BR112021008041A2

BR112021008041A2 - terapia contra o câncer com células imunitárias anti-cd33

Info

Publication number: BR112021008041A2
Application number: BR112021008041-4A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Alexander Terrett; Jason Sagert; Demetrios Kalaitzidis
Original assignee: Crispr Therapeutics Ag
Priority date: 2018-11-07
Filing date: 2019-11-07
Publication date: 2021-08-10
Also published as: IL282286A; EP3877414A1; WO2020095107A1; MX2021005398A; KR20210089712A; JP2022512882A; AU2019377892A1; SG11202103832SA; CN113227141A; CA3118816A1; US20220226375A1

Abstract

TERAPIA CONTRA O CÂNSER COM CÉLULAS IMUNITÁRIAS ANTI-CD33. A presente invenção refere-se a métodos e composições (por exemplo, composições celulares) para o tratamento de câncer, tal como malignidades CD33+.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERA- PIA CONTRA O CÂNCER COM CÉLULAS IMUNITÁRIAS ANTI- CD33".

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício das datas de depósito do Pedido Provisório dos E.U.A. No. 62/756,718, depositado a 7 de no- vembro, 2018, Pedido Provisório dos E.U.A. No. 62/767,388, deposita- do a 14 de novembro, 2018; Pedido Provisório dos E.U.A. No. 62/767,395, depositado a 14 de novembro, 2018, Pedido Provisório dos E.U.A. No. 62/826,643, depositado a 29 de março, 2019, e Pedido Provisório dos E.U.A. No. 62/826,648, depositado a 29 de março,

2019. Os conteúdos inteiros de cada um dos pedidos anteriores são incorporados por referência aqui.

ANTECEDENTES

[0002] A terapia com células T de receptor de antígeno quimérico (CAR) usa células T geneticamente modificadas para visar e matar mais especificamente e eficientemente células cancerosas. Após as células T terem sido coletadas do sangue, as células são manipuladas para incluí- rem CARs em sua superfície. Os CARs podem ser introduzidos nas células T usando tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9. Quando estas células T CAR alogênicas são injetadas em um paciente, os re- ceptores permitem que as células T matem as células cancerosas.

SUMÁRIO

[0003] A leucemia mieloide aguda (AML) é um neoplasma sanguí- neo decorrente de mutações acumuladas em progenitores mieloides e resulta em proliferação excessiva e diferenciação bloqueada o que le- va ao acúmulo de blastos mieloides no tecido hematopoiético. Embora as respostas à quimioterapia de indução padrão sejam inicialmente elevadas, a recidiva é comum e o prognóstico é fraco para a maioria dos pacientes com AML (Talati e Sweet, 2018). Poucas terapêuticas novas para AML foram aprovadas em anos recentes.

[0004] CD33 (também conhecido como Siglec3, lectina 3 tipo Ig de ligação ao ácido siálico, go67 ou p67) é um alvo atraente para o trata- mento de AML e outras leucemias, por exemplo, leucemias de células T. É expresso na maioria dos blastos e subpopulações de AML (célu- las-tronco de leucemia imunofenotipicamente definidas) tanto na apre- sentação como na recidiva (Haubner et a/., 2018). Se pensa que sua expressão esteja restrita a monócitos normais, granulócitos, progenito- res hematopoiéticos e algumas células na população de células-tronco hematopoiéticas imunofenotipicamente definidas (Haubner et al, 2018). O nocaute de CD33 em camundongos não resulta em nenhum fenótipo aparente (Brikman-Van der Linden et a/., 2003). Adicional- mente, o conjugado anticorpo anti-CD33-fármaco gemtuzumab o02z0g- micina (GO) está aprovado para uso humano em AML e tem um perfil de segurança aceitável. No entanto, GO mostra melhorias somente modestas na sobrevivência geral (Talati e Sweet, 2018). Visar células expressando CD33 com uma carga útil mais potente, tal como células CAR-T anti-CD33, pode demonstrar eficácia melhorada em AML em relação a GO. Adicionalmente, as células CAR-T anti-CD33 represen- tam opção terapêutica eficaz para outras malignidades expressando CD33.

[0005] Alguns aspectos da presente divulgação proporcionam uma célula T manipulada compreendendo um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especificamente a CD33. Em algumas modalidades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido. Por exemplo, o gene TRAC pode ser interrompi- do por inserção do ácido nucleico codificando um CAR. Em algumas modalidades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene de beta-2-microglobulina (B2M) interrompido. Em algumas moda- lidades, a célula T manipulada compreende adicionalmente um gene CD33 interrompido.

[0006] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende um gene TRAC interrompido, um gene B2M interrompido, um gene CD33 interrompido e um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33. Em algumas modalidades, a célula T manipulada compreende um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, um gene B2M interrompido e um gene CD33 interrompido. Em algumas modalidades, o CAR compre- ende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio coestimulador CD3z.

[0007] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e (ii) um gene B2M interrompido. Em alguns exemplos, tais células T manipuladas compreendem um gene CD33 de tipo selvagem.

[0008] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreen- dendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; (ii) um gene B2M interrompido; e um gene CD33 interrompido.

[0009] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104,; e (ii) um gene B2M inter- rompido.

[0010] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende um ácido nucleico codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO: 104; (ii) um gene B2M inter- rompido; e (iii) um gene CD33 interrompido.

[0011] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; e (ii) um gene B2M interrompido. Em algumas modalidades, a célula T manipulada compreende um CD33 de tipo selvagem.

[0012] Em algumas modalidades, a célula T manipulada compre- ende: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrom- pido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD33 interrompido.

[0013] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nuclei- co codificando um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que com- preende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um do- mínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de coestimulador CD3C; e (ii) um gene B2M interrompido. Em alguns exemplos, as célu- las T manipuladas compreendem um CD33 de tipo selvagem.

[0014] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nuclei- co codificando um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que com- preende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um do- mínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio de coestimulador CD3C; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD33 interrompi- do.

[0015] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nuclei- co codificando um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e (ii) um gene B2M interrompido. Em alguns exemplos, as células T manipuladas compreendem um CD33 de tipo selvagem.

[0016] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nuclei- co codificando um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; (ii) um gene B2M interrompido; e (ili) um gene CD33 interrompido.

[0017] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nuclei- co codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104; e (ii) um gene B2M interrompido. Em alguns exemplos, as células T manipuladas compreendem um CD33 de tipo selvagem.

[0018] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nuclei- co codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD33 inter- rompido.

[0019] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; e (ii) um gene B2M interrompido. Em alguns exemplos, as células T manipuladas compreendem um CD33 de tipo selvagem.

[0020] Em algumas modalidades, a divulgação proporciona uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrom- pido, em que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um gene CD33 interrompido.

[0021] Quaisquer células T manipuladas descritas aqui podem ser células T humanas.

[0022] O ectodomínio do CAR, em algumas modalidades, compre- ende um anticorpo anti-CD33. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-CD33. O scFv anti-CD33, em algumas modalidades, compreende uma se- quência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 73, 75, 85, 87, 97 ou 99. Em algumas modalidades, o scFv anti-CD33 compreen-

de uma região variável de cadeia pesada (VH) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 65, 77 ou 89 e/ou uma região variável de cadeia leve (VL) compreendendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 66, 78 ou

90. Em algumas modalidades, o scFv anti-CD33 compreende uma VH compreendendo sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 e/ou SEQ ID NO: 69; e/ou o scFv anti-CD33 com- preende uma sequência de VL compreendendo sequências de amino- ácidos de CDR de SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71 e/ou SEQ ID NO:

72. Em algumas modalidades, o scFv anti-CD33 compreende uma VH compreendendo sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80 e/ou SEQ ID NO: 81; e/ou o scFv anti-CD33 com- preende uma sequência de VL compreendendo sequências de amino- ácidos de CDR de SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83 e/ou SEQ ID NO:

84. Em algumas modalidades, o scFv anti-CD33 compreende uma VH compreendendo sequências de aminoácidos de CDR de SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 e/ou SEQ ID NO: 93; e/ou o scFv anti-CD33 com- preende uma sequência de VL compreendendo sequências de amino- ácidos de CDR de SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95 e/ou SEQ ID NO:

96.

[0023] O CAR, em algumas modalidades, compreende um domí- nio de sinalização citoplasmática CD37. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio coestimulador CD28 ou um domínio co- estimulador 41BB. Em exemplos específicos, o CAR divulgado aqui compreende um scFv anti-CD33, um domínio coestimulador CD28 e um domínio de sinalização citoplasmática CD36. Em outros exemplos, o CAR divulgado aqui compreende um scFv anti-CD33, um domínio coestimulador 4-1BB e um domínio de sinalização citoplasmática CD3C.

[0024] Em algumas modalidades, o gene TRAC compreende a se-

quência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118 e/ou em que o CAR compre- ende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119. Em algumas mo- dalidades, o gene B2M interrompido compreende pelo menos uma se- quência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 9-14.

[0025] Em algumas modalidades, as células T compreendem um gene CD33 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, as células T compreendem um gene CD33 interrompido.

[0026] Em algumas modalidades, o gene CD33 interrompido com- preende uma sequência de nucleotídeos de AGTTCATGGTACTGG- TTCC (SEQ ID NO: 187), AGITCATGGTTCC (SEQ ID NO: 188), AG- TTCATGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 189), AGITCATGGTTTAC- TGGTTCC (SEQ ID NO: 190), AGITCC, AGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 191), AGITCATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 192), AGTTCATGG- TATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 193), e/ou AGITACTGGTTCC (SEQ ID NO: 194).

[0027] Em algumas modalidades, o gene CD33 interrompido care- ce de um fragmento compreendendo AGTTCATGGTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 186).

[0028] Em algumas modalidades, o gene CD33 interrompido com- preende uma sequência de nucleotídeos de AAATCCTGGCACT (SEQ ID NO: 300), AMATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 301), ARMATCCT- CATTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 302), AMATCCTCACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 304), AMATCCTCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 305), AA- ATCCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 306), AMATCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 307), ACATCCTCATTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 308), ACA- TCCTGGCACT (SEQ ID NO: 309), AMATCCTCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 310), AMATCCTCATCTGGCACT (SEQ ID NO: 311), AAA-

TCCT, AMACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 312), AMATCCTCTGGCACT (SEQ ID NO: 313), AMATCCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 314), AAA- TCCTCACT (SEQ ID NO: 315), ACATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 316), e/ou AAAT.

[0029] Em algumas modalidades, o gene CD33 interrompido care- ce de um fragmento compreendendo ASATCCTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 299).

[0030] Em algumas modalidades, o gene CD33 interrompido care- ce de um fragmento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotídeos de AMATCCTCAT (SEQ ID NO: 317), AMATCCTCATCCCT (SEQ ID NO: 318), AMATCCTCATCCCTGG (SEQ ID NO: 320), AAA- TCCTCATC (SEQ ID NO: 322) ou AMMATCCTCATCCCTGGCA (SEQ ID NO: 324).

[0031] Em algumas modalidades, o gene CD33 interrompido care- ce de um fragmento, o segmento 5 do qual compreende a sequência de nucleotídeos de CTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 323).

[0032] É também proporcionada aqui, em alguns aspectos, uma população de células T manipuladas (por exemplo, compreendendo um ácido nucleico codificando um CAR anti-CD33), em que pelo me- nos 25% ou pelo menos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR. Por exemplo, pelo menos 70% das células T mani- puladas da população expressam o CAR.

[0033] Em algumas modalidades, pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

[0034] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína do receptor de células T (TOR). Por exemplo, pelo menos 90% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína TCR.

[0035] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína B2M. Por exemplo, pelo menos 70% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína B2M.

[0036] Em algumas modalidades, pelo menos 20% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de pro- teína CD33. Por exemplo, pelo menos 50% das células T manipuladas da população podem não expressar um nível detectável de proteína CD33.

[0037] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da po- pulação, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam CD33, induzem a lise celular de pelo me- nos 50% das células cancerosas da população. Por exemplo, as célu- las T manipuladas da população podem induzir a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células cance- rosas da população. Em algumas modalidades, as células T manipula- das da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretam IFNy. Em algumas modalidades, a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1 a 2:1. As célu- las cancerosas podem ser, por exemplo, leucemia, tal como leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML). Outras cé- lulas cancerosas podem ser visadas.

[0038] Em algumas modalidades, a capacidade proliferativa das células T manipuladas da população está dentro de 10% da capacida- de proliferativa das células de controle.

[0039] Outros aspectos da presente divulgação proporcionam um método que compreende administração da população de células T manipuladas como descrito aqui. Em algumas modalidades, a percen-

tagem de peso corporal do indivíduo, após 5-10 dias de administração, está dentro de 10% do peso corporal inicial do indivíduo, em que o pe- so corporal inicial do indivíduo é o peso corporal do indivíduo aquando da administração. Em algumas modalidades, o indivíduo é um indiví- duo humano. Em algumas modalidades, o indivíduo tem um câncer. O câncer pode expressar CD33, por exemplo. O câncer pode ser, por exemplo, leucemia, tal como ALL, AML, CLL e CML.

[0040] Aspectos adicionais da presente divulgação proporcionam um método para produção de uma célula T manipulada, o método compreendendo (a) entrega a uma célula T de uma nuclease guiada por RNA, um gRNA visando um gene TRAC e um vetor compreenden- do um modelo dador que compreende um ácido nucleico codificando um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a CD33, em que o ácido nucleico codificando o CAR é flanqueado por braços de homologia à esquerda e à direita para o gene TRAC e (b) produção de uma célula T manipulada. Em algumas modalidades, o gRNA visando o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19 ou visa a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 40.

[0041] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente entrega à célula T de um gRNA visando o gene B2M. Em algumas modalidades, o gRNA visando o gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21 ou visa a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

[0042] Em algumas modalidades, o método compreende adicio- nalmente entrega à célula T de um gRNA visando o gene CD33. Em algumas modalidades, o gRNA visando o gene CD33 compreende uma sequência de nucleotídeos como proporcionado na Tabela 10.

[0043] Em algumas modalidades, a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyoge-

nes.

[0044] Em algumas modalidades, o modelo dador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118.

[0045] Em algumas modalidades, o CAR compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119.

[0046] Aspectos adicionais da presente divulgação proporcionam um método para redução do volume de um tumor em um indivíduo, compreendendo administração a um indivíduo tendo câncer, por exemplo, leucemia, de uma população de células T manipuladas como descrito aqui. Em algumas modalidades, o volume do tumor no indiví- duo é reduzido em pelo menos 50% em relação a um controle de linha de base, opcionalmente em que 1x10º células a 1x107 células da po- pulação são administradas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0047] A FIG. 1A inclui representações gráficas de citometria de fluxo ilustrando a expressão à superfície de um CAR anti-CD33 em células T editadas com construtos de CAR anti-CD33 selecionados às duas semanas pós-eletroporação. A transfecção com o CAR CTX- 965b resultou em uma elevada proporção de células T expressando um CAR anti-CD33. Todas as células T CAR são também TRAC-/B2M- (2K0O).

[0048] A FIG. 1B inclui representações gráficas de citometria de fluxo ilustrando a expressão à superfície de um CAR anti-CD33 em células T editadas com construtos de CAR anti-CD33 selecionados às duas semanas pós-eletroporação. A transfecção com o CAR CTX-970 e o CAR CTX-965b resultou em uma elevada proporção de células T expressando um CAR anti-CD33. Todas as células T CAR são tam- bém TRAC-/B2M- (2K0O).

[0049] A FIG. 1C inclui representações gráficas de citometria de fluxo ilustrando a expressão à superfície de um CAR anti-CD33 em células T editadas com construtos de CAR anti-CD33 selecionados à uma semana pós-eletroporação. A transfecção com o CAR CTX-981, o CAR CTX-981b, o CAR CTX-982 e o CAR CTX-982b resultou toda em uma elevada proporção de células T expressando um CAR anti-CD33. Todas as células T CAR são também TRAC-/B2M- (2KO).

[0050] A FIG. 2A inclui representações gráficas de citometria de fluxo demonstrando os efeitos da edição gênica nas populações de células T do dador. É mostrada a proporção de células T editadas com expressão de TCR à superfície celular, B2M e CAR anti-CD33. Adicio- nalmente, a proporção de células T que são CD4+ e CD8+ é mostra- da. Notavelmente, as células CTX-965b retêm expressão de elevados níveis de CD4/CD8 durante pelo menos uma semana após edição gê- nica.

[0051] A FIG. 2B mostra a % de células expressando CAR em cé- lulas T TRAC-/B2M- ao longo do tempo. Todas as células CAR-T anti- CD33 se expandiram ao longo do período de duas semanas.

[0052] A FIG. 2C mostra a % de células T CD4+ e CD8+ dentro da população de células T editadas CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 ao lon- go do tempo. O painel superior mostra as células CD4+ e CD8+ em células T CAR CTX-965b de sete dadores de células T primárias às 1 e 2 semanas pós-edição. O painel inferior mostra as células CD4+ e CD8+ em células T CAR CTX-970 de quatro dadores de células T pri- márias às 1 e 2 semanas pós-edição.

[0053] A FIG. 2D mostra a % de células CD4+ e CD8+ na popula- ção de células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 ao longo do tempo. Especificamente, a figura mostra as células CD4+ e CD8+ em células T CAR CTX-982b de três dadores de células T primárias às 1 e 2 se- manas pós-edição.

[0054] A FIG. 3 inclui um gráfico mostrando a expansão celular de uma população de células CAR-T anti-CD33 (CTX-965b) e populações de células T de controle (Sem RNP; TRAC-/B2M-).

[0055] A FIG. 4 inclui um gráfico mostrando os níveis de expres- são à superfície de CD33 em linhas variáveis de células derivadas do sangue. O painel esquerdo mostra que THP-1 (AML) e PBMC têm ele- vada expressão à superfície de CD33, o painel direito mostra elevada expressão à superfície de CD33 em linhas de células cancerosas de AML: MV4-11, THP-1 e KG-1. O painel direito mostra também que as células MV4-11 manipuladas com um nocaute de CD33 (nocaute de CD33 MV4-11) não expressam CD33.

[0056] As FIGS. 5A-5D incluem gráficos demonstrando que as cé- lulas T CAR* TRAC-/B2M-/anti-CD33 (CTX-965b e CTX-970) são ca- pazes de matar células de AML que expressam CD33 (THP-1, KG-1 e MV4-11). A FIG. 5A mostra que as células T CAR CTX-965b geradas a partir de 4 dadores de células T primárias diferentes são eficazes na indução da lise celular em células THP-1 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 CTX-965b:THP-1. A FIG. 5B mostra que as células T CTX-965b e CTX-970, cada uma gerada a partir de células T isoladas a partir de um dador, são eficazes na indução da lise celular de células THP-1 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 células CAR-T:THP-1. A FIG. 5C mostra que as células T CAR CTX-965b, geradas a partir de células T isoladas a partir de 4 dadores diferentes, e CTX-970, geradas a partir de um dador de células T primárias, são eficazes na indução da lise celular em células KG-1 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 células CAR-T:KG-1. A FIG. 5D mostra que as células T CTX-965b e CTX- 970, cada uma gerada a partir de células T isoladas a partir de um da- dor, são eficazes na indução da lise celular em células MV4-11 às ra- zões celulares de 0,05:1 a 1:1 células CAR-T:MV4-11.

[0057] As FIGS. 6A-6E incluem gráficos demonstrando que as cé-

lulas T CAR* TRAC-/B2M-/anti-CD33 (CTX-965b e CTX-970) são ca- pazes de secretar IFNy na presença de células de AML que expres- sam CD33 (THP-1, KG-1 e MV4-11). A FIG. 6A mostra que as células T CAR CTX-965b geradas a partir de 4 dadores são eficazes na se- creção de IFNy na presença de células THP-1 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 CTX-965b:THP-1. A FIG. 6B mostra que as células T CAR CTX-965b e CTX-970 são eficazes na secreção de IFNy na presença de células THP-1 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 células CAR- T:THP-1. A FIG. 6C mostra que as células T CAR CTX-965b e CTX- 970 são eficazes na secreção de IFNy na presença de células MV-411 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 células CAR-T:MV-411. A FIG. 6D mostra que as células T CAR CTX-965b e CTX-970 são eficazes na secreção de IFNy na presença de células KG1 às razões celulares de 0,05:1 a 1:1 células CAR-T:KG1. A FIG. 6E mostra que o crescimento de células T CAR CTX-965b é dependente de citocinas.

[0058] A FIG. 7 inclui um gráfico mostrando que as células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 (células T CAR CTX-965b) são eficazes na redução do volume tumoral em um modelo de camundongo in vivo de câncer THP-1 AML subcutâneo.

[0059] A FIG. 8 inclui um gráfico mostrando que as células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 (células T CAR CTX-965b) são eficazes na redução do volume tumoral de tumores bem estabelecidos (volume tumoral inicial de aproximadamente 150 mm?) em um modelo de ca- mundongo in vivo de câncer THP-1 AML subcutâneo.

[0060] A FIG. 9 mostra a percentagem de células T CD8+ (painel esquerdo) e CD4+ (painel direito) editadas após edição gênica por vá- rios SsaRNAs que visam CD33.

[0061] A FIG. 10 mostra a % de células expressando CAR em cé- lulas T editadas TRAC-/B2M- com e sem interrupção de CD33 ao dia 7 e dia 14 pós-edição gênica. Os dados são mostrados para células T expressando CAR de um de seis construtos diferentes: CTX-981 (981), CTX-981b (981b), CTX-982 (982), CTX-982b (982b), CTX-970 (970) ou CTX-965b (965b).

[0062] A FIG. 11 mostra a % de células expressando CAR em cé- lulas T editadas TRAC-/B2M- e células T editadas CAR+ TRAC-/B2M- /CD33-/anti-CD33 ao longo do tempo. Os dados são mostrados para células T CAR+ expressando CAR de um de três construtos diferentes: CTX-965b (965b), CTX-970 (970) ou CTX-982b (982b). barras pretas = 7 dias; barras cinzas = 14 dias.

[0063] A FIG. 12 mostra a % de células CD4+ e CD8+ nas popula- ções de células T editadas CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 e células T editadas CAR+ TRAC-/B2M-/CD33-/anti-CD33 ao longo do tempo. O painel esquerdo mostra as células CD8+ em células TCAR à 1 e 2 semanas pós-edição. O painel direito mostra as células CD4+ CD8+ em células T CAR à 1 e 2 semanas pós-edição.

[0064] A FIG. 13 mostra que as células T CAR+ TRAC-/B2M- /CD33-/anti-CD33 retêm a capacidade de matar células cancerosas de AML. O painel esquerdo mostra a % de lise celular de células de AML por células T CAR+ que foram geradas a partir de um único dador de células T primárias. O painel direito mostra a % de lise celular de célu- las de AML por células T CAR+ que foram geradas a partir de um da- dor de células T primárias diferente.

[0065] A FIG. 14 demonstra que as células T CAR anti-CD33 2X KO (TRAC-/B2M-) e as células T CAR anti-CD33 3X KO (TRAC-/B2M- /CD33-) são capazes de induzir a secreção de IFNy em células de AML expressando CD33 (MV4-11; MV4-11) a níveis similares. As célu- las T CAR geradas a partir de 2 dadores de células T primárias dife- rentes são eficazes na indução da secreção de IFNy às razões celula- res de 0,05:1 a 1:1 célula T CAR:MV4-11.

[0066] A FIG. 15 demonstra que as células T CAR anti-CD33 2X

KO (TRAC-/B2M-) e as células T CAR anti-CD33 3X KO (TRAC-/B2M- /CD33-) são capazes de induzir a secreção de IL-2 em células de AML expressando CD33 (MV4-11; MV4-11). Os dados são para células T CAR geradas a partir de 2 dadores de células T primárias diferentes.

[0067] A FIG. 16 mostra a % de lise celular para células MV4-11 de tipo selvagem (painel esquerdo) ou células MV4-11 nocaute de CD33 (CD33: MV4-11) (painel direito) em resposta a células T CAR anti-CD33 2X KO (TRAC-/B2M-) ou células T CAR anti-CD33 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-) quando inoculadas a uma razão de 1:1 (célula T CAR+t:célula alvo).

[0068] A FIG. 17 mostra a % de lise celular para células MV4-11 nocaute de CD33 (CD33" MV4-11) em resposta a células T CAR anti- CD33 2X KO (TRAC-/B2M-) ou células T CAR anti-CD33 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-) quando inoculadas a uma razão de 0,25:1, 0,5:1, 1:1 e 2:1 de célula T CAR+:células CD33-/MV4-11.

[0069] A FIG. 18 mostra a secreção de IL-2 (painel esquerdo) e a secreção de IFNy (painel direito) em células T CAR anti-CD33 2X KO (TRAC-/B2M-) ou células T CAR anti-CD33 3X KO (TRAC-/B2M- /CD33-) em resposta a células cancerosas deficientes em CD33 (célu- las CD33 KO, MV4-11).

[0070] As FIGS. 19A-19E incluem gráficos demonstrado que as células T CAR* TRAC-/B2M-/anti-CD33 (CTX-965b e CTX-970) pro- porcionaram efeitos terapêuticos em um modelo de camundongo MV- 4-11 NSG de AML. A FIG. 19A mostra que três doses diferentes de células T CAR CTX-965b foram eficazes na redução da carga tumoral no modelo de camundongo de AML. A FIG. 19A mostra que três doses dife- rentes de células T CAR CTX-965b foram eficazes no aumento da so- brevivência mediana no modelo de camundongo de AML. A FIG. 19C mostra que as células T CAR CTX-965b com e sem nocaute do gene CD33 foram eficazes no aumento da sobrevivência mediana no modelo de camundongo de AML. A FIG. 19D mostra que as células T CAR CTX- 970 com e sem nocaute do gene CD33 foram eficazes no aumento da sobrevivência mediana no modelo de camundongo de AML. A FIG. 19E mostra a carga tumoral como medida por visualização de biolumines- cência ao Dia 33 após tratamento de camundongos com células T CAR CTX-965b ou CTX-970 com ou sem nocaute de CD33.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0071] A presente divulgação é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que as células T CAR+ anti-CD33 reduziram a carga tumoral e aumentaram a sobrevivência mediana em modelos de ca- mundongo de leucemia mieloide aguda (AML). Foi também demons- trado que CD33 é altamente expresso em células T ativadas, que po- dem ser suscetíveis à morte autorreativa por células T CAR+ anti- CD33. Tal morte autorreativa pode ser reduzida ou eliminada por inter- rupção do gene CD33 endógeno em células T CAR+ anti-CD33 usan- do métodos de edição gênica proporcionados aqui. Conformemente, a presente divulgação proporciona, em alguns aspectos, células T CAR+ anti-CD33 com um gene CD33 endógeno interrompido. Em outros as- pectos, a presente divulgação proporciona células T CAR+ anti-CD33 tendo um gene CD33 endógeno de tipo selvagem.

[0072] Aspectos da presente divulgação proporcionam células T CAR+ anti-CD33 com ou sem um gene CD33 interrompido, métodos de produção de tais células T CAR+ anti-CD33 e métodos de uso de tais células T CAR+ anti-CD33 para tratamento de câncer (por exem- plo, AML) em um indivíduo. Componentes e processos (por exemplo, a abordagem de CRISPR para edição gênica e componentes usados na mesma) para preparação de células T CAR+ anti-CD33 divulgados aqui estão também dentro do escopo da presente divulgação. Antígeno de Câncer CD33

[0073] Em algumas modalidades, as células T da presente divul-

gação são manipuladas com um receptor de antígeno quimérico (CAR) desenhado para visar CD33. CD33, também conhecido como Siglec3, é um receptor transmembranar expresso em células da linhagem mie- loide que é conhecido por se ligar a ácidos siálicos. Como CD33 é ex- presso em células cancerosas (por exemplo, leucemia mieloide aguda) se pensa que CD33 represente um marcador de superfície celular para visar estas malignidades.

[0074] Assim, em algumas modalidades, as células T da presente divulgação são manipuladas para expressarem um CAR compreen- dendo um anticorpo anti-CD33 (por exemplo, scFv anti-CD33). Em al- gumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 codi- ficado pela sequência de qualquer uma de SEQ ID NOS: 74, 76, 86, 88, 98 ou 100. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 compreendendo a sequência de qualquer uma de SEQ ID NOS: 73, 75, 85, 87, 97 ou 99. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 compreendendo uma VH compreen- dendo uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 65, 77 ou 89. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD33 é um scFv anti-CD33 compreendendo uma VL compreendendo uma sequên- cia de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 66, 78 ou 90. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti- CD33 é codificado pela sequência de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119. Em algumas moda- lidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD33 compreen- de a sequência de qualquer uma de SEQ ID NOS: 101-108, 111, 114, 117 ou 120. Em algumas modalidades, um CAR compreendendo um anticorpo anti-CD33 compreende um anticorpo anti-CD33 como des- crito em US 9,359,442, US 9,587,019 ou US 5,773,001. Edição de Múltiplos Genes

[0075] As células T manipuladas da presente divulgação, em al-

gumas modalidades, incluem mais do que uma edição gênica, por exemplo, em mais do que um gene. Por exemplo, uma célula T mani- pulada pode compreender um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido, um gene da beta-2- microglobulina (B2M) interrompido, um gene de morte celular progra- mada-1 (PD-1 ou PDCD1) interrompido, um gene CD70 interrompido ou qualquer combinação de dois ou mais dos genes interrompidos an- teriores. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compre- ende um gene TRAC interrompido, um gene B2M interrompido e um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, uma célula T ma- nipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene B2M in- terrompido e um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene TRAC interrompido, um gene B2M interrompido, um gene CD70 interrompido e um gene PD-1 interrompido.

[0076] Deve ser entendido que a interrupção gênica engloba modi- ficação gênica através da edição gênica (por exemplo, usando edição gênica CRISPR/Cas para inserir ou deletar um ou mais nucleotídeos). Como usado aqui, o termo "um gene interrompido" se refere a um ge- ne contendo uma ou mais mutações (por exemplo, inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos, etc.) em relação à contraparte de tipo selvagem de modo a reduzir substancialmente ou eliminar completa- mente o atividade do produto gênico codificado. A uma ou mais muta- ções podem estar localizadas em uma região não codificante, por exemplo, uma região promotora, uma região reguladora que regula a transcrição ou tradução; ou uma região de íntron. Alternativamente, a uma ou mais mutações podem estar localizadas em uma região codifi- cante (por exemplo, em um éxon). Em alguns casos, o gene interrom- pido não expressa ou expressa um nível substancialmente reduzido da proteína codificada. Em outros casos, o gene interrompido expressa a proteína codificada em uma forma mutada, que não é funcional ou tem atividade substancialmente reduzida. Em algumas modalidades, um gene interrompido é um gene que não codifica proteína funcional. Em algumas modalidades, uma célula que compreende um gene interrom- pido não expressa (por exemplo, à superfície da célula) um nível de- tectável (por exemplo, por anticorpo, por exemplo, por citometria de fluxo) da proteína codificada pelo gene. Uma célula que não expressa um nível detectável da proteína pode ser referida como uma célula ina- tivada. Por exemplo, uma célula tendo uma edição no gene B2M pode ser considerada uma célula com nocaute de B2M se a proteína B2M não puder ser detectada à superfície da célula usando um anticorpo que se liga especificamente à proteína B2M.

[0077] Em algumas modalidades, um gene interrompido pode ser descrito como compreendendo um fragmento mutado em relação à contraparte de tipo selvagem. O fragmento mutado pode compreender uma deleção, uma substituição de nucleotídeos, uma adição ou uma sua combinação. Em outras modalidades, um gene interrompido pode ser descrito como tendo uma deleção de um fragmento que está pre- sente na contraparte de tipo selvagem. Em alguns casos, a extremida- de 5º do fragmento deletado pode estar localizada dentro da região gênica visada por um RNA guia desenhado tal como aqueles divulga- dos aqui (conhecido como sequência no alvo) e a extremidade 3' do fragmento deletado pode ir para além da região visada. Alternativa- mente, a extremidade 3” do fragmento deletado pode estar localizada dentro da região visada e a extremidade 5 do fragmento deletado po- de ir para além da região visada.

[0078] São proporcionadas aqui, em algumas modalidades, popu- lações de células nas quais uma certa percentagem das células foi editada (por exemplo, gene B2M editado), resultando em uma certa percentagem de células não expressando um gene e/ou proteína par-

ticulares. Em algumas modalidades, pelo menos 50% (por exemplo, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 85%) das célu- las de uma população de células com edição gênica são células com nocaute de B2M. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das célu- las (por exemplo, células T) da população não expressam níveis de- tectáveis de proteína B2M. Em algumas modalidades, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo me- nos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células de uma população de células com edição gê- nica podem ser células com nocaute de B2M.

[0079] Métodos de uso da tecnologia de edição gênica CRISPR- Cas para criar uma deleção genômica em uma célula (por exemplo, para eliminar um gene em uma célula) são conhecidos (Bauer DE et al. Vis. Exp. 2015; 95; e52118). Edição do Gene TRAC

[0080] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene TRAC interrompido. Esta interrupção leva à perda de função do TCR e torna as células T manipuladas não alorreativas e adequadas para transplante alogênico, minimizando o risco de doença de enxerto versus hospedeiro. Em algumas modalidades, a expressão do gene TRAC endógeno é eliminada para prevenir uma resposta de enxerto-versus-hospedeiro. Em algumas modalidades, gRNAs visando a região genômica de TRAC criam Indels no gene TRAC interrompen- do a expressão do mRNA ou proteína. Em algumas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é criada por gRNAs visando a região genômica de TRAC. Em algumas modalidades, uma interrup- ção na expressão do gene TRAC é criada por inserção de uma se- quência exógena (por exemplo, um ácido nucleico codificando um re- ceptor de antígeno quimérico) no gene TRAC (por exemplo, usando um vetor viral adenoassociado (AAV) e modelo dador). Em algumas modalidades, uma deleção genômica no gene TRAC é criada por um gRNA e/ou inserção de uma sequência exógena (por exemplo, um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico) no ge- ne TRAC (por exemplo, usando um AAV e modelo dador). Em algu- mas modalidades, uma interrupção na expressão do gene TRAC é cri- ada por gRNAs visando a região genômica de TRAC e inserção de um receptor de antígeno quimérico (CAR) no gene TRAC.

[0081] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de TRAC modificadas e não modificadas que podem ser usadas como proporci- onado aqui para criar uma interrupção genômica no gene TRAC estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 18 e 19). Ver tam- bém Pedido Internacional No. POCT/US2018/032334, depositado a 11 de maio, 2018, incorporado aqui por referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene TRAC lo- calizada no cromossomo 14 (GRCh38: cromossomo 14: 22,547,506- 22,552,154; Ensembl; ENSGO0000277734).

[0082] Em algumas modalidades, pelo menos 50% de uma popu- lação de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de superfície do receptor de células T (TOR). Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de uma população podem não expressar um nível detec- tável de proteína de superfície TOR. Em algumas modalidades, 50%- 100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%- 90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-290%, 70%-80%, 80%- 100%, 80%-90%, ou 90%-100% da população de células T manipula- das não expressam um nível detectável de proteína de superfície TOR.

[0083] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA visando o gene TRAC (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e o gRNA são entregues separadamente às células T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexada/ complexada com um gRNA.

[0084] Em algumas modalidades, os gRNAs visando a região ge- nômica de TRAC criam Indels no gene TRAC compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada das seguintes se- quências na Tabela 1: Tabela 1. Sequência SEQ ID NO: AAGAGCAACAAATCTGACT 1 AAGAGCAACAGTGCTGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACTAAGAGC 2

AACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGGAGCAACAAATCTGACTAAGAGCAACAAA 3

TCTGACT AAGAGCAACAGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACTAAGAGCAACAA 4

ATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGACTAAGAGCAACAAATCTGACT 5 AAGAGCAACAGTGCTGTGGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTAAGA 6

GCAACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTAAGAGCA 7

ACAAATCTGACT AAGAGCAACAGTGCTGTGTGCCTGGAGCAACAAATCTGACTAAGA 8

GCAACAAATCTGACT

[0085] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende uma deleção no gene TRAC em relação às células T não mo- dificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende uma deleção de 15-30 pares de bases no gene TRAC em re- lação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modali- dades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de mais do que 30 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de 20 pares de bases no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção de AGAGCAACAG- TGCTGTGGCC (SEQ ID NO: 325) no gene TRAC em relação às célu- las T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T mani- pulada compreende uma deleção compreendendo AGAGCAACAG- TGCTGTGGCC (SEQ ID NO: 325) no gene TRAC em relação às célu- las T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T mani- pulada compreende uma deleção de SEQ ID NO: 40 no gene TRAC em relação às células T não modificadas. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende uma deleção compreendendo SEQ ID NO: 40 no gene TRAC em relação às células T não modifica- das. Edição do Gene B2M

[0086] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene B2M interrompido. B2M é um componente comum (invariante) dos complexos MHC |. A interrupção de sua expressão por edição gênica prevenirá respostas hospedeiro versus células T alogêni- cas terapêuticas levando a persistência aumentada de células T alogêni- cas. Em algumas modalidades, a expressão do gene B2M endógeno é eliminada para evitar uma resposta de enxerto-versus-hospedeiro.

[0087] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de B2M modificadas e não modificadas que podem ser usadas como proporci- onado aqui para criar uma interrupção genômica no gene B2M estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOs: 20 e 21). Ver tam-

bém Pedido Internacional No. POCT/US2018/032334, depositado a 11 de maio, 2018, incorporado aqui por referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene B2M loca- lizada no Cromossomo 15 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 15: 44,711,477-44,718,877; Ensembl: ENSGO00000166710).

[0088] Em algumas modalidades, gRNAs visando a região genô- mica de B2M criam Indels no gene B2M interrompendo a expressão do MRNA ou proteína.

[0089] Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície B2M. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície B2M. Em al- gumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-290%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das célu- las T manipuladas de uma população não expressam um nível detec- tável de proteína de superfície B2M.

[0090] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA visando o gene B2M (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e o gRNA são entregues separadamente às células T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré- complexada/complexada com um gRNA.

[0091] Em algumas modalidades, um gene B2M editado compre-

ende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada das se- guintes sequências na Tabela 2: Tabela 2. Sequências SEQ ID NO: CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGCCTGGAG |9

GCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCGCCTGGAGG 10

CTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCOGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGAGGCTA 11

TCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCOGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGGATAGCCOT 12

GGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTATCCAGCGTGAGTCTCOTCCTA | 13

CCCTCCCGCT CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGTGGCCOTE 14

GAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCOGCT Edição do Gene CD33

[0092] CD33 (também conhecido como Siglec3, lectina 3 tipo Ig de ligação ao ácido siálico, go67 ou p67) é um receptor transmembranar expresso em células da linhagem mieloide. CD33 se liga aos ácidos siálicos, portanto é um membro da família SIGLEC de lectinas. É usu- almente considerado específico de mieloide, mas pode ser também encontrado em algumas células linfoides, incluindo células T ativadas (Hernandez-Caselles et a/., 2006).

[0093] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene CD33 interrompido. Em algumas modalidades, a ex- pressão do gene CD33 endógeno é eliminada para intensificar a eficá- cia antitumoral e diminuir o fratricídio das células T CAR da presente divulgação. Em algumas modalidades, gRNAs visando a região genô- mica de CD33 criam Indels no, em torno do ou próximo do gene CD33 interrompendo a expressão do mRNA de CD33 e/ou proteína CD33.

[0094] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de CD33 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como proporci- onado aqui para criar uma interrupção genômica no gene CD33 estão listados na Tabela 10, por exemplo, gRNA de CD33-1; UGGCUAUG- GAUCCAAAUUUCguuuuagagecuagaaavagcaaguuaaaavaaggcuaguceegu uaucaacuugaaaaaguggcaccgagueggugcUUUU (SEQ ID NO: 132). Em alguns exemplos, RNAs guia de CD33-2 ou de CD33-10 podem ser usa- dos para criar interrupções genômicas em um gene CD33. Em alguns exemplos, o RNA guia usado para interromper o gene CD33 compreende uma sequência espaçadora listada na Tabela 10. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene CD33 loca- lizada no cromossomo 19 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 19: 51,225,064-51,243,860; Ensembl: ENSGO00000105383.14).

[0095] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene CD33 interrompido. Em algumas modalidades, pelo menos 20% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de super- fície CD33. Por exemplo, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo me- nos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pe- lo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população po- dem não expressar um nível detectável de proteína de superfície CD33. Em algumas modalidades, 20%-75%, 20-50%, 30-50%, 30%- 75%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%- 100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%- 80%, 80%-100%, 80%-90%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expressam um nível detectável de proteína de superfície CD33.

[0096] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro-

teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA visando o gene CD33 (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e o gRNA são entregues separadamente às células T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexada/ complexada com um gRNA.

[0097] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode compreender um fragmento mutado, por exemplo, o gene CD33 edita- do compreende um ou mais dos fragmentos mutados proporcionados nas Tabelas 13-22 (coluna "Sequências com Edição Gênica"), por exemplo, aqueles proporcionados na Tabela 14 e/ou Tabela 22). Por exemplo, o gene CD33 pode compreender um fragmento mutado ten- do uma deleção em relação à contraparte de tipo selvagem, por exemplo, o gene CD33 editado pode compreender uma sequência de nucleotídeos estabelecida como GGATCCAAA-TTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 175), onde uma deleção de nucleotídeo único é representada por um traço (-). Em outro exemplo, o gene CD33 editado pode com- preender um fragmento mutado tendo uma inserção em relação à con- traparte de tipo selvagem, por exemplo, GGATCCAAATTTTCTGG- CTGC (SEQ ID NO: 176), onde a inserção é indicada em negrito. Ain- da em outro exemplo, o gene CD33 pode compreender um fragmento mutado tendo tanto uma deleção como uma inserção em relação à contraparte de tipo selvagem, por exemplo, a deleção mostrada em SEQ ID NO: 175 e a inserção mostrada em SEQ ID NO: 176 em rela- ção à sequência da contraparte de tipo selvagem SEQ ID NO: 174.

[0098] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ser descrito em termos de um fragmento que é deletado do gene de tipo selvagem (ou não editado).

[0099] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo GGATCCAAATTTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 174), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00100] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo AGTTCATGGTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 186), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00101] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo ACTCCCCAGTTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 196), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00102] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo AGCCATTATATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 207), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00103] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo TCAGTGACGGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 220), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00104] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 243), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00105] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG (SEQ ID NO: 263), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00106] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo ACTACTCACTCCTCGGTGCT (SEQ ID

NO: 268), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00107] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo CCCGATCTTCTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 285), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00108] Por exemplo, o gene CD33 editado pode carecer de um fragmento compreendendo ARATCCTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 299), ou uma sua porção, que pode compreender 1, 2, 3,4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais nucleotídeos.

[00109] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de GGA- TCCAAATTCTGGCTGC (SEQ ID NO:175), GGATCCAAATTTT- CTGGCTGC (SEQ ID NO:176), GGATCCTGGCTGC (SEQ ID NO: 177), GGATCCAATTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 178), TECTGGCTGC (SEQ ID NO: 179), GGATCTGGCTGC (SEQ ID NO: 180), GGATCC, e/ou GGATCCATTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 181); (b) carece de um fragmento compreendendo GGATCCAA- ATTTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 174); e (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de GGATCCAAATTTC (SEQ ID NO: 182), GGATCCAAATT (SEQ ID NO: 183), ou GGATCCAAATTT (SEQ ID NO: 185).

[00110] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 164 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 142).

[00111] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AGTT-

CATGGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 187), AGITCATGGTTCC (SEQ ID NO: 188), AGTITCATGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 189), AGTT- CATGGTTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 190), AGITTCC, AGTACTGG- TTCC (SEQ ID NO: 191), AGITCATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 192), AGTTCATGGTATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 193), e/ou AGTTAC- TGGTTCC (SEQ ID NO: 194); e (b) carece de um fragmento compreendendo AGTT- CATGGTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 186); Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 165 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 143).

[00112] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AC- TCCCCAGTTTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 197), ACTCCCCAGT- CATGGTTAC (SEQ ID NO: 198), ACTCCCCATGGTTAC (SEQ ID NO: 199), ACTCCCCAGTTAC (SEQ ID NO: 200), ACTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 201), ACTCCCCATCATGGTTAC (SEQ ID NO: 202), AC- TCCCCATTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 203), ACTCCCCAGTGT- CATGGTTAC (SEQ ID NO: 204), e/ou ACTCCCCAGTCTCATGGT- TAC (SEQ ID NO: 205) (b) carece de um fragmento compreendendo ACTCCCCA- GTTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 196); e (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de ACTCCCCAGTTCATGGTT (SEQ ID NO: 206).

[00113] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 166 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 144).

[00114] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AG- CCATTATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 208), AGCCAGGGACT (SEQ ID NO: 209), AGCCATTATTCCAGGGACT (SEQ ID NO: 210), AG- TCCAGGGACT (SEQ ID NO: 211), AGCCATTATAATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 212), AGCCATTATCCGGGGACT (SEQ ID NO: 213), AGCCATTATACAGGGACT (SEQ ID NO: 214), AGCCATTATT- CCGGGGACT (SEQ ID NO: 216), e/ou AGCCATTATAATOCGGG- GACT (SEQ ID NO: 217); (b) carece de um fragmento compreendendo AGCCATTA- TATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 207); e (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de AGCCATTATATCCA (SEQ ID NO: 218) ou AGCCATTATA (SEQ ID NO: 219).

[00115] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 167 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 145).

[00116] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de TCAG- TGACAGGAGGG (SEQ ID NO: 221), TEAGTGACGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 222), TEAGGAGGG (SEQ ID NO: 223), TEAGTGACG- GAGGG (SEQ ID NO: 224), TEAGTGACGGGAGGG (SEQ ID NO: 226), TEAGTGACGGTTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 227), TCAG- TGACGGACAGGAGGG (SEQ ID NO: 228), TEAGTGACGGGTACA- GGAGGG (SEQ ID NO: 229), TEAGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 230), TEAGTGACTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 231), TCAGTGA- CGGG (SEQ ID NO: 232), TEAGTGACGG (SEQ ID NO: 233), TOCAG- TGACGGCAGGAGGG (SEQ ID NO: 234) TEAGTGACGGAGGAGGG (SEQ ID NO: 235), TEAGTGATACAGGAGGG (SEQ ID NO: 236),

TCAGTGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 237), e/ou TCATACAGGA- GGG (SEQ ID NO: 238); (b) carece de um fragmento compreendendo TCAGTGA- CGGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 220); (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de TCAGTGACGGTA (SEQ ID NO: 239) ou TCAGTGACG; e (d) carece de um fragmento, o segmento 5' do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de GTGACGGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 242).

[00117] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 168 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 146).

[00118] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AG- CTGGAGCT (SEQ ID NO: 244), AGGTGAAGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 245), AGGTGAAGCT (SEQ ID NO: 246), AGGTGAAGTTGGA- GCT (SEQ ID NO: 247), AGGTGAAGTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 248), AGGTGGAGCT (SEQ ID NO: 249), AGGTGAAGCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 250), AGGTGACGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 252), e/ou AGGTGAAGTTTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 253); (b) carece de um fragmento compreendendo AGGTGAAG- TTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 243); (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de AGGTGAAGTTCG (SEQ ID NO: 256), AGGTGAAGTTCGCTGGAG (SEQ ID NO: 259), AGG- TGAAGTTCGCTGG (SEQ ID NO: 260), ou AGGTGAAGTT (SEQ ID NO: 261); e (d) carece de um fragmento, o segmento 5' do qual com-

preende a sequência de nucleotídeos de GGTGAAGTTCGCTGGA- GCT (SEQ ID NO: 262).

[00119] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 169 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 147).

[00120] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AGTT- CGCTGGTGTG (SEQ ID NO: 264) e/ou AGTTCGCTGAGCTGGTGTGE (SEQ ID NO: 266); (b) carece de um fragmento compreendendo AGTTCG- CTGGAGCTGGTGTG (SEQ ID NO: 263); e (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de AGTTCGCTGG (SEQ ID NO: 267).

[00121] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 170 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 148).

[00122] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AC- TACTCACTTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 269), ACTACTCGGTGCT (SEQ ID NO: 270), ACTACTCATCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 271), ACTACT, ACTACTCACCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 272), ACTAC- TCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 273), ACTACTCACCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 275), ACTACTCACTCGGTGCT (SEQ ID NO: 276), AC- TACTCTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 277), ACTACTTCCOTCGGTGCT (SEQ ID NO: 278), ACTACTCACTTCGGTGCT (SEQ ID NO: 279), e/ou ACTATCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 280); (b) carece de um fragmento compreendendo ACTACT-

CACTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 268); e (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de ACTACTCACT (SEQ ID NO: 282), ACTACTCACTCCTC (SEQ ID NO: 283) ou ACTACTCAC- TCCTCGGT (SEQ ID NO: 284).

[00123] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 171 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 149).

[00124] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características: (a) compreende uma sequência de nucleotídeos de CCCGATCTTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 286), CCCGATCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 287), CCCGATCTG GTTGT (SEQ ID NO: 288), CCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 289), CCCGATCTTCTGGTTGT (SEQ ID NO: 290), CCOGATCTTGGTTGT (SEQ ID NO: 291), CCCGATCTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 292), CCCGATCTTCCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 293), e/ou CCCGAT; (b) carece de um fragmento compreendendo CCCGATC TTCTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 285); (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de CCCGATCTTCT (SEQ ID NO: 295); e (d) carece de um fragmento, o segmento 5' do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de TOCTGGTTGT (SEQ ID NO: 298).

[00125] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 172 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 150).

[00126] Em algumas modalidades, o gene CD33 editado pode ter uma ou mais das seguintes características:

(a) compreende uma sequência de nucleotídeos de AAA- TCCTGGCACT (SEQ ID NO: 300), AAMATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 301), AMATCCTCATTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 302), AMATCCT- CACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 304), AMATCCTCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 305), AMATCCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 306), AA- ATCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 307), ACATCCTCATTCCCOTGG- CACT (SEQ ID NO: 308), ACATCCTGGCACT (SEQ ID NO: 309), AA- ATCCTCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 310), ASATCCTCATCTGG- CACT (SEQ ID NO: 311), AMATCCT, ASACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 312) AAATCCTCTGGCACT (SEQ I|D NO: 313) AAA- TCCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 314), AMATCCTCACT (SEQ ID NO: 315), ACATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 316), e/ou AAAT; (b) carece de um fragmento compreendendo AAATCCT- CATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 299); (c) carece de um fragmento, o segmento 3 do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de AMATCCTCAT (SEQ ID NO: 317), AAATCCTCATCCCT (SEQ ID NO: 318), AAATCCT- CATCCCTGG (SEQ ID NO: 320), AMATCCTCATC (SEQ ID NO: 322), ou AMATCCTCATCCCTGGCA (SEQ ID NO: 324); e (d) carece de um fragmento, o segmento 5' do qual com- preende a sequência de nucleotídeos de CTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 323).

[00127] Um tal gene CD33 editado pode ser produzido usando um RNA guia compreendendo uma sequência espaçadora de SEQ ID NO: 173 (por exemplo, o gRNA de SEQ ID NO: 151).

Edição do Gene PD-1

[00128] PD-1é uma molécula de ponto de verificação imunológico que é sobrerregulada nas células T ativadas e serve para amortecer ou parar as respostas das células T. A interrupção de PD-1 por edição gênica pode levar a respostas de células T terapêuticas mais persis-

tentes e/ou potentes e/ou reduzir a supressão imunitária em um indiví- duo. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada compreende um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, a expressão do gene PD-1 endógeno é eliminada para intensificar a eficácia anti- tumoral das células T CAR da presente divulgação.

