TW202400778A

TW202400778A - 具有多重基因編輯之抗ｃｄ１９ｃａｒ—ｔ細胞及其治療用途

Info

Publication number: TW202400778A
Application number: TW112110703A
Authority: TW
Inventors: 穆罕默德戈尼姆; 喬納森亞歷山大特雷特; 德米特里斯卡拉蒂茲; 瑪麗李德奎恩
Original assignee: 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司
Priority date: 2022-03-23
Filing date: 2023-03-22
Publication date: 2024-01-01
Also published as: WO2023180968A1; US20230303713A1

Abstract

本文提供基因工程改造之T細胞，該等T細胞表現靶向CD19之嵌合抗原受體(CAR)且具有多重基因編輯，包括中斷之 TRAC基因、中斷之 β 2M基因、中斷之 Regnase 1基因及/或中斷之 TGFBRII基因。本文亦提供製造此類基因工程改造之T細胞之方法及在癌症治療中使用該等基因工程改造之T細胞的方法。

Description

具有多重基因編輯之抗CD19　CAR-T細胞及其治療用途

本發明關於一種具有多重基因編輯之抗CD19 CAR-T細胞及其治療用途。

嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法使用基因修飾之T細胞以更特異性地且有效地靶向及殺死癌細胞。自血液中收集T細胞後，對細胞進行工程改造以在其表面上包括CAR。可使用CRISPR/Cas9基因編輯技術將CAR引入T細胞中。當將此等同種異體CAR T細胞注射至患者體內時，受體使T細胞能夠殺死癌細胞。

在CAR T療法中需要具有改良之培養持久性的T細胞。此類T細胞在活體外及活體內均存活更長時間，從而為CAR T細胞製造及臨床應用賦予效益。然而，改良T細胞之培養持久性仍具有挑戰。

本揭示案至少部分基於開發攜帶中斷之 Regnase 1( Reg1)基因、中斷之 TGFBRII基因、中斷之 TRAC基因及/或中斷之 β2M基因的基因編輯之抗CD19 CAR-T細胞(例如，攜帶所有中斷基因之抗CD19 CAR-T細胞)，經由使用如本文所揭示之向導RNA進行CRISPR/Cas介導之基因編輯來產生此類基因編輯之T細胞的有效方法。本文報導Reg1基因及TGFBRII基因兩者之中斷對增加CAR-T細胞擴增及功能持久性顯示出協同作用，從而增強活體外及活體內對CD19+癌症之治療功效。舉例而言，抗CD19 CAR-T細胞提高如在白血病及淋巴瘤動物模型中所觀測之存活率。此外，具有 Reg1及 TGFBRII中斷兩者之抗CD19 CAR-T細胞在低於具有野生型 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞對應物之劑量下顯示出治療有效性。

因此，在一些態樣中，本文提供一種基因工程改造之T細胞群體，該群體包含：(i)中斷之T細胞受體α鏈恆定區( TRAC)基因，(ii)中斷之β-2-微球蛋白( β2M)基因，(iii)中斷之 Regnase-1( Reg1)基因，(iv)中斷之轉化生長因子β受體II (TGFBRII)基因，及(v)編碼結合人類CD19之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD19 CAR)之核酸。在一些實施例中，抗CD19 CAR包含結合CD19之單鏈可變片段(scFv) (抗CD19 scFv)、CD28之共刺激結構域及CD3ζ細胞質信號傳導結構域。

在一些情況下，抗CD19 CAR中之抗CD19 scFv可包含重鏈可變區(V _H)，其包含與SEQ ID NO: 81中之彼等相同之重鏈互補決定區(CDR)；及(ii)輕鏈可變區(V _L)，其包含與SEQ ID NO: 82中之彼等相同之輕鏈CDR。在一些情況下，抗CD19 scFv包括包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之VL。在特定實例中，抗CD19 scFv包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列。在一個實例中，抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。

在一些情況下，將編碼抗CD19 CAR之核酸插入中斷之 TRAC基因處。舉例而言，在 TRAC基因中包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列之片段可缺失且由編碼抗CD19 CAR之核酸置換。在一些實例中，中斷之 TRAC基因包含SEQ ID NO: 91之核苷酸序列。

在一些實施例中，T細胞中之中斷之 β2M基因包含表 2中所列之核苷酸序列中之一或多者。在一些實施例中，T細胞中之中斷之 Reg1基因包含表 4中所列之核苷酸序列中之一或多者。替代地或另外，T細胞中之中斷之 TGFBRII基因包含表 3中所列之核苷酸序列中之一或多者。

在一些實施例中，基因工程改造之T細胞群體包含至少50% CAR+細胞、至少90% TCR ^-T細胞、至少60% β2M ^-T細胞、至少80% TGFBRII ^-T細胞及/或至少90% Reg1 ^-T細胞。在一些實例中，基因工程改造之T細胞群體包含至少75% CAR+ T細胞、至少99% TCR ^-T細胞、約65%至約80% β2M ^-T細胞、約80%至約90% TGFBRII ^-T細胞及/或約95%至約97% Reg1 ^-T細胞。

在一些實施例中，如本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體包含初級人類T細胞。在一些情況下，初級人類T細胞來源於一或多個健康人類供體。

在其他態樣中，本文提供一種用於治療CD19 ⁺癌症之方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之如本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體中之任一者。在一些實施例中，個體為患有B細胞惡性病，例如難治性或復發性B細胞惡性病之人類患者。示例性B細胞惡性病包括但不限於非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)，視情況選自由以下組成之群：瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，視情況為DLBCL非特指型(NOS)；具有 MYC及 BCL2及/或 BCL6重排之高級別B細胞淋巴瘤；轉化型濾泡性淋巴瘤(FL)；及3b級FL。在一些實例中，基因工程改造之T細胞群體之有效量在約1x10 ⁷至約6x10 ⁸CAR ⁺T細胞之範圍內，例如，約1x10 ⁷至約3x10 ⁷CAR+ T細胞、約3x10 ⁷至約1x10 ⁸CAR+ T細胞、約約1x10 ⁸至約3x10 ⁸CAR+ T細胞或約3x10 ⁸至約6x10 ⁸CAR+ T細胞。

此外，本文提供一種用於製備如本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體之方法。該方法可包括：(a)提供複數個細胞，該等細胞為T細胞或其前驅細胞；(b)對該複數個細胞之 TRAC基因、 β2M基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因進行基因編輯；及(c)將編碼抗CD19 CAR之核酸遞送至該複數個細胞中，從而產生基因工程改造之T細胞群體。在一些情況下，編碼抗CD19 CAR之核酸插入 TRAC基因中。

在一些情況下，步驟(a)中之複數個細胞為初級人類T細胞。舉例而言，初級人類T細胞可來自一或多個健康人類供體。

在一些情況下，由一或多個CRISPR/Cas9基因編輯系統進行 TRAC基因、 β2M基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因之基因編輯。在一些實例中，該一或多個CRISPR/Cas9基因編輯系統包含：(a) RNA引導之核酸酶；(b)靶向 TRAC之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 3之間隔子；(c)靶向 β2M之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 7之間隔子；(d)靶向 Reg1之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 11之間隔子；及(e)靶向 TGFBRII之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 15之間隔子。在一些情況下，RNA引導之核酸酶可為Cas9核酸酶，例如，釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9核酸酶。

在一些情況下，(b)-(e)之RNA引導之核酸酶及向導RNA形成一或多個核糖核蛋白粒子，該一或多個核糖核蛋白粒子係藉由一或多個電穿孔事件遞送至複數個細胞。

在一些情況下，編碼抗CD19 CAR之核酸係在AAV載體中。在一些實例中，編碼抗CD19 CAR之核酸包含位於編碼CAR之核苷酸序列側翼之左同源臂及右同源臂。左同源臂及右同源臂與 TRAC基因中之基因體基因座同源，從而允許將核酸插入基因體基因座中。

自本文所揭示之方法中之任一者產生之基因工程改造之T細胞中之任一者亦在本揭示案之範疇內。

用於治療CD19+癌症，諸如本文所揭示之彼等，或用於製造用於如本文所揭示之預期治療目的之藥劑的如本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體中之任一者亦在本揭示案之範疇內。

本發明之一或多個實施例之細節在下文之描述中闡述。本發明之其他特徵或優點將自以下圖式及若干實施例之詳細描述以及隨附申請專利範圍顯而易見。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2022年3月23日提交之美國臨時申請案第63/322,903號之申請日權益，該臨時申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。序列表

本申請案含有以XML格式電子提交之序列表，創建於2023年3月14日，且命名為「095136-0739-065WO1_SEQ.XML」 (101,795位元組)，其內容以全文引用之方式併入本文中。

本揭示案旨在建立具有改良之生長活性、持久性、降低之T細胞衰竭及增強之效力的基因工程改造之抗CD19 CAR-T細胞，此為CAR-T療法中之長期需要。本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞可包含對內源基因之多重基因編輯，例如， TRAC基因、 β2M基因、 TGFBRII基因及 Reg1基因之中斷，以使細胞適合用於同種異體免疫細胞療法且達成可改良治療功效之特徵。舉例而言， β2M中斷可降低宿主抗移植物反應之風險或預防宿主抗移植物反應，且TRAC中斷可降低移植物抗宿主反應之風險或預防移植物抗宿主反應。另外，TGFBRII中斷可降低轉化生長因子β (TGF-β)在腫瘤微環境中之免疫抑制作用，且Reg1中斷可經由長期持久性與穩固之效應功能來改良CAR-T細胞功能性。

此種T細胞可使用真實T細胞作為起始物質，例如，未轉化之T細胞、終末分化之T細胞、具有穩定基因體之T細胞及/或依賴於細胞介素及生長因子以供增殖及擴增之T細胞。或者，此種T細胞可使用自前驅細胞，諸如造血幹細胞(例如，iPSC)，例如活體外培養產生之T細胞。本文所揭示之T細胞可為CAR-T細胞製造及臨床應用賦予一或多種效益。

在1期CARBON試驗中，如本文所揭示之具有中斷之 TRAC基因及中斷之 β2M基因的抗CD19 CAR-T細胞及在中斷之 TRAC基因處插入之亦如本文所揭示之編碼抗CD19 CAR之核酸為安全的且在治療已接受至少兩種先前治療路線之復發性或難治性CD19+ B細胞惡性病中顯示出治療功效。參與此1期試驗之患者包括具有最具侵襲性之疾病呈現形式之患者，包括瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)非特指型(NOS)、高級別雙打擊或三打擊淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤及3B級濾泡性淋巴瘤。患者在劑量水準(DL) 1 (三千萬個CAR+ T細胞)至DL4 (六億個CAR+ T細胞)範圍內之劑量下接受抗CD19 CAR-T細胞，可選擇基於臨床效益進行再給藥。下文提供來自此臨床試驗之結果： ● 數據顯示有可能進行抗CD19 CAR-T細胞之單次輸注以達成長期持久之完全緩解與正向區分之安全性型態。 ● 在患有復發性或難治性(R/R) LBCL之大量預治療之患者群體(47%具有≥3種先前治療路線)中，在DL≥3 (n=27)下之抗CD19 CAR-T細胞得到67%之ORR及41%之CR率。 ● 三名患者在治療後兩年保持持續之CR，且另兩名患者在過去一年保持CR。 ● 觀測到無DLT、無任何級別之移植物抗宿主病(GvHD)且無≥3級細胞介素釋放症候群(CRS)事件。 ● 超過六個月持續處於CR之若干患者具有令人鼓舞之功效型態。 ● 觀測到鞏固給藥(再給藥)之效益的明顯證據，其中CR加強且在第二個劑量後穩定疾病及部分反應轉變為持續CR。 ● 安全性型態保持一致，從而確認鞏固方案之耐受性。 ● 抗CD19 CAR-T細胞之峰值擴增及總體藥物動力學在初始劑量與鞏固劑量之間為可比的。

然而，甚至在由免疫系統清除CAR T細胞之前發生之T細胞衰竭可導致功效減弱及反應損失，尤其在具有高腫瘤負荷之患者中。

在本揭示案中，已將 Regnase-1( Reg1)及 TGFBR2( TGFBRII)添加至基因編輯，諸如 TRAC(T細胞受體以預防GvHD)、 B2M(I類MHC以減少T細胞介導之排斥)，及視情況 CD70(以消除與抗CD70 CAR-T細胞相關之自相殘殺且增加效力)，及使用諸如AAV模板之供體模板在 TRAC基因座處之位點特異性CAR插入。意想不到地，本揭示案報導 Reg1及 TGFBRII之中斷協同作用以增加抗CD19 CAR-T細胞之擴增及功能持久性且增強如在動物模型中所觀測之對CD19+癌症之治療功效。 Reg1之中斷藉由增加細胞擴增潛力來改良功能持久性，此與中央記憶表型相關聯。 TGFBRII中斷允許CAR-T細胞避免腫瘤微環境抑制。以組合形式，此等編輯使效力增加至少10倍。另外，中央記憶T細胞(T _CM)表型之長期維持能夠實現高效製造。與 Reg1基因及/或 TGFBRII基因之中斷相關之其他有利特徵可見於WO2022064428中，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。

相對於具有完整 Reg1及 TGFBRII且具有活體內長期持久性與穩固之CAR-T細胞功能性之抗CD19 CAR-T細胞，具有剔除之 Reg1及 TGFBRII基因兩者之本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞在低劑量下展現出有效抗腫瘤活性。此外，觀測到本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞在有免疫能力之小鼠模型中有效清除。總之，本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞，包括本文亦揭示之多重基因編輯，已展示出增加之效力、延長之持久性及持續之抗腫瘤活性。本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞，

因此，本文提供具有改良之持久性及增強之抗腫瘤活性的抗CD19 CAR-T細胞、產生此類T細胞之方法，及此類T細胞在消除CD19+疾病細胞，諸如癌細胞中之治療應用。涉及 Reg1及 TGFBRII編輯之如本文所揭示之此類抗CD19 CAR-T細胞具有增加擴增及功能持久性之潛力，此可在臨床上轉換為更深度、更持久之反應。因此，將預期本文所提供之抗CD19 CAR-T細胞在治療諸如復發性及/或難治性B細胞惡性病之目標疾病中顯示出更高功效。

I. 具有增強特徵之抗 CD19 CAR-T 細胞

在一些態樣中，本文提供具有多重基因修飾以改良CAR-T細胞功能性且由此改良治療功效之抗CD19 CAR-T細胞。本文所提供之基因工程改造之T細胞表現結合CD19之嵌合抗原受體(CAR)且具有對內源基因，例如對 TRAC基因、 β2M基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因之多重基因編輯。

基因工程改造之T細胞可來源於自適合之來源，例如一或多個哺乳動物供體獲得之親本T細胞(例如，未編輯之野生型T細胞)。在一些實例中，親本T細胞為自一或多個人類供體獲得之初級T細胞(例如，未轉化及終末分化之T細胞)。或者，親本T細胞可自前驅T細胞分化，該等前驅T細胞獲自一或多個適合之供體或幹細胞，諸如造血幹細胞或誘導性多能幹細胞(iPSC)，該等細胞可在活體外培養。

基因工程改造之T細胞中之任一者可經由基因編輯(包括基因體編輯)而產生，該基因編輯為一種類型之基因工程改造，其中在DNA序列中，諸如在靶向細胞之基因體中進行核苷酸/核酸插入、缺失及/或取代。靶向基因編輯能夠在靶向細胞基因體中(例如，在靶向基因或靶向DNA序列中)之預選位點處進行插入、缺失及/或取代。當對內源基因之序列進行編輯，例如藉由核苷酸/核酸之缺失、插入或取代時，包含受影響序列之內源基因可能由於序列改變而剔除。因此，靶向編輯可用於中斷內源基因表現。「靶向整合」係指涉及插入一或多個外源序列之過程，伴有插入位點處之內源序列缺失或不缺失。當存在含有外源序列之供體模板時，靶向基因編輯可引起靶向整合。

A. 基因編輯之基因

在一些態樣中，本揭示案提供基因工程改造之T細胞，該等T細胞可包含中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因、中斷之 TRAC 基因及 / 或中斷之 β2M基因。

如本文所用，「中斷之基因」係指包含相對於內源基因之插入、缺失或取代之基因，使得來自內源基因之功能蛋白質之表現降低或抑制。如本文所用，「中斷基因」係指在內源基因中插入、缺失或取代至少一個核苷酸/核酸，使得來自內源基因之功能蛋白質之表現降低或抑制的方法。中斷基因之方法為熟習此項技術者所知且在本文中描述。

在一些實施例中，包含中斷之基因的細胞不表現(例如，在細胞表面處)可偵測水準(例如，在使用與編碼蛋白質結合之抗體的免疫檢定中或藉由流式細胞術)之由該基因編碼之蛋白質。不表現可偵測水準之蛋白質的細胞可稱作剔除細胞。

