초기 또는 후기 프로모터, 시토메갈로바이러스(cmv) 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 초기 프로모터; 진핵 세포 프로모터, 예를 들어 베타 액틴 프로모터, GADPH 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터; 및 연쇄 반응 요소 프로모터, 예를 들어 시클릭 AMP 반응 요소 프로모터(cre), 혈청 반응 요소 프로모터(sre), 포르볼 에스테르(phorbol ester) 프로모터(TPA) 및 최소 TATA 상자 근처의 반응 요소 프로모터(tre)를 포함한다. 인간 성장 호르몬 프로모터 서열(예컨대, Genbank, 수탁 번호 X05244, 뉴클레오티드 283-341에 기술된 인간 성장 호르몬 최소 프로모터) 또는 마우스 유방 종양 프로모터(ATCC, Cat. No. ATCC 45007에서 입수 가능)를 사용하는 것 또한 가능하다. 특정 구현예에서, 프로모터는 CMV IE, 덱틴-1, 덱틴-2, 인간 CD11c, F4/80, SM22, RSV, SV40, Ad MLP, 베타-액틴, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 프로모터이지만, 치료 유전자의 발현을 추진하는 데 유용한 임의의 다른 프로모터가 본 개시의 실시에 적용가능하다.
특정 양태에서, 본 개시의 방법은 또한 인핸서 서열, 즉 프로모터의 활성을 증가시키고, 서열의 배향에 관계없이, 심지어 비교적 멀리 있어도(표적 프로모터와 수킬로베이스까지 떨어져 있어도) 시스 작용할 가능성이 있는 핵산 서열에 관한다. 하지만, 인핸서 기능은 주어진 프로모터에 아주 근접하여 기능할 수도 있으므로 그렇게 먼 거리에 꼭 제한되는 것은 아니다.
(ii) 개시 신호 및 연결된 발현
특정 개시 신호는 또한 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 본 개시에 제공된 발현 작제물에서 사용될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 비롯하여 외인성 번역 제어 신호는 제공될 필요가 있을 수 있다. 당업자라면 이를 판정하여 필요한 신호를 손쉽게 제공할 수 있다. 개시 코돈이 전체 삽입의 번역을 확실히 하는 원하는 코딩 서열의 해독틀과 함께 “틀 내”에 있어야 함은 잘 알려져있다. 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 자연적이거나 합성일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소의 봉입에 의해 강화될 수 있다.
특정 구현예에서, 내부 리보솜 도입 서열(IRES)의 용도는 다중유전자, 또는 폴리시스트론성, 메시지를 생성하는 데 사용된다. IRES 요소는 5’-메틸화된 캡 의존성 해독의 리보솜 스캐닝 모델을 우회하여 내부 부위에서 번역을 개시할 수 있다. 피코르나바이러스 과의 두 개의 구성원(폴리오 및 뇌심근염 바이러스)의 IRES 요소뿐만 아니라, 포유류 메시지로부터의 IRES도 기술되었다. IRES 요소는 이종 열린 해독틀(open reading frame)에 연결될 수 있다. 각각 IRES에 의해 분리된 다수의 열린 해독틀이 함께 전사되어, 폴리시스트론성 메시지가 생성될 수 있다. IRES 요소에 의해, 각각의 열린 해독틀이 효율적인 번역을 위해 리보솜에 접근가능하다. 단일 프로모터/인핸서를 사용해서 단일 메시지를 전사시켜 다수의 유전자가 효율적으로 발현될 수 있다.
또한, 특정 2A 서열 요소는 본 개시에서 제공된 작제물에서 유전자의 연결- 또는 공-발현을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 열린 해독틀을 연결하여 단일 시스트론을 형성함으로써 유전자를 공발현하는 데 절단 서열이 사용될 수 있다. 예시적인 절단 서열은 F2A(구제역 바이러스 2A) 또는 “2A-유사” 서열(예컨대, 토세아 아사인아(Thosea asigna) 바이러스 2A; T2A)이다.
(iii) 복제의 기점
숙주에서 벡터를 번식시키기 위하여, 하나 이상의 복제 기점 부위(종종 “ori”로 칭함), 예를 들면, 전술한 바와 같은 EBV의 oriP 또는 프로그래밍 시 유사 또는 상승 기능이 있는 유전자 조작된 oriP에 상응하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 복제가 개시되는 특정 핵산 서열이다. 대안으로, 전술한 바와 같이 염색체외 복제 바이러스의 복제 기점 또는 자율 복제 서열(ARS)이 이용될 수 있다.
c. 선택 및 선별 마커
일부 구현예에서, 본 개시의 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함함으로써 시험관내 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 발현 벡터를 포함하는 세포를 쉽게 확인하게 하는 세포에 인식가능한 변화를 부여할 것이다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 특성을 부여하는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 마커의 선택을 가능하게 하는 것이지만, 음성 선택 마커는 마커의 존재가 마커의 선택을 방해하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 저항성 마커이다.
보통 약물 선택 마커의 포함은 형질전환체의 클로닝 및 확인에 도움을 준다, 예를 들면 네오마이신, 퓨로마이신, 히그로마이신(hygromycin), DHFR, GPT, 제오신(zeocin) 및 히스티디놀(histidinol)에 저항성을 부여하는 유전자가 유용한 선택 마커이다. 조건의 실행에 기초하여 형질전환체의 식별을 가능하게 하는 표현형을 부여하는 마커에 더하여, 비색 분석에 기초한 GFP와 같은 선별 가능 마커를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안으로, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(tk) 또는 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT)와 같은 음성 선택 마커로서 선별 효소가 이용될 수 있다. 당업자라면 또한 FACS 분석과 함께 사용 가능한 면역학적 마커를 사용하는 법을 알 것이다. 사용된 마커는 유전자 산물을 암호화하는 핵산과 동시에 발현될 수 있는 한 중요하다고 여겨지지 않는다. 선택 및 선별 마커의 추가 예는 당업자에게 잘 알려져 있다.
d. 핵산 전달의 기타 방법들
항원 수용체를 암호화하는 핵산의 바이러스 전달에 더하여, 다음은 주어진 숙주 세포에 재조합 유전자 전달의 추가 방법이므로 본 개시에서 고려된다.
핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA를 본 개시의 면역 세포내로 도입하는 것은 본원에 개시된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 바와 같이, 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달의 임의의 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되지 않지만, 생체외 형질감염, 미세주사(microinjection)를 포함한 주사, 전기천공, 인산 칼슘 침전, DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜의 사용, 직접 초음파 로딩(direct sonic loading), 리포좀 매개 형질감염 및 수용체-매개 형질감염, 미세입자 투사법(microprojectile bombardment), 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로박테륨(Agrobacterium)-매개 형질전환, 건조(desiccation)/억제-매개 DNA 흡수, 및 이들 방법의 조합에 의한 DNA의 직접 전달을 포함한다. 이러한 기술의 적용을 통해 예를 들면, 이들 세포소기관(들), 세포(들), 조직(들) 또는 생물체(들)는 안정하게 또는 일시적으로 형질전환될 수 있다.
E. 유전자 발현의 변형
일부 구현예에서, 본 개시의 면역 세포는 글루코코르티코이드 수용체, TGFβ 수용체(예컨대, TGFβ-RII), 및/또는 CISH와 같은 특정 유전자의 변형된 발현을 갖기 위해 변형된다. 일 구현예에서, 면역 세포는 내인성 TGFβ를 고갈시키는 사이토카인 싱크로 기능할 수 있는 우성 음성 TGFβ 수용체 II(TGFβRIIDN)를 발현하도록 변형될 수 있다.
사이토카인 신호전달은 조혈 세포의 정상 기능에 필수적이다. 단백질의 SOCS 과는 내재적 브레이크로 작용하여 사이토카인 신호전달의 음성 조절에서 중요한 역할을 한다. CISH 유전자로 암호화되는 단백질의 SOCS 과의 구성원인 CIS는 마우스에서 NK 세포의 중요한 관문 분자로 확인되었다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시는 세포독성을 향상시키기 위하여 면역 세포, 예를 들어 NK 세포 및 CD8+ T 세포에서의 CISH의 녹아웃에 관련한 것이다. 이 접근법은 항종양 활성을 향상시키기 위하여 다른 관문 억제제와 함께 또는 단독으로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 유전자 발현은 유전자에서의 파괴, 예를 들어 녹아웃, 삽입, 미스센스 또는 틀이동 돌연변이, 예를 들어 이중대립유전자 틀이동 돌연변이(biallelic frameshift mutation), 유전자의 전부 또는 일부, 예컨대 하나 이상의 엑손 또는 그의 부분의 결실, 및/또는 녹인을 달성함으로써 수행된다. 예를 들면, 변형된 유전자 발현은, 유전자의 서열 또는 그의 부분에 표적화되도록 특이적으로 설계된, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN) 및 전사 활성제 유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)과 같은 DNA-결합 표적화된 뉴클레아제, 및 CRISPR-관련 뉴클레아제(Cas)와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제와 같은 서열-특이적 또는 표적된 뉴클레아제에 의해 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자의 발현, 활성, 및/또는 기능의 변형은 유전자를 파괴함으로써 수행될 수 있다. 일부 양태에서, 유전자는 변형되어서 유전자 변형이 없거나 변형을 일으키려고 도입된 성분이 없는 발현과 비교하여, 그 발현이 적어도 약 20, 30, 또는 40%, 일반적으로는 적어도 약 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 감소된다.
일부 구현예에서, 변형은 일시적이거나 가역적이어서, 유전자의 발현은 나중에 수복된다. 다른 구현예에서, 변형은 일시적이거나 가역적이지 않고, 예컨대, 영구적이다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 전형적으로 표적화된 방식으로, 유전자에서 하나 이상의 이중 가닥 절단 및/또는 하나 이상의 단일 가닥 절단의 도입으로 수행된다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단은 뉴클레아제, 예컨대 유전자-표적 뉴클레아제와 같은 엔도뉴클레아제에 의해 이루어진다. 일부 양태에서, 절단은 유전자의 코딩 영역, 예컨대 엑손에 도입된다. 예를 들면, 일부 구현예에서, 도입은 코딩 영역의 N-말단 부분 근처, 예컨대, 제1 엑손, 제2 엑손, 또는 후속 엑손(subsequent exon)에서 일어난다.
일부 양태에서, 이중 가닥 또는 단일 가닥 절단은 세포 수복 과정, 예를 들어 비상동말단연결(NHEJ) 또는 상동-인도 수복(homology-directed repair, HDR)에 의해 수복이 일어난다. 일부 양태에서, 수복 과정은 오류 빈발(error-prone)이고 유전자의 파괴, 예를 들어 틀이동 돌연변이, 예컨대, 이중대립유전자 틀이동 돌연변이를 일으킬 수 있으며, 이는 유전자의 완전한 녹아웃을 일으킬 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 파괴는 결실, 변이 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 파괴는 조기 종결 코돈의 존재를 유발한다. 일부 양태에서, 삽입, 결실, 전위, 틀이동 돌연변이, 및/또는 조발성 종결 코돈의 존재는 유전자의 발현, 활성, 및/또는 기능의 파괴를 유발한다.
일부 구현예에서, 유전자 변형은 안티센스 기술, 예를 들어 RNA 간섭(RNAi), 소간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀(shRNA), 및/또는 리보자임을 사용하여 달성되고, 유전자의 발현을 저해 또는 억제하는 데 사용된다. siRNA 기술은 유전자로부터 전사된 mRNA의 뉴클레오티드 서열과 상동인 서열 및 이 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 이중 가닥 RNA 분자를 이용하는 RNAi이다. siRNA는 일반적으로 유전자로부터 전사된 mRNA의 한 영역과 상동성/상보성이거나, 또는 siRNA 상이한 영역과 상동성/상보성인 복수의 RNA 분자를 포함하는 siRNA일 수 있다. 일부 양태에서, siRNA는 폴리시스트론성 작제물에서 구성된다.
1. ZFP 및 ZFN
일부 구현예에서, DNA-표적 분자는 엔도뉴클레아제와 같은 효과기 단백질에 융합된, DNA-결합 단백질, 예를 들어 하나 이상의 징크 핑거 단백질(ZFP) 또는 전사 활성제 유사 단백질(TAL)을 포함한다. 예시는 ZFN, TALE, 및 TALEN을 포함한다.
일부 구현예에서, DNA-표적 분자는 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 하나 이상의 징크 핑거 단백질(zfp) 또는 이의 도메인을 포함한다. ZFP 또는 이의 도메인은 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화된 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인 하나 이상의 징크 핑거를 통해 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 더 큰 단백질내에 있는 단백질 또는 도메인이다. 용어 징크 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 징크 핑거 단백질 또는 ZFP로 축약된다. ZFP 중에는 개별 핑거의 조립에 의해 생성된, 전형적으로 9-18개의 뉴클레오티드 길이인, 특정 DNA 서열을 표적하는 인공 ZFP 도메인이다.
ZFP는 단일 핑거 도메인이 대략 30개 아미노산 길이이고 아연을 통해 단일 베타 회전의 두 개의 시스테인과 배위된 두 개의 불변 히스티딘 잔기를 포함하고, 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 또는 여섯 개의 핑거를 갖는 알파 나선을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, ZFP의 서열 특이성은 징크 핑거 인식 나선상에 네 개의 나선 위치(-1, 2, 3, 및 6)에서 아미노산 치환을 함으로써 변형될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, ZFP 또는 ZFP-함유 분자는 자연발생이 아니고, 예컨대, 선택한 표적 부위에 결합하도록 조작된다.
일부 구현예에서, DNA-표적 분자는 징커 핑거 뉴클레아제(ZFN)를 형성하는 DNA 절단 도메인에 융합된 징크 핑거 DNA 결합 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터 절단 도메인(또는 절단 반-도메인) 및 하나 이상의 징크 핑거 결합 도메인을 포함하고, 이는 조작되거나 조작되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 절단 도메인은 IIS형 제한 엔도뉴클레아제 Fok I로부터 생긴다. FokI은 일반적으로 한 가닥상의 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드에서 그리고 나머지 한 가닥상의 인식 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중가닥 절단을 촉매한다.
많은 유전자-특이적 조작 징크 핑거가 시판중이다. 예를 들면, 상가모 바이오사이언시스(Sangamo Biosciences, 미국, 캘리포니아주, 리치몬드 소재)는 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)와 제휴하여 징크 핑거 작제를 위한 플랫폼(CompoZr)을 개발하였고, 연구자들이 징크 핑거 작제 및 확인을 완전히 뛰어 넘게 하며, 수천 개의 단백질에 대한 특이적으로 표적화된 징크 핑거를 제공한다(문헌[Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405]). 일부 구현예에서, 시판중인 징크 핑거가 사용되거나 맞춤 설계된다. (예를 들면, 시그마-알드리치 카탈로그 번호 CSTZFND, CSTZFN, CTil-lKT, 및 PZD0020을 참조한다).
2. TAL, TALE 및 TALEN
일부 구현예에서, DNA-표적 분자는 예를 들어 전사 활성제 유사 단백질 효과기(TALE) 단백질에 있는 자연 발생 또는 조작(비자연 발생) 전사 활성제 유사 단백질(TAL) DNA 결합 도메인을 포함하며, 예컨대, 본원에 그 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 공개 번호 2011/0301073호를 참조한다.