[00129] “Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de PD-1 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como proporci- onado aqui para criar uma deleção genômica no gene PD-1 estão lis- tados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 22 e 23). Ver também Pedido Internacional No. PCT/US2018/032334, depositado a 11 de maio, 2018, incorporado aqui por referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene PD-1 loca- lizada no cromossomo 2 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 2: 241,849,881-241,858,908; Ensembl: ENSGO00000188389).

[00130] Em algumas modalidades, gRNAs visando a região genô- mica de PD-1 criam Indels no gene PD-1 interrompendo a expressão do mRNA de ou proteína PD-1.

[00131] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene PD-1 interrompido. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de super- fície PD-1. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície PD-1. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-290%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície PD-1.

[00132] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA visando o gene PD-1 (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e o gRNA são entregues separadamente às células T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexada/ complexada com um gRNA. Edição do Gene CD70

[00133] Agrupamento de Diferenciação 70 (CD70) é um membro da superfamília dos fatores de necrose tumoral e sua expressão é restrita a linfócitos T e B ativados e células dendríticas maduras. CD70 foi também detectado em tumores hematológicos e em carcinomas. CD70 está implicado na sobrevivência das células tumorais e células T regu- ladoras através da interação com seu ligando, CD27. A interrupção de CD7O0O por edição gênica aumenta a expansão celular e reduz a exaus- tão celular. Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, a ex- pressão do gene CD70 endógeno é eliminada para intensificar a eficá- cia antitumoral das células T CAR da presente divulgação. Em algu- mas modalidades, gRNAs visando a região genômica de CD70 criam Indels no, ou em torno do, gene CD70 interrompendo a expressão do MRNA de e/ou proteína CD70.

[00134] Exemplos não limitantes de sequências de gRNA de CD70 modificadas e não modificadas que podem ser usadas como proporci- onado aqui para criar uma interrupção genômica no gene CD70 estão listados na Tabela 4 (por exemplo, SEQ ID NOS: 24-27). Ver também Pedido Internacional No. PCT/IB2019/000500, depositado a 10 de maio, 2019, incorporado aqui por referência. Outras sequências de gRNA podem ser desenhadas usando a sequência do gene CD70 lo- calizada no cromossomo 19 (coordenadas de GRCh38: Cromossomo 19: 6,583,183-6,604,103; Ensembl: ENSGO00000125726).

[00135] Em algumas modalidades, uma célula T manipulada com- preende um gene CD70 interrompido. Em algumas modalidades, pelo menos 50% das células T manipuladas de uma população de células T manipuladas não expressam um nível detectável de proteína de super- fície CD70. Por exemplo, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo me- nos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% das células T manipuladas de uma população podem não expressar um nível detectável de proteína de superfície CD70. Em algumas modalidades, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, 50%-60%, 60%-100%, 60%-90%, 60%-80%, 60%-70%, 70%-100%, 70%-90%, 70%-80%, 80%-100%, 80%-290%, ou 90%-100% das células T manipuladas de uma população não expres- sam um nível detectável de proteína de superfície CD70.

[00136] Em algumas modalidades, uma partícula de ribonucleopro- teína (RNP) contendo uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, tal como uma nuclease Cas9) e um gRNA visando o gene CD70 (ou qualquer outro gene de interesse) são entregues às células T (por exemplo, células T primárias). Em outras modalidades, a nuclease guiada por RNA e o gRNA são entregues separadamente às células T. Uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) é simplesmente uma nuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9) pré-complexada/ complexada com um gRNA. Fenótipos Celulares

[00137] Em algumas modalidades, uma ou mais edições gênicas dentro de uma população de células resulta em um fenótipo associado a mudanças na capacidade proliferativa celular, exaustão celular, via- bilidade celular, capacidade de lise celular (por exemplo, produção e/ou liberação de citocinas aumentadas) ou qualquer sua combinação.

[00138] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente divulgação exibem capacidade proliferativa celular pelo me- nos 20% maior, em relação às células T de controle. Por exemplo, as células T manipuladas podem exibir capacidade proliferativa celular pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% maior, em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente divulgação exibem capacidade proliferativa celular 20%-100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%- 70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-290%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-290%, 40%-80%, 40%-70%, 40%- 60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-290%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%- 60% maior, em relação às células T de controle.

[00139] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente divulgação exibem um aumento de pelo menos 20% na viabi- lidade celular, em relação às células de controle. Por exemplo, as célu- las T manipuladas da presente divulgação podem exibir aumento de pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo me- nos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% na viabilidade celular, em relação às células de controle. Em algumas modalidades, as células T manipula- das da presente divulgação exibem um aumento de 20%-100%, 20%- 90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%- 90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%- 90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%- 90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60% na viabilidade celular, em re- lação às células de controle.

[00140] Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente divulgação exibem um aumento de pelo menos 20% na ca- pacidade de lise celular (matam pelo menos 20% mais células alvo), em relação às células de controle. Por exemplo, as células T manipu- ladas da presente divulgação podem exibir um aumento de pelo me- nos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60 %, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% na capacidade de lise celular, em relação às célu- las de controle. Em algumas modalidades, as células T manipuladas da presente divulgação exibem um aumento de 20% -100%, 20%-90%, 20%-80%, 20%-70%, 20%-60%, 20%-50%, 30%-100%, 30%-90%, 30%-80%, 30%-70%, 30%-60%, 30%-50%, 40%-100%, 40%-90%, 40%-80%, 40%-70%, 40%-60%, 40%-50%, 50%-100%, 50%-90%, 50%-80%, 50%-70%, ou 50%-60% na capacidade de lise celular, em relação às células de controle. Por exemplo, o nível de citocinas (por exemplo, IL-2 e/ou IFN-gama) secretadas pelas células T manipuladas pode pelo menos 2 vezes (por exemplo, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes) maior do que o nível de citoci- nas secretadas pelas células T de controle.

[00141] As células T de controle, em algumas modalidades, são cé- lulas T modificadas (por exemplo, células T com edição gênica). Em algumas modalidades, as células T de controle são células T manipu- ladas que compreendem um gene TRAC interrompido, um ácido nu- cleico codificando um CAR (por exemplo, um CAR anti-CD33) inserido no gene TRAC e/ou um gene B2M interrompido. Em algumas modali- dades, as células T de controle são células T não editadas. Métodos de Edição Gênica

[00142] A edição gênica (incluindo edição genômica) é um tipo de manipulação genética na qual nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s) é/são inserido(s), deletado(s) e/ou substituído(s) em uma sequência de DNA, tal como no genoma de uma célula visada. A edição gênica visada permite a inserção, deleção e/ou substituição em locais pré- selecionados no genoma de uma célula visada (por exemplo, em um gene visado ou sequência de DNA visada). Quando uma sequência de um gene endógeno é editada, por exemplo por deleção, inserção ou substituição de nucleotídeo(s)/ácido(s) nucleico(s), o gene endógeno compreendendo a sequência afetada pode ser inativado ou silenciado devido à alteração de sequência. Portanto, a edição visada pode ser usada para interromper a expressão do gene endógeno. "Integração visada" se refere a um processo envolvendo inserção de uma ou mais sequências exógenas, com ou sem deleção de uma sequência endó- gena no local de inserção. A integração visada pode resultar da edição gênica visada quando um modelo dador contendo uma sequência exógena está presente.

[00143] A edição visada pode ser alcançada através de uma abor- dagem independente de nucleases ou através de uma abordagem de- pendente de nucleases. Na abordagem de edição visada independente de nucleases, a recombinação homóloga é guiada por sequências homó- logas flanqueando um polinucleotídeo exógeno a ser introduzido em uma sequência endógena através da maquinaria enzimática da célula hospe- deira. O polinucleotídeo exógeno pode introduzir deleções, inserções ou substituição de nucleotídeos na sequência endógena.

[00144] &—Alternativamente, a abordagem dependente de nucleases pode alcançar edição visada com frequência mais elevada através da introdução específica de quebras de fita dupla (DSBs) por nucleases de corte raro específicas (por exemplo, endonucleases). Tal edição visada dependente de nucleases utiliza também mecanismos de repa- ração do DNA, por exemplo, junção de extremidades não homólogas (NHEJ), que ocorre em resposta a DSBs. A reparação do DNA por

NHEJ leva frequentemente a inserções ou deleções (indels) aleatórias de um pequeno número de nucleotídeos endógenos. Em contraste com a reparação mediada por NHEJ, a reparação pode também ocor- rer por uma reparação dirigida por homologia (HDR). Quando um mo- delo dador contendo material genético exógeno flanqueado por um par de braços de homologia está presente, o material genético exógeno pode ser introduzido no genoma por HDR, o que resulta em integração visada do material genético exógeno.

[00145] —Endonucleases disponíveis capazes de introduzir DSBs es- pecíficas e visadas incluem, mas não estão limitadas a, nucleases de dedos de zinco (ZFN), nucleases efetoras tipo ativador de transcrição (TALEN) e nuclease CRISPR-Cas9 guiada por RNA (CRISPR/Cas9; Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas Regularmente Intercala- das Associadas 9). Adicionalmente, o sistema DICE (troca de cassete de integrase dupla) utilizando integrases phiC31 e Bxb1 pode ser tam- bém usado para integração visada.

[00146] As ZFNs são nucleases visadas compreendendo uma nu- clease fundida a um domínio de ligação de DNA de dedos de zinco (ZFBD), que é um domínio de polipeptídeo que se liga ao DNA de uma maneira específica da sequência através de um ou mais dedos de zin- co. Um dedo de zinco é um domínio de cerca de 30 aminoácidos den- tro do domínio de ligação dos dedos de zinco cuja estrutura é estabili- zada através da coordenação de um fon de zinco. Exemplos de dedos de zinco incluem, mas não estão limitados a, dedos de zinco C2H2, dedos de zinco C3H e dedos de zinco C4. Um domínio de dedo de zinco desenhado é um domínio não ocorrendo na natureza cujo dese- nho/composição resulta principalmente de critérios racionais, por exemplo, aplicação de regras de substituição e algoritmos computado- rizados para processamento de informação em uma base de dados armazenando informação de desenhos de ZFP existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, Pat. dos E.U.A. NOs. 6,140,081; 6,453,242; e 6,534,261; ver também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496. Um domínio de dedo de zinco sele- cionado é um domínio não encontrado na natureza cuja produção re- sulta principalmente de um processo empírico tal como exibição em fagos, armadilha de interação ou seleção de híbridos. Os ZFNs são descritos em maior detalhe na Pat. dos E.U.A. No. 7,888,121 e Pat. dos E.U.A. No. 7,972,854. O exemplo mais conhecido de um ZFN é uma fusão da nuclease Fokl com um domínio de ligação ao DNA de dedos de zinco.

[00147] Uma TALEN é uma nuclease visada compreendendo uma nuclease fundida a um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL. Um "domínio de ligação ao DNA efetor tipo ativador de transcrição", "do- mínio de ligação ao DNA efetor de TAL" ou "domínio de ligação ao DNA TALE" é um domínio de polipeptídeo de proteínas efetoras de TAL que é responsável pela ligação da proteína efetora de TAL ao DNA. As proteínas efetoras de TAL são secretadas por patógenos ve- getais do gênero Xanthomonas durante a infeção. Estas proteínas en- tram no núcleo da célula vegetal, se ligam a sequências de DNA espe- cíficas do efetor através de seu domínio de ligação ao DNA e ativam a transcrição gênica em estas sequências através de seus domínios de transativação. A especificidade do domínio de ligação ao DNA efetor de TAL depende de um número variável efetor de repetições imperfei- tas de 34 aminoácidos, que compreendem polimorfismos em posições repetidas selecionadas chamadas dirresíduos variáveis de repetição (RVD). As TALENs são descritas em maior detalhe no Pedido de Pa- tente dos EUA No. 2011/0145940. O exemplo mais reconhecido de uma TALEN na técnica é um polipeptídeo de fusão da nuclease Fokl a um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL.

[00148] Exemplos adicionais de nucleases visadas adequadas para uso como proporcionado aqui incluem, mas não estão limitados a, Bxb1, phic31, R4, PhiBT1 e WB/ SPBc/TP901-1, quer sejam usadas individualmente ou em combinação.

[00149] Outros exemplos não limitantes de nucleases visadas in- cluem nucleases ocorrendo naturalmente e recombinantes, por exem- plo, CRISPR/Cas9, endonucleases de restrição, endonucleases de migração de meganucleases e similares. Edição Gênica CRISPR-Cas9

[00150] O sistema CRISPR-Cas9 é um mecanismo de defesa ocor- rendo naturalmente em procariotas que foi reaproveitado como uma plataforma de direcionamento de DNA guiado por RNA usada para edição gênica. Se baseia na DNA nuclease Cas9 e dois RNAs não co- dificantes - crisprRNA (crRNA) e RNA trans-ativador (tracrRNA) - para visar a clivagem do DNA.

[00151] O crRNA conduz o reconhecimento de sequência e a espe- cificidade do complexo CRISPR-Cas9 através do emparelhamento de bases de Watson-Crick tipicamente com uma sequência de 20 nucleo- tídeos (nt) no DNA alvo. A mudança da sequência dos 20 nt 5º no crRNA permite visar o complexo CRISPR-Cas9 para loci específicos. O complexo CRISPR-Cas9 se liga somente a sequências de DNA que contêm uma sequência correspondente aos primeiros 20 nt do crRNA, RNA guia único (sgRNA), se a sequência alvo for seguida por um mo- tivo de DNA curto específico (com a sequência NGG) referido como um motivo adjacente protoespaçador (PAM).

[00152] TracrRNA hibrida com a extremidade 3' de crRNA para formar uma estrutura dúplex de RNA que é ligada pela endonuclease Cas9 para formar o complexo CRISPR-Cas9 cataliticamente ativo, que pode depois clivar o DNA alvo.

[00153] Logo que o complexo CRISPR-Cas9 esteja ligado ao DNA em um local alvo, dois domínios de nuclease independentes dentro da enzima Cas9 clivam cada um uma das fitas de DNA a montante do local PAM, deixando uma quebra de fita dupla (DSB) onde ambas as fitas do DNA terminam em um par de bases (uma extremidade cega).

[00154] Após ligação do complexo CRISPR-Cas9 ao DNA em um local alvo específico e formação da DSB sítio-específica, o próximo passo crítico é reparação da DSB. As células usam duas vias princi- pais de reparação de DNA para reparar a DSB: união de extremidades não homólogas (NHEJ) e reparação dirigida por homologia (HDR).

[00155] NHEJ é um mecanismo de reparação robusto que parece altamente ativo na maioria dos tipos de células, incluindo células que não se dividem. NHEJ é propensa a erros e pode frequentemente re- sultar na remoção ou adição de entre uma e várias centenas de nucle- otídeos no local da DSB, embora tais modificações tenham tipicamen- te < 20 nt. As inserções e deleções (indels) resultantes podem inter- romper as regiões codificantes ou não codificantes dos genes. Alterna- tivamente, HDR usa um longo trecho de DNA dador homólogo, pro- porcionado endogenamente ou exogenamente, para reparar a DSB com elevada fidelidade. HDR é ativa somente em células em divisão e ocorre a uma frequência relativamente baixa na maioria dos tipos de células. Em muitas modalidades da presente divulgação, NHEJ é utili- zada como o operante da reparação.

[00156] Em algumas modalidades, a endonuclease Cas9 (proteína 9 associada a CRISPR) é de Streptococcus pyogenes, embora outros homólogos de Cas9 possam ser usados. Deve ser entendido que Cas9 de tipo selvagem pode ser usada ou versões modificadas de Cas9 po- dem ser usadas (por exemplo, versões evoluídas de Cas9 ou ortólogos ou variantes de Cas9), como proporcionado aqui. Em algumas modali- dades, Cas9 pode ser substituída por outra endonuclease guiada por RNA, tal como Cpf1 (de um sistema CRISPR/Cas de classe |l). RNAs Guia

[00157] A presente divulgação proporciona um ácido nucleico vi- sando o genoma que pode dirigir as atividades de um polipeptídeo as- sociado (por exemplo, um polipeptídeo sítio-dirigido) para uma se- quência alvo específica dentro de um ácido nucleico alvo. O ácido nu- cleico visando o genoma pode ser um RNA. Um RNA visando o ge- noma é referido como um "RNA guia" ou "gRNA" aqui. Um RNA guia compreende pelo menos uma sequência espaçadora que hibrida com uma sequência de ácido nucleico alvo de interesse e uma sequência repetida de CRISPR. Nos sistemas do Tipo Il, o gRNA compreende também um segundo RNA chamado a sequência de tracr»RNA. No RNA guia de Tipo Il (gRNA), a sequência repetida de CRISPR e a se- quência de tracrRNA hibridam entre si para formar um dúplex. No RNA guia de Tipo V (gRNA), o crRNA forma um dúplex. Em ambos os sis- temas, o dúplex se liga a um polipeptídeo sítio-dirigido, tal que o RNA guia e o polipeptídeo sítio-dirigido formem um complexo. Em algumas modalidades, o ácido nucleico visando o genoma proporciona a espe- cificidade do alvo para o complexo em virtude de sua associação ao polipeptídeo sítio-dirigido. O ácido nucleico visando o genoma dirige assim a atividade do polipeptídeo sítio-dirigido.

[00158] Como é entendido pelo perito na técnica, cada RNA guia é desenhado para incluir uma sequência espaçadora complementar à sua sequência alvo genômica. Ver Jinek et a/., Science, 337, 816-821 (2012) e Deltcheva et a/., Nature, 471, 602-607 (2011).

[00159] Em algumas modalidades, o ácido nucleico visando o ge- noma é um RNA guia de molécula dupla. Em algumas modalidades, o ácido nucleico visando o genoma é um RNA guia de molécula única.

[00160] Um RNA guia de molécula dupla compreende duas fitas de RNA. A primeira fita compreende, na direção 5' para 3”, uma sequên- cia de extensão espaçadora opcional, uma sequência espaçadora e uma sequência repetida de CRISPR mínima. A segunda fita compre-

ende uma sequência de tracr»RNA mínima (complementar à sequência repetida de CRISPR mínima), uma sequência de tracrRNA 3' e uma sequência de extensão de tracrRNA opcional.

[00161] Um RNA guia de molécula única (sgaRNA) em um sistema de Tipo |l compreende, na direção 5' para 3', uma sequência de exten- são espaçadora opcional, uma sequência espaçadora, uma sequência repetida de CRISPR mínima, um ligante guia de molécula única, uma sequência de tracr»RNA mínima, uma sequência de tracrRNA 3' e uma sequência de extensão de tracrRNA opcional. A extensão de tracr»RNA opcional pode compreender elementos que contribuem funcionalidade adicional (por exemplo, estabilidade) ao RNA guia. O ligante guia de molécula única liga a repetição de CRISPR mínima e a sequência de tracrRNA mínima para formar uma estrutura em grampo. A extensão de tracrRNA opcional compreende um ou mais grampos.

[00162] Um RNA guia de molécula única (referido como um "sgR- NA" ou "gRNA") em um sistema de Tipo V compreende, na direção 5” para 3”, uma sequência repetida de CRISPR mínima e uma sequência espaçadora.

[00163] O sgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de 20 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de sgRNA. O SgRNA pode compreender uma sequência espaçadora com menos do que 20 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de sgRNA. O SgRNA pode compreender uma sequência espaçadora com mais do que 20 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de sgRNA. O SgRNA pode compreender uma sequência espaçadora de comprimen- to variável com 17-30 nucleotídeos na extremidade 5' da sequência de SAgRNA (ver Tabela 3).

[00164] O sgRNA pode compreender nenhuma uracila na extremi- dade 3 da sequência de saRNA. O sgRNA pode compreender uma ou mais uracilas na extremidade 3º da sequência de sgRNA. Por exem-

plo, o saRNA pode compreender 1 uracila (U) na extremidade 3” da sequência de saRNA. O sgRNA pode compreender 2 uracilas (UU) na extremidade 3' da sequência de saRNA. O sgRNA pode compreender 3 uracilas (UUU) na extremidade 3 da sequência de saRNA. O saRNA pode compreender 4 uracilas (UUUU) na extremidade 3' da sequência de sgaRNA. O sgRNA pode compreender 5 uracilas (UUUUU) na ex- tremidade 3 da sequência de saRNA. O sgRNA pode compreender 6 uracilas (UUUUUU) na extremidade 3' da sequência de sgaRNA. O SgRNA pode compreender 7 uracilas (JUUUUUU) na extremidade 3' da sequência de sgaRNA. O sgRNA pode compreender 8 uracilas (UUUUUUULU) na extremidade 3 da sequência de saRNA.

[00165] O sagRNA pode ser não modificado ou modificado. Por exemplo, os saRNAs modificados podem compreender um ou mais nucleotídeos de fosforotioato de 2/-O-metila. Tabela 3. Sequências de sgaRNA exemplificativas.

SM guceguuaucaacuugaaaaaguggcaccegagueggugcuuuu guceguuaucaacuugaaaaaguggcacegaguegguge aaaaaguggcaccgagucggugcu,:-s)

[00166] A título de ilustração, os RNAs guia usados no sistema CRISPR/Cas/Cpf1 ou outros RNAs mais pequenos podem ser pronta- mente sintetizados por meios químicos, como ilustrado embaixo e descrito na técnica. Embora os procedimentos químicos sintéticos es- tejam continuamente em expansão, a purificação de tais RNAs por procedimentos tais como cromatografia líquida de elevado desempe- nho (HPLC, que evita o uso de géis tais como PAGE) tende a se tornar mais desafiante à medida que os comprimentos dos polinucleotídeos aumentam significativamente para além de uma centena ou assim de nucleotídeos. Uma abordagem usada para gerar RNAs de maior com- primento é produzir duas ou mais moléculas que são ligadas entre si. RNAs muito mais longos, tais como aqueles codificando uma endonu- clease Cas9 ou Cpf1, são mais prontamente gerados enzimaticamen- te. Vários tipos de modificações de RNA podem ser introduzidos du- rante a ou após síntese química e/ou geração enzimática de RNAs, por exemplo, modificações que intensificam a estabilidade, reduzem a probabilidade ou o grau de resposta imunitária inata e/ou intensificam outros atributos, como descrito na técnica. Sequência Espaçadora

[00167] Um gRNA compreende uma sequência espaçadora. Uma sequência espaçadora é uma sequência (por exemplo, uma sequência de 20 nucleotídeos) que define a sequência alvo (por exemplo, uma sequência alvo de DNA, tal como uma sequência alvo genômica) de um ácido nucleico alvo de interesse. Em algumas modalidades, a se- quência espaçadora tem 15 a 30 nucleotídeos. Em algumas modalida- des, a sequência espaçadora tem 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sequência espaçadora tem 20 nucleotídeos.

[00168] A'"sequência alvo" é adjacente a uma sequência PAMe é a sequência modificada por uma nuclease guiada por RNA (por exem- plo, Cas9). O "ácido nucleico alvo" é uma molécula de fita dupla: uma fita compreende a sequência alvo e é referida como a "fita PAM", e a outra fita complementar é referida como a "fita diferente de PAM". Um perito na técnica reconhece que a sequência espaçadora de gRNA hibrida com o complemento reverso da sequência alvo, que está localizado na fita diferente de PAM do ácido nucleico alvo de interesse. Assim, a sequên- cia espaçadora de gRNA é o equivalente de RNA da sequência alvo. Por exemplo, se a sequência alvo for 5-AGAGCAACAGTGCTGT- GGCC-3' (SEQ ID NO: 325), então a sequência espaçadora de gRNA é 5-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3' (SEQ ID NO: 19). O espaça- dor de um gRNA interage com um ácido nucleico alvo de interesse de uma maneira específica da sequência através de hibridação (i.e., em- parelhamento de bases). A sequência de nucleotídeos do espaçador varia assim dependendo da sequência alvo do ácido nucleico alvo de interesse.

[00169] Em um sistema CRISPR/Cas aqui, a sequência espaçadora é desenhada para hibridar com uma região do ácido nucleico alvo que está localizada 5' de um PAM da enzima Cas9 usada no sistema. O espaçador pode corresponder perfeitamente à sequência alvo ou pode ter incompatibilidades. Cada enzima Cas9 tem uma sequência PAM específica que reconhece em um DNA alvo. Por exemplo, S. pyogenes reconhece em um ácido nucleico alvo um PAM que compreende a se- quência 5 -NRG-3', onde R compreende A ou G, onde N é qualquer nucleotídeo e N é imediatamente 3' da sequência de ácidos nucleicos alvo visada da sequência espaçadora.

[00170] Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos alvo compreende 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende menos do que 20 nucleotídeos. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende mais do que 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo com- preende pelo menos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, o ácido nucleico alvo compreende no máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequên- cia de ácidos nucleicos alvo compreende 20 bases imediatamente 5' do primeiro nucleotídeo de PAM. Por exemplo, em uma sequência compreendendo 5 -NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3', o ácido nucleico alvo compreende a sequência que corresponde aos Ns, em que N é qualquer nucleotídeo, e a sequência NRG sublinhada é o

PAM de S. pyogenes.

[00171] Exemplos não limitantes de gRNAs que podem ser usados como proporcionado aqui são proporcionados na Tabela 4, Tabela 10 e PCT/US2018/032334, depositada a 11 de maio, 2018.

o ss sl = 6 S RS ss gg 8 3 ss 8 5 8 a &S a Oia O 2 Bo. 9 2 zZ 53 Z=|8 9153 Zz o Zi FS) Cs 23 s 3 - Ts 2/8 é 2 Sa 28 = 3 8 o 38 15 g|3 8 g mw /|38S5S mw |5 8 mM 53 5 335? eis? Qisa? ejas? | O 35 o|8 35 35 Tlo 35 o [Bt Q E 2| 3 3 2 &s = oO 5 0 jo 5 OX 35 < 6 8> 8 835 2/8535 $i 85 S/5 35 3 538 BS? 8 BSB533% 92338 |o 35 S/83s SIE 85 S/832 Ss sB3$ BB3$ [3683 óB538% 3 Ses 813 FS 3/6 SS ok: SS < 85 S$Sg2 53 oS 2 jbpb[38$2? BPBjoS Pri EO 05176 3/0 365 oO O q NO SK os Ko E o 32 0/5 5/0 8 o so W o o 3 o S5/ 5 o N53/5 gg o T|S 2/0 6 & NO &C oO W O oO CC o O = 3 8gE83858lk 3 Sos o 38shb So $$ Z2 0/0 $ FZ2/0< 3 $F 2 </D 9 3$Z2|> e O E POD IE E Po Ej|Pp E PDojPiP SPO SZ ST =X|5 SE Z/5/05 8 FZ 6/5885 3 | 8 8 Oolk|& Es Oo no à o| Po 8 E o 8 am P|o 2 SUP E En PIO 2 8 | nv j< SL 'k< jo E SS Lol E SL2 jo jo E SS LO & o & o 5 O so E 3 ss E: TF o T Oo 32 & 7 o Êo o Êo o go Êo = s ss > s/l Ss | 8 Rg S ZE Sie Ss S = ANE) & 2 v v 2 2 o Oo a 2/8 2188 Sis: Z 23 2 gs 2a| Ss 3 og Ss 9 3 3 o33 o 83 2/3 3 o 3 w|3 6 w/3 8 QÇ SB38ê O 3 8 NnI13 8 CONERICEES) 3 Oo o Ss Le Ss 2/38 n/às = 3 à 38 og 5835 [58 3 Zz o o 2 ES 8 SIS 8 Sé 8g lálo 8 9 <q 2/0 3 913 SE su 82 oÕ ss? 6 2/D 6 > & o 26 = 8) 3833 BBi3z BBi3 BRi3 o | ES 33 Sd 33 72/0533 B[3/633-2|8 Cc o o q 2% (0/5 q 2 SO 5/0 q 2 O |O q > TT|O o SK S5S3T</8 353 2IBB3SZ 2/8 S$S3g SIS = «2 8 92/20 8 PF 2B o 38 jojo 3 $2|o sf a $5 5 3/0 3% 0/0 3% o o co TS oOol6/0 ST Solo K E & <| 5 $ 9So6o|5 o $ o 3 SZ oj<3Sz<| o 35 sB535$SZ|5 <a a K< o SI K<B535 >2053/0 DD O | 5 >oSOI|5 EO E S50 0 E SH ph ES 2/0 E 859 & nK< 8 FLáio 8 FLoio 88 o jo 8 $$ LO fe7) o e o o o Qg - õ o? ê ã ã o GG | o Al SD o 8 8 8 || FE < < < || $ 2 É É É É E & > o o o O |S o o e $ os o Es o E jo Fr | 3 | 3 |o ? Ss o 2 SS 51 = Tê 8 88 88 88 83 — o < 8 |< 8 < & < S o ls Zz 6 Z 6 Z 6 Z õ 2 |g x 2 E 2 E 2 E 2 S jo Es ug ug ug uu

O

O o = Ê < EjÊ 5 < ' Ss 11 7 - Ê — z u E o uz) 2 e g 2 El eREBERBErR|S ic | 38 SE BEE ao o O 7 2 la Jo jo |É jà je do 3) 8 3 [ig 8 8B8I8i8|3 Ss Tg & SCE << <<< 3 FZ Miele zZzZZZ2| o = — | & — | |E | |& |€ |€ E |Y o ug 4 E ó 2 [FF $ 3 /$|;:

Células T do receptor de antígeno quimérico (CAR)

[00172] Um receptor de antígeno quimérico se refere a um receptor de célula imunitária artificial que é manipulado para reconhecer e se ligar a um antígeno expresso por células tumorais. Geralmente, um CAR é desenhado para uma célula T e é uma quimera de um domínio de sinalização do complexo receptor de células T (TOR) e um domínio de reconhecimento do antígeno (por exemplo, um fragmento de cadeia única (scFv) de um anticorpo ou outro fragmento de anticorpo) (Enblad et al., Human Gene Therapy. 2015; 26 (8): 498-505). Uma célula T que expressa um CAR é referida como uma célula T CAR. Os CARs têm a capacidade de redirigir a especificidade e a reatividade das células T na direção de um alvo selecionado de uma maneira não restrita ao MHC. O reconhecimento do antígeno não restrito a MHC dá às células T expressando CARs a capacidade de reconhecerem um antígeno in- dependentemente do processamento do antígeno, ignorando assim um mecanismo principal do escape tumoral. Além disso, quando ex- pressos em células T, os CARs não se dimerizam vantajosamente com as cadeias alfa e beta do receptor de células T (TOR) endógeno.

[00173] Existem quatro gerações de CARs, cada uma das quais contém componentes diferentes. Os CARs de primeira geração unem um scFv derivado de anticorpo ao domínio de sinalização intracelular CD3zeta (6 ou z) do receptor de células T através de domínios de charneira e transmembranar. Os CARs de segunda geração incorpo- ram um domínio adicional, por exemplo, CD28, 4-1BB (41BB) ou ICOS, para fornecer um sinal coestimulador. Os CARs de terceira ge- ração contêm dois domínios coestimuladores fundidos com a cadeia CD37 de TCR. Os domínios coestimuladores de terceira geração po- dem incluir, por exemplo, uma combinação de CD376, CD27, CD28, 4- 1BB, ICOS ou OX40. Os CARs, em algumas modalidades, contêm um ectodomínio (por exemplo, CD36), comummente derivado de um frag-

mento variável de cadeia única (scFv), uma charneira, um domínio transmembranar e um endodomínio com um (primeira geração), dois (segunda geração) ou três domínios de sinalização (terceira geração) derivados de CD3Z e/ou moléculas coestimuladoras (Maude et al. Blood. 2015; 125 (26): 4017-4023; Kakarla e Gottschalk, Cancer J. 2014; 20 (2): 151-155).

[00174] Os CARs diferem tipicamente em suas propriedades funci- onais. O domínio de sinalização CD37 do receptor de células T, quan- do envolvido, ativará e induzirá a proliferação de células T mas pode levar à anergia (uma ausência de reação pelos mecanismos de defesa do corpo, resultando em indução direta da tolerância de linfócitos peri- féricos). Os linfócitos são considerados anérgicos quando falham em responder a um antígeno específico. A adição de um domínio coesti- mulador nos CARs de segunda geração melhorou a capacidade repli- cativa e a persistência de células T modificadas. Efeitos antitumorais similares são observados in vitro com CARs CD28 ou 4-1BB, mas es- tudos pré-clínicos in vivo sugerem que os CARs 4-1BB podem produzir proliferação e/ou persistência superiores. Os ensaios clínicos sugerem que ambos estes CARs de segunda geração são capazes de induzir proliferação substancial de células T in vivo, mas os CARs contendo o domínio coestimulador 4-1BB parecem persistir mais tempo. Os CARs de terceira geração combinam múltiplos domínios de sinalização (co- estimuladores) para aumentar a potência.

[00175] Em algumas modalidades, um receptor de antígeno quimé- rico é um CAR de primeira geração. Em outras modalidades, um re- ceptor de antígeno quimérico é um CAR de segunda geração. Em ain- da outras modalidades, um receptor de antígeno quimérico é um CAR de terceira geração.

[00176] Um CAR, em algumas modalidades, compreende um do- mínio extracelular (ecto) compreendendo um domínio de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo, tal como um scFv), um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático (endo).

Ectodomínio

[00177] O ectodomínio é a região do CAR que é exposta ao fluido extracelular e, em algumas modalidades, inclui um domínio de ligação ao antígeno e, opcionalmente, um peptídeo de sinal, um domínio es- paçador e/ou um domínio de charneira. Em alguns casos, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento de um anticorpo. Ver discus- sões embaixo.

[00178] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antíge- no é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que inclui as VL e VH de imunoglobulinas conectadas a um peptídeo ligante curto. O li- gante, em algumas modalidades, inclui resíduos hidrofílicos com tre- chos de glicina e serina para flexibilidade bem como trechos de gluta- mato e lisina para solubilidade adicionada. Um fragmento variável de cadeia única (scFv) não é realmente um fragmento de um anticorpo, mas ao invés é uma proteína de fusão das regiões variáveis das ca- deias pesada (VH) e leve (VL) de imunoglobulinas, conectadas a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é geralmente rico em glicina para flexibilidade, bem como serina ou tre- onina para solubilidade, e pode conectar o terminal N da VH ao termi- nal C da VL ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Exemplos não limitantes de sequências de proteína de VH e VL que podem ser usadas para criar um scFv anti- CD33 podem incluir a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 65, 77 ou 89 (VH) e SEQ ID NOs: 66, 78 ou 90 (VL). Em algumas modali- dades, o scFv da presente divulgação é humanizado. Em outras mo- dalidades, o scFv é totalmente humano. Ainda em outras modalidades, o scFv é uma quimera (por exemplo, de sequência de camundongo e humana). Em algumas modalidades, o scFv é um scFv anti-CD33 (se liga especificamente a CD33). Exemplos não limitantes de proteínas scFv anti-CD33 que podem ser usadas como proporcionado aqui po- dem incluir a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOS: 54, 68, 75, 82. Podem ser usadas outras proteínas scFv.

[00179] O peptídeo de sinal pode intensificar a especificidade do antígeno da ligação ao CAR. Os peptídeos de sinal podem ser deriva- dos de anticorpos, tais como, mas não se limitando a, CD8, bem como marcadores de epítopos tais como, mas não se limitando a, GST ou FLAG. Exemplos de peptídeos de sinal incluem MLLLVTSLLLCEL- PHPAFLLIP (SEQ ID NO: 162) e MALPVTALLLPLALLLHAARP (SEQ ID NO: 121). Podem ser usados outros peptídeos de sinal.

[00180] Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou domí- nio de charneira está localizado entre um domínio extracelular (com- preendendo o domínio de ligação ao antígeno) e um domínio trans- membranar de um CAR ou entre um domínio citoplasmático e um do- mínio transmembranar do CAR. Um domínio espaçador é qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que funciona para ligar o domínio trans- membranar ao domínio extracelular e/ou ao domínio citoplasmático na cadeia de polipeptídeos. Um domínio de charneira é qualquer oli- gopeptídeo ou polipeptídeo que funciona para proporcionar flexibilida- de ao CAR, ou seus domínios, ou para prevenir o impedimento estéri- co do CAR ou seus domínios. Em algumas modalidades, um domínio espaçador ou um domínio de charneira pode compreender até 300 aminoácidos (por exemplo, 10 a 100 aminoácidos ou 5 a 20 aminoáci- dos). Em algumas modalidades, um ou mais domínio(s) espaçador(es) pode(m) ser incluído(s) em outras regiões de um CAR. Em algumas modalidades, o domínio de charneira é um domínio de charneira CD8. Podem ser usados outros domínios de charneira.

Domínio Transmembranar

[00181] O domínio transmembranar é uma hélice alfa hidrofóbica que abrange a membrana. O domínio transmembranar proporciona estabilidade do CAR. Em algumas modalidades, o domínio transmem- branar de um CAR como proporcionado aqui é um domínio transmem- branar CD8. Em outras modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD28. Ainda em outras modalidades, o do- mínio transmembranar é uma quimera de um domínio transmembranar CD8 e CD28. Podem ser usados outros domínios transmembranares. Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8a. FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLS-

LRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC NHRNR (SEQ ID NO: 125). Podem ser usados outros domínios trans- membranares.

[00182] Em algumas modalidades, o domínio transmembranar é um domínio transmembranar CD8a compreendendo a sequência de ami- noácidos: IYNIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY (SEQ ID NO: 163). Endodomínio

[00183] O endodomínio é a extremidade funcional do receptor. Após reconhecimento do antígeno, os receptores se agrupam e um sinal é transmitido para a célula. O componente de endodomínio mais comummente usado é CD3-zeta, que contém três (3) motivos de ati- vação à base de imunorreceptor de tirosina (ITAM). Isto transmite um sinal de ativação para a célula T após o antígeno estar ligado. Em mui- tos casos, CD3-zeta pode não proporcionar um sinal de ativação to- talmente competente e, assim, é usada uma sinalização coestimulado- ra. Por exemplo, CD28 e/ou 4-1BB podem ser usados com CD3-zeta (CD3C) para transmitir um sinal proliferativo/de sobrevivência. Assim, em algumas modalidades, a molécula coestimuladora de um CAR co- mo proporcionado aqui é uma molécula coestimuladora CD28. Em ou-

tras modalidades, a molécula coestimuladora é uma molécula coesti- muladora 4-1BB.

Em algumas modalidades, um CAR inclui CD36 e CD28. Em outras modalidades, um CAR inclui CD3-zeta e 4-1BB.

Ain- da em outras modalidades, um CAR inclui CD36, CD28 e 4-1BB.

À Tabela 5 proporciona exemplos de moléculas de sinalização que po- dem ser usadas como proporcionado aqui.

o u o << e E | ÉE3S8 |É KR = 2 E sos o z õ OE O Tm 8 &$ BEL L O o Fr ã z 3808 ú o < O < $ < GSE = S cEsêE | pg õ SEL és o Sã cosa ç É Õ < 82X 8 2 8 S86ES | o És) | oz | o oO OE ÉS oO gg. 5 < LOO u er Oo SE$0O o o Z O K O O & Sel js | Edo iz ; Sol o | 6o08E | R < uu 3 0; EE SE x S &S 5 $$ o LS 8Z2EK 295 & - $Seáéigzae tg ço | 5 XX oI2/ 0 ca SkRr O 2 o < DE m|=Z < $ o a so x ESBSSRRE32S ES < < E 7 0 0 DK os Sos SS) BexES DS 52 8) dsBíisSrESS TS ES o O << o SE IX E 8 Sis $E/8 Go S EFE = SMP 2 Ejo 8 Z/ 20 //8 5 SE sSESBSSSa ao a) ASH ES EBISS SS ER 3) Hárk É SESIESEGIBESS 5 nm S E E SI< 5 ro o < Or < |O 8) E Ss E36EIsss sa 5 E SsbooxmES GH SS aZXio ke o E IES EK PS ázia o o $ E/S Z2|Z oO oO zoo Ss co PIGS2S 5 EE|S > E Z< < 5 |O o 2/32 9 Ss / bSkg|EoSTRROFPSO Rg S <€ S/S jo o/HFE ROS o ZÉEIS E EEESSERSSSS8ES a eHESGSERZCGSIGIGIS 5) ESERSESS ISS IE o £LOIGIE O < O o x SS x So Io o|E < Z > |E o < O E < OR SSIS 43 O ERES a o O O E Oo|X o >= O ja Q O IG O Oo O << Oo(í oo o = E É ET < S 8 0 03 / 0 << EE $oS0 x 5 TX el lejo <E or HH 08 o00oBriK O s El EX o EFE OoP<ek| 6 |< es x |$ oo < So o |O 5 [3/0 O O lh Sô EQ TF FE SRS ESSE T|8 8 8 E o EP É 5/60 265 ZE 7 o “ Ff õ Ss mm co N o o ao a o 2 88 7 | à z E < O ) 8

> : es Oo Tx

O O oO Oo fe) = o | rHo2oo O rc Bo

CE GISSSSSESSB v SE SGOEOCOSSOo Si SB Go O OO E X Og om =) O r5$o << 2 Ss 3 O CO o 3S0O8Oo cos E O coSoSC2Lo0GEros 5 3 = Oo oco íoc co? dzZwos ss 8 E 55BSPSOG205a5TÊ O 6 DOS E << 00000 çêÊ 3 EXE EFSOHEOOoOS gs Ê oO $ o o & 5 Ss S$OKHO < ss o oO o 00oOosSs e? =) oO ocEOo<BS O 8 8 E É $665o SEE 83) SaSssS5SSsS nda 2 o LLO OO RE opro< 8 o 8 rs O K 2365oO < O O q SS à o cLEcodBgHIAÂ COS SS 6eE) BASPaSseSSSSDS SE E E osgreigo 5SOE TE E Ss ESBFGINEFIZESEA RO = o o EoOoO o o o 2 << O Ss < EE oo a É E o LEO 8GOor Sã os); Goscetásçsesos Cs SGEAESOSHOSS TB 3 E BEscGeçLessossat cc => o Es Soo 5HSronoabos 8 O BSS RASA SES &S oO Oo <«LOq<q PSD o Ow5wIIGIÍOO0GOE 8 e os ES O eres sos E < O O o < Õ o o É EESESS 25 SE) Besstasessiss: õ < 8 & LL 82 PESE EDOROS OoSS So o SESC OEEOSSS o, S&S É ES o 8 5 < 3 o mm o o O o 2C00o O o < 25 o O obcstgçoS$oo oe xocSã? AO EP SEO O0O00Owoa<gPesã Oo é ort$soSgsáaHrHooP<OoE38 T < Rr < ( K& > eg) Bescásossasdoss E o oo 2 0oOo EOO or oOoêS ; CT o 2 ES o k O S É PO, OE 5 < O <ood os < = sã QEE OO < E SS O E Sis (SS css ass o v oe PRÉSE o oLE LÕO GR ; É > o << E E 3 $$ Gêscsoosa sois 8 og Sig SER S5FRESOSGO SS 5 3 so o oocoocogxso0ooros SS. às & o 7 E< So o O Aos o so EN ; = X Ss = É an = o z so o BB 7oOo [EN E ZTS XP 5 2dcmwo $ ES x o <a SA E SS xX0 oO Fruseo DAasOoO

TE Bo = oO < Hr Oo

GEES SBC SESSS 3 ES gooSDSoEEÉEQ < O E O EK 8 EFITSTSEZICZOOCÇWÍcÃo 2 35os Sô moaoOoOod(<Oo<L SO = > < E 32883 gS>26 gg ao5õáteodgocoo is; 3 o oO 2 386 àqge FE SEOOOHO < E 33833 30000008 283583 8ESP ego sos 83 osS5soreaço sçtosk >? O gg Oo So É Ss Rr < Õõ Ss oSZsôoS88S SITIOS OOOSOFR & 8 ZoesTsosgosoo2Çogoodoçooo ss oem agE E SDOtLoo<gáí< Rr 3535523585 85 E SPISSTEstÇa dd O5O 2 9 oO oSo = = f 3 82385688 SD OSOo0oSDSogçomoíL O < < õ< & ovo Sos? ooooàO or oO 3 Es oS$Saoasooes o? Eoro SESDEC OR ros Õ 552888 SHOES O OS SD722X8$8TESSSEITSITOGLRORr SO E 3 Togo goês FE O õ o S&S POL E [ SSH asso SEK SISGÍIE So 8 gos oPESTSGEHE OO OO 823 Saragóso to oEaS = o o 3 o $ 233% EidoSSÍrHoS É 452 3$3S5EdoS Za RHOO 8 o SÉ çgçmo?osoEsEooOoOoHtr O E 2 28525325 3SEÇOoOS SHOES DZ ooásosçsoEorsaocEoe go é 3 8$8STS3ETroREZHOO q SS3 É Çgoom DO ÇOoO E OO q E S < PES gaos Sica dSdaÃo 6 É So 8 DP 5OO < O O $88SSS SFB EEaseroo 20% >og8 oOSPmoçdo < O O o Oo 23 So TE àmSOSO<LSTO Õ & SO ooOo2QsmRN go oOoO”o oO O 29283 arerooissos q E 5 dg oômoOoos ç oO < XX oOoOHE 2 3 Sos osSassoEgeaçgoPo = O o o O? = o O Do DOS o 8 o o O O oo & 8 e ooo Fo sSoçgokL COS 82 9SP3o3ooSDo EK << Oh H o E 8 go o H 8528 oS os SS 3a s 3 8çgoSoooSs5erk OOo OoOoTO o > > S DSO ODSS QqEsoooOo ) o O o O & ooo | o O Ss é DS Soo o osSSEod|L Z O | 8 T S 2 < SEXO 2 $8aPTPPESGZShHHSJOR > So SS 2 5 28 $O < O «€ <q O KH o E SooLS se osboo PALO É O E O Ó $$ 35 BEBO WS bsbOoOra<PrroxjZ o < < RH < < SE sessabeasiBssSs5ãoS cos coorroetrsaooçoo < o = GHEECLOE < OS SEEESGHGÓORHSOSE O coGIHFOogWFEOSEO <OoOoFErsá O 2 O o EO o OBTER RE o É o o<L< & 5 es E O E SESGLGTGSIEaS SS < e Ps$coo Ecocdaogo o o<SL $3í£ob 56 <P<O << SFoPocgoosSFPeliocoo rocoooodLsik < O<< < Soo coaozgzoo or aos o cl sgos IoOorHO<TLEOSOS ocosoofs ião E SSGLO58ELZ 5$o9ESóS geosoesrossao ssa ofFdooÇUeNõNráaokSoRS IS oOL<aoserogsoosdofr ser Eogosrorgos doíxi ES - oe ortsgodgoHro

SF HROOGSQREOEO SG OO ol <Eror Ss o << o O 28 O 5OoOSogZTSEo2LASHÃOE Fogo orroSgaha <Or< 50 8$0<4 o SC oSFOoOoSFTOO0O0OTO ac STCIGEOSOo2LoOo8XRO O E SEXGOOTO Õ ENC & o sõoodooitoddoSdET<< =. É OE GO < Oo Oro ogro õ <rEgooeõ& SErO<FOOOSOOOHF SCocroatrto<sa5hFhE $<00Hoo (CC AEGSTRE Sos oSO COLO XxOOO o Oo<LX CLE E OK O Oo cESRECSILGISS < OO o K ortcor2gãso (e) SI OK CEEESTEÃSS SIT<FTITZTO0S õ < CS oo ESDGLEOEFÃO ok S$O eogçosortk << o 3 ocro2ooçs SF E ELoZoSooFEZoBOoOo0oEfEocorj o<orhõgHOoOCrooofo < O O E OoL£o o 0doHEKrÃ < SHOoLOIRO

CF SEROÓSGIGSSOSS ER SO FEoosErçóeoosSSs Iodo od00dc0cgoSedososSSCoo0Hor OEKEEXXSO OH O o 8 20<$Ç0o ESocogçoo Zoo ESSO orrHr O O << oroÉEosgs<áE

9000.0283 o(Ss? SFooo28o EogPegasoSs FoSCeessa Corgo l cogeo 900o0oSG< <o 22H05 OSSO o o&8eo o or? o gçgoeo?< << OS 9 E epotocoroso sí osoreodarso sorEaHhFooçweooosrNrEsaeodoeês É Foro EOrO oro SogFosocossoosSISSOCHEH ORE OZ QE O O oO < EE OSS Só g<SSSHO ) roçeo Ss Õ ooo g s PSoFríágçoçooSdo < O 5Lo 2 O o Fr < O << = 00X 2 Oo S o O o o OoO$ooHr 5 < Ss PotrêsoosSLoofozgos 0 o ?9G6S i Esso AsçES ASR & ESSSSGIEESSGESQLIAESS

TR o o < o o ooo

SERPA REGESSOSS o b5ob5o << |õ6õ EE OL ESSesSSoôS o Sgoo << 2 0O O < ogro POSgsaD2d BROS ESSA

O O É O O oO 8 SESI ce Ss o <Q SEFOSk o SSITSÍ<OSCO

SEDE SESLELSHOOS < O É õ < < O Logo Soo SSSCEoo << BF HFPBGOH E OX ok ooo 8 o ox rHOokE coco osS ES EEoOoo <ecgrasãoo ESFOorkgçõooos Ooo E E EO oo Er ORHRO o <E<< O o $oOF o < E <OS oo? E ooo sos o oÇSoLLtãoS ORE GO os 8 <0o3SõOo Souorescrósgo pEESGSSEPOE 2 O O SC rEsRSRSZ of <a ltogoOos5 r5$ogo 9O00o Ogg oORF O O OoOorHOoOrKr <A O f- Eoocosgsoão <a Lorocedo BEZ go < < O E<<E COSTS OÇHO croSsosso brosggaoaroeê sos ococfóoçBo o 200Ss coSsorgSoBGPBEofHros O O <XLO O O |K < o E o CEGO o4< E o < 8 O 2 o

FESPOSTZ ESG o Õ 5 o < CoosgoLgFoO oco oocgEroSbDo o o2Loc0cPes < & o gg EO cSSEoE o seo Erasro Oo Oo O KH O < o O SOC OooO FO NFS CSIGa<sOoE

OE RO ERGEE SEE GS $ ESEO ES Ko E o 5 o Si5S5arscabSEs5ESs O < sS<oráaPeRS 5OEos < IOF EILOH DIE 200E Ss? O FE oc LIGO S<4050o0L4toS o8Çoçc2ggãOo o es fot SS o 83 Ss E É edc<qoSõor O $EOSO SGbhLIFÁPOOOO Eos 5ES eBS<SESCROXO < LOCO < o SI 0OGTOÇOROoOXOkZ ocrrosor ado odor sos cocos Sos soHEHOLESOSS ESSES SIESÇeZSAPGOS SEIS <rLoQoSS<O OOo S<GT8GOS o E<sroo os HNOoSGASGASoaRoOO <£ O < oro dosoZgooh co LEArósosgroópoeos 5 SES550000 35 LOS dos OB Posts ooo 5 o << oO ss pbpeocrrSOHWXZORPOSÇGOLRORA o O OO < O << O O KH OQ & SSB SBD 8o8s Ss OE << O soe ds08GEroosgo<? 7 BIS sogriítóáoo Ssrass a pocos EeocoftfbobozoPeorPriko