Reg1 基因編輯

在一些實施例中，基因工程改造之T細胞可包含mRNA衰變中所涉及之中斷基因。此種基因可為Reg1。Reg1含有鋅指模體，結合RNA且展現出核糖核酸酶活性。Reg1在免疫細胞及非免疫細胞中均發揮作用，且其表現可在多種條件下快速誘導，包括微生物感染、炎性細胞介素處理及化學或機械刺激。人類 Reg1基因位於染色體1p34.3上。額外資訊可在GenBank中以Gene ID: 80149找到。

在一些實例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 Reg1基因，使得T細胞中Reg1之表現實質上降低或完全消除。中斷之 Reg1基因可在一或多個適合之靶位點處(例如，在編碼區中或在非編碼調控區，諸如啟動子區中)包含一或多個基因編輯，其中斷 Reg1基因之表現。此類靶位點可基於用於製造基因工程改造之T細胞之基因編輯方法來鑑定。基因編輯之示例性靶位點可包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6或其組合。在一些實例中，一或多個基因編輯可在外顯子2或外顯子4中發生。此種基因編輯可藉由CRISPR/Cas技術使用適合之向導RNA，例如表 1中所列之彼等來誘導。使用表 1中所列之gRNA所得經編輯之 Reg1基因可包含下文之表 4中所提供之一或多個經編輯序列。

Reg1基因之中斷可增強長期持久性且維持穩固之效應功能，從而改良T細胞功能性。

TGFBRII 基因編輯

在一些實施例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 TGFBRII基因，其編碼II型轉化生長因子受體(TGFBRII)。TGFBRII受體為TGFβ信號傳導路徑中所涉及之絲胺酸/蘇胺酸激酶受體家族。此等受體結合TGFβ家族中之生長因子及細胞介素信號傳導蛋白，例如，TGFβ (TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)、骨形態發生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)、活化素及抑制素、肌肉生長抑制素、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)及NODAL。

在一些實例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 TGFBRII基因，使得T細胞中TGFBRII之表現實質上降低或完全消除。中斷之 TGFBRII基因可在一或多個適合之靶位點處(例如，在編碼區中或在非編碼調控區，諸如啟動子區中)包含一或多個基因編輯，其中斷 TGFBRII基因之表現。此類靶位點可基於用於製造基因工程改造之T細胞之基因編輯方法來鑑定。基因編輯之示例性靶位點可包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5或其組合。在一些實例中，一或多個基因編輯可在外顯子4及/或外顯子5中發生。此種基因編輯可藉由基因編輯技術(例如，CRISPR/Cas技術)使用適合之向導RNA，例如表 1中所列之彼等來誘導。使用表 1中所列之gRNA所得經編輯之 TGFBRII基因可包含下文之表 3中所提供之一或多個經編輯序列。

TGFBRII基因之中斷可消除TGFBRII之表面表現且降低轉化生長因子β (TFG-β)在腫瘤微環境中之免疫抑制作用。

β2M基因編輯

在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步包含中斷之 β2M基因。β2M為MHC I複合物之通用(不變)組分。藉由基因編輯中斷其表現將防止宿主對治療性同種異體T細胞之反應，從而增加同種異體T細胞持久性。在一些實施例中，消除內源 β2M基因之表現以防止宿主抗移植物反應。

在一些實施例中，經編輯之 β2M基因可包含選自表 1中之以下序列的核苷酸序列。熟習此項技術者已知，經編輯之基因，諸如經編輯之 β2M基因中之不同核苷酸序列(例如，表 2中之彼等)可由單個gRNA，諸如表 1中所列者(β2M-1)產生。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。

TRAC基因編輯

在一些實施例中，如本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步包含中斷之 TRAC基因。此中斷導致TCR功能喪失，且促使工程改造之T細胞不具有同種異體反應性且適合於同種異體移植，從而使移植物抗宿主病之風險降至最低。在一些實施例中，消除內源 TRAC基因之表現以防止移植物抗宿主反應。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。

TRAC基因之此種基因編輯可藉由基因編輯技術(例如，CRISPR/Cas技術)使用適合之向導RNA，例如表 1中所列之彼等來誘導。應了解，多於一個適合之靶位點/gRNA可用於本文所揭示之各靶基因，例如，此項技術中已知或本文所揭示之彼等。額外實例可見於例如WO2019097305中，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。

在一些情況下，可將編碼抗CD19 CAR之核酸插入 TRAC基因中，從而中斷TRAC基因之表現。舉例而言，CAR編碼核酸可置換經由CRISPR/Cas9之基因編輯中所用之gRNA之靶位點(例如，置換 TRAC基因中包含SEQ ID NO: 18之片段)。

B. 抗 CD19 嵌合抗原受體 (CAR)

嵌合抗原受體(CAR)係指人工免疫細胞受體，其經工程改造以識別及結合由非所需之細胞(例如，疾病細胞，諸如癌細胞)表現之抗原。表現CAR多肽之T細胞稱作CAR T細胞。CAR具有以非MHC限制之方式將T細胞特異性及反應性重定向至選定標靶之能力。非MHC限制之抗原識別為CAR-T細胞提供獨立於抗原加工而識別抗原之能力，由此避開腫瘤逃逸之主要機制。此外，當在T細胞上表現時，CAR有利地不與內源T細胞受體(TCR) α及β鏈二聚化。

存在多代CAR，各代含有不同組分。第一代CAR經由鉸鏈及跨膜結構域將源自抗體之scFv連接至T細胞受體之CD3zeta (ζ或z)細胞內信號傳導結構域。第二代CAR併有額外共刺激結構域，例如，CD28、4-1BB (41BB)或ICOS，以提供共刺激信號。第三代CAR含有兩個與TCR CD3ζ鏈融合之共刺激結構域(例如，CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40之組合)。(Maude等人, Blood.2015; 125(26):4017-4023；Kakarla及Gottschalk, Cancer J.2014; 20(2):151-155)。各代CAR構築體中之任一者在本揭示案之範疇內。

一般而言，CAR為融合多肽，其包含識別靶抗原之細胞外結構域(例如，抗體或其他抗體片段之單鏈片段(scFv))及包含T細胞受體(TCR)複合物之信號傳導結構域之細胞內結構域(例如，CD3ζ)，且在大多數情況下為共刺激結構域。(Enblad等人, Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505)。CAR構築體可進一步包含介於細胞外結構域與細胞內結構域之間的鉸鏈及跨膜結構域，以及用於表面表現之N末端信號肽。信號肽之實例包括下文之表 5中提供之SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52。可使用其他信號肽。

(i) 抗原結合細胞外結構域

抗原結合細胞外結構域為當CAR在細胞表面上表現時暴露於細胞外液之CAR多肽區域。在一些情況下，信號肽可位於N末端以促進細胞表面表現。在一些實施例中，抗原結合結構域可為單鏈可變片段(scFv，其可包括抗體重鏈可變區(V _H)及抗體輕鏈可變區(V _L) (在任一取向上)。在一些情況下，V _H及V _L片段可經由肽連接子連接。在一些實施例中，連接子包括親水性殘基，帶有用於可撓性之甘胺酸及絲胺酸段以及用於增加溶解度之麩胺酸及離胺酸段。scFv片段保留scFv片段所來源之親本抗體之抗原結合特異性。在一些實施例中，scFv可包含人源化V _H及/或V _L結構域。在其他實施例中，scFv之V _H及/或V _L結構域為完全人類的。

抗原結合細胞外結構域可對CD19抗原，諸如人類CD19抗原具有特異性。

在一些實施例中，抗原結合細胞外結構域可為結合如本文所揭示之CD19之單鏈可變片段(scFv)。scFv可包含抗體重鏈可變區(V _H)及抗體輕鏈可變區(V _L)，其視情況可經由可撓性肽連接子連接。在一些情況下，scFv可具有V _H至V _L取向(自N末端至C末端)。或者，scFv可具有V _L至V _H取向(自N末端至C末端)。

在一些實例中，抗原結合細胞外結構域可為結合人類CD19之單鏈可變片段(scFv)。在一些情況下，抗CD19 scFv可包含(i)重鏈可變區(V _H)，其包含與SEQ ID NO: 81中之彼等相同之重鏈互補決定區(CDR)；及(ii)輕鏈可變區(V _L)，其包含與SEQ ID NO: 82中之彼等相同之輕鏈CDR。參見下文之表 5。在一些特定實例中，本文所揭示之抗CD19抗體可包含如藉由Kabat方法確定的分別如SEQ ID NO: 63-65所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3。替代地或另外，本文所揭示之抗CD19抗體可包含如藉由Kabat方法確定的如SEQ ID NO:60-62所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。或者，本文所揭示之抗CD19抗體可包含如藉由Chothia方法確定的分別如SEQ ID NO: 69-71所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3。替代地或另外，本文所揭示之抗CD19抗體可包含如藉由Chothia方法確定的如SEQ ID NO:66-68所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。在一個特定實例中，抗CD19 scFv可包括包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之V _H及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之V _L。參見下文表 5之序列。

具有相同V _H及/或V _LCDR之兩種抗體意指當藉由相同方法(例如，如此項技術中已知之Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法。參見例如bioinf.org.uk/abs/或abysis.org/abysis/sequence_input)確定時，其CDR為相同的。

(ii) 跨膜結構域

本文所揭示之抗CD19 CAR多肽可含有跨膜結構域，其可為跨膜之疏水性α螺旋。如本文所用，「跨膜結構域」係指在細胞膜，較佳為真核細胞膜中熱力學穩定之任何蛋白質結構。跨膜結構域可為含有此類之抗CD19 CAR提供穩定性。

在一些實施例中，如本文所提供之抗CD19 CAR之跨膜結構域可為CD8跨膜結構域。在其他實施例中，跨膜結構域可為CD28跨膜結構域。在其他實施例中，跨膜結構域為CD8及CD28跨膜結構域之嵌合體。如本文所提供，可使用其他跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域為含有如下文之表 5中所提供之SEQ ID NO: 53之序列的CD8a跨膜結構域。可使用其他跨膜結構域。

(iii) 鉸鏈結構域

在一些實施例中，鉸鏈結構域可位於抗CD19 CAR之細胞外結構域(包含抗原結合結構域)與跨膜結構域之間，或位於抗CD19 CAR之細胞質結構域與跨膜結構域之間。鉸鏈結構域可為任何寡肽或多肽，其功能在於將跨膜結構域連接至多肽鏈中之細胞外結構域及/或細胞質結構域。鉸鏈結構域之功能可在於為抗CD19 CAR或其結構域提供可撓性，或防止抗CD19 CAR或其結構域之空間位阻。

在一些實施例中，鉸鏈結構域可包含至多300個胺基酸(例如，10至100個胺基酸，或5至20個胺基酸)。在一些實施例中，一或多個鉸鏈結構域可包括於抗CD19 CAR之其他區域中。在一些實施例中，鉸鏈結構域可為CD8鉸鏈結構域。可使用其他鉸鏈結構域。

(iv) 細胞內信號傳導結構域

抗CD19 CAR構築體中之任一者含有一或多個細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ，及視情況存在之一或多個共刺激結構域)，其為受體之功能末端。抗原識別後，受體簇集且將信號傳輸至細胞。

CD3ζ為T細胞受體複合物之細胞質信號傳導結構域。CD3ζ含有三(3)個基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)，其在T細胞與同源抗原嚙合後將活化信號傳輸至T細胞。在許多情況下，CD3ζ提供初級T細胞活化信號，但不為完全有效之活化信號，此需要共刺激信號傳導。

在一些實施例中，本文所揭示之抗CD19 CAR多肽可進一步包含一或多個共刺激信號傳導結構域。舉例而言，CD28及/或4-1BB之共刺激結構域可用於傳輸完全增殖/存活信號，以及由CD3ζ介導之初級信號傳導。在一些實例中，本文所揭示之CAR包含CD28共刺激分子。在其他實例中，本文所揭示之CAR包含4-1BB共刺激分子。在一些實施例中，CAR包括CD3ζ信號傳導結構域及CD28共刺激結構域。在其他實施例中，CAR包括CD3ζ信號傳導結構域及4-1BB共刺激結構域。在其他實施例中，CAR包括CD3ζ信號傳導結構域、CD28共刺激結構域及4-1BB共刺激結構域。

表 5提供可在本文中使用之來源於4-1BB、CD28及CD3-ζ之信號傳導結構域之實例。

在特定實例中，本文所揭示之抗CD19 CAR可包含SEQ ID NO: 73之胺基酸序列，其可由SEQ ID NO: 72之核苷酸序列編碼。或者，抗CD19 CAR可為不含N末端信號肽之成熟形式，例如，包含SEQ ID NO:74之胺基酸序列。

C. 製造基因工程改造之 T 細胞的方法

可經由習用基因編輯方法或本文所述之彼等對親本T細胞或其前驅細胞進行基因編輯來製備本文所揭示之基因工程改造之T細胞。

(a) T 細胞

在一些實施例中，T細胞可來源於一或多種適合之哺乳動物，例如，一或多種人類供體。T細胞可自許多來源獲得，包括但不限於外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。在某些實施例中，T細胞可使用技術人員已知之眾多技術自個體所收集之血液單位獲得，該等技術諸如沈降，例如FICOLL™分離。

在一些實例中，T細胞可自免疫細胞(例如，本文所述之彼等)之混合物中分離以產生分離之T細胞群體。舉例而言，在分離外周血單核細胞(PBMC)後，細胞毒性T淋巴細胞及輔助T淋巴細胞均可在活化、擴增及/或基因修飾之前或之後歸類為初始T細胞、記憶T細胞及效應T細胞亞群。

可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離表現一或多種以下細胞表面標誌物之特定T細胞亞群：TCRab、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD38、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD122、CD95、CD197、CCR7、KLRG1、MCH-I蛋白及/或MCH-II蛋白。在一些實施例中，藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離表現一或多種選自由TCRab、CD4及/或CD8組成之群之標誌物的特定T細胞亞群。在一些實施例中，可在基因工程改造前及/或基因工程改造後藉由陽性或陰性選擇來分離T細胞亞群。

分離之T細胞群體可表現一或多種T細胞標誌物，包括但不限於CD3+、CD4+、CD8+或其組合。在一些實施例中，自供體或個體分離T細胞，且在經歷基因編輯之前首先在活體外活化及刺激增殖。

在一些情況下，T細胞群體包含自一或多個人類供體分離之初級T細胞。此類T細胞終末分化，未轉化，取決於細胞介素及/或供生長之生長因子，及/或具有穩定基因體。

或者，T細胞可經由活體外分化而來源於幹細胞(例如，HSC或iPSC)。

可對來自適合來源之T細胞進行一或多輪刺激、活化及/或擴增。一般可使用例如美國專利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514及6,867,041中所述之方法活化及擴增T細胞。在一些實施例中，在將基因體編輯組合物引入T細胞中之前，可活化及擴增T細胞持續約1天至約4天、約1天至約3天、約1天至約2天、約2天至約3天、約2天至約4天、約3天至約4天、或約1天、約2天、約3天或約4天。

在一些實施例中，在將基因編輯組合物引入T細胞中之前，活化及擴增T細胞持續約4小時、約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時。在一些實施例中，在將基因體編輯組合物引入T細胞中同時活化T細胞。在一些情況下，可在如本文所揭示之基因編輯之後擴增及/或活化T細胞群體。藉由本文所述之基因編輯方法中之任一者產生的T細胞群體或分離之T細胞亦在本揭示案之範疇內。

(b) 基因編輯方法

可使用習用基因編輯方法或本文所述之彼等對本文所揭示之一或多個靶基因進行編輯(靶向編輯)來製備基因工程改造之T細胞中之任一者。靶向編輯可經由核酸酶非依賴性方法或經由核酸酶依賴性方法來達成。在核酸酶非依賴性靶向編輯方法中，由位於外源多核苷酸側翼之同源序列引導同源重組，以經由宿主細胞之酶促機構引入內源序列中。外源多核苷酸可在內源序列中引入核苷酸之缺失、插入或置換。

或者，核酸酶依賴性方法可經由特異性稀有切割核酸酶(例如，核酸內切酶)特異性引入雙股斷裂(DSB)，以更高頻率達成靶向編輯。此種核酸酶依賴性靶向編輯亦利用DNA修復機制，例如，對DSB作出反應而發生之非同源末端連接(NHEJ)。藉由NHEJ進行之DNA修復通常會導致少量內源核苷酸之隨機插入或缺失(插入缺失(indel))。與NHEJ介導之修復成對比，修復亦可藉由同源定向修復(HDR)而進行。當存在含有側接有一對同源臂之外源遺傳物質之供體模板時，可藉由HDR將外源遺傳物質引入基因體中，從而引起外源遺傳物質之靶向整合。

