TW202346575A - 具有ｒｅｇｎａｓｅ－１及／或ｔｇｆｂｒｉｉ破壞的抗ｃｄ８３ ｃａｒ－ｔ細胞 - Google Patents

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雪塔 辛格
喬納森 特雷特
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Abstract

一種基因工程改造之T細胞群體，該群體包含編碼抗CD83 CAR之核酸、中斷之 Reg1基因及/或中斷之 TGFBRII基因。此類基因工程改造之T細胞可包含進一步基因修飾，例如，中斷之 CD83基因。該基因工程改造之T細胞群體與非工程改造之T細胞對應物相比展現出以下一或多項：(a)改良之細胞生長活性；(b)增強之持久性；及(c)減少之T細胞衰竭，(d)增強之細胞毒性活性，(e)抵抗TGF-β誘導之抑制作用，及(f)抵抗纖維母細胞及/或由此分泌之抑制因子的抑制作用。

Description

具有Regnase-1及/或TGFBRII中斷之抗CD83　CAR-T細胞
本發明關於一種用於製造基因工程化CAR-T細胞之方法。
嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法使用基因修飾之T細胞以更特異性地且有效地靶向及殺死病原細胞。自血液中收集T細胞後，對細胞進行工程改造以在其表面上包括CAR。可使用CRISPR/Cas9基因編輯技術將CAR引入T細胞中。當將此等同種異體CAR T細胞注射至患者體內時，受體使T細胞能夠殺死癌細胞。
在CAR T療法中需要具有改良之培養持久性的T細胞。此類T細胞在活體外及活體內均存活更長時間，從而為CAR T細胞製造及臨床應用賦予益處。然而，改良T細胞之培養持久性仍具有挑戰。
本揭示案至少部分基於攜帶中斷之 Regnase 1( Reg1)基因(例如，「 Reg1剔除T細胞」)、中斷之 TGFBRII基因(例如，「 TGFBRII剔除T細胞」)且視情況攜帶中斷之CD83基因(例如，「CD83剔除T細胞」)、中斷之 TRAC基因(例如，「 TRAC剔除T細胞」)、中斷之 β2M基因(例如，「 β2M剔除T細胞」)或其組合之基因編輯之抗CD83 CAR-T細胞的開發。本文報導 Reg1基因及 TGFBRII基因之中斷在活體外及活體內均增強抗CD83 CAR-T細胞之細胞毒性，而不影響CAR-T細胞之特徵，諸如細胞生長、CD4:CD8比率及/或免疫檢查點標誌物之表現水準。此外，如本文所揭示之基因編輯之抗CD83 CAR-T細胞顯示增強之T細胞擴增及改良之抗腫瘤活性。
因此，在一些態樣中，本揭示案提供基因工程改造之T細胞群體，該群體包含：(i)編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD83 CAR)之核酸；及(ii)中斷之 Regnase-1( Reg1)基因及/或中斷之轉化生長因子β受體II ( TGFBRII)基因。在一些實施例中，基因工程改造之T細胞群體包含中斷之 Reg1基因及中斷之 TGFBRII基因兩者。
基因工程改造之T細胞中之任一者可進一步包含(iii)中斷之 CD83基因。替代地或另外，基因工程改造之T細胞群體可進一步包含(iv)中斷之T細胞受體α鏈恆定區( TRAC)基因、中斷之β-2-微球蛋白( β2M)基因或其組合。
在一些實施例中，基因工程改造之T細胞群體可包含(i)編碼抗CD83 CAR之核酸；(ii)中斷之 Reg1基因及中斷之 TGFBRII基因；(iii)中斷之 CD83基因；及(iv)中斷之 TRAC基因及中斷之 β2M基因。
在一些實施例中，中斷之 Reg1基因在外顯子4中進行基因編輯。替代地或另外，中斷之 TGFBRII基因在外顯子5中進行基因編輯。又替代地或另外，中斷之 CD83基因在外顯子2中進行基因編輯。
在一些實施例中，中斷之 CD83基因、中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因、中斷之 TRAC基因及/或中斷之 β2M基因可由CRISPR/Cas介導之基因編輯系統進行基因編輯。
在一些情況下，CRISPR/Cas介導之基因編輯包含靶向 Reg1基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 36或37之核苷酸序列。在一些實例中，靶向 Reg1基因之gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 34之核苷酸序列。
在一些情況下，CRISPR/Cas介導之基因編輯系統包含靶向 TGFBRII基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 30或31之核苷酸序列。在一些實例中，靶向 TGFBRII基因之gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO:28之核苷酸序列。