E 3 3 8 T co x É $a 0 0Oo

BE <o<aoS$orosSg E o - PES SSCLESSSBESE Bis É < O O O E 5 o < E oOrK OO crottkoOo (UENORNS) co oroóroztrasea68G boo $0LEos FESESGHOEHOO E EZX o Q< $ OO ooo gsge O OO Õ dO 0000oo<íf SE 000 -- OF oZgEEOo<SOSZ O EE O SECGERS socos COS < Õ 4 OOo < < 8 < E É E<5o8odooocoSsosookÊ 5 ooSGgoerodsgoçsosS5hE o Foto sghror aos A5Na Do ao Ee oeoçoreogskê E o OOo dE GCOGOES 986566 so É - TOS TETÇORO 28? Sosroeosgçãos << E X<o S6S5g5GIASSad a as | EO cCçcooSdsR go O GOO o RE O < O O o Oo < OL < o o? oO << O O Hr ESNO) oPpdãaooêS 5HSO<o 682 Oooroeoo 2 = 25 O O go oo P oso8os 3 O00OoO E O E o So HFE o O K < OK o RCE o 002% oOogo8%o EH REO o8GEOAGAO OSSOS kKMao FoeocrcsgoscrosíssõosSo E E Orar oço E SQGEE OOHK o K E OF o Or OS E O o E coco odosfos Í<O 9oE SE EHSSSSOS SÍ FIOS OoODOos õ ox o 85H 0oSoOSOoç5Noss serao ltgçaroooosSsoo S o <o 803582 osS 5|E E cErotgassos so 5 oe & Eras ooSscooESTGOEE OS 0058208 roça o0or 2 E coscsoersoorossareos << x? Ok ox <SO E EX6ô cHroPeosdosSSo e sócoboko SSB rEÇSES SSH É o 52oO <00$O O E S8TZ 2 E 090 ossçt É O6EFNrFOozxXK FEOSOLO|O < $SOooSFCoAoNromzsoPOGSHEIIEK SE O 2 o SESCIGIEZSSSEZÕO RP 5 rcoodd(< O O õ O O Oo ER |O 4 <F<LoÇorHorosoSdcoso0ET<Z Rr coSsooza o 0dosdá oOE|S Õ o 8288 EEFáorSOS/0O606 o oESooEE 2 o862TOKHHES r$ oi srtossecosNFerosõo ole osSsiloorosSs 2$GHOSE osogoPrortescsissossEes oF<aGLoressosaçoso õ < s OÕ O Og oõOo HR 5H OO o Eogasforaos gosríbos6s E be eocsfrao toe SsriáosoEek?EêE Ss o o o o < | RSEsasso snes add: é bpotftosxzotoooxocococo| o FEo <

IL o x o 3 õ $ 5 Es o as o OÇ7o o 8 28 5oLseç cer sBagshishE: o SFÇIPZÇORSS TST

CELQGIÇGOS BESSA STE E oSGSB < 3 $ 33 QÇgoSDSGHoO o SS O SS < 15H ossos Eos SOS oo ortosErosgss$ ses? ogsSHIGGHSO DES S SOS S o E o > 8 530 RSS SE Sa ESCASSA: O O oO MW = oO = oEêE SESGISGIESS SAIS BaE OE SE SE S<S É 338 SOOoOêÊSS $ESCOSSGOLSRASZSSRSSS Ego ex os Sã SEP or Çogx<r ossos ooóbrpososskt O<S3S000<b52ogStmsSi gago FesçeegroôsSsoSasosósa O E vw o ss % fo oapESSCoeLisaoçBEBSSDEBt

SS GGEASSOSSSSSSESSSA ESSoQRgoSNAE STS SST STE õ << EE O O DEBOÇR To Omo SESaSSSoR ad iss <AEoGSSGHFPROO RS SFRESEFSSOS SEL S5osBiSaD ata oO E o o BIrsconçõostsa sas: x o 8 <oostooSsrssasisos SSB CIHESOOSXO &o3s SEL EsS DS S$ Soo oE SS OESTE

Ô SEP HGS SRS GS SE OSS Sa: <<srFgçogkÊ 2 SS po owos SR EESô SE OgÇoHrE $ bos ooo <<oogsosrosssaogçgsbaoSS

SESGOE AOS SEGA ST SOS 5832552282] dB oO Too o oO o SDF B3BTX3OoOqgomgo PA GoGwOorS ZOO ESSES 3 cart oSLSOor sas aosdsgo Rr < O o > o bo o SG OdooSsr od asSã3ooso3SS Ccostroodrohço soe ggaossao 3503085 Sósia go 600 <ZxFrk ex ES SS SS s S5DESSTSSSH EIS STR pELCSEE2SOS Dao ass orazóosoghassssóssôsa o Õ Fogsgo O 8 qo Sos mms = o DD | o o P ESSES SASHAS DS BGE Sa o o ooco<<oO0oo0orossos3asãsoôêscão

UE 3 o o o fes) mM

Z +

== O oo<í HE O o < < PBSSHAS Sa ada dddE É < 4 O E << Ed oo <ooo o Oo E a > < O 3 Oo q<o<dLKgroogos SEER 29H SroodocooshtTidoo Si Hr Og FG EA GC ORLSGO o Soab SE QooEo?ooa<E fá doo02Ok ss oco EOO o << 3 8 ooOoooododoxdX so CNS &ooOoHHKHHrtrooO o Oo Eos OooktE 3 Sorooo4sL od ood<aráaoxL o se rezo SsSwoB<aEooOoS? O? DEÇO0OXO o os do £ o0Oo0OokE > O oO OE O E E 3 SOC oZzooçon? oroídio E EO LdL É ro <aoooké EP Gresdcssoroo ossos 3 o $ o 900000? Biboisíoaososo aos arS es 38 < o E O õ O E < O OoOor O ES OSEror FECÇoodOoOoLÇOSoSLe o < O o e ECC rooco BAR OErooora 2 b<0O o <<? SSRÇOE OK OO TOGO ororgtEosgsoedsês E 3 S0oO<<S oEFosrocíoZoHio SE OO Fe5SS - < o $Oo 23 HEZO SESGSO É E SHBÍHZO o o H< O O o o < <q OoOrro oO Soo 2 oo o o2Qooo E O < É SEE s Ss SSESHHBO <ErEgoo É s3O o o q<O o E O SS 3BSSORgHOoOoE soros 2 FSC a5osEaásastroads 2 8 8Oo o E Oo SOLO gEOOO 28 00 Z2oOo $F 200 O E < E sos $ O < Be O E à 8 o Oo $ oO O OErHrHO 8 oO rdáo < o <Oo Festçs PEÉO õ EO o <L oO O OO 2 p Bro Eogxoodor$go v Q E o Oo HE E o Oo oro o & EQ <E3SPoFt o 204 Õ SE 0 9 SS<Oor ESQLOSO O & E r Rr O OO <L,LOHFR RE O 38 5rGeEraFoo 5soscessos 3 ss > - So o fo) q O oOO0ox E OO oO K < E O SETE ISOS SOOGEOSOGOS 5 EO 2 B200O O 2 O D00Oo o << | o O O O O DS 5OO < O o0ÇoO EFE CO O E o DD Oo o o cBSBOZEaAS Pr POrgododgo DSBDO <oodtoõoor QE EP oo O É << O O (OBNCORNORS TEN O à SSOoSsoOo ã o E SG < o E GEerêo S$oOoSor 500 oOo 3 oo O X o E 2oÕO 6 RÇo <XZKLOoOGESOCOLO O SEL Lorosoo o oProoroS6S ES FOFNLEOSOK<gEr 8 SE > SS o go Ssort<HOdOG SO oEtodoçoçS E Foro Do EK << OR HK 00 ÇgÇ2Go04o o OS ÇO odor Ooo O E SO õ o SO K < o << <toS O OE s g ES roo o << do < o Oo 8 O & OL oO OO o Fr ÓO HK O o 6 &=o?OS o o tão O <O E East or socorro saegrtos o 8 S2PA<X cs < o EGOE < O Oo 2 E o E É z SSBSS oa osSç5HêR SE é RvoaetstoôootitkzFErEozi$0o0000kr o < O Es o < Oo < ot O o otEo8rão o o2o 6 2O0o< 5 O O SE cossoothtoePrgareaseos <SZFGE<KFGLICORT 2o<sL O KGO E < o O<OoOor< CO o o 2Q<Oo O <SO 2 Bodas 202522 d sas: o2CLo<od Ox FRESCOR o < <s$oo00oZo20SSSSE SPP CN O E 5 E So arsosssrátoroçtis <SsSPoSoOOoroosogossos < O r E O E << O STEPS Ssic caso orosEosz SS <OoOoSOS ESSESSESS 5 rosogesssõos 5 8S$o doRZGZO0O SHI SGOPCTRO É E Ó OEroçgGSgoO o << Ê SETE qc < O 20 r ço <EOLeoSsagraraerask? rEr<ao<gx<ogHKO õ 200% oçoS < OoKK << OO OOHK $0OZ0900 rFOooogorooroo O XOEroôo o oOo<ií SLSOOO<LOSÇOEOLO S Hoc atEOH Lo OSSOS o o s < K ã 2522322338 53285058. o O o <L 2 o o oO < 0 O << E O o o E 0 005 E E<1208G<0006 oeoooLthóLOoE O SESGSHOOS S5HoOSGOFEBEZOS 585 E << [OBNSENS) ST oSso 2 O ofocosgósocíioo << 0OS<or ossos tosçasosEdão SEGA SROOSSNEAGOS5SZ <a FCI EFLOXLSFGOSOLOSSE So 0çÇo20 2 Ooosros $3r-E$S5o580855heB E o o O OOo 8o<ÍosSo 8 go 8 o55B$00SS5OS SO oo oSoSCaoso5sSoSrh cecsocoregçorortoecocockor FEesgosrostoeçoosek SS CESSNáCOrsBHDa 23 SE ESGGroO < SS SS o SÍ <ooO Poa ág dd ) PoSsIIHrSOI OSCE Oo00 RO oC o8<00 0005 E O E E EO I<oÇHG<Koo<LGFE o ok socos oca ecoos o o SGT < É É Foo ar OQ o ST Q cEo Fog SOCO HTO E O S STE STSOO E OS 5 oO o << g<OoOG<Í< fíErozoos o E & < õ Oo 6 EK s O < OF õ > 6 oO o O rErEoO < E O O O << O é Beoocsnásssrestroscçi o <co<cosZoOoOrororooooo0o€<

Bo o < O or DOT g£ox< fo < 8 SoBaÉBos c388ó85oO < o ST EE OoO< É Os S O S S<SOSO SESSOS O < SSSS5BOSE O 5 2 Õ o 6 óc0cOO SG SESS S oO Or OoOOoK ooo od & 8 O SETTE SG OoS < < SO S<ocoeotbs FEED O Cos c<aEroaodOo FEB CSHZSôO Õ ohrOo<LEFGELSOO0OEZ OSS Õ FOQGHWHOOSGrOobS o O2OO Q o O < E o o O E O O g oroEtrreoro < Ooo o O £ OCO -. 5OEES oo SLHrHOK OL E <oo FO O<TCoO É SC BEFHFEGOROSO e8G5ES O P S<E<QGSO o És E OSSO < SST SIOROEoO = E RO S So<soogoorelioooio o SLESOEOÕOS oBS$o5oO00O05O Õ Ss O o E SESOOSO ooo 8 O so or FEOSCRO o bSsocgGssoRHrogoosasois << EEtEoosSsGIÍCE STO S OR Solo o<S$dãL OE <LO Er <o90o oo rogo ooo o8GEoIO OO < EZFON<EFHÂctooSsro = go o CcoOogGSEoEraro É Hs ogGresesgs EFERPROGO CI FSIÍIECHEGEócoSsScotçooSjsS CeBSESGCLALOÇGRLOXO So $$b509583 so 8 ESSS 8 OS GOLS õ < Õ E 8 or OoSCAoo oro oo E lo O E o áotliádoíÍ E BOEZEFrOo 8 o Eos õ capo SOo OE Hto8gos < 5 0 O <P < ess ESSSGOSO fr KorErotrosooodogErkE SSB SES5EASASCASaSE < oO 2/0 O RO OESTE L <A o<<E EXLKHOOÇUOÇOO o oEHEHOP OSSOS < Oo K STE STS 5004 o FE GÇAERS CIT IÍZGOREE SE SSI HFOSAOSOS Ez corsa o ooçorroog SirsgEÊE <bS EZHOSGAOoSOBSOCARO 36h35 SESEO OS sob osc3GI o sI<o LTS SE SóbpEHEKERGoQro osso otsoç o o E co o <gwoooErsosgotHhO

E SE ZIFOSLÃOLHOSOSOOL o 8/5 $oco3ISTES OEOSOOEE K oo <olCLoohrPoLOodxE o 8 o < 80x OoPoroS<Sh GE $ 285 Sos oço8GSOo8E o o SF 5 << og 2 o Hs O 8 |O O O o E< 2 Oo o e jo osoooõPerjs E Ss < |E É K o O < O o KHE 6 <SIOOÇNGFoodEoS8So o FE s <LC< 020009 9 Oto (<TLroO EZXo S SE DO O O fe o o < $ BsBscescstasncsSHeE o KHopoxzoProrzzoocooTogsoro

E 2 S 3 8 Ra E Zoo oo o o 8 - < - - 2o0o020o So seo Bais23 2 E O 38 HFogrdoSsso E o r$ O Ço0o0o E $ o og oToo og okrkisoSaS oco <<á EP SS OSCOSR < $SO$O0OEÊ 9 OG O Eos FSGSÇGS5HEES d006o$ob? oe sx o O 00Oo < É PR o ovcLo5o E O O O € O É oo? s o < O COS o8s << E O ESLSZSOOS0O oso88o Ds oe bnrEeR & oo < | o $ 85 o SS ES $$834ó oco BESGBGO < O O oO oO 08009 E SSLGQE ooo íL 238oEtso sos <oorogIES SG Po<SHOS E <q OE O <<o0oob5 EF$o do SEESSEE 5OErr So os O 20565 o < o e ot RgEO 65 SOS <aOoOSLO6ESODOO<E CSS OZHFGO SESES E oodo Oo < O <O O < E $ ER OOHRK E XO so 5 oO Oo E o < FE o<fFEE 22E O É Í<o 8 o << Cód o Ergo S SO O E << O S<Éo É < O < O O E E <oo < o E E o LEI98RGO EFOOOCOLOO o eErEÉGOLRS cFsEooCo<ZBr o << 2o < O 6 <rF OOo oOoHrdá o & o E EOÉOO O O<Oo Õ SEE <Z Soa oLEoSsodaçrEogoos S<Er SEX < Ss CÉGEAE O PE < << O sê são O 96Oo EFEORFKrSSOS < Õ EE OORLEKRSZ orooP4ZaoçoEKHOo<<OOTFEÉOCPRPRO <ocdToILosoocE GIFS SOOSTXO GESSO HNP ONGS SG OO0O0 OE casco fooErro CroErEEERS < TF 0OOLTOo ES SEESSSSS cosoProoriergokk sos << oO < O OS CEE SEZSDORS STGCISEROEZZEEZS O RS o PosgsocsaoNESSE O PREO RT as ot 3GELS SESSCOEÊSR orsogqE5orsogoroos co o<TIBHKH OS <oOoroork? O EK O E O O oO 6 E < <$ S5SSZOP ari ooçoorOo

CS EFRERISGL GE SOS LZHOOORT oCocroOCRESTIOOSGABGHSEOZO < < o EO o SOoçgo os SG OAGHSAHOSO EZGSGObS5 o SSSEiãosS SE FTSE SIS SO Sõ < O < O Sr oOoGOSo E <E OP o OS < a docs EdsscE dass o <OSOSC SPO OLX O o o LE dá Ss ESGSGOoOEHEOSO|EZEOEa o <E S o Õ < < O E) < SOFT EIFOSO HOT SFSO > KR OO Or < << O (SENo) o Oo EK Õ ooEfk ii rrosite ooo Õ <ES GS SSESGSSCHRSaS o o o wo x 8 <R

EO

O A DO rg 3 ops EmobPog Ooo o <a 388 TESESSP ABOZ ESSSSSSSSS SAR ESENNA: 2 3$ 323758 ssrOçHaÊ KH 3 829 os oe oork a E o Sg>as ss ssogssmo2sosSo o É 8b>S$5og3sosoeo3S E OoOoSo?RSS E PEDE S3 ooo saosooro?ososSS PETS SS ao BEroRaro

CS SERES SSIS O O WS SS 5g ào+TX”oE Oo o O 8 $$ o&gom FE DE DO OÇG O 8 ow ocçooo>oooEroHL S355SBLSóEEESO 2 $ 6 SÉSpIóogossoksoLsOSs 33 ESSES: SS > &ês | No) gg OO [= O 6 &s gg agossesSZOoOS ob < à 2 PE ooS DBO É << 0 $5$SaSSSSaTaSsOOadooS E fe) SS DE TOO LOL < 8 OST TPOm[|M+Ss PGE O O LTS raSHn Dar HE O qe os STS ÇGOoS QoS ês E OO oO SO dE GS O E O POOHE O 5838223335 BSSShS $$ Wo qgoEE oO 2a SESSSSSSCNENE NNE: q O &% ooo mo ET E Po < E Õ E 2 g9SS oo osZ oO SGO < o DE 2 8S8soOooSoÇg 58 o o 260 q > E S E O 5o E 2 OO Õ > & DO2 o D$ 2 PD < E cg ScsSesSSS Taça co 8 o 2 8 PE 5 à 83 o>EOHr < O 8 8 36d gsgsgssosrosSsrz 283 SoO8É Toa çoroRo É ssa SS SI5HOS SE o (o) E | So o o 8 $S2PgÇgSs 3 o EZPESOSOSS 283583 STis3S BOSS X o QÇ2eosos Ff oTFPooOoObS O O SST SSIPSSSSaEiPóo5E SE &w obs & s < o E ER? 3SGTO5HOEdZ EG 5s5S >83g2o2S 3 RETO GCHO P$8SS3óoSsss OG oO o & q o oro ooo O SS < E O O gq EX DSP o? os KO E É q ú E oO so DO É PR fS<33S82%$oóvôgo E SOoOoSoOocCoOo o DE Oo So O O 3 Eoz%xb&3S3583rE5OLOorl 2 2º q8 sos SEE ST OO ES S O & go 3osmomoSo o DEr oO o E = o DD | o o Tv oO > $0 386 $3TTITISTBOO o o o O << 2ÇaBsossEo oO o o o Pr O Doo oSb do sdo ww so o0ooooo oo < << E < EK <O

SS GEGESSSEDRASB ASS 6 Ooo O O PEXXOOBRP oo<GoCoroxz <o800Sgok oO <EOoO5r O E o QE O < O oO LO Õ o < O GO Oo O É o < 2 OF OK SOC ooF estro ssos CHE SO 200 SsoTGoPSEOCÃO SOS kE5 (OBS CENCORNS) o < SoPoc8$GooSP or rot 2odozZ < O << EcEroP$S=S$ooF EESGOROSS sos SF SFEES5E o Oo o okÊ 2 ES < o <$ E o so 2Lo Essa osSk o O E O Ê o << << 002 0S$oç E <ORXÍO SEZPSOS Fotágaosdo ST) 5 PE o Ss OS SS Oo $ o OK EOoF GSE o < osfcoiçãáo <o<<or$doo oO (SENCESSENCENO) ESSE O O - SãO e O E Ss o < Õ o EO 2002 0 < E Os K & &oOoi Lo SEHOSE&S < oXo<ooES oooSFoSFOoSSOS < $$ <O E O SG rEFOCSSAOHRO E o O O Õ < E ScGsaoS ssa ossd: o << o O O <r ooo $$ $Fs PSESES ASAS os O ES 2EÉOCO E OO 3 PO SOSCEoog< o? g2gE SE S5HSE <O0COrGOS É dorLOçÇoOoHNofr SEG SS5 SSCPSIGESEHOrSOSS0 OOo SITH OoSOGRO < O < o or SoaoEraosgos Et FOFO EEE LOGOS GL < coos<aEroroloobhLEçoozer E o S<ProohNeeroeookfos g O ESSO oFoSs<ióodool O KR ÓÕ O Rr $ 386 o O EO O Õ Õ o < <3S6LasossSasSt ond < E 2 o O O Oo0OoO eoESER < o SEFSSES < O STF SO8RO 2000 OE LELEO S < O 2oS$So O O EobhE 2Lo300 o 8< <Q GS oocEísçooorgasoartço CROo<T< FSFooroeooresgo <5ErEKErOOOOCPGOEOSOOS O 2ES E o ooLsgE LS Co ss s<roszoroo8So gos oo <o<r OoooosSHE O so 8 20 Ss Õ O 4 O 0 o70OoOoO0o O <<LO o o8So so Fogo 2 O O 600 < O < OS <xX 2 < O Ô o 0200 $000rF o <aSOSOB5 O EK O o OS õ 3 bp SGA SO SHOES GO 3 E - á < õ < O E 8 co GEESESSOrLroOSGESO a o FOOOroooor < OO0OO0OO<<LHF o o < o < o oro SFsSsScssçads H3pSss = o O << õ

ESEPRPSSÇGOZISSOS E OOESO <oHtroSsrSão - O EO O SEO o 2 SLELOOQOS E SOSFSoOoFrHEOosçco < SF SFSIRo EEOPSS5ESSIA 96 GE OS 6 O2gOo STEREO 4 Q 8 E5HO ersFeçrosgrtroso KH $oç o O E O O << GCOoo5aOoS0o 0 oo2Qoó CG RE<AOFPOLIELDO dodoSo <oO5oO2b E) o < 50 E oºO ss 5HOZEorOOS BorokrrF GIFTS coxo PPRoOg8k sos ELE GSO EosZ26Q sos SósSçEÊ o o oO E << SER SOFESO Sõ E EO E 5 5044 o sf S 2090 orago 2) 20õô Q $ Õ cooGheorESsaOo BSCóEo O OE 8E5SR o ER oO < õ oO oro rosshros Puga egGoráoSo 29060 OZo8SE O EO GOE OK 2S É oo o < o o Qdo E EK

SESC SRS EZ Oo O Soocdos o ogia O OE so $0o08ES O KH rot 5DESFCaoscrosssESSi5a ESSE ODESÇOSOS << o O PE ÉÊ So osFagHPÍZO0xXS0$oOEB SOHESGIGHGOSOOTES E O 5 64 cogoseEHES 012 O o oo < O SS o o o <00o < O Fragoso oas SE arEóSZ E O SOFrgOO E o o oO E GO SEG S5858 <E SK OS O OF < 8 S Õ O << o o Sans da anna RSSSS: o É 5 oô < ESSO TEEORQESSS oRES<OOE O EO o b5 < O O S5H Ro 0008 SSFE ES Pocos <SEES ES SOrR& Ss bBSSIES so Co <TES S5SSE <o0o9<TOOSOG SL o <0<o<o << OOOoOoOHKHE <oOorpocoogsgIdtorx cososooSITSÍCISP5EFICO AS Crgetosooítor SE 80200 < O <REOÇO < ce be eroaro gocratoe cia ssoBESAço orocatarássoesos 8 FotkoxgoBrhFHoo Oo oco0boEro Ro CososGroocoosErebo sofri q 5400 <OErkooxy É E << E o O < & BSSSSSoScsdsa Hds sds o oO < O < OG ê Se BGISTDOPRedeHSS28E > Hr < oO <OHFr < O o o Õ ESSSSSSSPSCaEÁSRStS

E 3 8 8 T co x a.) o 0Oo

O HE << O ooo <tr < x k SSGESDSSGEESSSSEaS

Õ S38 E oreoorçosordádE <oosra5Noor so sgroossk OLEO o O KH O ox<sr<artogkh [ON o < E ot $< 988 CSFSEFESSSESSO Eõo o KH O << 0o00o0ooSLSee SOS GREORS oo < & 8 E osoriéorggosah O o << LO O < o Oo 9rEr&GEoSBOS SETTL< doe rEoocoo ce çodcoogsso Eosw e oSeGrodgoosse & Oo O or < oO E O O <OPOO o SEO 4 EoEtrEOoHworol rogodoks o o<E<S ce GTSSIOSCOoSRS gooHtECerrosagçaososo oroFEoçs Goo Soa RoOoSk

IBESCOGOSGHNOLISOSOSS oe egto<a e eogosfoo < O < SCSI GISSSa OK OdLO o cos oçc<oS S$ SOHO oEHOoSTOSCSGPR EFe8bôo E EL Sorzsasgob5ro O oKHFE cotrísodooçosslL$o0o8o < o O O do doEswooOoSEOISTOE o 5S5h502004º 5 OO ESTE O<GO ooo ErorGS Or oErooHK roof hodsodofosç E o 2565 o 0o00o200osgo2 SS fi<o ooo ooor os ES coroóogçosgoo gi róeoosooo < o << <Oo«L O < Rr Sds sda Sds idoso os E 9 o Eos goçg& EoOÇQLo 2 O ora o2ChõooO soohráe<00oH Iwo rofsgeogwgadsozgeos < <SÔO orosgódcosSSoss & SozHHZaooZ e odod PES Sos roo EFELSLASZÕSO o<<8S< ce rr SIRCIGOS Oocrooocorogkçroorosoo og<rHrosoSAoHoZxoSS Rr 8 $o5OoXxo<SBk crío eso SoGHrOZISZIC$CÃO Z otr $ ok Eb2or SCoxzosseo SE stosdocrtosossãE 8 ESSO << <o2QoOo0O css ocaoorErESe sa oo SS aosoarotsosgço8s ts cog go 206 5Oo Ss < E OÉO Taz osIasoPotrteosíiíiosço Ss EO 3 PESSSSSSGESSSBE SS Ss o <roo<gF OFrZzozxo0oo82gHro Ss o<oodocogEt da < o ê SE SSFISSS z FGTS LHGSGOFSERH OSS é Foot sdoocoPeeooftfoszaiãto

PO o O O O oo? TT E GCESISDAsSaagrah SBB EE $ OQ o 8sS8$ gs o>oPSYX SEGA CSILO SA Ba SóE O8GEFSINÁRASGEassasDRS co rosross>sass SDS GISÇDao Se dão < O o E SD Ds 206 E < o O0o00o00O0çgÊÉs dd oÊes < | Er O EK &S Ss 2 q

SEIS SSD NS OSCE o<eGESOBCOS o 8 q 86 Sgoê coeçcofitotosçriissasiasta s$$o08 SESGESSL 2 ooo CrogfgooLosHroaopsog? o <4LOOBHOHFE o PpOo<< 8 8SoSYS O K oe o<xzooçsESãSSBS coLEooogHoegos asso <o<LorSoS < E O o &b&SES38OS Õ Õ O O o > O

SEGEIAGHOASGES SSIS SB

ESPOSA ESSOPEISDRÇBESS ErgoeloçoissoE sos sis E SE < ox oO E Do oSPEerÊÉl Ss ER O o8oh5r dgEÉS3S os o oO LE ERO O DF BOMÇW OBS So SESARRESO PSOE O OoO<LOoO O < E OE 5 oOoSoçRr ms CSA GELÇES SOS 38 NE o É FEÇQOPO SST SE 88 sao SESSSTE SS SSB Ste SSSa5oaPSaREoSiS

SESSGOSGGOSO RSRS O O É õ mB og Os > EK SL g DEASSECS SSB osiasd. SESEESr2oos AR STED É o 8 DP SSBEÊE GS

PESTE OKOS OS TPICB o SESC OELEAOS SEGA DE << O o o E 2 O GO bSSSSERSOSSESaSso o < O O [= << O g 2 2 So É KR O o ba 22 5H SS SS 555830E < B 6 d5ogo Lado çha possas É o q o CSEa os ES sS e E SSca essas batata Ex < << E 5 o o cs pogzofrtoçadgraososoçaoso Ê catotrtazoosEsghassSSaos Ss KHE E << OOo 3SE é BESEogGróssçS o sDAaDai o é jEOoOOSOZXZO00POESSBGB3S e 3 o E 8 o Fo SO 2 & 1 O fes)

EE o ATT

BP Luv ão Fr ooo <o 8 SSL SoEaBbASSGHBESS 8 E o Oo o < o O o OOo O o 2 OOo <oOT Il Çog<or ES Ooo MS o E O O o O 3 &Sommotr <£, Oo go o << oxg<otr 25 SS EOOor << o EO ogoLgOo 2582 EOZO2o SEEK OOS 8 3 e 38oosSsoseQSIShO<L<SÀ o 828 õ < [SENCRNO) O 3883 o0oO0OHKHSOS0OL O rE OK > SS $SEO O ooo 8SCros Tv o ooSE Oo k E HE OX O $$ SETOR <SaoroErrtoPrSa io >8$ÉS3SO CF ESOSL SOS < 28ÉSS o S8o $o O DEBE DSDOOGÇS O <S$S o $o8 DooErSOHE Caro oOSRO < o) vt mos o < O | < 0 o 280 3$o 2 2 me oO KR << O OÊ 35 6 8 BEE LoOLoO - <r$Í$Ooo 2382 ÊT o $52QsSgçãor 3 SP DPãOoOOo2 SC oÇ[0oStoção SEO ooOosLI oo O roos Õ SS SS 6 $OrR õ o o 8 o 3838 odaOoOsLosdo?0o O O $ E SÇwOO O EO O < O 33 SS eae s dados Power o>ê << O 8 SESS SEO SORE SS DOF TOoêD O OO O o O oO $$ SS DWoS2QOFEo E OE OS O EK SC OT Ç Ob o oO<<< Oo $$ 8 osgZoo Ho o oSFooO E< 5 ooo Ss FALE ELEEL Z O o 8 E DoOÇo o gooOo osso Foz ge S2S E ooo 5 SE E < É ?5OS (OBESO) o 3 gpgS=Oo3ZOIES E o 5 E so ol OoSFa E O O Oo o o 230 DPF O0o00Ç8LOoor Soto 3 soe O 0 O0O0Oo < E 2 OS aossoo o E O <L<« O 8 E < E O S35 E Soa s55aSAsas DP Dog oE Foo < E OF Spas aorosh sto O <ÇFEO & SS oO Ses Õ oo OEESO & o OQ OoOoÇOoOor O o 2 <<8FE SS SE5HOSSEOoS < E Ss BÇS 3 ÃO o TG HEroso à os oêE < O O K O E o? oOo2d ooo Ooo 0 EO O à 8 S53S05O2oEgILOLES 6 82 Og O E O Oo $a O385E Eos DSO MS õ [) O SB osGA SR: nAEddds O DOomqgo O O < O 3 Om osOor < o or$ oO 59 EÇç8OOI rh Oo o << OR S mo SF Oo << O 5 EOOOÕOO So O2P go So os < tok o 5 os ok O EÊrR o Oo o<LE < > 8 D8ÉRO KS < < OE OO a DSTs ooo sBáge nado é BSS STE $ío 2 8oOo00o0s s $ 3 &gSSPororsoooeSi5e 3 ESSE BOOrFogreSS oca o o FR õ $$ S5OO0000POoooÉooo

<< <O o<oOoSQEHr r o O < EK < O | e) Fr dÉPodsds as Essa < 3 o08o Sd oxFHFHEFroOoosjs < <roSgooB8EKEOOVUOO GO o SS SarastçostsooHrDO0EOoo

SEOFIÍSOESIEZEZGTGOLOS RR o < ESSO SGOosóoCo Rd os 83 SE O E OoO<X<O OH OO Õ ce etrtsassosoaitossoosersô o $ < o O OoX OG E <S E OO ooo, CEERLSGSS css <<< - oco aco Loo oE Essas IRES rEZGPRGoE cosgcISstaoasa se rriao5ssork FS rsasseosooorolLsgogos CrErosoagoO o 0oog0ob o R < O E ESSZ E O OE 8 E O roressoõoo <ork($oOo o < < ot FoorgoooorsoooOo coa e osgos e osorosoos goesoErgo 5 $ E ERC ÇOÕO CEEE ErorPo4sSd< <ESEEA corofro Eros Õ Socçgso so < oOoKF FE << <XO90GOO0HK s$ogo ocrcfgooSsSitood oo O <O 2S0O0000o<íL <O0O0OO0OLO SRS EK > õ OE O

SSESS GSE É SGPOEGO o) Oo r< O SILOo0OçRÇ or o < O oo0oLo0oOo Soro g2gooo ocCcorosossSsSECOGOSHEESDS oO Ooo < À O <P E se o So

COEN SDRSROES ESPOSO ERRO O O0O00oZXOo ok O E Pp <<ogk oooEÇGwEkE<XOS 835 O OS GS Cos o o oo SESES O OO EPRZ<O0O os <05 02003 <2o SH og asosE SPRocroSIToSTH SORGO GÃO obs < OO 20<oro 265 o E < E <X<OL O O os O 500008 o 23$$O oo Õõ Fe oos 8 okê <E E E E E o Oo os Sa SE SErosoostnoasS SS og o83o SO8SO OSC orKda o og <OQ OSC BGSÇOSOFREOO co Goo aro 5ds S8OCESOGESOS 8 E OO o oO c<scoerocooEráco <o3SS$OoO5S SHEGOrLógcosar o ogErosseasorçõTEoSsE cooOorecssITHrEOROCIOoGOH OO coro toe osaoraçosoEk HE OõoO 56 wo 2o68 Ooo? 0cog8gS Leco Lrsáareioeooo $ OE cc EOÍO PGS oOoHrHSO ss PpPocestisadõol PÇS o o < õ o o $ o < Oo $ é oscar assi SrFSSSES 2 o oO < EE OOo < < OoOoFH OO0OZgoO 00 e Sooo<Lí SE OE OoOoOoÉEO E SorcErarasosogsosrosshkE o O E <CO<COLOFOFOFOOOO o o Rr O O FR o 853 RSESRISSSDESDÕSZ < O £ 4 S$STOOooco GOES o o8O O Er fo) oRroOorgçosto ESEERSBS ES << OH O O <OOS < STO << -) SELO QDOILÇS o O 5 OQ So o IT TÇERNAO SEL E8 FE Ce ggseghoos o o<o2 RFso<scooraocosS Foçgs EP 96 OS 2EO oo? co oCo2Loosbs 2EoHE oo Pocosood cocos os E ES o O <EoRr o ÇwOoss SOS o e BEE SOEEE Ss OS s$oSs E 2oÊ o 8 SESOOS < O EogsaocCoQroreser Eróôso Boss toterSNS5oS E RO E FEFQOGOS o o<EcTOS O Sso56Z Bosco dsaosaHrgEs E OS o<FEro5roóEGSO < Õ O O O < o Oo oe são SS O<XFG5HOCOIGE 2000 <X<ZoOo INB R<EP<Eroo os O oo STÊEO cCcESGORO 9 8$S EocCPeroosgdao sol 503 o6kSA5EZO ESSO L<20Po oii ooriíSsooo SST Eaporatoroo<sSdooso Sad ESSSS2S2O Go o Oo 2/6 O E < E o E 2 5rOoOoZOo cocos Ppaorashreboeadso E O Çgood|E O o O o FCO OO SEE ZIBS o00oÇçÇrroldço o Õ Õ $s/P o CESSNA << O PR O o) O <S oítEocõo o << od< o PO or oÇoZEHEH HE O EK EH REM o Doro S<TE<x<S Losso /08SGwOo0o Õ ESNHEOoO SEEFOocCooPoorooraozsosSs

CEESSBESSIRZASES E ES Ss BETIS OESÍSCGOEos Soo óo SIE EFOCORGSOOGÊES < E O OE Ss < O O < ES OS < SE O << < É CSSBEOIECSO O or oooor < O | SO <LOoXLOo O < EK OTTO SS boo tLoBkEoSÍOS OD<o<(< <TFSH OO E OOX< 30850 ES o ESGOHK coossgorogEriho O OF oO < o SS og o Ed sda Q < O $8 < oO OSS O 0 O ÕÓ o < O gs < 3 o O EGO o 3 Oo oo do<oSç << <GLO 20800 É Õõ 6 |O oOorkE < OL $ Q s O O < E E O < O ss 65 ZE SECO $ S orgs EM o LE O (SENSENCNNS) 2 EPRSFSHESOR SEG ÍORAEOORE Ss O O ro O Oo gZgooOo o Oo $ PREASGHSOZe5a85aaS SS a pDozzopossoEtEosdooso0000

E o on 2 q x E o o ot o o re ok EE qa É o > rHo2Zoo GESSHSdsaS Basso? e aos ES o nwGOoreeso SESSOS oo Õ Esso So oO o o0<4Oo<< SS rosas o 8O < E O € O <OOoOÊ So oo82Log0EkE Soo FIGITHEZS bosco? o oO rE O OOo < E PS8O 85 2H Soo o o SP LS Rr O E O O OoHKO << E O EDSO Ss gG$08080é É q k 6 eB5 ES cooe8gZE L$S5HÍS5O 5338822 0S 23386 s Fogo osorodsdo co <SIHE GO o EGO SOB EoO 265 EOooxjX o8o og oo KEH$o door 200 oBHEE p2ESGOSSZE OE o Ço2O <o<or<8S or ÇELoSÇdoo sos sôo8 900 oosooO os<secrioço o & < E EOOS EZXO so ESSO SE < SEK OoOSHEFE O S53S So oOokroeogsltoêE o goE = << O S<ok O oC ITLIBES o Od<XFE croóogogosgstepbpesorerks dorHto so tesobpooEZEogo 9osjL EESÍoS O OoO<oOo o eo costa Soo rpoaorz EO OE LES & SOESGErEk oo osdsoldos É $ < o O SE < O Sor ISEL SS EP OSS og rErodofsgogkko<<ooiSE coscolcsocIosoocESIHS SO O Pe<E <Q O E O SS$3G00O oerEeSCSOSÍSGOEEO OEÇRPE PeEríooroseasokE Za orregtk <SE<COFLOEooroHESRO SO SISocaSgogxggtooHFEIrEASErz o < SISTER ES E8$ o cELrócCSISIS SO SEEC ORE < < E cosgREororssx SE5SGO Erratas orsáoxHOoráodo O EO o 2 oFZS 65 S2SGFE dscEeess rFoposteogos oct SAI GE BESC <RE oroooSrSoS ais c<ocE<O co xosçswoE RP SSOSOOS EoESSSrasdsbars5ise <oZoO o so $ e Bossóss tits sanado o LOCO SO O<KO o o gs EoRPoSGGOSESOOE RE OEa $$ EXcrootozsseímósorisra é passes SsSco Ss sat bpRrRPRk<kE<ozE<oodocvUcirtooocdok 4a

I E

E ao o go SO - & 6 co x 8 <a E & IO

O A DO

38EsSSSSSLSESESESSES = o = (5634338 SST Soo a3EZSE Sra s$gpSRoS SEO Ss Z Er 38 PooÇrW os or oro O Ss o go SS SÉ st TE OOO SE <OBSE DST ZSS38Ê 38 oOEro O ooKH g$$E pos E SDS S oa sSoo O do 00qg;gEsS o êôsesagaseos oO O Ecoo5sssassiça sa Sihor o $S233ÇS5 EDS SEOSOS

GESTORES o bl = = 5$<35383535 SETH = = o + 8 op oSposaosesska o<$Ç8áSas os oEOÃoO | 2 o tv SO SO 8352 53 sSSSSAdoL E O $ 58 gos o>sZoçeçQg EE <

CSPE BESBS SERÃO DO o 2 33048555 SE SS 5583 Õ or o geo ST Oq oÇ OSS É O O OF DOS oomsmo Se DO Dois sso asso sSo < DOM É o = 2 É 355383838 SBROREAOO K DT Zoo Ôsês 28 = g< oOb5s5or 3 ss 33 PT YFYFPSOSOGO É = [oo] o | cOSpIBERaR SSH < E OS s 25 SS ÉççoSbargor? o SPESF$ESDT SÊ SOS SS SEÇDO KW < O 3 5 9258 SoOoDOoS3o?E O ESSES RCUANASSNNa: = o Do = o So DO ÇFOoO o oÊE 22 593w os 8 os F ST Tra E OogoHr 2 boo os 2” ÇooosSs ooo o $rosçgçossaçs 3 5DPEOO O vw Som 2863 ob 3 5332822283 85858 239590 S 27% 5oosoo ooo sç < SOS as iro Oo Tv de oSP2LOS5OSOOSêS > o o828oEeôçEZsaSO SG O5É S<od5osSgstzsog ow s dor OS Frodo 3 Sos oSô ESSO Oro og9? o FR gs o8 ooo o <oPbos gs So 36 so PEREZ oO o<< É q E E oo085oSgô Rgoqjfít o 8 2ES% 6 o g8o o Õõ s dS8SESZiRtas oa soo 2 <E<0OoçF Foo Sg8 PL SEO 5 c<ar<áh So PS SoSDSorosSEOO 8 s$So O 8 $$ o 3oroomoSoo”?EFKoO SE $oO33S3Sgçgosesastsaooo > o? O = o o? O o O O0OO0o0< 2 gasosos oso>o0oPaAO Ó O OO0OrFr otboosoàob sda sdo wo oor org o O O o Egg ssseroasose 8 o2oSk 5 o0ooOooosSs re SO SBÓ5SSIG8S Sor < ErogoLIegooorossoos Ecrogesosfossrassot FocÓsErosaos5osoktoreasa ELO OHL oO k o8$00SSE EHO0O0osL Ô Oo GIAPSGgO<S< o << CICE<ZOS o O $ÇOBb5 o o8GO SIC <TcoLIoSsISCSORHOROO SodcooioosEç IBGSIOCO SL coFGOOForgasooosoodEtos K oo O 5 0$00 Sor Z2gO OE << 2 o O oO o OE < FEoSs<ooFrkE $oF É vos coçcgosçotr os ae ão 2008 IC aci oçgçóõEçãoolHr cesrgcs so soaoodaosdaoso < O <S Hr O o Oo Er << $ Sogosesgoososrhhods

O OÕ < Oo < < o K < <EoOortasoãádos < 09 00S SEG GÍLIHIASE oo O S<2Ç00Oo0oS os oorHoRgOoE 58009890 FEZ 8oO <<r$e co SCEEroor S$FGSLELÊRL O <ZoOo cesFrosoRçoosHsorsçosos < oOxoool CG LCo<SSS < SESESGROAEE Or OE OOSES c<S0oOoÇros [ONNSENO) EO ortroóceçooseosearosooos SESGSS <a PEOSTEOPRGIGSIEZ < < O E o os Soo õ o õ o EóôP É Sa 5a Ep agESES

CEE ITSESNESGOSEOSSHEGSOS SrHOOO o SSS o oO O OO cos Ero5Nresosdgsíçcesseçeo FHPSSGoO Goo HESHOO cocESGSARIGOoLosEoSos so so STF5H5OO <oO8G<S o $$ oi $ES E O SE OE Eosososgiá o o < o s< o o o oO o ÇQo Õ KR O <SEoOorEtoBE Sotoos costa oxorl <a CCoÇgooOo <FLCSGEOEO NDA reososS SGESSESScaaHENHSOS ce cocosocsoorossasoos<oSs << E E Cororãgo oO oO8SIGS EOoOGHROoesSstazg eo RGEHRRO000 cooPSCILIHOSCSOSoSCEZO OS É Eo<X ) O E o o o E f<S SL ozZooNocrogo 2 Eos oras CGEFSEESGO Ss 9 < E EK O roçoos O é BESESSSOSEE5NHosdaso c ascsddEossasiosdd: & ESSEFRISSFIO SSH o o o o & < gg O oo 83 GsSSSGHá5nas 258 ooÇGogLosgoosoS5rW Rg Ros So Grass sa SS SOFoRGELrROSS do ESB5 É R 2ES ooo Ss o EH6GOEôo o <s 5 o O EQ $oHgoEeSoOsSELr So SP5 of oooccocs<saçáaodorHOo2dO0O0 < E <a bB<ASCIToCressEtro So5õ o o cod <S 25o2dkoS Ox O eg <00c0c8o ESSO E SO ocoeca5Nr or o8EosS o< S<c25320E rg õoL dot < E ESG 20º? O < E E < ro) < 5$EOErsr o É Soosdodos E5SE o Oo < o oroo<co<qogob5 5 < OS SF oorgçgooroo çsiaeoso BS SOOrocêscoroaekdao Ro oFEForoSsoo RGE | Sa 920 <rEÇorSsGIrHO | É cscerrossooLeiesco & E ESSNORNORE-S K OO5NESTOTX E < ge cosooreeosoess jo ÉS c6EBOoSsBEoSEosktosrkt oErá < O RE << Q0O Cos O - o FEI oososatido 8oê8 oxzosoraeaer SS < 2 srogSsEOoSREoroaga o <€ E OE OST HH ooçoSs2eoço O OO Ió<SO ota oO << 58 ceacSsoF<SSE o Oo ê o O oO E SEEOCRP E FEB ooo dETESZOSISOOSE o 5 E OOo o To58HE oe s<aosií 204 O OS o <r DEE<ZXO < O É Ê SESGERO o ES o E SS RR c<S$Ho< RO ESSO GO $o30o oÇkÊ SEO <0ooOoSoEb5 O EFESESO EZX 5 $E Cocgç o çeoSso < < E S estas oroegeos o ok ogrE$SoOo Soçgoo( o 5 OE 200o P < 8 OO O EO EOoOOoOrOo < o BHO < O OO o 0Oo<íto o RS COGECOOEO SEFHFSBOROSS PXZRLÓOP0G5O E <óoD0esgoos? < o 8 SSB saao5o 8 SP ESNE asas ooçosgP PRE OrE SIR ÃO SOFIA ra5OS EO RSS 5 SEO 98/00 GE cESNHDHEÕS o S588 000 TE çoxi E S8pPpooedoPio os s rogzgsoóo oocooEr$E ES o SCosreoo < O <h5 05 E Ss o r2ogooso sô < O02O S o FX Co8 eSsSEosctErioo => Hr <€ ooo Oorodooro(go 5 ot oEt = < < O € É O o or < O O /6 00 é SESI ELLOOOEFLITOEretoo?s

E 3 o o o o o o T co x ss. o oO

- < - o SSLassadEsaADRSRSds g 8 < ogo <a SESSSLASCSIEIAE SBGEO gsroHrwAaOo O ESSO Eraço os f cocoroLsrieghrNNOoGO go PoSsSIRBREASOSOLREHHOOSRRO HESOR < o oO E É 2 0O<< 4 do SEI ESSE ESSES orosgçoooSíoossocos oo r< < OE O o op < SB <sEgoogEhro5oross os E o OE O o oO Eok E < 9 80 < <<OgX5O cocos o LI roosdscosso <osEEraáosraçsgotdedo ESSO rFFGERÓSCÃSO < SE $O bBacrol otro Hogsatoõss Õ ar IÍGLErF ZOO rFesogso? E<z Ss o E SEHSOEPSS oco rEos So 2 2080<oSoS FPorocoss o daeorooossdo or <oOo<Z20uS 0 ÕdO Foods OCGrErogorageõo Htooodk o Shá< S5O <38GTO5 Ss SO sé OK o E E 200 8 5 2º o < E Oo< O o o o o kos ESSO Lada rERoSE rsltoosoorasgtornoozsk? Ooo orgadgoLrNPpEtr O OO

SE SSSIGESS SSIS SS oFGGoP PELO oo < ocreogaEebhE o E & & o docwoOoSsSsaLa<o?Z o 20SóSS$o E ooeº8 E<goSsoofioossok <<cECEZSSFOGONoOoHOooSao0o0o0or? rcozssocrogoooragroookÉ < EE <Z É cotessossrEoeBegassão SS Es rosçaçaosdsso o HEFSoÇrssosoçõrosoass Rr < XX O o oO O Oo < Fora SsEroSSESoorLS oe o2<o pg o < OOo o 8 o Soro o oog8oSOos ES <Q? OE SH 6 EE LOOK o 8 rod osso aoosodosos SE8 rea ooCoros o O SCI GLELETENooHosSsosk oca rrosa2?2ç SCE GOoOSRO 50 <OOo oocrsgGogagH < cosdsocotgçoosSoosdosS si <P OLOLSO Sos gçodsgs É SoO<TOLLO 290058 Tk O Ss SFC TFAIGTOXEEOGSOS E $0o83ES o SH OO0OO0Co0o0 Soo oFotçoooo 0 oo<OogEor£? es EFoZ ooo eosooroorikoi o oc SL OBRB5TE & OE H5oordáo E pesos orHtostíáo800T7 $ o o o o Eos Ser = &) | oO Hr O E < Õ > ásrocssosoodaosóção o o < E O O O O <Fr d bPRoocsoPeiíooi o arresgitõo o o ie o H K 20020 2rH 3 3 op

GE GISSOSSES SET O o oo Bogestagisosssos < O dSoocEÍGSIBSO <td dos SE BEST IGRO <E 5H 2983 23 Bigssostobsa iss < É Ó Or 2DÊ5E EO BERG ESOCEGCA5 FERE o E PO 540000 P EE SS o << < = FooHEOoOoL g8 SS E o o $Ss SEE GÇCISL ISP É O O OO &) Sd 8 TS << BLA oo0oosk 8 8 88 Oo COCoGEZao204X o 3 DE < O O o E E O 539 O Soc os NHosoESDSBROE RW <<o0oor << do 8$bob a E SÇHOSGHSS RES o o CQEHrOOOEREOT< X 8 5 2gGE O o < o O <r O 8 o fe) se KEosoxsóosós5HdoapEsS BssF$3oS5a5o sai: Õ O E << oaprísoesisao 986 EP do SS$oESSSS co HHzoPSsZGHIGE<STSOS < E É E oo 8Gor Saes É ES O < E EO o 98 SOo Ss Bostofpásssao sa: < O oErá o SE SOR S8S o < SoEacosaçeoT Tas? & o o < à o 8 E o SESERL ww ooS ss $ 8 3 É 382583 SES5SES SS os BEóssogcisçosP iai sk QE ÇOS5HSZSOÕO < Ox >832S Sá PRESS GIOO0G0OE SSB õ o o orgçóseok 38 PDT o < ESSEEFE S<5$0838$S < O Or OO OST KO SECSEESEZSZ OLE SSaSDE oô BESSESSSSSOG IST KHE E KR ss oOe0CEoSsHr 2 o o E go o << SESGOE AO SSESSB 32 FoEs$so8Goroosiageêso go SEGA IGEGoSSASSoS es doe eggçosorLrSsaO ss E O K SE O o O2CoEgoê < O corso SsdaHosdPZXO o ES << r O o DO co LRBSSS RS D5oa RSS << O Fr O oO E q car ooetrão GG PROSSE ESSO < SEE IG OOo< E STS oRoHFSsESstEroosZOoOSa<s Ss s SEcBScS css DL 2 s< ooo o o<LE LOCO RGF S EEEZEOEaZOoSOSERHASS $ <rgS<orro0zK<soZOo Ses = õ o ; Beseesroasróágçssaosis é jproloEocooSdox<ooorosss f: 3 8 o o 8 &&ê 3 6 2 Ôm

EFE o ATI

TE DSP Ox OCOoOorL o 2H SS o 85855 iss toÇçgatasis $$ 883 E<SEoSsodsosS 3855 o 3 osso çA5ãS ToS SF & O OOo HE $$ $TPHOCskFE so O O O o DD oE < O <L O 2 os oo as OoOOoOodOo0oOSx,E 5 << so Soo 8 O O oSoX E So $ PES 3FERGES < O O 8 o o 2 o Dos O EF OSOOX<4L O 2É 92233 328E DOOoOHE K DE go moSmoOOSêE QIrgorS$S%o o 3535 tas ó8sdodoo São 85a3assssSooorisiçoororst 8825355865? 5ASooF = 2 O += Rr 3253 SEtéAOOSB8S 8 838 Pam 6 OO Õ RP o Dora om O go so 33 2533 sOor?iíirots FE DO0OSDoÇgos5 oí4LO Õ Õ O O 6 SS 38 SQÇTwOooo£à? 8 oO É o DS SS Soo(s o EO Ho & DP Eos oDSTT SE ooo eríoso Soo? To 2Pbt8S E osá o o o o = ERSSSERSSESEENISSN: O oO OT go O < oOookb Tom ms sos o << O DS 3 o TO OL RH O EG OErX É E 93 5oçgooPIOOZGELOoO< o É o 2 825 S E os o oo 227 SLDOSSOQÇOS 2 or oo m o O bg ooo EÉEO EXCEL IÇGÇÃO FSB BISTa5actasoo5e 3 E 328 LH Oorooo oco SST SESSOSHosrir = 8 E SS o03TEGGHGEAZOSOrIro 93833355 oESagoo O é O vw O O Bom << OSLO DE É goomosoçoOoOoOHrooo ss Dí o SS << OO É HE ES 3 os o>5ss3s sas O O O Õ 3532 g3ZoOOoOHHEE <o8Oo? ES Soo oaooo2OSolro < Ê SS OZ omosos83ZFOSODO so so 38 R%83SSS OSLO $ S 8 S 25 [OENSES) DST SS aa otEroooO o o 2 go o Õ OG << re EK OO >3$8S$g9gSESE < voOoFrEtoO = 5 20 SS o9PYPo $cOoOS oO<q<oO o Db o mqOoOooOoogGo x E O << O E 3 8woS Sosa Sol o XLOO o << oo CS SOGg/GoOo+sr O E od <O So OQ oSDP53e sd? ooOooço O oO 8 ó 3 moSPg o 8 mo << 28 o SS SS gE Ss o Er O<<OoRk o O o o > o < KH O O < < 2 2 0 PS oDPIFEODFROOS SO KR s 28 383 ESOoOLSk<rOosão é 938838 S TG ES ATO $ B3SS5stó SS oct atesso é Bossa SSBGoEsoE SE cs BSESSSSDESAOLIS=5oS o DO do oso ww osoor OOro<s oo o oO O < < H HE o Fossa s son so ÉS E P<oo<soro ter wGrhõoeo od