在一些實施例中，基因中斷可藉由使用兩個向導RNA使基因體序列缺失而發生。使用CRISPR-Cas基因編輯技術在細胞中產生基因體缺失(例如，剔除細胞中之基因)的方法為已知的(Bauer DE等人, Vis. Exp.2015; 95:e52118)。

能夠引入特異性及靶向DSB之可用核酸內切酶包括但不限於鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)及RNA引導之CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；規律間隔重複短迴文序列簇9)。另外，利用phiC31及Bxb1整合酶之DICE (雙整合酶卡匣交換)系統亦可用於靶向整合。下文詳細揭示一些示例性方法。

CRISPR-Cas9 基因編輯系統

CRISPR-Cas9系統為原核生物中天然存在之防禦機制，已將其重新用作用於基因編輯之RNA引導之DNA靶向平台。該系統依賴於DNA核酸酶Cas9及兩種非編碼RNA，crisprRNA (crRNA)及反式活化RNA (tracrRNA)，以靶向DNA之裂解。CRISPR為規律間隔重複短迴文序列簇之縮寫，此為在細菌及古細菌基因體中發現之DNA序列家族，其含有與先前暴露於細胞之外源DNA (例如，藉由已感染或攻擊原核生物之病毒)具有相似性之DNA片段(間隔子DNA)。原核生物使用此等DNA片段來偵測及破壞再引入後之類似外來DNA，例如，在後續攻擊期間來自類似病毒。CRISPR基因座之轉錄得以形成包含間隔子序列之RNA分子，該RNA分子與能夠識別及切割外來之外源DNA的Cas (CRISPR相關)蛋白締合並靶向該等Cas蛋白。已描述許多類型及類別之CRISPR/Cas系統(參見例如Koonin等人, (2017) Curr Opin Microbiol37:67-78)。

crRNA經由典型地與靶DNA中之20個核苷酸(nt)序列進行瓦生-克立克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)來驅動CRISPR-Cas9複合物之序列識別及特異性。改變crRNA中之5' 20nt序列允許將CRISPR-Cas9複合物靶向特異性基因座。若靶序列後繼之以特異性短DNA模體(序列為NGG)，稱作原型間隔子相鄰模體(PAM)，則CRISPR-Cas9複合物僅結合含有與crRNA之前20 nt序列匹配之DNA序列。

tracrRNA與crRNA之3'端雜交形成RNA雙鏈體結構，該結構由Cas9核酸內切酶結合以形成催化活性CRISPR-Cas9複合物，該複合物接著可使靶DNA裂解。

一旦CRISPR-Cas9複合物在靶位點處與DNA結合，Cas9酶內之兩個獨立核酸酶結構域各自使PAM位點上游之一股DNA裂解，留下雙股斷裂(DSB)，其中兩股DNA終止於鹼基對(平端)。

CRISPR-Cas9複合物在特異性靶位點處與DNA結合且形成位點特異性DSB之後，下一個關鍵步驟為修復DSB。細胞使用兩個主要DNA修復路徑來修復DSB：非同源末端連接(NHEJ)及同源定向修復(HDR)。

NHEJ為在包括非分裂細胞在內之大多數細胞類型中呈現高度活性之穩固修復機制。NHEJ為易錯的且通常可導致在DSB位點處移除或添加一個至數百個核苷酸，但此類修飾典型地＜ 20 nt。由此產生之插入及缺失(插入缺失)可中斷基因之編碼或非編碼區。或者，HDR使用內源或外源提供之一長段同源供體DNA，以高保真度修復DSB。HDR僅在分裂細胞中有活性，且在大多數細胞類型中以相對較低頻率發生。在本揭示案之許多實施例中，NHEJ用作修復操作。

用於 CRISPR 之核酸內切酶

在一些實施例中，Cas9 (CRISPR相關蛋白9)核酸內切酶用於CRISPR方法中，以製造如本文所揭示之基因工程改造之T細胞。Cas9酶可為來自釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)之酶，但亦可使用其他Cas9同源物。應了解，如本文所提供，可使用野生型Cas9或可使用Cas9之修飾型式(例如，Cas9之進化型式，或Cas9直系同源物或變異體)。在一些實施例中，Cas9可用另一種RNA引導之核酸內切酶，諸如Cpf1 (屬於II類CRISPR/Cas系統)替代。

在一些實施例中，CRISPR/Cas系統包含來源於I型、II型或III型系統之組分。CRISPR/Cas基因座之更新分類方案定義1類及2類CRISPR/Cas系統，具有I型至V型或VI型(Makarova等人, (2015) Nat Rev Microbiol, 13(11):722-36；Shmakov等人, (2015) Mol Cell, 60:385-397)。2類CRISPR/Cas系統具有單蛋白效應子。II型、V型及VI型Cas蛋白為單蛋白、RNA引導之核酸內切酶，本文中稱為「2類Cas核酸酶」。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白。Cpf1核酸酶(Zetsche等人, (2015) Cell 163:1-13)與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶結構域。

在一些實施例中，Cas核酸酶來自II型CRISPR/Cas系統(例如，來自CRISPR/Cas9系統之Cas9蛋白)。在一些實施例中，Cas核酸酶來自2類CRISPR/Cas系統(單蛋白Cas核酸酶，諸如Cas9蛋白或Cpf1蛋白)。如本文進一步描述，Cas9及Cpf1蛋白家族為具有DNA核酸內切酶活性之酶，且其可藉由設計適當向導RNA來指導以使所需核酸標靶裂解。

在一些實施例中，Cas核酸酶可包含多於一個核酸酶結構域。舉例而言，Cas9核酸酶可包含至少一個RuvC樣核酸酶結構域(例如，Cpf1)及至少一個HNH樣核酸酶結構域(例如，Cas9)。在一些實施例中，Cas9核酸酶在靶序列中引入DSB。在一些實施例中，Cas9核酸酶經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，Cas9核酸酶經修飾以使得核酸酶結構域之一發生突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，Cas9核酸酶經修飾以不含功能性RuvC樣核酸酶結構域。在其他實施例中，Cas9核酸酶經修飾以不含功能性HNH樣核酸酶結構域。在其中僅一個核酸酶結構域有功能之一些實施例中，Cas9核酸酶為能夠將單股斷裂(「切口」)引入靶序列中之切口酶。在一些實施例中，Cas9核酸酶結構域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶切口酶包含RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。RuvC樣核酸酶結構域中之示例性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9核酸酶)。在一些實施例中，切口酶包含HNH樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。HNH樣核酸酶結構域中之示例性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9核酸酶)。一個實例在下文之表 1中提供(SEQ ID NO: 29)。

在一些實施例中，Cas核酸酶來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。舉例而言，Cas核酸酶為Cas3核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於IV型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於V型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於VI型CRISPR/Cas系統。

向導 RNA (gRNA)

CRISPR技術涉及使用基因體靶向核酸，該核酸可將核酸內切酶引導至靶基因內之特異性靶序列，以在特異性靶序列處進行基因編輯。基因體靶向核酸可為RNA。基因體靶向RNA在本文中稱作「向導RNA」或「gRNA」。向導RNA至少包含與用於編輯之靶基因內之靶核酸序列雜交之間隔子序列，及CRISPR重複序列。

在II型系統中，gRNA亦包含第二個RNA，稱為tracrRNA序列。在II型gRNA中，CRISPR重複序列與tracrRNA序列相互雜交以形成雙鏈體。在V型gRNA中，crRNA形成雙鏈體。在兩個系統中，雙鏈體結合定點多肽，以使得向導RNA及定點多肽形成複合物。在一些實施例中，基因體靶向核酸藉助於其與定點多肽之締合為複合物提供標靶特異性。因此，基因體靶向核酸指導定點多肽之活性。

如一般熟習此項技術者應了解，各向導RNA經設計以包括與其基因體靶序列互補之間隔子序列。參見Jinek等人, Science, 337, 816-821 (2012)及Deltcheva等人, Nature, 471, 602-607 (2011)。

在一些實施例中，基因體靶向核酸(例如，gRNA)為雙分子向導RNA。在一些實施例中，基因體靶向核酸(例如，gRNA)為單分子向導RNA。

雙分子向導RNA包含兩股RNA分子。第一股在5'至3'方向上包含視情況存在之間隔子延伸序列、間隔子序列及最小CRISPR重複序列。第二股包含最小tracrRNA序列(與最小CRISPR重複序列互補)、3' tracrRNA序列及視情況存在之tracrRNA延伸序列。

II型系統中之單分子向導RNA (稱作「sgRNA」)在5'至3'方向上包含視情況存在之間隔子延伸序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子向導連接子、最小tracrRNA序列、3' tracrRNA序列及視情況存在之tracrRNA延伸序列。視情況存在之tracrRNA延伸可包含為向導RNA提供額外功能性(例如，穩定性)之元件。單分子向導連接子連接最小CRISPR重複及最小tracrRNA序列以形成髮夾結構。視情況存在之tracrRNA延伸包括一或多個髮夾。V型系統中之單分子向導RNA在5'至3'方向上包含最小CRISPR重複序列及間隔子序列。

gRNA中之間隔子序列為定義所關注之靶基因之靶序列(例如，DNA靶序列，諸如基因體靶序列)的序列(例如，20個核苷酸之序列)。在一些實施例中，間隔子序列之範圍為15至30個核苷酸。舉例而言，間隔子序列可含有15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，間隔子序列含有20個核苷酸。

「靶序列」在與PAM序列相鄰之靶基因中且為將由RNA引導之核酸酶(例如，Cas9)修飾之序列。「靶序列」在「靶核酸」中所謂的PAM股上，該靶核酸為包含PAM股及互補非PAM股之雙股分子。熟習此項技術者認識到，gRNA間隔子序列與位於所關注之靶核酸之非PAM股中之互補序列雜交。因此，gRNA間隔子序列為靶序列之RNA等效物。舉例而言，若靶序列為5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC**-3' (SEQ ID NO: 18)，則gRNA間隔子序列為5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC**-3' (SEQ ID NO: 15)。gRNA之間隔子經由雜交(亦即，鹼基配對)以序列特異性方式與所關注之靶核酸相互作用。因此，間隔子之核苷酸序列取決於所關注之靶核酸之靶序列而變化。

在本文之CRISPR/Cas系統中，間隔子序列經設計以與靶核酸之區域雜交，該區域位於PAM之5'且由系統中使用之Cas9酶可識別。間隔子可與靶序列完全匹配或可具有錯配。各Cas9酶具有在靶DNA中識別之特定PAM序列。舉例而言，釀膿鏈球菌在靶核酸中識別包含序列5'-NRG-3'之PAM，其中R包含A或G，其中N為任何核苷酸且N緊鄰間隔子序列靶向之靶核酸序列之3'。

在一些實施例中，靶核酸序列之長度為20個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度小於20個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度大於20個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度為至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度為至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸序列具有緊鄰PAM之第一個核苷酸之5'的20個鹼基。舉例而言，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NRG-3'之序列中，靶核酸可為對應於N之序列，其中N可為任何核苷酸，且加下劃線之NRG序列為釀膿鏈球菌PAM。

本文所揭示之向導RNA可經由crRNA中之間隔子序列靶向所關注之任何序列。在一些實施例中，向導RNA之間隔子序列與靶基因中之靶序列之間的互補程度可為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，向導RNA之間隔子序列與靶基因中之靶序列為100%互補的。在其他實施例中，向導RNA之間隔子序列及靶基因中之靶序列可含有至多10個錯配，例如，至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個錯配。

對於本文所提供之gRNA序列中之任一者，未明確指示修飾之彼等意欲涵蓋未修飾之序列及具有任何適合修飾之序列兩者。

本文所揭示之gRNA中之任一者中的間隔子序列之長度可取決於CRISPR/Cas9系統及用於編輯本文亦揭示之靶基因中之任一者的組分。舉例而言，來自不同細菌種類之不同Cas9蛋白具有變化之最佳間隔子序列長度。因此，間隔子序列之長度可為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50個或多於50個核苷酸。在一些實施例中，間隔子序列之長度可為18-24個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列之長度可為19-21個核苷酸。在一些實施例中，間隔子序列可包含20個核苷酸長度。

在一些實施例中，gRNA可為sgRNA，其可在sgRNA序列之5'端包含20個核苷酸之間隔子序列。在一些實施例中，sgRNA可在sgRNA序列之5'端包含少於20個核苷酸之間隔子序列。在一些實施例中，sgRNA可在sgRNA序列之5'端包含多於20個核苷酸之間隔子序列。在一些實施例中，sgRNA在sgRNA序列之5'端包含具有17-30個核苷酸之可變長度間隔子序列。實例在下文之表 1中提供。在此等示例性序列中，「n」之片段係指5'端之間隔子序列。

在一些實施例中，sgRNA在sgRNA序列之3'端不包含尿嘧啶。在其他實施例中，sgRNA可在sgRNA序列之3'端包含一或多個尿嘧啶。舉例而言，sgRNA可在sgRNA序列之3'端包含1-8個尿嘧啶殘基，例如，在sgRNA序列之3'端包含1、2、3、4、5、6、7或8個尿嘧啶殘基。

本文所揭示之gRNA中之任一者，包括sgRNA中之任一者，可為未修飾的。或者，其可含有一或多個修飾之核苷酸及/或修飾之骨架。舉例而言，修飾之gRNA (諸如sgRNA)可包含一或多個2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可位於5'端、3'端或兩端。

在某些實施例中，多於一個向導RNA可與CRISPR/Cas核酸酶系統一起使用。各向導RNA可含有不同靶向序列，以使得CRISPR/Cas系統使多於一個靶核酸裂解。在一些實施例中，一或多個向導RNA可具有相同或不同特性，諸如Cas9 RNP複合物內之活性或穩定性。在使用多於一個向導RNA之情況下，各向導RNA可在相同或不同載體上進行編碼。用於驅動多於一個向導RNA表現之啟動子為相同或不同的。

在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 Reg1基因，例如，靶向 Reg1基因之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5或外顯子6內之位點。此種gRNA可包含與 Reg1基因之外顯子2或外顯子4中之靶序列(完全或部分)互補之間隔子序列或其片段。 Reg1之示例性靶序列及示例性gRNA序列在下文之表 1中提供。

在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 TGFBRII基因，例如，靶向 TGFBRII基因之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5或外顯子6內之位點。此種gRNA可包含與 TGFBRII基因之外顯子4或外顯子5中之靶序列(完全或部分)互補之間隔子序列或其片段。TGFBRII之示例性靶序列及示例性gRNA序列在下文之表 1中提供。

在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 β2M基因，例如，靶向 β2M基因內之適合位點。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。其他gRNA序列可使用位於染色體15上之 β2M基因序列來設計(GRCh38坐標：染色體15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)。在一些實施例中，靶向 β2M基因體區域之gRNA及RNA引導之核酸酶在 β2M基因體區域中產生斷裂，導致 β2M基因中之插入缺失，從而中斷mRNA或蛋白質之表現。

在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 TRAC基因。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之主題及目的。其他gRNA序列可使用位於染色體14上之 TRAC基因序列來設計(GRCh38：染色體14：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)。在一些實施例中，靶向 TRAC基因體區域之gRNA及RNA引導之核酸酶在 TRAC基因體區域中產生斷裂，導致 TRAC基因中之插入缺失，從而中斷mRNA或蛋白質之表現。

示例性間隔子序列及靶向 β2M基因或 TRAC基因之gRNA在下文之表 1中提供。

舉例說明，如下文所說明及此項技術中所述，CRISPR/Cas/Cpf1系統中使用之向導RNA或其他較小RNA可容易地藉由化學方式合成。儘管化學合成程序不斷擴展，但藉由諸如高效液相層析(HPLC，避免使用凝膠，諸如PAGE)之程序純化此類RNA往往變得更具挑戰性，此係因為多核苷酸長度顯著增加超過約一百個核苷酸。一種用於產生更長RNA之方法為產生兩個或更多個接合在一起之分子。更長RNA，諸如編碼Cas9或Cpf1核酸內切酶之彼等，更容易酶促產生。如此項技術中所述，可在RNA之化學合成及/或酶促產生期間或之後引入各種類型之RNA修飾，例如，增強穩定性、降低先天免疫反應之可能性或程度及/或增強其他屬性之修飾。

在一些實例中，本揭示案之gRNA可藉由活體外轉錄(IVT)、合成及/或化學合成方法或其組合來產生。利用酶促(IVT)、固相、液相、組合合成方法、小區域合成及接合方法。在一個實施例中，使用IVT酶促合成方法製造gRNA。藉由IVT製造多核苷酸之方法為此項技術中已知的且描述於WO2013/151666中。因此，本揭示案亦包括用於活體外轉錄本文所述之gRNA的多核苷酸，例如，DNA、構築體及載體。