TALE DNA 결합 도메인 또는 TALE는 하나 이상의 TALE 반복 도메인/단위를 포함한다. 반복 도메인은 이의 동족(cognate) 표적 DNA 서열에 대한 TALE의 결합에 관여한다. 단일 “반복 단위”(또한 “반복”으로도 지칭됨)는 전형적으로 33-35개 아미노산 길이이고, 자연 발생 TALE 단백질 내의 다른 TALE 반복 서열과 적어도 일부 서열 상동성을 보인다. 각각의 TALE 반복 단위는 전형적으로 반복의 위치 12 및/또는 13에 있는 반복 가변 이잔기(Repeat Variable Diresidue, RVD)를 구성하는 1개 또는 2개의 DNA-결합 잔기를 포함한다. 이들 TALE의 DNA 인식을 위한 자연(원형) 코드가 결정되어 위치 12 및 13에서 HD 서열은 시토신(C)에 결합하고, NG는 T에 결합하며, NI는 A에, NN은 G 또는 A에 결합하고, NO는 T에 결합하며, 비원형(비정형) RVD가 또한 알려져있다. 일부 구현예에서, TALE은 표적 DNA 서열에 특이성이 있는 TAL의 설계에 의해 임의의 유전자에 표적화될 수 있다. 표적 서열은 일반적으로 티미딘으로 시작한다.
일부 구현예에서, 분자는 TALE 뉴클레아제(TALEN)와 같은 DNA 결합 엔도뉴클레아제이다. 일부 양태에서, TALEN은 TALE에서 유래한 DNA 결합 도메인 및 핵산 표적 서열을 절단하는 뉴클레아제 촉매 도메인을 포함하는 융합 단백질이다.
일부 구현예에서, TALEN은 유전자에서 표적 서열을 인식하고 절단한다. 일부 양태에서, DNA의 절단은 이중 가닥 절단을 일으킨다. 일부 양태에서, 절단은 상동 재조합 또는 비상동말단연결(NHEJ)의 속도를 자극한다. 일반적으로, NHEJ는 종종 절단 부위에서 DNA 서열에 변화를 일으키는 불완전한 수복 과정이다. 일부 양태에서, 수복 메커니즘은 직접 재연결(re-ligation) 또는 소위 미세 상동성 매개 말단 연결을 통해 두 개의 DNA 말단의 남은 것의 재연결을 포함한다. 일부 구현예에서, NHEJ를 통한 수복은 작은 삽입 또는 결실을 초래하고 파괴하는 데 사용될 수 있어서 유전자를 억제하게 된다. 일부 구현예에서, 변형은 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환, 결실, 또는 첨가일 수 있다. 일부 양태에서, 절단 유도 돌연변이 생성 사건, 즉 NHEJ 사건에 이은 돌연변이 생성 사건이 발생한 세포는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 확인되고/되거나 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TALE 반복은 유전자를 특이적으로 표적하도록 조립된다(문헌[Gaj et al., 2013]). 18,740개의 인간 단백질 코딩 유전자를 표적하는 TALEN의 라이브러리가 구축되었다(문헌[Kim et al., 2013]). 맞춤 설계 TALE 배열은 셀렉티스 바이오리서치(Cellectis Bioresearch, 프랑스 파리 소재), 트랜스포사겐 바이오파마슈티컬스(Transposagen Biopharmaceuticals, 미국 켄터키주 렉싱턴 소재), 및 라이프 테크놀로지스(Life Technologies, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)를 통해 시판중이다. 구체적으로, CD38을 표적하는 TALEN이 시판중이다(Gencopoeia, 카탈로그 번호 HTN222870-l, HTN222870-2, 및 HTN222870-3 참조). 예시적인 분자는 예컨대, 미국 특허 공개 번호 US 2014/0120622호 및 2013/0315884호에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, TALEN은 하나 이상의 플라스미드 벡터에 의해 암호화된 트랜스 유전자로서 도입된다. 일부 양태에서, 플라스미드 벡터는 상기 벡터를 수용한 세포의 확인 및/또는 선택을 위해 제공하는 선택 마커를 포함할 수 있다.
3. RGEN(CRISPR/Cas 시스템)
일부 구현예에서, 하나 이상의 DNA-결합 핵산을 사용하여 변형이 수행된다, 예를 들어 RNA-가이드 엔도뉴클레아제(RGEN)를 통한 변형이 수행된다. 예를 들면, 주기적 간격으로 분포하고 짧은 회문구조 반복(CRISPR) 및 CRISPR-연관(Cas) 단백질을 사용하여 변형이 수행될 수 있다. 보통, “CRISPR 시스템”은 총체적으로 Cas 유전자를 암호화하는 서열, tracr(트랜스-호라성화 CRISPR) 서열(예컨대, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열(내인성 CRISPR 시스템의 환경에서 "직접 반복" 및 tracrRNA-처리 부분 직접 반복을 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 환경에서 "스페이서(spacer)"라고도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사를 포함하는 CRISPR-연관(“Cas”) 유전자의 활성의 발현 또는 유도에 관여하는 전사 및 다른 요소를 의미한다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 서열 특이적으로 DNA에 결합하는, 비코딩 RNA 분자(가이드) RNA 및 뉴클레아제 기능성(예컨대, 두 개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질(예컨대, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 I형, II형, III형, CRISPR 시스템에서 유래할 수 있고, 예컨대, 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 생물체, 예를 들어 화농성 연쇄상구균에서 유래할 수 있다.
일부 양태에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA(표적 서열에 특이적인 cfRNA와 교정된 tracrRNA의 융합을 포함)는 세포내로 도입된다. 보통, gRNA의 5’ 말단에 있는 표적 부위는 상보성 염기쌍을 사용하여 표적 부위, 예컨대 유전자에 Cas 뉴클레아제를 표적화한다. 표적 부위는 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열, 예를 들어 전형적으로 NGG, 또는 NAG의 5’에 바로 위치하는 것에 기초하여 선택될 수 있다. 이 점에 있어서, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하는 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11, 또는 10개의 뉴클레오티드를 변형시킴으로써 원하는 서열에 표적화된다. 보통, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 전형적으로, “표적 서열”은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 의미하며, 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 일으키고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 충분한 상보성이 있는 경우, 완전한 상보성이 필수적으로 요구되는 것은 아니다.
CRISPR 시스템은 표적 부위에서의 이중 가닥 절단(DSB)에 이어 본원에서 논의된 파괴 또는 변형을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, “틈내기 효소(nickase)”로 간주되는, Cas9 변이체가 표적 부위에서 단일 가닥에 틈을 내는 데 사용된다. 짝지어진 틈내기 효소는 예컨대, 특이성을 향상시키는 데 사용될 수 있으며, 상이한 gRNA 표적 서열의 쌍에 의해 각각 유도될 수 있어서 동시에 틈새의 도입 시에 5’ 돌출부가 도입된다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9이 이종 효과기 도메인 예를 들어 전사 억제제 또는 활성제에 융합되어 유전자 발현에 영향을 미친다.
표적 서열은 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 예를 들어 세포의 소기관 내에 있는 세포의 핵 또는 세포질에 위치될 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌내로 재좁하하기 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 “편집 주형” 또는 “편집 폴리뉴클레오티드” 또는 “편집 서열”이라 지칭된다. 일부 양태에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형이라 지칭될 수 있다. 일부 양태에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 환경에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열 근처 또는 내에서(예컨대, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 또는 그 이상의 염기쌍 내에서) 한 가닥 또는 양 가닥의 절단을 일으킨다. 야생형 tracr 서열의 전부 혹은 일부(예컨대, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, 또는 그 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 이로써 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한 예를 들어 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 가이드 서열에 작동가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 혹은 일부에 혼성화함으로써 CRISPR 복합체의 부분을 형성할 수 있다. tracr 서열은 혼성화하고 CRISPR 복합체의 형성에 참여하기에 충분한 tracr 메이트 서열 상보성을 갖는다, 예를 들어 최적으로 정렬됐을 때 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 서열 상보성이 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%이다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 하나 이상의 벡터 구동 발현이 세포내로 도입될 수 있어 CRISPR 시스템의 요소들의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 유도하게 된다. 구성 성분이 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들면, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열, 및 tracr 서열은 각각 별개의 벡터상의 별개의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 대안으로, 동일한 또는 상이한 조절 요소로부터 발현된 요소 중 두 개 이상이 단일 벡터에서 조합될 수 있고, 하나 이상의 추가 벡터가 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공한다. 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열(클로닝 부위라고도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치된다. 여러 개의 상이한 가이드 서열이 사용될 때, 단일 발현 작제물은 세포 내에 여러 개의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화하는 데 사용될 수 있다.
벡터가 CRISPR 효소, 예를 들어 Cas 단백질을 암호화하는 효소 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체 또는 이들의 변형 버전을 포함한다. 이들 효소는 공지되어 있고, 예를 들어, 화농성 연쇄상구균 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 SwissProt 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
CRISPR 효소는 (예컨대, 화농성 연쇄상구균 또는 폐렴 연쇄상구균으로부터의) Cas9일 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열의 위치, 예를 들어 표적 서열 내에서 및/또는 표적 서열의 상보적인 서열 내에서 한 가닥 또는 양 가닥의 절단을 유도할 수 있다. 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 암호화할 수 있어 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 한 가닥 또는 양 가닥을 절단하는 능력이 결여된다. 예를 들면, 화농성 연쇄상구균으로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서 아스파트산-대-알라닌 치환(D10A)은 Cas9을 양 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 틈내기 효소(단일 가닥을 절단)로 변형시킨다. 일부 구현예에서, Cas9 틈내기효소는 DNA 표적의 각각의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화하는, 가이드 서열(들), 예컨대 두 개의 가이드 서열의 조합으로 사용될 수 있다. 이 조합은 양 가닥에 틈이 생기게 하고 NHEJ 또는 HDR을 유도하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소를 암호화하는 효소 코딩 서열은 특정 세포, 예를 들어 진핵 세포에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 특정 생물체, 예를 들어 이에 제한되지 않지만 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 또는 비인간 영장류를 포함하는 포유류로부터 유래될 수 있거나 이들의 세포일 수 있다. 대체로, 코돈 최적화는 원래 서열의 적어도 하나의 코돈을 목적하는 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로, 원래의 아미노산 핵산은 유지하면서 치환하는 것에 의해서 해당 숙주 세포의 강화된 발현을 위해 핵산 서열을 변형하는 과정을 말한다. 다양한 종이 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정한 편향을 나타낸다. 코돈 편향(생명체 사이의 코돈 사용 빈도 차이)은 종종 전령 RNA(mRNA)의 번역의 효율과 관련있고, 이는 결국 무엇보다도 번역되는 코돈의 성질 및 특정 운반 RNA(tRNA) 분자의 효용에 달려있다고 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA 중 우세한 것은 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용된 코돈이 반영된 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 생명체에서 최적 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
대체로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도하기에 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되었을 때, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이다.
NR3CS(글루코코르티코이드 수용체)에 대한 예시적인 gRNA 서열은 Ex3 NR3C1 sG1 5-TGC TGT TGA GGA GCT GGA-3(서열 번호 1) 및 Ex3 NR3C1 sG2 5-AGC ACA CCA GGC AGA GTT-3(서열번호 2)을 포함한다. TGF-베타 수용체에 대한 예시적인 gRNA 서열은 EX3 TGFBR2 sG1 5-CGG CTG AGG AGC GGA AGA-3(서열번호 3) 및 EX3 TGFBR2 sG2 5-TGG-AGG-TGA-GCA-ATC-CCC-3(서열번호 4)을 포함한다. T7 프로모터, 표적 서열, 및 중첩 서열은 서열 TTAATACGACTCACTATAGG(서열번호 5) + 표적 서열 + gttttagagctagaaatagc(서열번호 6)를 가질 수 있다.
최적 정렬은 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있는데, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform)에 기반한 알고리즘(예컨대, 버로우즈 휠러 정렬기(Burrows Wheeler Aligner)), Clustal W, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign) (노보크래프트 테크놀로지스(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에이고 소재), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능)이 포함된다.
CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 부분일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열, 및 선택적으로 임의의 두 개의 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 제한 없이 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 다음 활성 중 하나 이상을 가지는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸화 활성, 탈메틸화 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 적혈구응집소(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 이에 제한되지 않지만, 글루타티온-5-전이효소(GST), 서양고추냉이 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT) 베타 갈락토시다아제, 베타-글루쿠로니다아제, 루시퍼라아제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가 형광 단백질을 포함한다. CRISPR 효소는 DNA 분자 또는 다른 세포 분자와 결합하는 단백질의 단편 또는 단백질을 암호화하는 유전자 서열에 융합될 수 있으며, 이에 제한되지 않지만 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합, GAL4A DNA 결합 도메인 융합, 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합을 포함한다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 부분을 형성할 수 있는 추가 도메인은 본원에 참조로서 포함된 US 20110059502호에 기술된다.
Ⅲ. 사용 방법
일부 구현예에서, 본 개시는 본 개시의 면역 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 면역 요법의 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 의학적 질환 또는 장애는 면역 반응을 유도하는 면역 세포 집단의 전이에 의해 치료된다. 본 개시의 특정 구현예에서, 암 또는 감염은 면역 반응을 유도하는 면역 세포 집단의 전이에 의해 치료된다. 항원 특이적 세포 요법의 유효량을 개인에게 투여하는 것을 포함하는, 개인에서 암의 진행을 지연시키거나 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 본 방법은 면역 장애, 고형암, 혈액암, 및 바이러스 감염의 치료에 적용될 수 있다.
본 치료 방법이 유용한 종양은 임의의 악성 세포 유형, 예를 들어 고형 종양 또는 혈액 종양에서 발견되는 것들을 포함한다. 예시적인 고형 종양은 이에 제한되지 않지만, 췌장, 결장, 맹장, 위, 뇌, 머리, 목, 난소, 콩팥, 후두, 육종, 폐, 방광, 흑색종, 전립선, 및 유방으로 이루어진 군에서 선택된 장기의 종양을 포함할 수 있다. 예시적인 혈액 종양은 골수의 종양, T 또는 B 세포 악성 종양, 백혈병, 림프종, 아세포종, 골수종 등을 포함한다. 본원에서 제공된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가 예는 이에 제한되지 않지만, 폐암(소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐선암종, 폐의 편평상피암종 포함), 복막암, 위 또는 위장암(위장관암, 위장관기질암을 포함), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 콩팥 또는 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 다양한 유형의 두경부암, 및 흑색종을 포함한다.