SBD EE Oo O IG OC<XLGOSSOS oroorbtogooo E SÇGO o < 586 8 S<O Soo É 8 ss << OO Õ C<STEZ SS INSS 2EQO 8 SE aocsoPrserhas <SI<EÇGLISTHLITETL o 8 OOo S$5oSgGoEoçE IS < O O O O o Es 548 < o or os ooo sSsorgoosocoorçgRo oSsCoeresezácço o EoP oo EoSk SESTGIGHEE o EE < osso 380õdosoo < & OoroooõE<L Do) O <OFE sos <o0oozxo0 Ep dO HK 8 o o oo <<< E2ZooOoSThEO osso ZzrESSGISSSENSGRRSGO <<rotrt<ar ossos oLoo0o0oo GH OOEr ES GOZO EITRIGOL << oOoLOoOotHO SI EGÇOSRGOoEÃaO o <oosSs 2 Se50o<9 Soo SESGSGOEEZO OLEO SS 2 o <ot õ gs 5 $0oHE $96ó SfosSsGocgcossatdosa io ge $ OOo E É SSH oO SPESOS costotrtiísieseaoLrisPEsH DO GOB S$S590 80

ESB SÊ SS EG OOFS O o OOo o og 9 90Oo cr HóGÍS EG Soo ds E o o Ooo0oS<HK so SE É SE 2 õ <OO0O O SoESL cróocsotoggGAGHOoOo So Eos S<oOorTOosSE O <oE $k ESET O oO o HE S O Õõ << E OErres< o) O o K Õ o E<< E<ORWEEOOSOOOOSHK õ o o O S < sr O $ 00 <TGEKASLHOO o õ oSToOorroort roodosgo O 3550250833 55a É E O E < O É

O O Oo BSES5SSS $2$0056S <

Õ Õ o E8á 520 4< OSS Oo & corso osoedgosso & << $o dorososEoss5ráohkol:s EeaoeENZSOSOS LO ZO4S <TGO<L<O E ÇwooEo o Ooo KH O o0902do o O É < O coXtGcorososoogatcoor < O oO O <CHO o < < EO O O O <r OO < CESSNA 2 o Ergo o E o < o o Oo E O s o OE o2< $ < o o o < O o o O O o < E O Or <QO Õ <2S$SSR o E |ô Poco o Grossos SsEEoO S Õ ES os 900 o 3 ssa 3a Ss oFESS SA asdso é RFeocoocoeoxsoococooProPreo

FSGEoos4 oo ookt tt SogScós go58S2Adbodsd EE E O Sos < Ora o<(l O OOHK o < SK O O OOo O Q o o o3O0OHKHo 56 00HKO < <P so 8 5 EFEEroSsFes goodosgoirtes o CE o0O 5 o 2H okE OSSO E o << O oo SOS Õ o o ooo d <r<aEoerooçoPreS 808383 SR <FTESGOOSRE r$õoodos proFS5COPoOS 5a orst BEsSssog5seãs 2oEe5raãa SE LEr & o O <O o Hr o o SSESEESE Fosesoso FoOoEESSE 50606 o E rofEooO doce egxgorods 09000o<<O ooo iuLwE ISOLAR E OE LO o < Fá<orS$S$oO O É o oSs86FEO ge ogosçstos OH E O OO door ok o OO o ã << o << OE <OSO<K LO ESSO S osso ocrogoErxd o3HFGES 8 E tos < $ o OPS 49 SOSETLL Fox dso EISSSSRSESS 3SE$O o cokFworçoO <Eçoo o orar só2oo0oSdo La todos SoSGTGLZo ota SE S5ÉSSOS 5222058338 o 5 o os0ogorLfLLgxOo 8OosgçHE É O Roo &ÇoOooEiá o Oo o << oo ELroêgisoo FEerrszes O00ESkHSÍOO0EO o Rr O rEOoOOoOo<qá ELEFr<Á osg<SHOL EO6kóoõ o Co <4<H GO $ 8 O ) O KR & o) O [ORE =ANO) < O LÓó<Xa< O O No) < O Õõ Õ > < O O FE LOoSo LbLbHsHEEoSkhHOO 655 EROS o o gsoteço O o ST < Õ SECEowOAESZSS os << <o2 2 o2KEo 2 E oOob Sob okxtoSsosktoSso Colo BEOoKEAao o ESET oc óoso Rg gorNorkE S5OS dor SÍSOHEIÍND OS E 200 - o OOo < os 00970 $oHr GEE ErOES Srogogod E O cocos PoSoE Ss NESS ESs O O SE SO OS < Oo Og<xoo oocçHtOooSoodoEHraAÇOooCorã$o oorFr$%% SEE ROSGOSESSGO o < o o2eE$ SBGEO IGFIOELTO << STOros Pops oosgão Ps ga BG5GaS O BRÉOr OF oOorKOoOrzZgHK oO Fogo? oo S o E Ss o o<os$o E S< O <ZX GEE 2 $ < O o Oo E SOo OOo Ê < OO O OO O 5 SEBEHESR o 200829 00S E Só o O O 5 BSSSS5SCASHAsrotaso o Foo Zgrocpoogsoroocoraão

E

Z 8 à 2 q x E Zoo oo o E < o o < <HKH O E o Oo [o] ok KH O c3SsPrósssdds 38 < 0 OO eg oo<o o h83 OH HW ÓOOoOoHr < $ << 5$6oO 8 6ES CEXEOOCOTS £o O E D0O0x< PGOrdgo S<<<o0o< 55400 cortrsgsaoesocodo BSS o << o SES< 29<S$ POSSO 3 ooaESEOEsosS 5659 3 E oRrokFE HO O õ 2 RO gocFosósoa SS EFECR $$ EGO <<FrS$< E o $Ss $ Õ E POGOOSOSKX o oÉtorjs Sogotctoo odSEOS Ooo ESPE? << <20 RGE so Cossróosssm ESP a coorrerhorEooSoEK E2oor5 < < oFr<e<aroosb E E O SS < 2 rF$<o8 oO ESSO FosortíEogostEço Rss co dosrhoo2RoO Õ SOSO < E OO E O 200 Er SEO Q GESSESSSO 5$ PSSEZ Õ o < ooo <( o <STFK OS o ES E OSsoo(í > o oO O õ < oo & E<SCoLfoSarrt <<orá orefgríácwcosSsors |E5 oÕ < O EgXO Eosgodso E o P o COsSoS aos çorgsm bot E SO o 260000 O OoO<oOo <o2Eo o o2oSSHE O S < &oS$soos eos O < $oEo SE S5HOSZo0O08O8O g$ < o S << OSÇOoráa ooo < Oo << SSH O SEESSS8 or Ooo EF O(,C<EO s 35 283SE DO50O CESTOS o O Õ o 3833 SS sESSso 3343 s o) O RrOoO FEHESISSOSGSSSEO ú& < o OO $oHogos Ss eEÉ CNC: SobEGSGOF O E E & EESSOSOÕESES SAS o ESSE 06 TOOTFHE<E O 8 oÇoP< < 2000 ro2goso cocos cEão EX OO ocqooI SL TGoBHrooSL OoFrooEFkB ESNCENCENSENCENE D<ro < o Õ o OoOg2o0oorãá BE < rá cosa NEOoZDOO NH SS o 8 SSH SÍ8 20900S$Oo S$3Sçgo gs E o QE < E 8 < O ço os oo 2 0oOo 208 oO<LRO $$$ 2 E KR rs < Oo E OO O ogékO002QrEo Õ < < o E Õ oood4cocog o sSNE SEE s OSS ERSÁZSSCO OSS? o EoSk E o<SB o E Oo OoOdgL O S a SEE oFEREOCEEZE OE Ss o o o < O o o < $ Rss oissasissER a ES é pi oxtrrEoozZzotEorreçorooo

É E Ez o 8, E: x$<

EFE

O A DO o Op7o >= Es sou SC SSErsssçaa SEE aSêEs SE < E < SG $ 28 8o0gopoD$F DEE Coco osagge sdesTvEÊs sf Sos SSGSSGErzassassgaoaoaósaãs oo 2º so Er 38 PD oD7Açqçr op o QE O EO O à 8 Doo ooo êsêooêE o Poco od <ossS asas SS SS oO o0Zouor ??ÊÉ bg ogEgoooSoôs Ss 5400098905 SgaioSsSSLão o HH OOo g SDS go oSoQQE 3535232855 255 55 É BS 82H SE SPSS 5355S5SEOassS ooZoobh gd gZ2SSm>oo 3 OK OQE S 8 EB obB mts oO oro? OOsEsS Tô oses gs PE DTH < O < <|r OSS 2P3Saoooomos ss o O0go<sT5Z 3 oSoS BIT OLO oh oogdPSSES SS EFE PET

ESSO PESSSRBSADER SR Gs o o oO O O GESTOS ps S SE SS

ORAS SGOLH SIE SOS ORE 8 s CSS SS5DSOSRISA RES O OoO< É Do qgoEEoóo or 882 O gds > [o] 2 E ESS5NHSZatal Dava RS < E E DES É SooSBS 2 Ss õ So0ob55sEsS8 so gs BSS

SECOS PIZÉTSSOS SDS SITGTSSaAFHE SEL SS as O Or otkX%osSd Hs oçosooêsos oo

CNC CSS NC COS asI DORES DIS SEP osrfásasgsasssaossôs Oo0OoEoSsrosgsgs2?P25 3 o28EESo E ER o S q Soo goeos 50 0EkK $ 833288 DPF SS SSB

SGESGISSS EDS ESTES $6rHOorSZ2Oss SS SS so SE e) o o o Tv os P2S ooo mçso <HrH ooP<Oo<E ôgE% bsgsosSagosss 5058 <Ogo>Sçsasêsooooss 2CroSooHrrdagsgosSoôoooaçmsE 23050885 das Sa doa: É FE o 3 8 oDSDo o od <gxE RSS so a ESSGLITSSHE55DSs So goÉ s rESSLSEGSOX EO SOS SS? E «28H ÁRÇE SBC o o x OD - 6 o à bes PÍ0 833588 S 8 KFPOdoS< 833 at gasoso? o O O<O0OOOFOoOçdooàêoàmo?>bo bd Soro

Cos Er O < re O o oO SoSSasseEsS Rasa a E SIGO EGO Sso oo Ss ooo rErLosieaoosbooo0oo0oo0or8Ro FogsFrasorndodssoooFroçsi coldloscor? Ooo oRroo O OO Soro 8BtiA<oGoroGkhoF oo8t< <a GSFTEONOLIGOS SECO O E Eoroçs O OOroooOo < < 8 Õ oo Õ o O E oo SS Soo atrasa sos O oO oo o 2o<KrH ooo OooSo ooSTGFOOLE OO o o0odLs RO ESSO EoaEros dd oscisoooraorhõoereos õo< o Oo oo É o O S3ESS582823508833É SS SSH ES Sao < < O O 5 SS EostoSs sPeobosEh5so coxo &RwEOEo orobsb ago? O oOO cSsCoSsSsLSTECHOB5O > eosSço o oo eEeLTO <A o K Ef QZorro<sgtk << 8SESS Socorro gErooEkE OSS OGHK SO Doro E IFSGESSO RE 2<0C0 Õ << cESCOrafE ES 32- So $GO<L o - & & O O o od<L SEO 2 OOC8BS< COErsErgçoo8aLsd 2008 sEriás oEo2Lorefgãõo cg <rEÍ<rHoo sab rEÍOOOEETZ 8 Oo < o < 2 Õ o <LLCOo<ÇoOo o E oa 5 O00O SE SZTFSSO Cos sHoraR 2908 HEI SÍFGSOSOESOS EcogcocoSoNrsarosorg2Eê BESSA Zoresdos O LOS õ rFotcrtogissh < oz oErEOÇS E OO o ocroçgors o Oo E E OO $OoOÇoO E O $ o o Ss SoõwErErOPR Foco HFrS 30093002 Sorerogortg 3008 ooodoso2KZ0oç00oo < O DBOoOororosoosõoríL Kr O | & $OO0OoSTLCOo0Fryo? GESS O 8559233805 za 8g3Hrs SG Or 5 E Õ O o <<r O<X EE Õ S2ov0oo o FLA RISOGHESE 8 OK E? SEE Oo0OO<<L<L $ 8 o E E 6000 OO 0go00 2 008 E OO õ GE < [& O <o0o0oo ros ESEC OQRGAA SHIS o <Q SorEgAEosagro<soarooSohÊE Ss Ss E 5 ObE Qootrtoóoook ook o 2 OO O o 200 o << oO oFrdáZ 8 tocada 2LO28$o E OÇo Ss O O E S$ < O o o = ro o o õ O or OOo FA 353960 S598950205835528 o PL£LOXZLOFOLOL<LO O OOHFEO Õ Por oorodsaodsroooordxte or o or E < <q O EgSPsSAGESBAGESGio dOSGsTOoOoRRGRLo5ISLE OO Sforgoorsosreaesegoss so Gr etoogoaíkor fe E EQPEGO OE 5SoossSsPo SESHoorersçoosis5o o oSoL O OO K SFG bosçadósEeadohs ooo REroeofgfoSsroeooosroo o oo cássoLoaresõarbho o O O Oro O O0O0O < < fo) Car SoSoPSoooe oS$gort cross resoPraosi osso << 0 oorsorçóosçõooo? rEod<stk FoZgorsgeorsi PBS SoocdcoogEr5 ca 500º < Sã É o <<? <oQoHr o É o O e O $OOo < ô o COOrgor cs ocIoGoreaderorçoeioo $6 $$ P oEo Dol rookdeo õ oÕ E 8 E oo s$o<ã cocotwaraE2orósSSHrHo SHrescEróôosoorisco Sos 5k Soc PE SO 2 coscsoosoLrrodosoo ss SIGO 5HOoNhOSr$SrikoO < So <KLSICÍCOSGOroSs ses <oNrogcrSOoO00 tor aáaO õ cao oct REorgoross < 2 focos cossoo SESI O < K& o << sSE< CE SGSGITHOOS 2o3$2o o <oS 8 e<sS 2<<<2 OSSO SGT S E SSSEÊÉ SP o ES <SFE5S O EO 5 E O Õõ o ofwoo0o0o€L o Podcodcoaçersedseoseosoi sa esfseçoeõo orEE<XO > E ort EP SEO Egg o0oS< <SQ ros fsrHOo<LX 6 o0oorodo00o0Ooço $o2o0O o ÇoÉ o<<o< 2 OS OEbL O g8EKEKEZXO Soc ca Ha raaão o 2o93do o EEOSEKS SEE SEZO o<Ssl &GoOo0oOO o gQo0o Ss Õ REL O8HK <o20oO $ o od roBSwao sos orS S oo É <o5e<83oo sa aOo <a Qd ocostorooehrooo ok os < 4 oco oo ES < O SS voohrERES o < SF Ora ea çõteoS oa o oOB86 SEJ E OS 28SEOSS õ SOLO EE Eoeçosoê s bBbSocrotsgos ES : 30802 DANdSS Sds s < $ o 3 RS2ORSsSoS Sora DB: dd poocstazotEPoOoOILPOoOOrErEPZ

Be o O o ox o< o Hr < ESSES S da srada Sô ororeoroôssooro 0 OL SB SES SESCOOIRLLOoOKHOS <Oo<L fo) SSITEWFSIGOFE EE ScosdktosSEoOoESTÃO E o cocos eeoceraoostrtozx$sçoo CNN) E É <o23dooross <P Sá o CEO SZORO PR Oo< o < eso tLESTOoSOOroesiso co Eco iesoscogdst SST E < ESS$P8 Oo O rordsaos SST 5EE É og rHáoFEdao oGoscodloeçaíroSsdoogsitor E<< EK E<? o oorOood<«LOoL É oEros cr2oosçrhõaork oc5 ooo CEo SE <O OooOoí< E E S$ coco roosgçrooêg Soro sShOrsoROoSO SS o Logo otosESOoSOEoo osovcoo os oco le çoesoraoo Dor zaáarofoossdaoproO GEO Ooo çgooo0oEKE OO SO o < O <HK proftssooorrtoredorios o <€LE 0O00HK S$oF o oO o Oo cROGEErooO SS <a 2EOSO O OK EFozscáafíoocoros oPpoEO Eo<ESoOCBGHSOÇoSO ooodoobrlioocoktPooSoõo < FX XX POFROO <oSorotsço GOFoz<$oofEdaOSorZ SELOS - OroogHrHo<OooO CTT) E EoS5DER oO Egor SHK 2Ero CoLa oC ooo sSos o <E<S$ <ECSGCÍCS O o8I<É E o ES FOSCGGESPOSOSS co SsSoscoshros CESTO < O E OoOo(XOoO ESESCOO Õ S Stores otro gos 8 ISTSETA O 8ÉÇGOoSaSES <P IG SCEAE o RGHORBRO cosas osararegsosos < < EES$Oo r5coco Los 5S oo2Ê CD<ELHO ss OoÇGRoO Fosco <a Or O <SGIGGESO oocerecreogssoosos o 8 oxzht<aSooGi dg ltoohrNogoHr oO < O << < OFrOOo<SFE SES582832880AdSE SS o ErO E Oo O O 3322582385 5888035 < o E O coOosCosroosroo O 0Oo<XLGSGO O E SS800d<o<ros CD ogHK o << O O o EtooHr SSEEOS s ESOSGOOFGOoO00o0oo0o0ok $O0O o <<rLroostgaorotr 0OOo0SS o << HH o Oo Or oo <o0o00os2Qr Ooo o Õ << O O < o Lo S&S Regsocerostoasosoorpoi E Soros kwro?P E RGPRPIGZEERXOO é poxzooftfototroPoPoOo6<ÉOoO

E 3 Ss 8 T co x É $a o 0Oo ob o oo o o or & 39235 BsaroS208SSInas BE K F3orPeooso < Cox 900 E < Po) O<ZXSO dooktsosgsS < 3 OH SOSOk FE <SSGOoOOo or? Er 8 < O $ oo ooctoS$sitosês POLO SO O o > $oShHO d080o0o Orooraeaosê E< o E 552 SO co<8GoOoBHa < O OO0O<« < PR O HE << O O0OOO o o Ooo<do < É ESOHEOOLS RR [o $ < SSÇKO < 28 Eos bs 5S0oo0o00o0So|SB o go? coco SSagEZ: O o E<XOX<O4õ fe esse SSI BETH OHOESS oo os SL5GHEOVPZLOGOLSES 0ooEgSO EGgGrrogooogkEoOos& < O <2oO o ERRO SGEO<SR8 o OoHrS$HE ES E<Ç<<rEPSS EE OS eo e socos osozs <g O 5 E o corooodPsS83B E << OoO 2eEs8 <o oO E <5 O ogroo ESPoS ras oeçíss < s2o E LCUCOOO <LELSTES 3 < E < XE O S<oGHtÍISGE<& o <E SS É E ge <osdcor 8 L2GOo ES oo <rFrolios << cPíGrEXFSGOS SE SOS o <0o0OoE 9 oOE<4 o gFISHrE O GOR o OE5EE O O<OoC O GEE E SS 02 GET EaÇGEEO oo CSEGÊ E$rHS SEo5NhTE SS SG EsKo35aErosgobS coçoxE PssrtçooSÍ<aACOoS 8 a$os% bDPRSSPILSNHAHESE SS 88 8 E os SCGoSL<A8 OELOL o $$o Or oRkros oco |E<SSTEEFIHFS5HSOS 6 Oro oO BE OO OST TGLELSB F$$o8 SEOFEAESEZO OEA O OS CEEXXZOORO o9&bê8 $0o0o8S CELT EPRSS E = O OE o << 2 cocEtrLia EE <GO SoEtr$gogo o SC T< 28H E O ESPÓSENO) O O o << < O do0o2%º%0 06 E <ZO $$ oB5áddco ES 3380225505 2583855 O E SO < Rr o << O Eosos oo ão < O RPO < g Õ ss E E o OoodL É É o oRP SS <LSTREFOoOL LO ÍA s o lL<$< 5H ooo E << O00O0HK 2 E $oSHr ooo fttEtosodaraáaõdo Ss o 2oSs< caftortazoosEcsr5 o < O = 2 5 Fogo <TOo Fog s$oOo 3 REFocoosgolto o Oo So E o o2EoPoegxieirrEosgtrtecoooS< 8 Potooctri EoociócoEcooP sô <

IE ôõM = 8 só = Fo PF 65 2UmMm x o Cm E Er O A 3Uv

> vs oLQu EO < o < o DG OS o O Rr $$73SosossEesSshaooHrk? 338%SETE3SSa5õsIGe Adoos PE SDO SL mo momsOoO EEoO< o Rr PE OÇGo”DPTFGS5oOo DE O < < < O > 8 o 65 É O EST SRaiadõedõçso o bm o? SFT b fes) O o << 2 3Sg2>D8 og DG O OLE < oS BesTtesses seres O oOQqQgoOo g o mwoo>SE $ O O o Z | E O o o oO WO oO K [) oÕ 2 D$S3Sos og eo DES So OO 3oOo o & SÉ &Àmo+mmoEr Odo << O < O $8$8geSo3so ESTO SGoN OO 33 5555223580 g33333S 8 ESSES oo SS 8% 388 PapçbEoO o O0oE7E0o<íL< PSB astasoosoh ao? DPS SDL ko? DE oODTóSTTSSDO OO o = d >STosoST go oooOooOo fo) õ DO qwmw|s > E Oo oo o

SSSSSSSRSC INES NA E E STS oo ssa?oOoOm õ O SSD; 53os5o qe OH Õ <q Dodo bt ooo OSLOO < 3S35É SDS SAO SLHOoSS WD É 8 8 $ 82 8a SEO OS GEES 3 5 Só SZ Sat isrtosSs 32 Ss 82553 good 208 Ss 3 8 $S$28 8338 TEOOSHE FTSE $É2SDE SÉ SE SEOOROOSOE = 2 35838583 aEásroSE 285 gos TE Ooo ÇRoSo 323238 SSOÇWELth Ob Po PSPPÉSOSODgg osoE O OO & 388 ss SS 3HOSGOOO8 $583o3 STS STGS5E OSS fe) > o vB fo) O & E SS O2QS go o Õ O << RSS SSSSdSS5oSA so DO D>832 YO Dog SS OO E 8 = o o ww O oo 2 00 ST SSHSadEaA SD Gr5GS o q E > oo Sos eK< E OoE & = E oO o f-) & O OoE< < « 57 É7 3355 çãsorresos .— += o += 2 E $SSST3S SS SZo0LOLO8 Ss $ o SPZoomoo to S3ZSO E$rão 8 &s $$ o SoÇ ooo oPErW oO O $ so & 8 So 2% 3000 o00O 3 |S2$35gs 3 oo PZOL0HOSL Ó DS OOoOomo?obdbdS7o Sor oo oOoLrooro

O o OO O < < H E GoGSSS asas Sar Ec socoeszoosoro a tes geç5õo <OÓOoSLooooorkHoS fogos ERICO FroLaSs EO PS cocçroorofoBosadsaBoSo <a 0o0dgoro2)EH5ogZooo E Ro ESOHSOLZGOSS oO$oorsgosx oO QCOrooo EEO o O PorooorIsífokgçioo SER SSGGOZHSO dx dr o <CrWrOOOOOoOror ) < O SEGO O <oros 8 SESGREFGGLSILCoSAo SF GOF ES Ot SOEESE Soo eErto O O OE o STGGEE SO 8GHOoOo<xESdosogo < O okxr Oo? Oo oo < O É O << O < O 2 2 o<Ooço E < o <o0oOo0OLXdooOo O Oo oRH rox4dLX ÕO O < LL EF XOOSÍL <oo08Çeosrz ESTO TEEÇSO EESSGE cesso < oo O o EK O Cx oo 2LFTRELOIG ocaso oENEIÍZaoza id xooOo oro eCTS< Fases seazso EoOSZstasSROor oegsgogçEo SA 5EO<< o E SESI GESO css oodoseao3TOgx< So < (o) O < O cora ozodgo SOTESITIECEESsIO COS O E crsoeoessõo 200 oO%SF O O OoO<Xo Õ OSS O cEogoroFrsea sorriso So <o5rKH$oOo g costs cd oo Eocoçóosdaros sos iíisto? oco scosrodoos<reaooooeoo O - E SZ O of cEoSgodEroo O <rtoSro < oO Oo0Oo<L É oo oC GosEcrosoris E acre gosrpotraosdsosts EO o RS or <OoEtHE dooOoÇ? oC Gezgoarasdooro Críáocoooriook<sEooosS 260 GEO POGOOOOOOGO GEES SoOo2GZoco500 Pecas faiso o << < QE O o EO -) SO S8SO 5 Soo ESEESGESSEeSO STA g o o Õ S5524S SOEE PSs$ForasosgedaoBSer Ê O o <<HWH O<RP sr OO? O so o O KHOHE HR $000908 o EO sá E ) << O É o Oo< oO Õ sr O o o ooo o ESSO SSB o 5 o e< Õ <ocorososgaosgatos

O < rF<Oo< oO OgsSolLoss<Hro Sro<orooosSEorj CEO s ESSE HOArOo?Ss<SSEIS o o oo o OGESOSO <2SIR & Kossarroggade arg oSS S [) õ O o E ÓóOor<(ZX oO $ Becas sssasSrESsso5nãs KT XZrooooosox<xo00o0oP o o rHo?o < o EsPoSGHreSIS PSB GSSO ES çoo so | SRP S Ss ES < EK O <E o SEFES KH O O OOo o o o O <LOoOHK oO O0OS0Oo0OHK OE ÕÓ Õ sk SagbbSSroS [B3SEHSSSS õ O & 82 EK < OC OO Õ o CCÓóOo oO (CENCENS) < E OQOPêP GLEOQQS O O SEÊÉS costs <P PSSEÇRO FOOoÇS E O <€ OG õ < o << o E O EO o O 204 co oBGFCSLOEsE EHE<sgsEáso E O o ZoE E < SC OSOo S5E o OO oOxo2oHK oOgoooOo 2 orPetrosPesoso E << E o<R CoorFrofooOo ESrosbh EFSSoOocCOorso boocosgF eFSSPRS õ < FREE SSOOSO SOSOOO SPO crRERIOEO FEoorr Soo ooo Coorgsãos4i o $o8oog6 É O O Õ O É E OOo 583g0FE$$LE < o 8 oSfocookr oo <orosoOo Ss IE lL<0o0o0 E <REF OoZoIS ESSO OR ooc<oroô(sixo o e sb o Eoztreosãso BHOSCEESSO $o08 ob $ bBegcrores <<< AL o geo o 5O rFoBbçro <cooriasgção Do 2Co0o8Oo ERSO oco KEF<<a<Pporo o $85SE E EO GO ros<sSsgo caceaossçse PBESHSSS SO oO OS 5 o O < O << 025090 E < erra gõô 2QÊÉSE o < ESores O EO o < rãos SESI REPERS HogsSHS BS Pos SGosítouooGãá bos8 0028 s<o oo rgrio Fotobsesos <q SsSEecrcodoSo FERE $ oEosrHrLAE SS ec SvuPo É C$< <P GGSGHESO SESS338s CS HBesessos o5oêe obs S Ssáao<to gi FRED SRSRZOO OQ 0 0oZgZr<X<2QGSÉÊ o oít o << o 220 EO O < Ob E Er <IEÉ oocraeor O oO okK CN E o O $oã O o 2<4çg<$Oo os Pro < o < Ixggçorrrotrossoo<rosgãgos < $O8STO 65 Ss jo ES SEO CE SPO? OBESO oSS SIESEoS5HOSOSO o ooo SEISS5HErS 2/8 $S62E3OO8 O O <8ooEsrsos SELO c<3oE<SoPosçgçostioocoo

OEA OA DOES SSSCOS KO o EK OF E 5 jo o oo Ss o ÉS Oo 50o<o$ogEÇoÕBGIPGHGO o ES < O cock IT Iroos < o o SEOOEL É < o O o E o S o xá E ES So 020 oES id BSSSSGsS sos ESSESS a SPROPROXZORPOSPDOXooÉEoki

E 3 E 8 o o

RO E o o 6 ok o <a o4SfL Orego o SIR Raros SSSãas | EoSsSooroSsSSs SINES RDO € ESTE OQ o <6$90O Ss <oEIOS Ce ocHrá<oorx ss8go EFEESSOSTOLS Zz cCoZztozssi <a? 0o0r a ESSE S < o & ooreçsorgsossi cEoOoZÇes ES58BOS a <o5 OO o C<agot? S a 3623 Etosg<aêEoO £ Pp = og Oo o E car SS - o oc raocrosSS os S << 6 OO <A OR oxX2o > Oo FESP SEk FT OEÍTE > crase EZodooóa o o OE <Q CEO <groçoHK > cd rocosgEáosri dos reaoszoSsiSooo8gGosrão ã o oOorRO O Po? d<O 2 o = SITLCESGESNDOS SEK a STF TSOFRO G5ESGIESTS Õ OOPSAEro<reo O <$O0R oHESErgdos? ss <Ss o soro oosEgosoei E <<tEogHFoaoSoS5HEk o SST EHNOÓFEOoSL OS OO < O E O O oa x < EO < SSH OJ2QO doE É HE rogoodosgososShça 2 osfzoScrosgassos É X << S$E<or& Oo <E O o&ÍTE = oa 03? 00<os ISS z CororoB5rraooê oç5oOo mn 90 <º 9” o08Goo o oIa<QAK o CSSGGESRSOSS eBgES E E O 006 o BLOGO 205 0o E coEáíá<o0o0oTGEoO 9oOP oO < O oo? Oo < 90o0kK O SS ZFócoossIo08s P O5orooo2LZSo00EHoS? 4£ HEHE OQO OZ OO $ EF O<CSO 4 <<< E O $ SORGO E õ Foco e e2Lgçoo or E O Ó < E << O oOK O << oo o O O $ < o 2 362 3GITGEOQR< ES oo. E ogSSFFOS0O oEgococsGkhdoHr > <Lo0o5o G3GHoS gçoo Sol! o < OFrFrOoosx(< o O FE ESHFoOoCGOS SO E00 ab 4 o É o O OH OOHKOSL 29esoçg $ 2 - & > EO0000 << CO oo & << roszos2gf5SO É osrF<HFOoSGOOKSOO<Í EL Zz <a OT 5TILOOSO<KEHBREbHD<O Hr uu SE É O o ão < Oo << O oO ODE OOZXE O O < ESOoOtR corre S5NOos So o o O Ss poocoeoocortíosossaBrHr & 2 OE OR OO EAZOPOSOSE õ É o ooOoOoSoOo o O oO O << O õ o << O o <L<OoO < o OS : ESSSSSSE SRH doS e: d bErEoPoPLS=ZEE EX 000%Oo) o co

OQ g E & ss & Ss 8 o = Cc a < o N « o on >=

O

Ó uu x

E (7 :z - o z o a o o

E 8 q o “x = UU Z 2 2 É ds & zo — <| O É | É uu nl x o o o < un) oO oO ui — E a) à & | x â FE é xl 2

E É B > — ES O < o > = = Oo, O| = = 6 É Z < < > E | | = SE < D o Ss E Ó Ó 8 e & > D Ss x & o a a ZE o 5 & a E E 2 Ed fo W > = 5 < o O & o = o HE O XE O — | > = 2 oO = & E DP o < =| > = > Ó o x WU Lu o >| UU X| o o o o o o o & o o co co co co 3 O 3 O Q O O €£ 2 €£ 2 S 2 2 E = = E É = + 2º rp E 2 + é: s os ss. e S> <> 6 >| 6 SS 3 É o Ee 3 E o à ojo à 2/90 à 2 o à DIS m/& gg >? ji& go j ego | &çg nn CIO O nO DIO O = / 0 O N/0O O MIO O É SC OE É E 82 &S ex EX|S E ea) = 2 O = o E = = SoS5SG6£L>3O0O 5 GEESEF LS ERES

TI

N N N N > o oo < > 9883 HESFgSaZ São os EFE OOS sor SEE HOSS

ÉS S OS 92 sSSS1o58 22 Ss? o O Õ Ss E E 532885 O OX o << GESSO o a O =D SSH > OO E Q <QHH O O oro SOCROÓSOEE 255 B$S<8 85 q E o 3 ESv5EEeCsaos DOXZXLHIGSÁ< ESÇOoOFE $$ 22888388 8s Õ $ EIS < O OS 8 E E Szo EO oo E 3 <0O0kt O Oo oa SSTLTGGSO cracgrossõsãoe = & O E |E oO o< SCócb<aga<aoodHO E xoÓOOo Oo<o0oÇçÇ odor srESGiSAOG5SS o rZz3 8kHFoFf ed oos E << 2 Oo oooÇotrK o? E IES o <O Oo o So TO É Fr 692EO0o00Oo0SOSGS oTEETÇERSOGHO > = < 2 PD o 2 EFoEtrdáot so S<RSZ or SS s 2 alo ESERO oO 2Ê RIO < < 4 nz S-35<88S

ENTE SIBTORO O GE SaoakwR3B5 o ESSAS oo o SSH FOQosSoeçgo ceará siasos E

EEIE SONS ELSS sz E Gob Prooosoos creo nboozZztoox(sL < DOG < Er OOo O AGE SOOSOOJOOr o o & a XE O O<LOOoOOO o " & OI 8 Ko EOor O 8 fa 3 <> EF ooo s É 4 SBESE RSPSOSGS = o = RO ÇIO OO oOooHFEOdO e < o) ass RSSGESGS 6 = X 6 COL 000000 o o a a Sã Sã $ 8 |S O O x FS x = : E : 5 E 5 = = = = > 6 SS 6 > 8 o 3/8 8 3/8 E BZ o 3 & & Ss 2 Ss x 8827/88 Px > x > oE soe ÃEL É o|l&é £o|6 £o|o EE os

Bo E E 0

N N OH O < < o o O o E < Õ o << E E < << O Ss E O 8O S<O o Oo Er OLX oO gx o << O<ELELXLS HE Oo Fr o <Q DA Oo <rY OO 8QGOEQO O O E OQ voo o or go<o É SEO E OoL E OO PP <OTS E o E ol oro? oo Õ o Oo oo? 295 2a PH<OLOS SS oe Ez l58 oe SoSErE SE: 35 8333835328 O 3 oo 5382305 SS É < zoa bpESGSTIOORISTEZ EE FE E o 20 or oi SS O SO 5 86 gEoEregearos E ÓOo 8 5 0kKFE o < kk < do E Ô O o o $o<O o << >= EK <o o FE o2E jPozobsEzesrofr rFão E D36 cs socotads o 8 Bcgoos eo SGGHFERO o OS Co> 5 << O o < e rE OS SÉES o<sS o Er RO E = un <6 85028 < O o os 234 O <82Z<oOoQEOSHE oO5E <EÉE DONO OEO <E2RO O OQ 2so3asgsoçoo o oO Sos E O E zo 6go5raost Ss o OOo g & 2 <ZZ OE ESSO Õ oo KEKoESDEAS<A oL<AS So E O FEGAPOWZLOIrEoSESSO SEE Ee E5ZE5SoGRE ESSO PR < D É E |o Hoc ZzonNHOo<LOo o or DO ZZ OCO < E o 2oO5ho <oo ESSES pESLTCSÇedoss 0 oE Srs X<ooo o S$SB5OSÍO <o<S gh os>0ErodscofSGoedçs Páteo oxragLOoErrsaoesoreose SESEBRSESZIS eSTBROZEO o O XL |O g CcoBGotrqa . E<XS S Jó OK ooZZ<SE SBB SS HS? E < 2 OO O < < O <XEGoÉuS SE COCO ESSDOO CE HTZA SA dci SE ow200065 So SckrR3oofFoos2LOor? o o Oo Ow Y Oui < HE O oOxoo? EL o O Zoo 2 e <K<oso os O0OO o Soo Ç GEN SE O O EFESO SESI BE ZAHMOoSZ ossos aoes É Sora 8 o <Oo< go o o < O O Z p2úPSósoSSIRGHO É Era ÁELogbhoorooPrkeos CE SS Rage Besrto e roros o o< Or xYxv [= oO < O <C OO Ss E OE 2HEO x o STE ÍSSIZ o 5 ooo <caBSQO <STOOO ss basco nEeÇES Soo OoSOo Ss o < É O 8 SEIGGEOS GEO o or > É < 200 | FE SHNHOSGRO O OOo o CM Oo oO <X<O oO Oo< é GcEoOoMHISA dd doSoSoiEoosS 8 8 s$ $$ | x Ss x 6 E o o | o o o o Ss 2 Ss x 2 x 7 [A [A o 88 os

N N N co < . 8 & PÓ

S Õ | Z & & C É o br . 6 >

S O s ã O > E 2 E +» x à 2 $ = E É ã e Ss 2 E E Oo C o o 2 o $ < 2 o 3 = & & a v x >= I =< S > 3, 9 LL vw < =| — <> sa O jo > O u E OX 2 4 E Er o Rr o x > O 16 à o O 82 É o Ez 3.

E > oe 25 Sa < < O L or uu OL = 27 O x EEz 3 z

Z 2E 5 3 & S 5 8 bh > Ss Õ EK o 2 on a S 85 8 5 ã = E [EE 2 E o < bo: O | 9h sx Z a o > E O E 583 O > uu) o oO >< 2 o > Ss > o O jõ x o oO Z = O o o 8 E E 8 8 =: E = E É: ré: pé: 8º 22 ,/58 3,1 ,/823523/Sãé 2 & 3EÉ/ 8& 3É 8 ÉS | LS E & se DIS w/&LÇg >? &go o | &So go n DIO O nO DIO O = / 0 O NI O sã & SS & Sc 8 E QQlsEexXlss E XI EE ZF2A9O E E Z O E EF OIE & gq ES > O cow SS > O cow SS Ol l& O Ojo co co co co ol o o 33 ESSE voo ooo E Sl o Soto sor <Hoóogsl s x $ € Oo os $ E SE $8$S 8 no E õÕ o oO 2ãdSse Port coz B$28 Ss Z CDB<O 263 EOEÇO o go É 2 o =5% Béis Ger Õ E 2 E CT ooo 2 ou ooítda SI os < OK GO ooxr SE OO L23O0O 22 ÇK ES s$io? Eosxr FE GS

EST SE > te o oo ES < RPE S=CEÉo0STZ Zu = <E O c> Ro ESG 02 0/pOÇ6kÊ

ERHGOFSELZDO Fr <C ZUL EH OSOHK un Oo EÉErISO go FE > 9272/00 <€4 O > E GE < E < OS oLrigokK OX wo Sokg

SS EES AaZo jopE$o

DAE ASK > &% E Oo oo

SS EERSHS o 2oEéfiorz < — O <| |O < O O SO uU>X|oDK < E EGoESEE v><uUuÇo<(L vw << OL O OO SET GoG oo o o Rd 0 0 EK O = < Er OÓONIÇrEoo E 5 oo 2Ko<o S 9 o Z E gGFIÇO OO 2 à | 3 |&ã | Sasçesoi — | u)| e Z 354 2>|io ok 7 2 | |3 | ZE 23H58 õ < & = GE nobõooo a a o o o o o o - - - SS 3 o? ) o o x É x IE RI ERUÉERSIO E o > 6 > EST > 68 > o &S o 2 9 à oO/o à 2/9 à 2 o 7 o 7 | g >| É go É ço|S 2 8 &|8 E X|88EX|8SEFx > x > o E Ego e SESoE SÉ LS É ols £ o je é ole é 0/0 8 35 os

TR co co ES 5 o g 833i5ss | 85 ESSES o o o ErHK o OO o EE os Õ o o kxO cos O So < Oo < E o oOoS<<L DP k 3252 cercas | Ec R$8348 S838S8R | 38 gosês < O O o<5 > SE GEES < 333383 | Ss Bisõãs < O OK O O 3 O XxX ESIErár Eorgaro Zzoas ES SSERO [SENT ENSENCENO) É z O mm oO < Õ o RSNSENCENO) gs O > < Doo << o sEÉíRdo E o o SoE$s$so Rr > <<<r Sa3RS2E | e35 asno? soc ESGES dó joregiãis So5rEroro 2 Sa E o so o) ooSsi sSsaÃo GEES O & O õ & < oO 35 o Zg<<opr o o & õ SG OO EX<$S0EHEZO & EQ 8230006 or EGP se 32 03308 SS 58838 | E ZE pS2ó8S

E GSEPRO <oXtoRQE z <IfjoPoreo Sd <$<3SE ErOoFRREOPOEoO $$ oOSO Hr o Too bos EPe O ooo Es > oZ0Ká 20000 Fosdídgéao O no OOo <E O E Cook <k 2 TELE SS E SO LOOÇS ar Lo 5Oeo Ec Soros rap eoçHão O 5E< DL = ) $ 20o resossiá E > 2 ES E SS & SEE S SS 5O EE soros SLEZG o oe <oOLOoO5mÇOOSO Zooax*>xfM6k<odoo0o os coxo SEoZsaHSáSsç5o ESG E E FÉ 0SãoO<Z < KR << O < O SFG S | SENTAR LS [(SENo) 2 L O o < O oSGLSOPRO CP os POSSE <GEEEOoÍS < 2 ES orsSo SS oito SE $nes O SE O <20OS a 2 Ssaímoreoss SOCO GEÉLSOE 8309/8308 « EFóogcsoos|) Ease 058 3 pocos SCE SGBILZOOO é B8SHS5aL Es 3585 Ss = < < O O = SUIS o oO TT óáósóoeoocros) GARE RISO GRO o bBoocoooPro aorroitrooro 8 8 Ss 8 o x õ x o E õ o o o eg g o 2 o Kês KZ o 3 o 3

<< o “ Escor Z e EC o8Ro & & $ESEO 2 6 FL OoSL | > CASCENSEEASÃO) Z fo) está - 8 & O o Rr < soe O | So 2 <ço = OÕ So 9 <Eg$sFro = 2 o o 2 < Ê a 356 z & O O O >= Ss 806 o ES2O06 2% z 2SE5S | EE & EÉSEFIB DE sv o oooFE dO EE 2 E O o 8 E a 2528 & Ss 3 > SSGOF E O 3 e õo<<Q 2 8 E rEooos É = o o OE > 4 às SSL | SE | &

LL < o OSS El a El o o << E = o otkoO nl Oo ol a <E O O > GEES | ES â| É SEE E? | É 2 o > OQ < O <O xXx Bê ul & S5828 | 2 à < o $SSRE 2 O E É >= o E

CEO ZHO CX E < EXE ZOO > 7 > O KR SF PD %X à ESSO 8 o 88 o 8 o<íá & E SS 208 zZ oo SESSO 22 4< o o Soo a E no E SFC oOOoH| 22 E ER es BSEsÍÁcrl gs & e < O S$TRO S BE 2 O SPOb $a O O Ss O < O E ã Pr X é 653355) ss à 3 â o <OFroro u< oO O o o o o oe o o - é já é já ç E | 36. És E É : E É cs 6 O so. lc. so.ã5O> o à 3 É o Ee 3 É o à Oo & 6 DIS m/&LçÇ?> Q O O DIO O nn CIO O T SE É E 8 É Cl8E&% = + = = EXITO S EA ZOS5SIERO

Bo E E E E E o o o o o uz 2 SS EC Z3êP DT OyO

SE 3 8: 89

O Zz x s 2 o

Z $ do > OA = Or 238 < Ed: soa < 6 >

ET 3 So

ET

E 88 E p< O o 2 E É sê — mn É E o é $ So

XX ORE O TETE EEE

E & É 2 <€ 5 ass L Ono x H > OO | TT no | g á< pp <€ É & ss o3> fa) S | FE s o > Z = FFOÓ Ss & ã (2 a GL o < O > um x Ê Z 3 7 õ o s z | O W EEE Ss ã wu Z 545 OoO> 3 | = | | | & | 3 88 o <= = Ó > O o << O! ooo 2 oe oe oe oe oe = o o o o o 8 o Q Q Q Q Q Sg 8 o o o o o x EO ZIU0IEO rE|Et E? E? o Ss soOETOoORAOosHOsSEOSGS & o à ojo à 2 / o à ol o à oilo à oi 7 & gq o & go &Q O & go oie gOo|S o 8 8 &/8 8 Qg|82r|8 ÉS g|88S Tx > 2 SAE SE SSE SAE ZSKSS «a fole Fole E ole EF ole É oo 6 2 o - o =) E ssrARSSSA 93 5 o S<Lo o fo o < SL B8psso sds ES 2 O (o) < Q É E CTF ELILCÃIOS 29 5 O o ooLtáa<<OooQ = Ó Õ F2oo2LIAOSSSI Boo | o oFroS$Soore$Go E 8% 8

O O OH O O O O 3EoAS5HSS 2a SS É 8 o Õ 3 E s &G co Sracrorre ES 83 Pabtasogasos EE ÉS 0 oo oÕ õ < n = o << OS O 26h43 2) 3SgGróçãao soe =>2 EE O ErO2Oo So OoOS ez o cocsgresgaeos E5: BS cráscocrosoco Br o o R E QOiL oo $OO o E SEG 5522do ESSE o OoEo E & a oso SS oOoSE<RGR5 degelo aporprococsSsE<ako C oe É 5/8 E 0500 EgESO >< EE < oo <o O Sox O 2 ão O GER OLE SGSSSIES EZEÓ/S ob O 520 9o <£L < O IE golo E O << Oo oOdErEoõo Zz2tLRHKHO ZorEgGÇoLLOHOÇRO Ss SEG 0 <a<GESIGEF OLE O zZ0=2$< So FER SO S<STSL E SÉ X> õ < Ea $2o 2L2o0oX< E 2 Elo 4 z<ESDSsoS doi Ecozs> R$ 6 <eooOo 28 oO T GU 0 ZE EÓOOOREA $ o SE oÉKjoS CBS ESSo5nSaSSs ÉESGRÊ > |O O $ o << ovas O oEoOoILSoCLoESO jpuwut%2io< = o CC ocoaIaIPREOR ooo o Ko orkSPOGO0O EXCEL O ES EQOO obs5á<£ 00h Ss o Z < E < < Oo Foro 3 o5f$ô $SERXR2QO < OE õ< a <ooLorb E & ÉS 2900 8LoBos5k& nSaAEE ui < uu 000c Ego Zgo<Erik lox on 2 o Oo CE ooSdS<aZg OH oO0O NS > E o RE O TE E OK <EXEZxXEGIEO

DESC EERSOCSIHE SEE ZAES o SFG ECOoO So HW AARO 2 O oro [CNT < É REI SA s ESSO GESaGorros ços é ERIC ototoo Gás ERo à EESSSSSREASO5 22 SE & ExSSFecrassssepassoi à ld /6ooocorooProzEP ca<od0|/6Oo 2 S Ss co co co o o o o o S 8 o x x S x S o E jo o o so o = a 7 a co co co & $ 2 | x 7 KZ KZ o 3 o 82 bb

EB E | o Oprdoo —

SHAH MH CISSA o < 5H oOEQQO 3 og = <X > 595338 BOsadoi $38583808á Eng E O K o 2X “x < o rostroior vCESCOXXGO E O 8Oo É>GRã soE2SS5ão izú022s: E O E = DS z rFogçoodoço = > E BL <Z <<LOGLKLHORO > UE 39X É EoE PESSED-SUTANOS) OE>>392% O OÇocoEHFr ra sogorg <CEGOREEO o ESSTIEÉER C< 0 0Oo $o EE osõkE2) <rE osrosSssSeP so2EEKE<ETS c<rooldszo B2ZÉ9E8$ ZHZS sS5SGIG0SOOS LESTE S € cooodtro CE oGSSOo SOCOS EHSO SL oezx% 009080 S8aF HE wSÍÉ So bx Oo 2 SEG OG8SS Sho, cESFoRÇaro BH 208& sao os EEçoS < 36 ÓLEO os aHEFIRO<XESÉ SS SS Froaraoarzs 33308 o EsaaEsÉ oO > DÓ O E obrtoEHwF<<ºeoS EóOPZR3ãa ã ooo < O < O uu à E & SE Z ot oIdoSGrês 25 ogsErs E kçkooo oEOO oe GDA < 9 < E E O OO a“ Óó << XO Estores IGN OFBSoG correaroago MEZAZZE E < O O BEL IZA< SE<LSCÃO SE OFLETãEÁ É sctossããrk 3a CE co E EoodõoS< od ÇgE+; BS 3G2dSSo ESSES O O o < EFO/D<X 2X> < CS 00 É GRE ÉLCZ> - 22080552 de zS$3 <83HOSOoSoo<HZSO EE SERASA DRSS 25 ZE ego SoP Su KAOS vó 5333388132 3022%38 TEQESEO SH óSosZzESL Ss O < O o Oo O oO 7 >Ox% S ESTSSCOSOHNE=0X228 o < [= O uy o s o o<KE 8 >= 2% O ; DSSoBiassinitsisic: o kEdoooitaooo2=3S>7E8E oO

E o 3 8 T co

KZ o 06oOo

Bee E oO oO oO = = T ESÇQOSH oo> RF 0O90+xr O o Ho o CHF R>S Eos hao ES 29ZH4H20S OQ r<K x ooo GOES Cv > 3o< o > os seres Ciscrid Eãs EZZO3ESYL ço z=3 32 223 cESZGESHe SFOGSsEX CEO Stgeãsa HFHasoses 5H Ss From ÉornsoxI |Éo0E IE CO < O OLE < <g o OLL E => G6XUZ É E O Au << É E O sESZ3Ão Bicas 5 [65 Pr << 6 go!po CoZrEror+y Po LL OO E à ww uu SS IT o3% oO uu yo Tc —oOoçZELO >>> XE ko" >>X>XZ SGITIEE HFocr>IW<0 Bo OST 328 O EÇÀLU>> E P<ESCEITEGBEÚ nOoOrEé<d&Z n OF $8C38or LESSA REE O mêoa A o SEX GY 5 E ooFpruY BSOCTÍsCo BS$o [A wu Áõ xXx EH oroorkEgiêzEEoZER > Zo0ZoEt=254 Sos oEa5ark na gEo< wu SE oO <OZnalk oo <30o0o2ºuSaoazw>2UwWS Gs ww OE>HLToS3Soan 2? 2% gooZ Es <rpYçpE SENNA rooE or SEgrAa=zdtSAaRBAEsiSãÃa Ao sim >= P<93S Pá GLenóECasEóssZzEasEó o 8H osS/PAgsÇE= vo OE Oxvo6ELLE3IEROE ES 2Qrárjo E Y GITIOoRrsIT OTA roaaoooas oE>=O0057 2 KXóõoa0nta?2tãávio oa 2 WE <IdzxPREOo<Lo<aoa> EE O < SEoçrLEtEeueçooULtiáacaçãoo ga sara Hrõoasaos alo — & o8ELOSNOLXSEStECrokho rECosgGRgaAaltsIao E Ao ZHWHr E <ÍogE SS SEO <r 4%” SET TREARZ ss SOU Sds 23 %6 E É Z”* 2 r3o8 ZUO%06S zZzísrosõ 3 GErraa;|HoOçgosrEsAs)SA >> o ITXFEFoOUOÓÇS IZZÇHWw0o a 0o0028Z3IaUEHEZr o ças r=roEH Xo São SO áNrorso3atihKo 2 oo <> o EO2Ç <> 2x O 3S>30Z=&%37OÇZ7H)H<8 Tas ZO1H)H<S 3009 3zr5s o CoZ2Z0oSzsGrHo260 Ss 02 OoOgzg>>3S0XKX> 690% >>320 EZX e QS Ê cr oanabto uÇ£s3Sodiío | E 30 o 3 063 ZXO zonçiíigo 2 O = a Ó = <€ | a > a 3 dc oSztiRadóss isca on o EzEHETLEGoSOEGoLIC[EO200O