如此項技術中所述，可在RNA之化學合成及/或酶促產生期間或之後引入各種類型之RNA修飾，例如，增強穩定性、降低先天免疫反應之可能性或程度及/或增強其他屬性之修飾。在一些實施例中，可在合成期間或合成後將非天然修飾之核鹼基引入本文所揭示之gRNA中之任一者中。在某些實施例中，修飾在核苷間鍵、嘌呤或嘧啶鹼基或糖上。在一些實施例中，藉由化學合成或聚合酶在gRNA之末端引入修飾。修飾之核酸及其合成之實例揭示於WO2013/052523中。修飾之多核苷酸之合成亦描述於Verma及Eckstein, Annual Review of Biochemistry, 第76卷, 99-134 (1998)中。

在一些實施例中，酶促或化學接合方法可用於將多核苷酸或其區域與不同功能部分，諸如靶向或遞送劑、螢光標記、液體、奈米粒子等結合。多核苷酸及修飾之多核苷酸之結合物在Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 第1(3)卷, 165-187 (1990)中綜述。

在本揭示案之一些實施例中，用於對本文所揭示之靶基因中之任一者進行基因編輯之CRISPR/Cas核酸酶系統可包括至少一個向導RNA。在一些實例中，CRISPR/Cas核酸酶系統可含有多個gRNA，例如，2、3或4個gRNA。此類多個gRNA可靶向同一靶基因中之不同位點。或者，多個gRNA可靶向不同基因。在一些實施例中，向導RNA及Cas蛋白可形成核糖核蛋白(RNP)，例如，CRISPR/Cas複合物。向導RNA可將Cas蛋白引導至一或多個靶基因上之靶序列，如本文所揭示之彼等，其中Cas蛋白在靶位點處使靶基因裂解。在一些實施例中，CRISPR/Cas複合物為Cpf1/向導RNA複合物。在一些實施例中，CRISPR複合物為II型CRISPR/Cas9複合物。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9蛋白。在一些實施例中，CRISPR/Cas9複合物為Cas9/向導RNA複合物。

在一些實施例中，包含一或多個特異性gRNA之特定CRISPR/Cas核酸酶系統之插入缺失頻率(編輯頻率)可使用TIDE分析來確定，該分析可用於鑑定用於編輯靶基因之高效gRNA分子。在一些實施例中，高效gRNA產生高於80%之基因編輯頻率。例如，若gRNA產生至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%之基因編輯頻率，則認為該gRNA為高效的。

將向導 RNA 及核酸酶遞送至 T 細胞

可將包含一或多個gRNA及至少一個RNA引導之核酸酶，視情況包含如下文所揭示之供體模板的本文所揭示之CRISPR/Cas核酸酶系統遞送至靶細胞(例如，T細胞)，用於經由習用方法對靶基因進行基因編輯。在一些實施例中，可將如本文所揭示之CRISPR/Cas核酸酶系統之組分獨立地、同時或依序遞送至靶細胞。在其他實施例中，可將CRISPR/Cas核酸酶系統之組分一起(例如，作為複合物)遞送至標靶中。在一些情況下，gRNA及RNA引導之核酸酶可預複合在一起以形成核糖核蛋白(RNP)，可將其遞送至靶細胞中。

RNP適用於基因編輯，至少係因為其使富含核酸之細胞環境中發生混雜相互作用之風險降至最低且保護RNA免於降解。用於形成RNP之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，可將含有RNA引導之核酸酶(例如，Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶)及靶向一或多個所關注基因之一或多個gRNA的RNP遞送至細胞(例如，T細胞)。在一些實施例中，可藉由電穿孔將RNP遞送至T細胞。

在一些實施例中，可將RNA引導之核酸酶在DNA載體中遞送至細胞，該DNA載體在細胞中表現RNA引導之核酸酶。在其他實例中，可將RNA引導之核酸酶在編碼RNA引導之核酸酶且在細胞中表現核酸酶之RNA中遞送至細胞。替代地或另外，可將靶向基因之gRNA作為RNA或在細胞中表現gRNA之DNA載體遞送至細胞。

經由直接注射或使用已知方法之細胞轉染，例如電穿孔或化學轉染來進行RNA引導之核酸酶、gRNA及/或RNP之遞送。可使用其他細胞轉染方法。在一些情況下，Cas9酶可形成一個RNP，其具有靶向 TRAC基因、 β2M基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因之所有gRNA且經由一個電穿孔事件遞送至T細胞。或者，Cas9酶可形成兩個或更多個RNP，其共同地包括靶向 TRAC基因、 β2M基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因之所有gRNA。可經由依序電穿孔事件，例如兩個依序電穿孔事件將多個RNP遞送至T細胞。

其他基因編輯方法

除本文所揭示之CRISPR方法以外，如此項技術中已知之額外基因編輯方法亦可用於製造本文所揭示之基因工程改造之T細胞。一些實例包括涉及鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、限制性核酸內切酶、大範圍核酸酶歸巢核酸內切酶及類似物之基因編輯方法。

ZFN為包含與鋅指DNA結合結構域(ZFBD)融合之核酸酶的靶向核酸酶，ZFBD為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之多肽結構域。鋅指為鋅指結合結構域內約30個胺基酸之結構域，其結構經由鋅離子之配位而穩定。鋅指之實例包括但不限於C2H2鋅指、C3H鋅指及C4鋅指。經設計之鋅指結構域為自然界中不存在之結構域，其設計/組成主要源於合理之準則，例如，應用替代規則及電腦化演算法來處理存儲現有ZFP設計及結合數據之資訊的數據庫中之資訊。參見例如美國專利第6,140,081號、第6,453,242號及第6,534,261號；亦參見WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536及WO 03/016496。選定之鋅指結構域為自然界中未發現之結構域，其產生主要源於經驗過程，諸如噬菌體呈現、相互作用阱或雜交選擇。ZFN更詳細地描述於美國專利第7,888,121號及美國專利第7,972,854號中。ZFN之最公認實例為FokI核酸酶與鋅指DNA結合結構域之融合。

TALEN為包含與TAL效應子DNA結合結構域融合之核酸酶的靶向核酸酶。「轉錄活化因子樣效應子DNA結合結構域」、「TAL效應子DNA結合結構域」或「TALE DNA結合結構域」為負責TAL效應蛋白與DNA結合之TAL效應蛋白之多肽結構域。TAL效應蛋白係由黃單胞菌屬之植物病原體在感染期間分泌。此等蛋白質進入植物細胞核，經由其DNA結合結構域結合效應子特異性DNA序列，且經由其反式活化結構域活化此等序列處之基因轉錄。TAL效應子DNA結合結構域之特異性取決於不完全34胺基酸重複之效應子可變數目，該等重複包含選定重複位置處之多態性，稱為重複可變雙殘基(RVD)。TALEN更詳細地描述於美國專利申請案第2011/0145940號中。此項技術中TALEN之最公認實例為FokI核酸酶與TAL效應子DNA結合結構域之融合多肽。

適合用於如本文所提供之用途的靶向核酸酶之額外實例包括但不限於Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1及Wβ/SPBc/TP901-1，無論個別使用抑或組合使用。

本文所揭示之核酸酶中之任一者可使用載體系統遞送，包括但不限於質體載體、DNA微環、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體；疱疹病毒載體及腺相關病毒載體，及其組合。

可使用習用基於病毒及非病毒之基因轉移方法將編碼核酸酶之核酸及供體模板引入細胞(例如，T細胞)中。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、DNA微環、裸核酸及與諸如脂質體或泊洛沙姆(poloxamer)之遞送載體複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒，其在遞送至細胞後具有游離基因體或整合基因體。

核酸之非病毒遞送方法包括電穿孔、脂轉染(lipofection)、顯微注射、生物彈道(biolistics)、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質:核酸結合物、裸DNA、裸RNA、加帽RNA、人工病毒粒子及劑增強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)之聲致穿孔亦可用於遞送核酸。下文提供一些特定實例。

D. 將抗 CD19 CAR 構築體遞送至 T 細胞

在一些實施例中，可藉由熟習此項技術者已知之方法將編碼抗CD19 CAR之核酸引入本文所揭示之基因工程改造之T細胞中之任一者中。舉例而言，可將抗CD19 CAR之編碼序列選殖至載體中，可將該載體引入基因工程改造之T細胞中以用於表現抗CD19 CAR。此項技術中已知之多種不同方法可用於將本文所揭示之核酸或表現載體中之任一者引入免疫效應細胞中。將核酸引入細胞中之方法的非限制性實例包括：脂轉染、轉染(例如，磷酸鈣轉染、使用高度分支之有機化合物之轉染、使用陽離子聚合物之轉染、基於樹枝狀聚合物之轉染、光學轉染、基於粒子之轉染(例如，奈米粒子轉染)，或使用脂質體(例如，陽離子脂質體)之轉染)、顯微注射、電穿孔、細胞擠壓、聲致穿孔、原生質體融合、穿刺轉染、流體動力遞送、基因槍、磁轉染、病毒轉染及核轉染。

在特定實例中，可使用腺相關病毒(AAV)將編碼抗CD19 CAR構築體之核酸遞送至細胞。AAV為小病毒，其以位點特異性方式整合至宿主基因體中且因此可遞送轉殖基因，諸如抗CD19 CAR。反向末端重複(ITR)存在於AAV基因體及/或所關注之轉殖基因側翼且充當複制起點。AAV基因體中亦存在rep及cap蛋白，其在轉錄時形成衣殼，該衣殼囊封AAV基因體以遞送至靶細胞中。此等衣殼上之表面受體賦予AAV血清型，此決定衣殼主要結合哪些靶器官且因此決定AAV最有效地感染哪些細胞。當前已知有十二種人類AAV血清型。在一些實施例中，用於遞送抗CD19 CAR編碼核酸之AAV為AAV血清型6 (AAV6)。

出於若干原因，腺相關病毒為基因療法最頻繁使用之病毒之一。首先，AAV在向哺乳動物(包括人類)投與後不會引起免疫反應。其次，將AAV有效地遞送至靶細胞，特別為在考慮選擇適當AAV血清型時。最後，AAV具有感染分裂細胞及非分裂細胞兩者之能力，此係因為基因體可在宿主細胞中持續存在而無需整合。此種特性使其成為基因療法之理想候選者。

可設計編碼CAR之核酸以插入宿主T細胞中所關注之基因體位點中。在一些實施例中，靶基因體位點可在安全港基因座中。

在一些實施例中，可設計編碼抗CD19 CAR之核酸(例如，經由供體模板，該供體模板可由病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，以使其可插入 TRAC基因內之位置中來中斷基因工程改造之T細胞中之 TRAC基因且表現CAR多肽。 TRAC之中斷導致內源TCR之功能喪失。舉例而言， TRAC基因之中斷可用核酸內切酶，諸如本文所述之彼等及靶向一或多個 TRAC基因體區域之一或多個gRNA產生。對 TRAC基因及本文所揭示之靶區域具有特異性之gRNA中之任一者可用於此目的。

在一些實例中，可藉由同源定向修復或HDR (例如，使用供體模板，該供體模板可為病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體之一部分)來產生 TRAC基因之基因體缺失及由抗CD19 CAR編碼區段進行之置換。在一些實施例中， TRAC基因之中斷可用核酸內切酶，如本文所揭示之彼等及靶向一或多個 TRAC基因體區域且將抗CD19 CAR編碼區段插入 TRAC基因中之一或多個gRNA產生。

如本文所揭示之供體模板可含有抗CD19 CAR之編碼序列。在一些實例中，抗CD19 CAR編碼序列可側接有兩個同源區域以允許使用此項技術中已知之基因編輯方法在所關注之基因體位置處，例如在 TRAC基因處進行有效HDR。在一些實例中，可使用基於CRISPR之方法。在此種情況下，靶基因座處之兩股DNA可由對靶基因座具有特異性之gRNA引導之CRISPR Cas9酶切割。接著進行HDR以修復雙股斷裂(DSB)且插入編碼CAR之供體DNA。為使其正確發生，供體序列經設計具有與靶基因(下文稱為「同源臂」)，諸如 TRAC基因中之DSB位點周圍之序列互補之側翼殘基。此等同源臂充當DSB修復之模板且使HDR成為基本上無錯誤之機制。同源定向修復(HDR)率為突變與切割位點之間距離的函數，因此選擇重疊或附近之靶位點為重要的。模板可包括由同源區域側接之額外序列，或可含有與基因體序列不同之序列，由此允許序列編輯。

或者，供體模板可能不具有與DNA中之靶向位置同源之區域，且可在靶位點處裂解後藉由NHEJ依賴性末端連接進行整合。

供體模板可為單股及/或雙股DNA或RNA，且可呈線性或環狀形式引入細胞中。若以線性形式引入，則可藉由熟習此項技術者已知之方法保護供體序列之末端(例如，免於核酸外切降解)。舉例而言，將一或多個雙去氧核苷酸殘基添加至線性分子之3'末端及/或將自身互補之寡核苷酸連接至一端或兩端。參見例如Chang等人, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963；Nehls等人, (1996) Science272:886-889。保護外源多核苷酸免於降解之額外方法包括但不限於添加末端胺基及使用修飾之核苷酸間連接，諸如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及O-甲基核糖或去氧核糖殘基。

可將供體模板作為具有額外序列，諸如復制起點、啟動子及編碼抗生素抗性之基因之載體分子的一部分引入細胞中。此外，可將供體模板作為裸核酸、作為與諸如脂質體或泊洛沙姆之劑複合之核酸引入細胞中，或可由病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒及整合酶缺陷慢病毒(IDLV))遞送。

在一些實施例中，可將供體模板插入內源啟動子附近(例如，下游或上游)之位點，以使其表現可由內源啟動子驅動。在其他實施例中，供體模板可包含外源啟動子及/或增強子，例如，組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子以控制CAR基因之表現。在一些實施例中，外源啟動子為EF1α啟動子，參見例如下文之表 6中提供之SEQ ID NO:90。可使用其他啟動子。

此外，外源序列亦可包括轉錄或轉譯調控序列，例如，啟動子、增強子、絕緣子、內部核糖體進入位點、編碼2A肽之序列及/或聚腺苷酸化信號。

在一些實施例中，用於遞送抗CD19 CAR之供體模板可為插入有核酸片段之AAV載體，該核酸片段包含抗CD19 CAR之編碼序列，且視情況包含用於表現抗CD19 CAR之調控序列(例如，啟動子，諸如序列表中提供之EF1a啟動子)，其可側接有用於將編碼序列及調控序列插入所關注之基因體基因座中之同源臂。在一些實例中，將核酸片段插入內源 TRAC基因座中，從而中斷 TRAC基因之表現。在特定實例中，核酸可置換 TRAC基因中之片段，例如，包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列之片段。在一些特定實例中，用於遞送抗CD19 CAR之供體模板可包含SEQ ID NO: 91之核苷酸序列，可將其插入中斷之 TRAC基因中，例如，置換SEQ ID NO: 18之片段。

E. 具有多重 基因編輯 之示例性抗 CD19 CAR-T 細胞

應了解，基因中斷包括經由基因編輯進行之基因修飾(例如，使用CRISPR/Cas基因編輯來插入或缺失一或多個核苷酸)。中斷之基因相對於野生型對應物可含有一或多個突變(例如，插入、缺失或核苷酸取代等)，從而實質上降低或完全消除編碼之基因產物的活性。一或多個突變可位於非編碼區，例如啟動子區、調控轉錄或轉譯之調控區、或內含子區中。或者，一或多個突變可位於編碼區中(例如，外顯子中)。在一些情況下，中斷之基因不表現編碼蛋白質或表現水準實質上降低之編碼蛋白質。在其他情況下，中斷之基因以突變形式表現編碼蛋白質，該蛋白質無功能或具有實質上降低之活性。在一些實施例中，中斷之基因為不編碼功能蛋白質之基因。在一些實施例中，包含中斷基因之細胞不表現(例如，在細胞表面處)可偵測水準(例如藉由抗體，例如藉由流式細胞術)之由該基因編碼之蛋白質。不表現可偵測水準之蛋白質的細胞可稱作剔除細胞。舉例而言，若使用特異性地結合β2M蛋白之抗體無法在細胞表面處偵測到β2M蛋白，則具有 β2M基因編輯之細胞可視為 β2M剔除細胞。另一方面，當經由常規方法，例如藉由流式細胞術或免疫染色可偵測到表面受體(例如，抗CD19 CAR)之表面表現時，細胞應視為對表現此種受體呈陽性(+)。