암은 구체적으로 다음의 조직학적 유형을 가질 수 있지만 이에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두상 암종; 편평세포 암종; 림프표피 암종; 기저 세포 암종; 모기질 암종; 이행세포 암종; 유두상 이행세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담도암종; 간세포 암종; 복합형 간세포 암종 및 담도암종; 육주상 선암종; 선양 낭포 암종; 선종폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 용종증; 고형 암종; 유암종, 악성; 기관지-폐포 선암종; 유두상 선암종; 난염성 암종; 호산성 암종; 호산성 선암종; 호염기성 암종; 투명세포 선암종; 과립세포 암종; 소포성 선암종; 유두상 및 소포성 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 부속기 암종; 아포크린 선암종; 피지선 선암종; 귀지 선암종; 점막표피양 암종; 낭선종; 유두상 낭선종; 유두상 장액성 낭선종; 점액성 낭선종; 점액성 선암종; 인환세포 암종; 침윤성 관 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증성 암종; 파제트병, 유선; 선방 세포 암종; 선편평 암종; 선암종 w/편평상피화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 난포막종, 악성; 과립막 세포종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리 세포 암종; 간질세포종, 악성; 지질 세포 종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 무흑색소성 흑색종; 표재 확산 흑색종; 흑색점 악성 흑색종; 말단흑자성 흑색종; 결절성 흑색종; 거대색소 모반 내 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 청색모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구종, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아형 횡문근육종; 폐포 횡문근육종; 기질 육종; 혼합종양, 악성; 뮐러 혼합종양; 신아세포종; 간아세포종; 암육종; 간엽소포종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 미분화세포종; 배아형 암종; 기형종, 악성; 난소갑상선종, 악성; 융모막 암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 방피질성 골육종; 연골육종; 연골모세포종, 악성; 간충직 연골육종; 골거대세포종; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 사기질모세포성 치아육종; 에나멜상피종, 악성; 에나멜 아세포 섬유육종; 송과체종, 악성; 척색종; 신경교종, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 섬유질 성상세포종; 성모세포종; 교모모세포종; 핍지교종; 핍지모세포종; 원시 신경외배엽성; 소뇌 육종; 신경절모세포종; 신경모세포종; 망막모세포종; 후각 신경성 종양; 뇌수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경초종, 악성; 과립세포 종양, 악성; 악성림프종; 호지킨병; 호지킨; 부육아종; 악성 림프종, 소세포성 림프종; 악성 림프종, 거대세포, 미만성; 악성 림프종, 소포성; 균상식육종; 기타 명시된 비-호지킨 림프종; B-세포 림프종; 저등급/소포성 비호지킨 림프종(NHL); 소세포성 림프종(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL; 중간 등급 미만성 NHL; 고등급 면역아구성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비분할 세포 NHL; 거대 종양 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만 세포 육종; 면역 증식 소장병증; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종 세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산성 백혈병; 단구성 백혈병; 비만 세포 백혈병; 거핵아구 백혈병; 골수성 육종; 모발세포 백혈병; 만성 림프구성백혈병(CLL); 급성 림프모구성 백혈병(ALL); 급성 골수성 백혈병(AML); 및 만성 골수아구성 백혈병.
특정 구현예는 백혈병의 치료 방법에 관한 것이다. 백혈병은 혈액 또는 골수의 암이고 혈구, 보통 백혈구의 비정상적인 증식(증식에 의한 생산)을 특징으로 한다. 혈액학적 종양이라 불리는 질환의 광범위한 군의 부분이다. 백혈병은 다양한 질환을 포함하는 광범위한 용어이다. 백혈병은 임상적으로 그리고 병리학적으로 급성 및 만성 형태로 나누어진다.
본 개시의 특정 구현예에서, 면역 세포는 이를 필요로 하는 개인, 예를 들어 암이나 감염에 걸린 개인에게 전달된다. 그런 다음 세포는 각각의 암 또는 병원성 세포를 공격하도록 개인의 면역 체계를 강화시킨다. 일부 경우에, 개인에게 면역 세포의 하나 이상의 투여량이 공급된다. 개인에게 면역 세포의 둘 이상의 투여량이 공급되는 경우, 투여 사이의 기간은 개인에서 증식할 시간이 충분해야 하며, 특정 구현예에서 투여 사이의 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 그 이상의 일 수이다.
본 개시의 특정 구현예는 면역 매개 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 대상은 자가 면역 질환을 갖는다. 자가 면역 질환의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역성 애디슨병, 부신의 자가면역성 질환, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 자가면역성 난소염 및 고환염, 자가면역성 혈소판감소증, 베체트병, 수포성유천포창, 심근증, 복강 빈발-피부염(celiac spate-dermatitis), 만성 피로 면역 장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 척-스트라우스증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한랭 응집소 질환, 크론병(Crohn’s disease), 원판성 루푸스, 본태성 혼합 한냉-글로블린증, 섬유근육통-섬유근육염, 사구체신염, 그레이브스병(Graves’ disease), 길랑-바레(Guillain-Barre), 하시모토 갑상선염(Hashimoto’s thyroiditis), 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병(Meniere's disease), 혼합결합조직병, 다발성 경화증, 제1형 또는 면역 매개 당뇨병, 중증근무력증, 신장 증후군(예를 들어 미세변화병, 국소 사구체경화증, 또는 막성 신장증), 심상성천포창, 악성빈혈, 결절다발동맥염, 다발연골염, 다분비선증후군, 류마티스성 다발성 근육통, 다발근육염 및 피부근육염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담관간경화, 건선, 건선성 관절염, 레이노드 현상(Raynauld's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군(Sjoren's syndrome), 강직 인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 포도막염, 혈관염(결절성 다발성 동맥염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 또는 포진성 피부염 혈관염), 백반, 및 베게너 육아종증(Wegener’s granulomatosis). 따라서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 일부 예는 이에 제한되지 않지만, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 제1형 당뇨병, 크론병; 궤양성 대장염, 중증근무력증, 사구체신염, 강직성 척추염, 혈관염, 또는 건선을 포함한다. 대상은 또한 천식과 같은 알레르기성 장애를 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 대상은 이식된 장기 또는 줄기세포의 수용자이고 면역 세포는 거부 반응을 예방하고/하거나 치료하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 대상은 이식편대숙주 질환이 발병할 위험에 있거나 이 질환을 갖는다. GVHD는 관련 공여자 또는 비관련 공여자 중 하나로부터 받은 줄기세포를 사용하거나 포함하는 임의의 이식에서 가능한 합병증이다. 두 종류의 GVHD, 급성 및 만성이 있다. 급성 GVHD는 이식 후 처음 3개월 이내에 나타난다. 급성 GVHD의 징후는 퍼지고 더 심해질 수 있는 손과 발에 나타나는 붉은 피부 발진을 포함하고, 피부가 벗겨지거나 물집이 생긴다. 급성 GVHD는 또한 위 및 장에 영향을 줄 수 있어 경련, 구역질 및 설사가 동반된다. 피부와 눈의 황화(황달)은 급성 GVHD가 간에 영향을 준 것을 나타낸다. 만성 GVHD는 중증도에 따라서 등급이 매겨진다: 단계/등급 1은 중등도이고, 단계/등급 4는 중증이다. 만성 GVHD는 이식 후 3개월 이후에 발병된다. 만성 GVHD의 증상은 급성 GVHD와 유사하지만, 또한 만성 GVHD는 또한 눈의 점액샘, 입의 침샘, 및 위벽 및 장을 윤활하는 샘에 영향을 줄 수 있다. 본원에 개시된 면역 세포의 임의의 집단이 사용될 수 있다. 이식된 장기의 예는 고형 장기 이식 예를 들어 신장, 간, 피부, 췌장, 폐 및/또는 심장, 또는 세포성 이식 예를 들어 섬(islets), 간세포, 근아세포, 골수, 또는 조혈 또는 기타 줄기세포를 포함한다. 이식은 얼굴 조직과 같은 복합 이식일 수 있다. 면역 세포는 이식 전에, 이식과 함께, 이식 후에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 이식 전에 예를 들어 이식 전 적어도 1시간, 적어도 12시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 또는 적어도 1개월에 투여된다. 하나의 구체적이고 비제한적인 예에서, 면역 세포의 치료 유효량의 투여는 이식 전 3~5일에 일어난다.
일부 구현예에서, 대상에게 비골수파괴성 림프구제거 화학요법을 면역 세포 요법 이전에 실시할 수 있다. 비골수파괴성 림프구제거 화학요법은 이러한 임의의 적합한 요법일 수 있고, 임의의 적합한 경로에 의해 실시될 수 있다. 비골수파괴성 림프구제거 화학요법은 특히 전이성일 수 있는 암이 흑색종인 경우, 예를 들면, 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 시클로포스파미드 및 플루다라빈을 투여하는 예시적인 경로는 정맥내이다. 유사하게, 시클로포스파미드 및 플루다라빈의 임의의 적합한 투여량이 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 25 mg/m2의 플루다라빈이 5일 동안 투여된 후, 시클로포스파미드의 약 60 mg/kg이 2일 동안 투여된다.
특정 구현예에서, 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 성장 인자가 대상에게 면역 세포와 함께 투여되거나 면역 세포 이후에 투여된다. 면역 세포 성장 인자는 면역 세포의 성장 및 활성화를 촉진하는 임의의 적합한 성장 인자일 수 있다. 적합한 면역 세포 성장 인자의 예는 인터루킨(IL)-2, IL-7, IL-15, 및 IL-12를 포함하고, 이는 단독으로 사용되거나 다양하게 조합하여 사용될 수 있는데, 예를 들어 IL-2 및 IL-7, IL-2 및 IL-15, IL-7 및 IL-15, IL-2, IL-7 및 IL-15, IL-12 및 IL-7, IL-12 및 IL-15, 또는 IL-12 및 IL2의 조합일 수 있다.
면역 세포의 치료 유효량이 예를 들어 정맥내, 복강내, 근육내, 흉골내 또는 관절내 주사 또는 주입의 비경구 투여를 포함하여, 많은 경로로 투여될 수 있다.
입양 세포 요법에서 사용하기 위한 면역 세포의 치료 유효량은 치료 받는 대상에서 원하는 효과를 달성하는 양이다. 예를 들면, 이는 자가면역 또는 동종면역 질환의 진행을 억제하거나 퇴행을 유발하는 데 필요한 면역 세포의 양일 수 있고, 이는 통증 및 염증과 같은 자가 면역 질환에 의해 유발된 증상을 경감시킬 수 있다. 이는 통증, 부종 및 고온과 같은 염증과 연관된 증상을 경감시키는 데 필요한 양일 수 있다. 이는 또한 이식된 장기의 거부 반응을 감소시키거나 방지하는 데 필요한 양일 수 있다.
면역 세포 집단은 질환에 맞는 치료 투약법(regimen)으로 투여될 수 있는데, 예를 들면 질환 상태를 경감시키기 위해 하루 내지 수일에 걸쳐 단일 복용량 또는 몇회의 복용량 또는 질환의 진행을 억제하고 질환의 재발을 방지하기 위해 장기간에 걸쳐 주기적인 복용량으로 투여될 수 있다. 제형으로 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중증도에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 면역 세포의 치료 유효량은 치료받는 대상, 고통의 유형 및 중증도, 및 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 일부 구현예에서, 인간 대상의 치료에 사용될 수 있는 투여량은 적어도 3.8×104, 적어도 3.8×105, 적어도 3.8×106, 적어도 3.8×107, 적어도 3.8×108, 적어도 3.8×109, 또는 적어도 3.8×1010 면역세포/m2의 범위이다. 특정 구현예에서, 인간 대상의 치료에 사용된 투여량은 역 3.8×109 내지 약 3.8×1010 면역세포/m2의 범위이다. 추가 구현예에서, 면역 세포의 치료 유효량은 kg 체중 당 약 5×106 세포 내지 kg 체중 당 약 7.5×108 세포, 예를 들어 kg 체중 당 약 2×107 세포 내지 kg 체중 당 약 5×108 세포, 또는 kg 체중 당 약 5×107 세포 내지 약 2×108 세포로 다양할 수 있다. 면역 세포의 정확한 양은 대상의 연령, 체중, 성별, 및 생리학적 상태에 기초하여 당업자에 의해 손쉽게 결정된다. 효과적인 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 용량 반응 곡선에서 추론될 수 있다.
면역 세포는 면역 매개 장애의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 요법은 이에 제한되지 않지만, 하나 이상의 항균제(예를 들면, 항생제, 항바이러스제, 및 항진균제), 항종양제(예를 들면, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 면역 고갈제(immune-depleting agent)(예를 들면, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 면역억제제(예를 들면, 아자티오프린, 또는 글루코코르티코이드, 예를 들어 덱사메타손 또는 프레드니손), 항염증제(예를 들면, 클루코코르티코이드 예를 들어 히드로코르티손, 덱사메타손 또는 프레드니손, 또는 비스테로이드 항염증제 예를 들어 아세틸살리실산, 이부프로펜 또는 나프록센 나트륨), 사이토카인(예를 들면, 인터루킨-10 또는 변환성장인자-베타), 호르몬(예를 들면, 에스트로겐), 또는 백신을 포함할 수 있다. 게다가, 이에 제한되지 않지만, 칼시뉴린 억제제(예컨대, 시클로스포린 및 타크로리무스); mTOR 억제제(예컨대, 라파마이신); 미코페놀레이트 모페틸, 항체(예컨대, CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG, 또는 B 세포를 인식함); 화학요법제(예컨대, 메토트렉사트, 트레오설판, 부설판); 방사선조사; 또는 케모카인, 인터루킨, 또는 그들의 억제제(예컨대, BAFF, IL-2, 항-IL-2R, IL-4, JAK 키나아제 억제제)를 포함하는 면역억제제 또는 면역관용제가 투여될 수 있다. 이러한 추가 약학 제제가 원하는 효과에 따라 면역 세포의 투여 전에, 중에, 또는 후에 투여될 수 있다. 이러한 세포 및 제제의 투여는 동일한 경로 또는 상이한 경로일 수 있고 동일 부위 또는 상이한 부위에서 될 수 있다.
A. 약학 조성물
또한, 면역 세포(예컨대, T 세포 또는 NK 세포) 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물 및 제형이 본원에 제공된다.
본원에 기술된 약학 조성물 및 제형은 하나 이상의 선택적인 약학적으로 허용되는 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 22nd edition, 2012])가 있는 원하는 순수한 정도를 가지는 활성 성분(예를 들어 항체 또는 폴리펩티드)을 혼합하여 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 이에 제한되지 않지만 다음을 포함한다: 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 산화방지제; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물(글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함함); 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물(예컨대, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원의 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예를 들어 가용성 중성 활성 하이알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 하이알루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(HYLENEX®, 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는 특정 예시적 sHASEGP들 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186호 및 2006/0104968호에 기재되어 있다. 일 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가 글리코사미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나아제와 조합된다.
B. 병용 요법
특정 구현예에서, 본 구현예의 조성물 및 방법은 적어도 하나의 추가 요법과 병용하여 면역 세포 집단을 포함한다. 추가 요법은 방사선 요법, 수술(예컨대, 종양절제술 및 유방절제술), 화학요법, 유전자 요법, DNA 요법, 바이러스 요법, RNA 요법, 면역요법, 골수 이식, 나노요법, 단클론 항체 요법, 또는 전술한 것들의 조합일 수 있다. 추가 요법은 수술 후 보조(adjuvant) 요법 또는 수술 전 보조(neoadjuvant) 요법의 형태일 수 있다.
