JP6673848B2

JP6673848B2 - 癌免疫療法のためのｃｄ３３特異的キメラ抗原受容体

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Publication number: JP6673848B2
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Inventors: ロマンガレット
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Publication date: 2020-03-25
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Description

発明の分野
本発明は、大部分の骨髄系細胞に見出され患者における急性骨髄白血病（AML）を診断するために使用される細胞表面糖タンパク質CD33へ免疫細胞の特異性および反応性を向け直すことができる組換えキメラタンパク質であるキメラ抗原受容体（CAR）に関する。本発明によるCARは、T細胞またはNK細胞において発現された時、CD33を保持する悪性細胞を処置するために特に有用である。得られた操作された免疫細胞は、免疫療法のための安全性および効率を付与する、悪性細胞に対する高レベルの特異性を示す。

発明の背景
エクスビボで生成された自己の抗原特異的T細胞の移入を含む養子免疫療法は、ウイルス感染および癌を処置するための有望な戦略である。養子免疫療法のために使用されるT細胞は、抗原特異的T細胞の増大または遺伝子操作を通したT細胞の向け直しのいずれかによって生成され得る（Park, Rosenberg et al. 2011）。ウイルス抗原特異的T細胞の移入は、移植に関連したウイルス感染および稀なウイルス関連悪性疾患の処置のために使用されている、よく確立された手法である。同様に、腫瘍特異的T細胞の単離および移入は、黒色腫の処置において成功が示されている。

T細胞における新規特異性は、トランスジェニックT細胞受容体またはキメラ抗原受容体（CAR）の遺伝子移入を通して、成功裡に生成された（Jena, Dotti et al. 2010）。CARは、単一の融合分子として1つ以上のシグナリングドメインと会合したターゲティング部分からなる合成受容体である。通常CARの結合部分は、フレキシブルリンカーによって結合されたモノクローナル抗体の軽鎖可変断片を含む、単鎖抗体（scFv）の抗原結合ドメインからなる。受容体またはリガンドのドメインに基づく結合部分も、成功裡に使用されている。第一世代CARのためのシグナリングドメインは、CD3ζ鎖またはFc受容体γ鎖の細胞質領域に由来する。第一世代CARは、T細胞の細胞傷害を成功裡に向け直すことが示された。しかしながら、それらは、インビボで、長期にわたる増大および抗腫瘍活性を提供することができなかった。共刺激分子に由来するシグナリングドメインが、膜貫通ドメインおよびヒンジドメインと共に追加されて、第二世代および第三世代のCARが形成され、ヒトにおける治験はいくらかの成功を収め、T細胞をCD19を発現する悪性細胞へ向け直すことができた（June et al.,2011）。しかしながら、CD19 ScFvに関して使用されたシグナリングドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインの組み合わせは、極めて抗原特異的であり、任意の抗原マーカーへは拡張され得なかった。

急性骨髄白血病（AML）は、2番目に一般的な急性白血病であり、米国における1年当たりの新規症例はおよそ13,300例であり年間死亡者数は8,800人である。白血病性疾患の一般的に適用されている治療には、放射線および／または化学療法が含まれる。さらに、ある種の環境において、骨髄移植の付加的な可能性が適当であると考えられている。しかしながら、これらの治療は、患者にとって比較的毒性であり、疾患からの完全治癒をもたらさないことが極めて多い。従って、化学療法を受けた患者の65〜80％で完全寛解が達成され得るが、化学療法を生き延びた細胞は、AML白血病幹細胞（AML-LSC）が濃縮されており、再増大され再発を引き起こすことができる特に危険な細胞の貯蔵庫を構成するため、これらの患者の大部分が再発する（Cros et al.,2004）。白血病幹細胞は、急性骨髄白血病について特によく特徴決定されている。AML-LSCは、とりわけCD33を含む細胞表面抗原の特徴的なセットを発現する。60歳を超えた患者は予後不良を有し、4年無病生存率はわずか10％〜15％である（Gardin et al.,2007）。AML患者のこの高い再発率および高齢患者の予後不良は、CD33⁺細胞を優先的に標的とする新規治療薬の緊急の必要性を強調している。

UniProtKB/Swiss-Protタンパク質データベースでP20138とも呼ばれるCD33（シアリル酸結合Ig様レクチン3）またはSIGLEC3は、骨髄系の細胞上に発現される膜貫通型受容体である。一般的には骨髄特異的と考えられているが、いくつかのリンパ系細胞にも見出される。シアリル酸に結合し、従って、レクチンのSIGLECファミリーのメンバーである。

過去に、CD33に対する抗腫瘍活性を有する非コンジュゲートモノクローナル抗体を開発するため、種々のアプローチが使用されてきた。しかしながら、これらの試みは、悪性細胞に特異的に対処することができなかった。

2000年、カリケアマイシン結合型ヒト化抗CD33モノクローナル抗体であるゲムツズマブオゾガマイシン（Mylotarg（商標）、GO）が、難治性のまたは再発したAMLを有する60歳を超える患者を処置するため、米国FDA（Food and Drug Administration）によって承認された。しかしながら、これは、2010年6月21日に販売中止となった；GOは、細胞傷害性薬剤カリケアマイシンに化学的にカップリングされたヒト化抗CD33 IgG抗体からなっていた。承認後調査（SWOG S0106）が製品の安全性に関する懸念を示し、他の臨床研究（British MRC AML-15治験およびHOVON-43治験）は、臨床上の利益を証明することができなかった（Maniecki et al.,2011）。副作用には、肝静脈閉塞症、肺毒性、および重度過敏症反応が含まれることが見出され、インビトロ研究は、CD33陰性細胞株に対する抗原非依存的な細胞傷害性を明らかにした（Schwemmlein et al,2006）。

さらに最近、CD33を標的とする治療薬で以前に直面した特異性の問題を回避するため、CD123抗体、CD16抗体、およびCD33抗体に由来する免疫グロブリンドメインを組み合わせた三重特異性ポリペプチド分子が提唱された（WO2011/070109）。

従来の戦術の代替法として、本発明は、有意な臨床的利点を有する、CD33+悪性細胞を標的とするために免疫細胞において発現させることができるCD33特異的CARを提供する。

本発明者らは、異なる構造を有し、異なるCD33特異的抗体に由来する異なるscFVを含むCD33特異的CARを生成した。本発明の好ましいCARポリペプチドは、SEQ ID NO：19〜42より選択されるアミノ酸配列を含む。本発明のより好ましいCARポリペプチドは、SEQ ID NO：68のアミノ酸配列を含むか、またはSEQ ID NO：68との少なくとも80％の同一性を有する。（例えば、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズおよび組換えIL2による）インビトロでの非特異的な活性化の後、ウイルス形質導入を使用して、これらのCARを発現するポリヌクレオチドによってドナー由来のT細胞を形質転換した。ある種の場合において、非アロ反応性T細胞を作出するため、より具体的には、移植片対宿主反応を防止するため、TCRの成分（αβT細胞受容体）の妨害によって、さらに具体的には、TCRの成分（αβT細胞受容体）およびCD33遺伝子の妨害によって、T細胞をさらに操作した。

得られた操作されたT細胞は、様々な程度に、CD33陽性細胞に対してインビトロで反応性を示し、このことから、本発明のCARは、T細胞の抗原依存的な活性化に寄与し、その増殖にも寄与し、従って、免疫療法のために有用であることが示された。

本発明のCARをコードするポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列は、本明細書中に詳述される。

本発明の操作された免疫細胞は、B細胞リンパ腫または白血病の処置のような治療的な適用のために特に有用である。
[本発明1001]
図2に図示するV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つと少なくとも80％の同一性を有するCD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）であって、該構造が、
（a）モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（b）FcRIIIαヒンジ、CD8αヒンジ、およびIgG1ヒンジより選択されるヒンジ、
（c）CD8α膜貫通ドメイン、ならびに
（d）CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む、CD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）。
[本発明1002]
構造V3がCD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、本発明1001のCD33特異的CAR。
[本発明1003]
CD8αヒンジがSEQ ID NO：4と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1002のCD33特異的CAR。
[本発明1004]
SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1002または1003の構造V3のCD33特異的CAR。
[本発明1005]
構造V1がFcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、本発明1001のCD33特異的CAR。
[本発明1006]
FcγRIIIαヒンジがSEQ ID NO：3と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1005のCD33特異的CAR。
[本発明1007]
SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、およびSEQ ID NO：22と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1005または1006の構造V1のCD33特異的CAR。
[本発明1008]
構造V5がIgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、本発明1001のCD33特異的CAR。
[本発明1009]
IgG1ヒンジがSEQ ID NO：5と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1008のCD33特異的CAR。
[本発明1010]
SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、およびSEQ ID NO：38と少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、本発明1008または1009の構造V5のCD33特異的CAR。
[本発明1011]
VHが、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、およびSEQ ID NO：17より選択されるポリペプチド配列と少なくとも80％の同一性を有し、かつVLが、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、およびSEQ ID NO：18より選択されるポリペプチド配列と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1001〜1010のいずれかのCD33特異的CAR。
[本発明1012]
4-1BB由来の共刺激ドメインがSEQ ID NO：8と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1001〜1011のいずれかのCD33特異的CAR。
[本発明1013]
CD3ζシグナリングドメインがSEQ ID NO：9と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1001〜1012のいずれかのCD33特異的CAR。
[本発明1014]
CD8α膜貫通ドメインがSEQ ID NO：6と少なくとも80％の同一性を有する、本発明1001〜1013のいずれかのCD33特異的CAR。
[本発明1015]
シグナルペプチドをさらに含む、本発明1001〜1014のいずれかのCD33特異的CAR。
[本発明1016]
シグナルペプチドがSEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2と少なくとも80％の配列同一性を有する、本発明1015のCD33特異的CAR。
[本発明1017]
CD33に特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、本発明1001〜1016のいずれかのCD33特異的CAR。
[本発明1018]
本発明1001〜1017のいずれかのCARをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1019]
本発明1018のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1020]
本発明1001〜1017のいずれかのCD33特異的CARを細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
[本発明1021]
炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、本発明1020の操作された免疫細胞。
[本発明1022]
TCRの発現が抑制されている、本発明1021の操作された免疫細胞。
[本発明1023]
CD33の発現が抑制されている、本発明1020〜1022のいずれかの操作された免疫細胞。
[本発明1024]
少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に対して耐性になるよう修飾されている、本発明1020〜1023のいずれかの操作された免疫細胞。
[本発明1025]
治療において使用するための、本発明1020〜1024のいずれかの操作された免疫細胞。
[本発明1026]
患者がヒトである、本発明1025の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1027]
状態がCD33発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態である、本発明1025〜1026のいずれかの治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1028]
状態がCD33発現細胞の過剰量を特徴とする状態である、本発明1025〜1027のいずれかの治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1029]
状態が血液癌状態である、本発明1025〜1028のいずれかの治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1030]
血液癌状態が白血病である、本発明1029の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1031]
白血病が、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、本発明1030の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1032]
白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、本発明1031の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1033]
血液癌が悪性リンパ増殖性障害である、本発明1029の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1034]
悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、本発明1033の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1035]
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、本発明1034の治療において使用するための操作された免疫細胞。
[本発明1036]
癌細胞の傷害を引き起こすために有効な量の本発明1020〜1024のいずれかの操作された免疫細胞と血液癌細胞を接触させる工程を含む、血液癌細胞に傷害を与える方法。
[本発明1037]
（c）免疫細胞を準備する工程、
（d）本発明1001〜1017のいずれかの少なくとも1種のCD33特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法。
[本発明1038]
（e）免疫細胞を準備する工程、
（f）CD33特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（g）該細胞においてポリヌクレオチドを発現させ、任意で、CD33特異的キメラ抗原受容体を発現させる工程
を含む、本発明1037の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1039]
（b）免疫細胞を準備する工程、
（c）CD33特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（d）CD33に特異的ではない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
を含む、本発明1037または1038の免疫細胞を操作する方法。
[本発明1040]
（c）本発明1001〜1017のいずれかのCD33特異的キメラ抗原受容体を表面に発現している免疫細胞を準備する工程、
（d）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法。
[本発明1041]
前記免疫細胞がドナーから提供される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記免疫細胞が患者自身から提供される、本発明1040の方法。

本発明による操作された免疫細胞の模式図。この図に提示された操作された免疫細胞は、CARをコードするレトロウイルスポリペプチドによって形質導入されたT細胞である。このT細胞は、本発明の範囲内で任意である、患者へのより良好でより安全な生着を可能にするため、さらに操作されている。X遺伝子は、例えば、TCRの成分（TCRαまたはTCRβ）を発現する遺伝子であり得、Yは、（Campathに関して）CD52または（6-チオグアニンに関して）HPRTのような免疫抑制薬に対するT細胞の感受性に関与する遺伝子であり得る。異なるCAR構成（V1〜V6）の模式図。 V1構造、V3構造、またはV5構造を有する異なるCARの模式図。 CAR+T細胞をCD33発現細胞（U937）またはCD33を発現しない細胞（Jeko）と6時間共培養した時の、3種の構成（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、v5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）を有するM195 scFvの脱顆粒活性（％CD8/CD107a+細胞およびCD8+細胞の中のCD107aの平均蛍光強度（MFI））。データは、脱顆粒の率（％）および平均蛍光強度（MFI）として提示されている。 CAR+T細胞をCD33発現細胞（U937）またはCD33を発現しない細胞（Jeko）と6時間共培養した時の、3種の構成（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、v5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）を有するm2H12 scFvおよびMy9.6 scFvの脱顆粒活性（％CD8/CD107a+細胞およびCD8+細胞の中のCD107aのMFI）。データは、脱顆粒の率（％）および平均蛍光強度（MFI）として提示されている。 CAR+T細胞が、高レベルまたは中レベルのCD33を発現する細胞（それぞれ、U937およびK562）またはCD33を発現しない細胞（Jeko-1）と6時間共培養された時の、7種の構築：M195-V1、M195-V3、M195-V5、m2H12-V1、m2H12-V3、およびMy9.6-V1、およびMy9.6-V13（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、v5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）の脱顆粒活性（％CD8/CD107a+細胞）。データは、脱顆粒の率（％）として提示されている。異なるレベルのCD33を発現する細胞（U937およびK562）またはCD33を発現しない細胞（Jeko-1）と24時間共培養された時の、抗CD33 CAR発現T細胞によって放出されたIFNγの量。共培養と同一の条件で単独で培養されたT細胞からのIFNγ放出も示される。実験は3人の独立のドナーについて行われ、ある代表的なドナーからの結果がここに示される。抗CD33 CAR発現T細胞の特異的細胞溶解活性。CAR mRNAトランスフェクションの48時間後にアッセイを行った。T細胞を、4時間、U937＋Jeko細胞またはK562＋Jeko細胞と共培養した。細胞株の各々についての細胞生存率を共培養の終わりに決定し、特異的細胞溶解率を計算した。