在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體表現抗CD19 CAR，如本文所揭示之彼等(例如，包含SEQ ID NO:73或SEQ ID NO: 74之胺基酸序列、中斷之 TRAC基因、中斷之b2M基因、中斷之 Reg1基因及中斷之 TGFBRII基因)。可將編碼抗CD19 CAR之核苷酸序列插入中斷之 TRAC基因中(例如，置換由下文之表 1中所列之sgRNA靶向之位點)。

本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體可包含中斷之 β2M基因，其包含表 2中所列之一或多個序列；中斷之 TGFBRII基因，其包含表 3中所列之一或多個序列；及/或中斷之 Reg1基因，其包含表 4中所列之一或多個序列。

此種基因工程改造之T細胞群體可包含约50%-99% (例如，約55%至約80%)之CAR ⁺T細胞、約90%-99.9% (例如，約95%至約99.7%)之TCR ^-T細胞、約60%至約90% (例如，約70%至約80%)之β2M ^-T細胞、約70%至約90% (例如，約80%至約90%)之TGFBRII ^-T細胞及/或約90%至約98% (例如，約95%至約98%)之Reg1 ^-T細胞。在一些情況下，基因工程改造之T細胞群體在 TGFBRII基因中可包含約80%至約90% (例如，約85%)之插入缺失頻率。替代地或另外，基因工程改造之T細胞群體在 Reg1基因中可包含約90%至約97% (例如，約95%)之插入缺失頻率。

可將本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞中之任一者懸浮於冷凍保存溶液(例如，CryoStor ^®C55)中以形成醫藥組合物。用於本揭示案之冷凍保存溶液亦可包含腺苷、右旋糖、葡聚糖-40、乳糖酸、蔗糖、甘露糖醇、緩衝劑(諸如N-(2-羥乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸) (HEPES))、一或多種鹽(例如，氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀等)、一或多種鹼(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀等)，或其組合。可將冷凍保存溶液之組分溶解於無菌水(注射品質)中。冷凍保存溶液中之任一者可實質上不含血清(藉由常規方法不可偵測)。

II. CD19+ 癌症之同種異體 CAR-T 細胞療法

本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞可用於消除表現CD19之疾病細胞，諸如CD19+癌細胞。舉例而言，可經由適合途徑，例如靜脈內輸注向需要治療之個體投與有效量之抗CD19 CAR-T細胞。

投與步驟可包括藉由使CAR-T細胞至少部分定位於所需位點，諸如腫瘤位點之方法或途徑將抗CD19 CAR-T細胞置放(例如，移植)至個體中，從而可產生所需作用。可藉由遞送至個體中之所需位置的任何適當途徑投與抗CD19 CAR-T細胞，在該位置處至少一部分植入細胞或細胞組分保持存活。向個體投與後細胞之存活期可短至數小時，例如二十四小時，至數天，至長達數年，或甚至個體之一生，亦即，長期植入。舉例而言，在本文所述之一些態樣中，可經由全身投藥途徑，諸如腹膜內或靜脈內途徑投與有效量之治療性T細胞。

在一些實施例中，全身投與抗CD19 CAR-T細胞，其係指以除向靶位點、組織或器官中直接投與之方式投與細胞群體，使其實際上進入個體之循環系統且因此經歷代謝及其他類似過程。適合之投藥模式包括注射、輸注、滴注或攝入。注射包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、心室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、腦脊髓內及胸骨內注射及輸注。在一些實施例中，途徑為靜脈內。

個體可為需要診斷、治療或療法之任何個體。在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人。抗CD19 CAR-T細胞對於個體而言可為非自體的(「非自身的」，例如，同種異體的、同基因的或異種的)。「同種異體」意指抗CD19 CAR-T細胞不來源於接受治療之個體，而來源於與個體相同物種之不同個體(供體)。供體為並非所治療之個體的個體。供體為並非患者之個體。在一些實施例中，供體為未患有或未疑似患有所治療之癌症的個體。在一些實施例中，使用多個供體，例如，兩個或更多個供體。在一些實施例中，根據本文所述之方法投與之抗CD19 CAR-T細胞群體包含自一或多個供體，例如一或多個健康人類供體獲得之同種異體T細胞。

有效量係指預防或減輕醫學疾患(例如，癌症)之至少一或多種體徵或症狀所需之本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞的量，且涉及足以提供所需作用，例如治療患有醫學疾患之個體之組合物的量。有效量亦包括足以預防或延緩疾病症狀之發展、改變疾病症狀之過程(例如但不限於減緩疾病症狀之進展)或逆轉疾病症狀之量。應了解，對於任何給定之情況，可由一般熟習此項技術者使用常規實驗來確定適當有效量。

使用本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞之治療功效可由熟練之臨床醫師確定。若以有益方式改變(例如，增加至少10%)體徵或症狀中之任一者或全部，如僅舉一例，功能標靶之水準，或者改良或改善其他臨床上接受之疾病(例如，癌症)症狀或標誌物，則治療視為「有效的」。亦可藉由個體未能發生如藉由住院治療或需要醫療干預所評估之惡化來量測功效(例如，疾病之進展停止或至少減緩)。量測此等指標之方法為熟習此項技術者已知的及/或描述於本文中。治療包括對個體疾病之任何治療且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或減緩症狀之進展；或(2)減輕疾病，例如，引起症狀消退；及(3)預防或減少症狀發展之可能性。

本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞之有效量可包含約1x10 ⁷個抗CD19 CAR+細胞至約6x10 ⁸個抗CD19 CAR+細胞，例如，約1x10 ⁷個細胞至約3x10 ⁷個表現抗CD19 CAR之細胞(CAR ⁺細胞)、約3x10 ⁷個細胞至約1x10 ⁸個CAR ⁺細胞、約1x10 ⁸個細胞至約3x10 ⁸個CAR ⁺細胞或約3x10 ⁸個細胞至約6x10 ⁸個CAR ⁺細胞。

在一些實施例中，如本文所揭示之抗CD19 CAR-T細胞可用於在人類患者中消除CD19 ⁺癌細胞及/或治療CD19 ⁺癌症。在一些情況下，人類患者可能患有B細胞惡性病，例如，難治性或復發性B細胞惡性病。如本文所用，「復發性」或「復發」係指在一段時間之完全反應後重新出現之B細胞惡性病，諸如本文所揭示之彼等。進行性疾病係指在最後一次評價(例如，穩定疾病或部分反應)後疾病惡化之情況。此種人類患者可顯示出B細胞惡性病之一或多種症狀，例如，不明原因之體重減輕、疲勞、盜汗、呼吸短促或腺體腫脹。需要抗CD19 CAR T細胞治療之人類患者可藉由常規醫學檢查來鑑定，例如，身體檢查、實驗室測試、活組織檢查(例如，骨髓活組織檢查及/或淋巴結活組織檢查)、磁共振成像(MRI)掃描或超音波檢查。

在一些實施例中，CD19 ⁺B細胞惡性病為非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其為源於B淋巴細胞、T淋巴細胞或自然殺手(NK)細胞之一組異質性惡性病。世界衛生組織(World Health Organization)基於癌症所源於之細胞類型、組織學、突變圖譜及細胞表面上之蛋白質標誌物來定義多於60種不同NHL子類，且NHL為世界範圍內第10大常見惡性病(Chihara等人, 2015；Trask等人, 2012)。NHL佔所有報導之新癌症病例之4.3%且為美國癌症死亡之第8大原因。主要NHL亞型包括瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)及濾泡性淋巴瘤(FL；Teras等人, 2016；Trask等人, 2012)。CD19表現在B細胞惡性病上普遍存在且在惰性及侵襲性NHL亞型當中持續存在(Scheuermann及Racila, 1995)，其已促成CD19定向療法在此等適應症中之發展增加。

在一些實例中，可使用本文所述之方法治療之B細胞惡性病包括但不限於瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、具有MYC及BCL2及/或BCL6重排之高級別B細胞淋巴瘤、轉化型濾泡性淋巴瘤(FL)、3b級FL，或慢性淋巴細胞白血病(CLL)之里克特氏轉化(Richter's transformation)。在一些實例中，B細胞惡性病為DLBCL，例如，高級別DLBCL或DLBCL非特指型(NOS)。在一些實例中，B細胞惡性病為轉化型FL或3b級FL。在一些實例中，人類患者具有至少一個可量測病灶，其為氟去氧葡萄糖正子發射斷層掃描(PET)陽性的。在一些實例中，人類患者可能患有具有大面積呈現形式之難治性NHL疾病(高風險個體)。

DLBCL為最常見之NHL類型，佔經診斷病例之30-40% (Sehn及Gascoyne, 2015)。約30-50%用第一線化學免疫療法實現治愈，該化學免疫療法由利妥昔單抗(rituximab)、環磷醯胺、阿黴素(doxorubicin)、長春新鹼(vincristine)及普賴蘇(prednisone)組成(R-CHOP；Coiffier等人, 2010；Maurer等人, 2016)。然而，約20%對於R-CHOP而言為難治的且30%在完全反應(CR；Maurer等人, 2016)後復發。

FL為異質性疾病，通常為惰性的，且佔報告之NHL之約20%。過程之特徵為對療法有初始反應，繼而復發，且有時轉化為更具侵襲性之淋巴瘤形式。一般認為其在較晚期不可治愈，但對於患有早期疾病且基於濾泡性淋巴瘤國際預後指數評分之風險因子為0至1之個體的10年存活率為71% (Solal-Céligny等人, 2004)。基於組織學評估及中心細胞與中心母細胞之比例將FL分為1-3級，且將3級細分為3a及3b。現將3b級FL視為生物學上獨特之實體，其中t(14;18)及CD10表現頻發缺乏，且p53及MUM1/IRF4表現增加(Horn等人, 2011)。多於500個FL病例之大型回溯性分析進一步確認3b級FL之臨床過程類似於1-2級FL，而3b級FL之臨床過程更類似於DLBCL之臨床過程(Kahl及Yang, 2016；Wahlin等人, 2012)。由於此原因，典型地以類似於DLBCL之方式控制3b級FL (Kahl及Yang, 2016)。

本揭示案亦涵蓋組合療法。舉例而言，本文所揭示之治療性T細胞可與其他治療劑共同使用，用於治療相同適應症，或用於增強治療性T細胞之功效及/或減少治療性T細胞之副作用。

IV. 套組

本揭示案亦提供用於產生基因工程改造之T細胞、治療性T細胞及用於治療用途之套組。

在一些實施例中，本文所提供之套組可包含用於對 Reg1基因、 TGFBRII基因、 TRAC基因及 β2M基因中之一或多者進行基因編輯之組分，且視情況包含將進行基因編輯之免疫細胞群體(例如，白血球單采(leukopak))。白血球單采樣品可為自外周血收集之經富集之白血球去除術產物。其典型地含有多种血細胞，包括單核細胞、淋巴細胞、血小板、血漿及紅血球。用於對靶基因中之一或多者進行基因編輯之組分可包含適合之核酸內切酶，諸如RNA引導之核酸內切酶及一或多個核酸向導，其指導核酸內切酶使一或多個適合之基因體位點裂解。舉例而言，套組可包含Cas酶(諸如Cas 9)及一或多個靶向 Reg1基因、 TGFBRII基因、 TRAC基因及 β2M基因之gRNA。套組中可包含對此等靶基因具有特異性之gRNA中之任一者。

在一些實施例中，本文所提供之套組可包含如本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體，及一或多種用於產生亦如本文所揭示之治療性T細胞之組分。此類組分可包含適合用於基因編輯之核酸內切酶及編碼如本文所揭示之抗CD19 CAR構築體之核酸。CAR編碼核酸可為如本文所揭示之供體模板之一部分，其可含有位於CAR編碼序列側翼之同源臂。在一些情況下，供體模板可由病毒載體，諸如AAV載體攜帶。套組可進一步包含對 TRAC基因具有特異性之gRNA，用於將抗CD19 CAR編碼序列插入 TRAC基因中。

在其他實施例中，本文所揭示之套組可包含如所揭示用於預期治療目的之治療性T細胞群體。

本文所揭示之套組中之任一者可進一步包含用於製造治療性T細胞或治療性T細胞之治療應用的說明書。在一些實例中，所包括之說明書可包含關於使用基因編輯組分對靶基因(例如， Reg1、 TGFBRII、 TRAC基因及 β2M基因)中之一或多者進行基因工程改造之描述。在其他實例中，所包括之說明書可包含如何將編碼CAR構造之核酸引入T細胞中以用於製造治療性T細胞之描述。

或者，套組可進一步包含用於投與如本文所揭示之治療性T細胞以達成預期活性，例如消除由在治療性T細胞上表現之CAR靶向之疾病細胞的說明書。套組可進一步包含基於鑑定個體是否需要治療來選擇適合於治療之個體的描述。與本文所述之治療性T細胞之使用有關的說明書一般包括有關預期治療之劑量、給藥方案及投藥途徑之資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本揭示案之套組中提供之說明書典型地為標籤或包裝插頁上之書面說明書。標籤或包裝插頁指示治療性T細胞用於治療個體之疾病或病症、延遲疾病或病症發作及/或減輕疾病或病症。

本文所提供之套組在適合之包裝中。適合之包裝包括但不限於小瓶、瓶、廣口瓶、軟包裝及類似包裝。亦考慮與特定裝置，諸如用於投與治療性T細胞之輸注裝置組合使用之包裝。套組可具有無菌入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞的小瓶)。容器亦可具有無菌入口。

套組可視情況提供額外組分，諸如緩衝液及解釋性資訊。通常，套組包括容器及在容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。在一些實施例中，本揭示案提供包含上文所述之套組之內容物的製品。

序列表

表 1. sRNA 序列及靶序列

gRNA 序列
名稱	未修飾之序列	修飾之序列
TRACsgRNA	AGAGCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 1)	AGAGCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 2)
TRACsgRNA間隔子	AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO: 3)	AGA*GCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO: 4)
β2MsgRNA	GCUACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 5)	GCUACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 6)
β2MsgRNA間隔子	GCUACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ ID NO: 7)	GCU*ACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ ID NO: 8)
Reg1 sgRNA	ACGACGCGUGGGUGGCAAGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 9)	ACGACGCGUGGGUGGCAAGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 10)
Reg1 sgRNA 間隔子	ACGACGCGUGGGUGGCAAGC (SEQ ID NO: 11)	ACG*ACGCGUGGGUGGCAAGC (SEQ ID NO: 12)
TGFBRII sgRNA	CCCCUACCAUGACUUUAUUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 13)	CCCCUACCAUGACUUUAUUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 14)
TGFBRII sgRNA 間隔子	CCCCUACCAUGACUUUAUUC (SEQ ID NO: 15)	CCC*CUACCAUGACUUUAUUC (SEQ ID NO: 16)
靶序列
向導名稱	靶序列 (PAM)	靶序列 - 無 PAM
TRAC sgRNA	AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 17)	AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (SEQ ID NO: 18)
β2M sgRNA	GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 19)	GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (SEQ ID NO: 20)
Reg1 sgRNA	ACGACGCGTGGGTGGCAAGC(GGG) (SEQ ID NO: 21)	ACGACGCGTGGGTGGCAAGC (SEQ ID NO: 22)
TGFBRII sgRNA	CCCCTACCATGACTTTATTC (TGG) (SEQ ID NO: 23)	CCCCTACCATGACTTTATTC (SEQ ID NO: 24)
示例性 sgRNA 式
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu (SEQ ID NO: 25)
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc (SEQ ID NO: 26)
n _(17-30)guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuug aaaaaguggcaccgagucggugcu _(1-8)(SEQ ID NO: 27)
示例性 Cas9 序列 (spCas9)
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (SEQ ID NO: 28)

*：2'-O-甲基硫代磷酸酯殘基「n」係指5'端之間隔子序列

表 2. 經編輯之 β2M 基因序列 。

描述	序列(缺失由破折號(-)指示；插入由粗體指示)	SEQ ID NO:
β2M基因編輯	CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT	29
β2M基因編輯	CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTC--GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT	30
β2M基因編輯	CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT-----CTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT	31
β2M基因編輯	CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTG GATAGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT	32
β2M基因編輯	CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGC-------------------------GCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT	33
β2M基因編輯	CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTC TGTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT	34

表 3. 中斷之 TGFBRII 基因中之示例性核苷酸序列

描述	基因編輯之序列 ^b	SEQ ID NO
TGFBRII基因編輯	CATGA-------CTGGAAGA	35
TGFBRII基因編輯	CATGAC----TTCTGGAAGA	36
TGFBRII基因編輯	CATGACT---TTCTGGAAGA	37
TGFBRII基因編輯	CATGACTTTA TTTCTGGAAGA	38
TGFBRII基因編輯	CATGACTTT AATTCTGGAAGA	39
TGFBRII基因編輯	CA-----------TGGAAGA
TGFBRII基因編輯	CATGACTT--TTCTGGAAGA	40
TGFBRII基因編輯	CAT------------GAAGA
TGFBRII基因編輯	C------------------A
TGFBRII基因編輯	--------------------
TGFBRII基因編輯	CATGA---------------
TGFBRII基因編輯	CAT---------------GA
TGFBRII基因編輯	CA---------TCTGGAAGA	41
TGFBRII基因編輯	CATGACTTT-TTCTGGAAGA	42
TGFBRII基因編輯	CATGACTTTA-TCTGGAAGA	43
TGFBRII基因編輯	CATGACTTT-------AAGA	44
TGFBRII基因編輯	----------TTCTGGAAGA	45
TGFBRII基因編輯	CATGACTTTA--CTGGAAGA	46