É E É 2 à 8 a à 3 8 8 8 8 8 3 m 3 co 3 m “ % Ss “ KZ KA E o oo oO OOo oo

EEB E oO oO s ? uW o 3 O qEEZ 2X qro 86 SoÉéx bot SsITX pos 35 o < T n escãá Bos <2Eg oo >= q x O io x [$ x<23 cSEOF EI SE o=Z44S dão SoO=&E HS À d=une2 É EE 4 SEL vo

ESG FEZ FS ZZIS BZ 226 2606 a 2 çÍE538 7 E ZÉEuz < uv Z Egg áRZ= 3 E o uU> o o a É 4/9 o To = AuU3j3Z >= 52 gcEéxn<>32O2é o XxX ouUoOo zZ o& & EE SÓ ZÉ $o sem E$sg <rógikbso <É E & = o Fr - = o = > IO % E 2a P2>0/EX% o %Z vZ38$ o3SS <2OKÉKo63S <3 ESSE n< Oo E 3X < << O [2 so; <EZ EEE RE Z Er x Sã SÊ &$%xo CÊ &&8 Fo v 3 OS ECLFAÇDOAS & 2 sa uno EPE, to 83H, EE <roorkgei gt <g]2 2 E3okH<X Sor=t>39290908E20zZ33]3/>3090ÉLtz cá gu4NeÍÉZ O E 20 0% 236 & Desta S32232FIZasgçaçBEr:E ELOI GOSTA LZSIEioOS Sano Z EXE Pio 6o03o 30 <Ço Dn soTrT EN Xxo7<>O CE ZXOoOdÀd<X> O 3 EC SE ÊÉó8E TZ OE Ê OT 2Log%< Rh or e 7zEeEGCAÇOoL) 2 e çE Cage okEkrors>Ooxrigr or ST> 2 o o > o O 2 7ouxX n O 7) - >= <E2]S EEE SOSGu RE ERES ErXacóeasassaro Seas i: = = E dukESSDAS SFN AS Sa

ECEUE CEO SIGO DENSO á2ÉF 55 aNis SÉ < LL Ogo|lL Õ uu SH 2 Õ uu

EXESSEZSS E SS ZE SS ES E datas ros sa isso ZzUOo|t É Ez 320090323 3202903 3ríscHESESZZ ado ES: ELST oEFrçoraoad st <FrgoEra <<>Z25Eh80S27 2x = LSZ2e Fr ;Haos3Efiíumo84osoíi Srs xrxrsçooo Eu OL Z3oO0%EUO s o >3Sr)ãégroZzosoa*> Kg ÓóZaoA+xr g otbtoQ UE XoOosSgQEO NM =9083? Ss BriÍi£zo o) o ÉEaooO Em o E à GSE GEES ERA GN 3 jS8>=3E 2 cessa K< tços Ó EO o =23Z32>r+->;><tz=23>Yx+* << £ É 3 7 o à s 8 o õ o 8 o co o m % a o EK $a E o oO OO oo

PO o oO ? 2 — — O À à uu — O À à O C 2060 >1TSQOS 2060>T%*% | LL 3 > [O & 3 & Ç O 3x“ ç OA o S & 00 $>t= & oz <O dx ESE3330 SSE332E Sr SoOoERGOSGH SERROTE Ww 3 E OoZdOÇOO? E OoZ OO É < x 2 « x o o um x < < x < oco TE = O | Ima 3 Ev < = 583 ZE SET z $3Z OX EC) SS É go << E 3 (=RrROÇZ < = Hr Oço323O9 E< Rod É o od a“ <o do ZOO 3 Oo oOoZ=060 o > > oo oonÉéço > n&Q amor 25 FESTA EZH BPESSROZ x ároxisl árgs dus > E CRE SOLXS Cr EÉESOU AS u< DE Z>3239% FEZES LO UE Qussgsozgo 2QuzSoxNuyu [A scozZzmuX mu scozZzuwCEu oO É >= o6>EkE 2DÔOo >= o>stktvoL

O SOCLÇOITTE SOLO ES E o o EI TsQ>3XZ E IT >30% z”> EoÇÉSZSSOS EoÇÉSXSOTL d3 FrESBSE gEerEÓSOZ ZOO GÊ zZ Do o E zZ ox 2X past E Pabst iamoó 3 BED AEEFEO DEOZEFHOXL 2 SRS G5NeRBGASSCCa: ZÉ Masasessinsaçadossz PD a Po o SE Bass roscas: So X OS fnsioX% sh oóoSgs%Eo% < x“ o ErGQÇyoktOoI NH GHoK o =2% 35 os O 2>=< 337 2% 432/O0Oy/7>< 3) 22) %C% << < Eron SYZE<ELOoLnuçYLE<Oo Ooº |s a = OS vos à 3 000 08 vv 020<C€ 32 o o av LO2CE EO vYvíX<LtL23O0 O oO o o xr É > O>EEFOoZ O>EEF> o < 4 Oomnunono trair tono n1gyg AE Eu Eóo<ras> HF EO <WE <IU< CC < Sogocsautbía E ooo ibh >3 EooHrFEU CEO ORNE EE ES 300928 EEFI|)H2 9028 S6O EX GEoISsIENOSGoZINECZCZO9 6 IT SE SEXEZ>S2THEXÃSAS nz zSgZS LZzíis7ESZSLZHoO o =Z 3 o GX E DO 536% EC 2OoO u > 28 sSrEZAçsGscsreÃsz s uz << > L zZ >” FE <> L Zz o o wu O 32309tLÉ32O 30 t Ló oQOYX 2 ox“ TCE roR ES o o w 5 z yu << XX x wu XX>83O 2 4 oO Ez ztoósohzozacçoL 2 ES EF trsorgEgZótCirsor é joE ]EXoÉKr>3oxmE=H5XoÉES3ou £ É 7 7 e 8 E 8 5 o = Õ x R Za É <a E << O OO oo

Ber oO 2 r 2 Oo o or 2 3 DEE CELIO rsasssaodss SERSESSSL5a? Siga

SEG EFIGSÁSGISEA SH RS 5KE < 008 O SSERSSSSSAT SSB GAP o Ss assa: EO 00X O0ookK 278 a ESB OOo SP ILS GSGSGOSEZS SE < | Er O EK &S Ss 2 q

SEIS SSD NS OSCE o<eGESOBCOS o 8 q 86 Sgoê coeçcofitotosçriissasiasta s$$o08 SESGESSL 2 ooo CrogfgooLosHroaopsog? o <4LOOBHOHFE o PpOo<< 8 8SoSYS KH O KR o o kEoo gs 8268 o 2LEHOoOoSE E O<< 8 Sacos <o<LoWFSoSS<HE OS DESSES Õ O O | Do Oo

EESGERGOHOOSPRS SEIS

EZOFÍÍOPSCSOL ESSES ESFSGIHNFIZENEARoRITSOS Or oo o S&S Oo O E EESESSOZE okE topo oo EÉg ER O o8oh5r dgEÉS3S os oScoPndáçõçeSoSsSsSSasss So SESARRESO PSOE O << dB Woo OoSoRg O CSA GELÇES SOS 38 NE Õ É EFEQooOoPo SS SER sao SESSSTE SS SSB Soasod aaa Rib SFG a isso E<ôO6S HE <5$08SSo8EZSZ OE OO SET SOS Sa BESOTZE SECSEAESEZ oOoNiasasgsósdsã

PESTE OKOS OS TPICB o SESC OELEAOS SEGA DE É < O < >? Oo o E Pb Ge bg drasos sado: o dá O O [e << O 8 2 2 8 o É E 20009 ob5o 8 & 3

SESSGSEAZOSRADGSZSRRE 5080283855 38 SE rasissçados iss! ISEL TREGO<X<XOS<s SE & pesos sátecaotassis te Õ Ê catotrtazoosEsghassSSaos o < o o 2 =D é BESEogGróssçS o sDAaDai

DO à SEoCOSOCHECOO0P OSS SB o "O õ

É ES on = E og go 8x < eHmHK fa) Zo5o

BP Ly ãÃOO - fooc3o 5 o SE TS OX Hr E < Õ É O SST ESENSSSNTRNND: o 2 OOo O 2 O so mo”oOoÀ&S O oO LoOoloORL << Fr 353 3&SHKHOO0o0OOotoos<s o Li Eido DS EOOO0O0OO0<OÇGO TER O SDF FEOLZLOOOS < E SO 20 53 oD8oO É E For eied<a 3 83 88oriáoktagesdobLsdS Pas s2rEgooaçostos co So Rss aa sad HER o Be tesgoeooo srorsateoss DPoo6ESOHE oo? so É Dm às O o 2 0o<tTo O 2 8 88 8OEoor o o 2ão 6 $b5ErE o EO o<á<S 29 He << O << E O <E PO 3 SPT m-ãoo0OoOS& S2Eoro<qooO SS To oooo Coríáso2060 KH ?DoçÇX o E of < EO a SP 3SFÉio SK os Ss SEíiaPezgiosos 35 83H58 HO = XE O Oo 3 8 85 Roos osso ossS DOS om < O O o < O < $ ESSES O - Soo q OST Sb Esc NES 6 < 3 oaosDO OE or O oO fo) SS ETA [OBS] a EGQLO 8 oçÇooSDPCO ES 30 o < SRS S GG SGSo5 Eros IRIS ASSSvó Sc s5as | $ soe < << < É [) mo so ESOoOOSrH OOo [) < O O o & me do rHrtr O oO O O O OO o os TE OOL O Sono S a RS Sado 2 mo?o,oºobêoS O oO w O O sào MW EK < O FoQsççõro SS TFT OoOróôçreshs o or 0872383554 33852238? Z p2P8oO o O o E E SBD areS SEDE 3 & O2STBRÇ OrFro SE OE E o qb oo8sOoOoor o Oo r O $ Sp aSearoóoç<ogo o 2 oS<oSo P DO mmo>oo orosrEcrooodErro 8 mOooObgo oO Oo ct < O PO WMO mg SO rs O << O OQ OÉE o $$ meoqçqgosOQOOO o OF O OO 23 oERXS8OFrpPoOoO oc doo $ &SoPT GOO oESS o << É DE go ooo < o oSss | o O 5àooSs HE <L O CIRO & So $ 8RFOSOEtaesoo o < 28 SB & < o S&S E 20X R 2 OSEotcr

Ss o so Ss o O

Sos iso sed sstcisss o 3 &oQg OE <

8 o Ff SPEFWK < O <q O < OO <LO

Z 3535323 958$L3SESS5 o 6 DO Too Orooooo(L8Lra oro o OK EE Oo Soo 2H fo) O O o kk < oO <gk o o oO rEoOoor <O0OOGSGO < O O oO > O KH < O O Hr O 6 OK E O Õ $ o oro O O Õ o OosL É 5 o < oe scessstonço S< E o 2SLooooOo Eooeosgçopooo <ogçrooggeao0ooh da E<SCERHS 6 ÍooZ? 0400 So0oSS Õ ( << O O 5 o O O Oo XOO O < o < o go Q o orkr EE O 6 <E E É PrEGOGEASSGO SoGSGEITO É or <GOOE EE5ZZ 8 f- sas RLOITFZGHrorgos5rES Sorgobsdaosgstraáagooçstos ao SGCáGIGOoOSSToOo o LnNoREÇSO CEESDSSOS SooErorores < o STo0oo Iorouol?l o as oosoNEESE 8OE$S < E O É o x O ns) O Qroro O O O < oO OE SEO GESSO aSEErsaosso SOEagGoSEoSRoshErooss SrEroodsoSsaPePesoosçs o So occroscsotosrroetos oreaareao20oSEagçoor? E << E & O or<á< < 0 OO << OO0OkCo| EkEo so oe<ores caso NOS oEro Forodcítosçoróoshori o ESEGIGEFRÇOSOQ00EL <rososgESSFOSES <T<E Éoocoltoçosges CSSTB5E <KE <<< 2 E É E É o E < oO SO SITESOT< Ego o PO FE <ESGESIAOSOSN SP O BK o d<STLo0osoço o or OS

CENSOS HOSEST SESBGEOS 00 08SÍSo g so BO 8 SOoErosço o o o0dOoOo SH $O É õ O EO SÕEO o OG FoOootrooídokxgE < TSE << o O cocos ATEHRriá < É Sõ CSESTHSHESS5S Õ oo o < o <r4< o ooo? HK o sô o o or OKOLS $ - cosctroçestõçoosoa5o?tios o <P oSRO < EE SGEPRPE SOR E E SEGA ISOSOS <S5HO E<ortsasgsosfçn<oo0 Ss PE SS Gatas 2a Orr5 orgçogos < O SORO 00rX < o 2080 & <<20085S SoocoFráçogsri Ss5H ES 8 os ookE O O0OO0O 2 Oo SEE S o E < < õ Oo O DE< [SENSEETSNO) o 20õ6o o < Foco Sssoscrkos < OO < 2 S cre oSóooseE5So ESSE S o O9LO <LG&ELECOSCSHEÊEO & BesoesocosçsosoçEeosoos S Ó O SEO <$ o 8 ÓÕ < ÕO O o << dooOoiL o > 0898 o ok <KXO<L O EF oo o oFEoSSE SE<Oo

Õ SESSSERSSSSSSCHEAS SS

TR <r OOo o o fo) oro Fr < Sos Bogetescarásgobs Srs BEAESESITHFAELISAGESS Sr 6 E 6 o8ELoo0o0o$ oo 8855 RESAZIGOLoRoSS o o õ og<o<< SEE <$83OBbL 26 238O Sõ o Oo o ooo SESE 4d Ó SG cE<OSGETHO STZXE õ Oo < <4 oocHkFO 2 Oo o 2 2d0o o SO SS oocotr GOSoFHF O O OE EG&< o < < 6 O o < o DEoSO<XOo o OE SE os 9005 8 3 $< Eoãa ao SGESEES E s 2 E o2ÇoOo<Frô o P$0o OoFEOOFráoO 6 Q60oO or oo FREE <CÇOO < EOOO ÉS 35308 <8oOoçç dó bBossrossosóseis 28$o EForgdoredoSs oktsa < 822 bproL<ZEoócstooPrESoO SRI HEHForsíssóobtieosooPers É or FEo Erros ooo0o Eos S5E wOocsoõxx o E 32258 SIGILSS5OREaBES SsS<8 po EGeLosroPetrso o $çoOo 9 054<FE < oPpo<O E < PoorPpoosSsS < GEO o 82 Eororosg? SEO E DOE 2 So o<oorodgosx<?d04L CNS SPRPESÇGEECoOoO SER õ EE BoclSoçoo EESC RO O O o < Ó O Ó o O K O o O E O oO < OÕ $ & E QÇO << OR O Õ Õõ O É O < O oO KR < O E O E á< O o << ESSO x Oo< oO O o g O < o - <P 5 OoRGEáÁáSO o Z& 2 < O < = FS < O << | O LOS bpsáaftwsoFosioçrobLg oosS$8 oo EP ooo íÍiao 98 < E 2 S<sSs<aooNEkS E SO so RoOogFESSONISSISPO 3832 ES SEroSsSa5e E O S FER SO 5 2eofoodos oo opoocoeos aa rkrorNPZ < ot ços <5F5orIÍI OCS OO 06 <<aTESRBORBEOSOoHLZO00h5OO CTPS S<ELL e oGoEsoro Eorsspsssesesockasrçoo oo E OoSSO FIO ORE RZFÃO 9900 $|8 o orgo<osEiio E o |O FO 2600EGO o oo cod EpoSsoosgas ego eo cErsáEtasbprs5FrEoosSEESS FOFO ESCSZEOO S<0O0Oo68 od <oLo Õ oO Hr O or << Ss oFRÇELÇNILOSOoOTL <GSErô 8 <oo8 88 oo do o0OoL< S 3 E o 2/0 XX O osrosorgos o O = O E SO EO E EE << Oro > SEE (OB/OBRTANSENCENTENSENCENO) rOodgXoo < O soe O O O <OoO LO o foot tkErEe oretrosoRgõo o o

3. o E o = 8 à Fr <a o oO

EE E x E OR o < cQozoOoGoº < oe gsoo O O C>ÁÉE uu SEZS5 oErE2O E&>O8HNS$o EEog&82oSsSHE x us > Oo oroíTo 8 < dz 4 X <dx<oSCço2Ç0oS |5€ z Eu E - < Cao É E 2 A E << 6 E ESSQFrSo o nprs<s*tS o<foosooÊÉ EGO EZE ocrcoseaI5Ão 5605 á o < o << ra & = o EoFa SHOT FEZ nd cocdcosdgoé E os2zx3 <5<o0o<P2dOor0 PEC XFEÍu SLEsSErsos ZESSGADZ OISHFIEHOSOS Ensz396É <O<OoO o z Rã E5Z5SoOEPR SS aÉEICÃÉo co EhIASS BH Z373É%d cEooSgoSgEROoO a à 4O0Orao oÇoroosgta4jl 4 oO 02 >>& Õ ooo 8ErEA< x SE > <4aZ SESPSECSS os %t2ookr < o EO O(< oo E E TT OXXXr S <FKEErÍLXO FEF<OX<X<TX OEROO E O & ot Co o o > < < O o OL < o É v ErOOO0O É |KBSHSE 335232232? BSZ355SE roogsgsogão DA>&uoLám ZE ÇGOSOE 4 29E 5322 %CaozZz Core ooçosrk o 273707 %r%C%o6ço Foo fLfLoo oo 2 Fr 90 3oÇQ cre rosçõdo |<Té537ESa O Oo SEO o FF Ou 2S e

ESPEISIRPIISIIS IDA o E Õ 9od0oÇSE< 24º $rFosgasasehoZzEizãr 329 eçÇassHdaia& tão So SSEFreogsoosócadisk OK o SÇ5sTNEOoSOAEFEZgus COFGGoCLOGO0ELELZ>ZRoRo E OS o Oo $Xo2 & EE O o 3$ogHrH GÓES oSprYrtEo OCL STHFESP OA SE as SEGSIGER Lro EO ZH <aA%z>z> so ocCSIITSSCTHOGEAQZ3A 25834 <EoosS88<É [ATTENO) <2Ç CC oçsi ow om 2 2GL IZO IOTLESOLÇOSS FSOTCoAzZzETrxr cs BSsSsisSoa 2232253 o eEESSES O Er SG XHXZ2ZO s É oO ordÃM oOAnZçESX Ss <EsssoaRidRESOC5ZSoE OS Erogr Lo < 3 S$SO0OO0OR AO xX Ss OX 0000o0oeOoEK30oOo03 du o OrFrFrro<so<aroop>2rYÇYrozZL 3>oO = os 8 co $ o o tm x E ES É < E O ooo

Bee a

TZ r 2 Oo o or 2 3 DEE CELIO rsasssaodss SERSESSSL5a? Siga d3GFSGASaBGEa ssa scos 5E<SCO0O SSERSSSSSAT SSB GAP o Ss assa: EO 00X O0ookK 278 a ESB OOo SP ILS GSGSGOSEZS SE < | Er O EK &S Ss 2 q

SEIS SSD NS OSCE o<eGESOBCOS o 8 q 86 Sgoê coeçcofitotosçriissasiasta s$$o08 SESGESSL 2 ooo CrogfgooLosHroaopsog? o <4LOOBHOHFE o PpOo<< 8 8SoSYS KH O KR o o kEoo gs 8268 o 2LEHOoOoSE E O<< 8 Sacos <o<LoWFSoSS<HE OS DESSES [) O O Ss ooo

GESCESGOHOGOSRPS SSIS

EZOFÍÍOPSCSOL ESSES ESFSGIHNFIZENEARoRITSOS Or oo o S&S Oo O E EESESSOZE okE topo oo EÉg ER O o8oh5r dgEÉS3S os o CErEGHRSO RF SSB S So SESARRESO PSOE O << dB Woo OoSoRg O CSA GELÇES SOS 38 NE o É EFEQooOoPo SS SER sao SESSSTE SS SSB Ss od ico AEDI oolS SHSSGO330Sca is io. E<ôO6S HE <5$08SSo8EZSZ OE OO SET SOS Sa BESOTZE SECSEAESEZ oOoNiasasgsósdsã

PESTE OKOS OS TPICB o SESC OELEAOS SEGA DE É < O < > o o E 2 O Ge bg drasos sado: o dá O O [e << O 8 2 2 8 o É Er 2009000 Hg 8 & 3 SESC ACSOSEADLOSSSSdE 5080283855 38 SE rasissçados iss! SFH oOo<<OoS<sESEZS & pesos sátecaotassis te Õ S catotrtazoosEsghassSSaos o < o o 2 =D é BESEogGróssçS o sDAaDai

DO a CEFEvOOSOoE0O0PROSSSBB o "O õ 3% DE 3 2 E 8 o 8 $o o PP 2ClmÂm Es 203Y%

Ss o so Ss o O

Sos iso sed sstcisss o 3 &oQg OE <

8 o Ff SPEFWK < O <q O < OO <LO

Z 3535323 958$L3SESS5 o 6 DO Too Orooooo(L8Lra oro o O <«Or O oOo<cÇolkK SE SCSSSESGESSSáRESS O O <o S o E (CENSENSENO) o o ES oo0oEr <Q o $o o Õ o R$Oo E Oo O O O o Ooo O o8SLOLSSOG oO ES

O O E OO E SP SS5HEOZOE $ E O O cos ILAZLISFHEroosa SE 82835 oxsE LG ISFGOSOSE Sosa FIXO < õ FOOD <S< O EorÍíosgsooSoEo0do o OSHO or eEo o º So <5800FSo E e E SERSEeSSIGIZE OECesgoo > O s$oSoo < WE oSrAÃX <<$0$O068 caorEáõaodoSo O oE<L & Ooo HFH É O O EE 9á4o0o0c o str Z”ooSoçcrtooços SEIS 5ao 38d < O osso o oO o 8 SE<aPOoSOooOIAdEaoSsSç&k do ecra go0ooxdLt O <COO O < eLroFasoNrezosao She o o Es ocoAasscoso 8 oo Õ K E OO E O O SSEES $oTSEt ce od0c0cosIEaoo So sda daafiá orszoltssooE E SEasoSoE - << oo0ooH%ETEosso5or o ES O O O0OOoO<(< costa GoSaROrO FordássPeoso?2$ o docoo O E

SSL rt oso<soss <86o<<s 5 Focos sEtwSo Ss OORFÍCOOS 2ESSS E Ooo EcCcSSRe o Goto O O0o<<LHE SsS<20O O ceossEreosdoosES EREEZ O ÕõO É O OO0OOoHK Oo O 2 oo0o oEE << o EE OOSÇOÕOHR $ o Sosa sasdsdsasriásis sora 8Bb5 rH Ooo O O ODE GO Õ Foca csgarçówororHr < E Ov0o0oo(ísL ES SoOrKF< SB OO o O FocossTo SForocooSH5ERE SSESSDSS o < ORoo0odZ 0 o o <rooodLdOoiL OOSTEKEF 3302382 a50adS sa Õ õ Oo õ oz e scroo CE GSI EOoO >> Oo0o0eo to o <SO o oO ssscsrooçoNroLsesos g

SG SGA SS CEO SSSILOSSHROS ea <5oOososztSsIICEBrHGIOES oO OOo > 308 2086 o < SE OSSO < 2S$SPOSS o oo < [68 - O E << O 5 2ErEOoOoO Eoso FE SCENCEIS) 200000 3 o < < O S 3 3283rEog5a5aSO 5 Ss oO OLOS 900o0oo LOOK oO | O < $ Bogesossossa5oHo588 ; Sogcosfoasroratsçsão o Sooitiíioco Ez oProProo<<tr

PR 9 - 2ESS BESSA ZADáçDaÃ < O O o < o EQ < O soco? 6 E 92 0000oSs Õ < oO Ooo O <OO0O < O o E < | 5 O 8 5 O o SG É o orosols o pPOojíú Sc asçeçãeo so o ES <TGEGLLZSOSÃoO FogsE RBEOQASGSLTFESERASQE o2G5 pEZOGESGHOSSOSA P$0o < O O E O Sob o go EGO [oProooor2 e sgsçoor $$ SEEN SOESS ESSO OSC RRoógceoestitoro o SÉ 3523 BD 383552581 5845 522 bGrSGSSGSSSSRSSS < o <Oo 3$S õ O O $ 283 o FTEGEoRSPSCESTZ <3122 Eorgo Sos oktsa O o 2 oro? d4 ecwoorégo Foosg FHoOorsocoolrosooPesks o 82 SE EOEeS 288 O << oO o E oO o S o E OO CO RLosSoOrEroR<O O E SOS otEoooÇG<IELESDO O o 2 o K E oO O E Õ o os SOCOS EóR AGR ORS << O < GO reogcocrácobbe ESSO Eoto5rmosoroESROtk ESQ o Oosforroososearos $oõoá o5rÇO OO ooo 2LHrEo e Oo or Ob o Oo ox26o0oOoESoOoZ oo pH eocsiqtLorhgo os 22 Potsozsaeosgçosssa ISO Sc oLrtgassessos O 8 OoRGEáÁáSO õ & Pg o Ss EK Rr < Q < O <€ É 5 S oo £ $ $osFEok o 5 o Ss o o $ oo ocoopettrosco ii sosoSsSo casada HboCssooNELSS E SS ooo rsesograsoNisosPro rorggssço o oo Iresoteasorjs dote rF5Foo So 2oEcdooS oog8Sse ocoPolcasrgóoNPerz Fogo E <a5orií PePodooo o ogdo o 2 E SORGO Fá oo0or OO orsEta gatos o88GS - Õ fo) E OO 25) mr O <o dos o SITH ILIFNagroê? S<o<arIGAsooo ECO rr LO O E EcTEOoBGROE ogsxo<EEo o $o 8x co 2oo0EIdoÇo0o SEEoOo SB OLLOCESHE SOR LO & 8 oPSFRESOSOFEESS

SEESSES EX OL OOO o o Foro OE <X< o Ss O 2 <4</0 20 o o o S SS oSSBgS OBS SSBGATES Ss EFeoesobpasoossrostreaodo P CSPE SSORGo5ESSR a BdoToFkHE:EPorrarodoosoõo o o vB

SE 2% &ê Sa x E o o ot

BR - o a cstoS83da R$TÍZÃão E O o < X<OZÇOÓOh o o SEESSSSDOE & > oh

É o060o SSSSSEZSS BeasEsEs o oOod EE Sã3%SSÉ cESSLO8RS E o ors$izg < o < = < < o SOS 3525á B23:28a O OE a & XE uZ SEL ssAS úgs2o4S & o oo$s x O Es<FoRWrPGS 2 Ez 2ES GEES HSÃO NGS tos 9Do0ov0ooo<O 2 oc E>82Z Õ PESE mw TE >< OL SESSÃO 5 dE EF ogHz Soo3sd das ESSE O É - o É uu aBá508 E & SEL So 4 R o Oo O o o no €X OO o o [E SS S5o BIS 35ão 8 O O Dn eúXWw SE < 5328320897 SOS tacabednicsa BSSSEFrEsoSsahss gos O o u4 vv SÉ ogto SESBHGESOGHOS EAR Sc o < o oO 2 OU zZEZ o 00S$ooEoçRio Oo <ÉRL XoOX o Oo SEOo<XSH O EQ OoLEXx3>E dE GESSO 5SÇEÇOOZASãE o Oo css dEOOSEERO OIE XX Loo & > >&&XEES SESC STHEO $Xo2 & o“É O Oo < o dd <ZO 5 Wo 2%&XOoçg oGH5HOSISGSOLHE ZE SZ> cocos ea;)O>= sa gos 5HEOZORHO2ELZÃo oFEOoS<aotgó dd ósEr ela <3 OST 5HSIEHEOErxryÊ RT go<agoPos E XE STSOTAZIO SSIGEPSSASSLtOZOSS8 OS s o odbõoÇOoO O 2903 <X>ZO = [) < E O <<L O & 26 o CEESES O O & >= PR ra S É ES<SOQ Or5sE ELOA çZçEOUY Ss < o Oo 2 O o Ô Es > "x à BSssS:3 083535 o pDEP<ZOSGO<2o0= 2 OzZ23XY e E 83 &ô <—& E É < E E o OoET

Bee

E

T O O O oo? TT E GCESISDAsSaagrah SBB 9 EEE $ o O 2589 ççOoOSOOS SEGA CSILO SA Ba SóE O8GEFSINÁRASGEassasDRS co rosross>sass SDS GISÇDao Se dão < O o E SD Ds 206 E < o O0o00o00O0çgÊÉs dd oÊes < E sr O EK &S so? &

SESSSSSSSSSS CAN NNIO OSCE o<eGESOBCOS o 8 q 86 Sgoê coeçcofitotosçriissasiasta s$$o08 SESGESSL 2 ooo CrogfgooLosHroaopsog? o <4LOOBHOHFE o PpOo<< 8 8SoSYS O K oe o<xzooçsESãSSBS coLEooogHoegos asso <o<LorSoS < E O o &b&SES38OS Õ Õ O O o > O

SEGEIAGHOASGES SSIS SB

ESPOSA ESSOPEISDRÇBESS ErgoeloçoissoE sos sis E SE < ox oO E Do oSPEerÊÉl Ss ER O o8oh5r dgEÉS3S os o oO LE ERO O DF BOMÇW OBS So SESARRESO PSOE O OoO<LOoO O < E OE 5 oOoSoçRr ms CSA GELÇES SOS 38 NE o É HE reÇQoOdo st SER SS sao SESSSTE SS SSB Ss od ico AEDI oolS SHSSGO330Sca is io. > EK SL E 8 DEASSECS SSB osiasd. SESEESr2oos AR STED É o = DP SSBEÊE GS

PESTE OKOS OS TPICB o SESC OELEAOS SEGA DE << O o o E 2 O $S5G0388ESS2OS SEE o < O O [= << O g 2 2 So É KR O o ba 22 5H SS SS 555830E < B 6 d5ogo Lado çha possas É o q o CSEa os ES sS e E SSca essas batata Ex < << E 5 o o & bozoftrtosdáear dados çoaoso Ê catotrtazoosEsghassSSaos Ss < < É < O o o gb = é BESEogGróssçS o sDAaDai o é jEOoOOSOZXZO00POESSBGB3S Es on wo oO 8 85 x$<t

E O IO O A DO

Z OS o - PESEBLOgGE5GES 2QRob6Go asse TEÇoRoCEráígráso SONS TERES RE ENS NS: Somos < O os o à Oo mmoltr HE OoHKroO So O O oo e orEraoososSoSto 2983000 8ÇoSsErE OO 28 DBO o O õ O O SEO 3 83833 HEHE 2<O<SOE O $$ 8 agaro o oooOodoo so Dos O O O Sagas crazo do ns5nosoE ô gd SÉ ÇTO o oO<L Ooo og 532 $F E SÇGOS < << O OE O Po fe) 0 OOo o Xá 3 23808 soa E SsEOGISIARasoss ao 3388 çZw2AO THESIS GOGO YZ o Ss Rr O o Pq mw>&oOoO 20o00H20005 g $a EÇOoressoaosSsaosso DD OoÇT o El Õ So õ O OO PE o5o>oL OO o KR KR 5H OoOoOX $ W o Tv O0o0o(L oO <Er O o $$ SOS O o so rsss çadBdçads: o o O E q 2 Õ É o DODGE Om o so o ooro ooo SS ooo eocLooo oro ohO & DF SOB Õ R2E É o oo $ 888 odOo<o8o 2 or7s ds rosas oDEaSaGEE Fasso Sa Ros Gesaros e É SG < E Oo<L O OS 2392 7TF3SLCAoLEIroço O EE XX SS dSSLosSERSS 55288 3 388 EO oo <ao 2 OS RES $ 3835255588 O85 2 5w7oo,obçS Rr w o Oo SS q oo $ocoooHrtsoo q O Do OoOÇO ÊR oO << & osso gÇráaOoFooor Es E E so god Eo oe ooo Rosi 83 83003 d2ao Sos SS srs saha as ços go o o [& O DGE SST sz Cc COE<< Õ o 3835 5323523250 ÉS S S&S fe g so É O 2 8wESEO o õ E <L<RXL Ss seo mo8S o O Er Oo<X< 3 E SEE at rasa rOERS TS ss So eso E Erodõs 3 SISssicoSsácoos5o so Ss 3 86 vs os oO < Fr OL O o oo o Boo oO Oo<L ES o o o Õ $$ StOO<LOoOrodoooOoagoOo

- K o [é] O HF <ÇOQOO O OPG S LL oor ao EK dOO co Hoo0oosSsKo ooo ST EEo <EogZgr o ooo SK r KSO oO Õ IES 5HOLOSEFOSOOSIHOORER O co400rosSoo <oOoPçwIO O Õ O oE<OÓTOHE Ssro<ooO É orESGOHSS < E O SILrSÍo Pp dos EE <g3O8$GSSFE <<$4092HKHXO < 6 orgo<sê8 SorgogoaosgooraPor < IE oOoBKZI<XASGIGOOSOFE O5HK oo CSEEBSSSGERSE o E O OoO5FE << o 0dosorl <oOoZgrtoopPo Sato octoSo So rErooSSÇOS SEoProsfoPOogGo<rErGOLE o < o EO < o o9SõÇo 9 Oo SSEZGLSSSGESOABHhOO os O E o oOSo0osegsoooo O Oo O0UOCrogsgodsdídozxoo o lo<i<oroO Ora rãosrogss OoFE<OP POr E o O 20040 o EoEXFoo Ss e oerosszee sro cc ESTE ISIÍGEISO oo Stko Foros EST ReRa o E<XASGXZEOOFRFIIPECOSEZ aFgasosoçktSse riso? Froodocosteseos E5So 58E <E <<o0E3$92O0o b O 2x oocCfEoros o sooçoohoeso FE <ES8 É EÇQOoOHE oO o E o O <STHOoS < E<$o sb

CESSA OSSOLGOEZO SR sococRçoHgosortrososo oroçgo SESESESIZSORS O o o < Rr < < EO f otrtoçooookES? O 65 < o O < OorEHE oO0o0O0Oo0H Sos DSretõESASS5OS 3 o < o<or<aEoOo0O0OdLO õ O O O Oo Fold ldgazrrororHk OO o osSEosdí < <ooFrkgooí 829 gor ÍcaPeoSoHro EEE 28O O << oO go oZoOootk <ascrsasitaoso oOoSEEO 6 OOo <a SFTLO EErse o Oo 5 cEroGógosrEra5N iss o8? < 5028600900 o << ESS oo orFriaçoodoXrSsgoo4fL O O osrooroeçore fg oetos o or Oo < o < KR Õ < OO O 5 << oo rEococo FocosseooosWteoosSssOosi o E OO SSIS TGCEOrSOBS E 33888 d0< oo$Ço2LHo o EGITO AZRES ERROS OR o O OO o ESRFSGSSEFEBsES S o ooo STF OO0Oo Cor <E 2 < O O OG Presos SsoSso Ss 006 o (SENSENS) < KO 3 ss issas sd Sdsbo: a pdboPoscídozsoProoofkkPOoo

PR o oO << O <L< KH 335º BssSSSGSSaDãss o OKO SEGITTHEIOSOSOG<EGO < E OO O SESGSÍHOS GORROS c=5Sg 088 e GOoraçoos <aoo2o EFEFLQCLHGOOGHSOOGRSO o Z< < o SIS BGHE oO o 2QezxEt o So o o Soço od ço Pda o os csocoororesçoõsãso o ES < oO < KH E $o e sgrob eb<ta $$ o0oc0co<çwIBGESSOO O o KH oror5EEao?orZ O << E $09 coosgoroSGE E o ros $o<EL o otcocrsáss osso Bock$seoísoeorNnoer SE Rô PESE SGEOHOSEASGOS 25 c0OoO cLEIHFESÇOEEOokEE <O < O EX o LIT IOdOo $0o3s SESO socorros Ssoo E5õS EsFcáíagroóooçoosSLRPooO 4 < o OREÇHOCQO0O0OSOo0oOHKHSBS SS E 20$09080S <EOOO < < 2 o SO cork OOo 5 SS BSIPGoSSswSRRRES 500608 SS Eos essorrço 268? $OoxooSsos < oC o Sd Oo<ooOo SS STOorRO OO O Õ coros o E EO És SG£LOEr$gos o HcosgsocofEeross $00oí CE SS Erod oz Sd8oO < O O sSsoCoSF<SsS ESSO Esso bLesctsssiooaos <r KO oocitoc oo ocrobsFoo <ogÇEá FHEororoeraa ooo OE Or o $Q o Oo soFáá - oodígo Oo FSTGPROTSIÇS r O O SP So EPRSeZzodoroossã B33 Eõ5ESSSOS o 8 < COoorgao 523200 E O 590044 Se ges5o oo SC obLbGEEroES5S rFHOosdgorz o O O0OoKH < << O SOS ooo ST<<aGoorsrearosseoo?Po SSIS RO oSsITSoros roErssáesÊEs 2 $ÇÇCOHXO0 O Oo 2 |2 O 2 É CRGOoErO oogcidaEHSZoSsoCEra sebo? o) o obp0SSIColcgçooso E O o o É |É <<5022090CÇESS cErsSsEtseECgHÓSOSooi So <oPosS$OOoO SCGLGLLOLIHOSOG Sá PBESS SEESSOXÕSOSO o HK O SOS o So 5 <o$ og E ECorsasosoSdroosSs o 2 o oSgooo O O 3 PRESSSRÁRSSSEARA Srs Ê sô SSBSGISásSSoBEas S 2 oO < O E OK OE GOO $SSCES ; Páccspessesssa ssa o <oríaoksiztgLogEoOoOOg<OLELO o o

2.

o E 2% gê3

PT x ss.

o 06Oo oe EH<SCOo0o o E>2T329$u sos s8a NESSE

O O o A > O SEZS5 otro ET o <= EK o 3203 SE o Os ooo ooroesgsosos PoLÉÍE<mu rácogoz2to EosTarodOoO KR < <t O < o uu É > E ESCSHOR CEeSTÍCGOA o <$ocoSsookE É É ELLW O SS $6S o 2 5 << D3Sd0sdo: IE dis: E 3Ã3 o Ho dos jFZ2ZmXrtáreo ES So AScSdzá S<€oxsolL $ E SZTEE< 5oSSEHSSAá ES ãgã5E Oroogogro OS gv orà%a Soto gáiosas LE nEkE XX L2)O O oO Oo r S<oorllnlm < o [) x HK < SESPSEHTSLS 5 n$8S3IS < GEOSL o oO 8 a [CN S <Er FE $<XO o ÍTZ OEROO Rr O q Oorsoor O O YMôÁM = > E o88óSsi SEC oxrmT ErOIOOO0O É << TX S36SS9232 28233 E ESBSAORTSHO EHoLNEO, 58288855 S23940SÉ FoçcáoooLSo E<L7HvHçFã Srt oooifo? EE SÓ FçrozX cassado! Sa ESAGSO 3228328338 2SEasd 3503333082 ás5s23a << o|ã O E 2Z $$ SS ORE SHARG2A XX O OO oO POoOorGEIREQO2ZE 3858523833 2844sS o Q o DÓ 3 >E Eos? o ob 26 & 3 o og3 foot o | E DEE GOGEOSGHEE SPO E SOXriro SGSLFELSLLEAÃ3 Goo MC Hd Se sos ssatac;ó| RE TÃO or 3$OoxX Eovoaéds 2236 << oscoms<aç Sa doisDzz> 3 oOSrKo2Lódoo EP 3 o £5S$32 o IgG oíooróámç|ÇCodr zo ocoO<ToSsgEFoZoglHSGOgrZyryza s CERGSEAECSARRZdZEÃo o É O or <QO O < 3a O < < > DP< XX E Ag o 800 AEZTO 2“ o o ELOS E < so zo SEO OS <> OLE à BeoSd5 oo 3dc=3Ea58E à E«KrEEPREZSOOOPECGITZ DOM e E 8 ã E o x & ES E << EA ooo

Ber

E

Z O O O oo? TT E GCESISDAsSaagrah SBB EE $ OQ o 8sS8$ gs o>oPSYX SEGA CSILO SA Ba SóE dB CHIC Sra ss aERRS co rosross>sass SDS GISÇDao Se dão < O o E SD Ds 206 E < o O0o00o00O0çgÊÉs dd oÊes < | Er O EK &S Ss 2 q

SEGEIAGHOASGES SSIS SB

ESPOSA ESSOPEISDRÇBESS ErgoeloçoissoE sos sis E SE < ox oO E Do oSPEerÊÉl Ss ER O o8oh5r dgEÉS3S os o oO LE ERO O DF BOMÇW OBS So SESARRESO PSOE O OoO<LOoO O < E OE 5 oOoSoçRr ms CSA GELÇES SOS 38 NE Õ É EFEQooOoPo SS SER sao SESSSTE SS SSB Ste SSSa5oaPSaREoSiS

SESSGOSGGOSO RSRS oO O KW o mB og Os > EK SL g

SESSEESSSASGSES SN SEE SESEESr2oos AR STED É o = DP SSBEÊE GS

PESTE OKOS OS TPICB o SESC OELEAOS SEGA DE << O o o E 2 O GO bSSSSERSOSSESaSso o < O O [= << O g 2 2 So É KR O o ba 22 5H SS SS 555830E < = so d5ogo Lado çha possas É o q o CSEa os ES sS e E SSca essas batata Ex < << E 5 o o & bozoftrtosdáear dados çoaoso Ss catotrtazoosEsghassSSaos 3 NES Go ssssio583 8a < É o << O OO < O FB BOoSL à SEoCOSOCHECOO0P OSS SB

É E S g

E O $$ SS 2 Mm

EE o ATT

P < < << o O o oO O o or S3ccazddçaDadRSGGES Or E EO oO <SHOOF s dog o <<OZHE < Oo5S$go 8 1020 SHFoSgarorçoegoso 3oSE3Oo23ET < o 9 $IHFE SÉ OR ÇHEOIKGO<r Ooo OoROOSE o) SOHrOoOZXZEOOOO 5209 <S8S< SERSESSSGIOO EFooores É OE << EEESGOSE OE EESSE<ESICSOS <oroosStHG 3 oE<9E ROB <OEL EoSdoeox o <oo0osodE dor ESFRZ3G5H5O SEFESSSTSSSOOPS 8 o O O0E < o o0o0Oo(X EFSGOSNFEOOGSNS Sac esgçersoetorooõros SEofEizoroBsk<oosoooEroçs o << ST LCSOROS o oLoro Sór-togss EostrSO5EOS oEE<S cCcSIFCSSOCOXOEO d0ocoFITE<ASCOE FEFOsES EO SETORES o 0o0k Estrago dooÉSsoPISáASE cos ITSrEIoSSESDSIDZSORGE Horst os toco oesosoõs oO S<ES8 s 12 0o85 3 OS <r<ofos<aos E 0o0Sr& 5 O 0S<k SsSoSSOErE RO O ES S<oocPOoO o<$o E O oo oktogdogoo oCoCFESsoSS PE CE SGESE PS 3o0O o SEErodOos < ESs2G8OS5 coEratoóorerEoShS SEER sootrtsgosgsa3Beçgo SO ã o E<SEb E O OK QOHK < oo O o rr Ooo0Ooo O OOLO < so KR sooçossiztHooO o O Ó oFGEE OO ESSFOroEoSSs DSESSSS38S SãoKr< 8 OO o < dog << FI GEO SGHSF Oo Oo 50<80$OSO oO OZ O0OO0OO cOegGosocsosgsrrwríáooosEr oO < Oo > 6 TSE E < o So e EEFSOROo e ato stosgs << O FROORKO Sã < ESSO SG o68SOVLOAS O E Sosa dçnaças são < o os <osi<o o Oo ses Soo os BE SSL SHookXoos Ses ooosgHE XE o O O [ONT oO HO O 5H SOo 5 OO o RO rFroocZÓoldoçEoS SPO, Sos 6 E ooSLs 858 SEFEBGSEO SEZGGEEOSS5SSG SSEB5 o 2 HOOoEgZ<ogRooo8SoSSPRO s boocofgtoso ooo o [so goro o CcILoOoOSGaooOox,Xoo<tEtoPorosS Ss < O O LL FEOSOOKFOOCOOg<E O0O e 388 o 3 Basspossass5ae5aReE

Õ SESTGFALISSEGSGO GH SGAÍAE

TR o o o o <<O<L<L 558 BETE BASSDSSS Õ < e O x 9 O oFrsE FE ocooograsogo E o < css SIGEHOO o o2FE o 4 OH o [) dSovçodçS < < E 200 csocoororesçoõsãso o Eroo < oO <HK E Soo BH OHFR $$ $$ o0oc0co<çwIBGESSOO Õ oO < CIrorccEageo Õ < o Sh coostorgogr E < 8 o SI<EZOOQHÇGO õ o 253º CS ças IEOSGEGOHK ERS$O < O EoroSs<SHOo s933 BrSEeGSepódires 3228 o LOS <d0dohLa$foo < < O FSC CNC CN: o$ão EsrcagçróiçooSsgeçgo 50 00oS bo HOooOSoSOSoHEBS 2958 E 20$9080o < E O O O < o < O = EK O oO O SOS OOrgaa o0o0o O SE 96E Pegou soskt Õ o o o 5X TOS o 2098 PpPLSSGLSCOOOSIFGEOS < O < o ES EooodOeomo ES coOorHoto o E < & EFREO EfSrEosocoof o ross 08 co SI SEE LoooWE 28

SE OK ST LSCEIL ESTO eoãS hessesóssivoasos < E OO o00uSito od Çno oCrorbho SIG Foo rorortasao Ro 832 Soo 3GoSsIEasts ESSES Og oE SS 52HO o Oo SS oFE Pg o Ooo GESSO ocCocdokbsbs ESESHSRESORO <<< << o08S<S o Oo 5oodçgkS

SION SHE OSSOS E TORO SEO PES RoOoZFEOCES SH 8oR Eowdi ok <E< ese sogços 0007 $SI8 ES E LSOOFEZX o) OE OCO oSsITSoros O SOM KPOES 2005 Õ oFrsErsorororifoodsoaAPo O << o < O E < KR O S2C2roo $a sr SoEoSemF c<c< ooo ceoc gçoos < O cCERQRESHPARHORSSO GE SS <o$og EFE 5NósoSsooSso S$ E o ZX8Oo <OOLOL EFOLS Õ É Q o go< FEFoSgo<o SE 3BEóosoE o SE cEr$íoroorseaádosoorgoo foco x ooSÇooocooço O s <P $o|o É O g O $o õ ESGOTIBSGHOSSLZOSGOREOS 8 <orághoçoõosd<<80o o 2 FS IGBOLoO0Ç5RriiocLHo z SFT PposcLLóoEAEs o SO o ocorokHíaeaogeooo<OoULErALO o o ”

FS E

E 8a sê Ss E SO

TA E o o ot

BEER a E < o 2> Sor SSRIA GELSAT 3 FSSS582 B7É$33áo rE<S$STHES5 Wood ao SS d ESES5HãrZ soSscoosdL <Ogueo mon O R < UU SESSÓrSSS EI as: < O O < x casos slis Ezsdine 35388828 R$E5838d o < O < oOç do uu OSErô o ES A 2092 > o O < E >= m KR rEOoOOoOoÇço 2 22X > Soc ocsdo c2áGado RO oO Pr mo] Xé%< ORnRu Ooo oeo KO g DEnNnNkKEEOo Õ 892833 SETE SES5SOSS O 5a$33IOE < ooo og PO Sz2ranté6 O Er oSsoeo< oTZ$ÓX O õ < O go s O x O o < O O EXE O < O rOoÇg<FKrFE Ss &% EcomL EFSOSGSIRG 3 7><$Q“% SETE o BF gdS < O & eo = O o [ 7 co > O O or <á<o0oo < Q< HE GLAM dog orgodcdoigkz);/ 2% = E 88 265ojo E ERES 8 E 88 8 SEO &ZEE TELS oo Losso sgoSTGrHSASSe o <<< o oê8 8 o o 0090 To0odE o 222 roYv af oo E Oo<o oo T30OáLdiL ZOO O o $ o É O A > E DEZOX 8 o Cos EZARE dae: oO 0o0KE XL O & 2 < UE Eros roóorQ Zoo EE RO Õ o£dooSosg<K OIE DE EE 96H OSSGOoOECTOXA 2 087 coÓooPr<e|TZ O Eg&SOTI oO O or o$oSÇmoOSTOoSEEZyXy 83 << O<TOo OZ OEL CSA 20035 á<Oo EEXó3<Edo osso cosiaçTOO Ez o oOocEro ao </55S$8FE > E oo <qocoor li oessõTmoSOÇS 230 s PEBESESSSCOOEZ03ZEÓZ o É õo < O O ÓÔ < Z O << o K >= o >= É < oocPosoco|:=&EZo2<ax%SX s SEXO o o & & o x 3 Besos 8SbzoinES o o E <OSCOLLLOEZOESE> 30 o <tEEooxo(soPrEesedosisaoaoSro = É o = DO o ã& 88 Sm x É

É XE oo ET

Bells a e e o o o a a S S S S Ss E o o O o Rr oO < = 588 383

SRS SESER O - rs) C < o | so8<áã o ES 7) ore rtja o SITE | o oOotH|áã Oroo Fr < E O x E OO o sÉSo | O O < E jo BEE E 530 o o E o 5 S || 8OoO |& 8 oO OCk Eo20o0 k sE5o o GEE ç 5 $oei < O o O r & $$SO <q 8 OG 3 BEE é 5o8rk

T FE 3 EB$s3 [Ei 3 SEE, Zz OSS tó E 8 3 oz 2 RES ÉS sozeFi & 5188 4 E CEE O|&Z = ol o OE ES ST SHFOxMO S z o OOo 732 2 cok > & | ooo Ea SEO EE Ss o < O O ORE 8 & 06 oo X 2 56 eoE> E BSS 8383 o 6 |= 610 Or OOj5loO ESSSES - EAR EAR ' ' a é o 8 233 8 8 o Ewbe Ewbe Es Es o s s co co S + + S + + 8 +8S + 8 8 sal 552 552 |sã 8 3: 3: 258 |35 =D O Oo O Oo O OQ — O Oo = SE LS SE LS SEE SE õ 2 SO O 2 SO O E oo x o o $& E DO $& E DO o E 2 o E

Beck EEE b|| x x bx T+ | « x OQ O o < S ESGSIGO x 8 É <<< o o o 58$$É q O É E <tS < Zz O o o PS | ê $$ Báscoê | õ < S Sofoo o o so 5 E roses S oo 20 oro s o E < E $$ < O Zz 8 8 ds ssa k