（表１）様々なCAR成分の配列

（表２）様々なCAR成分の配列

（表３）構造V-1のCAR

（表４）構造V-2のCAR

（表５）構造V-3のCAR

（表６）構造V-4のCAR

（表７）構造V-5のCAR

（表８）構造V-6のCAR

発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用される技術用語および科学用語は、全て、遺伝子治療、生化学、遺伝学、および分子生物学の領域の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

適当な方法および材料が本明細書に記載されるが、本明細書に記載されたものに類似しているかまたは等価である全ての方法および材料が、本発明の実施または試行において使用され得る。本明細書において言及された刊行物、特許出願、特許、およびその他の参照は、全て、参照によってその全体が組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先されるであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、他に特記されない限り、例示的なものに過ぎず、限定するためのものではない。

本発明の実施は、他に示されない限り、当技術分野の技術の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を利用するであろう。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；Mullisら、米国特許第4,683,195号；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984);the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York)、特に、第154巻および第155巻(Wu et al.eds.)および第185巻、「Gene Expression Technology」(D.Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；ならびにManipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照されたい。

本発明は、図2に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つとの少なくとも80％の同一性を有するCD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）を提供し、該構造は、
（a）モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（b）FcRIIIαヒンジ、CD8αヒンジ、およびIgG1ヒンジより選択されるヒンジ、
（c）CD8α膜貫通ドメイン、ならびに
（d）CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含む。

好ましい態様において、本発明は、構造V3がCD8αヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、CD8αヒンジがSEQ ID NO：4との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、およびSEQ ID NO：30との少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

一態様において、本発明は、構造V1がFcγRIIIαヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、FcγRIIIαヒンジがSEQ ID NO：3との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、およびSEQ ID NO：22との少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

一態様において、本発明は、構造V5がIgG1ヒンジおよびCD8α膜貫通ドメインを含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、IgG1ヒンジがSEQ ID NO：5との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、およびSEQ ID NO：38との少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、VHがSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、およびSEQ ID NO：17より選択されるポリペプチド配列との少なくとも80％の同一性を有し、VLがSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、およびSEQ ID NO：18より選択されるポリペプチド配列との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、4-1BB由来の共刺激ドメインがSEQ ID NO：8との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、CD3ζシグナリングドメインがSEQ ID NO：9との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、CD8α膜貫通ドメインがSEQ ID NO：6との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、シグナルペプチドをさらに含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、シグナルペプチドがSEQ ID NO：1またはSEQ ID NO：2との少なくとも80％の同一性を有する、前記のCD33特異的CARを提供する。

一つの態様において、本発明は、SEQ ID NO：48〜71 SEQ ID NO：48との少なくとも80％の同一性、好ましくは、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70との少なくとも80％の同一性、より好ましくは、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70との少なくとも80％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

本発明は、CD33に特異的ではない別の細胞外リガンド結合ドメインをさらに含む、前記のCD33特異的CARを提供する。

一つの局面において、本発明は、前記の態様のいずれか一つによるCARをコードするポリヌクレオチドを提供する。

一つの局面において、本発明は、前記のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

一つの局面において、本発明は、前記のいずれか一つによるCD33特異的CARを細胞表面膜に発現する操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、またはヘルパーTリンパ球に由来する、前記の操作された免疫細胞を提供する。本発明は、TCRの発現が抑制されている、前記の操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、CD33の発現が抑制されている、前記の操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、少なくとも1種の免疫抑制薬または化学療法薬に対して耐性になるよう修飾されている、前記の操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、治療において使用するための、前記の操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、患者がヒトである、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、状態がCD33発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、状態がCD33発現細胞の過剰量を特徴とする状態である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、状態が血液癌状態である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、血液癌状態が白血病である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、白血病が、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、白血病が急性骨髄性白血病（AML）である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、血液癌が悪性リンパ増殖性障害である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、悪性リンパ増殖性障害がリンパ腫である、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

本発明は、リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、前記の治療において使用するための操作された免疫細胞を提供する。

一つの局面において、本発明は、癌細胞の傷害を引き起こすために有効な量の前記の操作された免疫細胞と血液癌細胞を接触させる工程を含む、血液癌細胞に傷害を与える方法を提供する。

一つの局面において、本発明は、
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）前記の少なくとも1種のCD33特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作する方法を提供する。

本発明は、
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）前記のCD33特異的キメラ抗原受容体をコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程、
（c）該細胞においてポリヌクレオチドを発現させ、任意で、CD33特異的キメラ抗原受容体を発現させる工程
を含む、前記の免疫細胞を操作する方法を提供する。

本発明は、
（d）TRC発現および／またはCD33発現を阻害する工程
をさらに含む、前記の免疫細胞を操作する方法を提供する。

一つの態様において、前記の方法の工程（a）のために準備される免疫細胞は、細胞表面におけるTRCおよび／またはCD33の発現が阻害されており、任意で、癌、具体的には、AMLを処置するために使用される少なくとも1種の薬物に対して耐性である免疫細胞である。

本発明は、
（a）CD33に特異的ではない少なくとも1種の他のキメラ抗原受容体を導入する工程
をさらに含む、前記の免疫細胞を操作する方法を提供する。

本発明は、
（a）前記のいずれか一つによるCD33特異的キメラ抗原受容体を表面に発現する免疫細胞を準備する工程、
（b）該免疫細胞を患者へ投与する工程
を含む、その必要のある対象を処置する方法も提供する。

一つの局面において、本発明は、免疫細胞がドナーから提供される、前記の方法を提供する。

本発明は、（本発明によって操作される）免疫細胞が患者自身から提供される、前記のその必要のある対象を処置する方法を提供する。

CD33特異的キメラ抗原受容体
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナリング伝達ドメインを含む、抗CD33キメラ抗原受容体（CARまたはCD33 CARまたはCD33特異的CARまたは抗CD33 CAR）の新しい設計に関する。

より正確には、本発明は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジ、CD8αヒンジ、およびIgG1ヒンジより選択されるヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、新しいCD33特異的CARに関する。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして働くリガンドを認識するよう選択され得る。好ましい態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接合された標的抗原特異的モノクローナル抗CD-33抗体の軽鎖（V_L）および重鎖（V_H）の可変断片を含む単鎖抗体断片（scFv）を含む。V_LおよびV_Hは、好ましくは、表2に示される、M195、m2H12、DRB2、およびMy9-6と呼ばれる抗体より選択される。

さらに好ましい対応において、V_LおよびV_Hは、任意で、ヒト化されていてもよい、SEQ ID NO：17および18を含む。

それらは、好ましくは、例えば、配列SEQ ID NO：10を含むフレキシブルリンカーによって共に連結されている。換言すると、CARは、優先的には、SEQ ID NO:11〜SEQ ID NO:18からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも90％、95％、97％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12のポリペプチドを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:14のポリペプチドを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:16のポリペプチドを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO:17およびSEQ ID NO:18のポリペプチドを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用されるように、例えば、バクテリオファージ、酵母発現系、または哺乳動物細胞発現系によって発現された抗体または抗体断片のような、組換えDNAテクノロジーを使用して生成された抗体または抗体断片を意味する。その用語は、抗体もしくは抗体断片をコードしかつ抗体もしくは抗体断片のタンパク質を発現するDNA分子の合成によって生成された抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片を特定するアミノ酸配列も意味するものと解釈されるべきであり、DNAまたはアミノ酸配列は、当技術分野において入手可能であり周知であるDNAまたはアミノ酸配列の組換えまたは合成のテクノロジーを使用して入手されたものである。

本明細書において使用されるように、「保存的配列修飾」または「ヒト化」という用語は、（最初の抗CD33を使用して構築されたCARのものと比較して）CARの特徴に有意に影響を与えず変更せず、かつ／または修飾されたアミノ酸配列を含有しているCARの活性に有意に影響を与えず、ヒト抗マウス抗体（HAMA）応答を低下させるかまたは消失させるアミノ酸修飾をさすものとする。そのような保存的修飾には、CAR内の抗体断片および／またはCAR分子の他の部分におけるアミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異誘発、PCRによって媒介される変異誘発のような当技術分野において公知の標準的な技術によって、または最適化された生殖系列配列を利用することによって、抗体、抗体断片、または本発明のCAR分子の他の部分のいずれかへ導入され得る。従って、本発明は、VHがSEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、またはSEQ ID NO：17との少なくとも80％の同一性を有し、VLがSEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、またはSEQ ID NO：18との少なくとも80％の同一性を有する（ヒト化）CD33 CARを提供する。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO：12のアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO：13およびSEQ ID NO：14のアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO：15およびSEQ ID NO：16のアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

一つの態様において、本発明のCARは、優先的には、SEQ ID NO：17およびSEQ ID NO：18のアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。

保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と交換されるものである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、本発明のCAR内の1個以上のアミノ酸残基を、同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と交換することができ、改変されたCARを、本明細書に記載された機能アッセイを使用して、CD33に結合する能力について試験することができる。

本発明によるCARのシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞の活性化および免疫応答をもたらす、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合の後の細胞内シグナリングを担う。換言すると、シグナル伝達ドメインは、CARが発現される免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1種の活性化を担う。例えば、T細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。従って、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、専門の機能を果たすよう細胞に指図するタンパク質の部分をさす。

CARにおいて使用するためのシグナル伝達ドメインの好ましい例は、抗原受容体会合後にシグナル伝達を開始するために協調的に作用するT細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびに同一の機能的能力を有するこれらの配列の誘導体またはバリアントおよび合成配列であり得る。シグナル伝達ドメインには、細胞質シグナリング配列の2種の別個のクラス（抗原依存性の一次活性化を開始するもの、および二次的または共刺激的なシグナルを提供するために抗原非依存的に作用するもの）が含まれる。一次細胞質シグナリング配列には、免疫受容活性化チロシンモチーフであるITAMとして公知であるシグナリングモチーフが含まれ得る。ITAMは、syk/zap70クラスチロシンキナーゼのための結合部位として役立つ、多様な受容体の細胞質内テールに見出される十分に定義されたシグナリングモチーフである。本発明において使用されるITAMの例には、非限定的な例として、TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものが含まれ得る。好ましい態様において、CARのシグナリング伝達ドメインには、SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％〜99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインが含まれ得る。

具体的な態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル分子を含む。共刺激分子とは、効率的な免疫応答のために必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むが、これらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83に特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例には、CD27、CD28、CD8、4-1BB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、およびCD83に特異的に結合するリガンド等が含まれる。

好ましい態様において、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、4-1BB（GenBank：AAA53133）およびCD28（NP_006130.1）の断片からなる群より選択される共刺激シグナル分子の一部を含む。具体的には、本発明のCARのシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。

本発明によるCARは、細胞の表面膜上に発現される。従って、そのようなCARは、膜貫通ドメインをさらに含む。適切な膜貫通ドメインの特徴的な特色には、細胞、本発明において好ましくは、免疫細胞、具体的には、リンパ球またはナチュラルキラー（NK）細胞の表面に発現され、予定された標的細胞に対する免疫細胞の細胞性応答を指図するために共に相互作用する能力が含まれる。膜貫通ドメインは、天然起源または合成起源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合型タンパク質または膜貫通型タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通型ポリペプチドは、α、β、γ、またはδのようなT細胞受容体のサブユニット、CD3複合体を構成するポリペプチド、IL2受容体p55（α鎖）、p75（β鎖）、またはγ鎖、Fc受容体、具体的には、Fcγ受容体IIIまたはCDタンパク質のサブユニット鎖であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であってもよく、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含んでいてもよい。好ましい態様において、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α鎖（例えば、NP_001139345.1）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域をさらに含んでいてもよい。本明細書において使用される「ヒンジ領域」という用語は通常、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するために機能するオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。具体的には、ヒンジ領域は、細胞外リガンド結合ドメインに、より多くの可動性および接近可能性を提供するために使用される。ヒンジ領域は、300個までのアミノ酸、好ましくは、10〜100個のアミノ酸、最も好ましくは、25〜50個のアミノ酸を含み得る。ヒンジ領域は、天然に存在する分子の全部もしくは一部、例えば、CD8、CD4、もしくはCD28の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に相当する合成配列であってもよいし、または完全合成ヒンジ配列であってもよい。好ましい態様において、ヒンジドメインは、本明細書において、それぞれ、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、およびSEQ ID NO：5と呼ばれる、ヒトCD8α鎖、FcγRIIIα受容体、もしくはIgG1の一部、またはこれらのポリペプチドとの好ましくは少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、もしくは100％の配列同一性を示すヒンジポリペプチドを含む。

本発明によるCARは概して、膜貫通ドメイン（TM）、より具体的には、SEQ ID NO：6または7のポリペプチドとの同一性を示すCD8αおよび4-1BBより選択される膜貫通ドメイン（TM）をさらに含む。

本発明によるCARは概して、SEQ ID NO：6のポリペプチドと90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を示すCD8α由来の膜貫通ドメイン（TM）を含む。好ましい態様において、本発明によるCARは概して、SEQ ID NO：6のポリペプチドと100％の同一性を示す、CD8α由来の膜貫通ドメイン（TM）をさらに含む。

標的抗原のダウンレギュレーションまたは変異は、癌細胞において一般的に観察され、抗原損失エスケープバリアントを作出する。従って、腫瘍エスケープを相殺し、免疫細胞を標的に対してより特異的にするため、本発明によるCD33特異的CARは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化するための、他の細胞外リガンド結合ドメインを含んでいてもよい。一つの態様において、細胞外リガンド結合ドメインは、同一の膜貫通ポリペプチド上にタンデムに置かれてもよく、任意で、リンカーによって隔てられていてもよい。別の態様において、異なる細胞外リガンド結合ドメインは、CARを構成する異なる膜貫通ポリペプチド上に置かれてもよい。別の態様において、本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団に関する。具体的には、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を該細胞の表面に発現させる工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。別の具体的な態様において、本発明は、免疫細胞を準備する工程、および各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を構成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを該細胞へ導入する工程を含む、免疫細胞を操作する方法に関する。CARの集団とは、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含む、少なくとも2種、3種、4種、5種、6種、またはそれ以上のCARを意味する。本発明による異なる細胞外リガンド結合ドメインは、好ましくは、標的内の異なる要素に同時に結合し、それによって、免疫細胞の活性化および機能を強化することができる。本発明は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む単離された免疫細胞にも関する。