表 4. 中斷之 Reg1 基因中之示例性核苷酸序列

描述	基因編輯之序列 ^b	SEQ ID NO
Reg1基因編輯	GTGGGTGGCA AAGCGGGTGGT	47
Reg1基因編輯	GT-----------GGGTGGT
Reg1基因編輯	-----------GCGGGTGGT
Reg1基因編輯	GTGGGTGGC-AGCGGGTGGT	48
Reg1基因編輯	---------------GTGGT
Reg1基因編輯	GTG--------------GGT
Reg1基因編輯	------------CGGGTGGT
Reg1基因編輯	--------------------
Reg1基因編輯	GTGGGTGGC-----------
Reg1基因編輯	GTGGGTGGCAT AGCGGGTGGT	49
Reg1基因編輯	GTGGGTG-------------
Reg1基因編輯	GTGG----------------
Reg1基因編輯	GTGGGTGG--AGCGGGTGGT	50

表 5. 嵌合抗原受體序列

描述	序列	SEQ ID NO
信號肽	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP	51
信號肽	MALPVTALLLPLALLLHAARP	52
CD8a跨膜結構域	IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY	53
4-1BB核苷酸序列	AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG	54
4-1BB胺基酸序列	KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL	55
CD28核苷酸序列	TCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCC	56
CD28胺基酸序列	SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS	57
CD3-ζ核苷酸序列	CGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA	58
CD3-ζ胺基酸序列	RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	59
抗CD19 VL CDR1 (Kabat)	RASQDISKYLN	60
抗CD19 VL CDR2 (Kabat)	HTSRLHS	61
抗CD19 VL CDR3 (Kabat)	QQGNTLPYT	62
抗CD19 VH CDR1 (Kabat)	DYGVS	63
抗CD19 VH CDR2 (Kabat)	VIWGSETTYYNSALKS	64
抗CD19 VH CDR3 (Kabat)	HYYYGGSYAMDY	65
抗CD19 VL CDR1 (Chothia)	RASQDISKYLN	66
抗CD19 VL CDR2 (Chothia)	HTSRLHS	67
抗CD19 VL CDR3 (Chothia)	QQGNTLPYT	68
抗CD19 VH CDR1 (Chothia)	GVSLPDY	69
抗CD19 VH CDR2 (Chothia)	WGSET	70
抗CD19 VH CDR3 (Chothia)	HYYYGGSYAMDY	71
抗CD19 CAR FMC63-28Z (FMC63-CD8[tm]-CD28[共刺激結構域]-CD3z)	ATGCTTCTTTTGGTTACGTCTCTGTTGCTTTGCGAACTTCCTCATCCAGCGTTCTTGCTGATCCCCGATATTCAGATGACTCAGACCACCAGTAGCTTGTCTGCCTCACTGGGAGACCGAGTAACAATCTCCTGCAGGGCAAGTCAAGACATTAGCAAATACCTCAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACGGTAAAACTCCTCATCTATCATACGTCAAGGTTGCATTCCGGAGTACCGTCACGATTTTCAGGTTCTGGGAGCGGAACTGACTATTCCTTGACTATTTCAAACCTCGAGCAGGAGGACATTGCGACATATTTTTGTCAACAAGGTAATACCCTCCCTTACACTTTCGGAGGAGGAACCAAACTCGAAATTACCGGGTCCACCAGTGGCTCTGGGAAGCCTGGCAGTGGAGAAGGTTCCACTAAAGGCGAGGTGAAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGTCTCGTTGCCCCCAGTCAAAGCCTCTCTGTAACGTGCACAGTGAGTGGTGTATCATTGCCTGATTATGGCGTCTCCTGGATAAGGCAGCCCCCGCGAAAGGGTCTTGAATGGCTTGGGGTAATATGGGGCTCAGAGACAACGTATTATAACTCCGCTCTCAAAAGTCGCTTGACGATAATAAAAGATAACTCCAAGAGTCAAGTTTTCCTTAAAATGAACAGTTTGCAGACTGACGATACCGCTATATATTATTGTGCTAAACATTATTACTACGGCGGTAGTTACGCGATGGATTATTGGGGGCAGGGGACTTCTGTCACAGTCAGTAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGA	72
抗CD19 CAR FMC63-28Z (FMC63-CD8[tm]-CD28[共刺激結構域]-CD3z)胺基酸有信號肽	MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	73 (有信號肽) 74 (無信號肽)
抗CD19 CAR FMC63-28Z (FMC63-CD8[tm]-CD28[共刺激結構域]-CD3z)胺基酸無信號肽	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR	75
抗CD19 scFv編碼序列	GATATTCAGATGACTCAGACCACCAGTAGCTTGTCTGCCTCACTGGGAGACCGAGTAACAATCTCCTGCAGGGCAAGTCAAGACATTAGCAAATACCTCAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACGGTAAAACTCCTCATCTATCATACGTCAAGGTTGCATTCCGGAGTACCGTCACGATTTTCAGGTTCTGGGAGCGGAACTGACTATTCCTTGACTATTTCAAACCTCGAGCAGGAGGACATTGCGACATATTTTTGTCAACAAGGTAATACCCTCCCTTACACTTTCGGAGGAGGAACCAAACTCGAAATTACCGGGTCCACCAGTGGCTCTGGGAAGCCTGGCAGTGGAGAAGGTTCCACTAAAGGCGAGGTGAAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGTCTCGTTGCCCCCAGTCAAAGCCTCTCTGTAACGTGCACAGTGAGTGGTGTATCATTGCCTGATTATGGCGTCTCCTGGATAAGGCAGCCCCCGCGAAAGGGTCTTGAATGGCTTGGGGTAATATGGGGCTCAGAGACAACGTATTATAACTCCGCTCTCAAAAGTCGCTTGACGATAATAAAAGATAACTCCAAGAGTCAAGTTTTCCTTAAAATGAACAGTTTGCAGACTGACGATACCGCTATATATTATTGTGCTAAACATTATTACTACGGCGGTAGTTACGCGATGGATTATTGGGGGCAGGGGACTTCTGTCACAGTCAGTAGT	76
抗CD19 scFv胺基酸序列連接子加下劃線	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT GSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS	77
CD8a細胞外 + CD8a跨膜 + 5'連接子(加下劃線)	GCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGC	78
CD8a細胞外 + CD8a跨膜 (無連接子)	TTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGC	79
CD8a細胞外 + CD8a跨膜	FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNR	80
抗CD19 VH	EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS	81
抗CD19 VL	DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT	82
CD19連接子	GSTSGSGKPGSGEGSTKG	83

表 6. AAV 供體模板序列

名稱	序列	SEQ ID NO:
左ITR (5' ITR)	TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT	84
左ITR (5' ITR) (替代性)	CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT	85
右ITR (3' ITR)	AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA	86
右ITR (3' ITR) (替代性)	AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG	87
TRAC-LHA (800bp)	GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCA	88
TRAC-RHA (800bp)	TGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG	89
EF1a	GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA	90
CD19 LHA至RHA	GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGCTTCTTTTGGTTACGTCTCTGTTGCTTTGCGAACTTCCTCATCCAGCGTTCTTGCTGATCCCCGATATTCAGATGACTCAGACCACCAGTAGCTTGTCTGCCTCACTGGGAGACCGAGTAACAATCTCCTGCAGGGCAAGTCAAGACATTAGCAAATACCTCAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGAACGGTAAAACTCCTCATCTATCATACGTCAAGGTTGCATTCCGGAGTACCGTCACGATTTTCAGGTTCTGGGAGCGGAACTGACTATTCCTTGACTATTTCAAACCTCGAGCAGGAGGACATTGCGACATATTTTTGTCAACAAGGTAATACCCTCCCTTACACTTTCGGAGGAGGAACCAAACTCGAAATTACCGGGTCCACCAGTGGCTCTGGGAAGCCTGGCAGTGGAGAAGGTTCCACTAAAGGCGAGGTGAAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGTCTCGTTGCCCCCAGTCAAAGCCTCTCTGTAACGTGCACAGTGAGTGGTGTATCATTGCCTGATTATGGCGTCTCCTGGATAAGGCAGCCCCCGCGAAAGGGTCTTGAATGGCTTGGGGTAATATGGGGCTCAGAGACAACGTATTATAACTCCGCTCTCAAAAGTCGCTTGACGATAATAAAAGATAACTCCAAGAGTCAAGTTTTCCTTAAAATGAACAGTTTGCAGACTGACGATACCGCTATATATTATTGTGCTAAACATTATTACTACGGCGGTAGTTACGCGATGGATTATTGGGGGCAGGGGACTTCTGTCACAGTCAGTAGTGCTGCTGCCTTTGTCCCGGTATTTCTCCCAGCCAAACCGACCACGACTCCCGCCCCGCGCCCTCCGACACCCGCTCCCACCATCGCCTCTCAACCTCTTAGTCTTCGCCCCGAGGCATGCCGACCCGCCGCCGGGGGTGCTGTTCATACGAGGGGCTTGGACTTCGCTTGTGATATTTACATTTGGGCTCCGTTGGCGGGTACGTGCGGCGTCCTTTTGTTGTCACTCGTTATTACTTTGTATTGTAATCACAGGAATCGCTCAAAGCGGAGTAGGTTGTTGCATTCCGATTACATGAATATGACTCCTCGCCGGCCTGGGCCGACAAGAAAACATTACCAACCCTATGCCCCCCCACGAGACTTCGCTGCGTACAGGTCCCGAGTGAAGTTTTCCCGAAGCGCAGACGCTCCGGCATATCAGCAAGGACAGAATCAGCTGTATAACGAACTGAATTTGGGACGCCGCGAGGAGTATGACGTGCTTGATAAACGCCGGGGGAGAGACCCGGAAATGGGGGGTAAACCCCGAAGAAAGAATCCCCAAGAAGGACTCTACAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCGGAGGCCTACTCAGAAATAGGTATGAAGGGCGAACGACGACGGGGAAAAGGTCACGATGGCCTCTACCAAGGGTTGAGTACGGCAACCAAAGATACGTACGATGCACTGCATATGCAGGCCCTGCCTCCCAGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG	91

一般技術

除非另有指示，否則本揭示案之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，該等技術在此項技術之技能範圍內。此類技術在文獻中有完整解釋，諸如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版 (Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press； Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編, 1984)； Methods in Molecular Biology, Humana Press； Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis編, 1989) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell編, 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel等人編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practice approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)； DNA Cloning: A practical Approach,第I卷及第II卷 (D.N. Glover編 1985)； Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames及S.J. Higgins編 1985)； Transcription and Translation(B.D. Hames及S.J. Higgins編, 1984)； Animal Cell Culture(R.I. Freshney編, 1986)； Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press, 1986)；及B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel等人 (編)。

無需贅述，據信熟習此項技術者基於上述描述可最大限度地利用本發明。因此，以下特定實施例僅解釋為說明性的，而不以任何方式限制本揭示案之其餘部分。本文引用之所有出版物以引用之方式併入以用於本文所提及之目的或主題。

實例 1. 抗 CD19 CAR-T 細胞產生及表徵

產生缺乏 TRAC基因、 β2M基因、 Regnase-1基因及 TGFBRII基因之表現且表現靶向CD19之嵌合抗原受體(CAR)的同種異體人類T細胞。以下sgRNA用於產生：TA-1 (SEQ ID NO: 2) (靶向TRAC以消除TCR α及β鏈之表面表現)、β2M-1 (SEQ ID NO: 6) (靶向β2M以消除I類MHC表面表現)、TGFBRII-5 (SEQ ID NO: 14) (靶向TGFBRII，TGF-β信號傳導抑制劑)及ZC3H12A-10 (SEQ ID NO: 10) (靶向Regnase-1，免疫反應負調控劑)。在 TRAC基因座處之CRISPR-Cas9編輯有助於整合rAAV-138，其編碼SEQ ID NO:73之抗CD19 CAR。具有 TRAC基因、 β2M基因、 Regnase-1基因及 TGFBRII基因剔除之抗CD19 CAR T細胞表示為CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO。

在小規模下及製造規模下各自由3個健康供體產生CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO之非優良製造規範(GMP)批次。小規模批次( 表 7)顯示出55.6 ± 3% CAR細胞表面表現、94.3 ± 3.3%表面TCRαβ損失(無TCRαβ耗竭)、72.8 ± 8.7% B2M表面表現損失，以及對於TGFBRII及Regnase-1分別為84.4 ± 4.3及96.4 ± 1%之插入缺失頻率。製造規模批次( 表 8)顯示出63.3 ± 6.2%細胞表面CAR表現、99.7 ± 0.3%表面TCRαβ損失(有TCRαβ耗竭)、82.8 ± 0.2% β2M表面表現損失，及對於TGFBR2及Regnase-1分別為84.9 ± 3.3及95.3 ± 1.5%之插入缺失頻率。

表 7. 小規模非 GMP 批次

T 細胞批次	供體 1	供體 2	供體 3	平均值	S.D.
% TCRab ^-	91.3	97.8	93.8	94.3	3.3
% β2M ^-	63.8	81.1	73.5	72.8	8.7
% Regnase-1插入缺失	97.0	97.0	95.3	96.4	1.0
% TGFBR2插入缺失	83.6	89.0	80.6	84.4	4.3
% CAR ⁺	57.8	52.1	56.9	55.6	3.1
β2M：β-2微球蛋白；CAR：嵌合抗原受體；GMP：優良製造規範；插入缺失：插入/缺失；Regnase：調控性RNase；S.D.：標準偏差；TCRαβ：T細胞受體α及β鏈；TGFBR2：轉化生長因子β受體2。

將來自3個個別供體之T細胞解凍且在完全補充培養基(含有5%人類AB血清、IL-2及IL-7)中使用TransAct珠粒活化48小時。第2天，用靶向 Regnase-1及 TGFBRII基因座之含有Cas9及gRNA之RNP對T細胞進行電穿孔。接著將經編輯之細胞接種於完全補充培養基中且培養48小時。第4天，用靶向 TRAC及 β2M基因座之含有Cas9及gRNA之RNP對細胞進行電穿孔。此後使用編碼CD19 CAR之含有HDR模板之AAV6培育。第8天，用IL-2及IL-7補充細胞。當細胞達到3 × 10 ⁶個細胞/mL (± 10%)之密度時，將其收集且在CS5緩衝液中以50 × 10 ⁶個細胞/mL冷凍保存。使用針對TRAC及β2M蛋白質之抗體進行染色，而經由用生物素標記之抗獨特型抗體染色來偵測CAR表現，繼而與螢光鏈黴親和素一起培育。藉由將冷凍保存之DP解凍且提取基因體DNA來評估TGFBR2及Regnase-1 gRNA及Cas9之編輯效率。此後進行桑格定序(Sanger sequencing)且使用分解追蹤插入缺失(TIDE)分析進行插入缺失分析。

表 8. 製造規模非 GMP 批次

T 細胞批次	供體1	供體2	供體3	平均值	S.D.
% TCRαβ ^-	99.9	99.9	99.4	99.7	0.3
% B2M ^-	82.6	83.0	82.7	82.8	0.2
% Regnase-1插入缺失	97.1	94.3	94.6	95.3	1.5
% TGFBR2插入缺失	85.8	87.7	81.3	84.9	3.3
% CAR ⁺	56.2	67.6	66.1	63.3	6.2

產生來自3個供體之細胞且如上文所述但在製造水準規模下分析。當細胞達到3 × 10 ⁶個細胞/mL (± 10%)之密度時，亦使此等批次經受TCRαβ耗竭。簡言之，使用磁性管柱藉由與抗TCRαβ-生物素珠粒一起培育，繼而與抗生物素珠粒一起培育來使TCR ⁺細胞耗竭。將TCR耗竭之細胞接種至完全補充培養基中，且在TCR耗竭後16至20小時，收集細胞且在CS5緩衝液中以50 × 10 ⁶個細胞/mL冷凍保存。