Õ Õ < < << O x os o Oo 2LoOE$O o O < $SOo5 4 . E É SS BSPRE |ó oo No) 5 $o O x“ PS ES) EKESSGL E S E õ < & ES BSS O% E 88 Ss óoriso RB E E RS6BkESSSS 23 > < o QE ER 6 Oo CCZ o 33 E PRiBósSsaES | Rr O u wu o Es a << fa) FESCETECENESNCEA = o 286 | CoeBEHEZSO |2É Es & kHEkB5bSSES BZ se É EEBREIIEE ES O O a EB 6SSSb C 4 O O õ EH SRPIROS 6 o o O so >= E obB6 eo <S 2 o ES € o oe oo? => o É E OE oSgEE z o E ER SdSS ERR o kk a oo o o co = É o HF oEkepoSçro Ho ES & 2 < o oO 8 dC 63 E KEsrócisssão

ES E PÉRSICO SRE $$ |E eE= o oES<S|6 x <8 | So FRPógassbi E É E 2OoOrorzo

Bebe a

S S rearogoo2o or [oo Sagas sras B5SS SS OH 2Co0$o < ES CO EsahaZaoSoPo bP<ooO SootíocogSo < oO oOEFE 5E<06OSRO 8 < 5 OE O $FoCdosgçorogsEgo oo docoíto to? zk=o | 2REO SEE O 900 o0ot cio SE BFEGRSDÃSSS < <O EEE 2H OOK o ok FSIUENE & Õ E 5 ES Xo oSIrFaGoaGosase RuOE OGESLHOSCOS e vs coco iêstosçiis oo SS IB<SOHOHOKÉ o g< Scr FEOoOCTFoOoS à EE ETLOOCÇCOHR o ES O < E E SEE oc Poxa |PÉÉO cELEooogGroefsors 5 0o<< <oOSOIXFÍOSIO EE O C8E ES 6 ZÉ oO 0O0O<(L 6 o2or os<socresçaegço S O Oo EO so SS ek SS SO < SK O E E GE S< G<< rFEOCO2 OO Sãortr 90 << O S<okS8 E < GOS<L — Oo oçoHF O Oo < Coscoópesês o bes ID o E oO ESXSGOHKE ZH E Rg x GE AESSSHCSOE <o2SêS = O O<O Õ SEE HE SdoOoxúã g escácrEreóegosos ESG << $SSEGES O PE O SOS Y SE Oo fo] 2ookb SEER Fr O > S<a<a5o(tO $< BO | EFOS<EOOZTFEoOorokE CG OS < DEÇOGSsNSOOSgEomw KO = O ss Soo e ocoErô TG EZO o ES PESEHFS5S < O O a ESSE < So 2 õ T o OO fo) Õõ E o oO “ a<orgasrEosokE O O0O0oOo < SE ESSE o E Oroo Ss FEESEEODEOÍTEO O OEo ox SESSGOE ROS 5 O £ É Sorsgoego os 28SES 8 SESGSLIGESO OSLO 2 coseogonoróásaoE SS É cESCSLHEHaOo o SoEkbosçs Ss coco E< OE SHE Õ o E Bosssscasóçss Bs: oo < K o O o 0 SE 5 Sa RoO so 2 < SPRE o OoodiLi E 5 O Oo o $Sx< << o$<o O uu o << oOoO OE Tv Us EFooorz E < 0 o0o0ZHrH |O SK ST) o bozofEirtososarasobpodco AF) E EFE rLasoosishphõdZOo I)S <$< E <<o(okkHOoÉ 83 t BLSPoGCRSIS SETOR OoOS ol 8 l5E5 o < E O O O O < O OE GO 5 o bBEFoocoOoCcCO<OOOFOODOOkK Fr o |

E E o O o z nO < uu NE n 5 s 3 3 ê o > E <S E É S 6 o - . Fr uu

E ala &| vos o o 22SHF5SHGOGOLCSTOSDh o É E O O oO P < O CESGRÓFOGAGO SS So go < O < O ÇG<ESGSOF << O OF OE DOGS Ó O Ss go Srs EGO 3382522223 <b5o 35 Oorosroso Soo o O orofsosogsr & E 8 E E OO dor ror o õ O = CFC EO006058O06G < ES <aoOoCEt<a<roodgoçgko Hr O Soco oorsíogo<s od doo<soo2o0o28<Oo É ESG OOFrrosSso?od o < O coolLIHNÇGÇOoOSOoSOO e o E < ERES 9009 óÇwoOo S 0 o O 0ÇOOO 8 < O EogoBgoscooSsCoro ES õ Oo < OE EK ST SHOoOO O 2 ST LEGOSO5HÊESO <ô 6 <O5$O er O O oo Cí oSFREESOo õ Oo < 8 Eoosts 6 OSEOoF < coorfoo ooo hr ooo O E croeozgrot eoggoor | |Eo dOGTFOX<o6QgÉ< dá fe) Õ rooçoçgI Eos S É 28 538538 SE 3 gr EeSÇPÉÇGO 6 E 5 65 IoScHESOoo< Ice so 5 lo SotkêS ES oO ESG 3G<ZE00000<oSoO 8 g 5385288828 DE 5 5 oo Go SgoSGoSSFOOKP < o cEroóogoçgoosse?to<<|8 5 < o o É oO BGTSOELOSIO oo E oo ooo? Õ 6 ORE Õ <o<LE 5 OOOO EO 5 < o oo 2 Çoo(aodo(L< E S 2 EO Be SEOORGOHEO Õ dosasadisadtdsso É 95gÇoreo<eso So GRE SÁ PIO É O EO o 088 E O o |O oo ogror&Goo o SÇGoEor ok < O < 5 OO FortrgoorjsX 2 õ << o 80 OoPoro SG BS ESSE o o voodoo O |O doCEorSgosoSs<F E oo OO0OO0Oo0OiíL & Er odo0ds32SO < ZE 2 HEHE QOOO o O xhr OSSO gIHK O o<BGRo o < OK do S$io s< oc e ás oo coça ooSsogko [jo orreeseoçsço ll 5Eo O Õ s Dt oÇgo e orostos E E so e |5 OE O O oO < o | o Oo E BESSHOFSGOSO os o E Ss DOHEOoGOogLrogç çrE < à So soa nashaçoE Be é buoScLeoooooit oco<tr|l Po o 8 o

E on < | 8 x E | E |& 7 --

o - -

SSBPBRSESS O 8 OBS SELOS rEooreçoôldox. SR $8828a o so8ErzÉ RSS H5DSDE << B8<OL A oG3Sb85SS

Õ S52S5ó8$co Sodo o r2içooo

SEO OSSOS SoSESASSiO oo<org2go SS O SSERDass Rr << O oO O ESC o <<< $oSsOo <COSE fo) Ss ESSE o $S5S 5 egsooco<aSção4jS EF OHKO o << os < É o oErES$KáoOo SS CGE s5he So2830328s s< orar õo O 65 sSo<sQ DESSSSD8SS

É Cocrássesos o5SFageoss sas

SG coxo ocoesrss cossESNFEHoÇNSO <sSo8GoÇLonSÍS õ Oo SgE O O

S SESSÇGÕSOE 823292555 SSL 5a? Ego ESCROS OS 288 IPÊ O DD SE oO a BsSpsgsd5st e KZ 5rLSO<LOO Ss | CESGOERSO < Ss oEPoo8SkhoPiÍOo FF pEXTrOSOSÓDOO CC pE<X<GCOPTELPO Poa <roodookr

Anticorpos

[00185] Um anticorpo (indistintamente usado na forma plural) é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., atra- vés de pelo menos um local de reconhecimento do antígeno, localiza- do na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usado aqui, o termo "anticorpo" engloba não só anticorpos monoclonais intac- tos (i.e., de comprimento total), mas também fragmentos de ligação ao antígeno (tais como Fab, Fab”, F(ab”)2, Fv), fragmento variável de ca- deia única (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos humanizados, anticorpos quimé- ricos, diacorpos, anticorpos lineares, anticorpos de cadeia única, anti- corpos de domínio único (por exemplo, anticorpos VHH de camelo ou lhama), anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecí- ficos) e qualquer outra configuração modificada da molécula de imu- noglobulina que compreende um local de reconhecimento do antígeno da especificidade requerida, incluindo variantes de glicosilação de an- ticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anti- corpos covalentemente modificados.

[00186] Uma molécula de anticorpo típica compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) e uma região variável de cadeia leve (VL), que estão usualmente envolvidas na ligação ao antígeno. Estas regiões/resíduos que são responsáveis pela ligação ao antígeno po- dem ser identificados a partir de sequências de aminoácidos das se- quências de VH/VL de um anticorpo de referência (por exemplo, um anticorpo anti-CD33 como descrito aqui) por métodos conhecidos na técnica. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, também conhecidas como "regiões determinantes da complementaridade" ("CDR"), intercaladas com regi- ões que são mais conservadas, que são conhecidas como "regiões estruturais" ("FR"). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. A extensão da re- gião estrutural e CDRs pode ser precisamente identificada usando me- todologia conhecida na técnica, por exemplo, pela definição de Kabat, pela definição de Chothia, pela definição de ADM e/ou pela definição de contato, todas as quais são bem conhecidas na técnica. Como usado aqui, uma CDR pode se referir à CDR definida por qualquer mé- todo conhecido na técnica. Dois anticorpos tendo a mesma CDR signi- fica que os dois anticorpos têm a mesma sequência de aminoácidos dessa CDR como determinado pelo mesmo método. Ver, por exemplo, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological In- terest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242, Chothia et a/., (1989) Nature 342: 877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917, Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948; e Almagro, J. Mol. Recognit. 17: 132-143 (2004). Ver também hgmp.mrc.ac.uk e bioinf.org.uk/abs.

[00187] Em algumas modalidades, o anticorpo é um scFv, tal como um scFv anti-CD33. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgD, IgE, IgG, IgA ou IgM (ou sua subclasse), e o an- ticorpo não necessita de ser de qualquer classe particular. Dependen- do da sequência de aminoácidos do anticorpo do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobuli- nas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmen- te divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, 1gG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que cor- respondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de su- bunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[00188] Os anticorpos a serem usados como proporcionado aqui podem ser murinos, de rato, humanos ou qualquer outra origem (inclu- indo anticorpos quiméricos ou humanizados). Em alguns exemplos, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte, por exemplo, não de- sencadeia a lise mediada pelo complemento, ou não estimula a citoto- xicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).

[00189] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente divul- gação é um anticorpo humanizado. Os anticorpos humanizados se re- ferem a formas não humanas (por exemplo, murinas) que são imuno- globulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que contêm sequência mínima de- rivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo destinatário) nos quais os resíduos de uma região determinante da complementari- dade (CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como camundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidade e capacidade deseja- das. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) de Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além do mais, o anticorpo humanizado pode com- preender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo destina- tário nem nas sequências de CDR ou estruturais importadas, mas são incluídos para refinar e otimizar adicionalmente o desempenho do an- ticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substanci- almente todos os ou pelo menos um, e tipicamente dois, domínios va- riáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiõês CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. Um anticorpo humanizado compreenderá também otimamente pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aque- la de uma imunoglobulina humana. Outras formas de anticorpos hu- manizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que estão alteradas no que diz respeito ao anticorpo original, que são também denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs do anticorpo original. Os anticorpos humanizados podem também envolver maturação de afinidade.

[00190] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente divul- gação é um anticorpo quimérico, que pode incluir uma região constan- te pesada e uma região constante leve de um anticorpo humano. Os anticorpos quiméricos se referem a anticorpos tendo uma região variá- vel ou parte da região variável de uma primeira espécie e uma região constante de uma segunda espécie. Tipicamente, em estes anticorpos quiméricos, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada mi- metiza as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamífero (por exemplo, um mamífero não humano tal como ca- mundongo, coelho e rato), enquanto as porções constantes são homó- logas às sequências em anticorpos derivados de outro mamífero tal como humano. Em algumas modalidades, modificações de aminoáci- dos podem ser feitas na região variável e/ou na região constante.

[00191] Em algumas modalidades, um anticorpo da presente divul- gação se liga especificamente a um antígeno alvo, tal como CD33 hu- mano. Um anticorpo que "se liga especificamente" (usado indistinta- mente aqui) a um alvo ou epítopo é um termo bem entendido na técni- ca, e métodos para determinar tal ligação específica são também bem conhecidos na técnica. Se diz que uma molécula exibe "ligação espe- cífica" se reagir ou se associar mais frequentemente, mais rapidamen- te, com maior duração e/ou com maior afinidade com um antígeno alvo particular do que com alvos alternativos. Um anticorpo "se liga especi- ficamente" a um antígeno alvo se se ligar com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente (ou preferencialmente) a um epítopo de CD33 é um anticorpo que se liga a este epítopo de CD33 com maior afinidade, avidez, mais pron- tamente e/ou com maior duração do que se liga a outros epítopos de CD33 ou epítopos diferentes de CD33. É também entendido pela leitu- ra desta definição que, por exemplo, um anticorpo que se liga especifi- camente a um primeiro antígeno alvo pode ou não pode se ligar espe- cificamente ou preferencialmente a um segundo antígeno alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessari- amente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação preferencial.

[00192] Em algumas modalidades, a constante de dissociação de equilíbrio (Kp) entre o anticorpo e CD33 é 100 pM a 1 uM. Em algumas modalidades, o Kp entre o anticorpo e CD33 é 1 nM a 100 nM.

[00193] Estão também dentro do escopo da presente divulgação variantes funcionais de qualquer um dos anticorpos anti-CD33 exem- plificativos como divulgado aqui. Uma variante funcional pode conter uma ou mais variações de resíduo de aminoácido na VH e/ou VL ou em uma ou mais das CDRs de HC e/ou uma ou mais das CDRs de VL em relação a um anticorpo de referência, enquanto retém ligação e atividades biológicas substancialmente similares (por exemplo, afini- dade de ligação, especificidade de ligação, atividade inibidora, ativida- de antitumoral substancialmente similares ou uma sua combinação) ao anticorpo de referência.

[00194] Em alguns exemplos, um anticorpo anti-CD33 divulgado aqui compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 20uU 1 variação de aminoácido) em comparação com a CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo de referência tal como Anticor- po A (VH: SEQ ID NO: 65; VL: SEQ ID NO: 66). "Coletivamente" signi- fica que o número total de variações de aminoácidos em todas as três CDRs de VH está dentro da gama definida. Alternativamente ou adici- onalmente, o anticorpo anti-CD33 pode compreender uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL, que coletivamente contém não mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) em compara- ção com a CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL do anticorpo de referência.

[00195] Em alguns exemplos, o anticorpo anti-CD33 divulgado aqui pode compreender uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 varia- ções de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 vari- ação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VH de um anticor- po de referência tal como Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 65; VL: SEQ ID NO: 66). Em exemplos específicos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VH, que contém não mais do que 5 variações de aminoáci- dos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoáci- do) como a CDR3 de VH de um anticorpo de referência tal como Anti- corpo A (VH: SEQ ID NO: 65; VL: SEQ ID NO: 66). Alternativamente ou adicionalmente, um anticorpo anti-CD33 pode compreender uma CDR1 de VL, uma CDR2 de VL e uma CDR3 de VL, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VL do anticorpo de referência. Em exemplos específicos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VL, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de VL do anticorpo de referência.

[00196] Em alguns exemplos, um anticorpo anti-CD33 divulgado aqui compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 20uU 1 variação de aminoácido) em comparação com a CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo de referência tal como Anticor- po B (VH: SEQ ID NO: 77; VL: SEQ ID NO: 78). Em alguns exemplos, o anticorpo anti-CD33 divulgado aqui pode compreender uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VH de um anticorpo de referência tal como Anti- corpo B (VH: SEQ ID NO: 77; VL: SEQ ID NO: 78). Em exemplos es- pecíficos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VH, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de VH de um anticorpo de referência tal como Anticorpo B (VH: SEQ ID NO: 77; VL: SEQ ID NO: 78).

[00197] Em alguns exemplos, um anticorpo anti-CD33 divulgado aqui compreende uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, que coletivamente não contém mais do que 10 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 20uU 1 variação de aminoácido) em comparação com a CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo de referência tal como Anticor- po C (VH: SEQ ID NO: 89; VL: SEQ ID NO: 90). Em alguns exemplos, o anticorpo anti-CD33 divulgado aqui pode compreender uma CDR1 de VH, uma CDR2 de VH e uma CDR3 de VH, pelo menos uma das quais contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácidos) como a contraparte CDR de VH de um anticorpo de referência tal como Anti- corpo C (VH: SEQ ID NO: 89; VL: SEQ ID NO: 90). Em exemplos es- pecíficos, o anticorpo compreende uma CDR3 de VH, que contém não mais do que 5 variações de aminoácidos (por exemplo, não mais do que 4, 3, 2 ou 1 variação de aminoácido) como a CDR3 de VH de um anticorpo de referência tal como Anticorpo C (VH: SEQ ID NO: 89; VL: SEQ ID NO: 90).

[00198] Em alguns casos, as variações de resíduos de aminoácidos podem ser substituições conservativas de resíduos de aminoácidos. Como usado aqui, uma "substituição conservativa de aminoácidos" se refere a uma substituição de aminoácidos que não altera a carga rela- tiva ou as características de tamanho da proteína na qual a substitui- ção de aminoácidos é feita. As variantes podem ser preparadas de acordo com métodos para alterar a sequência de polipeptídeos conhe- cida de um perito na técnica tais como são encontradas em referên- cias que compilam tais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nova lorque. As substituições conserva- tivas de aminoácidos incluem substituições feitas entre os aminoácidos dentro dos seguintes grupos: (a) AO G, Ss; () RS KH (C)N>SO, H; (d) D 3 E, N; (e) COS, A (NJ QS N; (ES D,Q(N)G>SA() HOSN, 0; ()I!ISLV(NLS1V()K>SRH (mM) M>L1,YV;(N)JF > Y,M,L;(0)P>3 A; (p) S 3 T; (TS S; (NNW >Y,F;(s)Y>SW,F; e(t)V>1,L.

[00199] Em algumas modalidades, um anticorpo divulgado aqui po- de compreender CDRs de VH que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às CDRs de VH de um anticorpo de referência tal como Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 65; VL: SEQ ID NO: 66). Alternativamente ou adicionalmente, o anticorpo pode compreender CDRs de VL que coletivamente são pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idênticas às CDRs de VL do anticorpo de referência. Em algumas modalidades, um anticorpo pode compreender uma VH que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntica à VH de um anticorpo de referência tal como Anticorpo A (VH: SEQ ID NO: 65; VL: SEQ ID NO: 66) e/ou uma VL que é pelo menos 80% (por exemplo, 85%, 90%, 95% ou 98%) idêntica à região variável VL do anticorpo de referência. Modelo Dador

[00200] O ácido nucleico codificando um CAR pode ser entregue a uma célula T usando um vetor (por exemplo, um vetor AAV) que com- preende o que é referido aqui como um modelo dador (também referi- do como um polinucleotídeo dador). Um modelo dador pode conter uma sequência não homóloga, tal como o ácido nucleico codificando um CAR, flanqueada por duas regiões de homologia para permitir HDR eficiente em uma localização genômica de interesse. Alternati- vamente, um modelo dador pode não ter regiões de homologia com a localização visada no DNA e pode ser integrado por união de extremi- dade dependente de NHEJ após clivagem no local alvo.

[00201] Um modelo dador pode ser DNA ou RNA, de fita única e/ou fita dupla, e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou cir- cular. Se introduzido na forma linear, as extremidades da sequência dadora podem ser protegidas (por exemplo, da degradação exonucleo- lítica) por métodos conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, um ou mais resíduos de didesoxinucleotídeo são adicionados ao ter- minal 3' de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomple- mentares são ligados a uma das ou ambas as extremidades. Ver, por exemplo, Chang et a/., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-

4963; Nehls et a/l., (1996) Science 272: 886-889. Métodos adicionais para proteção de polinucleotídeos exógenos da degradação incluem, mas não estão limitados a, adição de grupo(s) amino terminal(ais) e o uso de ligações internucleotídeos modificadas tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamidatos e resíduos de ribose de O-metila ou de- soxirribose.

[00202] Um modelo dador pode ser introduzido em uma célula co- mo parte de uma molécula de vetor tendo sequências adicionais tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes codifi- cando resistência a antibióticos. Além disso, um modelo dador pode ser introduzido como ácido nucleico nu, como ácido nucleico comple- xado com um agente tal como um lipossomo ou poloxâmero, ou pode ser entregue por vírus (por exemplo, adenovírus, AAV, herpesvírus, retrovírus, lentivírus e lentivírus defeituoso em integrase (IDLV)).

[00203] “Um modelo dador, em algumas modalidades, é inserido tal que sua expressão seja conduzida pelo promotor endógeno no local de integração, nomeadamente o promotor que conduz a expressão do gene endógeno no qual o dador é inserido. No entanto, em algumas modalidades, o modelo dador compreende um promotor e/ou intensifi- cador exógenos, por exemplo um promotor constitutivo, um promotor indutível ou promotor específico de tecido. Em algumas modalidades, o promotor exógeno é um promotor EF1a compreendendo uma se- quência de SEQ ID NO: 129. Podem ser usados outros promotores.

[00204] Além do mais, as sequências exógenas podem também incluir sequências reguladoras transcricionais ou translacionais, por exemplo, promotores, intensificadores, isoladores, locais internos de entrada de ribossomos, sequências codificando peptídeos 2A e/ou si- nais de poliadenilação. Métodos e Construtos de Entrega

[00205] “Nucleases e/ou modelos dadores podem ser entregues usando um sistema de vetor, incluindo, mas não se limitando a, veto- res de plasmídeo, minicírculos de DNA, vetores retrovirais, vetores len- tivirais, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus; vetores de her- pesvírus e vetores de vírus adenoassociados e suas combinações.

[00206] “Métodos convencionais de transferência de genes basea- dos em vírus e não virais podem ser usados para introduzir ácidos nu- cleicos codificando nucleases e modelos dadores em células (por exemplo, células T). Os sistemas de entrega de vetor não viral incluem plasmídeos de DNA, minicírculos de DNA, ácido nucleico nu e ácido nucleico complexado com um veículo de entrega, tal como um lipos- somo ou poloxâmero. Os sistemas de entrega de vetor viral incluem vírus de DNA e RNA, que possuem genomas epissomais ou integra- dos após a entrega à célula.

[00207] Os métodos de entrega não viral de ácidos nucleicos inclu- em eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomos, |li- possomos, imunolipossomos, policátion ou conjugados lipídeo:ácido nucleico, DNA nu, RNA nu, RNA coberto, vírions artificiais e absorção intensificada por agente do DNA. Sonoporação usando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) pode ser também usada para en- trega de ácidos nucleicos. Entrega Viral Adenoassociada

[00208] O ácido nucleico dador codificando um construto de CAR pode ser entregue a uma célula usando um vírus adenoassociado (AAV). Os AAVs são pequenos vírus que se integram sítio- especificamente no genoma do hospedeiro e podem portanto entregar um transgene, tal como CAR. Repetições terminais invertidas (ITRs) estão presentes flanqueando o genoma de AAV e/ou o transgene de interesse e servem como origens de replicação. Estão também pre- sentes no genoma de AAV proteínas rep e cap que, quando transcri- tas, formam capsídeos que encapsulam o genoma de AAV para entre-

ga em células alvo. Receptores de superfície em estes capsídeos que conferem o serotipo de AAV, que determina a que órgãos alvo os cap- sídeos se ligarão principalmente e assim que células o AAV infetará mais eficientemente. Existem doze serotipos de AAV humanos corren- temente conhecidos. Em algumas modalidades, o AAV é serotipo 6 de AAV (AAV6).

[00209] Os vírus adenoassociados estão entre os vírus o mais fre- quentemente usados para terapia gênica por várias razões. Em primei- ro lugar, os AAVs não provocam uma resposta imunitária após admi- nistração a mamíferos, incluindo seres humanos. Em segundo lugar, os AAVs são efetivamente entregues às células alvo, particularmente quando é dada consideração à seleção do serotipo de AAV apropria- do. Finalmente, os AAVs têm a capacidade de infetar células tanto em divisão como não em divisão porque o genoma pode persistir na célula hospedeira sem integração. Este traço os torna um candidato ideal pa- ra terapia gênica. Reparação Dirigida por Homologia (HDR)

[00210] O ácido nucleico dador codificando um CAR é inserido por reparação dirigida por homologia (HDR) no lócus do gene alvo. Ambas as cadeias do DNA no lócus alvo são cortadas por uma enzima CRISPR Cas9. HDR ocorre então para reparar a quebra de fita dupla (DSB) e inserir o DNA dador. Para que isto ocorra corretamente, a se- quência dadora é desenhada com resíduos flanqueantes que são complementares à sequência rodeando o local de DSB no gene alvo (doravante "braços de homologia"). Estes braços de homologia servem como o modelo para reparação de DSB e permitem que HDR seja um mecanismo essencialmente isento de erros. A taxa de reparação diri- gida por homologia (HDR) é uma função da distância entre a mutação e o local de corte, logo é importante escolher locais alvo sobrepostos ou próximos. Os modelos podem incluir sequências extras flanquea-

das pelas regiões homólogas ou podem conter uma sequência que difere da sequência genômica, permitindo assim a edição da sequên- cia.

[00211] O gene alvo pode ser associado a uma resposta imunitária em um indivíduo, em que a deleção permanente de pelo menos uma porção do gene alvo modulará a resposta imunitária. Por exemplo, pa- ra gerar uma célula T CAR, o gene alvo pode ser a região constante de TCRa (TRAC). A interrupção de TRAC leva à perda da função do TCR endógeno.

[00212] Em algumas modalidades, o gene alvo está em um lócus de porto seguro. Células T manipuladas

[00213] As células T CAR manipuladas (com edição gênica) da pre- sente divulgação podem ser autólogas ("próprias") ou não autólogas ("não próprias", por exemplo, alogênicas, singênicas ou xenogênicas). "Autólogo" se refere a células do mesmo indivíduo. "Alogênico" se re- fere a células da mesma espécie que um indivíduo, mas que diferem geneticamente das células do indivíduo. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de um mamífero. Em algumas modalidades, as células T são obtidas de um ser humano.

[00214] As células T podem ser obtidas de um número de fontes incluindo, mas não se limitando a, células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido de linfonodos, sangue do cordão um- bilical, tecido do timo, tecido de um local de infeção, ascites, derrame pleural, tecido do baço e tumores. Em certas modalidades, as células T podem ser obtidas de uma unidade de sangue coletada de um indi- víduo usando qualquer número de técnicas conhecidas do perito, tal como sedimentação, por exemplo, separação com FICOLL'Y,

[00215] Em algumas modalidades é usada uma população isolada de células T. Em algumas modalidades, após isolamento das células mononucleares do sangue periférico (PBMC), os linfócitos T tanto cito- tóxicos como auxiliares podem ser classificados em subpopulações de células T naive, de memória e efetoras antes da ou após ativação, ex- pansão e/ou modificação genética.

[00216] Uma subpopulação específica de células T, expressando um ou mais dos seguintes marcadores de superfície celular: TORab, CD3, CD4, CD8, CD27 CD28, CD38 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD127, CD122, CD95, CD197, CCR7, KLRG1, proteínas MCH-I e/ou proteínas MCH-Il, pode ser adicionalmente isolada por técnicas de se- leção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, uma subpopula- ção específica de células T, expressando um ou mais dos marcadores selecionados do grupo consistindo em TOCRab, CD4 e/ou CD8, é adici- onalmente isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Em algumas modalidades, as populações de células T manipuladas não expressam ou não expressam substancialmente um ou mais dos se- guintes marcadores: CD70, CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, HM3 e LAG3. Em algumas modalidades, as subpopulações de células T podem ser isoladas por seleção positiva ou negativa antes da manipu- lação genética e/ou pós-manipulação genética.

[00217] Em algumas modalidades, uma população isolada de célu- las T expressa um ou mais dos marcadores incluindo, mas não se limi- tando a, um CD3+, CD4+, CD8+ ou uma sua combinação. Em algu- mas modalidades, as células T são isoladas de um dador, ou indiví- duo, e em primeiro lugar ativadas e estimuladas para proliferarem in vitro antes de serem submetidas a edição gênica.

[00218] Para alcançar doses terapêuticas suficientes de composi- ções de células T, as células T são frequentemente sujeitas a uma ou mais rondas de estimulação, ativação e/ou expansão. As células T po- dem ser ativadas e expandidas geralmente usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. 6,352,694; 6,534,055;

6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; e 6,867,041. Em algumas modalidades, as células T são ativadas e expandidas durante cerca de 1 dia a cerca de 4 dias, cerca de 1 dia a cerca de 3 dias, cerca de 1 dia a cerca de 2 dias, cerca de 2 dias a cerca de 3 dias, cerca de 2 dias a cerca de 4 dias, cerca de 3 dias a cerca de 4 dias, ou cerca de 1 dia, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias ou cerca de 4 dias antes da introdução das composições de edi- ção do genoma nas células T.

[00219] Em algumas modalidades, as células T são ativadas e ex- pandidas durante cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 12 ho- ras, cerca de 18 horas, cerca de 24 horas, cerca de 36 horas, cerca de 48 horas, cerca de 60 horas ou cerca de 72 horas antes da introdução das composições de edição gênica nas células T.

[00220] Em algumas modalidades, as células T são ativadas ao mesmo tempo que as composições de edição do genoma são introdu- zidas nas células T. Métodos de Tratamento e Composições

[00221] São proporcionados aqui, em algumas modalidades, méto- dos para tratamento de câncer (por exemplo, leucemias, por exemplo, leucemia mieloide aguda). Exemplos não limitantes de leucemias que podem ser tratadas como proporcionado aqui incluem leucemia linfo- blástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocí- tica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML). Em algumas modalidades, os métodos compreendem entrega das células T CAR (por exemplo, células T CAR anti-CD33) da presente divulgação a um indivíduo tendo câncer (por exemplo, leucemias) incluindo leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

[00222] O passo de administração pode incluir a colocação (por exemplo, transplante) de células, por exemplo, células T manipuladas, em um indivíduo, por um método ou via que resulta em localização pe- lo menos parcial das células introduzidas em um local desejado, tal como tumor, tal que o(s) efeito(s) desejado(s) seja(m) produzido(s) As células T manipuladas podem ser administradas por qualquer via apropriada que resulte na entrega em uma localização desejada no indivíduo onde pelo menos uma porção das células implantadas ou componentes das células permanece viáveis. O período de viabilidade das células após administração a um indivíduo pode ser tão curto quanto algumas horas, por exemplo, vinte e quatro horas, a alguns di- as, até tão longo quanto vários anos, ou mesmo o tempo de vida do indivíduo, i.e., enxerto de longo prazo. Por exemplo, em alguns aspec- tos descritos aqui, uma quantidade eficaz de células T manipuladas é administrada através uma via de administração sistémica, tal como uma via intraperitoneal ou intravenosa.

[00223] “Um indivíduo pode ser qualquer indivíduo para o qual diag- nóstico, tratamento ou terapia é desejado. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[00224] “Um dador é um indivíduo que não é o indivíduo a ser trata- do. Um dador é um indivíduo que não é o paciente. Em algumas mo- dalidades, um dador é um indivíduo que não tem ou não é suspeito de ter o câncer a ser tratado. Em algumas modalidades são usados múlti- plos dadores, por exemplo, dois ou mais dadores.

[00225] Em algumas modalidades, a população de células T mani- puladas sendo administrada de acordo com os métodos descritos aqui compreende células T alogênicas obtidas de um ou mais dadores. "Alogênico" se refere a uma célula, população de células ou amostras biológicas compreendendo células obtidas de um ou mais dadores di- ferentes da mesma espécie, onde os genes em um ou mais /oci não são idênticos ao destinatário (por exemplo, indivíduo). Por exemplo, uma população de células T manipuladas, sendo administrada a um indivíduo, pode ser derivada de um ou mais dadores não relacionados ou de um ou mais irmãos não idênticos. Em algumas modalidades po- dem ser usadas populações de células singênicas, tais como aquelas obtidas de dadores geneticamente idênticos (por exemplo, gémeos idênticos). Em algumas modalidades, as células são células autólogas; isto é, as células T manipuladas são obtidas ou isoladas a partir de um indivíduo e administradas ao mesmo indivíduo, i.e., o dador e o desti- natário são os mesmos.

[00226] Em algumas modalidades, uma população de células T manipuladas sendo administrada de acordo com os métodos descritos aqui não induz toxicidade no indivíduo, por exemplo, as células T ma- nipuladas não induzem toxicidade em células não cancerosas. Em al- gumas modalidades, uma população de células T manipuladas sendo administrada não desencadeia a lise mediada por complemento ou não estimula a citotoxicidade mediada por células dependente de anti- corpos (ADCC).

[00227] Uma quantidade eficaz se refere à quantidade de uma po- pulação de células T manipuladas necessária para prevenir ou aliviar pelo menos um ou mais sinais ou sintomas de uma condição médica (por exemplo, câncer) e se relaciona com uma quantidade suficiente de uma composição para proporcionar o desejado efeito, por exemplo, para tratar um indivíduo tendo uma condição médica. Uma quantidade eficaz inclui também uma quantidade suficiente para prevenir ou retar- dar o desenvolvimento de um sintoma da doença, alterar o decurso de um sintoma da doença (por exemplo, mas não se limitando a, desace- lerar a progressão de um sintoma da doença) ou reverter um sintoma da doença. É entendido que, para qualquer dado caso, uma quantida- de eficaz apropriada pode ser determinada por um perito na técnica usando experimentação de rotina.

[00228] Para uso nos vários aspectos descritos aqui, uma quanti- dade eficaz de células (por exemplo, células T manipuladas) compre- ende pelo menos 10? células, pelo menos 5 X 10? células, pelo menos 10º células, pelo menos 5 X 10º células, pelo menos 10º células, pelo menos 5 X 10º células, pelo menos 10º células, pelo menos 2 X 105 células, pelo menos 3 X 105º células, pelo menos 4 X 10º células, pelo menos 5 X 10º células, pelo menos 6 X 105º células, pelo menos 7 X 10º células, pelo menos 8 X 10º células, pelo menos 9 X 10º células, pelo menos 1 X 10º células, pelo menos 2 X 10º células, pelo menos 3 X 1086 células, pelo menos 4 X 10º células, pelo menos 5 X 106 células, pelo menos 6 X 10º células, pelo menos 7 X 10º células, pelo menos 8 X 1086 células, pelo menos 9 X 108º células ou seus múltiplos. As células são derivadas de um ou mais dadores ou são obtidas de uma fonte autóloga. Em alguns exemplos descritos aqui, as células são expandi- das em cultura antes da administração a um indivíduo com sua neces- sidade.

[00229] Os modos de administração incluem injeção, infusão, insti- lação ou ingestão. Injeção inclui, sem limitação, injeção e infusão in- travenosas, intramusculares, intra-arteriais, intratecais, intraventricula- res, intracapsulares, intraorbitais, intracardíacas, intradérmicas, intra- peritoneais, transtraqueais, subcutâneas, subcuticulares, intra-articu- lares, subcapsulares, subaracnoides, intraespinhais, intracerebroespi- nhais e intraesternais. Em algumas modalidades, a via é intravenosa.

[00230] Em algumas modalidades, as células T manipuladas são administradas sistemicamente, o que se refere à administração de uma população de células sem ser diretamente em um local, tecido ou órgão alvo, tal que entrem, ao invés, no sistema circulatório do indiví- duo e, assim, sejam sujeitas ao metabolismo e outros processos simi- lares.

[00231] A eficácia de um tratamento compreendendo uma composi- ção para o tratamento de uma condição médica pode ser determinada pelo médico perito. Um tratamento é considerado "tratamento eficaz" se qualquer um dos ou todos os sinais ou sintomas de, como um exemplo, níveis de alvo funcional forem alterados de uma maneira be- néfica (por exemplo, aumentado em pelo menos 10%) ou outros sin- tomas clinicamente aceites ou marcadores da doença (por exemplo, cancro) forem melhorados ou aliviados. A eficácia pode ser também medida pela falha de um indivíduo em piorar como avaliado por hospi- talização ou necessidade de intervenções médicas (por exemplo, a progressão da doença é interrompida ou pelo menos desacelerada). Os métodos de medição destes indicadores são conhecidos dos peri- tos na técnica e/ou descritos aqui. O tratamento inclui qualquer trata- mento de uma doença no indivíduo e inclui: (1) inibição da doença, por exemplo, paragem, ou desaceleração da progressão dos sintomas; ou (2) alívio da doença, por exemplo, causando regressão dos sintomas; e (3) prevenção ou redução da probabilidade do desenvolvimento de sintomas. Outras Modalidades

[00232] A divulgação se relaciona com as seguintes modalidades. Ao longo desta seção, o termo modalidade é abreviado como "E" se- guido por um ordinal. Por exemplo, E1 é equivalente à Modalidade 1.

E1. Uma célula T manipulada compreendendo um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especificamente a CD33.

E2. A célula T manipulada da modalidade 1 compreenden- do adicionalmente um gene da região constante alfa do receptor de células T (TRAC) interrompido.

E3. A célula T manipulada da modalidade 2, em que o áci-

do nucleico codificando o CAR é inserido no gene TRAC.

E4. A célula T manipulada de qualquer uma das modalida- des 1-3 compreendendo adicionalmente um gene da beta-2-micro- globulina (B2M) interrompido.

E5. A célula T manipulada de qualquer uma das modalida- des 1-4, em que o ectodomínio do CAR compreende um anticorpo an- ti-CD33.

EB6. A célula T manipulada da modalidade 5, em que o anti- corpo anti-CD33 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti- CD33.

E7. A célula T manipulada da modalidade 6, em que o scFv anti-CD33 compreende as mesmas regiões determinantes da com- plementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um an- ticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende: (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 65 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 66, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 77 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 78 ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 89 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 920.

E8. A célula T manipulada da modalidade 7, em que o scFv anti-CD33 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticor- po de referência.

E9. A célula T manipulada da modalidade 7, em que o scFv anti-CD33 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 73, 75, 85, 87, 97 ou 99.

E10. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 1-9, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

E11. A célula T manipulada da modalidade 10, em que o CAR compreende adicionalmente um domínio de sinalização citoplas- mática CD3C.

E12. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 3-11, em que o gene TRAC compreende a sequência de nucle- otídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115 ou 118, e/ou em que o CAR é codificado pela se- quência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119.

E13. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 4-14, em que o gene B2M interrompido compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 9-14.

E14. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 1-15, em que as células T compreendem um gene CD33 de tipo selvagem.

E15. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 1-15, em que as células T compreendem adicionalmente um gene CD33 interrompido.

E16. A célula T manipulada da modalidade 17, em que o gene CD33 interrompido compreende uma sequência de nucleotídeos de AGTTCATGGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 187), AGITCATGG- TTCC (SEQ ID NO: 188), AGTTCATGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 189), AGTITCATGGTTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 190), AGTTCC, AGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 191), AGTITCATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 192), AGITCATGGTATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 193), e/ou AGTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 194).

E17. A célula T manipulada da modalidade 17 ou modali- dade 18, em que o gene CD33 interrompido carece de um fragmento compreendendo AGTTCATGGTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 186).

E18. A célula T manipulada da modalidade 17, em que o gene CD33 interrompido compreende uma sequência de nucleotídeos de ARSATCCTGGCACT (SEQ ID NO: 300), AMATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 301), AMATCCTCATTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 302), AA- ATCCTCACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 304), AMATCCTCCCCTGG- CACT (SEQ ID NO: 305), AMATCCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 306), ANATCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 307), ACATCCTCATT- CCCTGGCACT (SEQ ID NO: 308), ACATCCTGGCACT (SEQ ID NO: 309), AMATCCTCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 310), AAATCCT- CATCTGGCACT (SEQ ID NO: 311), AMATCCT, ANACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 312), AMATCCTCTGGCACT (SEQ ID NO: 313), AAA- TCCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 314), AMATCCTCACT (SEQ ID NO: 315), ACATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 316), e/ou AAAT.

E19. A célula T manipulada da modalidade 20, em que o gene CD33 interrompido carece de um fragmento compreendendo AAATCCTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 299).

E20. A célula T manipulada da modalidade 20 ou modali- dade 21, em que o gene CD33 interrompido carece de um fragmento, o segmento 3 do qual compreende a sequência de nucleotídeos de AAATCCTCAT (SEQ ID NO: 317), AMATCCTCATCCCT (SEQ ID NO: 318), AMATCCTCATCCCTGG (SEQ ID NO: 320), AMATCCTCATC (SEQ ID NO: 322), ou AMATCCTCATCCCTGGCA (SEQ ID NO: 324).

E21. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 20-22, em que o gene CD33 interrompido carece de um frag- mento, o segmento 5 do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de CTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 323).

E22. Uma população de células T manipuladas compreen- dendo a célula T manipulada de qualquer uma das modalidades 1-21, em que pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células T manipula- das da população expressam o CAR.

E23. A população da modalidade 22, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

E24. A população da modalidade 22, em que pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressam o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

E25. A população de qualquer uma das modalidades 22-24, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína do receptor de células T (TOR).

E26. A população da modalidade 25, em que pelo menos 90% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína TCR.

E27. A população de qualquer uma das modalidades 22-26, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína B2M.

E28. A população da modalidade 27, em que pelo menos 70% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína B2M.

E29. A população de qualquer uma das modalidades 22-28, em que pelo menos 20% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína CD33.

E30. A população da modalidade 29, em que pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressam um nível detectável de proteína CD33.

E31. A população de qualquer uma das modalidades 22-30, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam CD33, induzem a lise celular de pelo menos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancerosas da população.

E32. A população da modalidade 31, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma po- pulação de células cancerosas que expressam CD33, induzem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

E33. A população da modalidade 31 ou modalidade 32, em que as células T manipuladas da população, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretam IFNy.

E34. A população de qualquer uma das modalidades 31-33, em que a razão entre células T manipuladas e células cancerosas é 1:1a21.

E35. A população de qualquer uma das modalidades 31-34, em que as células cancerosas compreendem leucemia.

E36. A população de qualquer uma das modalidades 31-34, em que as células cancerosas compreendem leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crô- nica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

E37. Um método compreendendo administração da popula- ção de células T manipuladas de qualquer uma das modalidades 22- 36 a um indivíduo.

E38. O método da modalidade 37, em que o indivíduo é um indivíduo humano.

E39. O método da modalidade 37 ou 38, em que o indiví- duo tem um câncer.

E40. O método da modalidade 39, em que o câncer é uma leucemia, opcionalmente leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

E41. O método da modalidade 39 ou modalidade 40 em que o câncer compreende células cancerosas expressando CD33.

E42. O método de qualquer uma das modalidades 39-41,

em que a administração da população de células T manipuladas a um indivíduo causa uma redução no(s) volume(s) tumoral(ais) cancero- so(s) em relação a um controle de linha de base.

E43. Um método para produção de uma célula T manipula- da, o método compreendendo: (a) entrega a uma célula T de (i) uma nuclease guiada por RNA, (ii) um gRNA visando um gene TRAC e (iii) um vetor compreendendo um modelo dador que compreende um ácido nucleico codificando um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a CD33; e (b) produção de uma célula T manipulada tendo um gene TRAC inter- rompido e expressando o CAR.

E44. O método da modalidade 43, em que o gRNA visando o gene TRAC compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19 ou visa a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40.

E45. O método da modalidade 43 ou 44 em que o ácido nucleico codificando o CAR é flanqueado por braços de homologia à direita e à esquerda para o gene TRAC.

E46. O método de qualquer uma das modalidades 43-45 compreendendo adicionalmente entrega à célula T de um gRNA vi- sando o gene B2M.

E47. O método da modalidade 46, em que o gRNA visando o gene B2M compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: ou SEQ ID NO: 21 ou visa a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

E48. O método de qualquer uma das modalidades 43-47, em que a nuclease guiada por RNA é uma nuclease Cas9, opcional- mente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

E49. O método de qualquer uma das modalidades 43-48 compreendendo adicionalmente entrega à célula T de um gRNA vi- sando o gene CD33.

E50. O método da modalidade 49, em que o gRNA visando o gene CD33 compreende uma sequência de nucleotídeos como pro- porcionado na Tabela 10.

E51. O método de qualquer uma das modalidades 43-50, em que o ectodomínio do CAR é um anticorpo anti-CD33.

E52. O método da modalidade 51, em que o anticorpo anti- CD33 é um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-CD33.

E53. O método da modalidade 52, em que o scFv anti- CD33 compreende as mesmas regiões determinantes da complemen- taridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anti- corpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 65 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 66, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 77 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 78 ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 89 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 920.

E54. O método da modalidade 52, em que o scFv anti- CD33 compreende as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

E55. O método da modalidade 54, em que o scFv anti- CD33 compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 73, 75, 85, 87, 97 ou 99.

E56. O método de qualquer uma das modalidades 43-55, em que o CAR compreende um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

E57. O método da modalidade 56, em que o CAR compre- ende adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3C.

E58. O método de qualquer uma das modalidades 43-57, em que o modelo dador compreende a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118.

E59. O método de qualquer uma das modalidades 43-58, em que o CAR é codificado por uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119.

E60. Um método para redução do volume de um tumor em um indivíduo tendo câncer, o método compreendendo administração ao indivíduo de uma população de células T manipuladas de qualquer uma das modalidades 22-36.

E61. O método da modalidade 60, em que o volume do tu- mor no indivíduo é reduzido em pelo menos 50% em relação a um controle de linha de base, opcionalmente em que 1x10º células a 1x107 células da população são administradas.

E62. Uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico codificando um CAR compreen- dendo um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33.

E63. A população de células da modalidade 62, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimula- dor 41BB e um domínio coestimulador CD3C.

E64. A população de células da modalidade 62 ou modali- dade 63, em que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nu- cleico codificando o CAR.

E65. A população de células de qualquer uma das modali- dades 62-64 compreendendo adicionalmente um gene CD33 interrom- pido. E66. Uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimula- dor 41BB e um domínio de coestimulador CD3C; e (ii) um gene B2M interrompido.

E67. A população de células da modalidade 63 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido.

E68. Uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e (ii) um gene B2M interrompido.

E69. A população de células da modalidade 68 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido.

E70. Uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104; e (ii) um gene B2M interrompido.

E71. A população de células da modalidade 70 compreen-

dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido.

E72. Uma população de células compreendendo células T manipuladas, em que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; e (ii) um gene B2M interrompido.

E73. A população de células da modalidade 72 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido.

E74. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico codificando um CAR compreen- dendo um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33.

E75. A célula T manipulada da modalidade 74, em que o CAR compreende (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimula- dor 41BB e um domínio coestimulador CD3C.

E76. A célula T manipulada da modalidade 74 ou modali- dade 75, em que o gene TRAC interrompido compreende o ácido nu- cleico codificando o CAR.

E77. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 74-76 compreendendo adicionalmente um gene CD33 interrom- pido.

E78. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar

CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimula- dor 41BB e um domínio de coestimulador CD3C; e (ii) um gene B2M interrompido.

E79. A célula T manipulada da modalidade 75 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido. E80. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e (ii) um gene B2M interrompido.

E81. A célula T manipulada da modalidade 77 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido. E82. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104; e (ii) um gene B2M interrompido.

E83. A célula T manipulada da modalidade 82 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido. E84. Uma célula T manipulada compreendendo: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; e (ii) um gene B2M interrompido.

E85. A célula T manipulada da modalidade 84 compreen- dendo adicionalmente um gene CD33 interrompido. E86. A célula T manipulada de qualquer uma das modali- dades 1-21 e 74-85, em que a célula T é uma célula T humana. E87. Um método de tratamento de câncer em um indivíduo,

compreendendo administração ao indivíduo a população de células de qualquer uma das modalidades 62-73.

E88. O método da modalidade 87, em que o câncer é uma leucemia, opcionalmente leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

E89. O método da modalidade 87 ou modalidade 88 em que o câncer compreende células expressando CD33.

E90. Uma célula T manipulada produzida por qualquer um dos métodos das modalidades 43-59.

E91. Uma população de células produzida por qualquer um dos métodos das modalidades 43-59.

E92. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o CAR compreende uma sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 104, 105, 107, 111, 114, 117 ou 120.

E93. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o CAR compreende uma sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 104.

E94. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de GGATCCAAATTCTGGCTGC (SEQ ID NO:175), GGATCCAAATTTTCTGGCOTGC (SEQ ID NO:176), GGA- TCCTGGCTGC (SEQ ID NO: 177), GGATCCAATTOTGGCTGC (SEQ ID NO: 178), TCCTGGCTGC (SEQ ID NO: 179), GGATCTGGCTGC (SEQ ID NO: 180), GGATCC, e/ou GGATCCATTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 181).

E95. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um fragmento compreendendo GGATCCAAATTTCTGGCTGC (SEQ ID NO: 174).

E96. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda-

lidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um fragmen- to, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotídeos de GGATCCAAATTTC (SEQ ID NO: 182), GGATCCAAATT (SEQ ID NO: 183), ou GGEATCCAAATTT (SEQ ID NO: 185).

E97. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de ACTCCCCAGTTTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 197), ACTCCCCAGTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 198), AC- TCCCCATGGTTAC (SEQ ID NO: 199), ACTCCCCAGTTAC (SEQ ID NO: 200), ACTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 201), ACTCCCCAT- CATGGTTAC (SEQ ID NO: 202), ACTCCCCATTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 203), ACTCCCCAGTGTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 204), e/ou ACTCCCCAGTCTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 205).

E98. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um fragmento compreendendo ACTCCCCAGTTCATGGTTAC (SEQ ID NO: 196).

E99. Uma célula T manipulada de qualquer uma das moda- lidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um fragmen- to, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotídeos de ACTCCCCAGTTCATGGTT (SEQ ID NO: 206).

E100. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de AGCCATTATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 208), AGCCAGGGACT (SEQ ID NO: 209), AGCCATTATTCCOAGG- GACT (SEQ ID NO: 210), AGTCCAGGGACT (SEQ ID NO: 211), AG- CCATTATAATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 212) AGCCATTA- TCCGGGGACT (SEQ ID NO: 213), AGCCATTATACAGGGACT (SEQ ID NO: 214), AGCCATTATTCCGGGGACT (SEQ ID NO: 216), e/ou AGCCATTATAATCCGGGGACT (SEQ ID NO: 217).

E101. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo-

dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento compreendendo AGCCATTATATCCAGGGACT (SEQ ID NO: 207).

E102. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de AGCCATTATATCCA (SEQ ID NO: 218) ou AGCCATTATA (SEQ ID NO: 219).

E103. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de TCAGTGACAGGAGGG (SEQ ID NO: 221), TCAGTGACGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 222), TEAGGAGGG (SEQ ID NO: 223), TEAGTGACGGAGGG (SEQ ID NO: 224), TCAG- TGACGGGAGGG (SEQ ID NO: 226), TEAGTGACGGTTACAGGA- GGG (SEQ ID NO: 227), TEAGTGACGGACAGGAGGG (SEQ ID NO: 228), TEAGTGACGGGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 229), TCAGTA- CAGGAGGG (SEQ ID NO: 230), TEAGTGACTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 231), TEAGTGACGGG (SEQ ID NO: 232), TEAGTGACGG (SEQ ID NO: 233) TCAGTGACGGCAGGAGGG (SEQ ID NO: 234) TCEAGTGACGGAGGAGGG (SEQ ID NO: 235), TCAGTGATA- CAGGAGGG (SEQ ID NO: 236), TEAGTGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 237), e/ou TCATACAGGAGGG (SEQ ID NO: 238).

E104. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento compreendendo TEAGTGACGGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 220).

E105. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de TEAGTGACGGTA (SEQ ID NO: 239) ou TCAGTGACG.

E106. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 5 do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de GTGACGGTACAGGAGGG (SEQ ID NO: 242).