本発明は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジ、CD8αヒンジ、およびIgG1ヒンジより選択されるヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示されるV1〜V6より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有するCD33特異的CARを提供する。

本発明は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジおよびCD8αヒンジより選択されるヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示されるV1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造のうちの一つを有するCD33特異的CARを提供する。

本発明は、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71からなる群より選択されるポリペプチド配列を含むCD33 CARを提供し、好ましくは、CARは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71より選択されるポリペプチド配列を含み、より好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71より選択されるポリペプチド配列を含み、さらに好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68のポリペプチドを含む。

本発明は、
SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含むCD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）、
より好ましくは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含むCAR、
さらに好ましくは、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含むCAR
も提供する。

好ましくは、本発明は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示される構造V1を有するCD33特異的CARを提供する。

好ましくは、本発明は、任意で、ヒト化されていてもよい、M195、m2h12、およびMy9.6より選択されるモノクローナル抗CD33抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示されるポリペプチド構造V1の一つを有するCD33特異的CARを提供する。

より好ましくは、本発明は、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、およびSEQ ID NO:66からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、図2に図示されるポリペプチド構造V1の一つを有するCD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）を提供し、より好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、およびSEQ ID NO:66からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列を含む。

好ましくは、本発明は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、CD8αヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示される構造V3を有するCD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）を提供する。

好ましくは、本発明は、任意で、ヒト化されていてもよい、M195、m2h12、DRB2、およびMy9.6より選択されるモノクローナル抗CD33抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示される構造V3を有するCD33特異的CARを提供する。

より好ましくは、本発明は、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62、およびSEQ ID NO:68からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、図2に図示される構造V3を有するCD33特異的CARを提供し、より好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、およびSEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列を含む。

好ましくは、本発明は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、IgG1ヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示される構造V5を有するCD33特異的CARを提供する。

好ましくは、本発明は、任意で、ヒト化されていてもよい、M195、m2h12、DRB2、およびMy9.6より選択されるモノクローナル抗CD33抗体に由来するVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、FcRIIIαヒンジ、CD8α膜貫通ドメイン、ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む、図2に図示される構造V5を有するCD33特異的CARを提供する。

より好ましくは、本発明は、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:64、およびSEQ ID NO:70からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、図2に図示される構造V5を有するCD33特異的CARを提供し、より好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、およびSEQ ID NO:70からなるアミノ酸配列を含むポリペプチド配列を含む。

一つの態様において、本発明は、
・ SEQ ID NO：1または2のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意でのシグナルペプチド（好ましくは、任意のシグナルペプチドは、SEQ ID NO：1のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドは存在する。）；
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）；
・ SEQ ID NO：3のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するFcγRIIIα由来のヒンジ；
・ SEQ ID NO：6のポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD8α由来の膜貫通ドメイン；
・ SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の共刺激シグナル分子；
・ SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むCD33特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一つの態様において、本発明は、
・ SEQ ID NO：1または2のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意でのシグナルペプチド（好ましくは、任意でのシグナルペプチドは、SEQ ID NO：1のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドは存在する。）；
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）；
・ SEQ ID NO：3のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するFcγRIIIα由来のヒンジ；
・ SEQ ID NO：7のポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の膜貫通ドメイン（TM）；
・ SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の共刺激シグナル分子；
・ SEQ ID NO：9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むCD33特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一つの態様において、本発明は、
・ SEQ ID NO：1または2のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意でのシグナルペプチド（好ましくは、任意でのシグナルペプチドは、SEQ ID NO：1のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドは存在する。）；
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）；
・ SEQ ID NO：4のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトCD8α鎖由来のヒンジ；
・ SEQ ID NO：6のポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD8α由来の膜貫通ドメイン；
・ SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の共刺激シグナル分子；
・ SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むCD33特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一つの態様において、本発明は、
・ SEQ ID NO：1または2のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意でのシグナルペプチド（好ましくは、任意でのシグナルペプチドは、SEQ ID NO：1のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドは存在する。）；
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）；
・ SEQ ID NO：4のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトCD8α鎖由来のヒンジ；
・ SEQ ID NO：7のポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の膜貫通ドメイン（TM）；
・ SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の共刺激シグナル分子；
・ SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むCD33特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一つの態様において、本発明は、
・ SEQ ID NO：1または2のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意でのシグナルペプチド（好ましくは、任意でのシグナルペプチドは、SEQ ID NO：1のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドは存在する。）；
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）；
・ SEQ ID NO：5のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するIgG1由来のヒンジ；
・ SEQ ID NO：6のポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有するCD8α由来の膜貫通ドメイン；
・ SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の共刺激シグナル分子；
・ SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むCD33特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一つの態様において、本発明は、
・ SEQ ID NO：1または2のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意でのシグナルペプチド（好ましくは、任意でのシグナルペプチドは、SEQ ID NO：1のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。好ましくは、シグナルペプチドは存在する。）；
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）；
・ SEQ ID NO：5のポリペプチドとの少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、または99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するIgG1由来のヒンジ；
・ SEQ ID NO：7のポリペプチドとの少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の膜貫通ドメイン（TM）；
・ SEQ ID NO:8からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する4-1BB由来の共刺激シグナル分子；
・ SEQ ID NO:9からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも70％、好ましくは、少なくとも80％、より好ましくは、少なくとも90％、95％、97％、99％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するCD3ζシグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメイン
を含むCD33特異的キメラ抗原受容体を提供する。

一つの態様において、本発明は、以下の配列または以下の配列の80％を有するCD33特異的CARのうちの少なくとも1種を提供する。

一つの態様において、本発明は、これらのCD33特異的CARのうちの少なくとも1種を付与された初代T細胞を提供する。

好ましい態様において、本発明は、SEQ ID NO:48〜71より選択される配列の少なくとも80％、より好ましくは、SEQ ID NO：68の少なくとも80％を有するCD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）を提供し、さらに好ましくは、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。

この態様において、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との81％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との82％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との83％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との84％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との85％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との86％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との87％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との88％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との89％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との90％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との91％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との92％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との93％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との94％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との95％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との96％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との97％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との98％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、CARは、優先的には、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との99％の同一性を示すポリペプチド配列を含み、一つの態様において、CARは、SEQ ID NO:68からなるアミノ酸配列との100％の同一性を有する。

本発明は、SEQ ID 48〜SEQ ID 71の配列のいずれか一つとの本明細書に記載される同一率（80％〜99％）を有するCARを包含する。

本発明は、
（a）任意で、ヒト化されていてもよい、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（b）CD8αヒンジ、
（c）CD8α膜貫通ドメイン、ならびに
（d）CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むCD33特異的CARを提供する。

本発明は、
（a）任意で、ヒト化されていてもよい、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（b）FcγRIIIαヒンジ、
（c）CD8α膜貫通ドメイン、ならびに
（d）CD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含むCD33特異的CARを提供する。

ポリヌクレオチド、ベクター：
本発明は、本発明による前記のCARのいずれか一つをコードするポリヌクレオチド、ベクターにも関する。

本発明は、本発明による抗CD33 CARをコードするポリヌクレオチド、本発明による抗CD33 CARをコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも1種を含むベクター、好ましくは、レンチウイルスベクターにも関する。

ポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）の中に存在し得る。

具体的な態様において、2Aペプチドをコードする配列のようなリボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含む一つのポリヌクレオチドまたはベクターに、異なる核酸配列を含めることができる。ピコルナウイルスのアフトウイルス亜群において同定された2Aペプチドは、コドンによってコードされた2つのアミノ酸の間にペプチド結合が形成されない、あるコドンから次のコドンへのリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Donnelly and Elliott 2001；Atkins,Wills et al.2007；Doronina,Wu et al.2008）を参照されたい）。「コドン」とは、リボソームによって1つのアミノ酸残基へ翻訳されるmRNA（またはDNA分子のセンス鎖）上の3ヌクレオチドを意味する。従って、ポリペプチドが、インフレームにある2Aオリゴペプチド配列によって隔てられている時、mRNA内の単一の連続するオープンリーディングフレームから、2つのポリペプチドが合成され得る。そのようなリボソームスキップ機序は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーRNAによってコードされた数種のタンパク質の発現のため、数種のベクターによって使用されることが公知である。

膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路へ差し向けるためには、（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても公知の）分泌シグナル配列が、ポリヌクレオチド配列またはベクター配列の中に提供される。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に機能的に連結される。即ち、2種の配列は、正確なリーディングフレームにおいて結合され、新たに合成されたポリペプチドが宿主細胞の分泌経路へ差し向けられるよう位置付けられる。分泌シグナル配列は概して、関心対象のポリペプチドをコードする核酸配列の5'に位置するが、ある種の分泌シグナル配列は、関心対象の核酸配列の他の場所に位置し得る（例えば、Welchら、米国特許第5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照されたい）。好ましい態様において、シグナルペプチドは、アミノ酸配列SEQ ID NO:1および2を含む。

当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのポリヌクレオチド分子において相当の配列変動が可能であることを認識するであろう。好ましくは、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のため、コドン最適化される。コドン最適化とは、関心対象の配列において、所定の種の高発現遺伝子において通常は稀であるコドンを、そのような種の高発現遺伝子において概して高頻度であるコドンへ交換することをさす。そのようなコドンは、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードする。

CARが付与されるよう免疫細胞を操作する方法：
本発明は、以前に記載されたように、CD33 CARの一つをコードするポリヌクレオチドまたはベクターを免疫細胞へエクスビボで導入する工程を含む、免疫療法のための免疫細胞を調製する方法を包含する。

好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、免疫細胞において安定的に発現されることを考慮して、レンチウイルスベクターに含まれている。

さらなる態様によると、方法は、同種移植のためにより適当なものにするため、細胞を遺伝子修飾する工程をさらに含む。

第1の局面によると、免疫細胞は、例えば、HLAまたはβ2mのタンパク質発現をコードするかまたは制御する遺伝子の不活性化と組み合わせられてもよい、WO 2013/176915に記載されたようなT細胞受容体（TCR）の1個以上の成分を発現する少なくとも1種の遺伝子を不活性化することによって、比較的非同種にされ得る。従って、移植片対宿主症候群および移植片拒絶のリスクは有意に低下する。

別の局面によると、本発明のCD33特異的CAR免疫細胞において、CD33の1個以上の成分の発現を可能にする少なくとも1種の遺伝子が不活性化される。抗CD33 CARを発現する細胞におけるCD33表面発現の阻害は、本発明の抗CD33 CAR発現免疫細胞を調製する方法の一部である。

一般的な方法は、WO 2013/176915に記載されている。CD33遺伝子の不活性化は、抗CD33 CAR発現免疫細胞におけるCD33の細胞表面発現が阻害され、従って、抗CD33 CARを発現する近隣細胞の生存を変更させるかまたはその活性を阻害することがないよう、シアリル酸結合Ig様レクチンのようなCD33発現をコードするかまたは制御する遺伝子の活性化／または不活性化と組み合わせられ得る(Cao H,Crocker PR.CD33関連シグレックの進化：宿主免疫機能の制御および病原体活用の回避？（Evolution of CD33-related siglecs:regulating host immune functions and escaping pathogen exploitation?）Immunology.2011 Jan;132(1):18-26)。

別の局面によると、免疫細胞は、CD33陽性悪性細胞を処置するための標準治療として使用される免疫抑制薬または化学療法処置に対する耐性を改善するため、さらに遺伝子操作され得る。
例えば、キャンパス（アレムツズマブ）およびグルココルチコイドによる処置の薬物標的であるCD52およびグルココルチコイド受容体（GR）を、これらの処置に対して細胞を耐性にし、特異的なCD33 CARを付与されていない患者自身のT細胞と比べて競争有利性を与えるため、不活性化することができる。別の免疫抑制薬であるテプリズマブに対する耐性を付与するため、CD3遺伝子の発現を抑制するかまたは低下させることもできる。化学療法において、具体的には、急性リンパ芽球性白血病の処置のため、一般的に使用される細胞分裂阻害剤である6-チオグアニンに対する耐性を付与するため、HPRTの発現を本発明に従って抑制するかまたは低下させることもできる。「GLl1」遺伝子の発現は低下し得る。

本発明のさらなる局面によると、PDCD1またはCTLA-4のようなT細胞活性化の制御因子として働く「免疫チェックポイント」として働くタンパク質をコードする遺伝子を不活性化することによって、より高活性にするためまたは消耗を制限するため、免疫細胞をさらに操作することができる。発現を低下させるかまたは抑制することができる遺伝子の例は、表9に示される。

（表９）免疫チェックポイントタンパク質をコードする遺伝子のリスト

好ましい態様において、免疫細胞をさらに操作する方法は、DNA切断によって、前述のような、遺伝子を選択的に不活性化する特異的なレアカットエンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、具体的にはmRNAを、T細胞へ導入する工程を含む。より好ましい態様において、レアカットエンドヌクレアーゼは、TALEヌクレアーゼまたはCas9エンドヌクレアーゼである。TALヌクレアーゼは、他の型のレアカットエンドヌクレアーゼより高い特異性および切断効率を有することが従来立証されているため、一定のターンオーバーで大規模に操作された免疫細胞を作製するための選り抜きのエンドヌクレアーゼである。

送達方法
上記の様々な方法は、CARを細胞へ導入する工程を含む。非限定的な例として、CARは、1種のプラスミドベクターによってコードされたトランスジーンとして導入され得る。プラスミドベクターは、ベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含有し得る。

ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への導入の結果として、細胞においてインサイチューで合成され得る。あるいは、ポリペプチドは、細胞外で作製され、次いで、細胞へ導入されてもよい。ポリヌクレオチド構築物を細胞へ導入する方法は、当技術分野において公知であり、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれる安定的形質転換法、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムへ組み込まれない一過性形質転換法、およびウイルスによって媒介される方法を非限定的な例として含む。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等によって細胞へ導入され得る。例えば、一過性形質転換法には、例えば、微量注入、電気穿孔、または微粒子銃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞における発現を考慮して、ベクター、より具体的には、プラスミドまたはウイルスに含まれ得る。