實例 2. TGF-β 對活體外細胞擴增之作用

評估TGF-β抑制具有 TRAC、 β2M、Reg1及TGFBRII (R/T)剔除之工程改造之CAR T細胞生長之能力。結果顯示TGF-β能夠抑制來自3個供體之模擬電穿孔之人類T細胞之生長。TGF-β不能抑制經編輯以缺乏TGFBRII (以及TRAC、β2M及Regnase-1基因座中斷)且表現抗CD19 CAR或不表現抗CD19 CAR (無CAR)之T細胞的生長(參見圖 1A-1C)。數據表明TGFBRII中斷消除TGF-β對人類T細胞活體外擴增之抑制作用。

實例 3. 由抗 CD19 CAR T 細胞釋放效應細胞介素

自3個獨特供體產生三批CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞。此類T細胞在CD19陰性K562細胞株存在下不分泌高水準之IFN-γ，但當CD19在K562細胞中表現(K562-CD19)時以及在3種不同人類CD19陽性白血病/淋巴瘤細胞株存在下分泌高水準之IFN-γ ( 圖 2A-2E)。含有TRAC、β2M、Reg1及TGFBRII編輯但插入之CAR除外(無CAR)之細胞不表現顯著水準之IFN-γ。數據表明CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞在CD19存在下選擇性分泌IFN-γ且額外編輯不改變此特異性。

實例 4. 抗 CD19 CAR T 細胞對腫瘤細胞之細胞毒性

評估CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞殺死表現CD19之細胞的能力。自3個獨特供體產生三批CAR T細胞。此類T細胞所顯示之對CD19陰性細胞株K562之細胞毒性活性水準不高於對照細胞，該等對照細胞為模擬電穿孔(模擬)之TCR ⁺T細胞或含有TRAC、β2M、Reg1及TGFBRII編輯但CAR插入除外(無CAR)之細胞。CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞在經工程改造以表現人類CD19 (K562-CD19)之K562細胞中以及對3種不同表現CD19之人類白血病/淋巴瘤細胞株展現出高水準之細胞毒性( 圖 3A-3E)。數據表明CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞選擇性殺死CD19陽性細胞且額外編輯不改變此特異性。

實例 5. 活化之 CAR T 細胞之 RNA 定序

為評估Regnase-1對基因表現之作用，在存在及不存在CD19陽性靶細胞(Nalm6)之情況下在0小時、4小時及24小時對各種工程改造之CAR T細胞進行RNA定序，該等細胞包括單個額外編輯對照(TRAC及β2M中斷之CD19 CAR；TRAC、β2M及TGFBRII中斷之CD19 CAR；及TRAC、β2M、Regnase-1中斷之CD19 CAR)，及CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO (TRAC、β2M、TGFBRII及Regnase-1中斷之CD19 CAR)。將潛在Regnase-1調控基因之清單與文獻中所述之基因對潛在安全影響進行比較。

實例 6. TGFBRII 及 / 或 Regnase-1 剔除 之評估

將NOG小鼠用(A) Nalm6白血病細胞靜脈內接種或(B) Jeko-1細胞皮下接種。以4 × 10 ⁶個CAR ⁺細胞/小鼠向小鼠輸注指定之CAR T細胞，且小鼠之存活率示於圖 4A-4B中。對於兩個模型自3個獨特供體產生CAR T細胞；在各模型中，5隻小鼠用作對照且各研究中之5隻小鼠接受自各供體(總共15個)產生之細胞。對來自指定CAR T細胞組之小鼠之外周血細胞中分離之DNA進行ddPCR (液滴數位聚合酶鏈反應)以偵測整合之CAR ⁺人類細胞。每mg DNA之CAR複本數為指定值 ± S.E.M (平均值之標準誤差) ( 圖 4C-4D)。

結果顯示CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO T細胞中TGFBRII及Regnase-1兩者之進一步基因中斷協同增加免疫受損小鼠中CD19 ⁺Nalm6白血病及Jeko-1淋巴瘤兩個模型之存活率(對於兩個模型， P＜ 0.0001對數秩[Mantel-Cox]檢驗)。儘管TGFBRII或Regnase-1可能個別地增加Jeko-1模型之存活率(分別為 P＜ 0.0006及 P= 0.019)，但單獨編輯不能增加兩個模型中相對於CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO之存活率，亦不能達到高於TGFBRII/Regnase-1雙重缺乏細胞之量值。此增加之功效與Nalm6及Jeko-1兩個模型中CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞相對於僅具有TGFBRII剔除或Regnase-1剔除之CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO T細胞或CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO T細胞之擴增及持久性的協同增加相關聯。此等數據表明TGFBRII及Regnase-1中斷協同作用以增加CAR T細胞之擴增及功能持久性。亦即，TGFBRII及Regnase-1中斷協同增加CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO T細胞對CD19陽性惡性病之效力。

進一步評估顯示具有 TRAC、 β2M及R/T剔除之多株抗CD19 CAR T細胞在雌性及雄性兩種小鼠中持續存在(參見圖 5A-5B)。

實例 7. 抗 CD19 CAR-T 細胞在 CD19 ⁺ 白血病及淋巴瘤異體移植模型 中之治療功效

在腫瘤細胞接種後3天將CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞輸注至帶有Raji-螢光素酶淋巴瘤細胞(播散性)或Nalm6-白血病細胞(播散性)之NSG小鼠中。對於Jeko-1實驗，當腫瘤達到150 mm ³時，將T細胞輸注至帶有Jeko-1淋巴瘤細胞(皮下)之NSG小鼠中。

結果顯示所有3個模型中高水準之腫瘤控制( 圖 6A-6C)。在腫瘤細胞接種(第0天)後顯示存活小鼠中隨時間變化之白血病或淋巴瘤水準。值得注意地，CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞在低於CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO之次有效劑量之劑量(＜4 × 10 ⁶個CAR ⁺細胞/小鼠)下展現出高水準之Jeko-1淋巴瘤模型控制(參見圖 4A-4D)。

進一步顯示具有TRAC、β2M、TGFBRII及Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞當輸注至帶有Nalm6-白血病細胞之NSG小鼠中時在低劑量下為有效的(參見圖 7A-7B)。

實例 8. 具有額外編輯之 CAR T 細胞之毒理學研究

為評估具有TRAC、β2M、TGFBRII及Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞在不存在人類細胞介素之情況下生長之能力，自5個供體產生此類T細胞且將10 × 10 ⁶個細胞置於含有5%人類血清 ± IL-2/IL-7之T細胞培養基中。

結果顯示儘管所有製劑均能夠在細胞介素存在下生長，但無一者在不存在細胞介素之情況下生長( 圖 8)。此等數據表明具有 TRAC、 β2M、 TGFBRII及 Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞需要細胞介素以供生長。

為評估TGFBRII或Regnase-1是否改變與其他人類組織之相互作用，將具有TRAC、β2M、TGFBRII及Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞連同具有TRAC及β2M剔除之抗CD19 CAR T細胞與來源於人類組織(諸如中樞神經系統、心臟、腎、肺、肝、骨骼、皮膚、骨骼肌、腸及血液)之初級細胞一起共同培養隔夜，且量測細胞毒性及細胞介素分泌(IFN-γ、IL-2)。此等實驗將確定TGFBRII及Regnase-1之額外編輯是否潛在地改變與人類組織之反應性。

實例 9. 免疫受損小鼠中之致腫瘤性研究

為支持同種異體CAR T細胞之發育，在NSG小鼠中進行優良實驗室規範(GLP)順應致腫瘤性研究。詳言之，進行12週GLP順應研究以在全身照射(200 cGy總照射劑量)後NOD/SCID/IL2Rγnull (NSG)小鼠中單次靜脈內緩慢團注之後評價具有TRAC、β2M、TGFBRII及Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞之致腫瘤潛力( 表 9)。對於所有組，劑量體積為250 μL/小鼠。在160 cGy/分鐘之速率及靶向之LD _0/140下遞送輻射。

表 9. GLP 致腫瘤性研究 設計

測試物品	劑量水準(細胞/小鼠)	總照射劑量(cGy)	動物數	終點
雄性	雌性
媒劑 - 無RT ^a	0	0	5	5	臨床觀測、體重、存活率、血液學、血清化學、組織病理學、暴露(ddPCR、IHC、細胞介素)
媒劑 - RT ^b	0	200	12	12
CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO	0.5 × 10 ⁶	12	12
CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO	1 × 10 ⁷	12	12
cGy：厘戈瑞(Centigray)；ddPCR：液滴數位聚合酶鏈反應；GLP：優良實驗室規範；IHC：免疫組織化學；PBS：磷酸鹽緩衝鹽水；RT：輻射處理。 ^a未對動物進行照射且未施用細胞(投與PBS)。 ^b對動物進行照射但未施用細胞(投與PBS)。

評估額外病理學及組織病理學終點以評價CAR T細胞之耐受性；然而，因為NSG小鼠不產生B細胞(CD19抗原之主要來源)，所以此等結果應僅解釋為反映一般脫靶耐受性，應了解，預期歸因於人類CD19抗原之缺乏在此模型中不發生CAR T細胞擴增。此研究之主要終點為存活率、臨床觀測、體重量測及組織病理學(參見表 10)。藉由ddPCR在小鼠血液中且藉由免疫組織化學在組織中評估CAR T細胞暴露。

表 10. GLP 致腫瘤性 終點

終點	檢定形式	時間點
臨床觀測	籠旁觀測	每天1-2次
外周血暴露	ddPCR	第7天、第15天、第29天、第43天、第71天、第84天
組織病理學	FFPE、H&E	第84天
外周血細胞介素(人類細胞介素)	Luminex (IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF)	第84天
組織暴露	hCD45及hTCR之IHC	第84天
ddPCR：液滴數位聚合酶鏈反應；FFPE：福馬林(formalin)固定石蠟包埋；GM-CSF：顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子；H&E：蘇木精及曙紅染色；hCD45：人類CD45蛋白；hTCR：人類T細胞受體蛋白；IFN-γ：干擾素γ；IHC：免疫組織化學；IL：介白素；TNF-α：腫瘤壞死因子α。

死亡率：在用低劑量之CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)處理之動物中存在5/24例死亡(2/12例雄性及3/12例雌性)，始於第69天。在用高劑量之CAR T細胞(1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)處理之動物中觀測死亡率，其中第51天開始過早處死12/12例雄性及9/12例雌性，且第66天發現1/12例雌性死亡( 圖 9)。歸因於尾部或後肢疑似骨折、駝背、收腹或活動困難，處死來自低劑量組之動物。歸因於前述臨床體徵，過早處死來自高劑量組之動物，另外發現在8/12例雄性及4/9例處死之雌性中尾部疑似骨折。來自高劑量組之額外展現之臨床體徵包括但不限於：經1週時段＞20%體重損失、眼及鼻周圍之滲出物、偶發性呼吸窘迫(呼吸困難)以及食物及水消耗量減少。微觀病理學揭露檢查之所有組織中之廣泛單核細胞炎症。單核細胞浸潤液中之細胞常常展現出對hCD45抗原之陽性反應及在較小程度上對hTCR抗原之陽性反應，從而指示該等細胞來源於輸注之人類細胞。兩個媒劑處理組中之所有動物均存活直至第84天進行預定屍體剖檢。

臨床觀測：第32天開始，用低劑量之CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)處理之幾乎所有動物均展現出臨床體徵，包括：眼部異常(部分/完全閉合及/或凹陷)、立毛、駝背、活力下降、虛弱、呼吸窘迫(20/24隻動物呼吸困難及/或11/24隻動物速率增加)及協調性缺乏。另外，第69天開始在11/24隻動物之後肢或尾部觀測到偶發性骨折。在低劑量組中，臨床體徵伴有體重損失，此有必要在第69天與第81天之間過早處死5/24隻動物。在用低劑量(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)及高劑量(1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)處理之動物中觀測到體重變化減小(參見圖 10)。在媒劑處理之動物中不存在顯著體重變化。

用高劑量(1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)處理之幾乎所有動物均呈現出類似但更嚴重之臨床體徵且更早出現。第6天開始，動物展現出駝背，繼之以第30天開始之低劑量組之前述臨床體徵。另外，來自高劑量組之動物展現出14/24隻動物之後肢或尾部疑似骨折、3/24隻動物震顫及3/24隻動物呼吸微弱。此等臨床體徵伴有嚴重體重損失，導致在第51天與第80天之間過早處死22/24隻動物。

臨床病理學：在存活直至第84天進行預定屍體剖檢之動物中評價血液學。接受低劑量(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)之動物歸因於明顯更高之嗜中性球(雄性及雌性中12x)及淋巴細胞(雄性中132x、雌性中142x)計數而觀察到明顯更高之總白血球計數(雄性中48x、雌性中36x)，當與經照射之對照組相比時來自大型未染色細胞及嗜鹼性球之貢獻最小(至多2x)。據發現比經照射之對照組高至多2倍之額外血液學參數包括略微更高之網狀細胞計數，從而導致最低程度上更高之平均血球體積、略微更高之紅血球分佈寬度及血紅素分佈寬度以及血小板分佈寬度。

大體病理學：與投與CAR T細胞相關之宏觀觀測存在於骨骼、肺與支氣管、皮膚及皮下層中，且認為與GvHD相容之炎症有關。脾腫大亦存在於接受低劑量或高劑量(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠或1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)之大多數動物中，此在微觀上與以中度至重度反應性表現hCD45之單核細胞及以最小至明顯反應性表現hTCR之細胞的輕度至明顯浸潤液相關聯。

微觀病理學：炎症之微觀觀測存在於接受低劑量(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)或高劑量(1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)之一些動物之皮膚及皮下層及/或肺及/或骨骼(具有或不具有增加之骨骼重塑)及/或眼及/或心臟及/或輸注/注射部位及/或鼻及/或尾部及/或肛門中，在接受低劑量之1隻雄性中造血組織壞死。單核細胞浸潤液存在於接受低劑量或高劑量之一些動物之腎上腺、骨髓、腦、十二指腸、大腸、附睪、食道、眼、膽囊、心臟、輸注/注射部位、腎、肝、肺、各種淋巴結、乳腺、鼻、嗅球、視神經、卵巢、胰臟、垂體腺、前列腺、下頜唾液腺、坐骨神經、精囊、骨骼肌(股骨)、皮膚及皮下層、脊髓(頸椎、胸椎、腰椎)、脾、胃、睪丸、胸腺、甲狀腺、舌、氣管、膀胱、子宮/子宮頸及陰道中。單核細胞浸潤液中之細胞常常展現出對hCD45抗原之陽性反應及在較小程度上對hTCR抗原之陽性反應，從而指示該等細胞來源於輸注之人類細胞。在用CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞處理之任何動物中未發現腫瘤或贅生性病灶。

器官重量：在存活直至第84天進行預定屍體剖檢之動物中評估器官重量。與經照射之對照動物相比，與投與CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞有關之器官重量增加存在於接受低劑量(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)及高劑量(1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)之CAR T細胞之動物之脾、胸腺及腎上腺中，且認為與因CAR T細胞植入所致之單核細胞浸潤液有關。

血液中之CAR T細胞暴露：在用低劑量處理之12/17隻動物中及用高劑量處理之19/19隻動物中在所評估之第一時間點(投與後第8天)藉由ddPCR偵測循環CAR T細胞( 圖 11)。第15天，在所有檢定之動物樣品中偵測到循環CAR T細胞且在整個研究過程中維持。

實例 10. 活體外混合淋巴細胞反應研究

在MLR檢定中評估具有TRAC、β2M、TGFBRII及Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞與PBMC之間的相互作用。將CAR T細胞與PBMC及/或子組一起共同培養，且與用CAR T細胞建立之共同培養物相比活體外評估同種異體細胞之增殖或細胞毒性。

結果示於圖 12中。在具有TRAC及β2M剔除且具有或不具有額外 TGFBRII及 Regnase-1剔除之抗CD19 CAR T細胞中展現出可比之同種異體MLR反應。

實例 11. 活體外自然殺手 細胞排斥

為評估同種異體NK細胞使抗CD19 CAR T細胞溶解之能力，將來自3個獨特健康供體之具有 TRAC及 β2M剔除且具有或不具有額外TGFBRII及Regnase-1剔除之CAR T細胞以及β2M ⁺對照細胞(未編輯之CAR T細胞)與來自2個獨特供體之同種異體NK細胞一起共同培養隔夜且進行基於流式細胞術之細胞毒性檢定。溶解之T細胞之百分比示於圖 13中。

結果顯示具有TRAC及β2M剔除且不具有R/T剔除(β2M陰性平均值66%)之抗CD19 CAR T細胞及具有TRAC、β2M及R/T剔除(β2M陰性平均值64%)之抗CD19 CAR T細胞顯示出由NK細胞以可比方式溶解。與未編輯(β2M ⁺)之CAR T細胞來自相同健康供體之對照同種異體細胞在類似水準下不溶解。具有額外R/T剔除之CAR T細胞相對於不具有額外R/T剔除之CAR T細胞不顯示出對NK介導之攻擊的任何明顯抗性。另外，具有或不具有額外R/T剔除之CAR T細胞同樣顯示出可比之同種異體T細胞反應(參見圖 14A-14B)。其他實施例