일부 구현예에서, 추가 요법은 소분자 효소 억제제 또는 항전이제의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 부작용 제한제(side-effect limiting agent)(예컨대, 치료의 부작용의 발생 및/또는 중증도를 감소하게 하는 약제, 예를 들어 항구역제(anti-nausea agents) 등)의 투여이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 방사선 요법이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 수술이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 방사선 요법과 수술의 병용이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 감마선 조사이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 PBK/AKT/mTOR 경로를 표적하는 요법, HSP90 억제제, 튜불린 억제제, 아포토시스 억제제, 및/또는 화학예방제이다. 추가 요법은 당해 기술 분야에 공지된 화학요법제 중 하나 이상일 수 있다.
면역 세포 요법은 면역 관문 요법과 같은 추가 암 요법에 대하여 요법 전에, 중에, 후에 또는 다양하게 병용하여 투여될 수 있다. 동시 내지 수 분 내지 수 일 내지 수 주의 범위의 간격으로 투여될 수 있다. 면역 세포 요법이 추가 치료제와 별도로 환자에게 제공되는 구현예들에서, 한 요법은 일반적으로 각각의 전달 시간 사이에 중요한 시기가 만료되지 않았음이 확실하여, 두 개의 화합물이 환자에게 유익한 병용 효과를 여전히 가할 수 있다. 이러한 예에서, 한 요법은 환자에게 항체 요법을 제공하고 항암 요법이 서로 약 12 내지 24시간 또는 72시간 내에, 보다 구체적으로는 서로 약 6~12시간 내에 제공될 수 있다. 일부 상황에서, 각각의 실시 사이에 며칠(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일) 내지 몇 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주)가 경과하는 치료를 위한 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.
다양한 조합이 사용될 수 있다. 하기 예시에 대해 보면, 면역 세포 요법은 “A”이고 항암 요법은 “B”이다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
환자에게 본 구현예의 임의의 화합물을 투여하거나 요법을 실시하는 것은 만약 있다면, 약제의 독성을 고려하여, 이러한 화합물의 투여에 대한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 그러므로, 일부 구현예에서, 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.
1. 화학요법
매우 다양한 화학요법제가 본 구현예에 따라 사용될 수 있다. 용어 “화학요법”은 암을 치료하는 약물의 사용을 의미한다. “화학요법제”는 암의 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미하는 것으로 사용된다. 이들 약제 또는 약물은 세포 내 활성의 방식, 예를 들면 세포 주기에 영향을 주는지 그리고 세포 주기에 어떤 단계에 영향을 주는지에 의해 분류된다. 대안으로, 약제는 직접 DNA를 교차결합시키는 능력, DNA 내로 삽입하는 능력, 또는 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 또는 유사분열 이상을 유도하는 능력에 기초하여 특징지어질 수 있다.
화학 요법제의 예시는 알킬화제 예를 들어 티오테파 및 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예를 들어 부술판, 임프로술판, 및 피포술판; 아지리딘 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알프레타민, 트리에밀렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리에밀롤로멜라민을 포함하는 에밀레루민 및 메밀라멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); (합성 유사체 토포테칸을 포함한) 캄프토테신; 브리오스타틴; 칼리스타틴; (CC-1065의 아도젤레신, 카르젤레신, 및 비젤레신 합성 유사체를 포함한) CC-1065; 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; (합성 유사체 KW-2189 및 CBI-TMI를 포함한) 두오카르마이신; 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 시클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스타드; 니트로소우레아 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포레무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예를 들어 에네디인 항생제(예컨대, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마II 및 칼리케아미신 오메가I1), 디네미신 A를 포함한 디네미신, 비스포스포네이트 예를 들어 클로드로네이트, 에스페라미신, 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련된 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예를 들어 미토마이신 C, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 항대사물 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체 예를 들어 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록수리딘; 안드로겐 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스토락톤; 항부신제 예를 들어 미토탄, 및 트릴로스탄; 엽산 보충제 예를 들어 프롤린산; 아세갈톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불리닌산; 에니루라실; 암사크린; 베스트라부칠; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜친; 디아지퀴논; 엘포르니틴; 엘리프티니움 아세테이트; 에포티론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예를 들어 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토잔트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비친; 로소잔트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테나우아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리초테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 아구니딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 탁소이드, 예컨대, 파클리탁셀 및 도세탁셀 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 유사체 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예컨대, CPT-11); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DFMO); 레티노이드 예를 들어 레티노산; 카페시타빈; 카르보플라틴, 카르보플라틴, 프로카르바진, 플리코마이신, 겜시타비엔, 나벨빈, 파르네실-단백질 트랜스퍼라제 억제제, 트랜스플라티눔, 및 상기의 임의의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
2. 방사선요법
DNA 손상을 일으키고 광범위하게 사용된 기타 인자들은 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포에 방사성동위원소의 직접 전달로 통상 알려진 것을 포함한다. DNA 손상 인자 중 다른 형태, 예를 들어 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국 특허 5,760,395호 및 4,870,287호), 및 UV-조사가 또한 고려된다. 이 모든 인자가 필시 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 수복, 및 염색체의 조립 및 유지에 광범위한 손상을 준다. X-선의 용량 범위는 장기간(3주 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 일일 용량 내지 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 용량의 범위이다. 방사성동위원소의 용량 범위는 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 및 신생 세포에 의한 섭취에 따라 다르고 매우 다양하다.
3. 면역요법
당업자는 추가 면역요법이 구현예들의 방법과 병용하여 또는 공동으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 상황에서, 면역요법은 일반적으로 암세포를 표적하고 파괴하는 면역 효과기 세포 및 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(RITUXAN®)이 그러한 예이다. 면역 효과기는 예를 들면 종양 세포의 표면상에 있는 일부 마커에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 요법의 효과기로서 작용할 수 있거나 실제로 세포 사멸 작용을 하는 다른 세포들을 모집할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법, 방사성 핵종, 리신(ricin) A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있고 표적화제(targeting agent)로서 작용할 수 있다. 대안으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분장을 지니는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다.
항체-약물 결합체는 암 치료법의 발달에 비약적인 발전을 이룬 접근법으로서 나타났다. 암은 세계에서 주요 사망 원인 중 하나이다. 항체-약물 결합체(ADC)는 세포-사멸 약물과 공유결합으로 연결된 단클론 항체(MAb)를 포함한다. 이 접근법은 그들의 항원 표적에 대한 MAb의 고특이성을 매우 강력한 세포독성 약물과 결합하여, 농축된 수준의 항원이 있는 종양 세포에 페이로드(약물)를 전달하는 “무장한” MAb를 만들게 된다. 약물의 표적화된 전달은 또한 정상 조직에서의 노출을 최소화하여 독성을 감소시키고 치료 지수를 향상시킨다. 두 가지 ADC 약물의 FDA 승인, 2011년에 ADCETRIS®(브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin)) 및 2013년에 KADCYLA®(트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine) 또는 T-DM1)은 본 접근법을 허가하였다. 현재 30개의 ADC 약물 후보가 암 치료에 대한 임상 시험의 다양한 단계에 있다(Leal et al., 2014). 항체 공학 및 링커-페이로드 최적화가 점점 더 성숙해지면서, 새로운 ADC의 발견 및 개발은 이 접근법 및 표적화 MAb의 세대에 적합한 새로운 표적의 확인 및 승인에 따라 점점 더 의존한다. ADC 표적에 대한 두 개의 기준은 종양 세포에서의 발현 및 강력한 내재화의 상향조절된/높은 수준이다.
면역요법의 한 양태에서, 종양 세포는 표적화가 쉬운, 즉 대다수의 다른 세포에 존재하지 않는 일부 마커를 지녀야 한다. 많은 종양 마커가 존재하고 이들 중 임의의 것이 본 구현예의 상황에서 표적화에 적합할 수 있다. 일반 종양 마커는 CD20, 암배아 항원, 티로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원(Sialyl Lewis Antigen), MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B, 및 p155를 포함한다. 면역요법의 대안적인 양태는 항암 효과와 면역 자극 효과를 결합한다. 면역 자극 분자는 또한 다음을 포함하여 존재한다: 사이토카인, 예를 들어 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들어 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어 FLT3 리간드.
현재 연구 중이거나 사용 중인 면역요법의 예는 면역 보조제, 예컨대 소결핵균, 열대열원충, 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(미국 특허 5,801,005호 및 5,739,169호; 문헌[Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998])’ 사이토카인 요법, 예컨대 인터페론 α, β, 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF(문헌[Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998]); 유전자 요법, 예컨대 TNF, IL-1, IL-2, 및 p53 (문헌[Qin et al., 1998; Austin-Ward 및 Villaseca, 1998; 미국 특허 5,830,880호 및 5,846,945호]); 및 단클론 항체, 예컨대 항-CD20, 항-강글리오시드 GM2, 및 항-p185(문헌[Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998]; 미국 특허 5,824,311호)이다. 하나 이상의 항암 요법이 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.
일부 구현예에서, 면역요법은 면역 관문 억제제일 수 있다. 면역 관문은 신호(예컨대, 공동 자극 분자)를 활성화하거나 억제한다. 면역 관문 억제제에 의해 표적화될 수 있는 억제성 면역 관문은 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3 (CD276으로도 알려짐), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), 세포독성 T-림프구-연관 단백질 4(CTLA-4, Cd152로도 알려짐), 인돌아민 2,3-이산소화효소(IDO), 살해 세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3 (LAG3), 프로그램된 사멸 1(PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제(VISTA)를 포함한다. 특히, 면역 관문 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.
면역 관문 억제제는 약물, 예를 들어 소분자, 리간드 또는 수용체의 재조합형일 수 있거나, 특히 항체, 예를 들어 인간 항체(예컨대, 본원에 둘 다 참조로서 포함된 국제 특허 공개 WO2015016718호; 문헌[Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012])이다. 면역 관문 단백질 또는 그 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있고, 특히, 키메라, 인간화 또는 인간 형태의 항체가 사용될 수 있다. 당업자라면 알듯이, 본원에서 언급된 특정 항체에 대하여 대체 및/또는 등가의 명칭이 사용될 수 있다. 이러한 대체 및/또는 등가의 명칭은 본 개시의 문맥에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 람브롤리주맙(lambrolizumab)은 또한 대체 및 등가의 명칭인 MK-3475 및 펨브롤리주맙(pembrolizumab)으로도 알려진 것이 알려져있다.
일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 그의 리간드 결합 파트너에 대한 PD-1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL 1 및/또는 PDL2이다. 일부 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 그의 결합 파트너에 대한 PDL1의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 일부 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 그의 결합 파트너에 대한 PDL2의 결합을 억제하는 분자이다. 특정 양태에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 그의 항원 결합 단편, 면역접합체(immunoadhesin), 융합 단백질, 또는 올리고펩티드일 수 있다. 예시적인 항체는 모두 본원에 포함된 미국 특허 번호 US8735553호, US8354509호, 및 US8008449호에 기술되어 있다. 본원에 제공된 방법에서 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제가 모두 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 출원 번호 US20140294898호, US2014022021호, 및 US20110008369호에 기술된 바와 같이 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체(예컨대, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합체(예컨대, 불변 영역(예컨대, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합체)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP-224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO®로도 알려진 니볼루맙은 WO2006/121168호에 기술된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, Merck 3475, 람브롤리주맙, KEYTRUDA®, 및 SCH-900475로도 알려진 펨브롤리주맙은 WO2009/114335호에 기술된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 알려진 CT-011은 WO2009/101611호에 기술된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg 로도 알려진 AMP-224는 WO2010/027827호 및 WO2011/066342호에 기술된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.
본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 관문은 세포독성 CT152로도 알려진 T-림프구 연관 단백질 4(CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 Genbank 수탁 번호 L15006이다. CTLA-4는 T 세포의 표면에서 발견되고, 항원 제시 세포의 표면상의 CD80 또는 CD86에 결합했을 때 스위치를 “끄는” 역할을 한다. CTLA4는 보조 T 세포의 표면상에 발현된 면역글로불린 상과의 구성원이고 억제 신호를 T 세포에 전달한다. CTLA4는 CD28인 T 세포 공동자극 단백질과 유사하고, 두 개의 분자가 항원 제시 세포상의 각각 B7-1 및 B7-2라고도 불리는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전달하는 반면, CD28은 자극 신호를 전달한다. 세포내 CTLA4는 조절 T 세포에서도 발견되며, T 세포의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체 및 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제성 수용체인 CTLA-4의 발현을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 항-CTLA-4 항체(예컨대, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체), 그의 항원 결합 단편, 면역 접합체, 융합 단백질 또는 올리고펩티드이다.
본 방법에서 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 그로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 기술 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안으로, 기술분야에서 인정되는(art-recognized) 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들면, US 8,119,129호, WO 01/14424호, WO 98/42752호; WO 00/37504호(CP675,206호, 트레멜리무맙(tremelimumab)으로도 알려진 이전에 티실리무맙(ticilimumab)), 미국 특허 번호 6,207,156호; 문헌[Hurwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206)]; 및 문헌[Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304]에 기술된 항-CTLA-4 항체가 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다. 전술한 출판물의 각각의 교시가 본원에 참조로서 포함된다. CTLA-4의 결합에 있어서 이들 기술 분야에서 인정되는 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 인간화 CTLA-4 항체는 모두 본원에 참조로소 포함된, 국제 특허 출원 번호 WO2001014424호, WO2000037504호, 및 미국 특허 번호 8,017,114호에 기술되어 있다.
예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(ipilimumab)(10D1, MDX- 010, MDX- 101 및 Yervoy®) 또는 그의 항원 결합 단편 및 변이체이다(예컨대, WO 01/14424호 참조). 다른 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 항체는 전술한 항체와 같이 CTLA-4 상에 동일한 에피토프와의 결합에 대해 경쟁하고/하거나 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는 전술한 항체와 적어도 약 90% 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예컨대, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.
CTLA-4를 조절하는 다른 분자는 CTLA-4 리간드 및 예를 들어 모두 본원에 참조로서 포함된, US5844905호, Us5885796호 및 국제 특허 출원 번호 Wo1995001994호 및 Wo1998042752호에 기술된 수용체, 및 예를 들어 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 번호 Us8329867호에 기술된 면역 접합체를 포함한다.
4. 수술
암에 걸린 대략 60%의 사람이 예방, 진단 또는 단계, 근치 및 고통완화 수술을 포함하는, 일부 유형의 수술을 받을 것이다. 근치 수술은 암 조직의 전부 또는 일부를 물리적으로 제거, 절개, 및/또는 파괴하는 절제술을 포함하고, 다른 요법, 예를 들어 본 구현예의 치료, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법, 및/또는 대체 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부의 물리적 제거를 의미한다. 종양 절제술에 더하여, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 동결 수술, 전기 수술, 현미경-제어 수술(모스 수술(Mohs’ surgery)을 포함한다.
암 세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부의 절개 시, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 추가 항암 요법으로 해당 영역의 관류, 직접 주사, 또는 국소 적용에 의해 성취될 수 있다. 이러한 치료는 예를 들면, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일, 또는 매 1, 2, 3, 4, 및 5주, 또는 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이들 치료는 또한 다양한 투여량을 가질 수 있다.