在一些情況下，CRISPR/Cas介導之基因編輯系統包含靶向 CD83基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 24或25之核苷酸序列。在一些實例中，靶向 CD83基因之gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 22之核苷酸序列。或者，CRISPR/Cas介導之基因編輯系統包含靶向 CD83基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 100或101之核苷酸序列。在一些實例中，靶向 CD83基因之gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 98之核苷酸序列。
本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體中之任一者可進一步包含中斷之T細胞受體α鏈恆定區( TRAC)基因及/或中斷之β-2-微球蛋白( β2M)基因。在一些實施例中，T細胞包含中斷之T細胞受體α鏈恆定區( TRAC)基因。替代地或另外，T細胞包含中斷之β-2-微球蛋白( β2M)基因。在一些實例中，中斷之 TRAC基因及/或中斷之 β2M基因由一或多個CRISPR/Cas介導之基因編輯系統進行基因編輯。
在一些情況下，CRISPR/Cas介導之基因編輯包含靶向 TRAC基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 6或7之核苷酸序列。在一些實例中，靶向 TRAC基因之gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列。
在一些情況下，CRISPR/Cas介導之基因編輯系統包含靶向 β2M基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 12或13之核苷酸序列。舉例而言，gRNA可包含間隔子序列，該間隔子序列包含SEQ ID NO:10之核苷酸序列。或者，CRISPR/Cas介導之基因編輯系統包含靶向 β2M基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 18或19之核苷酸序列。舉例而言，gRNA可包含間隔子序列，該間隔子序列包含SEQ ID NO:16之核苷酸序列。
在一些實施例中，將編碼抗CD83 CAR之核酸插入T細胞之基因體中。在一些情況下，將編碼CAR之核酸插入中斷之 CD83基因、中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因、中斷之 TRAC基因或中斷之 β2M中。在一些實例中，將編碼CAR之核酸插入中斷之 TRAC基因中。在特定實例中，編碼CAR之核酸可置換 TRAC基因中包含SEQ ID NO:7之缺失片段。
本文所揭示之CAR構築體中之任一者可包含對CD83具有特異性之細胞外抗原結合結構域、4-1BB或CD28之共刺激信號傳導結構域及CD3ζ之細胞質信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞外抗原結合結構域為結合CD83之單鏈可變片段(scFv) (抗CD83 scFv)。此種抗CD83 scFv可包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。在一些情況下，V H包含分別如SEQ ID NO:71、72及73所示之重鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3。替代地或另外，V L包含分別如SEQ ID NO:74、75及76所示之輕鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3。在一些情況下，V H包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列，及/或V L包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列。在一些情況下，抗CD83 scFv包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列。在一些情況下，結合CD83之CAR包含SEQ ID NO:80或81之胺基酸序列。
本文所揭示之基因工程改造之T細胞可來源於一或多個人類供體之初級T細胞。在一些情況下，基因工程改造之T細胞顯示出細胞介素依賴性生長。
在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步表現結合腫瘤抗原之嵌合抗原受體(CAR)，該腫瘤抗原視情況為CD19、BCMA或CD70。
在其他態樣中，本揭示案提供一種用於製備本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體中之任一者的方法。在一些情況下，該方法可包括：(a)提供複數個細胞，其為T細胞或其前驅細胞；(b)向T細胞遞送編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR)之核酸(「抗CD83 CAR」)，例如，本文所揭示之彼等；(c)對 Reg1基因、 TGFBRII基因或其組合進行基因編輯，從而產生表現抗CD83 CAR且具有 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因或其組合的基因工程改造之T細胞群體。