本說明書中揭示之所有特徵可按任何組合形式組合。本說明書中揭示之各特徵可由用於相同、等效或類似目的之替代性特徵代替。因此，除非另有明確規定，否則所揭示之各特徵僅為一系列通用之等效或類似特徵之實例。

自以上描述，熟習此項技術者可容易地確定本發明之基本特徵，且在不脫離其精神及範疇之情況下，可對本發明進行各種改變及修改以使其適於各種用途及條件。因此，其他實施例亦在申請專利範圍內。等效物

儘管本文已描述及說明若干發明性實施例，但一般熟習此項技術者將容易地設想用於執行功能及/或獲得結果之多種其他方式及/或結構及/或本文所述之一或多個優點，且此類變化及/或修改中之每一者應視為在本文所述之發明性實施例之範疇內。更一般而言，熟習此項技術者將容易地了解，本文所述之所有參數、尺寸、材料及配置意欲為示例性的且實際參數、尺寸、材料及/或配置將取決於使用發明性教義之特定應用。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之特定發明性實施例之許多等效物。因此，應了解，前述實施例僅以實例之方式呈現，且在所附申請專利範圍及其等效物之範疇內，可按不同於特定描述及主張之方式來實踐發明性實施例。本揭示案之發明性實施例涉及本文所述之各個別特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法之任何組合包括於本揭示案之發明範疇內。

如本文所定義及使用之所有定義應理解為主導字典定義、以引用之方式併入之文獻中之定義及/或所定義之術語的普通含義。

本文所揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案關於各自引用之主題以引用之方式併入，在一些情況下可涵蓋文獻全文。

除非有相反明確指示，否則如本文在說明書及申請專利範圍中使用之不定冠詞「一個」及「一種」應理解為「至少一個/種」。

如本文在說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應理解為意指如此聯合之要素中之「任一者或兩者」，亦即，在一些情況下聯合存在且在其他情況下分開存在之要素。以「及/或」列出之多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此聯合之要素中之「一或多者」。除由「及/或」條款特定標識之要素以外，可視情況存在其他要素，無論與彼等特定標識之要素相關抑或不相關。因此，作為一個非限制性實例，當與諸如「包含」之開放式語言聯合使用時，對「A及/或B」之引用在一個實施例中可指代僅A (視情況包括除B以外之要素)；在另一個實施例中，僅B (視情況包括除A以外之要素)；在又一個實施例中，A及B兩者(視情況包括其他要素)；等。

如本文在說明書及申請專利範圍中使用之「或」應理解為具有與如上文所定義之「及/或」相同之含義。舉例而言，當分隔清單中之項目時，「或」或「及/或」應解釋為包括性的，亦即，包括許多或一系列要素中之至少一者，但亦包括多於一者，且視情況包括額外未列出之項目。僅有相反明確指示之術語，諸如「僅一個」或「恰好一個」，或當在申請專利範圍中使用時，「由……組成」將指代恰好包括許多或一系列要素中之一個要素。一般而言，如本文使用之術語「或」當前置有排他性術語，諸如「任一個」、「其中一個」「僅一個」或「恰好其中一個」時，僅應解釋為指示排他性替代方案(亦即，「一者或另一者，而非兩者」)。「基本上由……組成」當在申請專利範圍中使用時，應具有專利法領域中使用之普通含義。

如本文使用之術語「約」意指在一般熟習此項技術者確定之特定值之可接受誤差範圍內，此將部分取決於量測或確定該值之方式，亦即，量測系統之限制。举例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意指在可接受之標準偏差內。或者，「約」可意指给定值之至多± 20%、較佳至多± 10%、更佳至多± 5%且甚至更佳至多± 1%之範圍。在申請案及申請專利範圍中描述特定值之情況下，除非另有規定，否則術語「約」為隱含的且在此情形中意指在對於特定值可接受之誤差範圍內。

如本文在說明書及申請專利範圍中使用，關於一或多個要素之清單的片語「至少一個」應理解為意指選自要素清單中之任何一或多個要素的至少一個要素，但不一定包括要素清單內特定列出之每個要素中之至少一者，且不排除要素清單中之要素的任何組合。此定義亦允許除片語「至少一個」所指之要素清單內特定標識之要素以外的要素可視情況存在，無論與彼等特定標識之要素相關抑或不相關。因此，作為一個非限制性實例，「A及B中之至少一者」(或等效地「A或B中之至少一者」，或等效地「A及/或B中之至少一者」)在一個實施例中可指代至少一個，視情況包括多於一個A，不存在B (且視情況包括除B以外之要素)；在另一個實施例中，至少一個，視情況包括多於一個B，不存在A (且視情況包括除A以外之要素)；在又一個實施例中，至少一個，視情況包括多於一個A，及至少一個，視情況包括多於一個B (且視情況包括其他要素)；等。

亦應了解，除非有相反明確指示，否則在本文主張之包括多於一個步驟或動作之任何方法中，方法之步驟或動作之次序不一定限於敘述方法之步驟或動作的次序。

無

圖 1A-1C說明 TGFBRII中斷消除TGF-β對細胞擴增之抑制。圖 1A：TGF-β對模擬電穿孔之人類T細胞生長之抑制。圖 1B：經編輯以缺乏TGFBRII (連同TRAC、β2M及Regnase-1基因座之中斷)而無CAR之T細胞生長之TGF-β抑制的消除。圖 1C：經編輯以剔除 TGFBRII(連同 TRAC、 B2M及 Regnase-1基因座之中斷)且表現抗CD19 CAR [CAR-T (R/T)]之T細胞生長之TGF-β抑制的消除，R/T係指 Reg1及 TGFBRII之中斷。

圖 2A-2E說明抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞在CD19表現存在下選擇性分泌IFN-γ。圖 2A：在CD19陰性K562細胞株存在下無高水準之IFN-γ分泌。圖 2B：當CD19在K562細胞中表現(K562-CD19)時高水準之IFN-γ分泌。圖 2C：人類CD19陽性Raji-螢光素酶淋巴瘤細胞中高水準之IFN-γ分泌。圖 2D：人類CD19陽性Nalm6-白血病細胞中高水準之IFN-γ分泌。圖 2E：人類CD19陽性Jeko-1淋巴瘤細胞中高水準之IFN-γ分泌。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 3A-3E說明抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞以高水準之細胞毒性特異性殺死表現CD19之細胞。圖 3A：對CD19陰性細胞株K562之細胞毒性活性水準不高於對照細胞 - 模擬(模擬電穿孔之TCR ⁺T細胞)或無CAR (含有TRAC、β2M及R/T編輯但CAR插入除外之細胞)。圖 3B：經工程改造以表現人類CD19之K562細胞(K562-CD19)中高水準之細胞毒性。圖 3C：人類CD19陽性Raji-螢光素酶淋巴瘤細胞中高水準之細胞毒性。圖 3D：人類CD19陽性Nalm6-白血病細胞中高水準之細胞毒性。圖 3E：人類CD19陽性Jeko-1淋巴瘤細胞中高水準之細胞毒性。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 4A-4D說明R/T中斷協同增加抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞對CD19陽性惡性病之效力。圖 4A：CD19 ⁺Nalm6白血病小鼠之存活率(存活概率)增加。圖 4B：CD19 ⁺Jeko-1淋巴瘤小鼠之存活率(存活概率)增加。圖 4C：Nalm6模型中抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞相對於抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO T細胞或抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + TGFBR2 KO T細胞或抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + Regnase-1 KO T細胞之擴增及持久性(CAR複本/μg DNA)增加。圖 4D：Jeko-1模型中抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + R/T KO T細胞相對於抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO T細胞或抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + TGFBR2 KO T細胞或抗CD19 CAR + TRAC KO + β2M KO + Regnase-1 KO T細胞之擴增及持久性(CAR複本/μg DNA)增加。CAR-T係指具有中斷之 TRAC及 B2M之抗CD19 CAR-T細胞。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 5A-5B說明具有 TRAC、 β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之多株抗CD19 CAR T細胞持續存在於雌性( 圖 5A)及雄性( 圖 5B)小鼠中。

圖 6A-6C說明抗CD19 CAR + TRACKO + β2MKO + Reg1 KO + TGFBRII KO T細胞在低細胞劑量下控制白血病/淋巴瘤。圖 6A：Raji-螢光素酶淋巴瘤細胞中高水準之腫瘤控制。圖 6B：Nalm6-白血病細胞中高水準之腫瘤控制。圖 6C：在低於僅具有TRAC及β2M剔除之抗CD19 CAR T細胞之次有效劑量之劑量下Jeko-1淋巴瘤模型中高水準之腫瘤控制。BLI：生物發光成像。

圖 7A-7B說明具有 TRAC、 β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞( 圖 7A)相對於僅具有 TRAC及 β2M剔除之抗CD19 CAR T細胞( 圖 7B)在更低劑量下有效治療Nalm6-白血病小鼠。

圖 8說明具有 TRAC、 β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞需要細胞介素以供細胞生長。

圖 9說明NSG小鼠中使用具有 TRAC、 β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞之GLP順應致腫瘤性研究。GLP：優良實驗室規範；RT：輻射療法。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 10說明經低劑量(0.5 × 10 ⁶個細胞/小鼠)及高劑量(1 × 10 ⁷個細胞/小鼠)之具有TRAC、β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞處理之小鼠的體重變化。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 11說明小鼠血液中具有TRAC、β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞之暴露。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 12說明活體外在具有或不具有進一步 Reg1及 TGFBRII剔除之情況下具有 TRAC及 β2M剔除之抗CD19 CAR T細胞引發可比之同種異體混合淋巴細胞反應(MLR)響應。CAR-T係指具有中斷之 TRAC及 B2M之抗CD19 CAR-T細胞。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 13A-13B說明來自供體1 ( 圖 13A)及供體2 ( 圖 13B)之同種異體自然殺手(NK)細胞可活體外使僅具有 TRAC及 β2M剔除之抗CD19 CAR T細胞或具有 TRAC、 β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞溶解。CAR-T係指具有中斷之 TRAC及 B2M之抗CD19 CAR-T細胞。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

圖 14A-14C說明由僅具有TRAC及β2M剔除之抗CD19 CAR T細胞或具有 TRAC、 β2M、 Reg1及 TGFBRII剔除之抗CD19 CAR T細胞活體內引發之對來自供體1 ( 圖 14A)、供體2 ( 圖 14B)及供體3 ( 圖 14C)之同種異體NK及T細胞的可比反應。CAR-T係指具有中斷之 TRAC及 B2M之抗CD19 CAR-T細胞。CAR-T (R/T)係指具有中斷之 TRAC、 B2M、 Reg1及 TGFBRII之抗CD19 CAR-T細胞。

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Claims

一種基因工程改造之T細胞群體，該群體包含： (i) 中斷之T細胞受體α鏈恆定區( TRAC)基因， (ii) 中斷之β-2-微球蛋白( β 2M)基因， (iii) 中斷之 Regnase-1( Reg1)基因， (iv) 中斷之轉化生長因子β受體II ( TGFBRII)基因，及 (v) 編碼結合人類CD19之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD19 CAR)之核酸，其中該抗CD19 CAR包含結合CD19之單鏈可變片段(scFv) (抗CD19 scFv)、CD28之共刺激結構域及CD3ζ細胞質信號傳導結構域，該抗CD19 scFv包含重鏈可變區(V _H)，其包含與SEQ ID NO: 81中之彼等相同之重鏈互補決定區(CDR)，及(ii)輕鏈可變區(V _L)，其包含與SEQ ID NO: 82中之彼等相同之輕鏈CDR；且其中編碼該抗CD19 CAR之該核酸插入該中斷之 TRAC基因處。
如請求項1之基因工程改造之T細胞群體，其中該群體中至少50%之該等T細胞表現該抗CD19 CAR，其中該群體中至少90%之該等T細胞為TCR ^-，其中該群體中至少60%之該等T細胞為β2M ^-，其中該群體中至少80%之該等T細胞為TGFBRII ^-，及/或其中該群體中至少90%之該等T細胞為Reg1 ^-。
如請求項2之基因工程改造之T細胞群體，其中： (a) 至少75之該等T細胞表現該抗CD19 CAR； (b) 至少99之該等T細胞為TCR ^-； (c) 約65%至約80之該等T細胞為β2M ^-； (d) 約80%至約90之該等T細胞為TGFBRII ^-；及/或 (e) 約95%至約97之該等T細胞為Reg1 ^-。
如請求項1至3中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該抗CD19 scFv包括包含SEQ ID NO: 81之胺基酸序列之V _H及包含SEQ ID NO: 82之胺基酸序列之V _L。
如請求項4之基因工程改造之T細胞群體，其中該抗CD19 scFv包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列。
如請求項1之基因工程改造之T細胞群體，其中該抗CD19 CAR包含SEQ ID NO: 74之胺基酸序列。
如請求項1至6中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中在該 TRAC基因中包含SEQ ID NO: 18之核苷酸序列之片段缺失且由編碼該抗CD19 CAR之該核酸置換。
如請求項7之基因工程改造之T細胞群體，其中該中斷之 TRAC基因包含SEQ ID NO: 91之核苷酸序列。
如請求項1至8中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等T細胞中之該中斷之 β 2M基因包含表 2中所列之核苷酸序列中之一或多者。
如請求項1至9中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等T細胞中之該中斷之 Reg1基因包含表 4中所列之核苷酸序列中之一或多者。
如請求項1至10中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等T細胞中之該中斷之 TGFBRII基因包含表 3中所列之核苷酸序列中之一或多者。
如請求項1至11中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等T細胞為初級人類T細胞。
如請求項1至12中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等T細胞來源於一或多個健康人類供體。
一種用於治療CD19 ⁺癌症之方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之如請求項1至13中任一項之基因工程改造之T細胞群體。
如請求項14之方法，其中該個體為患有B細胞惡性病之人類患者。
如請求項15之方法，其中該B細胞惡性病為難治性或復發性B細胞惡性病。
如請求項15或請求項16之方法，其中該B細胞惡性病為非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)，視情況選自由以下組成之群：瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，視情況為DLBCL非特指型(NOS)；具有 MYC及 BCL2及/或 BCL6重排之高級別B細胞淋巴瘤；轉化型濾泡性淋巴瘤(FL)；及3b級FL。
如請求項14至17中任一項之方法，其中該基因工程改造之T細胞群體之該有效量在約1x10 ⁷至約6x10 ⁸個CAR ⁺T細胞之範圍內。
一種用於製備如請求項1之基因工程改造之T細胞群體之方法，該方法包括： (a) 提供複數個細胞，該等細胞為T細胞或其前驅細胞； (b) 對該複數個細胞之 TRAC基因、 β 2M基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因進行基因編輯；及 (c) 將編碼抗CD19 CAR之核酸遞送至該複數個細胞中，其中編碼該抗CD19 CAR之該核酸插入該 TRAC基因中，從而產生該基因工程改造之T細胞群體。
如請求項19之方法，其中步驟(a)中之該複數個細胞為初級人類T細胞。
如請求項20之方法，其中該等初級人類T細胞係來自一或多個健康人類供體。
如請求項19至21中任一項之方法，其中該 TRAC基因、該 β 2M基因、該 Reg1基因及該 TGFBRII基因之該基因編輯係由一或多個CRISPR/Cas9基因編輯系統進行。
如請求項22之方法，其中該一或多個CRISPR/Cas9基因編輯系統包含： (a) RNA引導之核酸酶， (b) 靶向 TRAC之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 3之間隔子， (c) 靶向 β2M之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 7之間隔子， (d) 靶向 Reg1之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 11之間隔子，及 (e) 靶向 TGFBRII之向導RNA，其包含SEQ ID NO: 15之間隔子。
如請求項23之方法，其中該RNA引導之核酸酶為Cas9核酸酶。
如請求項24之方法，其中該Cas9核酸酶為釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9核酸酶。
如請求項23至25中任一項之方法，其中(b)-(e)之該RNA引導之核酸酶及該向導RNA形成一或多個核糖核蛋白粒子，該一或多個核糖核蛋白粒子係藉由一或多個電穿孔事件遞送至該複數個細胞。
如請求項19至26中任一項之方法，其中編碼該抗CD19 CAR之該核酸係在AAV載體中。
如請求項19至27中任一項之方法，其中編碼該抗CD19 CAR之該核酸包含位於編碼CAR之核苷酸序列側翼之左同源臂及右同源臂；且其中該左同源臂及該右同源臂與該 TRAC基因中之基因體基因座同源，從而允許將該核酸插入該 TRAC基因中之該基因體基因座中。