E107. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de AGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 244), AGG- TGAAGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 245), AGGTGAAGCT (SEQ ID NO: 246), AGGTGAAGTTGGAGCT (SEQ ID NO: 247), AGGTGAAGTCG- CTGGAGCT (SEQ ID NO: 248), AGGTGGAGCT (SEQ ID NO: 249), AGGTGAAGCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 250), AGGTGACGCTG- GAGCT (SEQ ID NO: 252), e/ou AGGTGAAGTTTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 253).

E108. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento compreendendo AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 243).

E109. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de AGGTGAAGTTCG (SEQ ID NO: 256), AGGTGAAGTTCG- CTGGAG (SEQ ID NO: 259), AGGTGAAGTTCGCTGG (SEQ ID NO: 260), ou AGGTGAAGTT (SEQ ID NO: 261).

E110. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 5 do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de GGTGAAGTTCGCTGGAGCT (SEQ ID NO: 262).

E111. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de AGTTCGCTGGTGTG (SEQ ID NO: 264)

e/ou AGTTCGCTGAGCTGGTGTG (SEQ ID NO: 266).

E112. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento compreendendo AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG (SEQ ID NO: 263).

E113. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de AGTTCGCTGG (SEQ ID NO: 267).

E114. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de ACTACTCACTTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 269), ACTACTCGGTGCT (SEQ ID NO: 270), ACTACT- CATCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 271), ACTACT, ACTACTCAC- CCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 272), ACTACTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 273), ACTACTCACCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 275), ACTACT- CACTCGGTGCT (SEQ ID NO: 276), ACTACTCTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 277), ACTACTTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 278), AC- TACTCACTTCGGTGCT (SEQ ID NO: 279), e/ou ACTATCCTCGG- TGCT (SEQ ID NO: 280).

E115. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento compreendendo ACTACTCACTCCTCGGTGCT (SEQ ID NO: 268).

E116. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de ACTACTCACT (SEQ ID NO: 282), ACTACTCACTCCTC (SEQ ID NO: 283), ou ACTACTCACTCCTCGGT (SEQ ID NO: 284).

E117. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo-

dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado compreende uma se- quência de nucleotídeos de COCCOGATCTTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 286), CCOGATCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 287), CCOGATCTGGTTGT (SEQ ID NO: 288), CCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 289), CCCGATCTT- CTGGTTGT (SEQ ID NO: 290), CCCGATCTTGGTTGT (SEQ ID NO: 291), CCCGATCTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 292), CCCGATCTT- CCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 293), e/ou CCCGAT.

E118. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento compreendendo CCCGATCTTCTCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 285).

E119. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 3” do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de CCCGATCTTCT (SEQ ID NO: 295).

E120. Uma célula T manipulada de qualquer uma das mo- dalidades de 1-21, em que o gene CD33 editado carece de um frag- mento, o segmento 5 do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de TCCTGGTTGT (SEQ ID NO: 298).

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33.

[00233] Este exemplo descreve a produção de células T humanas alogênicas que carecem de expressão do gene do receptor de células T (TOR) (gene editado na região Constante Alfa de TOR (TRAC)), o gene de B2-microglobulina (B2M) e que expressam um receptor de an- tígeno quimérico (CAR) visando CD33 e cânceres CD33*”. Quatro CARs anti-CD33 exclusivos (CTX-965, CTX-964, CTX-969 e CTX-970) compreendendo domínios coestimuladores CD28 foram separadamen- te expressos em células T TRAC/B2M' para experimentação e avalia- ção. CARs anti-CD33 adicionais (CTX-965b, CTX-964b, CTX-969b e

CTX-970b) foram também gerados com um domínio coestimulador 4- 1BB no lugar de CD28. CARs adicionais podem ser gerados como mostrado na Tabela 6.

S bLbbbEbbEL o oO oO oO oO oO o oO hai F Rai a 2 je je je e e (eee E E | Tv e Ee E e E EE EE = = = = = = = = = = = = o o o o o o o o o o o o cs cs cs cs cs cs cs cs cs cs cs cs E |EÉ |É |É |É |É |É |É |É |É |É |E o o o o o o o o o o o o SaSssSssSssSssSsSsSsSaSxS3Ss so 3 co Soo 3 o 2 oo a co 3100 o 2 oo (a co ES 100 À o À à 8a S)a 9a Sa SJ SIG SIA Ba SIA S/a 8/6 8 SE ZE SO EZSESS2SQ = 54 Srt ST So 5 o St sr Srt S5SxXOS2I 528 > $>8>= 0> 8>S3>S8=>3=>s8><23=><s><s2>3 2 ES o Ss o So 3 o Sos o Sos o ES o Sol os E 2/8 2/2 2/2 3/9 2/9 3/2 2/2 2/2 2/2 2/9 2/9 2 & E 6 Elgg EG E 6 Elo E e Elm Ele E e Elo E 6 E PASSAS As: Ss ss cs: XI oX ja ou XE o XE Bju ou ja ole BE o E = 8= 8> 82 8= 8|= 8)= 8= 82 82 8= 8= 8 = O e o = o e o E o o e o o e o o E oo

FESSESS ENS FSS FRSENRS ERS ENS FRSESSFRS FR & 5 Só Ej Sj6 Ejs Sj E Sja Ej6 So E So E S8 28 3/8 38 38 38 3/8 38383832 82482>, o RN o Dl oR o oR o o oD oNR oD oNR om SoSomnmodon od em od omnes on ediom SS SE 2 5 e 2 98 2 98 9 9 ole 9 8 518 DERA ETREREEEEECAso E E AS ASAS ASAS ASS AS 2E Ss 4 |O co oO co co coco coco co oo coco coco coco co oo coco coco co nO 000/06 09/06 9/0 9/0 9/6 9/6 9/6 3/6 0/06 3/6 À w/|O 0/0 0/0 0/60 0/60 0/0 0/0 0/60 0/0 0/0 0/0 0/0 O 2 2 E E 2 2 E E E E 2 2 23 Rr 3 mr rr 3 >| > 3X 2 6X XE à à EX EX jà à jà à E |X > > BB ss >>> >> |> Go do do o duo du du du du o oo o > > > | >| >>> >>> >> & kb kh po N É E || | | jó |& o o o o MN MN MN MN co co co co SO |ô lo ló jôo o 6 |ô jô jô ô |jô z jZ Z Z 2 Z Z 2 Z 2 2 |Z 2 ja jo la jo la jo a a ja la | o o o o o o o o o o o o uu uu uu uu uu wu wu wu wu wu wu wu nn jo jo jo o |O O on o o o jo IEsESsfsErSESESESESESESESES corsresreerPerererteserseses o|< S< S)< O)< 5,2 o/a ója ó/2 5,0 5)0 0/0 5/0 &gZ Zi igZ g<igZ ZA FZ ZA RS RÁ RÁ 8 & ggs selselse selsalsse selsalfe seio 2/2 OE 0/2 OE 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 O sis WicuwWiowWlswWicwW|oswWloWicwW|osWioCWicCW|CUW << 0 < O < O < O a | a a la la <a na O < à s 2 o 2 2 2 Fe) o z 3 o o fo o o o = = o o o o o o o Nm Nm co co co co — o o o o o o o o o o o o & Ex x x x x x XxX x x x x XxX 2 ME E | E E | E E |E |E |E |E |E |R E |õjo do jo jo |o |o jo jo jo |o |o o

[00234] CélulasT humanas primárias ativadas foram eletroporadas com complexos Cas9:g9RNA RNP e infetadas com vetores adenovirais adenoassociados (AAVs) contendo modelo dador de CAR anti-CD33 com homologia ao lócus TRAC para gerar células T CAR* TRAC/B2M" lanti-CD33. Serotipo 6 de AAV recombinante (AAV6) compreendendo um modelo dador de CAR (SEQ ID NOS: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118) foi entregue com Cas9:sgRNA RNPs (1 uM de Cas9, 5 uM de gRNA) a células T humanas ativadas. Os seguintes SgRNAs foram usados: TRAC (SEQ ID NO: 28) e B2M (SEQ ID NO: 30). As versões não modificadas (ou outras versões modificadas) dos gRNAs podem ser também usadas (por exemplo, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 20). Ver também Tabela 4.

[00235] Cerca de uma (1) semana pós-eletroporação, as células T com edição gênica foram analisadas por citometria de fluxo para avali- ar a percentagem da população de células que expressou um CAR anti-CD33. A marcação de CAR anti-CD33 à superfície celular foi feita com uma combinação de uma proteína CD33 (AcroBiosystems) conju- gada a biotina e um reagente secundário de estreptavidina-APC (FIG. 1A, FIG. 1B e FIG. 1C). As células de controle, incluindo células T tra- tadas sem RNP (por exemplo, "Sem RNP") e células T com uma inter- rupção dos genes TRAC e B2M mas sem inserção de CAR (por exemplo, TRAC-/B2M- ou "TB-"), não mostraram expressão de uma proteína de superfície CAR anti-CD33 como esperado. Em contraste, certas células T geradas com uma interrupção dos genes TRAC e B2M e um construto de CAR resultaram em uma elevada percentagem da população que expressou um CAR anti-CD33. Isto era verdade pa- ra células T geradas com um construto de CAR CTX-965b, CTX-969 ou CTX-970. No entanto, nem todas as células T preparadas com um construto de CAR tiveram expressão de CAR. Por exemplo, as células T geradas com um construto de CAR CTX-964, CTX-964b, CTX-965,

CTX 970b ou CTX-969b não demonstraram aumento nas células T expressando CAR em comparação com controles (Tabela 8; FIG. 1h e FIG. 1B). Surpreendentemente, para células T CAR com um dado scFv, o domínio coestimulador usado (por exemplo, CD28 vs. 41BB) teve um efeito na percentagem de células T que foram positivas para a expressão de CAR. Por exemplo, enquanto os construtos de CAR CTX-965b e CTX-965 tiveram o mesmo scFv, o construto CTX-965b que tinha um domínio coestimulador 4-1BB resultou em significativa- mente mais células CAR-positivas do que o construto CTX-965 que tinha um domínio coestimulador CD28 (FIG. 1A). Adicionalmente, a orientação do scFv teve um efeito nas quantidades relativas de células expressando CAR. Por exemplo, CTX-964 resultou em essencialmente nenhumas células com expressão de CAR apesar de ser compreendi- do pelos mesmos domínios VH e VL que CTX-965. De fato, este resul- tado não foi alterado por troca do domínio coestimulador do CAR (por exemplo, CTX-964 em comparação com CTX-964b).

[00236] Células T CAR* TRAC/B2M/anti-CD33 adicionais foram geradas com CTX-981, CTX-981b, CTX-982 e CTX-982b. Para este conjunto de CARs, a expressão não pareceu ser afetada pela orienta- ção da cadeia pesada e leve ou pelo domínio coestimulador usado. Ao invés, cada uma das populações de células T geradas com este con- junto de construtos de CAR resultou em uma elevada proporção da população que foi positiva para a expressão de CAR à superfície celu- lar (FIG. 1C).

[00237] Dos doze construtos de CAR avaliados para a expressão de CAR, três foram selecionados para análise adicional nos exemplos embaixo: Células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33, expressando CAR CTX-965b Células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33, expressando CAR CTX-970 Células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33, expressando CAR CTX-982b

[00238] Para demonstrar que a expressão de CAR é alcançada in- dependentemente do dador humano usado para gerar as células T com edição gênica, as células CAR-T anti-CD33 foram preparadas usando o construto de CAR CTX-965b de dois dadores de células T primárias adicionais de acordo com o protocolo de edição gênica aci- ma (para gerar células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 referidas como células T CAR CTX-965b) Cerca de uma (1) semana pós- eletroporação, as células foram analisadas por citometria de fluxo para avaliar os níveis de expressão de TRAC (usando PE-anti-TCRaB hu- mano, clone BW242/412 da Miltenyi Biotech, Auburn, CA), B2M (usan- do PE-Cy7-anti-B2M humano, clone 2M2 da Biolegend), CD4 (usando APC-Cy7-anti-CD4 humano, clone RPA-T4 da Biolegend), CD8 (usan- do Pacific Blue-anti-CD8 humano, clone SK1 da Biolegend) e CAR an- ti-CD33 (usando proteína CD33 conjugada a biotina (AcroBiosystems) e estreptavidina-APC) níveis de expressão à superfície celular da po- pulação de células editada (FIG. 2A). Para células editadas com CTX- 965b, uma elevada proporção da população teve expressão positiva de CAR anti-CD33 e expressão esgotada de TCR e B2M. Foi vista ex- pressão de CAR comparável para ambas as fontes de dadores, indi- cando que é alcançada edição gênica eficiente mesmo quando a fonte de dador da qual as células T são derivadas é variada. Adicionalmente foi descoberto que os níveis de CD4 e CD8 na superfície celular das células TRAC/B2M/CAR* eram comparáveis àqueles nas células de controle (células T TRAC* e células T TRAC/B2M), indicando que a inserção de um CAR não está alterando a expressão destes marcado- res fenotípicos críticos (FIG. 2A).

[00239] Os seguintes anticorpos foram usados para citometria de fluxo (Tabela 7):

— eo booocoo = S/S SSSOoO > TERES E|S > see eE ee QN o "o o o >

E

S o o s 5 E õ 22 o 8 o =. SO 5 o o E 8 2 o S DZ o — so S 2 e. O an S2mo w OM UH oO7Oo e go

ES SPCRRRRERLELESNZ SS $$ + 6 so or os OSS Do DmN EO TO 7 O O 0 Oo « o 2 0 OF 5Z om Tv $Qosvo o. N voo *H*. 2 O MM Mm —- HH O <L o Po f =) o 2 o o 3 é E Wo v <q no o < > Oo = o O 5 E Ss 7 OS O = E wW wWwW o o u|Uo 2 AQ à < nn < no a x Ss +

RW 2 & 8 a = N 2Z==o ts O MM NX boa zZ

O & <q o 8 o Ss o o E O nO êÊ O Em ww os 2 2 Ec = o 53 o ot 2c DE X= + oO 5X o 2 E O0OdàdAAAmsFg de E <rFoooMmM As

[00240] As células CAR-T CTX-965b foram produzidas a partir de 7 dadores de células T no total. Adicionalmente, o CAR CTX-970 e o CAR CTX-982b foram usados para gerar células T CAR+ TRAC-/B2M- lanti-CD33 (também referidas como células T CAR CTX-970 e células T CAR CTX-982b) a partir de 4 dadores de células T.

[00241] — Adicionalmente à expressão de CAR, as populações de cé- lulas T editadas foram analisadas quanto à percentagem de células com expressão de superfície esgotada de TORabB e B2M devido à in- terrupção gênica por CRISPR/Cas9 (Tabela 8). Como acima, cerca de uma (1) semana pós-eletroporação, as células foram processadas por citometria de fluxo para avaliar os níveis de expressão de CAR anti- CD33 na superfície celular da população de células editada. A expres- são de TCRaB e B2M foi também avaliada por coloração de células com anticorpos como descrito acima. Uma elevada percentagem de células editadas demonstrou esgotamento da expressão de superfície tanto de TORaB como de B2M (Tabela 8). Adicionalmente, dependen- do do construto de CAR usado, uma elevada percentagem de células editadas foi positiva para a expressão de um CAR anti-CD33. Estes dados mostram que as células T de dadores saudáveis podem ser edi- tadas com CRISPR/Cas9 para produzir interrupção de TRAC e B2M e inserção gênica resultando na expressão de um CAR anti-CD33.

& s< Sã o E WC oO o QE 6 A o o x - o 6 o | + + + EB < << VENÇA RZ 8x zZz ZZz PS 888

Ó = 3X + o. SS < co T o = + + e 8 No Ho o + ox Pv a en oSomº”º pk No So o ooo Tr roao OO a o o z 2 N o o = o = o 2 Ss co - - Co n n +" [= ho] < «<< FERE NGEES OS OO Soo o

8. ZzZzZRRNRRRGOSESKR o 28 E E o = z e Oo ES Es o o n n n s 3 < a « 2 8/8 2a e = je je O O QN NO ooo Ns Z 2 20 0/0 0 5 505 m

É E o rs +, 5 % o <q oO o oo

É 28 o o o oO e 8

TE Ez re TT vg Tr Tr mr mo te) E. sc s 8

FE gs 3 18 2 o o F-) F-) 2 cor IT TEBSBBSPZEFAS 6 O O O O Nr N& O O O O =" =s DQ |$ |& [É $$ & [É [É $& $$ o a xXx XxX XxX x xXx xXx XxX XxX 2 ERRAR AE LE É E 0/0 0/0 0/0 0 0/0 /0/0 00

[00242] —Surpreendentemente e inesperadamente, a proporção de células expressando anti-CD33-CAR aumentou às 2 semanas de cul- tura em relação às células analisadas à 1 semana pós-eletroporação/ infeção por rAAV. Esta tendência foi consistente para populações de células T adquiridas de diferentes dadores e transfectadas com dife- rentes construtos de CAR: CTX-965b (6 dadores), CTX-970 (4 dado- res) ou CTX-982b (3 dadores) (FIG. 2B).

[00243] Ensaio de Proporção de células T. A proporção de célu- las T com edição gênica que eram células T CD4+ ou células T CD8+ foi avaliada por citometria de fluxo à uma e duas semanas (i.e., 7 dias e 14 dias) pós-edição usando os anticorpos marcadores CD4* e CD8* listados na Tabela 7. Surpreendentemente, a percentagem de células CD4* na população de células editadas diminuiu às 2 semanas pós- edição em relação a 1 semana pós-edição. Este esgotamento de célu- las T CD4 não foi observada em células T de controle que careciam de expressão de um CAR anti-CD33 (por exemplo: sem RNP) (FIG. 2C). Para células T expressando CAR, no entanto, este esgotamento de célu- las T CDA4 ao longo do tempo foi observada para células T editadas com diferentes construtos de CAR e adquiridas de diferentes dadores: CTX- 965b (FIG. 2C), CTX-970 (FIG. 2C) ou CTX-982b (FIG. 2D).

[00244] CD33 é expresso em células T cultivadas ativadas (FIG. 4, painel esquerdo). Adicionalmente, uma proporção mais elevada de cé- lulas T CD4* são positivas para a expressão de CD33 em comparação com células T CD8* (58% vs. 31%, respectivamente).

[00245] A expansão das células CAR* e a diminuição nas células CD4* em culturas de CAR-T anti-CD33 sugerem que as células CAR-T anti-CD33 podem estar reagindo contra as células T expressando CD33 na mesma cultura. De fato, a perda completa da expressão de CD33 de superfície é observada em culturas de CAR-T anti-CD33 (por exemplo, CTX-965b) em relação aos controles (36% das células ex-

pressam CD33 em células T transfectadas sem RNP, 30% em culturas TRAC-B2M- e somente 0,21% em culturas de CTX-965b), sugerindo que as células T expressando CD33 são eliminadas por células T ex- pressando CAR anti-CD33. Adicionalmente, dado que as células T CD4* expressam níveis mais elevados de CD33, elas podem ser mais suscetíveis à morte autorreativa por células T expressando CAR. Esta autorreatividade pode explicar a diminuição observada na percenta- gem de células T CD4* na cultura de células T ao longo do tempo (FIG. 2C). A morte autorreativa pode também funcionar para estimular e ativar células T CAR+, levando à expansão observada de células T CAR+ ao longo do tempo (FIG. 2B). Com base nestes dados, a inter- rupção genética de CD33 na cultura de células T pode prevenir a mor- te autorreativa e permitir a manutenção de razões de CAR-T CD4/CD8 equilibradas. A interrupção genética de CD33 em células T pode ser realizada usando sequências de saRNA, como mostrado embaixo.

[00246] As células T com edição gênica de CTX-965b foram depois expandidas durante duas semanas in vitro para demonstrar que as cé- lulas T com edição gênica poderiam crescer e se expandir comparati- vamente às células de controle (células T TRAC* e células T TRAC IB2M). As células CTX-965b se expandiram —100 vezes, similarmente às células de controle (FIG. 3). Exemplo 2: Capacidades funcionais de células T CAR+ anti-CD33.

[00247] Células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 (por exemplo, cé- lulas T CAR CTX-965b ou células T CAR CTX-970) foram geradas como descrito no Exemplo 1. Populações de células T CAR com edi- ção gênica foram geradas a partir de múltiplos dadores de células T. Populações de células T TOR+ e células T TRAC-/B2M- foram simi- larmente geradas para uso como controles.

[00248] Após preparação das células T editadas por transfecção, a atividade funcional das células T CAR foi verificada usando um ensaio de citotoxicidade baseado em citometria de fluxo. As células T CAR ou células T de controle (células T TOR+ e células T TOR-B2M-) foram cocultivadas com uma linha de células cancerosas expressando CD33. Três diferentes linhas de células derivadas de AML humanas (referidas como as "células alvo") foram testadas: THP-1 (ATCC TIB-202), KG-1 (ATCC CCL-246) ou MV4-11 (ATCC CRL-9591). As células alvo foram marcadas com 5 uM de efluor670 (eBiosciences), lavadas e incubadas em coculturas com as células T CAR CTX-965b (CAR+ TRAC-/B2M- lanti-CD33) ou células T CAR CTX-970 (CAR+ TRAC-/B2M-/anti- CD33) em razões variáveis (de 0,05:1 a 1:1 células T:células alvo). As células alvo foram inoculadas a 50.000 células por poço em uma placa de fundo em U, de 96 poços. A cocultura foi incubada durante a noite. No dia seguinte, os poços foram lavados e o meio foi substituído por 200 uL de meio contendo uma diluição 1:500 de 5 mg/mL de DAPI (Molecular Probes). 25 uL de esférulas CountBright (Life Technologies) foram depois adicionados a cada poço e as culturas de células foram analisadas quanto à viabilidade celular por citometria de fluxo (i.e., cé- lulas viáveis sendo negativas para a coloração com DAPI).

[00249] A percentagem de lise celular das células alvo (por exem- plo, THP-1, KG-1 ou MV4-11) foi depois determinada usando a seguin- te fórmula:

[00250] — Percentagem de lise celular = (1 - ((número total de células alvo em uma amostra de teste) + (número total de células alvo em uma amostra de controle)) X 100; em que uma amostra de teste foi células alvo (por exemplo, células THP-1) cocultivadas com 1) células T CAR CTX-965b; 2) célu- las T CAR CTX-970; 3) células T TRAC*; ou 4) células TTRAC/B2M e uma amostra de controle foi células alvo sozinhas que não haviam sido cocultivadas.

[00251] As células T CAR CTX-965b foram eficazes na morte de células THP-1 (i.e., indução da citotoxicidade) a todas as razões entre células T CTX-965b e células THP-1 que foram testadas (FIG. 5A). As células T CAR CTX-965b foram também eficazes na morte de outras células cancerosas de AML (KG-1 e MV4-11) (FIG. 5C e FIG. 5D). Adicionalmente, um CAR anti-CD33 alternativo, CTX-970, foi também eficaz na morte de todas as linhas de células cancerosas de AML tes- tadas (FIG. 5B - FIG. 5D). Estes dados demonstram que as células T CAR anti-CD33 como descrito aqui induzem potente lise celular de li- nhas de células de AML expressando CD33. Estes resultados são re- produtíveis mesmo quando as populações de células CAR-T alogêni- cas são produzidas a partir de diferentes fontes de dadores (FIG. 5A).

[00252] Ensaio de Liberação de Citocinas. A capacidade funcio- nal de células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 (por exemplo, células T CAR CTX-965b e células T CAR CTX-970) de induzirem a secre- ção/liberação de citocinas na presença de células alvo THP-1, KG-1 ou MV4-11 foi testada em comparação com as células T de controle (por exemplo, células T TOCR* e células T TRAC/B2M'). Para medir a liberação de citocinas, as células T foram cocultivadas com as células alvo durante 24 horas. O meio sobrenadante foi coletado para medição de citocinas IFNy ou IL-2 por ensaios baseados em ELISA (RD Sys- tems) de acordo com as instruções do fabricante (RD Systems). As células T CAR CTX-965b e as células T CAR CTX-970 produziram ní- veis muito mais elevados de IFNy em relação aos controles em res- posta às células THP-1, mesmo a razões baixas entre células T CAR e células alvo (FIG. 6A- FIG. 6D). Estes resultados indicam que a ex- pressão do CAR anti-CD33, introduzido usando o construto de CAR CTX-965b ou CTX-970, confere funções efetoras às células T na pre- sença de células alvo expressando CD33.

[00253] “Dependência de Citocinas. Para determinar se a edição gênica resultou em edição fora do alvo indesejada que poderia gerar células com propriedades adversas, tais como crescimento celular descontrolado, a capacidade das células CAR* TRAC/B2M/anti-CD33 de crescerem na ausência de citocinas e/ou soro foi avaliada. 1x106 células T CAR* TRAC/B2M/anti-CD33 foram plaqueadas no dia O, aproximadamente duas semanas pós-edição gênica. O número de cé- lulas viáveis foi enumerado 7, 14 e 21 dias pós-plaqueamento em meio total, 5% de soro humano sem citocinas (IL-2 e IL-7) ou meio de base carecendo de soro e citocinas. Células T CAR* RAC/B2M/anti-CD33 geradas a partir de 2 dadores foram testadas. Nenhuma expansão ce- lular foi detectada aos 14 ou 21 dias quando plaqueadas nos meios que careciam de citocinas, sugerindo que quaisquer potenciais efeitos fora do alvo devido à edição do genoma não induziram atividade de expansão independente do fator de crescimento às células. As células se expandiram somente na presença de citocinas (meio total que con- tém citocinas) e não se expandiram na presença de soro sozinho, co- mo mostrado na FIG. 6E. Assim, in vivo, não é esperado que as célu- las CAR* TRAC/B2M/anti-CD33 cresçam na ausência de citocina, fa- tor de crescimento ou estimulação de antígeno devido a qualquer edi- ção do genoma fora do alvo.

Exemplo 3: Eficácia de células T CAR+ TRAC-/B2M-/anti-CD33 em um modelo de xenoenxerto de AML em Camundongos NOG.

[00254] —“CRISPR/Cas9 e AAVG6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplo 1) para criar células T humanas que careciam de expressão do TCR e B2M e com expressão concomitante de um cons- truto de CAR visando CD33 (CTX-965b; SEQ ID NO: 56 (ácido nuclei- co); SEQ ID NO: 104 (aminoácido)) que foi inserido no lócus TRAC. Células T ativadas foram em primeiro lugar eletroporadas com 2 com- plexos Cas9:sgRNA RNP distintos, um contendo sagRNAs visando TRAC (SEQ ID NO: 28) e o outro contendo sgRNAs visando B2M (SEQ ID NO: 30). A quebra de fita dupla do DNA no lócus TRAC foi reparada por reparação dirigida por homologia com um modelo de DNA entregue por AAV6 (SEQ ID NO: 55 (codificando CAR anti-CD33 CTX-965b compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104) contendo braços de homologia à esquerda e à direita do ló- cus TRAC flanqueando um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para expressão gênica). As células T modi- ficadas resultantes são células T 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 CAR+ (células T CTX-965b). Tratamento em modelo de tumor pequeno

[00255] A capacidade das células T CAR+ anti-CD33 modificadas (células T 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 CAR+) de melhorarem a doença causada por uma linha de células cancerosas CD33+ foi avali- ada em camundongos NOG usando métodos empregues pela Transla- tional Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Em breve, doze ca- mundongos CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc*º12rg!"'Su9/JicTac), fêmeas de 5-8 semanas de idade foram individualmente alojados em gaiolas de microisolador ventiladas e mantidos sob condições isentas de pató- genos durante 5-7 dias antes do início do estudo. Os camundongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x10º células THP-1, deri- vadas de AML humana/camundongo no flanco posterior direito. Logo que o tamanho tumoral médio alcançasse 25-75 mm? (alvo de -50 mm?º), os camundongos foram adicionalmente divididos em 3 grupos de tratamento como mostrado na Tabela 9. No Dia 1, os grupos de tratamento 2 e 3 receberam uma única dose intravenosa de 200 uL de células T CAR+ anti-CD33 (células T CTX-965b) de acordo com a Tabela 9. Tabela 9. Grupos de tratamento dongo anti-CD33, 2XK KO | dongo anti-CD33, 2XK KO | dongo (5*) *N = 5 para o Grupo 3 em modelo de tumor grande

[00256] O volume tumoral foi medido 3 vezes semanalmente come- çando no dia de início do tratamento. Pelo dia 5, todos os animais tra- tados com células T CAR+ anti-CD33 (Grupos de tratamento 2 e 3) começaram a mostrar uma diminuição no volume tumoral. Pelos dias 6-8, os animais tratados com células T CAR anti-CD33 (Grupos de tra- tamento 2 e 3) demonstraram uma redução significativa no crescimen- to tumoral em comparação com os animais que não foram tratados (Grupo de tratamento 1) (FIG. 7). Estes dados demonstram que as cé- lulas T CAR+ anti-CD33 alogênicas podem reduzir rapidamente e efi- cazmente o crescimento e a expansão de AML CD33+ in vivo. A re- gressão completa dos tumores AML CD33+ devido ao tratamento com células T CAR+ anti-CD33 alogênicas foi alcançada pela e persistiu durante a duração do estudo. Para o grupo 2, todos os camundongos tinham tumores de O mm? ao dia 22, para o grupo 3 seu dia 24. Tratamento em modelo de tumor grande

[00257] A capacidade das células T CAR+ anti-CD33 modificadas (células T 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 CAR+) de reduzirem tumo- res grandes causados por uma linha de células cancerosas CD33+ foi avaliada em camundongos NOG usando métodos empregues pela Translational Drug Development, LLC (Scottsdale, AZ). Em breve, do- ze camundongos fêmeas de 5-8 semanas de idade, CIEA NOG (NOD.Cg-Prkdc*“12rg!"'Su9/JicTac), foram individualmente alojados em gaiolas de microisolador ventiladas e mantidos sob condições isen- tas de patógenos durante 5-7 dias antes do início do estudo. Os ca- mundongos receberam uma inoculação subcutânea de 5x10º células THP-1, derivadas de AML humana/camundongo. Logo que o tamanho tumoral médio alcançou 125-175 mm? (alvo de -150 mm?), os camun-

dongos foram adicionalmente divididos em 3 grupos de tratamento como mostrado na Tabela 9.

[00258] No Dia 1, os grupos de tratamento 2 e 3 receberam uma única dose intravenosa de células T CAR+ anti-CD33 de acordo com a Tabela 9. O volume tumoral foi medido 3 vezes semanalmente come- çando com o dia de início do tratamento. Pelo dia 5, todos os camun- dongos tratados com células T CAR+ anti-CD33 (Grupos de tratamen- to 2 e 3) começaram a mostrar uma diminuição inicial no volume tumo- ral (FIG. 8). Esta redução foi mantida na maioria dos animais receben- do a dose moderada de células CAR-T durante até ao dia 30 do estu- do. O crescimento tumoral foi substancialmente retardado no grupo 3 que recebeu a elevada dose de células T CAR+ anti-CD33. De fato, 2 dos 5 animais que receberam a dose mais elevada de células T CAR anti-CD33 mostraram baixo a nenhum crescimento tumoral a partir da administração de células T CAR+ até ao final do período de observa- ção (dia 73). Especificamente, um animal tinha um baixo volume tumo- ral de 157 mm? no dia 73 e um segundo animal demonstrou uma eli- minação completa do tumor pelo dia 43 que continuou até ao final do período de observação (dia 73). Estes dados demonstram que as célu- las T CAR+ anti-CD33 alogênicas podem inibir ou reduzir significati- vamente o crescimento e a expansão de grandes tumores AML CD33+ in vivo. Exemplo 4: Desenho de gRNAs para edição do gene CD33.

[00259] Este exemplo descreve a edição eficiente do gene CD33 em células T humanas primárias ex vivo usando edição gênica CRISPR/Cas9 para o propósito de eliminar o risco de autorreatividade em células T CAR+ anti-CD33. Os segmentos genômicos do gene CD33 contendo os dois primeiros éxons codificantes de proteínas (éxons 2 e 3) do gene CD33 foram usados como entrada no software de desenho de gRNA. Os gRNAs desejados eram aqueles que intro-

duziriam inserções ou deleções na sequência codificante e deste mo- do produziriam uma mutação fora-da-grelha ou códon de paragem prematura que prejudica a expressão gênica (i.e., dando um alelo fora- da-grelha/perda-de-função que é referido como um "nocaute de CD33"). Dez (10) sequências espaçadoras de gRNA identificadas in Silico visando o gene CD33 foram selecionadas com base em um bai- xo risco previsto de edição gênica fora do alvo (SEQ ID NO: 132-141). Os gRNAs foram sintetizados e especificamente modificados como indicado na Tabela 10. Enquanto os gRNAs na Tabela 10 foram modi- ficados com modificações de fosforotioato de 2 -O-metila podem ser também usados gRNAs não modificados ou gRNAs com outras modi- ficações.

q q q

SE SE SE SE SE SIT SE SE

TT ÇOX DT ESGOTO TR O WO 3 ESTIG IST ST ZSTIasTo STS o To TJ o OD / 002 O = 8 Ti SPT Pr EPT OIL DNIT D375O E 32-83 23-06 30 830830 83083 DIFOOPOPIOoOD320OP HÇZEoZÇçoZ00Z2 DO TIoaZISIoZoÇZ So 3 Es 3 FT 3 3 3 2003003003 00903çq% 3003003090 332332332 3323060 237332 533230890 oO TO 3033 3 5 2 GO 307025 3,53 3 > > > 3 5 >5TDSE 3 DPISWS$S3WSO3U sy s>S O 3H O 323402300 300 30 ã033 SpogpuSsauosras Tororó oo 2868338338325?3529S>?2$52OS 5572552352 <53550352ID5350a355S 3 26Trsra oo soa Da PDR?

E E E 3 rógrógrassoDSbsanDosbnó;z SO DS3< D3O0D329 0700 SDS DSO DTO5SOS BO PooOPoog2Ço< 8 o>y 8 5So08%sSoSsSorg S233258TSOGPO SOS dZS assado 2 << 3353333302 SL THROWFTÃO TÃO > 2 O3SDOFRFSDOFDOFOFoOFdoOosõÕos ACNE SCORES CCAAAS. = = 3 O o o o o Ss ESTE 3 8O38O3G 3 EO <€ 3 6O 3003003 o< 3 9) 3 90 3 DO > Toa 230 as sagçsos OO sReo<a

ORSON SETRDO NOSSOS SD SP 32 0352888 ES gpSSoSSESSO Rania SOS NO TO<XTSDOOTSDOGAOTIA<T GO ço fo o o S o go 8 5 > do 83 3 Ss =s Elo) S S & So E õ 3 > 3 > $s5 35 33 35 33 3 > 322 322 322 22 3 >> 3 22 2 323 82 $23 33 $8 38 38 $ Z os os Ss gs o 3 8 3 o 3 gs < à à à 7a SB 78 SB Pa 8 28 28 28 38 2 238 38 238 8 5 5 Cs &s TS go OS És e SS Ss So SS 38 $$ 8% Ss Ss >? & >? & PDM Som O Cs Go o o SS SS ço so 3 o o 3 o so = 2 0o 2 0o 3 o 320º 35 35 o 20 8 8 >? q ss oo O so o 3 5 = Do Do o DO õ o gs o > DO o Ss Ss Ss Ss õ o Ss ss ss ss Ss o 8 SS $$ 853 $$ Sã Sã 553 83 o 3 3 & 3 3 365 365 3 o 3 3 3 36 36 30 õ 30 > o 3 3 36 3 30 35 36 3 o 3 3 36 36 so FS 5 ss 3 o =? =? > o S&S So Ó > O os < o o fe) [2 fe) 2 6 o 39 409 09 OS s3 os 2 os o ç33 53 583 337 233 03 53 03 "v voo 26 E) <o õ 26 õ 3 o ses os os 3659 O q 2 o q os $ é$8 08 <38 SS 2 DS 35 SS Zz s3S32 23 03 33 ss sã Sã OS ra BO < o os C = = 2 23 > ESISSIZOSZÓIZÇoaP só P ASP e & çS Ss Ss & 8 o <F3I3FSSGFÍSO POL SSD SSD SHIT COS ros O rOosro3saro2asro3232roo 2837 0STosSTesTSarostosas-os o DO <LDO DO DO SOLTO Ss O > ES s286Z098ZSSZGIZ 23293258 23288 e << SA Çiõadêa &oo0 3008 3 O<8 sz = DP= $$ 2 os oa oa > o $$ PO Po Po PO g>ypigÇosgoos 2 SFT ICnSaOoSmESmo São sãos > 0 O SÃO 36Ã< 390 3ÀÕ2 ÃO çvÁnLd unos & 8/2 5 T< 5 O 5 O 8 2O 6 S< 6 <O é 2O & oa Ss =.

SST Y 2 T S E w o vT 38288 o o o o o o o O FES o o o o o co co <2 ooo o o o Q o o o É zo o o o o o o o

E CS o 233298 F 33828 Tc STS.

Ss 535 8360 Z2S TZ GZ n38n38o 032303280 US 3|S3W 2o pLo ge > 258283? D/35 25Z92>S 523358935 2288538 FS SO8S o 30 336353 = DO 3 DS 2 > Boss s3S0TAS<TS e 8Oo38838 E Pá 2 60ÇORoS 235088 3 $<S3OSS ON SDO ToO<TOD E o do fofo 33 32 = = o 38 $ O o qs-TBEBeOcFcosso 23 EF SRTSSFSESSE 2 o 2 o ITISSSSOSSS CF > 2 5/68 oo ss 8 C2Z 2222222 SS SS aeapazezenaa 3 5 o o oo o ooo 28 ES ZERDoEsEa $$ DS nn a eLÁLTLCAL 3583 35 XZSOCOSCOSSTS 3 6 36 oo oO O OO 33 38 880 od çoo 8% 88 Zoo ge 3: 8. ERPOSSSSOS ”v oO8 35 FÉ < O SORO 3 3% << ecEetocork 2 238 538 s SG X<oorarsó Ss os 55 = 20 Soo Bv 538 065 < E ES es o 3 E É oO<ogZgo<orHkHOo Eds aaE ; EPOGOBERZGE ST STE T ã docldodeocos <Cosdasosao % o<ssNrTassos sZ0S5Z$SZ E ESSELOSBSS sícesosão É OSSO ONTRS E oORSooSa, dt Gesdeçeoso SE N<SÍUOSTN2ST oOoOoLZocosgo<o gnoZToTCT<AGIZg0 FX O0O0O0<O0O0OO0O<L o no o o e o e? o S 2 = S = jo o [FT $ [9 É É É = & = oÓ oÓ 3 e qo > o o & E. ecc OO o O Q o o S0O0AOOAOOAAAAPAAAAÇS Ó e) e) nn 2 0 0000000000 38

[00261] As células T humanas primárias foram transfectadas (ele- troporadas) com uma partícula de ribonucleoproteína (RNP) contendo nuclease Cas9 e um sgRNA modificado sintético visando o gene CD33 (sequências na Tabela 10) ou controles (sem Cas9, sem gRNA). Qua- tro a seis (4-6) dias pós-transfecção, as células foram processadas por citometria de fluxo (anticorpo primário: anticorpo anti-CD33 humano, t de cat da Biolegend 366608) para avaliar os níveis de expressão de CD33 à superfície celular. Para uma porção dos gRNAs testados, qua- se todas as células T tiveram perda de expressão de CD33 de superfí- cie indicativa de interrupção gênica (i.e., CD33-negativo) (por exemplo, CTX33-2, CTX33-5 e CTX33-10 como mostrado na FIG. 9).

[00262] Três (3) gRNAs foram adicionalmente testados por análise TIDE, como indicado na Tabela 11. Destes, dois (2) gRNAs alcança- ram edição de elevada eficiência, com frequências de edição acima de 97%.

ovo à |ôE 3 o 7 & É E E? o 20º E 27 2 28 o ã SE o. 8 3 à e ERABSSRNSSNNNNN NAS o < o o o co o bo N o oO o o wWw 8 o o o oo co co Sa co co o o x a às õ 6 E o º SE o us ts so 8 2º o 27 o 2 o a 8º Ss o o no s 83 « — o 2 FRANSSRN SN NN NR E x bl N o = co o o = N co o US) co o W o o co oÓo o co o o

A O Ss E 3 < Re o eo 2 . Nm N Nm ú o o o o e 8 «o o lo o 38 |8 | 2 gs 8 2/8 8 3 18 8 o 3 /5 |S |3 323 O |<€< 6 |3S |S FS 3 15 | 535 |< [O |S3 [Q |53 o |S oo o jo 13 [98 2 O jo |3 | 8 $ & 12 | ó jo 5 12 | 3 3 so 3 | o 23 | $ S&S | ô jo |5 & s>sS<coad 5eS Do > <3 38/88 OB <S oS SR ST SR R 8 OTrigriorior|jorioriworiorior - 8 n| 5 So SS sos Sol ao So ao So 80/25 — o 38 << o2/ 584/02 <2|/52 02/02/02 02 2 & IDE SP 2222/88/92 38 SRS 2/I88 < o| E GoSolscoo Lolgol&ol&8al&gol8o 2 o & ou au gu on Su gu Qu Su Su 6" o E | yu SL <2jo0L2/02/02/<L 02 /0L2/0L2/<2 o. 8 = e 8 s/a lo | T/ s/l lo rw la o]? o O o o o o o o o o o o o co co co co co co co co co co Q2 = O O O O O O O O O O 2 O o/ol/o0o/0o/0/0|/0|/0| o =

[00263] As experiências iniciais foram levadas a cabo usando o guia exibindo a % de indel e a % de silenciamento mais elevadas da expressão de proteína. Análise de perfis fora do alvo e no alvo em células T.

[00264] Uma avaliação dependente da homologia dos gRNAs de CD33 da Tabela 12 mostrou que CD33-2 (SEQ ID NO: 165) tinha uma frequência média de indel no alvo de 88% e nenhuns locais fora do alvo com uma frequência de indel maior do que 0,2%. Em contraste, outros gRNAs de CD33 com elevada frequência média de indel no al- vo maior do que 90% (por exemplo, CD33-5, CD33-8 e CD33-10) pro- duziram numerosas indels fora do alvo >1% e foram despriorizados. À análise foi completada com captura híbrida combinada com sequenci- amento de próxima geração, a partir do gene de células T editado com cada uma das dez guias listadas na Tabela 12. Duas populações de células de células editadas foram geradas a partir de duas células T dadores diferentes (denominadas 1 e 2) e usadas para este ensaio. Os dados fora do alvo guiaram a seleção deste gRNA de CD33 particular (CD33-2) para análise adicional. Tabela 12. Resultados de eficiência de edição genômica no alvo de CD33 e edição fora do alvo em células T com edição gênica.

Guia Edição média Sumário de fora do alvo no alvo (%) ? CD33-1 48,2 Um 4% fora do alvo, um < 1% fora do alvo CD33-2 88 Sem fora do alvo identificados CD33-3 64,3 Um < 1% fora do alvo CD33-4 29 Dois < 1% fora do alvo CD33-5 91,4 Dois 70% fora do alvo, um < 1% fora do alvo CD33-6 48,6 Um < 1% fora do alvo CD33-7 25 Um 2% fora do alvo CD33-8 93,9 Três 1-2% fora do alvo, seis < 1% fora do alvo CD33-9 64 Um 2% fora do alvo CD33-10 /92,8 Dois > 40% fora do alvo, quatro 1-10% fora do alvo, cinco < 1% fora do alvo ? Média ao longo dos dadores 1 e 2.

Análise de perfis de indel no alvo em células T.

[00265] Os dados usados para quantificar a edição fora do alvo fo- ram também usados para quantificar e resumir as indels no alvo mais frequentes para todos os guias de CD33 listados na Tabela 12. Estes dados foram gerados a partir da captura híbrida do lócus CD33 combi- nada com sequenciamento de próxima geração em dois dadores (de- nominados 1 e 2).

[00266] Após edição gênica, a análise de captura híbrida do lócus CD33 em uma população de células T após edição gênica CRISPR/Cas9 para produzir células T CD33' resulta em frequências de indel específi- cas e sequências de genes editados no lócus CD33 (Tabelas 13-22; deleções como traços e inserções a negrito).

[00267] Para os propósitos de quantificação de sequências indivi- duais a partir de dados da captura híbrida, leituras de sequências se alinhando ao longo do local no alvo CD33, 20 pb a montante e a jusan- te do local de corte, foram selecionadas e consideradas para a quanti- ficação de sequências de indel. A partir das leituras selecionadas, a sequência dentro de 10 pb a montante e a jusante de cada local de corte putativo (-3 pb a montante do PAM (Jinek, et al., Science 2012) foi quantificada como uma região representativa da edição por união de extremidades não homólogas (NHEJ) no alvo. Os dados sobre es- tas sequências com edição gênica no alvo são apresentados nas tabe- las embaixo, com as frequências destas sequências representando a percentagem de todas as sequências abrangendo o local no alvo den- tro de 20 pb a montante e a jusante de cada local de corte. As indels para cada guia são mostradas em relação a uma sequência de refe- rência no alvo nas Tabelas 13-22. A sequência de referência é centra- da no local de clivagem com 10 pb em qualquer direção, terminando 4 pb 3” do PAM.

Fr go S o E = = o MmMiNIN = as L 3 SS = NS So o E o Ss õ o o co v Ts - = Nm O TT nomNnNTAnAN= gg 8 o SS QN NNE ZE Err g 3 & E ”v a w Ss E S 2 => ts x Tm OT NO oe E “Oo 7 OE SS QN QN QN = 8% ê E o & T oO E 5 E Ss so 2 FS o e o aah 8 o nos S 6 NaN NS Tra IO o o 2 E 2 Co "o o e x o O O o > O 3 > GC E o É E o R o E O 3 Oo É = s O > - qT 2 E o o " < o O E S 2 5) É ár 54$ Sã Ss 2 õ Õ E Õ E o o r & & é à 8 BEE à F S É É É É o & o fe > 4 $ go $ SEER O 1 2 S o SO 8 o o oÕ -r O << OrFrooo E o SD O 8 E o O o 8 E = a o To = o o Oo co co 3 N O o vB 8 8 2 2 2E|Se o >?