操作した免疫細胞
本発明は、細胞を操作する方法によって入手可能な単離された細胞または細胞株にも関する。具体的には、単離された細胞は、少なくとも1種の上記のCARを含む。別の態様において、単離された細胞は、各々異なる細胞外リガンド結合ドメインを含むCARの集団を含む。具体的には、単離された細胞は、CARをコードする外因性のポリヌクレオチド配列を含む。本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖する。

既に記載された方法のいずれか一つによって入手された単離された免疫細胞、好ましくは、T細胞も、本発明の範囲に包含される。免疫細胞とは、自然免疫応答および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞をさす。本発明による免疫細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より具体的には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト細胞はCD34+細胞である。単離された細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、NK細胞、B細胞、または炎症性Tリンパ球、細胞傷害性Tリンパ球、制御性Tリンパ球、もしくはヘルパーTリンパ球からなる群より選択されるT細胞であってもよい。別の態様において、細胞は、CD4+Tリンパ球およびCD8+Tリンパ球からなる群に由来し得る。本発明の細胞の増大および遺伝子改変の前に、細胞の起源は、多様な非限定的な方法を通して対象から入手され得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位に由来する組織、腹水、胸水、脾組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な起源から入手され得る。本発明のある種の態様において、当業者に入手可能であり公知である多数のT細胞株が使用され得る。別の態様において、細胞は、健常ドナー、癌を有すると診断された患者、または感染を有すると診断された患者に由来し得る。別の態様において、細胞は、異なる表現型的特徴を提示する細胞の混合集団の一部である。既に記載された方法によって形質転換されたT細胞から入手された細胞株も、本発明の範囲に包含される。免疫抑制処置に対して抵抗性であり、以前の方法によって入手可能である改変された細胞は、本発明の範囲に包含される。

好ましい態様として、本発明は、患者への同種移植のための、機能性のTCRを発現せず、CD33陽性細胞に対して反応性である、前記のCD33 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団を提供する。

より好ましい態様として、本発明は、患者への同種移植のための、機能性のTCRおよびCD33を発現せず、CD33陽性細胞に対して反応性である、前記のCD33 CARを賦与されたT細胞またはT細胞の集団を含む、本発明による操作された免疫細胞を提供する。

さらに好ましい態様として、本発明は、CD33 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団を含む、本発明による操作された免疫細胞を提供し、該CD33 CARは、V1、V3、およびV5より選択されるポリペプチド構造を含み、該ポリペプチド構造は、モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン；FcRIIIαヒンジ、CD8αヒンジ、およびIgG1ヒンジより選択されるヒンジ；CD8α膜貫通ドメイン；ならびにCD3ζシグナリングドメインおよび4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメインを含む。

一つの態様において、本発明による操作された免疫細胞は、M195、m2h12、DRB2、およびMy9.6、またはM195、m2h12、およびMy9.6より選択され、任意で、ヒト化されていてもよい、モノクローナル抗CD33抗体を含む特異的なCD33 CARを含む。

より好ましい態様において、CD33 CARは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるポリペプチドを含むか、またはSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるポリペプチドを含む。

さらに好ましい態様において、CD33 CARを付与されたT細胞は、機能的なTCRおよびCD33を発現せず、CD33 CARは、SEQ ID NO:68のポリペプチドを含み、任意で、ヒト化されていてもよい。

一つのさらに好ましい態様において、CD33 CARを付与されたT細胞またはT細胞の集団、具体的には、機能的なTCRおよびCD33を発現しない抗CD33 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するか、またはSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるアミノ酸配列のいずれか一つとの少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するか、またはSEQ ID NO:68との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

このさらに好ましい態様において、CD33 CARを付与されたT細胞は、機能的なTCRおよびCD33を発現せず、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるアミノ酸配列との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列、またはSEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:68からなる群より選択されるアミノ酸配列のいずれかとの少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列、またはSEQ ID NO:68との少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。

好ましくは、抗CD33 CAR発現T細胞は、TCRαKOおよびCD33 KO T細胞であり、AMLの処置のために使用される少なくとも1種の薬物に対して耐性である。

本発明による抗CD33 CAR発現T細胞は、抗CD33 CARを付与された単離された免疫T細胞、好ましくは、抗CD33 CARを付与されたTCRαKOかつ／またはCD33 KO免疫T細胞、より好ましくは、AMLの処置のために使用される少なくとも1種の薬物に対して耐性である、抗CD33 CARを付与されたTCRαKOかつ／またはCD33 KO免疫T細胞を表す。好ましくは、本発明による抗CD33 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO：48〜SEQ ID NO：71より選択される配列のうちの少なくとも一つを有する抗CD33 CAR、より好ましくは、SEQ ID NO：48〜SEQ ID NO：71との少なくとも80％の同一性、さらに好ましくは、SEQ ID NO：68との少なくとも80％の同一性を有する抗CD33 CARを含む。本発明による操作された免疫細胞（または抗CD33 CAR発現T細胞）とは、前記の本発明による操作された免疫細胞のいずれか一つを意味する。

T細胞の活性化および増大
本発明の遺伝子改変免疫細胞は、活性化されており、抗原結合機序と無関係に増殖するが、本発明の免疫細胞、具体的には、T細胞は、T細胞の遺伝子改変の前であっても後であっても、例えば、米国特許第6,352,694号；第6,534,055号；第6,905,680号；第6,692,964号；第5,858,358号；第6,887,466号；第6,905,681号；第7,144,575号；第7,067,318号；第7,172,869号；第7,232,566号；第7,175,843号；第5,883,223号；第6,905,874号；第6,797,514号；第6,867,041号；および米国特許出願公開第20060121005号に記載されるような方法を一般に使用して、さらに活性化させ増大させることができる。T細胞は、インビトロまたはインビボで増大させることができる。

概して本発明のT細胞は、T細胞の表面上のCD3 TCR複合体および共刺激分子を刺激してT細胞のための活性化シグナルを作出する薬剤との接触によって増大する。例えば、カルシウムイオノフォアA23187、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、またはフィトヘマグルチニン（PHA）のような分裂促進性レクチンのような化学物質が、T細胞のための活性化シグナルを作出するために使用され得る。

非限定的な例として、T細胞集団は、例えば、表面に固定化された抗CD3抗体もしくはその抗原結合断片もしくは抗CD2抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼC活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、インビトロで刺激され得る。T細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のため、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞の集団は、T細胞の増殖を刺激するために適切な条件の下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。T細胞培養のために適切な条件には、血清（例えば、ウシ胎仔血清もしくはヒト胎児血清）、インターロイキン2（IL-2）、インスリン、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp、およびTNF-、または当業者に公知の細胞の増殖のためのその他の添加剤を含む、増殖および生存可能性のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはRPMI培地1640またはX-vivo 5（Lonza））が含まれる。細胞の増殖のためのその他の添加剤には、界面活性剤、プラスマネート（plasmanate）、ならびにN-アセチル-システインおよび2-メルカプトエタノールのような還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンが添加されており、無血清であるか、または適切な量の血清（もしくは血漿）もしくはホルモンの定義されたセットおよび／もしくはT細胞の増殖および増大のために十分な量のサイトカインが補足されている、RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1、およびX-Vivo 20、Optimizerが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養にのみ含まれ、対象へ注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖を支持するのに必要な条件、例えば、適切な温度（例えば、37℃）および雰囲気（例えば、空気＋5％C02）で維持される。様々な刺激時間に曝されたT細胞は、異なる特徴を示し得る。

別の具体的な態様において、細胞は、組織または細胞との共培養によって増大させることができる。細胞は、細胞を対象へ投与した後、インビボで、例えば、対象の血液中で増大させてもよい。

治療的適用
別の態様において、既に記載されたような異なる方法によって入手された単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、医薬として使用され得る。別の態様において、医薬は、その必要のある患者において、癌を処置するため、具体的には、B細胞リンパ腫および白血病の処置のため、使用され得る。別の態様において、本発明による単離された細胞または単離された細胞に由来する細胞株は、その必要のある患者における癌の処置のための医薬の製造において使用され得る。

別の局面において、本発明は、
（a）既に記載された方法のいずれか一つによって入手可能な免疫細胞を準備する工程、
（b）形質転換された免疫細胞を患者へ投与する工程
のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に依る。

一つの態様において、本発明のT細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受けることができ、より長時間にわたり、存続することができる。

好ましい局面において、本発明は、
（a）抗CD33発現CAR免疫細胞（または本発明の操作された免疫細胞のいずれか）を調製するため、本発明の方法のいずれか一つによって入手可能な免疫細胞を準備する工程、
（b）抗CD33発現CAR免疫細胞を患者へ投与する工程
のうちの少なくとも一つを含む、その必要のある患者を処置する方法に依り、任意で、本発明のCD33 CAR T細胞は、頑強なインビボT細胞増大を受け、より長期にわたり、存続することができ、具体的には、より長期にわたり、CD33に結合することができる。

処置は、寛解、治癒、または予防であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法処置の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者を処置するために使用される細胞、細胞株、または細胞の集団が、患者またはヒト白血球抗原（HLA）適合ドナーに起因することを意味する。同種とは、患者を処置するために使用される細胞または細胞の集団が、患者ではなくドナーに起因することを意味する。

一つの態様において、本発明による抗CD33 CAR発現T細胞は、医薬として使用するために提供される。

具体的な態様において、医薬として使用するために提供される本発明による抗CD33 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38より選択されるポリペプチド、より好ましくは、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38のポリペプチドより選択されるポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む。

さらに好ましくは、医薬として使用するために提供される本発明による抗CD33 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるポリペプチドを含むか、またはSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70からなる群より選択されるポリペプチドを含み；これらのCARはヒト化されていてもよい。

一つの態様において、医薬として使用するために提供される本発明による抗CD33 CAR発現T細胞は、任意で、ヒト化されていてもよい、SEQ ID NO:68のポリペプチド、またはSEQ ID NO:68のポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む。

換言すると、本発明は、医薬として使用するための、任意で、ヒト化されていてもよい、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドのいずれか一つとの少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む、本発明による抗CD33 CAR発現T細胞に関する。

医薬としてまたは開示された方法と共に使用され得る操作された免疫細胞は、以前のセクションに記載されている。好ましくは、操作された免疫細胞には、CD33発現が変更されており、TCR発現が変更されており、任意で、血液癌を処置するために使用される少なくとも1種の薬物に対して耐性である初代T細胞が含まれ得る。

通常医薬は、CD33発現細胞によって媒介される病理学的状態またはCD33発現細胞の直接的もしくは間接的な活性を特徴とする状態、即ち、CD33発現細胞の有害な活性に関連した状態を処置するために使用され得る。

医薬は、CD33発現T細胞、具体的には、CD33発現T細胞の過剰量を特徴とする前悪性または悪性の癌状態を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。そのような状態は、白血病またはB細胞リンパ増殖性障害のような悪性リンパ増殖性障害のような血液癌において見出される。

本発明による抗CD33 CAR発現T細胞によって処置され得る、CD33発現細胞によって媒介される病理学的状態またはCD33発現細胞の直接的もしくは間接的な活性を特徴とする状態の別の例は、アルツハイマー病である。

リンパ増殖性障害は、リンパ腫、具体的には、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）であり得る。

本発明の抗CD33 CAR発現T細胞によって、CD33によって媒介されるかまたはCD33が関与する疾患のいずれか一つ、具体的には、悪性リンパ増殖性障害または白血病が、処置され得、該病理学的状態に罹患している患者の健康状態が、改善され得る。

好ましい態様において、本発明の抗CD33 CAR発現T細胞を使用して処置され得る癌は、白血病、白血病に関連した疾患、またはその合併症、具体的には、AML、AML亜型、AML関連合併症、およびAML関連状態である。

本発明の抗CD33 CAR発現T細胞を使用して防止または処置され得る白血病は、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群であり得る。

本発明の抗CD33 CAR発現T細胞を使用して処置され得るAMLまたはAML亜型は、具体的には、CD33陽性細胞が関与している、急性骨髄芽球性白血病、最小分化型（minimally differentiated）急性骨髄芽球性白血病、成熟を伴わない急性骨髄芽球性白血病、顆粒球成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、前骨髄球性または急性前骨髄球性白血病（APL）、急性骨髄単球性白血病、骨髄好酸球増加を伴う骨髄単球性白血病、急性単芽球性白血病（M5a）または急性単球性白血病（M5b）、赤白血病（M6a）および極めて稀な純赤血球性（pure erythroid）白血病（M6b）を含む急性赤血球性白血病、急性巨核芽球性白血病（M7）、急性好塩基球性白血病、骨髄繊維症を伴う急性汎骨髄症であり得る。

本発明の抗CD33 CAR発現細胞を使用して処置され得るAMLの亜型には、t(8;21)(q22;q22)（AML1/ETO）を有するAML、inv(16)(p13;q22)またはt(16;16)(p13;q22)（CBFβ/MYH11）を有するAML、t(15;17)(q22;q12)（PML/RARα）およびバリアントを有するAML、t(9; 11)(p22;q23)（MLLT3/MLL）を有するAML、t(6;9)(p23;q34)（DEK/NUP214）を有するAML、inv(3)(q21q26)またはt(3;3)(q21;q26)（RPN1/EVI1）を有するAML、t(1;22)(p13;q13)（RBM15/MKL1）を有するAML（巨核球性）、以前のMDSまたはMDS/MPNに起因するAMLを含む、骨髄異形成関連変化を伴うAML、MDS関連細胞遺伝学的異常を有するAML、および多系統異形成を伴うAML、アルキル化剤／放射線に関連したAML、（AML-MOとしても公知の）最小分化型AML、（AML-M1としても公知の）成熟を伴わないAML、（AML-M2としても公知の）成熟を伴うAML、（AML-M4としても公知の）急性骨髄単球性白血病、（AML-M5としても公知の）急性単芽球性／単球性白血病、（AML-M6としても公知の）急性赤血球性白血病、ならびに純赤血球性白血病も含まれる。

従って、特異的な遺伝子異常を伴うAMLとして分類されるAMLは、本発明の抗CD33 CAR発現細胞を使用して処置され得る状態である。分類は、導入治療に対する応答、再発リスク、生存を予測する核型の能力に基づく。