在一些實施例中，(a)中之複數個細胞包含中斷之 CD83基因、中斷之 TRAC基因、中斷之 β2M基因或其組合。在一些實施例中，該方法進一步包括：(d)對 CD83基因進行基因編輯，及/或(e)對 TRAC基因、 β2M基因或其組合進行基因編輯。
步驟(c)、(d)及/或(e)中之任一者可由一或多個CRISPR/Cas介導之基因編輯系統來執行。在一些實施例中，將RNA引導之核酸酶及一或多個靶向 Reg1基因、 TGFBRII基因、 CD83基因、 TRAC基因及/或 β2M基因之gRNA遞送至複數個細胞。在一些實施例中，RNA引導之核酸酶及一或多個gRNA形成一或多個核糖核蛋白粒子(RNP)。在一些情況下，RNA引導之核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶。在一些特定情況下，Cas9核酸酶為釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9核酸酶。
在一些實施例中，編碼抗CD83 CAR之核酸係在AAV載體中。在一些實施例中，編碼抗CD83 CAR之核酸包含位於編碼CAR之核苷酸序列側翼之左同源臂及右同源臂，且左同源臂及右同源臂與T細胞中之基因體基因座同源，此允許將核酸插入基因體基因座中。在一些情況下，基因體基因座係在 CD83基因中、 Reg1基因中、 TGFBRII基因中、 TRAC基因中或 β2M基因中。在一些特定情況下，基因體基因座係在 TRAC基因中。
在一些實施例中，藉由將(a)靶向 Reg1基因中之位點，例如包含SEQ ID NO: 37之核苷酸序列之位點的向導RNA (gRNA)，(b)靶向 TGFBRII基因中之位點，例如包含SEQ ID NO: 31之核苷酸序列之位點的gRNA，或(a)與(b)之組合遞送至複數個T細胞來進行基因編輯。在一些情況下，藉由將靶向 CD83基因中之位點，例如包含SEQ ID NO:25之核苷酸序列之位點或包含SEQ ID NO: 101之核苷酸序列之位點的gRNA遞送至複數個T細胞來進一步進行基因編輯。在一些情況下，可藉由將靶向 TRAC基因中之位點，例如包含SEQ ID NO:7之核苷酸序列之位點的gRNA，及/或靶向 β2M基因中之位點，例如包含SEQ ID NO: 13或19之核苷酸序列之位點的gRNA遞送至複數個T細胞來進一步進行基因編輯。如本文所揭示之靶向 Reg1基因、 TGFBRII基因、 CD83基因、 TRAC基因及/或 β2M基因之gRNA中之任一者可用於本文所揭示之方法中以產生基因編輯之抗CD83 CAR-T細胞。
藉由本文所揭示之方法製備的基因工程改造之T細胞之任何群體亦在本揭示案之範疇內。
此外，本揭示案提供一種用於消除個體中非所需之細胞的方法，該方法包括向有需要之個體投與本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體中之任一者。在一些實施例中，非所需之細胞為表現CD83之疾病細胞。在一些情況下，表現CD83之疾病細胞為CD83+癌細胞或CD83+自體反應性免疫細胞。
在一些實施例中，個體為患有癌症或自體免疫病症之人類患者。在一些實施例中，基因工程改造之T細胞群體對個體而言為同種異體的。
用於治療如本文所揭示之目標疾病的基因工程改造之T細胞、靶向 CD83之gRNA、靶向 Reg1之gRNA及/或靶向 TGFBRII之gRNA中之任一者或其用於製造用於預期治療目的之藥劑的用途亦在本揭示案之範疇內。
一種抑制個體之免疫反應的方法進一步在本揭示案之範疇內，該方法包括：向有需要之個體投與(a)有效量之如上文及本文所述之基因工程改造之T細胞群體，及(b)有效量之消炎劑。
在一些實施例中，將基因工程改造之T細胞群體及消炎劑(例如，抗CTLA-4-Fc融合多肽，諸如貝拉西普(belatacept))調配於兩個獨立組合物中。在一些實例中，向需要治療之個體同時投與兩種組合物。或者，向個體依序投與兩種組合物。
在一些實施例中，消炎劑為抑制促炎細胞介素之抗體。或者，消炎劑可為抑制T細胞共刺激之劑。在一些實施例中，消炎劑為CTLA4-Fc融合蛋白。在一些實例中，CTLA4-Fc融合蛋白為貝拉西普。或者，CTLA-4-Fc融合蛋白為阿巴西普(abatacept)。
在一些實施例中，個體為人類患者。此種人類患者可能患有免疫疾病(例如，自體免疫疾病)或移植物抗宿主病(GvHD)或處於其風險下。在一些實例中，人類患者患有自體免疫疾病，例如，本文所揭示之彼等。在其他實例中，人類患者患有GvHD或處於其風險下。