5. 기타 약제
기타 약제가 치료의 효험을 향상시키기 위하여 본 구현예의 특정 양태와 병용하여 사용될 수 있음이 고려된다. 이들 추가 약제는 세포 표면 수용체 및 GAP 결합의 상향 조절에 영향을 주는 약제, 세포 정지제 및 분화제, 세포 접착 억제제, 아포토시스 유도제에 대한 과증식성 세포의 민감도를 증가시켜주는 약제, 또는 기타 생물학적 약제를 포함한다. GAP 결합의 수를 증가시킴으로써 세포내 신호전달의 증가가 인접한 과증식성 세포 집단에 대해 항-과증식 효과를 증가시킨다. 다른 구현예에서, 세포정지제 또는 분화제는 치료의 항-과증식 효험을 향상시키기 위하여 본 구현예의 특정 양태와 병용하여 사용될 수 있다. 세포 접착 억제제가 본 구현예의 효험을 향상시키기 위하여 고려도니다. 세포 접착 억제제의 예는 국소 부착 키나아제(fak) 억제제 및 로바스타틴(Lovastatin)이다. 아포토시스에 대해 과증식성 세포의 민감도를 증가시키는 기타 약제, 예를 들어 항체 c225는 치료 효험을 향상시키기 위하여 본 구현예의 특정 양태와 병용하여 사용될 수 있음이 추가로 고려된다.
Ⅳ. 제조 물품 또는 키트
면역 세포를 포함하는 제조 물품 또는 키트가 또한 본원에서 제공된다. 제조 물품 또는 키트는 개인에서 암의 진행을 지연시키거나 치료하는 데, 또는 암에 걸린 개인의 면역 기능을 향상시키는 데 면역 세포를 사용하기 위한 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 항원 특이적 면역 세포 중 임의의 것이 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다. 예를 들면, 적합한 용기는 병, 바이알, 봉투 및 주사기를 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예를 들어 유리, 플라스틱(예를 들어 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리올레핀) 또는 금속 합금(예를 들어 스테인리스 스틸 또는 하스텔로이)으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 용기는 제형을 담고, 용기에 부착된 라벨 또는 용기와 관련된 라벨은 사용상의 주의 사항을 명시할 수 있다. 제조 물품 또는 키트는 기타 완충액, 희석제, 바늘, 주사기 및 사용 시 지침이 있는 패키지 삽입물을 포함하여, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 내용물을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제조 물품은 하나 이상의 다른 약제(예컨대, 화학요법제 및 항종양제)를 추가로 포함한다. 하나 이상의 약제를 위한 적합한 용기는 예를 들면 병, 바이알, 봉투, 및 주사기를 포함한다.
Ⅴ. 실시예
하기의 실시예가 본 발명의 바람직한 구현예를 설명하기 위해 포함된다. 당업자들은 하기 실시예에 예시된 기술들이 본 발명을 잘 실시할 수 있도록 본 발명자들에 의해 발견된 기술을 나타내고, 따라서 바람직한 실시 양태를 이루는 것으로 고려될 수 있음을 인정할 것이다. 그러나, 당업자들은 본 개시에 비추어, 개시된 특정 구현예에 많은 변형이 가해질 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 얻을 수 있는 것을 인정할 것이다.
실시예 1- IL-15 발현 CAR-NK 세포
NK 세포는 제대혈에서 유래하였고 이식편대숙주 질환(GVHD)의 위험을 증가시키지 않으면서 항종양 활성을 강화시킬 수 있는 종양 특이적 키메라 항원 수용체(CAR)을 발현하도록 유전자 조작함으로써 NK 세포의 특이성을 전용하여, 표적을 발현하는 임의의 암의 면역요법과 같은 요법에 대한 세포의 “상용” 공급원을 제공한다. 유전자 변형을 위해, CB-NK 세포를 레트로바이러스 작제물(iC9/CAR.CS1/IL-15)로 형질도입하여 종양 항원 CS1을 인식하고 골수종을 표적하는 그의 특이성을 전용하였다. 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 CB-NK 세포의 형질도입 효율을 모니터링하였고 전이유전자 발현이 안정적인 것이 확인되었다. 2명의 상이한 공여자로부터 온 NK 세포에서의 CAR 발현의 형질도입 효율이 도 1a에 도시된다. 형질도입된 NK 세포는 CS1 발현 골수종 세포주에 대해 우수한 사멸을 발휘하였고(도 1a) CS1 발현 골수종 세포주에 반응하여 더 많은 효과기 사이토카인을 생산한 것(도 1c)이 관찰되었다.
CAR-형질도입 NK 세포의 항-백혈병 효과를 측정하기 위하여, 림프모구백혈병의 “인간화” 마우스 모델인 루시퍼라아제-발현 Raji NSG 마우스 모델에 주입하였다. CAR-CD191+ CB-NK 세포의 생체내 종양 부위로의 이동(trafficking)을 모니터하기 위하여, 세포를 생물발광 이미징에 의해 모니터링할 수 있게 하는, FFLuc 벡터로 표지하였다. 이식된 마우스는 정맥내 주사된 CS1+ Raji 백혈병 B 세포(2x106)를 받았고 종양 성장을 모니터하기 위하여 Rluc 벡터로 표지하였다. 종양 이식 후 6 내지 10일에, 마우스에 변형되지 않은 2x107으로 증식된 CB-NK 세포 또는 FFLuc로 표지된 CD19-CD28-제타-2A-IL15 CB-NK 세포로 정맥내 주입하였다. 모든 이미징은 3주 동안 매주 한 번 수행하였다. 네 그룹의 동물(한 그룹 당 n=10)을 연구하였고, 안락사시킨 후 마우스의 혈액 및 림프절을 수집하였다. CAR-형질도입 세포는 강한 항종양 반응을 일으켰고, 생체내 생물발광 이미징에 의해 입증되었다. IL-15가 종양의 NK-CAR 매개 살해를 증가시키고 생존을 연장시키는 것이 관찰되었다(도 2a~2b).
IL-15의 자가 분비 생산으로 인한 자발적인 미제어 NK 세포에 대한 우려때문에, 유도성 카스파제-9(IC9)에 기초한 자살 유전자를 작제물내에 통합시켰다. 레트로바이러스 벡터내에 통합된 유도성 카스파제-9 자살 유전자를 시험하기 위하여, 10 nM의 CID AP20187을 iC9/CS1/IL15+ NK 세포의 배양물에 첨가하였다. AP20187 은 4시간 이내에 형질도입 세포의 아포토시스/네크로시스를 유도하였고 아넥신-V-7AAD 염색에 의해 평가되었다.
실시예 2 - 글루코코르티코이드 수용체의 녹아웃
스테로이드 저항성 면역 세포를 제조하기 위하여, gRNA 서열번호 1~2를 사용하여 조혈 세포에서 글루코코르티코이드 수용체를 녹아웃하는 데 CRISPR-CAS9 시스템을 사용하였다. 글루코코르티코이드 수용체 녹아웃의 PCR 기반 스크리닝은 T 세포 및 NK 세포에서 효율적인 녹다운을 보였다(도 3).
3명의 상이한 공여자로부터의 CAR-형질도입 NK 세포를 관찰하였고 덱사메타손 살해에 대한 민감도를 평가하였다. 덱사메타손의 상이한 용량에서 4시간 및 24시간의 치료 후에, 아넥신 V 염색을 수행하여 세포 사멸을 평가하였다. 3명의 모든 공여자로부터의 NK 세포가 덱사메타손에 민감함을 확인하였고 500 μM 덱사메타손 처리하고 24시간에 모든 세포가 사멸하였다(도 4a~4b) CAR NK 세포에서의 GR 녹아웃은 덱사메타손 사멸을 방지하는 것을 확인하였다. 200 μM 덱사메타손으로 12시간 동안 처리한 GR 녹아웃이 있는 세포 또는 CAR NK 대조군 세포의 아넥신 V 염색이 도 5에 도시된다. GR 녹아웃이 있는 NK 세포가 대조군 NK 세포와 비교하여 덱사메타손 사멸에 상당한 저항성이 있음을 확인하였다(도 5). 따라서, CRISPR-CAS9 시스템을 사용하여 GR 녹아웃이 스테로이드 저항성 NK 세포를 생성할 수 있었다.
실시예 3 - 면역 세포에서 TGFβ-RII의 녹아웃
다음으로, CRISPR-CAS9를 사용하여 CAR NK 세포의 TGFβ를 녹아웃하여 외인성 TGFβ의 면역억제 효과에 저항성이 있는 CAR NK 세포가 되게하였다(도 6a). TGFβ-RII의 성공적인 녹아웃을 CRISPR/CAS9 기술(gRNA 서열 번호 3~4를 사용하는 TGFβ-RII의 엑손 3의 Cas9 플러스 gRNA 표적화)을 사용하여 달성하였다(도 6a). 야생형 및 TGF-β-RII 녹아웃 NK 세포를 재조합 TGF-β 10 ng/ml로 48시간 동안 처리하였고 K562 표적에 대한 이의 반응을 평가하였다. TGF-β-RII 녹아웃 NK 세포가 외인성 TGF-β의 면역억제 효과에 대해 저항성이 있음을 확인하였다(도 6b). CRISPR/CAS9 기술에 의한 TGFβ-RII 녹아웃은 또한 CAS9 단독으로 처리한 NK 세포와 비교하여 재조합 TGF-β 10 ng/ml에 반응하여 Smad-2/3 인산화를 저지함을 확인하였다(도 6c). 따라서, TGFβ-RII의 CRISPR-CAS9-매개 녹아웃은 TGFβ에 대해 NK 세포가 저항성이 있게 한다.
실시예 4 - 다수의 항원 수용체를 발현하도록 조작된 면역 세포
면역 세포, 예를 들어 T 세포 또는 NK 세포는 혈액, 예를 들어 제대혈에서 유래하고, 종양 특이적 항원 수용체, 예를 들어 CAR 및/또는 TCR을 발현하도록 유전자 조작된다(도 7a~7d). 유전자 변형에 있어서, 세포는 레트로바이러스 작제물(도 7d)로 형질도입되어 두 개 이상의 종양 항원을 인식하도록 세포의 특이성을 전용한다. 형질 도입 효율 및 전이유전자 발현이 모니터링된다. 또한, 항원 특이적 표적 세포의 사멸에서 면역 세포의 효험이 세포독성 분석에 의해 측정된다.
수용체 형질도입 면역 세포의 항암 효과를 측정하기 위하여, 암의 마우스 모델에 주입된다. 세포는 생체내 모니터링을 위해, 예를 들어 생물발광 이미징을 위해 검출가능한 모이어티로 표지된다. 이식된 마우스는 종양 성장을 모니터하기 위하여, 벡터, 예를 들어 Rluc 벡터로 표지하고 정맥내 주사한 항원 특이적 표적 세포(예컨대, 2x106)를 받는다. 종양 이식 후에, 마우스는 변형되지 않은 또는 항원 수용체를 발현하는 증식된 형질도입 면역 세포로 정맥내 주입된다. 동물은 예를 들어 3주 동안 일주일에 한 번 이미징으로 모니터링된다. 마우스를 안락사시킨 후 마우스의 비장, 혈액 및 림프절을 수거한다.
* * *
본원에 개시되고 청구되는 모든 방법은, 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실시될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예에 관해 설명되었지만, 당업자는, 본 발명의 개념, 사상, 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 개시된 방법 및 본원에 개시된 방법의 단계 또는 일련의 단계에 변형이 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적으로 그리고 생리학적으로 관련된 특정 약제가, 본원에 개시된 약제를 대체할 수 있는 동시에 동일하거나 유사한 결과가 달성되는 것이 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환물 및 변형은, 첨부된 청구 범위에 의해 한정되는 본 발명의 사상, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고 문헌
하기의 참고 문헌은 본원에 개시된 것들에 예시적인 절차 또는 기타 상세한 보충을 제공하는 정도로 본원에 참조로서 구체적으로 포함된다.
Austin-Ward and Villaseca, Revista Medica de Chile, 126(7):838-845, 1998.
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994.
Bennekov et al., Mt. Sinai J. Med. 71 (2): 86-93, 2004.
Bukowski et al., Clinical Cancer Res., 4(10):2337-2347, 1998.
Camacho et al. J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206), 2004.
Campbell, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 298: 23-57, 2006.
Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988.
Christodoulides et al., Microbiology, 144(Pt 11):3027-3037, 1998.
Cohen et al. J Immunol. 175:5799-5808, 2005.
Davidson et al., J. Immunother., 21(5):389-398, 1998.
Davila et al. PLoS ONE 8(4): e61338, 2013.
Doulatov et al., Cell Stem Cell. 10:120-36, 2012.
유럽 특허 출원 번호 EP2537416호
Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215), 2013.
Frolet et al., BMC Microbiol. 10:190 (2010).
Gaj et al., Trends in Biotechnology 31(7), 397-405, 2013.
Hanibuchi et al., Int. J. Cancer, 78(4):480-485, 1998.
Heemskerk et al. Hum Gene Ther. 19:496-510, 2008.
Hellstrand et al., Acta Oncologica, 37(4):347-353, 1998.
Hollander, Front. Immun., 3:3, 2012.
Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 14523-28, 1999.
Hui and Hashimoto, Infection Immun., 66(11):5329-5336, 1998.
Hurwitz et al. Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071, 1998.
국제 특허 공개 번호 WO 00/37504호
국제 특허 공개 번호 WO 01/14424호
국제 특허 공개 번호 WO 2007/069666호
국제 특허 공개 번호 WO 2007/069666호
국제 특허 공개 번호 WO 98/42752호
국제 특허 공개 번호 WO/2014055668호
국제 특허 공개 번호 WO1995001994호
국제 특허 공개 번호 WO1998042752호
국제 특허 공개 번호 WO2000037504호
국제 특허 공개 번호 WO200014257호
국제 특허 공개 번호 WO2001014424호
국제 특허 공개 번호 WO2006/121168호
국제 특허 공개 번호 WO2007/103009호
국제 특허 공개 번호 WO2009/101611호
국제 특허 공개 번호 WO2009/114335호
국제 특허 공개 번호 WO2010/027827호
국제 특허 공개 번호 WO2011/066342호
국제 특허 공개 번호 WO2012/129514호
국제 특허 공개 번호 WO2013/071154호
국제 특허 공개 번호 WO2013/123061호
국제 특허 공개 번호 WO2013/166321호
국제 특허 공개 번호 WO2013126726호
국제 특허 공개 번호 WO2014/055668호
국제 특허 공개 번호 WO2014031687호
국제 특허 공개 번호 WO2015016718호
국제 특허 공개 번호 WO99/40188호
Janeway et al, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 433, 1997.
Johnson et al. Blood 114:535-46, 2009.
Jores et al., PNAS U.S.A. 87:9138, 1990.
Kim et al., Nature Biotechnology 31, 251-258, 2013.
Kirchmaier and Sugden, J. Virol., 72(6):4657-4666, 1998.
Leal, M., Ann N Y Acad Sci 1321, 41-54, 2014.
Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003.
Li et al. Nat Biotechnol. 23:349-354, 2005.
Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279, 1992.
Linnemann, C. et al. Nat Med 21, 81-85, 2015.
Lockey et al., Front. Biosci. 13:5916-27, 2008.
Loewendorf et al., J. Intern. Med. 267(5):483-501, 2010.
Ludwig et al. Nature Biotech., (2):185-187, 2006a.
Ludwig et al. Nature Methods, 3(8):637-646, 2006b.