従って、本発明の抗CD33 CAR発現T細胞を使用して処置され得るAMLは、8番染色体と21番染色体との間の転座を伴うAML、16番染色体における転座または反転を伴うAML、9番染色体と11番染色体との間の転座を伴うAML、15番染色体と17番染色体との間の転座を伴うAPL（M3）、6番染色体と9番染色体との間の転座を伴うAML、3番染色体における転座または反転を伴うAML、1番染色体と22番染色体との間の転座を伴うAML（巨核芽球性）であり得る。

本発明は、これらの特定の細胞遺伝学的マーカーに関連したAMLの処置のために特に有用である。

本発明は、オールトランス型レチノイン酸（ATRA）を使用して同定されたt(15;17)(q22;q21)を有する患者のようなAMLの特定の細胞遺伝学的サブセットを有する患者の処置のため、および高用量シタラビンの反復投与を使用して同定されたt(8;21)(q22;q22)またはinv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22)を有する患者の処置のための、抗CD33CAR発現T細胞も提供する。

好ましくは、本発明は、低い完全寛解率および生存率を有することが示されている-5/del(5q),-7、3qの異常、または複合核型のような異常を有する患者の処置のための抗CD33 CAR発現T細胞を提供する。

患者の群
好ましい態様において、本発明は、60歳を超える患者、20歳未満の患者、特に小児の患者における、白血病、特にAMLに対する医薬を提供する。

より好ましい態様において、本発明は、小児処置、特に、AMLまたはAMLに関連する疾患もしくは合併症に対する小児処置を提供する。

さらに別の好ましい態様において、本発明は、低いか、不良であるか、または不利な状況を有する、即ち、5年生存率未満の予測生存を有するAML患者において、処置として使用される。この群において、以下の細胞遺伝学的特徴：-5；5q；-7；7q-；11q23；non t(9;11)；inv(3)；t(3;3)；t(6;9)；t(9;22)を有するAMLに罹患している患者は、不良リスク状態に関連しており（Byrd J.C.et al.,December 15,2002;Blood:100(13)）、本発明に従ってまたは本発明の目的によって処置されることが特に企図される。

一つの態様において、本発明の抗CD33 CAR発現T細胞は、AML再発の症例または難治性もしくは耐性のAMLの症例において処置として使用される。好ましくは、SEQ ID NO：1、およびSEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、またはそれらの組み合わせとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドより選択されるポリペプチドを含むかまたはそれからなる本発明の少なくとも1種のヒト化抗CD33 CARを含むT細胞が、より好ましくは、少なくとも1種の他の抗癌薬と組み合わせられて、AML再発または難治性もしくは耐性のAMLを有する患者において使用される。

別の好ましい態様において、本発明の少なくとも1種の抗CD33 CAR T細胞は、具体的には、抗癌処置の後、骨髄枯渇の間、または骨髄移植の前、骨髄破壊の後に起こる癌細胞発達を防止するために使用される。

AML合併症
一つの具体的な態様において、本発明は、患者、具体的には、AMLに関連した合併症を起こしている患者の健康状態を改善する医薬を提供する。より好ましくは、本発明の操作された抗CD33 CAR発現T細胞は、SEQ ID NO：1、およびSEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、またはそれらの組み合わせとの少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む少なくとも1種の抗CD33 CARを発現しており、AMLに関連した合併症の処置のための医薬として使用される。

一つの具体的な態様において、本発明は、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む、本発明の抗CD33 CAR発現T細胞を含む、AMLに罹患している患者、具体的には、AMLに関連した合併症を起こしている患者の健康状態を改善する医薬を提供する。

AMLに関連した合併症または疾患には、先行する骨髄異形成期、二次性白血病、具体的には、二次性AML、高白血球数、およびアウエル小体の欠如が含まれ得る。とりわけ、白血球停滞および中枢神経系（CNS）の関与、白血球増加症、残存疾患も、AMLに関連した合併症または疾患と見なされる。

AML関連疾患
一つの態様において、本発明は、AMLに関連した病理学的状態の処置のための抗CD33 CAR発現T細胞も提供する。好ましくは、本発明は、AMLに関連した病理学的状態の処置のための、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドとの少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む、少なくとも1種の抗CD33 CARを発現する細胞を提供する。

本発明は、AML関連骨髄新生物、急性骨髄白血病、および骨髄異形成症候群のための医薬、再発したまたは難治性の急性骨髄白血病の処置、成人における再発したまたは難治性の急性前骨髄球性白血病の処置、急性前骨髄（promyeloid）白血病の処置、60歳を超える成人における急性骨髄白血病の処置を提供する。

別の局面によると、本発明は、AML関連疾患、具体的には、AMLに関係する血液悪性疾患の処置のための組成物を提供する。

AML状態に関係する血液悪性疾患には、無効な骨髄系血液細胞の産生（または異形成）、およびAMLへの形質転換のリスクと合併した血液状態の多様なコレクションである骨髄異形成症候群（MDS、以前は「前白血病」として公知であった）が含まれる。

別の態様において、本発明は、多発性骨髄腫に罹患している患者の健康状態を改善する本発明による医薬を提供する。

AMLのリスクに関連した他の病理学的状態または遺伝的症候群も、本発明の適切な使用によって改善され得、それらの遺伝的症候群には、ダウン症、トリソミー、ファンコニー貧血、ブルーム症候群、毛細血管拡張性運動失調、ダイヤモンド・ブラックファン貧血、シュワックマン・ダイヤモンド症候群、リー・フラウメニ症候群、1型神経繊維腫症、重度先天性好中球減少症（コストマン症候群とも呼ばれる）が含まれる。

一つの態様において、本発明は、アルツハイマー病の処置のための抗CD33 CAR発現T細胞を提供する。本発明は、以前のセクションに記載された開示された方法と共に使用され得る細胞を提供し、好ましくは、細胞は、抗CD33 CAR発現T細胞、より好ましくは、TCRおよびCD33 KO抗CD33 CAR発現T細胞である。処置は、CD33発現細胞、具体的には、CD33発現細胞の過剰量を特徴とする前悪性または悪性の癌状態を有すると診断された患者を処置するために使用され得る。そのような状態は、白血病または悪性リンパ増殖性障害のような血液癌において見出される。

白血病は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群であり得る。

処置され得る癌には、プレB ALL（小児適応症）、成人ALL、マントル細胞リンパ腫、びまん性大B細胞型リンパ腫等を含むが、これらに限定されない、血液腫瘍のような非固形腫瘍が含まれ得る。本発明のCARによって処置される癌の型には、白血病またはリンパ系悪性疾患が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／癌および小児の腫瘍／癌も含まれる。

本発明による操作された免疫細胞による処置は、抗体治療、化学療法、サイトカイン治療、樹状細胞治療、遺伝子治療、ホルモン治療、レーザー光線治療、および放射線治療の群より選択される、癌に対する1種以上の治療と組み合わせられてもよい。

本発明の好ましい態様によると、処置は、免疫抑制処置を受けている患者へ投与され得る。実際、本発明は、好ましくは、そのような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子の不活性化によって、少なくとも1種の免疫抑制剤に対して耐性にされた細胞または細胞の集団に頼る。この局面において、免疫抑制処置は、患者における本発明によるT細胞の選択および増大を補助するはずである。

組成物
本発明は、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物を提供する。

一つの態様において、組成物は、医薬として使用するために提供される。

別の態様において、組成物は、CD33発現細胞、具体的には、CD33発現細胞の過剰量を特徴とする状態の処置のための医薬として使用するために提供される。そのような状態は、白血病またはB細胞リンパ増殖性障害のような悪性リンパ増殖性障害のような血液癌において見出される。

一つの局面によると、本発明は、CD33+細胞によって媒介される疾患の処置のための、本発明による抗CD33発現細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物を提供する。これらのCD33+細胞によって媒介される疾患には、前悪性または悪性の癌状態、炎症、自己免疫疾患、アルツハイマー病が含まれる。

一つの局面において、本発明による組成物を使用して処置され得るCD33発現血液癌細胞は、（急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群のような）白血病、ならびに（多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型および大細胞型の濾胞性リンパ腫のような）リンパ腫を含む悪性リンパ増殖性状態、またはそれらの合併症におけるCD33発現癌細胞を含むが、これらに限定されないCD33発現血液癌幹細胞であり得る。

本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物は、患者におけるCD33発現血液癌細胞の量を低下させ、増殖および／または活性を阻害する方法において使用するために提供される。例示的な方法は、CD33発現細胞を含む細胞の集団を、CD33発現細胞に結合する本発明のCD33 CART細胞と接触させる工程を含む。

より具体的な局面において、本発明は、本発明のCD33 CART細胞のCD33発現癌細胞との結合がCD33発現癌細胞の破壊をもたらすよう、CD33発現癌細胞集団を、CD33発現細胞に結合する本発明のCD33 CART細胞と接触させる工程を含む、患者におけるCD33を発現する癌細胞の増殖を阻害するかもしくはその集団を低下させるために使用するための方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物を提供する。

ある種の局面において、本発明のCD33 CART細胞を含む組成物は、骨髄白血病またはCD33発現細胞に関連した別の癌を有する対象またはその動物モデルにおいて、細胞および／または癌細胞の含量、数、量、または率を、陰性対照と比べて、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも65％、少なくとも75％、少なくとも85％、少なくとも95％、または少なくとも99％（検出不可能なレベルにまで）低下させる。

本発明は、CD33発現細胞に結合する本発明のCD33 CART細胞を含む組成物、具体的には、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物を、その必要のある対象へ投与する工程を含む、（例えば、血液癌、AMLに関連した）CD33発現細胞に関連した障害もしくは状態を防止し、処置し、かつ／もしくは管理する方法も提供する。一つの局面において、対象はヒトである。CD33発現細胞に関連した障害の非限定的な例には、（アレルギー、炎症性腸疾患BD、アルツハイマー病のような）炎症性障害、ならびに（血液癌、具体的には、AMLまたはAML合併症のような）癌が含まれる。

本発明は、本発明の抗CD33 CARを発現するT細胞と、薬学的に許容される媒体とを含み、好ましくは、SEQ ID NO：1、およびSEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、またはそれらの組み合わせより選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む抗CD33 CARと、薬学的に許容される担体または媒体とを含む、疾患を処置するために使用するための組成物、または疾患を処置する方法も提供する。一つの局面において、疾患は、本明細書に記載される疾患、具体的には、血液癌、より具体的には、（急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群のような）白血病、ならびに（多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型および大細胞型の濾胞性リンパ腫のような）リンパ腫を含む悪性リンパ増殖性状態、またはそれらの合併症を含むが、これらに限定されない、幹細胞癌である。

本発明は、患者におけるCD33発現細胞の増殖を阻害するかまたはその集団もしくは活性を低下させる方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物も提供する。例示的な方法には、CD33発現細胞を含む細胞の集団を、CD33発現細胞に結合する本発明のCD33 CART細胞と接触させる工程を含み、好ましくは、抗CD33 CARは、SEQ ID NO：1、ならびにSEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、およびそれらの組み合わせより選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む。

本発明は、本発明の組成物をその必要のある対象へ投与する工程を含む、（例えば、血液癌に関連した）CD33発現細胞に関連した障害もしくは状態を防止し、処置し、かつ／もしくは管理する方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物も提供し、抗CD33 CARは、CD33発現細胞に結合する、SEQ ID NO：1、ならびにSEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、およびそれらの組み合わせより選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む。一つの局面において、対象はヒトである。CD33発現細胞に関連した障害の非限定的な例には、（ループスのような）自己免疫障害、（アレルギー、IBD、および喘息のような）炎症性障害、ならびに（血液癌、具体的には、AMLまたはAML合併症のような）癌が含まれる。

本発明は、疾患を処置するために使用するための、本発明による抗CD33 CARを発現するT細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物、またはその使用を含む、疾患を処置する方法も提供し、好ましくは、抗CD33 CARは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む。一つの局面において、疾患は、本明細書に記載される疾患、具体的には、血液癌、より具体的には、（急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群のような）白血病、ならびに（多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞型および大細胞型の濾胞性リンパ腫のような）リンパ腫を含む悪性リンパ増殖性状態、またはそれらの合併症を含むが、これらに限定されない、幹細胞癌である。

本発明は、患者におけるCD33発現細胞の増殖を阻害するかまたはその集団もしくは活性を低下させる方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物も提供する。例示的な方法には、CD33発現癌細胞を含む細胞の集団を、CD33発現細胞に結合する本発明のCD33 CAR T細胞と接触させる工程を含み、好ましくは、抗CD33 CARは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択される配列との少なくとも80％の同一性を有するポリペプチドを含む。

本発明は、本発明の組成物をその必要のある対象へ投与する工程を含む、（例えば、血液癌に関連した）CD33発現細胞に関連した障害もしくは状態を防止し、処置し、かつ／もしくは管理する方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物も提供し、抗CD33 CARは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む。

一つの局面において、対象はヒトである。CD33発現細胞に関連した障害の非限定的な例には、（ループスのような）自己免疫障害、（アレルギー、IBD、および喘息のような）炎症性障害、ならびに（血液癌、具体的には、AMLまたはAML合併症のような）癌が含まれる。

本発明は、CD33発現細胞に結合する本発明の組成物をその必要のある対象へ投与する工程を含む、CD33発現細胞に関連した疾患を防止し、処置し、かつ／もしくは管理する方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物も提供する。この態様において、抗CD33 CARは、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む。一つの局面において、対象はヒトである。CD33発現細胞に関連した疾患の非限定的な例には、急性骨髄白血病（AML）、骨髄異形成、B細胞急性リンパ性白血病、T細胞急性リンパ性白血病、毛様細胞性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、慢性骨髄白血病、ホジキンリンパ腫が含まれる。

本発明は、本発明による組成物をその必要のある対象へ投与する工程を含む、CD33発現細胞に関連した癌の再発を処置するかまたは防止する方法において使用するための、本発明による抗CD33発現T細胞と薬学的に許容される媒体とを含む組成物を提供し、抗CD33 CARは、CD33発現細胞に結合するSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、およびSEQ ID NO:70より選択されるポリペプチドとの少なくとも80％〜100％の同一性を有するポリペプチドを含む。別の局面において、本発明は、有効量の別の治療と組み合わせて、本発明による組成物を、有効量、その必要のある対象へ投与する工程を含む。

一つの局面において、本発明は、CD19の発現レベルの上昇に関連した疾患または障害のための処置を受けたことがあって、CD33のレベルの上昇に関連した疾患または障害を示す対象を処置するための組成物および方法を提供する。