S on E un > gs S Dê S E cs E Ss O Wo o on "o = $ £ = o > " q o 8 dd. = 8 o O o & au 8 O 8 o Ss v 688 o 8 E E A x E -Z 5016 o FE dg O Toto 8 o 8 8 SR o TS IE EZ GP E O 0 O o SO A QÁ dever o 12 0 00b 26 SS SEO o Oo EK SO OO0OEÉE LX SS O 26565 Oo Ooo K o 2 o S$o6o8EkE 5 PR E Oo: o PoE 8 e 2 $o3CO o o Rr OF: ES oO SS TT EÊõ GT RO ore 2 = Es Toa e igor E dd 2 o ES >? 270 /Õ0/ 0 7 PISO OS OOo o o 8 j À E A í = o O > £S86$ OO Pio or io 1 0 Q o

E SOS SRFE E PIB E IE PE É S O E goes a a ii << ia PD a: : & 2 68 O O ii 060100 OS õ os ço 28 0/0 1 0/0 1 00 1 0/6 q o Tso S 2 o Sos 3 6 o 2 T 3 o o E e o t Ooo = O 3.2 SC oo =| = E Seje 209 ço? F oo e OE

Fr go 8 o = o o == aum << E) valo Ss So Ss '8 o Ss õ o o So > FS SgN Ne a Z e. õ SE PN arerE-g E ke) QE S Ss GE ”" a 2 > E 8 E? vs 2 = o o ox = OA ja o an à Rg 2 PL ShAÁNQZS- O o o O ê - Ss oO E 5 E Ss o BF NNW Ee = atada 8 É e a dels À e == == 8 SÔ o º E o "o o 3 o 9 o 3 > <= Pp eso o E S o o 8 > É S S o É Ee Ss g E 8 2 õ 2 — Z 2 o Ee sc fo) 2 É E o o o Zz | O o 3 (e) o o Hr O > o = Ss o Oo Epoeo2 1 o e < & O Sã & ro o E Ss E S Er ESSES s o 8 E 88 EEB E o O o FÍIRO 6 EP << O o

E E ES 9 o $ 8 a e Fe o SG 8 o o 2 8 S - = = S E cs 2 o o E 8 Pv qo = O) <£ vo & E) O o o 8 = o 2 a 8 8 o 3 8 8 g É É 2a 2 à DE ES É o 5 3 5 w O Toiros 9 E o RO CB o = S 8 DO O o OS co w SO o EK O K & O AnQÁ doer tê E ódio o o E = . 2 É 8 o < E < S O $58E5 0 Oo E & É oO ÇçgzZ 4% o so sad O 2 OO fora) O e es Sor E É E Do É CC o S&S gi SETE SO 1 Tt oco oÃio ice os = O 1 oO 71á1O = s OT SEZÇSE 1 E E j Ei Es 8 o o 268 SE << << 1a So S 2 3 368 E 0 O O O | 1 0O 1 e 28ê & SEE E EE: EE 15 Ss: cc ag 2 8 88/00 O 0 0 1000 ils o FC o Ls< <d d <<< <K </ O q o = Ss. & OOo e ES DES Ss S 86 o E s Nm O O So = ao ss eoçs 2 Soo 2 | 8 | 82 2 2? PO ÇE EB F o e OE

Fr go S o E Ss w < = o mars ma OS O 3 o o oobDOoOoONO O O o zº v Ts - o So E o x 2 je e x aa W - E = NS a EE EEE & E = Ss E É o 3 S 5 = S a õ SN [57 2 É we) o 1 e e a «o q O Ss f=) SS NaN E Es EE &G SS oO E " ms sq so 2 E GG o Ft T So FE o 2 E 8 o É S o m = ee sv 8 o o 2 Ss Na Esse LL 6 o o o > Oo 3 > ús < =

EE IS o 3 2 e o o > É E É É & S $ << 855 2 & E O O DS « Ss Z = E E e > D o o oo > | - << o o o o Ss o Oo O Oo To o O e E < OO O &D Ss EgS õ O E o & e õ o O O o 2 ÉS É E 8 E o z 3 < O oo õ E É o FIGO E OO << e T Oo 8 - > PR on E ss S < XZ E Ss 2 OE r oo o

O O $ SS 8 > O) "" w o o | o O o o õ vs o ce

BO 8 53 $2 do o É É LA ; de ES E < 22E E 2 O ET ÇEr o ES o e O TS ósãsid5 É 2oF O OT o Emas É E << 2089HE ES o a BRagêsEe orcs ó|E & osS5$Sg dg o o0HBFESE SS E 6 o 263% FER SÓS" oôE S sr g8ES oo 8 ig TITEOÍS o e soe $ o o 8EL << PI< O <<<) < 2 QE 2 OS 8EZo 38 GESSO ST 8o o 9 8 8$8$ 3 SO GO 1000 o = o 23 $$ 8 O O O O i60/ 006 o oe o & 2 5 3 FS O 0 0 O 1 00060 O E > OQ o o FT E E RE RE dE RR E q Es ; ag 2 8d O 0 O 00000: os o 6 SF ço2s8 << << << << << < 6 5 eo = S&S. w 3 E e 2 8 Sos 2065 ge NO So a oO 2 8 DO & oê 3 8 8 85 S8SES $ O go rr oO mo Tm Tm | QN QN AQ Nã dE

- g - 8 dB —= o — 3 Nie a a NaN TA BZ o NS QN sv s oc0o0ro Ç& Oo õ BR O o 72 o ? Na a e nana 9 e o õ NS NaN ZE EEE sã E Ss SE ke E É ao o E 2. o o É e TN o TE o o TFT SO mM NE == -.— 8 E O S = $ O E É & 2 E o = ão o õ $ oo 2 É NT Ns = ala NT aZ= go” E o TF TO rr ro orr=E sec o dêéo & E 2 3 sES KG 8 $ 3 e S < g Se s Ss 3 õ õ x É 5 g |) É BÃS = õ < < < 3. Ss [=) E | | w o E o Z = << << < 3 SO o o As É É É É É 7$ o o o) & SÉ SÉ < e So o U Ss o o o o D'W o ns) O < o < | & =s DS < O O oo < OO E 8:s vv KH Ó FL O < LO FEL < v o o o o o

E TE 8 O E o56 o O o n o 8 EO 8 SS S S S ES 8 3 So <s HE S 3 E o É 2 > & «o => < = sv 8 > FF E T Seo o 8.8 & Sa E o o so K K 8 oo v .ÍBEiZOo 2 $ 55 2822 = E L2S õ o $$ Sd908xx S 3 5S5E O rx 8 5H 8/80 woe T- SS ERRO oo CG << 2 OH ÇGO o — A À ego dó ooo EA Sóda8 2 8/8 S58SSASHESS o o 808 O So HE < E < Or & o e sc c 288 < O SH ocE<E< Ekos o gs o TETE O 8 a O <F< OX o 3 BSB 1 Rr 1 Õ o TS PTE ES E | TE r ERESEES O o O 5&88$SES ii 1) ig <<r << 8 = O q Sgy O ij PO PISO jd 0 2, OA e E FRIO io 16/60 60 1 600 2Qu - 9 2o8R8 0 ii Odo 0001/00 . & E EA <a ii << <<< << o LN Tue 2 - Ss 8 Ss És o = > Oo 2 E & 23 .e Tr am TO Lo NnNQ OO < 2 = Se ereerôg S&S Er 6º qe Oo a aNaNaN a NNO SS E

E] 2 o à = na. a =. mia An e Qo o rr So o oo CO o o Ss o o 2 o oo eo xa Ron o = - 6 6 FO QNNQNaN WEZ erE =) = = a - o É gx A A O ooomoaNanorona Q TIN NS TN SNS SNS NNE = = = - " 8 co S o e NA q mao = TN Q - [e] FT OS JN NE ES res —- Ss us q Ss » é < 38 8 à ê 2 ê à o o o < << o O oO O O OoH s < O < o Oo o o o) < < O o << O us Ss E E O OE < O O 6o0oo o Ss o o E < oo < < << O " => < O o E << o E ROO o o O < O OK E O 0 0E 4 8 Ó FX O 0/0FO Fr O 00000 <

O | < o se To 2 QN SN aa 5 s o o. É < —

O X K| = o oO q. 8 oO o oO Ss ss fo) 2 o oO ;: RE ES oO o Eos O &O 2 8-2 OX o o Ooá oO 3 ERaS, o 3, ,3goeócido, FSEErere Sr SE SESCECSCSCRCECSCAcCScEn So o $s5$5 o 2 2 QoS ERhTOS | o 8 os SESI BIBE ISSA) s 2 8586 << 0 1 <çoóooogr ii) o. EST << ii O E O0O2Co00o0oroobo :i DES V.8 6 ii < SG <EK<< << o<<< o 2 8853 1/0 0 ii o0HOS000TBo06006 2 88 8 ii E E | E QERERER IEEE | ST TST ii OQ OQ ivivovuoilvoo : o oc v8 ii << << ii <a iK<<KE<K<E<E<KELK<) < we ec o 88 1 / 0/0 i0i600o0SdUoOo o & eo 2 ie REP IPPRERPREPRRFR| FE o e E = QN OO E on Sor qamn gs NS A SS OÂO QN QD ÔÂOÔÊN a as o

Es o we << & = 2 nm Ç o oO PD PL ÇX Ts

SS W - aa E & E see = Ss 27 E q os = o o

E E q GS & 2 E Nems = Ss 8 o SF rSrF = Es o as É Z Po T 5 o õ 3 > É co | N = à = Tr o SS o 3 É = . > Rg S o q É BR ES Nos < o 2 O o be 2 8 2 8 o o 8 o 2 = Ss << O0O o o o SS OOor o Wu s E € O 2 g8R8óE: e Z 2 o<Szr 8 E O) é EESSPSÓGCO Ss

O Õ < E o sd o 2 e 883 q > | ae = << < OE & 5 o O| o Do g = TT o do) ZE ex sl... 23 <| 5 8 oO o 18 E 2O8%0o sc O HH ss go O29o ww O CEC CSCECSCAS 8 ES o 24º $çgpS65S à E o O o = segs 2O0om5 < E < Ss S&S Ss OS <a oO Ç o $ TST io < 2 o 208 Edo 2º EX o So SE õorÉ 0 o OL 2&€ FEZ O0O0O1Oo << 2 qo E Suissa! | 1585 > $$ 28K KKK 1 2 o CE FIO 0o0Oo 1 e > 2 o TE << << < q e o 88600600 õ.8 o a O 2DSEREF F/'6 geo ê $ ESB Ss 20 GS z DT 3 0 õ 3885 86 TS o Na a a Ns 8 E

" o S 2 o e 1 Je [1 1 st oO ao NT O E Or orooo oo oDoOoom;ÇH o e o Ss o r > nn = ANA ana Z E Ss TENS E SEE srs ee o 3 E S&S s = õv o 8 = 95 = O $ 2 2 = - 8 & o 8 SG Nao aQaNONQENN meaNçQg 8 gv [=] FS No NNE SE Er Ee ss = E E & o E & = - S 8 3 ê É Mw S [O Ooh oro orar a Ss AÉ SE€dNSNESSSeEF Sc S- Ss 8 9 E o o & Oo 2 8 o Sm E 2 < < Oo E E o o o << Ss S ú R RR oe 3 o Z So o o ES > s S&S o Oo o o SIS: ús 2 O OO o o 5 S NS se oO SE EO o EEE og o o 52 a E O E o Es. e SS & 5 52 25 ó 22 5 S a e 8a E E Sá FSESES o 2 & OO Oo o 000 5 E o Ss Cort BgHO S$ Boot OE & Ss 2 EF FERFSOSFE o oo HS o o a $$ 35220008, 0resee 8 o = o ood<Fraorrrá<g<a< og 88 S. 8 2. 8 á = o AN ow) mor aE O o Ú o + o o o oo o o Oo E = a aa ana a aaa SIS & 8 o os =) 8 Sl o õ ES 8 oo & Ss TH 2 Z sc O| E O op « — S a o - 85 > 7 = E o E 8 Ei o S Õ 8 r Hr 8 52) 6 o 8 <lSs Ss o Oo g O OS zo e sa 2 2 S18 ) 120 2 - 2egêSBdbo 5óo5 | 308 E E SS SE OOo O E A So o 5<NHr<OFr o < E <£HO E = 5 < 1/7 008 oo ES S sos Bois i <oBFOo5sZGaEE a. 2 9 : rFORFOQOO H o es IS E35i OC iooTteólitsio 8 2 e O 8 do Lo Í i PO: io 3 nsiés 35/53 3 5 553 /8& goTissicoi o iodo 1 icoieS Xu 2 oecASiIODOio LOQOii1iQqo1E ss nNLE<<A< IL <aLLL ii <<< o O o So. s oO 7 o [2 Ss os o Zz vT O 5 > x à o IRS N o Oo = ao gg o CO o Sã as Iãs QRRÃ O o Fr o = o

Fr . Wo 8 õ o E : ga 3 8 Ss Nro & & 3 o = o o. - Ss o o o Ss 8 = s = Ss E 3 é Fer sê

S GE ”" a 2 = N E = 2 =) q E . o o o o o e É e = a nm Ç O Ss f=) Ss Tv SS GF. oO E = 2. Ss E o 3 - 2 a õ o o 2 E E Zoom NINO o à SN e = 25 o SS o > oO 3 > = E > o S 2 E, o o 3 É £ s o” S Ss So 6 ES E 65 2 as & ô à 8 8Ê; > = o É Ko so 8 gd E sã8 8328 & LL && 8 o SE " oO z E E E 8 E 6 & 8% 228 se Es 8 3 8 g8 (7) = > O S 8 9 Ss Ee o à 8 = S o & 85 « $ | 3 eg W= O| E 8 & o = o S T ls» o E o O o O v o8s K E O e N ds o o ww O FT Sirês K õ Pv o ” Su 82X O OO SOS Aa Bt oh E É = A s2sçE o o 65 E << SO 2e6353 0 EK O o Z 8 o a $Osger O 4 o E & E o o 2 E O oO Õõ ' o sc E 8530 E 9 1 oo SS o eo E 8 1 25 ii 2 QE

FESSSSESCENSTERCESIS LEA o O SS SSB O TT O | o o & SEE SEE | É j Éés>e o o TOSBO | O ii ww OS O c OQ Ee í H = o S&S SH LSLE< ii 4 iG qQe TOS 6 2 9 2 É, 2 SG o EF TT; e o o 2.2 o uo 3 8 DO = Sa 82 &&& d%$%

F : n 3 E oa o 2 TT ajeia GS Ss [=] o = =- oO SO oSO0 Soo o E) o Ss o Ss N 2 ei o DN o O = on 8 = O IN TT SN SN dNdN QN E TZ = 3 E

S 3 ? E É Ee o o = a = = amalkblN o qn =) o O o No OS NaN Neres a o = Ss s E " o 8 o ir S o o mm TA NT mlaNn = 8 o No co o OS NaN NS NNE = = E - o o P : 8 o S F O o o É oO 5 5 É 3 Ô 8 8 & à E SS 2 S s o < << s O e o O O 6 o 2 2 E E E É É & à ã 8) 28) oeR: o - = õ õ EEE E o o o o S É É 0 0/0 /0 HE << So Hm o 0 0 6 rá dá << á 0 0/6 6 E e

E e 8 5 EK = Oo a O O co (O co co o | a NaN a a O 7 S E 4 o O S sc O Ss o | 3 => < E z O 2 o | T o 9 o - o <|.. 8 5 - " v Sl 8 O o o BEBE 5 <| 8 5 5 O 95 8 So 2 o = SEE E 8 co Io Sms 9d oo o O 5 E5 T- 8 E WEZ oçB8 6 E 5 EE OI5 AABB eRGQENSHEO o 8 o 12808 & oO $$ 5885 SNES E o PB ó PO 3 eso EEOS Ti SH 8885 sc 28 Essa 5RER 68 8 & 1 Io $$ gs is ó1a5 59 OT 8ERiRP ig O PER E|ÉE 8 SESI Rd de TRE XE gor SEEREEH PGE EE E : 2 88500 o0oo eo oo Ss 8 1580 e E <<< <<< Pr Kg Kg << á QN oO. co 3 2 os > = 2 E BEE RE É RERIE ro”o Na Na ao a NaN OQNJAN a

: go 83 cc ae ç3 oo ss Ss SÊ < o o o s o o 3 lal= 2 2 o = sv eso Ss o s SE & QE q E = Ss õ TS o 2 o

S A NB E RX o = SS 6:

E FS Es wo - nào Oo à io 8 o E o = NRO O o Toe E O É - Oo 3 o S 3 > ã 8 E Ee R So 3 O > E = ” O o & o K ES o a [=] g o 2 Õõ Ss O o O Z s 6 o 2 o 8 < spo o ç go E TO m o O <£< O E mw 2 o KH o o E 83º : 8 Pd — E o E mqwõ z s 8 o pZ NS > E O Ss SS e 8 2 8 o E À 8 * O Ê 2. < = w o o X O co SS Z 2 <.. 8 o O 58 Ss É O FEZ o 6 8 O o Emo EB Seen 20 os S SS E O o E <t gy É 2 DE E O o3Z SOS o ' Õ o $S o 82 sc er Q FE XX o 2 8 5 0 0 989 oE oO e q E << ii | Cc ve. O ir ÇFw2o EK | ! O E ss Ss i i > 66 8 0TO i 1 o Oo WO vw. osgE | << O > O 2 gEEPQ ig Ss e SE < ii < 65 õ o e Ss e 8 o SS à 58 & 283% Ss NR dE

Fr go o = Ss & << 3 2 Naa] mara = ex OL 3 riroio SC oOoDdDOSOodoOd0 0 oO o o o o xe N - = a E o e e en N e NO õ IF ESSQÂNQNE TZ == SW ES ke) QE S = GE é E 3 qa Ó : Ss Ú E ao o 7 o S & SN o x oe o 2 à SPSoSNNE E sZr rs wo o E E se sc o T o E rr " SC e 2 8 N jo o S S NE AE Ao eee E E o PE sSSNdsar ros 68 ê s o 2 5 3 > % E 7 o 8 3 e Ss Ss) ã 5 o es 8 S 3 Pk E o E E õ 7 O OK OE oo o o O KH On 2 o á o > e BE5 ses 8 o) & oe OB Soro o o 3 ELG oOE; ES E = o > o S o o o O 0 0HKOO OO E o 5 o FFrFoOODOOFErFEFr Og E E Ss o 8 o > E O) o oo no E q o E) O SO o $ S&S > E o Õ aa a Na = 5 8 6 E E KH Fo o o O) g v qo E) E E = 8 > o = 8 & & = 2 ss o 8; - o 8 v 8-5 E RO [ão x FE? PEGHS OEHOE wow O TFT os s5E o E E vo o TESE PORE FhEFEoG PISO Most gieHaoo OROBESEIE < & O S$SE35 5 PO FEESOSSN OSS S SOFT LOoÇOK O SGHEHSGRIIO o CS eso rHOO BO iiPóio E o é& S5roeSspr Il ESEROE EQ O 8 8 e 7 Elo o o or o6 io eo E 2 oOoTPEiEgoaPirciooPPe1iPiBT Bo 8 o S£E8P << Die <E<a<<< o o 2 3 3S$ FE OO ii SS 0 000 2 28 LC 3 28 OOo io 0 0 0 606 2 2 .- 2 e 6 8d O00Oo 11 O 0 0/0 0/0 0 O 5 =. nn 28 000 ióobp0o0oo0o006 q, QN SE S O o sv? o 2 2 eo. 2S o E O N o DS TN 3 2 > SC oo NÃ ás NAN da NO oe F o e OA .E

Fr . o 3 o O Neo = o mN= o Ss ob e vSSSSSr- Sos 3 o o o ” Ss PS o o o 2 O O mm a A o o o ooo Tm =| = ETNN GS SS dS de ZE EE EEE

S ? Fo x g S a õ 2 É SEUS = A Na a ON jo jo ja ie It ja jo do Ss o Fo ow SSNdde NE ZE E = o E o = o & E 3 S NOEL a A Nm al jo o e e A a jo o o o TS |N NY OS NS NNE Ne = o 2 & o 5 e O s a O S a Ss - É o [XX v o o 3 = 5 E: O O Ss 2 O O o e 2 8 & É É Õ > o o < < < E o = Õ Õ Õ O E o o Ss o E E o E o < & E 3 Seg 8 8 2 5) 8 8B & gls O o > > < õ > < O 3 E = E O < O E O O o o o o E OK o oO EE E < o o < r< ro o < oo o o o É S | = 2 8 2 o o o o Es] o c Pp . e < £ = O) " > E = & e a É 8 - Hr o 3 sdF o - o - 3 si E 3 $5 5/8 8 5 RT ÇE5sSR5O SS SSC85 ã ” Aa Be ess óRGoRPRO 8 oo 6 Oo Lô Ss 6 oo OO o E 5 O O K oO sos TaswooBgeasEçeoB8 or o o So SSHFGoESOBOBSGEBRO ES Ss sc e 8eEoS8BOoO<<E< TO PB<BK < 18 O O o” 2006009000 r oO O IS 3 Omo ae Ii ERORRE TA EE jo E dg > o E 83 i€<OOÓ60O6ibóO/io lo oi | o O 5S5S&£8S8S 8 1 rTOoO TOO 1 0001O O Oi = DS Sri EE EEE LE EE LE gqoFoo i Í Í << icms 2 8 08228 Í 2 Qn&SS 7: Sos o = o E SsEFaNaASBSES O NOSSO = a 6 o6õô Ss ooo o SS Or = = rr oO O OM &O O O O O O O O O oo oo

E o oo e = o Soo oo GG <<

O A õ o 2 o Co o E no Ng E Te SS & E Ss = S E & Ss Es - 8 3 o S = [O as je = e ja = [=] sv ersrreor-=-sSE [NT E o É = wo " & 2 S = o S oo =x TT OCO O o == =. rSSr o o > ]3 << >< < CT o QD 353 E o = 8 <<) HT Ss a ã 5 o & w K EK E "O ã sv o o SsoÇç e &s 8 O O SO o fo) k Õ Hogan. 35 Zz o É o O EE o s o o < O <E< o o = Õõ oO O O080doOoQ;/ ga & 8, 5558588 E Ss Õ o Soboroe * 2 8 E OHOOHRKE<FE GR E Hr > EXE EO Õ 85 Oo o SP IS ER KH õ < oÕ O EO F o ES õ o o o o E É Sê O Ss SS INN EÉ E O| o OM MO MM O E O| o O 4 é "vo S É 2 = = o

T Õ 8 a ox E 8 o ao o 8 Ee | E O si o HO - ww O CNCCANCAS 2 < o vo Eme s SS5S - SB po 2 eg E O04<o Sg|, E< 2 83 e EK OHKHRNOro: o >Z 8 o O FETO HKHOiEr" Re oO o Sos RT <?O o 181 ú% 4 = eso io io ir io ok 88 Elcio is iss ce E ETIiBogsi Ri So > 1 Po 1 SS ig L Rg | e se eFasissais Si sã; se: < Í i65 à Ss 2. õ & OOo 3 2$ z DT 3 o s O gbo O = o Hmm no ER e AE

Exemplo 5. Estabilização da expressão de CAR e populações de células CD4/CD8 com nocaute de CD33.

[00268] Este exemplo descreve o efeito benéfico surpreendente da edição do gene CD33 em células T humanas primárias ex vivo usando edição gênica CRISPR/Cas9. CRISPR/Cas9 e AAV6 foram usados como acima (ver, por exemplo, Exemplos 1-3) para criar células T hu- manas que careciam de expressão do TCR, B2M e CD33 com expres- são concomitante a partir do lócus TRAC usando um construto de CAR visando CD33.

[00269] Células T ativadas foram em primeiro lugar eletroporadas com 3 complexos Cas9:sgRNA RNP distintos, um contendo saRNAs visando o lócus TRAC (SEQ ID NO: 28), o segundo contendo saRNAs visando o lócus B2M (SEQ ID NO: 30) e o terceiro contendo os sgR- NAs visando CD33 (CD33-10: SEQ ID NO: 151). A quebra de fita du- pla do DNA no lócus TRAC foi reparada por reparação dirigida por homologia com um modelo de DNA entregue por AAVG6 (por exemplo, SEQ ID NOS: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118) (codificando um CAR anti-CD33 compreendendo a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 111, 114, 117, 120). O construto de CAR anti-CD33 era compreendido por braços de homologia à direita e à esquerda correspondendo ao lócus TRAC que flanqueava um cassete de receptor de antígeno quimérico (-/+ elementos reguladores para expressão gênica). As células T modi- ficadas resultantes são células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-), anti- CD33 CAR+. As células T CAR 3X KO anti-CD33 foram comparadas com as células T CAR 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 geradas como descrito acima.

[00270] A expressão do CAR anti-CD33 e as populações de células CDA4/CD8 foram avaliadas como descrito no Exemplo 2.

[00271] Como descrito no Exemplo 1, células T editadas TRAC-

IB2M-/CAR+ (2X KO, CAR+) demonstraram um aumento na percenta- gem de células que eram CAR+ ao longo do tempo (FIG. 2B). Para avaliar se o nocaute de CD33 estabilizaria a população de células T CAR+, as células T foram editadas com seis construtos de CAR dife- rentes (CTX-981, CTX-981b, CTX-982, CTX-982b, CTX-970, CTX- 965b) e avaliadas quanto à capacidade de CD33 KO de estabilizar a expressão de CAR. A FIG. 10 mostra que a percentagem de células positivas para a expressão de CAR aumentou entre 7 e 14 dias para células T que foram editadas com 2X KO (TRAC-/B2M-) e CAR anti- CD33. No entanto, para células T que foram editadas com 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-) e CAR anti-CD33, nenhum tal aumento na per- centagem de células expressando CAR foi observado entre 7 e 14 di- as.

[00272] O estudo foi repetido com células T CAR anti-CD33 gera- das a partir de 3 dadores de células T primárias diferentes. As células T CAR 2X KO, anti-CD33 (CTX-965b, CTX-970 e CTX-982b) mostra- ram novamente um aumento na proporção de células que são CAR+ entre 7 dias e 14 dias o que não foi observado em células T 3X KO, anti-CD33 CAR+ (TRAC-/B2M-/CD33-/CAR+) (FIG. 11). Ao invés, as células T 3KO CAR+ mantiveram um nível similar de células expres- sando CAR aos 7 e 14 dias.

[00273] Estes resultados demonstram que o nocaute do gene CD33 em células T editadas para expressar um CAR anti-CD33 previne a expansão da porção de células editadas que são CAR+. Esta estabili- zação de células expressando CAR na população de células T edita- das permite a geração de um produto reprodutível de células T CAR. A proporção de células T CD4 e CD8 é Estabilizada com nocaute de CD33.

[00274] Previamente, as células T editadas para serem 2X KO (TRAC-/B2M-) e CAR+ anti-CD33 mostraram uma diminuição na pro-

porção de células T CD4+ e um aumento na proporção de células T CD8+ entre 7 e 14 dias (FIG. 2C). Para determinar o efeito de um no- caute de CD33 na razão de células CD4 e CDB8 ao longo do tempo, células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-), CAR+ anti-CD33 foram avalia- das por citometria de fluxo no dia 7 e dia 14. A proporção de células T CD4+ e CD8+ foi determinada para células editadas com diferentes construtos de CAR (CTX-981, CTX-981b, CTX-982, CTX-982b, CTX- 970, CTX-965b). A mesma medição foi realizada para células T edita- das para serem 2X KO (TRAC-/B2M-) e CAR+ anti-CD33. Enquanto um aumento nas células T CD4+ e diminuição nas células CD8+ foram novamente observados para células T 2X KO CAR+ entre 7 e 14 dias, nenhuma tal mudança foi observada para células T 3X KO CAR+ (FIG. 12). Em particular, as células T 3X KO CAR+ editadas com um cons- truto de CAR CTX-982b, CTX-970 ou CTX-965b demonstraram pouca mudança na proporção de células que eram CD4+ e que eram CD8r+. Estes dados demonstram que o nocaute de CD33 estabiliza a razão entre células T CD4+ e células T CD8+ na população de células T edi- tadas ao longo do tempo.

Morte de células alvo e secreção de citocinas por células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-), anti-CD33 CAR+

[00275] A capacidade de células T 2X KO (TRAC-/B2M-) CAR+ de matarem células cancerosas foi avaliada como descrito no Exemplo 2 acima. Do mesmo modo, a capacidade de células T 3X KO (TRAC- /IB2M-/CD33-) CAR+ de eliminarem as células tumorais CD33+ foi de- terminada. Isto foi feito como descrito acima em que as células T CAR+ foram cocultivadas com a linha de células de AML expressando CD33 MV4-11 (ATCC CRL-9591). Uma comparação direta de células T 2X KO CAR+ e células T 3X KO CAR+ foi realizada. Em cada caso, as células T foram geradas a partir de dois dadores humanos diferen- tes e foram editadas com o construto de CAR CTX-965b, CTX-970 ou

CTX-982. As células T foram incubadas com células MV4-11 a uma razão entre célula T CAR e célula alvo de 0,05:1 - 1:1 e a percentagem de lise celular entre células MV4-11 foi determinada como descrito acima. Tanto as células T 2X KO CAR+ como as células T 3X KO CAR+ demonstraram morte eficiente de células MV4-11, mesmo a bai- xas razões células T CAR:células alvo (FIG. 13). Este resultado foi consistente para células T geradas de diferentes dadores. Indepen- dentemente do dador, as células T CAR+ tanto 2X KO como 3X KO alcançaram morte quase completa das células alvo quando inoculadas a uma razão de 1:1.

[00276] A capacidade funcional das células T CAR+ TRAC-/B2M- lanti-CD33 (por exemplo: células T CAR CTX-965b e células T CAR CTX-970) para induzir a secreção de citocinas na presença de células alvo foi avaliada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo

2. Para medir a liberação de citocinas, células T 3X KO CAR+ foram cocultivadas com células alvo MV4-11 expressando CD33 durante 24 horas a uma razão entre CAR-T anti-CD33 e MV411 variando de 0,05:1 a 1:1. O meio sobrenadante foi coletado e as citocinas (por exemplo, IFNy e IL-2) presentes no sobrenadante foram quantificadas usando ensaios ELISA de IFNy ou IL-2 (RD Systems) seguindo as ins- truções do fabricante (RD Systems). A produção de citocinas por célu- las T 3X KO CAR+ foi comparada com a produção de citocinas por cé- lulas T 2X KO (TRAC-/B2M-), CAR+ e células T de controle (por exemplo, células T TRAC+ e células T TRAC-/B2M-). A quantificação da produção de IFNy indicou que as células T 3X KO CAR+ induziram elevados níveis de IFNy em comparação com as células T de controle e níveis comparáveis de produção de IFNy em relação a células T 2X KO CAR+ para cada construto de CAR testado (FIG. 14). Assim, o no- caute de CD33 não pareceu alterar a capacidade das células T CAR+ de secretarem IFNy. Similarmente, a capacidade das células T CAR+ de produzirem IL-2 em resposta à estimulação das células alvo foi ava- liada. O nível de produção de IL-2 era dependente do construto de CAR usado para gerar as células T. As células T CAR+ anti-CD33 ge- radas com o CAR CTX-965b produziram elevados níveis de |L-2 em relação às células T de controle, enquanto aquelas geradas usando os construtos de CAR CTX-970 ou CTX-982b produziram níveis de IL-2 que eram somente ligeiramente mais elevados do que as células T de controle (FIG. 15). A baixa produção de IL-2 observada para células T geradas com os construtos de CAR CTX-970 ou CTX-982b foi obser- vada tanto para células T 2X KO CAR+ como para células T 3X KO CAR+, indicando que o nocaute de CD33 não resgatou a produção de IL-2. No entanto, para células T geradas com o CAR CTX-965b, as células T que tinham 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-) produziram níveis mais elevados de IL-2 do que as células T que tinham somente o 2X KO (TRAC-/B2M-). Exemplo 6. Seletividade das células T CAR+ anti-CD33.

[00277] Este exemplo descreve a geração de uma linha de células cancerosas deficiente em CD33 e o uso desta linha de células para avaliar a capacidade de células T CAR+ com edição gênica de alcan- çarem morte seletiva de células alvo expressando CD33. Geração de linha de células de AML CD33 KO MV4-11

[00278] Para gerar uma linha de células cancerosas deficiente em CD33, as células MV4-11 foram eletroporadas com Cas9:sgRNA vi- sando CD33 (CD33-10; SEQ ID NO: 151). As células foram plaquea- das a -1 célula por poço e deixadas a se expandirem durante três se- manas. Várias linhas clonais foram depois testadas quanto à expres- são à superfície de CD33 usando citometria de fluxo e um anticorpo anti-CD33 (PE-anti-CD33-humano, f de catálogo da Biolegend 366608). MV4-11 de tipo selvagem (WT MV4-11) tinha elevado nível de CD33 de superfície, enquanto uma linha clonal particular não de-

monstrou coloração de CD33 acima do fundo. Esta linha clonal (referi- da como células CD33 KO MV4-11) foi subsequentemente usada para avaliar a morte seletiva de CD33 por células T CAR+ anti-CD33.

[00279] A morte seletiva por células T CAR+ anti-CD33 foi avaliada por medição da lise das células alvo e produção de citocinas na pre- sença de WT MV4-11 ou CD33 KO MV4-11. As células T CAR+ que foram definidas como seletivas foram aquelas que induziram a lise ce- lular e a produção de citocinas na presença de células WT MV4-11 expressando CD33, mas não exibiram resposta na presença de CD33 KO MV4-11. Este resultado indica que a célula T CAR+ anti-CD33 re- quer o reconhecimento de um antígeno CD33 na superfície da célula alvo para mediar a morte celular. A morte seletiva foi avaliada por me- dição da lise das células alvo e a produção de citocinas de células T CAR+ como descrito no exemplo 2. A seletividade foi medida para cé- lulas T CAR+ geradas com três construtos de CAR diferentes (CTX- 965b, CTX-970 e CTX-982b) e tanto para células T 2X KO CAR+ como para células T 3X KO CAR+. Assim, 6 células T CAR+ foram avaliadas quanto à lise seletiva de células alvo e produção de citocinas quando cocultivadas durante 24 horas com células WT MV4-11 ou CD33 KO MV4-11 a uma razão célula T CAR+:célula alvo de 1:1. As células T CAR+ avaliadas foram como se segue: Células T 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 CAR+, expressando CAR CTX-965b Células T 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 CAR+, expressando CAR CTX-970 Células T 2X KO (TRAC-/B2M-), anti-CD33 CAR+, expressando CAR CTX-982b Células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-), anti-CD33 CAR+, expressando CAR CTX-965b Células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-), anti-CD33 CAR+, expressando

CAR CTX-970 Células T 3X KO (TRAC-/B2M-/CD33-), anti-CD33 CAR+, expressando CAR CTX-982b

[00280] Tanto as células T2XKO CAR+ como as células T 3X KO CAR+ alcançaram morte quase completa de células alvo WT MV4-11 (FIG. 16, painel esquerdo). Em contraste, nenhuma morte de WT MV4- 11 foi vista para os grupos de controle (por exemplo, MV4-11 sozinho ou MV4-11 cocultivado sem células T RNP, células T TRAC-/B2M- ou células T TRAC-/B2M-/CD33-). A capacidade das células T CAR+ de matarem as células CD33 KO MV4-11 foi também avaliada. As células T CAR+ geradas com um CAR CTX-965b ou um CAR CTX-970 induzi- ram níveis negligenciáveis a baixos níveis de morte celular em compa- ração com os grupos de controle (FIG. 16, painel direito). Isto foi ver- dadeiro para as células T tanto 2XK KO CAR+ como 3X KO CAR+. Em contraste, as células T tanto 2X KO CAR+ como 3X KO CAR+ geradas com um CAR CTX-982b induziram a morte de células CD33 KO MV4- 11 a níveis mais elevados do que 60%. Em conjunto, estes resultados indicam que as células T CAR+ anti-CD33 2X KO ou 3X KO geradas com um CAR CTX-965b ou CTX-970 são seletivas para a morte de células alvo expressando CD33, enquanto as células T geradas com um CAR-982b não são seletiva e induzem a morte indesejável de célu- las deficientes na expressão de CD33 (i.e., células fora do alvo).

[00281] Para determinar se a morte seletiva por células T CAR+ expressando o CAR CTX-965b ou o CAR CTX-970 é mantida a eleva- das razões entre célula T CAR+ e células cancerosas, uma gama de razões foi avaliada. Células T CAR+ foram cocultivadas com células CD33 KO MV4-11 a uma razão variando de 0,25:1 a 2:1. Enquanto as células T CAR+ geradas com um CAR CTX-965 ou um CAR CTX-970 demonstraram níveis baixos ou negligenciáveis de lise celular mesmo à razão mais elevada testada, as células T CAR+ geradas com um

CAR CTX-982b induziram elevados níveis de morte celular a todas as razões testadas (FIG. 17). Estes resultados demonstram que as célu- las T CAR CTX-965 ou CTX-970 são seletivas mesmo quando cultiva- das em elevada abundância em relação às células cancerosas, en- quanto as células T CAR CTX-982b não são seletivas em qualquer razão de inoculação testada.

[00282] Para proporcionar uma medida adicional de seletividade, a produção de citocinas por células T CAR+ na presença de células CD33 KO MV4-11 foi avaliada. Dado que as células T CAR+ produzem citocinas após reconhecimento de um antígeno em uma célula alvo é esperado que as células T CAR+ seletivas produzam citocinas somen- te quando uma célula alvo expressando um antígeno específico de CAR está presente. Dado que as células T CAR+ com um CAR CTX- 965 ou um CAR CTX-970 eram seletivas para indução da lise de célu- las alvo expressando CD33 (FIG. 16) era esperado que, do mesmo modo, elas produziriam citocinas somente na presença de células alvo expressando CD33 e não na presença de células deficientes em CD33. Para determinar se este era o caso, as células T CAR+ foram cocultivadas com células CD33 KO MV4-11 e IL-2 e IFNy no sobrena- dante foram medidos por ELISA como descrito no exemplo 2. Interes- santemente, nenhuma das células T CAR+ produziu IL-2 quando co- cultivadas com células CD33 KO MV4-11 (FIG. 18, painel esquerdo). Isto era verdade mesmo para células T CAR CTX-982b que foram identificadas como assassinas não seletivas como descrito acima. No entanto, as células T CAR CTX-982b induziram níveis significativos de IFNy quando incubadas com células CD33 KO MV4-11 (FIG. 18, pai- nel direito). Isto foi verdadeiro para as células T tanto 2X KO CAR+ como 3X KO CAR+ preparadas com um CAR CTX-982b. Em contras- te, as células T 2X KO CAR+ e 3X KO CAR+ preparadas com um CAR CTX-965 ou CTX-970 não induziram IFNy quando incubadas com cé-

lulas CD33 KO MVA4-11. Estas diferenças na produção de IFNy na pre- sença de células deficientes em CD33 substanciam a conclusão de que, embora as células T CAR+ geradas com um CAR CTX-982b não sejam seletivas, as células T CAR+ geradas com um CAR CTX-965 ou CTX-970 são capazes de alcançar ativação e morte seletivas somente na presença de células alvo expressando CD33 ou células cancero- sas. Exemplo 7. Efeito de células T CAR anti-CD33 in vivo.

[00283] Este exemplo descreve estudos realizados para avaliar os efeitos terapêuticos das células T CAR+ anti-CD33 em um modelo animal de leucemia mieloide aguda (AML) (modelo MV-4-11 NSG).

[00284] A linha de células derivadas de AML humana MV-4-11 foi feita para expressar os genes tanto da luciferase como mCherry (MV- 4-11-Luc-mCh-Puro) para estudos de visualização in vivo. A visualiza- ção de bioluminescência (BLI) se correlaciona com a quantidade de carga tumoral e, portanto, a BLI foi quantificada para avaliar a carga tumoral. Para medir a BLI, os camundongos foram injetados com luci- ferina antes da medição da luciferase usando IVIS S5 Lumina (Perkin Elmer). No Dia O, células MV-4-11-Luc-mCh-Puro foram injetadas em camundongos NSG fêmeas com 5-6 semanas de idade (The Jackson Laboratory) (2x10º células/camundongo). Células CAR-T anti-CD33 (CTX-965b) foram testadas em três doses (1,5x10º célu- las/camundongo, 3,0x10º células/camundongo e 6,0x10º célu- las/camundongo) no modelo MV-4-11 NSG. Células CAR-T anti-CD33 (CTX-965b) foram injetadas em camundongos ao Dia 5. As observa- ções clínicas e as medições de peso corporal foram realizadas a cada 2-4 dias e a BLI foi medida semanalmente.

[00285] “Todas as três doses reduziram a carga tumoral (FIG. 19A), retardaram o início do crescimento tumoral e levaram a um aumento na sobrevivência do camundongo (FIG. 19B e Tabela 23) em relação aos camundongos não tratados. Tabela 23. Sobrevivência mediana de camundongos com AML.

Grupo Sobrevivência valor p (em comparação com au- Mediana (Dias) sência de tratamento) Log-rank Sem tratamento 36,5 1,5E6 CAR-T+ 55 0,0033 3E6 CAR-T+ 48 0,01 6E6 CAR-T+ 63 0,0005

[00286] Estudos adicionais foram realizados para avaliar os efeitos terapêuticos das células T CAR+ anti-CD33 com ou sem nocaute do gene CD33 (guia CD33-2) no modelo de AML de camundongo MV-4- 11 NSG. Em estes estudos, os camundongos foram injetados com CTX-965b ou CTX-970 com ou sem nocaute do gene CD33 a uma do- se de 3x10º células/camundongo. Os camundongos em cada grupo de tratamento exibiram sobrevivência aumentada em comparação com os camundongos no grupo de controle não tratado (FIGs. 19C-19D e Ta- bela 24). Tabela 24. Sobrevivência mediana de camundongos com AML.

Grupo Sobrevivência valor p (em comparação Mediana (Dias) com ausência de trata- mento) Log-rank Sem tratamento 37 CTX-965b CAR T 44 0,0034 CTX-965b CAR T + CD33 KO 42 0,041 CTX-970 CAR T 42 0,029 CTX-970 CAR T + CD33 KO 37 0,012

[00287] As células T CAR+ CTX-965b com ou sem nocaute de CD33 pareceram ser mais eficazes em termos de controle da carga tumoral, como indicado pelas medições de luminescência mais baixas detectadas no Dia 33 para os grupos CTX-965b em comparação com aquelas dos grupos CTX-970 (FIG. 19E e Tabela 25).

Tabela 25. Análise estatística das medições de luminescência de- tectadas no Dia 33. [ARA et

[00288] Em suma, estes resultados demonstram que as células T CAR+ anti-CD33 têm efeitos terapêuticos em um modelo de camun- dongo de AML. Tais efeitos terapêuticos foram proporcionados por cé- lulas T CAR+ anti-CD33 com ou sem nocaute do gene CD33.

EQUIVALENTES

[00289] Todas as referências, patentes e pedidos de patentes di- vulgados aqui são incorporados por referência no que diz respeito ao assunto para o qual cada um é citado, o que em alguns casos pode englobar a totalidade do documento.

[00290] Os artigos indefinidos "um" e "uma", como usados aqui no relatório descritivo e nas reivindicações, a não ser que claramente in- dicado em contrário, devem ser entendidos como significando "pelo menos um(a)".

[00291] Deve ser também entendido que, a não ser que claramente indicado em contrário, em quaisquer métodos reivindicados aqui que incluam mais do que um passo ou ato, a ordem dos passos ou atos do método não está necessariamente limitada à ordem na qual os passos ou atos do método são recitados.

[00292] Nas reivindicações, bem como no relatório descritivo acima, todas as frases de transição tais como "compreendendo", "incluindo",

"transportando", "tendo", "contendo", "envolvendo", "mantendo", "com- posto por" e similares são para serem entendidas como sendo abertas, i.e., como significando incluindo mas não se limitando a. Somente as frases de transição "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" deverão ser frases de transição fechadas ou semifechadas, res- pectivamente, como estabelecido no Manual de Procedimentos de Exame de Patentes do Escritório de Patentes dos Estados Unidos, Seção 2111.03.

[00293] Os termos "cerca de" e "substancialmente" precedendo um valor numérico significam +10% do valor numérico recitado.

[00294] Onde uma gama de valores é proporcionada, cada valor entre as extremidades superior e inferior da gama é especificamente contemplado e descrito aqui.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Célula T manipulada, caracterizada por compreender um ácido nucleico codificando um receptor de antígeno quimérico (CAR), em que o CAR compreende um ectodomínio que se liga especifica- mente a CD33.

2. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente um gene da região constante de cadeia alfa do receptor de células T (TRAC) interrompi- do.

3. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por o ácido nucleico codificando o CAR ser inserido no gene TRAC.

4. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por compreender adicionalmente um gene de beta-2-microglobulina (B2M) interrompido.

5. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por o ectodomínio do CAR com- preender um anticorpo anti-CD33.

6. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o anticorpo anti-CD33 ser um fragmento variável de cadeia única (scFv) anti-CD33.

7. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por o scFv anti-CD33 compreender as mesmas regiões determinantes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pesada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de refe- rência compreende: (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 65 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 66, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 77 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 78 ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 89 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 90.

8. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o scFv anti-CD33 compreender as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

9. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o scFv anti-CD33 compreender a sequência de ami- noácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 73, 75, 85, 87, 97 ou 99.

10. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o CAR compreender adicional- mente um domínio coestimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

11. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por o CAR compreender adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3C.

12. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 11, caracterizada por o gene TRAC compreender a sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118, e/ou em que o CAR é codificado pela sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119.

13. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizada por o gene B2M interrompido compreender pelo menos uma sequência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma de SEQ ID NOs: 9-14.

14. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada por as células T compreenderem um gene CD33 de tipo selvagem.

15. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada por as células T compreenderem adicionalmente um gene CD33 interrompido.

16. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por o gene CD33 interrompido compreender uma se- quência de nucleotídeos de AGTTCATGGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 187), AGITCATGGTTCC (SEQ ID NO: 188), AGTITCATGTAC- TGGTTCC (SEQ ID NO: 189), AGITCATGGTTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 190), AGTTCC, AGTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 191), AGTT- CATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 192), AGTTCATGGTATACTGGTTCC (SEQ ID NO: 193), e/ou AGITACTGGTTCC (SEQ ID NO: 194).

17. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada por o gene CD33 interrompido carecer de um fra- gmento compreendendo AGTTCATGGTTACTGGTTCC (SEQ ID NO: 186).

18. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por o gene CD33 interrompido compreender uma se- quência de nucleotídeos de ANATCCTGGCACT (SEQ ID NO: 300), AAATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 301), AMATCCTCATTCCCTGG- CACT (SEQ ID NO: 302), AMATCCTCACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 304), ANATCCTCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 305), AMATCCTCCC TGGCACT (SEQ ID NO: 306), AMATCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 307), ACATCCTCATTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 308), ACATCC TGGCACT (SEQ ID NO: 309), AMATCCTCTCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 310), AMATCCTCATCTGGCACT (SEQ ID NO: 311), AMATCCT, AAACCCTGGCACT (SEQ ID NO: 312), AMATCCTCTGGCACT (SEQ ID NO: 313), AMATCCCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 314), AMATCCT- CACT (SEQ ID NO: 315), ACATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 316), e/ou AAAT.

19. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada por o gene CD33 interrompido carecer de um fragmento compreendendo AMATCCTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 299).

20. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada por o gene CD33 interrompido carecer de um fra- gmento, o segmento 3' do qual compreende a sequência de nucleotí- deos de AMATCCTCAT (SEQ ID NO: 317), AMATCCTCATCCCT (SEQ ID NO: 318), AMATCCTCATCCCTGG (SEQ ID NO: 320), AMATCCT- CATC (SEQ ID NO: 322), ou AMATCCTCATCCCTGGCA (SEQ ID NO: 324).

21. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada por o gene CD33 interrompido carecer de um fragmento, o segmento 5 do qual compreende a se- quência de nucleotídeos de CTCATCCCTGGCACT (SEQ ID NO: 323).

22. População de células T manipuladas, caracterizada por compreender a célula T manipulada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que pelo menos 25% ou pelo me- nos 50% das células T manipuladas da população expressam o CAR.

23. População, de acordo com a reivindicação 22, caracte- rizada por pelo menos 70% das células T manipuladas da população expressarem o CAR.

24. População, de acordo com a reivindicação 22, caracte- rizada por pelo menos 25% das células T manipuladas da população expressarem o CAR após pelo menos 7 dias ou pelo menos 14 dias de proliferação in vitro.

25. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 24, caracterizada por pelo menos 50% das células T ma- nipuladas da população não expressarem um nível detectável de pro- teína do receptor de células T (TCR).

26. População, de acordo com a reivindicação 25, caracte- rizada por pelo menos 90% das células T manipuladas da população não expressarem um nível detectável de proteína TCR.

27. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 26, caracterizada por pelo menos 50% das células T ma- nipuladas da população não expressarem um nível detectável de pro- teína B2M.

28. População, de acordo com a reivindicação 27, caracte- rizada por pelo menos 70% das células T manipuladas da população não expressarem um nível detectável de proteína B2M.

29. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 28, caracterizada por pelo menos 20% das células T ma- nipuladas da população não expressarem um nível detectável de pro- teína CD33.

30. População, de acordo com a reivindicação 29, caracte- rizada por pelo menos 50% das células T manipuladas da população não expressarem um nível detectável de proteína CD33.

31. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 22 a 30, caracterizada por as células T manipuladas da popu- lação, quando cocultivadas in vitro com uma população de células cancerosas que expressam CD33, induzirem a lise celular de pelo me- nos 10%, pelo menos 25% ou pelo menos 50% das células cancero- sas da população.

32. População, de acordo com a reivindicação 31, caracte- rizada por as células T manipuladas da população, quando cocultiva- das in vitro com uma população de células cancerosas que expressam CD33, induzirem a lise celular de pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da população de células cancerosas.

33. População, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, ca- racterizada por as células T manipuladas da população, quando cocul- tivadas in vitro com uma população de células cancerosas, secretarem IFNy.

34. População, de acordo com qualquer uma das reivindi-

cações 31 a 33, caracterizada por a razão entre células T manipuladas e células cancerosas ser 1:1 a 2:1.

35. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 31 a 34, caracterizada por as células cancerosas compreende- rem leucemia.

36. População, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 31 a 34, caracterizada por as células cancerosas compreende- rem leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

37. Método, caracterizado por compreender administração da população de células T manipuladas, conforme definidas em qual- quer uma das reivindicações 22 a 36, a um indivíduo.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracteriza- do por o indivíduo ser um indivíduo humano.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, carac- terizado por o indivíduo ter um câncer.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do por o câncer ser uma leucemia, opcionalmente leucemia linfoblásti- ca aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

41. Método, de acordo com a reivindicação 39 ou 40, carac- terizado por o câncer compreender células cancerosas expressando CD33.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 41, caracterizado por a administração da população de célu- las T manipuladas a um indivíduo causar uma redução no(s) volume(s) tumoral(ais) canceroso(s) em relação a um controle de linha de base.

43. Método para produção de uma célula T manipulada, ca- racterizado por compreender:

(a) entrega a uma célula T de (i) uma nuclease guiada por RNA, (ii) um gRNA visando um gene TRAC e (iii) um vetor compreendendo um modelo dador que compreende um ácido nucleico codificando um CAR que compreende um ectodomínio que se liga especificamente a CD33; e (b) produção de uma célula T manipulada tendo um gene TRAC interrompido e expressando o CAR.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do por o gRNA visando o gene TRAC compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19 ou visar a sequên- cia de nucleotídeos de SEQ ID NO: 40.

45. Método, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, carac- terizado por o ácido nucleico codificando o CAR ser flanqueado por braços de homologia à direita e à esquerda para o gene TRAC.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 45, caracterizado por compreender adicionalmente entrega à célula T de um gRNA visando o gene B2M.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do por o gRNA visando o gene B2M compreender a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 21 ou visar a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 41.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 47, caracterizado por a nuclease guiada por RNA ser uma nuclease Cas9, opcionalmente uma nuclease Cas9 de S. pyogenes.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 48, caracterizado por compreender adicionalmente entrega à célula T de um gRNA visando o gene CD33.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracteriza- do por o gRNA visando o gene CD33 compreender uma sequência de nucleotídeos como proporcionado na Tabela 10.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 50, caracterizado por o ectodomínio do CAR ser um anticor- po anti-CD33.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracteriza- do por o anticorpo anti-CD33 ser um fragmento variável de cadeia úni- ca (scFv) anti-CD33.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do por o scFv anti-CD33 compreender as mesmas regiões determinan- tes da complementaridade (CDRs) do domínio variável de cadeia pe- sada (VH) e as mesmas CDRs do domínio variável de cadeia leve (VL) que um anticorpo de referência, em que o anticorpo de referência compreende (i) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 65 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 66, (ii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 77 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 78 ou (iii) um VH estabelecido como SEQ ID NO: 89 e um VL estabelecido como SEQ ID NO: 920.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteriza- do por o scFv anti-CD33 compreender as mesmas cadeias de VH e VL que o anticorpo de referência.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracteriza- do por o scFv anti-CD33 compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 73, 75, 85, 87, 97 ou 99.

56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 55, caracterizado por o CAR compreender um domínio co- estimulador CD28 ou um domínio coestimulador 41BB.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteriza- do por o CAR compreender adicionalmente um domínio de sinalização citoplasmática CD3C.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-

ções 43 a 57, caracterizado por o modelo dador compreender a se- quência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 109, 112, 115, ou 118.

59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 43 a 58, caracterizado por o CAR ser codificado por uma se- quência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 110, 113, 116 ou 119.

60. Método para redução do volume de um tumor em um indivíduo tendo câncer, caracterizado por o método compreender ad- ministração ao indivíduo de uma população de células T manipuladas, conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 22 a 36.

61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracteriza- do por o volume do tumor no indivíduo ser reduzido em pelo menos 50% em relação a um controle de linha de base, opcionalmente em que 1x105º células a 1x107 células da população são administradas.

62. População de células compreendendo células T mani- puladas, caracterizada por as células T manipuladas compreenderem: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico codificando um CAR compreen- dendo um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33.

63. População de células, de acordo com a reivindicação 62, caracterizada por o CAR compreender (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio coestimulador CD3C.

64. População de células, de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizada por o gene TRAC interrompido compreender o ácido nucleico codificando o CAR.

65. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 62 a 64, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 interrompido.

66. População de células compreendendo células T mani- puladas, caracterizada por as células T manipuladas compreenderem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimula- dor 41BB e um domínio de coestimulador CD3C6; e (ii) um gene B2M interrompido.

67. População de células, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 in- terrompido.

68. População de células compreendendo células T mani- puladas, caracterizada por as células T manipuladas compreenderem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e (ii) um gene B2M interrompido.

69. População de células, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 in- terrompido.

70. População de células compreendendo células T mani- puladas, caracterizada por as células T manipuladas compreenderem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104; e (ii) um gene B2M interrompido.

71. População de células, de acordo com a reivindicação 70, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 in- terrompido.

72. População de células que compreende células T mani- puladas, caracterizada pelo fato de que as células T manipuladas compreendem: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 55; e (ii) um gene B2M interrompido.

73. População de células, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 in- terrompido.

74. Célula T manipulada, caracterizada por compreender: (i) um gene TRAC interrompido; (ii) um gene B2M interrompido; e (iii) um ácido nucleico codificando um CAR compreen- dendo um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33.

75. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 74, caracterizada por o CAR compreender (a) um ectodomínio que com- preende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um do- mínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimulador 41BB e um domínio coestimulador CD3C.

76. Célula T manipulada, de acordo a reivindicação 74 ou 75, caracterizada por o gene TRAC interrompido compreender o ácido nucleico codificando o CAR.

77. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 76, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 interrompido.

78. Célula T manipulada, caracterizada por compreender:

(i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo (a) um ectodomínio que compreende um fragmento de ligação ao antígeno anti-CD33, (b) um domínio transmembranar CD8 e (c) um endodomínio que compreende um domínio coestimula- dor 41BB e um domínio de coestimulador CD3C6; e (ii) um gene B2M interrompido.

79. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 75, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 inter- rompido.

80. Célula T manipulada, caracterizada por compreender: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 104; e (ii) um gene B2M interrompido.

81. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 77, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 inter- rompido.

82. Célula T manipulada, caracterizada por compreender: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende um ácido nucleico codificando um CAR, em que a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 56 e codifica o CAR de SEQ ID NO:104; e (ii) um gene B2M interrompido.

83. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 82, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 inter- rompido.

84. Célula T manipulada, caracterizada por compreender: (i) um gene TRAC interrompido, em que o gene TRAC interrompido compreende a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID

NO: 55; e (ii) um gene B2M interrompido.

85. Célula T manipulada, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada por compreender adicionalmente um gene CD33 inter- rompido.

86. Célula T manipulada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 e 74 a 85, caracterizada por a célula T ser uma célula T humana.

87. Método de tratamento de câncer em um indivíduo, ca- racterizado por compreender administração ao indivíduo da população de células, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 62 a73.

88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracteriza- do por o câncer ser uma leucemia, opcionalmente leucemia linfoblásti- ca aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mieloide crônica (CML).

89. Método, de acordo com a reivindicação 87 ou 88, carac- terizado por o câncer compreender células expressando CD33.