Marschall et al., Future Microbiol. 4:731-42, 2009.
Mokyr et al. Cancer Res 58:5301-5304, 1998.
Notta et al., Science, 218-221, 2011.
Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012
Parkhurst et al. Clin Cancer Res. 15: 169-180, 2009.
Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(24):14411-14416, 1998.
Rieder et al., J. Interferon Cytokine Res. (9):499-509, 2009.
Rykman, et al., J. Virol. 80(2):710-22, 2006.
Sadelain et al., Cancer Discov. 3(4): 388-398, 2013.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001.
Shah et al., PLoS One, 8:e776781, 2013.
Singh et al., Cancer Research, 68:2961-2971, 2008.
Singh et al., Cancer Research, 71:3516-3527, 2011.
Takahashi et al., Cell, 126(4):663-76, 2007.
Terakura et al. Blood. 1:72- 82, 2012.
Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5): 633-39, 2012.
미국 특허 번호 4,870,287호
미국 특허 번호 5,739,169호
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Varela-Rohena et al. Nat Med. 14: 1390-1395, 2008.
Wang et al. J Immunother. 35(9):689-701, 2012.
Wu et al., Adv. Cancer Res., 90: 127-56, 2003.
Wu et al., Cancer, 18(2): 160-75, 2012.
Yamanaka et al., Cell, 131(5):861-72, 2007.
Yu et al., Science, 318:1917-1920, 2007.
Zysk et al., Infect. Immun. 68(6):3740-43, 2000.
SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> IMMUNE CELLS EXPRESSING ENGINEERED ANTIGEN RECEPTORS <130> IPA191397-US <150> US 62/487,248 <151> 2017-04-19 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ex3 NR3C1 sG1 <400> 1 tgctgttgag gagctgga 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ex3 NR3C1 sG2 <400> 2 agcacaccag gcagagtt 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EX3 TGFBR2 sG1 <400> 3 cggctgagga gcggaaga 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EX3 TGFBR2 sG2 <400> 4 tggaggtgag caatcccc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlap sequence <400> 5 ttaatacgac tcactatagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Overlap sequence <400> 6 gttttagagc tagaaatagc 20

Claims (68)

  1. 인간 IL-15(hIL-15) 및 적어도 두 개의 항원 수용체를 발현하도록 조작된 면역 세포로서, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는, 면역 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 hIL-15, CAR, 및 TCR을 발현하도록 조작된, 면역 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 hIL-15 및 두 개의 CAR을 발현하도록 조작된, 면역 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 hIL-15 및 두 개의 TCR을 발현하도록 조작된, 면역 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 3개, 4개, 또는 5개의 항원 수용체를 발현하도록 조작된, 면역 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, 말초 혈액 림프구, NK 세포, 불변 NK 세포, NKT 세포, 또는 줄기세포로 추가로 정의되는, 면역 세포.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포인, 면역 세포.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 NK 세포인, 면역 세포.
  9. 제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC) 또는 유도만능줄기(iPS) 세포인, 면역 세포.
  10. 제1항에 있어서, 상기 면역 세포는 iPS 세포로부터 유래된, 면역 세포.
  11. 제7항에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 감마-델타 T 세포인, 면역 세포.
  12. 제7항에 있어서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(CTL)인, 면역 세포.
  13. 제6항에 있어서, 상기 면역 세포는 동종이계인, 면역 세포.
  14. 제6항에 있어서, 상기 면역 세포는 자기유래인, 면역 세포.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 하나 이상의 추가 사이토카인을 발현하도록 조작된, 면역 세포.
  16. 제15항에 있어서, 하나 이상의 상기 추가 사이토카인은 IL-21 및/또는 IL-2인, 면역 세포.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 글루코코르티코이드 수용체, TGFβ 수용체, 및/또는 CISH의 발현이 본질적으로 없도록 조작된, 면역 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 면역 세포는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas9 효소를 이용하여 조작되는, 면역 세포.
  19. 제18항에 있어서, 하나 이상의 상기 가이드 RNA는 서열번호 1~2를 포함하는, 면역 세포.
  20. 제18항에 있어서, 하나 이상의 상기 가이드 RNA는 서열번호 3~4를 포함하는, 면역 세포.
  21. 제17항에 있어서, 상기 TGFβ 수용체는 TGFβ-RII로서 추가로 정의되는, 면역 세포.
  22. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 말초 혈액, 제대혈, 또는 골수에서 분리되는, 면역 세포.
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 제대혈에서 분리되는, 면역 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제대혈은 둘 이상의 개별 제대혈 단위로부터 모인, 면역 세포.
  25. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 세포는 자살 유전자를 추가로 발현하는, 면역 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 자살 유전자는 CD20, CD52, EGFRv3, 또는 유도성 카스파제 9인, 면역 세포.
  27. 제25항에 있어서, 상기 자살 유전자는 유도성 카스파제 9인, 면역 세포.
  28. 제1항에 있어서, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체를 암호화하는 DNA가 세포의 게놈에 통합되는, 면역 세포.
  29. 제1항에 있어서, 상기 CAR 및/또는 TCR을 암호화하는 DNA가 세포의 게놈에 통합되는, 면역 세포.
  30. 제1항에 있어서, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체는 F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv, 및 scFv로 이루어진 군에서 선택된 항원 결합 영역을 포함하는, 면역 세포.
  31. 제30항에 있어서, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체의 상기 항원 결합 영역은 하나 이상의 종양 관련 항원과 결합하는, 면역 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 종양 관련 항원은 CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen), 알파태아단백(alphafetoprotein), CA-125, MUC-1, 상피 종양 항원, 흑색종-관련 항원, 변이 p53, 변이 ras, HER2/Neu, ERBB2, 엽산 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린(mesothelin), GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 쇄, 람다 쇄, CSPG4, ERBB2, WT-1, EGFRvIII, TRAIL/DR4, 및/또는 VEGFR2인, 면역 세포.
  33. 제30항에 있어서, 제1 항원 수용체의 항원 결합 영역은 제2 항원 수용체의 항원 결합 영역과 별개인, 면역 세포.
  34. 제32항에 있어서, 상기 제1 항원 수용체의 항원 결합 영역은 제1 항원에 결합하고 상기 제2 항원 수용체의 항원 결합 영역은 제2 항원에 결합하는, 면역 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 EGFRvIII이고, 상기 제2 항원은 NY-ESO인, 면역 세포.
  36. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 HER2/Neu이고, 상기 제2 항원은 MUC-1인, 면역 세포.
  37. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 CA-125이고, 상기 제2 항원은 MUC-1인, 면역 세포.
  38. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 CA-125이고, 상기 제2 항원은 WT-1인, 면역 세포.
  39. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 EGFRvIII이고, 상기 제2 항원은 Mage-A3, Mage-A4, 또는 Mage-A10인, 면역 세포.
  40. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 EGFRvIII이고, 상기 제2 항원은 TRAIL/DR4인, 면역 세포.
  41. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 CEA-CAR이고, 상기 제2 항원은 Mage-A3-TCR, Mage-A4-TCR, 또는 Mage-A10인, 면역 세포.
  42. 제34항에 있어서, 상기 제1 항원은 HER2/Neu, CEA-CAR, 및/또는 CA-125, EGFRvIII이고, 상기 제2 항원은 MUC-1, WT-1, TRAIL/DR4, Mage-A3-TCR, Mage-A4-TCR 및/또는 Mage-A10인, 면역 세포.
  43. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체는 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  44. 제42항에 있어서, 하나 이상의 상기 세포내 신호전달 도메인은 T-림프구 활성화 도메인인, 면역 세포.
  45. 제42항에 있어서, 하나 이상의 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP12, CD70, CD40, 또는 이들의 조합을 포함하는, 면역 세포.
  46. 제42항에 있어서, 하나 이상의 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ξ, CD28, 4-1BB-L, 및/또는 DAP12를 포함하는, 면역 세포.
  47. 제1항에 있어서, 적어도 두 개의 상기 항원 수용체는 하나 이상의 막관통 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  48. 제47항에 있어서, 하나 이상의 상기 막관통 도메인은 CD28 막관통 도메인, IgG4Fc 힌지, Fc 영역, CD4 막관통 도메인, CD3ξ 막관통 도메인, 시스테인 변이 인간 CD3ξ 도메인, CD16 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, 및/또는 에리스로포이에틴(erythropoietin) 수용체 막관통 도메인을 포함하는, 면역 세포.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 면역 세포의 유효량을 포함하는 약학 조성물.
  50. 대상의 면역 관련 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 면역 세포의 면역 세포 유효량을 포함하는 조성물.
  51. 대상의 면역 관련 장애의 치료를 위한 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 면역 세포의 면역 세포 유효량을 포함하는 조성물의 용도.
  52. 대상의 면역 관련 장애의 치료 방법으로서, 상기 대상에게 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 면역 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 면역 관련 장애는 암, 자가면역 질환, 이식편대숙주 질환, 동종이식편 거부반응 또는 염증성 병태인, 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 면역 관련 장애는 염증성 병태이고, 상기 면역 세포는 본질적으로 글루코코르티코이드 수용체의 발현이 없는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 대상은 스테로이드 요법을 받았거나 받는 중인, 방법.
  56. 제52항에 있어서, 상기 면역 세포는 자기유래인, 방법.
  57. 제52항에 있어서, 상기 면역 세포는 동종이계인, 방법.
  58. 제52항에 있어서, 상기 면역 관련 장애는 암인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 암은 고형암이거나 혈액암인, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기 암은 난소암이고 상기 면역 세포는 MUC-1, CA-125, 및/또는 WT-1에 대해 항원 특이성을 갖는, 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 암은 폐암이고, 상기 면역 세포는 NY-ESO, EGFR-vIII, Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, 및/또는 TRAIL/DR4에 대해 항원 특이성을 갖는, 방법.
  62. 제58항에 있어서, 상기 암은 췌장암 또는 대장암이고, 상기 면역 세포는 Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10, 및/또는 CEA에 대해 항원 특이성을 갖는, 방법.
  63. 제58항에 있어서, 상기 암은 유방암이고, 상기 면역 세포는 MUC-1, 및 HER2/Neu에 대해 항원 특이성을 갖는, 방법.
  64. 제58항에 있어서, 상기 암은 교모세포종이고, 상기 면역 세포는 Mage-A3, Mage-A4, Mage-A10v, 및/또는 EGFRvIII에 대해 항원 특이성을 갖는, 방법.
  65. 제58항에 있어서, 상기 암은 육종이고, 상기 면역 세포는 NY-ESO 및 EGFR-vIII에 대해 항원 특이성을 갖는, 방법.
  66. 제52항에 있어서, 적어도 제2의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 적어도 제2의 치료제는 화학요법, 면역요법, 수술, 방사선요법, 또는 생물요법을 포함하는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 면역 세포 및/또는 상기 적어도 제2의 치료제는 정맥 내로, 복강 내로, 기관 내로, 종양 내로, 근육 내로, 내시경을 통해, 병소 내로, 경피로, 피하로, 국소적으로, 또는 직접 주사 또는 관류에 의해 투여되는, 방법.