本発明による細胞または細胞の集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口、輸液、植え込み、または移植を含む、便利な様式で実施され得る。本明細書に記載された組成物は、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内に、筋肉内に、静脈注射もしくはリンパ内注射によって、または腹腔内に、患者へ投与され得る。一つの態様において、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈注射によって投与される。

細胞または細胞の集団の投与は、これらの範囲内の細胞数の全ての整数値を含む、体重1kg当たり10⁴〜10⁹個の細胞、好ましくは、体重1kg当たり10⁵〜10⁶個の細胞の投与からなり得る。細胞または細胞の集団は、単回投与されてもよいしまたは複数回投与されてもよい。別の態様において、有効量の細胞が、単回投与される。別の態様において、有効量の細胞が、ある期間にわたり複数回投与される。投与のタイミングは、管理する医師の判断にあり、患者の臨床状態に依る。細胞または細胞の集団は、血液バンクまたはドナーのような任意の起源から入手され得る。個々の必要性は変動するが、特定の疾患または状態のための所定の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当技術分野の技術の範囲内にある。有効量とは、治療的または予防的な利益を提供する量を意味する。投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば、同時処置の種類、処置の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存するであろう。

別の態様において、有効量の細胞またはそれらの細胞を含む組成物は、非経口投与される。投与は、静脈内投与であり得る。投与は、腫瘍内への注射によって直接行われてもよい。

本発明のある種の態様において、細胞は、抗ウイルス治療、シドホビル、およびインターロイキン2、シタラビン（ARA-Cとしても公知）のような薬剤による処置、またはMS患者のためのナタリズマブ処置、または乾癬患者のためのエファリズマブ処置、またはPML患者のためのその他の処置を含むが、これらに限定されない、多数の関連する処置モダリティと共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。さらなる態様において、本発明のT細胞は、化学療法、放射線、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびFK506のような免疫抑制剤、抗体、またはCAMPATH、抗CD3抗体、もしくはその他の抗体治療のようなその他の免疫除去（immunoablative）剤、シトキシン（cytoxin）、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、FR901228、サイトカイン、ならびに照射と組み合わせて使用されてもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリンおよびFK506）、または増殖因子によって誘導されるシグナリングにとって重要なp70S6キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson,Naya et al.1991；Liu,Albers et al.1992；Bierer,Hollander et al.1993）。さらなる態様において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビン、外部照射治療（XRT）、シクロホスファミドのような化学療法剤、またはOKT3もしくはCAMPATHのような抗体のいずれかを使用したT細胞除去治療と共に（例えば、前に、同時に、または後に）患者へ投与される。別の態様において、本発明の細胞組成物は、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなB細胞除去治療の後に投与される。例えば、一つの態様において、対象は、高用量化学療法による標準的な処置を受けた後、末梢血幹細胞移植を受けることができる。ある種の態様において、移植の後、対象は、増大させた本発明の免疫細胞の注入を受ける。付加的な態様において、増大させた細胞は、手術の前または後に投与される。

他の定義
他に特記されない限り、「a」、「an」、「the」、および「少なくとも1」は、交換可能に使用され、1または複数を意味する。ポリペプチド配列内のアミノ酸残基は、1文字コードによって本明細書において表記され、例えば、QはGln、すなわちグルタミン残基を意味し、RはArg、すなわちアルギニン残基を意味し、DはAsp、すなわちアスパラギン酸残基を意味する。

アミノ酸置換とは、あるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への交換を意味し、例えば、ペプチド配列内のアルギニン残基のグルタミン残基への交換は、アミノ酸置換である。

ヌクレオチドは以下のように表記される：1文字コードがヌクレオシドの塩基を表記するために使用される：aはアデニンであり、tはチミンであり、cはシトシンであり、gはグアニンである。縮重ヌクレオチドのため、rはgまたはa（プリンヌクレオチド）を表し、kはgまたはtを表し、sはgまたはcを表し、wはaまたはtを表し、mはaまたはcを表し、yはtまたはc（ピリミジンヌクレオチド）を表し、dはg、a、またはtを表し、vはg、a、またはcを表し、bはg、t、またはcを表し、hはa、t、またはcを表し、nはg、a、t、またはcを表す。

本明細書において使用されるように、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）のようなヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生成された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生成された断片をさす。核酸分子は、（DNAおよびRNAのような）天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチドの鏡像異性体）、または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾型ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に変化を有し得る。糖修飾には、例えば、1つ以上のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基への交換が含まれ、または糖がエーテルもしくはエステルとして官能化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、アザ糖および炭素環式糖類似体のような立体的かつ電子的に類似した構造に交換されてもよい。塩基部分の修飾の例には、アルキル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンもしくはピリミジン、またはその他の周知の複素環式置換基が含まれる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体によって連結され得る。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。

キメラ抗原受容体（CAR）とは、特異的な抗標的細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するため、標的細胞上に存在する成分に対する結合ドメイン、例えば、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体に基づく特異性を、T細胞受容体を活性化する細胞内ドメインと組み合わせた分子を表す。CARは通常、細胞外単鎖抗体（scFvFc）がT細胞抗原受容体複合体ζ鎖の細胞内シグナリングドメインに融合したもの（scFvFc:ζ）からなり、T細胞において発現された時に、モノクローナル抗体の特異性に基づき、抗原認識を向け直す能力を有している。本発明において使用されるCARの一例は、CD33抗原に対するCARであり、非限定的な例として、アミノ酸配列：SEQ ID NO:19〜42および好ましくはSEQ ID NO:48〜71を含み得る。

V1構造とは、以下のものを組み合わせた分子を表す：
・ CD8αシグナルペプチド
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）
・ FcγRIIIα由来のヒンジ
・ CD8α由来の膜貫通ドメイン
・ 41BBおよびCD3ζに由来する細胞質ドメイン。

V2構造とは、膜貫通ドメインが41BBに由来する、V1構造を有する分子を表す。

V3構造とは、以下のものを組み合わせた分子を表す：
・ CD8αシグナルペプチド
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）
・ CD8α由来のヒンジ
・ CD8α由来の膜貫通ドメイン
・ 41BBおよびCD3ζに由来する細胞質ドメイン。

V4構造とは、膜貫通ドメインが41BBに由来する、V3構造を有する分子を表す。

V5構造とは、以下のものを組み合わせた分子を表す：
・ CD8αシグナルペプチド
・リンカーによってVLドメインから分離されたVHドメイン（VHおよびVLはCD33との結合に寄与する。）
・ IgG1（α）由来のヒンジ
・ CD8α由来の膜貫通ドメイン
・ 41BBおよびCD3ζに由来する細胞質ドメイン。

V6構造とは、膜貫通ドメインが41BBに由来する、V5構造を有する分子を表す。

本発明のCAR構造は、図2、好ましくは、図3に図示される。

「化学療法」という用語は、化学物質を使用した治療、具体的には、癌に対して使用されるものをさす。

「エンドヌクレアーゼ」という用語は、DNA分子またはRNA分子、好ましくは、DNA分子の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することができる野生型酵素またはバリアント酵素をさす。エンドヌクレアーゼは、その配列に関係なくDNA分子またはRNA分子を切断するのではなく、「標的配列」または「標的部位」とさらに呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列においてDNA分子またはRNA分子を認識し切断する。エンドヌクレアーゼは、典型的には、12塩基対（bp）より長い、より好ましくは、14〜55bpのポリヌクレオチド認識部位を有する時、レアカットエンドヌクレアーゼとして分類され得る。レアカットエンドヌクレアーゼは、定義された場所においてDNA二本鎖切断（DSB）を誘導することによって、HRを有意に増加させる（Perrin,Buckle et al.1993；Rouet,Smih et al.1994；Choulika,Perrin et al.1995；Pingoud and Silva 2007）。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Paques and Duchateau 2007）、操作したジンクフィンガードメインとFoklのような制限酵素の触媒ドメインとの融合に起因するキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）（Porteus and Carroll 2005）、 CRISPR系に由来するCas9エンドヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）、または化学的エンドヌクレアーゼ（Eisenschmidt,Lanio et al.2005；Arimondo,Thomas et al.2006）であり得る。化学的エンドヌクレアーゼにおいては、化学的なまたはペプチド性の切断剤が、核酸のポリマーまたは特定の標的配列を認識する他のDNAのいずれかにコンジュゲートされ、それによって、切断活性を特定の配列へターゲティングする。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のDNA配列に結合することが公知の、オルトフェナントロリン、DNA切断分子、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド（TFO）のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される（Kalish and Glazer 2005）。そのような化学的エンドヌクレアーゼは、本発明による「エンドヌクレアーゼ」という用語に含まれる。

「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）とは、典型的には、転写活性化因子様（Transcription Activator Like）エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメイン、および核酸標的配列を切断する1つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を表す。触媒ドメインは、好ましくは、ヌクレアーゼドメインであり、より好ましくは、例えば、I-Tevl、ColE7、NucA、Fok-Iのようなエンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。具体的な態様において、TALEドメインは、例えば、I-CrelおよびI-Onulまたはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合され得る。より好ましい態様において、ヌクレアーゼは単量体TALEヌクレアーゼである。単量体TALEヌクレアーゼとは、WO2012138927に記載された、操作されたTALリピートとI-Tevlの触媒ドメインとの融合のような、特異的な認識および切断のために二量化を必要としないTALEヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、複数の反復配列を含む、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、各リピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に対して特異的な2残基（RVD）を12位および13位に含む。類似したモジュラー塩基対塩基核酸結合（modular base-per-base nucleic acid binding）特性を有する結合ドメイン（MBBBD）も、異なる細菌種において出願人によって最近発見された新しいモジュラータンパク質に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TALリピートより多くの配列可変性を示すという利点を有する。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連したRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、Tを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。別の態様において、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対する特異性をモジュレートするため、具体的には、この特異性を増強するため、他のアミノ酸残基に変異させてもよい。TALEヌクレアーゼは、既に記載され、遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変を刺激するために使用されている（Boch,Scholze et al.2009；Moscou and Bogdanove 2009；Christian,Cermak et al.2010；Li,Huang et al.2011）。操作されたTALヌクレアーゼは、商標TALEN（商標）の下で市販されている（Cellectis,8 rue de la Croix Jarry,75013 Paris,France）。

本発明によるレアカットエンドヌクレアーゼは、Cas9エンドヌクレアーゼでもあり得る。最近、II型原核生物CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short palindromic Repeats）適応免疫系（概説については（Sorek,Lawrence et al.2013）を参照されたい）から、RNAガイド（RNA-guided）Cas9ヌクレアーゼ（Gasiunas,Barrangou et al.2012；Jinek,Chylinski et al.2012；Cong,Ran et al.2013；Mali,Yang et al.2013）に基づき、新しいゲノム操作ツールが開発された。CRISPR関連（Cas）系は、細菌において最初に発見され、外来DNA、ウイルスまたはプラスミドに対する防御として機能する。CRISPRによって媒介されるゲノム操作は、まず、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短い配列モチーフがしばしば隣接している標的配列の選択によって進行する。標的配列選択の後、この標的配列に相補的な特異的なcrRNAが操作される。CRISPR II型系において必要とされるトランス活性化crRNA（tracrRNA）は、crRNAと対合し、供給されたCas9タンパク質へ結合する。Cas9は、tracRNAのcRNAとの塩基対合を容易にする分子アンカーとして作用する（Deltcheva,Chylinski et al.2011）。この三元複合体において、二重tracrRNA:crRNA構造は、同族標的配列にエンドヌクレアーゼCas9を差し向けるガイドRNAとして作用する。Cas9-tracrRNA:crRNA複合体による標的認識は、標的配列とcrRNAとの間の相同性について標的配列を走査することによって開始される。標的配列-crRNA相補性に加えて、DNAターゲティングは、プロトスペーサーに隣接した短いモチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ−PAM）の存在を必要とする。その後、二重RNAと標的配列との間の対合に続き、Cas9が、PAMモチーフの3塩基上流に平滑末端二本鎖切断を導入する（Garneau,Dupuis et al.2010）。

レアカットエンドヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼの名称でも公知のホーミングエンドヌクレアーゼであってもよい。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当技術分野において周知である（Stoddard 2005）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、DNA標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖の切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、12〜45塩基対（bp）長、通常14〜40bp長の範囲のDNA標的部位を認識する。本発明によるホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、LAGLIDADGエンドヌクレアーゼ、HNHエンドヌクレアーゼ、またはGIY-YIGエンドヌクレアーゼに相当し得る。本発明による好ましいホーミングエンドヌクレアーゼは、I-Crelバリアントであり得る。

「送達ベクター」とは、本発明において必要とされる薬剤／化学物質および分子（タンパク質または核酸）を、細胞と接触させるため（即ち、「接触」）、または細胞もしくは細胞内区画へ送達するため（即ち、「導入」）、本発明において使用され得る送達ベクターを表す。それには、リポソーム送達ベクター、ウイルス送達ベクター、薬物送達ベクター、化学的担体、ポリマー担体、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小気泡（超音波造影剤）、ナノ粒子、乳濁液、またはその他の適切な移入ベクターが含まれるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子（遺伝子、タンパク質）、またはプラスミド、Diatosによって開発されたペプチドのようなその他のベクターの送達を可能にする。これらのケースにおいて、送達ベクターは分子担体である。「送達ベクター」とは、トランスフェクションを実施するための送達方法も表す。

「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子をさす。本発明における「ベクター」には、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNA分子もしくはRNA分子が含まれるが、これらに限定されない。好ましいベクターは、それらが連結された核酸の自律複製が可能なもの（エピソームベクター）および／または発現が可能なもの（発現ベクター）である。多数の適当なベクターが、当業者に公知であり、市販されている。

ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）のようなマイナス鎖RNAウイルス、ピコルナウイルスおよびアルファウイルスのようなプラス鎖RNAウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）を含む二本鎖DNAウイルスが含まれる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが含まれる。レトロウイルスの例には、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプーマウイルスが含まれる（Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields,et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996）。