本發明之一或多個實施例之細節在下文之描述中闡述。本發明之其他特徵或優點將自以下圖式及若干實施例之詳細描述以及隨附申請專利範圍顯而易見。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2022年3月23日提交之美國臨時申請案第63/322,868號及2022年10月20日提交之美國臨時申請案第63/417,775號的申請日權益，各臨時申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。 序列表
本申請案含有以XML格式電子提交之序列表，且其全文藉此以引用之方式併入。創建於2023年3月15日之該XML複本命名為095136-0741-063WO1_SEQ.XML且大小為111,265位元組。
本揭示案旨在建立具有改良之生長活性、持久性及增強之針對靶細胞(例如，CD83+腫瘤細胞，諸如骨髓性白血病細胞)之細胞毒性的基因工程改造之抗CD83 CAR-T細胞。本文亦報導抗CD83 CAR-T細胞與貝拉西普(作為消炎劑之一個實例)之組合療法成功地抑制或延遲移植物抗宿主病(GvHD)之發展且延長如在動物模型中觀測之存活率。因此，預期基因工程改造之抗CD83 CAR-T細胞與本文所揭示之消炎劑之組合對抑制免疫反應更有效，從而有利於治療與非所需之免疫反應相關之免疫病症，諸如GvHD及自體免疫疾病。
本文所揭示之基因工程改造之T細胞相對於具有野生型 Reg1及 TGFBRII基因之對應CAR-T細胞在活體外及活體內均顯示出改良之活化後生長/擴增能力及增強之細胞毒性，如本文所提供，該等基因工程改造之T細胞具有編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD83 CAR)之核酸、中斷之 TGFBRII基因、中斷之 Reg1基因或其組合，且視情況具有一或多個額外基因編輯，例如，中斷之 CD83基因、中斷之 TRAC基因及/或中斷之 β2M基因。此外，發現 Reg1及 TGFBRII基因之基因編輯對所得CAR-T細胞無負面影響，包括CD4/CD8比率及免疫檢查點標誌物水準。亦參見PCT專利申請案第WO2022064428號，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。 CD83基因之中斷將改良抗CD83 CAR-T細胞之生長，減少促炎細胞介素之產生，及/或增強所得抗CD83 CAR-T細胞之效力。亦參見2022年9月13日提交之國際申請案第PCT/IB2022/058633號，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。
因此，本文提供具有中斷之 Reg1基因及/或 TGFBRII基因且視情況具有中斷之CD83基因之基因工程改造之抗CD83 T細胞、產生此類T細胞之方法及使用此類T細胞用於治療用途之方法。在一些情況下，抗CD83 CAR-T細胞可為具有進一步基因編輯，例如中斷之 TRAC基因、中斷之 β2M基因或其組合之同種異體CAR-T細胞。本文所揭示之抗CD83 CAR-T細胞可在CAR-T細胞製造中賦予一或多種益處(例如，增強之活體外細胞生長及擴增能力)及臨床應用(例如，增強之治療功效、增強之活體內擴增及持久能力及/或降低之移植物抗宿主病風險)。用於製造本文所揭示之T細胞之組分及過程(例如，用於基因編輯之CRISPR方法及其中使用之組分)亦在本揭示案之範疇內。
I. 具有增強特徵之基因工程改造之 T 細胞
本文所揭示之T細胞包括具有增強之培養持久性之基因工程改造之T細胞。此類基因工程改造之T細胞可具有 Reg1基因及/或 TGFBRII基因及視情況存在之 CD83基因之基因編輯。在一些情況下，此類基因工程改造之T細胞可具有 Reg1基因及 TGFBRII基因兩者之基因編輯。在一些情況下，此類基因工程改造之T細胞可具有 CD83基因、 Reg1基因及 TGFBRII基因之基因編輯。
在一些實例中，基因工程改造之T細胞可具有用於產生同種異體T細胞之進一步基因編輯，例如，移植物抗宿主或宿主抗移植物免疫反應中所涉及之基因。舉例而言，基因工程改造之T細胞可具有中斷之 TRAC基因、中斷之 β2M基因或其組合。在特定實例中，基因工程改造之T細胞具有中斷之TRAC及 β2M基因。
基因工程改造之T細胞可來源於自適合之來源，例如一或多個哺乳動物供體獲得之親本T細胞(例如，未編輯之野生型T細胞)。在一些實例中，親本T細胞為自一或多個人類供體獲得之初級T細胞(例如，未轉化及終末分化之T細胞)。或者，親本T細胞可自前驅T細胞分化，該等前驅T細胞獲自一或多個適合之供體或幹細胞，諸如造血幹細胞或誘導性多能幹細胞(iPSC)，該等細胞可在活體外培養。
在一些實施例中，基因工程改造之T細胞攜帶中斷之 Reg1基因及/或中斷之 TGFBRII基因，且視情況攜帶中斷之 CD83基因。此類基因工程改造之T細胞可進一步包含一或多個中斷之基因，例如， TRAC、 β2M或其組合。此類基因工程改造之T細胞可進一步表現嵌合抗原受體(CAR)，其可能能夠與所關注之抗原，例如腫瘤相關抗原(例如，CD83)結合。在一些情況下，基因工程改造之T細胞攜帶編碼抗CD83 CAR之核酸；中斷之 Reg1基因及中斷之 TGFBRII基因；中斷之 CD83基因、中斷之 TRAC基因及中斷之 β2M基因。令人驚訝地，本文報導將多重基因編輯引入T細胞中顯示出對CAR-T細胞特徵無負面影響且會改良治療效力並增強活化後細胞生長/擴增。