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3784256A4 (en) * 2018-04-27 2022-06-29 Baylor College of Medicine Car t cells with one or more interleukins
SG11202010763VA (en) * 2018-05-03 2020-11-27 Univ Texas Natural killer cells engineered to express chimeric antigen receptors with immune checkpoint blockade
CN112584844A (zh) * 2018-05-31 2021-03-30 华盛顿大学 用于治疗血液系统恶性肿瘤的基因组编辑的恒定自然杀伤t(inkt)细胞
BR112021016046A2 (pt) * 2019-02-15 2021-11-09 Editas Medicine Inc Células assassinas naturais modificadas (nk) para imunoterapia
AU2020254420A1 (en) * 2019-03-29 2021-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for production of CAR-NK cells and use thereof
CN114007642A (zh) 2019-04-30 2022-02-01 森迪生物科学公司 嵌合受体及其使用方法
CA3140393A1 (en) * 2019-06-04 2020-12-10 Nkarta, Inc. Combinations of engineered natural killer cells and engineered t cells for immunotherapy
JP2022542051A (ja) * 2019-07-23 2022-09-29 ウェン ヤン， 養子免疫療法のための組成物および方法
CN114651003A (zh) 2019-09-10 2022-06-21 黑曜石疗法公司 用于可调调节的ca2-il15融合蛋白
JP2022548902A (ja) * 2019-09-18 2022-11-22 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム Ｂｃｍａ陽性腫瘍を標的とするためのナチュラルキラー細胞の操作方法
US20210106619A1 (en) * 2019-10-10 2021-04-15 Nantkwest, Inc. NK-92 Bone and Brain targeting
JP2023519051A (ja) * 2019-11-08 2023-05-10 メイヨ・ファウンデーション・フォー・メディカル・エデュケーション・アンド・リサーチ 炎症状態及び変性疾患を処置するために操作された間葉系幹細胞を使用する方法及び材料
WO2021108631A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Large-scale combined car transduction and crispr gene editing of t cells
CA3163258A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Large-scale combined car transduction and crispr gene editing of nk cells
US20220378739A1 (en) * 2019-11-27 2022-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Natural killer cell immunotherapy for the treatment of glioblastoma and other cancers
US20230045174A1 (en) * 2019-11-27 2023-02-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Large-scale combined car transduction and crispr gene editing of msc cells
CN115003314A (zh) * 2019-11-27 2022-09-02 得克萨斯大学体系董事会 B细胞的大规模组合car转导和crispr基因编辑
WO2021142127A1 (en) * 2020-01-08 2021-07-15 Board Of Regents, The University Of Texas System A method of engineering natural killer cells to target cd70-positive tumors
US11591381B2 (en) 2020-11-30 2023-02-28 Crispr Therapeutics Ag Gene-edited natural killer cells
WO2023034723A1 (en) * 2021-08-30 2023-03-09 Carrygenes Bioengineering, Llc tCD34 AND OTHER MARKERS FOR IDENTIFICATION AND SORTING OF CELLS AND FOR USE AS IN VIVO TRACKING ASSISTANT
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024161021A1 (en) 2023-02-03 2024-08-08 Juno Therapeutics Gmbh Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
CN116410336B (zh) * 2023-06-02 2023-09-22 云南赛元生物技术有限公司 一种嵌合抗原受体的编码核苷酸、car-nk细胞及其构建方法和应用

Family Cites Families (242)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59204036A (ja) 1983-05-06 1984-11-19 Dainippon Ink & Chem Inc レジストパタ−ンの形成法
US4981784A (en) 1987-12-02 1991-01-01 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor method
US5171671A (en) 1987-12-02 1992-12-15 The Salk Institute For Biological Studies Retinoic acid receptor composition
US5906936A (en) 1988-05-04 1999-05-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Endowing lymphocytes with antibody specificity
US5602009A (en) 1988-12-23 1997-02-11 The Salk Institute For Biological Studies Dominant negative chimeras of the steroid/thyroid superfamily of receptors
US5164897A (en) 1989-06-21 1992-11-17 Techpower, Inc. Automated method for selecting personnel matched to job criteria
CA2075182C (en) 1990-02-09 2003-03-25 David J. Mangelsdorf Retinoid receptor compositions and methods
JPH06505152A (ja) 1990-12-21 1994-06-16 ザ ロックフェラー ユニヴァーシティ 肝集積性転写因子
US7049136B2 (en) 1991-03-07 2006-05-23 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US5843728A (en) 1991-03-07 1998-12-01 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by receptor chimeras
US6004811A (en) 1991-03-07 1999-12-21 The Massachussetts General Hospital Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras
US5851828A (en) 1991-03-07 1998-12-22 The General Hospital Corporation Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells
US5912170A (en) 1991-03-07 1999-06-15 The General Hospital Corporation Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras
US6887471B1 (en) 1991-06-27 2005-05-03 Bristol-Myers Squibb Company Method to inhibit T cell interactions with soluble B7
US6090914A (en) 1991-06-27 2000-07-18 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4/CD28Ig hybrid fusion proteins and uses thereof
DE59208378D1 (de) 1991-09-04 1997-05-28 Ciba Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von Glykosiden
EP0609240B1 (en) 1991-09-17 2002-04-03 The Salk Institute For Biological Studies Receptors of the thyroid/steroid hormone receptor superfamily
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
US5789187A (en) 1992-08-27 1998-08-04 Worcester Foundation For Experimental Biology Identification of differentiation factor receptors which inhibit the tumorigenicity of neuroblastoma cells in a ligand-independent manner
US5552303A (en) 1993-03-08 1996-09-03 Immunex Corporation DNA encoding epithelium-derived T-cell factor
CA2160011A1 (en) 1993-04-06 1994-10-13 Philip D. Greenberg Chimeric cytokine receptors in lymphocytes
IL110298A (en) 1993-07-13 1999-04-11 Brann Mark Robert Identification of ligands by selective amplification of cells transfected with receptors
US6083751A (en) 1994-11-01 2000-07-04 Targeted Genetics Corporation Chimeric receptors for the generation of selectively-activatable TH-independent cytotoxic T cells
US6005086A (en) 1995-01-13 1999-12-21 The Salk Institute For Biological Studies Farnesoid activated receptor polypeptides, and nucleic acid encoding the same
US5935821A (en) 1995-01-17 1999-08-10 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Polynucleotides related to monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
US5712149A (en) 1995-02-03 1998-01-27 Cell Genesys, Inc. Chimeric receptor molecules for delivery of co-stimulatory signals
US6103521A (en) 1995-02-06 2000-08-15 Cell Genesys, Inc. Multispecific chimeric receptors
EP0783577B1 (en) 1995-07-26 2008-07-09 AstraZeneca AB Chimeric receptors and methods for identifying compounds active at metabotropic glutamate receptors and the use of such compounds in the treatment of neurological disorders and diseases
US5750353A (en) 1995-12-11 1998-05-12 New England Medical Center Hospitals, Inc. Assay for non-peptide agonists to peptide hormone receptors
US6084084A (en) 1996-02-21 2000-07-04 Nps Pharmaceuticals, Inc. Human metabotropic glutamate receptor
JP2001502521A (ja) 1996-04-26 2001-02-27 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター インターロイキン―１５の拮抗剤
US6451308B1 (en) 1996-04-26 2002-09-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Antagonists of interleukin-15
US7196164B2 (en) 1997-07-08 2007-03-27 Human Genome Sciences, Inc. Secreted protein HHTLF25
AU7126798A (en) 1997-04-16 1998-11-11 Drexel University Bipolar electrochemical connection of materials
AU7267398A (en) 1997-04-30 1998-11-24 Hans Klingemann Natural killer cell lines and methods of use
JP2002513295A (ja) 1997-07-08 2002-05-08 ヒューマン・ジェノム・サイエンシズ・インコーポレイテッド １２３種類のヒト分泌タンパク質
US6416973B1 (en) 1997-08-01 2002-07-09 Schering Corporation Nucleic acids encoding mammalian cell membrane protein MDL-1
US6607879B1 (en) 1998-02-09 2003-08-19 Incyte Corporation Compositions for the detection of blood cell and immunological response gene expression
US7001733B1 (en) 1998-05-12 2006-02-21 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for screening for modulations of IgE synthesis, secretion and switch rearrangement
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
US6307024B1 (en) 1999-03-09 2001-10-23 Zymogenetics, Inc. Cytokine zalpha11 Ligand
JP2002541845A (ja) 1999-04-16 2002-12-10 セルテック セラピューティックス リミテッド 合成膜貫通成分
US6747665B1 (en) 1999-05-10 2004-06-08 Ge Medical Systems Global Technology Company, Llc Semi-transparent medical image overlays
US6361714B1 (en) 1999-06-03 2002-03-26 Fuji Photo Film Co., Ltd. Method of preparing barium fluorohalide phosphor
EP1246643A4 (en) 1999-10-14 2005-05-11 Jeffery A Ledbetter DNA VACCINES ENCODING ANTIGEN ASSOCIATED WITH CD40-BINDING DOMAIN
AU2001261585B2 (en) 2000-05-12 2006-08-31 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions and methods for achieving immune suppression
GB0017173D0 (en) 2000-07-12 2000-08-30 Bp Chem Int Ltd Process for the production of olefins
EP1304573A4 (en) 2000-07-17 2006-06-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR SCREENING A LIGAND WITH BIOLOGICAL ACTIVITY
RU2280255C2 (ru) 2000-09-14 2006-07-20 Бет Изрейэл Диконисс Медикал Сентер, Инк. Модуляция il-2- и il-15-опосредованных т-клеточных ответов
GB0025307D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
US20020102264A1 (en) 2000-10-18 2002-08-01 Cheung Nai-Kong V. Uses of monoclonal antibody 8H9
US6937446B2 (en) 2000-10-20 2005-08-30 Kabushiki Kaisha Toshiba Magnetoresistance effect element, magnetic head and magnetic recording and/or reproducing system
EP1356066A2 (en) 2000-10-24 2003-10-29 Syngenta Participations AG Control of gene expression in plants
JP5312721B2 (ja) 2000-11-07 2013-10-09 シティ・オブ・ホープ Ｃｄ１９特異的再指向免疫細胞
US6706867B1 (en) 2000-12-19 2004-03-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA array sequence selection
US7148040B2 (en) 2001-02-20 2006-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method of rapid production of hybridomas expressing monoclonal antibodies on the cell surface
US7723111B2 (en) 2001-03-09 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Activated dual specificity lymphocytes and their methods of use
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
US6824974B2 (en) 2001-06-11 2004-11-30 Genorx, Inc. Electronic detection of biological molecules using thin layers
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
JP3749873B2 (ja) 2002-03-28 2006-03-01 株式会社東芝 磁気抵抗効果素子、磁気ヘッド及び磁気再生装置
US8535672B2 (en) 2002-04-04 2013-09-17 Yissum Research Development Of The Hebrew University Of Jerusalem Broad-spectrum in-vivo effective superantigen toxin antagonists based on the interaction between CD28 and the superantigen and uses thereof
ATE428778T1 (de) 2002-04-26 2009-05-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Verfahren zum screening auf agonistische antikörper
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US8263375B2 (en) 2002-12-20 2012-09-11 Acea Biosciences Dynamic monitoring of activation of G-protein coupled receptor (GPCR) and receptor tyrosine kinase (RTK) in living cells using real-time microelectronic cell sensing technology
WO2004033685A1 (en) 2002-10-09 2004-04-22 Avidex Ltd Single chain recombinant t cell receptors
JP3836788B2 (ja) 2002-12-26 2006-10-25 株式会社東芝 磁気抵抗効果素子、磁気抵抗効果型ヘッドおよび磁気記録再生装置
WO2004061125A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Mmi Genomics, Inc. Compositions, methods and systems for inferring bovine traits
ES2625342T3 (es) 2003-06-27 2017-07-19 Monell Chemical Senses Center Receptores gustativos de la familia T1R del gato doméstico
AU2004260936B2 (en) 2003-06-27 2010-06-10 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to the deletion mutants of epidermal growth factor receptor and uses thereof
JP2007528862A (ja) * 2003-07-16 2007-10-18 アールブイエックス セラピューティクス， インコーポレイテッド ＴＧＦ−βの効果を下方制御するための化合物および方法
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
US7089052B2 (en) 2004-02-26 2006-08-08 Tanita Corporation Method and system for estimating visceral fat area
KR101289774B1 (ko) 2004-03-31 2013-08-07 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 표피성장인자 수용체를 표적으로 하는 치료에 대한 암의반응성을 결정하는 방법
EP2314317A3 (en) 2004-07-09 2011-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
FR2873813B1 (fr) 2004-07-30 2006-11-17 Abx Sa Procede et dispositif de caracterisation des composants cellulaires d'un liquide biologique
JP4550115B2 (ja) 2004-08-03 2010-09-22 ジーンアート・アクチエンゲゼルシャフト ＣｐＧ含量を変化させることにより遺伝子発現を調整する方法
US7235190B1 (en) 2004-09-02 2007-06-26 Sandia Corporation Nanocluster-based white-light-emitting material employing surface tuning
ES2382775T3 (es) 2004-10-08 2012-06-13 Government Of The United States Of America,As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Inmunoterapia adoptiva con supervivencia de linfocitos T potenciada.
US7485600B2 (en) 2004-11-17 2009-02-03 Honda Motor Co., Ltd. Catalyst for synthesis of carbon single-walled nanotubes
US7700728B2 (en) 2005-03-24 2010-04-20 Schering Corporation Use of chimeric receptors in a screening assay for identifying agonists and antagonists of cell receptors
CA2608474C (en) 2005-05-17 2019-11-12 University Of Connecticut Compositions and methods for immunomodulation in an organism
WO2006133398A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Invitrogen Corporation In vitro activated donor t-cells to promote transplant engraftment
US20070071759A1 (en) 2005-06-29 2007-03-29 University Of Miami Antibody-immune cell ligand fusion protein for cancer therapy
KR101304243B1 (ko) 2005-08-09 2013-09-05 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 ＨＬＡ-Ａ2 양성 환자용 글리피칸-3(ｇｌｙｐｉｃａｎ-3)유래의 암 거절항원 펩티드 및 그를 포함하는 의약
US7341944B2 (en) 2005-09-15 2008-03-11 Honda Motor Co., Ltd Methods for synthesis of metal nanowires
RU2008127252A (ru) 2005-12-08 2010-01-20 Новартис АГ (CH) Эффекты ингибиторов fgfr3 на транскрипцию генов
AU2007208452B2 (en) 2006-01-13 2012-07-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines and immunotherapeutics using codon optimized IL-15 and methods for using the same
EP1984505B1 (en) 2006-01-13 2019-12-25 The Government of the U.S.A., as repr. by the Secretary, Dept. of Health & Human Services, the Nat. Inst. of Health Codon optimized il-15 and il-15r-alpha genes for expression in mammalian cells
EP2047254B1 (en) 2006-04-20 2015-10-28 Givaudan SA Method relating to sweetness enhancement
JP5300184B2 (ja) 2006-07-18 2013-09-25 キヤノン株式会社 圧電体、圧電体素子、圧電体素子を用いた液体吐出ヘッド及び液体吐出装置
US7972438B2 (en) 2006-08-30 2011-07-05 Crystal Photonics, Incorporated High-index UV optical materials for immersion lithography
CA2662340C (en) 2006-09-08 2016-08-02 Medimmune, Llc Humanized anti-cd19 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
WO2008045437A2 (en) 2006-10-09 2008-04-17 The General Hospital Corporation Chimeric t-cell receptors and t-cells targeting egfrviii on tumors
CA2667414C (en) * 2006-11-13 2015-12-29 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of the human glucocorticoid receptor locus
EP2413142B1 (en) 2007-02-27 2013-06-05 Nuclea Biomarkers LLC Method for predicting the response of NSCLC-patients to treatment by an EGFR-TK inhibitor
US7977517B2 (en) 2007-03-08 2011-07-12 Virent Energy Systems, Inc. Synthesis of liquid fuels and chemicals from oxygenated hydrocarbons
WO2008112886A1 (en) 2007-03-13 2008-09-18 Evident Technologies, Inc. Infrared display with luminescent quantum dots
EP2856876B1 (en) 2007-03-30 2018-01-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred T lymphocytes
US8163279B2 (en) 2007-04-13 2012-04-24 Stemline Therapeutics, Inc. IL3Rα antibody conjugates and uses thereof
EP2160404B1 (en) 2007-06-18 2016-08-24 Valorisation-Recherche, Limited Partnership Azapeptides as cd36 binding compounds
EP2048237A1 (en) 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
CA2691785C (en) 2007-06-27 2017-01-10 Marine Polymer Technologies Inc. Complexes of il-15 and il-15ralpha and uses thereof
US20090017050A1 (en) 2007-07-13 2009-01-15 Ventana Medical Systems, Inc. Egfr antigen-binding molecules and uses thereof
US8900816B2 (en) 2007-07-19 2014-12-02 Duke University Assay for anti-EGFRvIII antibodies
DK2211904T3 (en) 2007-10-19 2016-10-24 Seattle Genetics Inc Cd19-binding agents and uses thereof
DK2279253T3 (en) 2008-04-09 2017-02-13 Maxcyte Inc Construction and application of therapeutic compositions of freshly isolated cells
US8591858B2 (en) 2008-05-01 2013-11-26 Honda Motor Co., Ltd. Effect of hydrocarbon and transport gas feedstock on efficiency and quality of grown single-walled nanotubes
WO2010025177A1 (en) 2008-08-26 2010-03-04 City Of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
CN102203034A (zh) 2008-08-27 2011-09-28 维仁特能源系统公司 从生物质合成液体燃料
WO2010042189A2 (en) 2008-10-08 2010-04-15 Intrexon Corporation Engineered cells expressing multiple immunomodulators and uses thereof
US8435762B2 (en) 2008-10-09 2013-05-07 Howard Hughes Medical Institute Chimeric ligand-gated ion channels and methods of use thereof