「レンチウイルスベクター」とは、比較的大きいパッケージング能力、低下した免疫原性、および広範囲の異なる細胞型を高い効率で安定的に形質導入する能力のため、遺伝子送達のために極めて有望である、HIVに基づくレンチウイルスベクターを意味する。レンチウイルスベクターは通常、3種（パッケージング、エンベロープ、および移入）またはそれ以上のプラスミドを産生細胞に一過性トランスフェクションした後、生成される。HIVと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面糖タンパク質の細胞表面上の受容体との相互作用を通して標的細胞に侵入する。侵入後、ウイルスRNAが、ウイルス逆転写酵素複合体によって媒介される逆転写を受ける。逆転写の産物は、感染細胞のDNAへのウイルス組み込みのための基質となる二本鎖の直鎖状ウイルスDNAである。「組込みレンチウイルスベクター（またはLV）」とは、非限定的な例として、標的細胞のゲノムに組み込まれ得るそのようなベクターを意味する。反対に、「非組込みレンチウイルスベクター（またはNILV）」とは、ウイルスインテグラーゼの作用を通して標的細胞のゲノムに組み込まれない効率的な遺伝子送達ベクターを意味する。

送達ベクターおよびベクターは、ソノポレーション（sonoporation）もしくは電気穿孔のような細胞透過処理技術、またはこれらの技術の変法と関連しているかまたは組み合わせられていてよい。

細胞とは、真核生物の生存細胞、初代細胞、およびインビトロ培養のためのこれらの生物に由来する細胞株を表す。

「初代細胞」とは、集団倍化をほとんど受けておらず、従って、腫瘍形成性の連続細胞株または人為的に不死化された細胞株と比較して、それが由来した組織の主な機能的成分および特徴をよりよく表している、生存組織（即ち、生検材料）から直接採取され、インビトロでの増殖のために確立された細胞を表す。

非限定的な例として、細胞株は、CHO-K1細胞；HEK293細胞；Caco2細胞；U2-OS 細胞；NIH 3T3細胞；NSO細胞；SP2細胞；CHO-S細胞；DG44細胞；K-562細胞、U-937細胞；MRC5細胞；IMR90細胞；ジャーカット細胞；HepG2細胞；HeLa細胞；HT-1080細胞；HCT-116細胞；Hu-h7細胞；Huvec細胞；Molt 4細胞からなる群より選択される。

これらの細胞株は、全て、関心対象の遺伝子またはタンパク質を作製し、発現させ、定量化し、検出し、研究するための細胞株モデルを提供するため、本発明の方法によって改変され得；これらのモデルは、研究および作製、ならびに非限定的な例としての化学物質、生物燃料、治療薬、および農学のような様々な領域において、関心対象の生理活性分子をスクリーニングするためにも使用され得る。

「変異」とは、ポリヌクレオチド（cDNA、遺伝子）またはポリペプチドの配列における1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、25個、30個、40個、50個、またはそれ以上までのヌクレオチド／アミノ酸の置換、欠失、挿入を表す。変異は、遺伝子のコード配列またはその制御配列に影響を与える場合がある。また、ゲノム配列の構造またはコードされたmRNAの構造／安定性に影響を与える場合もある。

「バリアント」とは、親分子のアミノ酸配列における少なくとも1個の残基の変異または交換によって入手されたリピートバリアント、バリアント、DNA結合バリアント、TALEヌクレアーゼバリアント、ポリペプチドバリアントを表す。

「機能的バリアント」とは、タンパク質またはタンパク質ドメインの触媒活性変異体を表し；そのような変異体は、その親のタンパク質またはタンパク質ドメインと比較して、同一の活性、または付加的な特性、またはより高いかもしくはより低い活性を有し得る。

「同一性」とは、2種の核酸分子またはポリペプチドの間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的のために整列化され得る各配列の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列のある位置が同一の塩基によって占有される時、それらの分子はその位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列の間の類似性または同一性の程度は、核酸配列が共有している位置における同一のまたは一致するヌクレオチドの数の関数である。GCG配列分析パッケージ（University of Wisconsin,Madison,Wis.）の一部として入手可能であるFASTAまたはBLASTを含む、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、2種の配列の間の同一性を計算するために使用され得、例えば、デフォルト設定で使用され得る。例えば、本明細書に記載された特定のポリペプチドとの少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有しており、好ましくは、実質的に同一の機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、企図される。
他に示されない限り、類似性スコアは、BLOSUM62の使用に基づくであろう。BLASTPが使用される時、パーセント類似性は、BLASTP陽性スコアに基づき、パーセント配列同一性は、BLASTP同一性スコアに基づく。BLASTP「同一性」は、同一である高スコア配列対における全残基の数および画分を示し；BLASTP「陽性」は、アライメントスコアが正の値を有しており、相互に類似している残基の数および画分を示す。本明細書に開示されたアミノ酸配列との同一性もしくは類似性のこれらの程度または同一性もしくは類似性の中間の程度を有するアミノ酸配列が、本開示によって企図され包含される。類似したポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号を使用して推定され、特に、遺伝暗号を使用して、そのアミノ酸配列を逆翻訳することによって、従来の手段によって入手され得る。

「シグナル伝達ドメイン」または「共刺激リガンド」とは、T細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ペプチドが負荷されたMHC分子とのTCR/CD3複合体の結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖活性化、分化等を含むがこれらに限定されないT細胞応答を媒介するシグナルを提供する抗原提示細胞上の分子をさす。共刺激リガンドには、CD7、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導性共刺激リガンド（ICOS-L）、細胞間接着分子（ICAM、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、トールリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、およびB7-H3に特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドには、とりわけ、以下に限定されないが、CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1（LFA-1）、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、CD83と特異的に結合するリガンドのような、T細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。

「共刺激分子」とは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これに限定されないが、増殖のような、細胞による共刺激応答を媒介するT細胞上の同族結合パートナーをさす。共刺激分子には、MHCクラスI分子、BTLA、およびトールリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。

「共刺激シグナル」とは、本明細書において使用されるように、TCR/CD3ライゲーションのような一次シグナルと組み合わせて、T細胞増殖および／または重要分子のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションをもたらすシグナルをさす。

「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、本明細書において使用されるように、リガンドと結合することができるオリゴペプチドまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の疾患状態に関連した標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するよう選択され得る。従って、リガンドとして作用し得る細胞表面マーカーの例には、ウイルス、細菌、および寄生虫の感染、自己免疫疾患、ならびに癌細胞に関連したものが含まれる。

「対象」または「患者」という用語には、本明細書において使用されるように、非ヒト霊長類およびヒトを含む動物界の全てのメンバーが含まれる。

「癌、特にAMLを処置するために使用する薬物」という用語は、癌、特にAMLの処置のための医薬を指し、例えば文書PCT/EP2015/055848に記載される。

上記の本発明の説明は、当業者が本発明を作成し使用することが可能になるよう、本発明を作成し使用する様式および過程を提供するものであり、この可能性は、当初明細書の一部を構成する添付の特許請求の範囲の主題のために特に提供される。

本明細書において数的な限度または範囲が記述される場合、その終点が含まれる。数的な限度または範囲に含まれる全ての値および部分範囲も、明示的に記載されたかのごとく、具体的に含まれる。

上記の説明は、当業者が本発明を作成し使用することを可能にするために提示され、特定の適用およびその必要条件に関して提供される。好ましい態様に対する様々な改変は、当業者に容易に明白になり、本明細書において定義された一般原理は、本発明の本旨および範囲から逸脱することなく、他の態様および適用に適用され得る。従って、本発明は、示された態様に限定されず、本明細書に開示された原理および特色と一致する最も広い範囲を与えられるものとする。

概略法：
初代T細胞における特定の遺伝子の不活性化
初代T細胞における特定の遺伝子の不活性化を、T細胞へのCAR導入の前または後に実施することができる。

少なくとも1種の遺伝子、1種の遺伝子または2種の遺伝子を、一工程でまたは連続的な工程で不活性化することができる。好ましい態様において、2種の遺伝子、好ましくは、TCRα遺伝子およびCD33遺伝子を、一度に不活性化することができる。

通常、標的遺伝子内のスペーサーによって分離された2個の長い配列（半標的と呼ばれる）を標的とする二量体ヌクレアーゼ、具体的には、TALEヌクレアーゼが設計され作製される。

各TALEヌクレアーゼ構築物を適切な哺乳動物発現ベクターへクローニングすることができる。標的ゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、プロモーターの下流にコード配列を保持するプラスミドから合成することができる。

細胞を精製し、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって、T細胞を予め活性化する。細胞を両方の半TALEヌクレアーゼ、具体的には、両方の半TALEヌクレアーゼおよびスペーサーをコードする2種のmRNAの各々によってトランスフェクトする。

細胞増殖を測定するため、細胞を可溶性抗CD28によって再活性化し、細胞の活性化状態を査定するため、活性化マーカーCD25を検出することができる。

キメラ抗原受容体
核酸−ベクター
本発明の抗CD33 CARをコードする核酸（mRNAまたはレンチウイルスベクター）を、図2または図3において設計された構成によって構築する。

抗CD33 CARレンチウイルスベクターは、例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO2013176915、WO2013176916、またはWO2014130635に以前に記載されたようにして調製され得る。レンチウイルスベクターは、Vectalys SA（Toulouse,France）によって作製される。

T7 mRNAポリメラーゼを使用してCAR mRNAを作製することができ、Cytopulseテクノロジーを使用してトランスフェクションを行うことができる。

抗CD33 CARのスクリーニングおよび選択
初代T細胞培養物
フィコール勾配密度媒体を使用して、EFS（Etablissement Francais du Sang,Paris,France）によって提供されたバフィーコート試料から、T細胞を精製する。PBMC層を回収し、市販されているT細胞濃縮キットを使用してT細胞を精製する。精製されたT細胞を、ヒトIL-2およびDynabeads Human T activator CD3/CD28を使用してX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において活性化する。

CAR mRNAトランスフェクション
T細胞の精製および活性化の後、4日目または11日目に、異なるCAR構築物をコードするCAR mRNAのトランスフェクションを行った。

CARの発現を可能にする組換えレンチウイルスベクターによるT細胞形質導入、組換えレンチウイルスベクターによるT細胞形質導入を、T細胞精製／活性化の3日後に実施する。レンチウイルスベクターは、ゲノムプラスミドおよびヘルパープラスミドをHEK-293細胞へトランスフェクトすることによって、Vectalys SA（Toulouse,France）によって作製される。形質導入は、様々な感染多重度（MOI）、具体的には、5のMOIで実施され得る。T細胞の表面のCAR検出を、（LakePharmaによって作製された）マウスIgG1 Fc断片に融合されたヒトCD33タンパク質の細胞外ドメインからなる組換えタンパク質を使用して行う。

このタンパク質のCAR分子との結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とするPE結合型二次抗体（Jackson Immunoresearch）によって検出する。

脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
様々なレベルのCD33タンパク質を発現する等量の細胞と共に、T細胞をインキュベートする。共培養を、少なくとも6時間、維持する。共培養の開始時に、蛍光性抗CD107a抗体を添加することによって、細胞刺激中にCD107a染色を行う。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生死細胞判定色素および蛍光色素結合型抗CD8によって染色し、フローサイトメトリーによって分析する。CD8+/CD107a+細胞の％として、そしてCD8+細胞におけるCD107a染色についての平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって、脱顆粒活性を決定する。

脱顆粒アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に実施される。

IFNγ放出アッセイ
mRNAトランスフェクションの24時間後、様々なレベルのCD33タンパク質を発現する細胞株と共に、37℃で24時間、抗CD33 CAR発現T細胞をインキュベートする。上清を回収し、細胞培養上清中のIFNγ検出をELISAアッセイによって行う。

細胞傷害アッセイ
同一のウェルにおいて、（様々なレベルのCD33を発現する）標的細胞または（CD33陰性）細胞と共に、抗CD33 CAR発現T細胞をインキュベートする。標的CD33+細胞および対照CD33-標的細胞を蛍光性の細胞内色素（例えば、CFSEまたはCell Trace Violet）によって標識した後、37℃で4時間共培養する。このインキュベーション期間の後、細胞を固定可能な生死細胞判定色素によって標識し、フローサイトメトリーによって分析する。各細胞集団（標的細胞またはCD33陰性対照細胞）の生存率を決定し、特異的細胞溶解の％を計算する。細胞傷害アッセイは、mRNAトランスフェクションの48時間後に実施される。

抗腫瘍マウスモデル
免疫不全NOGマウスに、CD33発現ルシフェラーゼ細胞を静脈内（iv）注射する。任意で、マウスは、抗CD33 CAR+T細胞を注射する前に、抗癌処置を受容する。次いで、異なる用量の試験される抗CD33 CAR+T細胞、またはCARレンチウイルスベクターによって形質導入されていないT細胞を、（腫瘍細胞株の注射の2日後または7日後のいずれかに）マウスにiv注射する。異なる動物における腫瘍進行を追跡するため、T細胞注射の当日（D0）、T細胞注射後7日目、14日目、21日目、28日目、および40日目に生物発光シグナルを決定する。

本発明を概略的に説明したが、例示のために本明細書に提供されるに過ぎず、他に特記しない限り、限定するためのものではない、いくつかの具体的な例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。

様々な抗CD33抗体断片を使用したCD33 CARの構築
CARの異なる構成、即ち、V1〜V6を設計した（図3）。第一工程として、T細胞においてキメラ抗原受容体（CAR）（SEQ ID NO：48〜SEQ ID NO：71）を生成するため、M195、DRB2、m2H12、およびMy9.6に由来する4種の異なるscFvを構築した。

実施例1：TCRα不活性化CD33-CAR発現細胞の増殖
初代T細胞培養物
フィコール勾配密度媒体を使用して、EFS（Etablissement Francais du Sang,Paris,France）によって提供された様々なバフィーコート試料から、T細胞を精製した。PBMC層を回収し、T細胞を市販されているT細胞濃縮キット（Stem Cell Technologies）を使用して精製した。精製されたT細胞を、20ng/mLヒトIL-2、5％ヒト血清、およびビーズ:細胞比1:1のDynabeads Human T activator CD3/CD28（Life Technologies）が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において活性化した。活性化の後、20ng/mLヒトIL-2および5％ヒト血清が補足されたX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において細胞を増殖させ維持した。

CAR mRNAトランスフェクション
T細胞の精製および活性化の後、4日目または11日目に、様々な抗CD33抗体断片を使用して生成された各CD33 CARのトランスフェクションを行った。異なるCAR構築物をコードする15μgのmRNAによって500万個の細胞をトランスフェクトした。mMESSAGE mMACHINE T7キット（Life Technologies）を使用してCAR mRNAを作製し、RNeasy Mini Spin Columns（Qiagen）を使用して精製した。最終体積200μlの「Cytoporation buffer T」（BTX Harvard Apparatus）において、0.4cmギャップキュベットにおいて、3000V/cmで0.1mSパルスを2回適用した後、325V/cmで0.2mSパルスを4回適用することによって、Cytopulseテクノロジーを使用してトランスフェクションを行った。細胞をX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）で直ちに希釈し、5％CO₂と共に37℃でインキュベートした。電気穿孔の2時間後に、20ng/mLのIL-2を添加した。

初代T細胞形質導入
T細胞形質導入
抗CD33 CARの発現のための組換えレンチウイルスベクターによるT細胞の形質導入を、T細胞の精製／活性化の3日後に実施した。Vectalys SA（Toulouse,France）によって作製されたレンチウイルスベクターを使用した。T細胞の表面の抗CD33 CAR検出を、（LakePharmaによって作製された）マウスIgG1 Fc断片に融合されたヒトCD33タンパク質の細胞外ドメインからなる組換えタンパク質を使用して行った。このタンパク質の抗CD33 CAR分子との結合を、タンパク質のマウスFc部分を標的とするPE結合型二次抗体（Jackson Immunoresearch）によって検出し、フローサイトメトリーによって分析した。

T細胞受容体α定常鎖領域（TRAC）遺伝子内の15bpスペーサーによって分離された2個の17bp長配列（半標的と呼ばれる）を標的とする異種二量体TALEヌクレアーゼを設計し作製した。各半標的は、表10にリストされた半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。

（表１０）TCRα遺伝子を標的とするTALヌクレアーゼ

各TALEヌクレアーゼ構築物を、T7プロモーターの調節下で、制限酵素消化を使用して哺乳動物発現ベクターへサブクローニングした。TRACゲノム配列を切断するTALEヌクレアーゼをコードするmRNAを、T7プロモーターの下流にコード配列を保持しているプラスミドから合成した。

抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって72時間予め活性化された精製されたT細胞を、両方の半TRAC_T01 TALEヌクレアーゼをコードする2種のmRNAの各々によってトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、同一のドナーに由来するT細胞の異なる群を、以前に記載されたCD33 CAR（SEQ ID NO:19〜42）のうちの1種をコードするレンチウイルスベクターによってそれぞれ形質導入した。形質導入の2日後、CD3陰性細胞を抗CD3磁気ビーズを使用して精製し、形質導入の5日後、細胞を可溶性抗CD28（5μg/ml）によって再活性化した。

週に2回、細胞を計数することによって、再活性化の30日後まで細胞増殖を追跡した。特に、抗CD28によって再活性化された時、非形質導入細胞と比較して、TCRα不活性化CD33 CAR発現細胞の増殖の増加が観察された。

CD33-CAR発現ヒトT細胞が活性化状態を示すか否かを調査するため、活性化マーカーCD25の発現を、形質導入の7日後に、FACSによって分析する。CD33 CARをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入された精製された細胞を、非形質導入細胞と比較して、活性化を査定するため、表面におけるCD25発現についてアッセイする。CD28再活性化条件または非再活性化条件の両方において、CD25発現の増加が予想される。

本発明は、細胞表面のTCRのレベルが低く検出されるCD33特異的CAR T細胞を提供した。

実施例2：
CD33遺伝子の不活性化
CD33遺伝子を不活性化するため、CD33遺伝子内の10bpまたは15bpのスペーサーによって分離された（TALEN左が結合する配列およびTALEN右が結合する配列と呼ばれる、表11参照）2種の配列を標的とするヘテロ二量体TALEヌクレアーゼを、下記のように設計し作製した。各半標的は、表11にリストされた半TALEヌクレアーゼのリピートによって認識される。次いで、TCRα遺伝子を不活性化するために設計されたものと共に、同時に、構築物をT細胞へ導入した。

（表１１）TCRα遺伝子を標的とするTALヌクレアーゼ

得られた細胞においては、CD33の細胞外ドメインが短縮されている。得られた細胞の二重染色およびサイトメトリーによる分析は、対照（モックによってトランスフェクトされた）細胞と比較した、CD33およびTCRの細胞表面発現の減少を示した。

あるいは、抗CD3/CD28によってコーティングされたビーズによって72時間予め活性化された精製されたTCR KO T細胞を、CD33不活性化のために使用してもよい。

CD33 CARを発現するヒトTCR KOおよびCD33 KO T細胞の活性化状態を調査するため、形質導入の7日後に、活性化マーカーCD25の発現をFACSによって分析する。

CARが構成V1、V3、およびV5に相当する、抗CD33 CAR T細胞、ならびにTCRα遺伝子および／またはCD33遺伝子が不活性化された抗CD33 CAR T細胞を作製することができる。

細胞は、便宜のため、「T細胞」または「CD33 CAR」と表記される。

実施例3
様々な抗CD33抗体断片を使用して生成されたCD33 CARの脱顆粒活性
前記のM195、m2H12、およびMy9.6の構築物V1、V3、およびV5の活性を、まず、ヒト初代T細胞における一過性発現によって決定した。

脱顆粒アッセイ（CD107a動員）
次いで、様々なレベルのCD33タンパク質を発現する等量の細胞と共に、96穴プレートにおいてT細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO₂で37℃で6時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。共培養の開始時に、1μg/mlの抗CD49d、1μg/mlの抗CD28、および1×モネンシン溶液と共に蛍光性抗CD107a抗体を添加することによって、細胞刺激中にCD107a染色を行った。6時間のインキュベーション期間の後、細胞を、固定可能な生死細胞判定色素および蛍光色素結合型抗CD8によって染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD8+/CD107a+細胞の％として、そしてCD8+細胞におけるCD107a染色についての平均蛍光強度シグナル（MFI）を決定することによって、脱顆粒活性を決定した。脱顆粒アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に実施された。

図3に図示されるように生成されたCAR分子のうち、9種を脱顆粒活性について試験し（図4〜図6）、そのうち7種をさらなる活性試験：インターフェロンγ放出および細胞溶解（図7および図8）のために選択した。

CAR+T細胞をCD33発現細胞（U937）または検出不可能なレベルのCD33を発現する細胞（JekoまたはJeko-1）と6時間共培養した時の、3種の構成（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、またはv5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）のうちの一つでM195 scFv、m2H12 scFv、またはMy9.6 scFvを含むCARの各々の脱顆粒活性を測定した。結果は図4〜図6に図示される。

図4は、CAR+T細胞をCD33発現細胞（U937）またはCD33を発現しない細胞（Jeko）と6時間共培養した時の、3種の構成（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、v5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）を有するM195 scFvの脱顆粒活性（％CD8/CD107a+細胞およびCD8+細胞の中のCD107aのMFI）を示す。データは、脱顆粒の率（％）および平均蛍光強度（MFI）として提示されている。

図5は、CAR+T細胞をCD33発現細胞（U937）またはCD33を発現しない細胞（Jeko）と6時間共培養した時の、3種の構成（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、v5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）を有するm2H12 scFvおよびMy9.6 scFvの脱顆粒活性（％CD8/CD107a+細胞およびCD8+細胞の中のCD107aのMFI）を示す。データは、脱顆粒の率（％）および平均蛍光強度（MFI）として提示されている。

図6は、CAR+T細胞を高レベルもしくは中レベルのCD33を発現する細胞（それぞれ、U937およびK562）またはCD33を発現しない細胞（Jeko-1）と6時間共培養した時の、7種の構築：M195-V1、M195-V3、M195-V5、m2H12-V1、m2H12-V3、およびMy9.6-V1、およびMy9.6-V3（v1：FcgRIIIヒンジ／CD8膜貫通、v3：CD8ヒンジ／CD8膜貫通、v5：IgG1ヒンジ／CD8膜貫通）の脱顆粒活性（％CD8/CD107a+細胞）を示す。データは、脱顆粒の率（％）および平均蛍光強度（MFI）として提示されている。

M195、M2H12、およびMy9.6に由来する抗CD33 scFv抗体断片を使用して生成されたCD33 CARを発現するT細胞によって誘導されたインターフェロンγ放出および細胞溶解
このため、様々なドナーに由来するT細胞をバフィーコート試料から単離し、CD3/CD28ビーズを使用して活性化した。細胞を、活性化の後、11日目に、異なる候補をコードするmRNAによって一過性トランスフェクトした。

以下のように、様々なレベルのCD33を発現する細胞と共培養された時のIFNγ放出および細胞傷害活性を測定することによって、CAR活性を査定した。

IFNγ放出アッセイ
96穴プレートにおいて、様々なレベルのCD33タンパク質を発現する細胞株と共に、抗CD33 CAR発現T細胞をインキュベートした（40,000細胞/ウェル）。共培養を、5％CO₂で37℃で24時間、100μlの最終体積のX-Vivo（商標）-15培地（Lonza）において維持した。このインキュベーション期間の後、プレートを5分間1500rpmで遠心分離し、上清を新しいプレートに回収した。細胞培養上清中のIFNγ検出をELISAアッセイによって行った。IFNγ放出アッセイは、mRNAトランスフェクションの24時間後に細胞共培養を始めることによって実施された。

図7は、異なるレベルのCD33を発現する細胞（U937およびK562）またはCD33を発現しない細胞（Jeko-1）と24時間共培養された時の、抗CD33 car T細胞（T細胞）によって放出されたIFNγの量を示す。共培養と同一の条件で単独で培養されたT細胞からのIFNγ放出も示される。実験は3人の独立のドナーについて行われ、代表的なドナーからの結果がここに示される。

次いで、以下のように、M195、M2H12、およびMy9.6に由来する抗CD33 scFv抗体断片を使用して生成されたCD33 CARを発現するT細胞を、CD33+標的癌細胞（U937：ヒト白血病単球リンパ腫細胞および慢性骨髄性白血病（CML）を有する患者に由来するK562ヒト白血病細胞）を溶解する能力について試験した。

細胞傷害アッセイ
96穴プレートにおいて、同一のウェルにおいて、10,000個の標的細胞（CD33発現）および10,000個の対照細胞（CD33陰性）と共に、抗CD33 CAR発現T細胞をインキュベートした（100,000細胞/ウェル）。標的細胞および対照細胞は、CAR+T細胞との共培養の前に蛍光性の細胞内色素（CFSEまたはCell Trace Violet）によって標識された。共培養物を5％CO₂で37℃で4時間インキュベートした。このインキュベーション期間の後、細胞を固定可能な生死細胞判定色素によって標識し、フローサイトメトリーによって分析した。各細胞集団（標的細胞またはCD33陰性対照細胞）の生存率を決定し、特異的細胞溶解の％を計算した。細胞傷害アッセイは、mRNAトランスフェクションの48時間後に実施された。

図8は、CAR-T細胞の特異的細胞溶解活性を示す。アッセイは、CAR mRNAトランスフェクションの48時間後に行われた。T細胞を、4時間、U937＋Jeko細胞またはK562＋Jeko細胞と共培養した。細胞株の各々についての細胞生存率を、共培養の終わりに決定し、特異的細胞溶解率を計算した。

全ての構築が活性を有し、My9.6 V3（My9.6-3、SEQ ID NO：68）CARが、対照と比較して他のCARより高い全体活性を示した。

上記の例は、CD33に結合するVH-リンカー-VL配列を含む例示されたCAR構造（V1、V3、およびV5）が、全てのアッセイにおいて活性を有することを証明している。

構造V1およびV3を有するCARが、脱顆粒アッセイ、INFγ放出アッセイ、および細胞傷害アッセイにおいて特に高活性であることが見出された（図4〜8を参照すること）。

従って、本発明は、癌細胞に対して活性を有する抗CD33 CAR発現T細胞を提供する。

CARポリペプチド配列の例：

参照

Claims

（a）モノクローナル抗CD33抗体由来のVHおよびVLを含む細胞外リガンド結合ドメイン、
（b）SEQ ID NO：3と少なくとも90％の同一性を有するFcγRIIIαヒンジおよびSEQ ID NO：4と少なくとも90％の同一性を有するCD8αヒンジより選択されるヒンジ、
（c）SEQ ID NO：6と少なくとも90％の同一性を有するCD8α膜貫通ドメイン、ならびに
（d）SEQ ID NO：9と少なくとも90％の同一性を有するCD3ζシグナリングドメインおよびSEQ ID NO：8と少なくとも90％の同一性を有する4-1BB由来の共刺激ドメインを含む細胞質ドメイン
を含むポリペプチド構造を有する、CD33特異的キメラ抗原受容体（CAR）。
前記構造が、SEQ ID NO：4と少なくとも90％の同一性を有するCD8αヒンジを含む、請求項1記載のCD33特異的CAR。
前記構造が、SEQ ID NO：3と少なくとも90％の同一性を有するFcγRIIIαヒンジを含む、請求項1記載のCD33特異的CAR。
VHが、SEQ ID NO：11のポリペプチド配列を有し、かつVLが、SEQ ID NO:12のポリペプチド配列を有するか、
VHが、SEQ ID NO：13のポリペプチド配列を有し、かつVLが、SEQ ID NO:14のポリペプチド配列を有するか、
VHが、SEQ ID NO：15のポリペプチド配列を有し、かつVLが、SEQ ID NO:16のポリペプチド配列を有するか、または
VHが、SEQ ID NO：17のポリペプチド配列を有し、かつVLが、SEQ ID NO:18のポリペプチド配列を有する、
請求項1〜3のいずれか一項記載のCD33特異的CAR。
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、およびSEQ ID NO:39より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項2記載のCD33特異的CAR。
SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、およびSEQ ID NO:37より選択されるポリペプチド配列を含む、請求項3記載のCD33特異的CAR。
請求項1〜6のいずれか一項記載のCARをコードする、ポリヌクレオチド。
請求項1〜6のいずれか一項記載のCD33特異的CARを細胞表面膜に発現する、操作された免疫細胞。
CD33発現細胞を特徴とする前悪性または悪性の癌状態の治療のための医薬の製造における、請求項8記載の操作された免疫細胞の使用。
白血病またはリンパ腫の治療のための医薬の製造における、請求項8記載の操作された免疫細胞の使用。
白血病が、急性骨髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、および骨髄異形成症候群からなる群より選択される、請求項10記載の使用。
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに濾胞性リンパ腫（小細胞型および大細胞型）からなる群より選択される、請求項10記載の使用。
（a）免疫細胞を準備する工程、
（b）請求項1〜6のいずれか一項記載の少なくとも1種のCD33特異的キメラ抗原受容体を該細胞の表面に発現させる工程
を含む、免疫細胞を操作するエクスビボ方法。