BRPI1005984A2 (pt) 2009-02-23 2016-10-04 Glenmark Pharmaceuticals Sa anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga ao cd19 humano, acido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, método para produzir um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo que se liga à cd12 humano, composição, imunoconjugado, uso de um anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo, artigo de manufatura e kit
US8877199B2 (en) 2009-05-15 2014-11-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services B cell surface reactive antibodies
IT1394774B1 (it) 2009-06-04 2012-07-13 Univ Roma Costrutti esprimenti recettori chimerici, e loro uso per l'attivazione controllata delle risposte di difesa a organismi patogeni in piante
WO2011020047A1 (en) 2009-08-14 2011-02-17 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of il-15 to increase thymic output and to treat lymphopenia
JP5934099B2 (ja) 2009-10-01 2016-06-15 アメリカ合衆国 抗血管内皮増殖因子受容体−２キメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用
US9181527B2 (en) 2009-10-29 2015-11-10 The Trustees Of Dartmouth College T cell receptor-deficient T cell compositions
US9273283B2 (en) 2009-10-29 2016-03-01 The Trustees Of Dartmouth College Method of producing T cell receptor-deficient T cells expressing a chimeric receptor
PT2496698T (pt) 2009-11-03 2019-04-18 Hope City Recetor de fator de crescimento epidermal truncado (egfrt) para seleção de células t transduzidas
US8771664B2 (en) 2009-12-11 2014-07-08 Fundacion Para La Investigacion Medica Aplicada Compositions comprising apolipoprotein A polypeptide and interleukin 15, and methods of treatment using the same
PT2552959T (pt) 2010-03-26 2017-04-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticorpos para muc16 e métodos de utilização dos mesmos
EP3725319A1 (en) 2010-04-14 2020-10-21 Roger Williams Medical Center Methods and compositions for treating hiv
WO2011140170A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Yeda Research And Development Co. Ltd. Immunotherapy using redirected allogeneic cells
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
US9315585B2 (en) 2010-06-19 2016-04-19 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-GD2 antibodies
WO2012012695A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center A method for the treatment of obesity
EP2614143B1 (en) 2010-09-08 2018-11-07 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of non-small lung cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
ES2602743T3 (es) 2010-09-08 2017-02-22 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Receptores de antígenos quiméricos con una región bisagra optimizada
EP2614151B1 (en) 2010-09-08 2019-07-24 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
US9845362B2 (en) 2010-10-08 2017-12-19 The University Of North Carolina At Charlotte Compositions comprising chimeric antigen receptors, T cells comprising the same, and methods of using the same
CN102443056B (zh) 2010-10-15 2015-04-29 上海市肿瘤研究所 表皮生长因子受体的外显子缺失变异体
CA2817015A1 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Altimab Therapeutics, Inc. Protein complexes for antigen binding and methods of use
SG190997A1 (en) 2010-12-09 2013-07-31 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2012082841A2 (en) 2010-12-14 2012-06-21 University Of Maryland, Baltimore Universal anti-tag chimeric antigen receptor-expressing t cells and methods of treating cancer
CN103298770B (zh) 2010-12-30 2016-09-07 维仁特公司 有机催化降解生物质
US9402865B2 (en) 2011-01-18 2016-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
EA201401134A1 (ru) 2011-02-11 2015-05-29 Мемориал Слоан-Кеттеринг Кэнсер Сентер Hla-рестиктированные пептидоспецифические антигенсвязывающие белки
US9987308B2 (en) 2011-03-23 2018-06-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method and compositions for cellular immunotherapy
US9266960B2 (en) 2011-04-08 2016-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-epidermal growth factor receptor variant III chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
WO2012140130A1 (en) 2011-04-13 2012-10-18 Immunicum Ab Method for proliferation of antigen-specific t cells
EP2998320B1 (en) 2011-04-19 2018-07-18 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Human monoclonal antibodies specific for glypican-3 and use thereof
CA2781954A1 (en) 2011-06-28 2012-12-28 F2M International Inc. Hose hanger
US9685295B2 (en) 2011-07-28 2017-06-20 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Electron emission device
WO2013025713A1 (en) 2011-08-16 2013-02-21 Nitto Denko Corporation Phosphor compositions and methods of making the same
WO2013033626A2 (en) 2011-08-31 2013-03-07 Trustees Of Dartmouth College Nkp30 receptor targeted therapeutics
WO2013040371A2 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
WO2013044225A1 (en) 2011-09-22 2013-03-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A universal immune receptor expressed by t cells for the targeting of diverse and multiple antigens
US9175308B2 (en) 2011-10-07 2015-11-03 Mie University Chimeric antigen receptor
JP6267644B2 (ja) 2011-10-20 2018-01-24 アメリカ合衆国 抗ｃｄ２２キメラ抗原受容体
KR101471647B1 (ko) 2011-10-26 2014-12-11 국립암센터 변이 ｃｔｌａ4 유전자 이입 ｔ 세포 및 이를 포함하는 항암 면역치료용 조성물
WO2013063419A2 (en) 2011-10-28 2013-05-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania A fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
WO2013067492A1 (en) 2011-11-03 2013-05-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Isolated b7-h4 specific compositions and methods of use thereof
WO2013070468A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
WO2013091130A1 (zh) 2011-12-19 2013-06-27 中国农业大学 猪cd28受体，编码其的基因及其应用
AU2013216320A1 (en) 2012-02-01 2014-04-03 Compugen Ltd. C10RF32 antibodies, and uses thereof for treatment of cancer
AU2013221672B2 (en) 2012-02-13 2017-11-09 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
SG11201404284SA (en) 2012-02-22 2014-10-30 Univ Pennsylvania Use of the cd2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
WO2013126733A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of University Of Pennsylvania Use of icos-based cars to enhance antitumor activity and car persistence
SG11201404285VA (en) 2012-02-22 2014-10-30 Univ Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of t cells useful for the treatment of cancer
CA3209571A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-mesothelin chimeric antigen receptors
CN104379179A (zh) 2012-04-11 2015-02-25 美国卫生和人力服务部 靶向b-细胞成熟抗原的嵌合抗原受体
US9156915B2 (en) 2012-04-26 2015-10-13 Thomas Jefferson University Anti-GCC antibody molecules
US9790278B2 (en) 2012-05-07 2017-10-17 The Trustees Of Dartmouth College Anti-B7-H6 antibody, fusion proteins, and methods of using the same
MX370265B (es) * 2012-05-25 2019-12-09 Cellectis Métodos para manipular por ingeniería genética célula t alogénica y resistente a inmunosupresores para inmunoterapia.
AU2013272504A1 (en) 2012-06-08 2015-01-22 Kinki University Antibody against transporter and use thereof
EP2872533B1 (en) 2012-07-13 2019-04-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration
EP2904106A4 (en) 2012-10-01 2016-05-11 Univ Pennsylvania COMPOSITIONS AND METHODS FOR TARGETING STROMAL CELLS FOR THE TREATMENT OF CANCER
EP2906684B8 (en) 2012-10-10 2020-09-02 Sangamo Therapeutics, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
RU2658485C2 (ru) 2012-10-24 2018-06-21 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы м971
WO2014117121A1 (en) 2013-01-28 2014-07-31 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. A chimeric receptor with nkg2d specificity for use in cell therapy against cancer and infectious disease
CA3115383A1 (en) * 2013-02-06 2014-08-14 Celgene Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
EP3881868B1 (en) 2013-02-15 2023-09-27 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptor and methods of use thereof
US9573988B2 (en) 2013-02-20 2017-02-21 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-CD123 chimeric antigen receptor engineered T cells
PL2958943T3 (pl) 2013-02-20 2020-04-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Leczenie nowotworu złośliwego za pomocą humanizowanego chimerycznego receptora antygenowego anty-egfrviii
CA2903096A1 (en) 2013-03-05 2014-09-12 Baylor College Of Medicine Oncolytic virus
US9434935B2 (en) 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
US9393268B2 (en) 2013-03-15 2016-07-19 Thomas Jefferson University Cell-based anti-cancer compositions with reduced toxicity and methods of making and using the same
US9657105B2 (en) 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
US9446105B2 (en) 2013-03-15 2016-09-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimeric antigen receptor specific for folate receptor β
IL300508A (en) * 2013-03-15 2023-04-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Preparations and methods for immunotherapy
WO2014145252A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Milone Michael C Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
WO2014160627A1 (en) 2013-03-25 2014-10-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-cd276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
CN104140974B (zh) 2013-05-08 2017-09-29 科济生物医药（上海）有限公司 编码gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的核酸及表达gpc‑3嵌合抗原受体蛋白的t淋巴细胞
AU2014265487B2 (en) * 2013-05-14 2020-10-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Human application of engineered chimeric antigen receptor (CAR) T-cells
AU2014268364A1 (en) 2013-05-24 2015-12-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Chimeric antigen receptor-targeting monoclonal antibodies
ES2883131T3 (es) 2013-05-29 2021-12-07 Cellectis Métodos para la modificación de células T para inmunoterapia utilizando el sistema de nucleasa CAS guiado por ARN
WO2014197638A2 (en) 2013-06-05 2014-12-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
MX2015016963A (es) 2013-06-10 2016-08-08 Dana Farber Cancer Inst Inc Metodos y composiciones para reducir la inmunosupresion por celulas de tumor.
NZ631015A (en) 2013-06-25 2019-08-30 Vaccinex Inc Use of semaphorin-4d inhibitory molecules in combination with an immune modulating therapy to inhibit tumor growth and metastases
CA2954168C (en) 2013-08-02 2023-09-19 The Regents Of The University Of California Engineering antiviral t cell immunity through stem cells and chimeric antigen receptors
EP3052085B1 (en) 2013-10-03 2019-07-03 University of Maryland, Baltimore Nanoparticle based artificial antigen presenting cell mediated activation of nkt cells
EP3620470B1 (en) 2013-10-11 2023-07-26 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Tem8 antibodies and their use
EP3057994B1 (en) 2013-10-15 2020-09-23 The Scripps Research Institute Peptidic chimeric antigen receptor t cell switches and uses thereof
WO2015082499A2 (en) 2013-12-03 2015-06-11 Iomet Pharma Ltd Pharmaceutical compound
WO2015083173A1 (en) 2013-12-06 2015-06-11 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Reduction of inflammatory disease symptoms by short peptides that inhibit signaling through cd28
WO2015127548A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 The Royal Institution For The Advancement Of Learning / Mcgill University Tc-ptp inhibitors as apc activators for immunotherapy
WO2015142675A2 (en) 2014-03-15 2015-09-24 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
WO2015140268A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Cellectis Cd123 specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
JP6673848B2 (ja) 2014-04-03 2020-03-25 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 癌免疫療法のためのｃｄ３３特異的キメラ抗原受容体
CN107106665A (zh) 2014-06-06 2017-08-29 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向间皮素的嵌合抗原受体及其用途
EP3157958B1 (en) 2014-06-18 2020-05-06 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Car-expressing nk-92 cells as cell therapeutic agents
BR112017001242A2 (pt) 2014-07-21 2017-12-05 Novartis Ag tratamento de câncer usando um receptor antigênico quimérico a cd33
US9546206B2 (en) 2014-08-08 2017-01-17 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University High affinity PD-1 agents and methods of use
SG11201700770PA (en) 2014-08-19 2017-03-30 Novartis Ag Anti-cd123 chimeric antigen receptor (car) for use in cancer treatment
ES2913865T3 (es) * 2014-08-28 2022-06-06 Bioatla Inc Receptores de antígeno quimérico condicionalmente activos para células T modificadas
KR102683584B1 (ko) 2014-09-19 2024-07-10 시티 오브 호프 ＩＬ13Ｒα2를 표적화하는 공자극 키메라 항원 수용체 Ｔ 세포
CN107106638A (zh) 2014-10-14 2017-08-29 激流生物科学有限公司 具有抗炎特性的肽
CN107709353A (zh) 2014-12-02 2018-02-16 普拉斯派克特查特凯尔Rwmc有限责任公司 治疗癌症的方法和组合物
RU2768019C2 (ru) 2014-12-24 2022-03-23 Отолус Лимитед Клетка
US10590182B2 (en) 2015-02-24 2020-03-17 The Regents Of The University Of California Binding-triggered transcriptional switches and methods of use thereof
SG11201706774WA (en) 2015-02-27 2017-09-28 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars) targeting hematologic malignancies, compositions and methods of use thereof
JP6336684B2 (ja) 2015-03-02 2018-06-06 イノベイティブ セルラー セラピューティクス シーオー．，エルティディ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ． Ｐｄ−ｌ１によって誘導される免疫寛容の低減
SG10201913158PA (en) 2015-04-03 2020-02-27 Eureka Therapeutics Inc Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
US10786549B2 (en) 2015-04-23 2020-09-29 Baylor College Of Medicine CD5 chimeric antigen receptor for adoptive T cell therapy
GB201507111D0 (en) 2015-04-27 2015-06-10 Ucl Business Plc Nucleic acid construct
AU2016268864B2 (en) 2015-05-28 2022-06-02 Kite Pharma, Inc. Methods of conditioning patients for T cell therapy
EP3098237B1 (en) 2015-05-28 2018-08-01 Universität Zu Köln Anti-toso chimeric antigen receptor and its use
WO2016197108A1 (en) * 2015-06-05 2016-12-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of treatment with natural killer cells matched for killer immunoglobulin receptor type
WO2017222593A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
JP2018521069A (ja) 2015-07-16 2018-08-02 プロスペクト チャーターケア アールダブリュエムシー，エルエルシー ディ／ビー／エイ ロジャー ウィリアムズ メディカル センターＰｒｏｓｐｅｃｔ Ｃｈａｒｔｅｒｃａｒｅ Ｒｗｍｃ，Ｌｌｃ Ｄ／Ｂ／Ａ Ｒｏｇｅｒ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ 腹膜癌を治療するための組成物及び方法
US10166255B2 (en) * 2015-07-31 2019-01-01 Regents Of The University Of Minnesota Intracellular genomic transplant and methods of therapy
RU2744245C2 (ru) 2015-08-03 2021-03-04 Кафа Терапьютикс Лимитед Антитело против глипикана-3 и его применение
AU2016305087B2 (en) 2015-08-12 2022-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Cell surface coupling of nanoparticles
CA2939288A1 (en) 2015-08-28 2017-02-28 Rolls-Royce High Temperature Composites, Inc. Ceramic matrix composite including silicon carbide fibers in a ceramic matrix comprising a max phase compound
CA2997673A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Board Of Regents, The University Of Texas System T-cell receptor (tcr)-binding antibodies and uses thereof
AU2016333898B2 (en) 2015-10-05 2020-11-12 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified cells comprising a modified human T cell receptor alpha constant region gene
KR20180081532A (ko) 2015-10-30 2018-07-16 알레타 바이오쎄라퓨틱스, 인크. 암 치료용 조성물 및 방법
TWI734715B (zh) 2015-11-19 2021-08-01 美商卡默森屈有限公司 趨化因子受體調節劑
TWI724056B (zh) 2015-11-19 2021-04-11 美商卡默森屈有限公司 Ｃｘｃｒ２抑制劑
AU2016363025B2 (en) 2015-12-03 2021-04-08 Juno Therapeutics, Inc. Modified chimeric receptors and related compositions and methods
ES2952064T3 (es) 2015-12-16 2023-10-26 Walter & Eliza Hall Inst Medical Res Inhibición de la proteína SH2 inducida por citocinas en células NK
US9856497B2 (en) 2016-01-11 2018-01-02 The Board Of Trustee Of The Leland Stanford Junior University Chimeric proteins and methods of regulating gene expression
SG10202112024PA (en) 2016-01-11 2021-12-30 Univ Leland Stanford Junior Chimeric proteins and methods of immunotherapy
CN113082201B (zh) 2016-04-01 2024-07-05 上海斯丹赛生物技术有限公司 刺激t细胞介导的对表达抗原的细胞群的免疫应答的方法
US11648271B2 (en) 2016-06-22 2023-05-16 David Klatzmann Genetically modified T lymphocytes
EP3493827A4 (en) 2016-08-04 2020-02-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMMUNOTHERAPY
GB2607227B (en) 2016-10-27 2023-05-10 Intima Bioscience Inc Viral methods of T cell therapy
SG11202010763VA (en) * 2018-05-03 2020-11-27 Univ Texas Natural killer cells engineered to express chimeric antigen receptors with immune checkpoint blockade

Also Published As

Publication number Publication date
US20200085872A1 (en) 2020-03-19
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