基因工程改造之T細胞中之任一者可經由基因編輯(包括基因體編輯)而產生，該基因編輯為一種類型之基因工程改造，其中在DNA序列中，諸如在靶向細胞之基因體中進行核苷酸/核酸插入、缺失及/或取代。靶向基因編輯能夠在靶向細胞基因體中(例如，在靶向基因或靶向DNA序列中)之預選位點處進行插入、缺失及/或取代。當對內源基因之序列進行編輯，例如藉由核苷酸/核酸之缺失、插入或取代時，包含受影響序列之內源基因可能由於序列改變而剔除。因此，靶向編輯可用於中斷內源基因表現。「靶向整合」係指涉及插入一或多個外源序列之過程，伴有插入位點處之內源序列缺失或不缺失。當存在含有外源序列之供體模板時，靶向基因編輯可引起靶向整合。
(a) 基因編輯之基因
在一些態樣中，本揭示案提供基因工程改造之T細胞，其可包含編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD83 CAR)之核酸，及中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因或其組合。在一些實施例中，本文所提供之基因工程改造之T細胞包含中斷之 Reg1基因及中斷之 TGFBRII基因兩者。在一些情況下，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步包含中斷之 CD83基因、中斷之 β2M基因、中斷之 TRAC基因或其組合。
如本文所用，「中斷之基因」係指包含相對於內源基因之插入、缺失或取代之基因，使得來自內源基因之功能蛋白質之表現降低或抑制。如本文所用，「中斷基因」係指在內源基因中插入、缺失或取代至少一個核苷酸/核酸，使得來自內源基因之功能蛋白質之表現降低或抑制的方法。中斷基因之方法為熟習此項技術者所知且在本文中描述。
在一些實施例中，包含中斷之基因的細胞不表現(例如，在細胞表面處)可偵測水準(例如，在使用與編碼蛋白質結合之抗體的免疫檢定中或藉由流式細胞術)之由該基因編碼之蛋白質。不表現可偵測水準之蛋白質的細胞可稱作剔除細胞。
Reg1 基因編輯
在一些實施例中，基因工程改造之T細胞可包含mRNA衰變中所涉及之中斷基因。此種基因可為Reg1。Reg1含有鋅指模體，結合RNA且展現出核糖核酸酶活性。Reg1在免疫細胞及非免疫細胞中均發揮作用，且其表現可在多種條件下快速誘導，包括微生物感染、炎性細胞介素處理及化學或機械刺激。人類 Reg1基因位於染色體1p34.3上。額外資訊可在GenBank中以Gene ID: 80149找到。
在一些情況下，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 Reg1基因，使得T細胞中Reg1之表現實質上降低或完全消除。中斷之 Reg1基因可在一或多個適合之靶位點處(例如，在編碼區中或在非編碼調控區，諸如啟動子區中)包含一或多個基因編輯，其中斷 Reg1基因之表現。此類靶位點可基於用於製造基因工程改造之T細胞之基因編輯方法來鑑定。基因編輯之示例性靶位點可包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6或其組合。在一些情況下，一或多個基因編輯可在外顯子4中發生。此種基因編輯可藉由CRISPR/Cas技術使用適合之向導RNA來誘導，例如，靶向 Reg1基因中之ACGACGCGTGGGTGGCAAGC (SEQ ID NO:37)位點之gRNA。靶向 Reg1基因之示例性gRNA在下文之 表 17中提供。在一些實施例中，經編輯之 Reg1基因可包含選自 表 21中所列之彼等的一或多個核苷酸序列，其可使用單個gRNA (例如， 表 17中所列之彼等)產生。亦參見WO2022064428，相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之主題及目的。
Reg1基因之中斷可增強長期持久性且維持穩固之效應功能，從而改良T細胞功能性。
TGFBRII 基因編輯
在一些實施例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 TGFBRII基因，其編碼II型轉化生長因子受體(TGFBRII)。TGFBRII受體為TGFβ信號傳導路徑中所涉及之絲胺酸/蘇胺酸激酶受體家族。此等受體結合TGFβ家族中之生長因子及細胞介素信號傳導蛋白，例如，TGFβ (TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3)、骨形態發生蛋白(BMP)、生長分化因子(GDF)、活化素及抑制素、肌肉生長抑制素、抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)及NODAL。
在一些實例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 TGFBRII基因，使得T細胞中TGFBRII之表現實質上降低或完全消除。中斷之 TGFBRII基因可在一或多個適合之靶位點處(例如，在編碼區中或在非編碼調控區，諸如啟動子區中)包含一或多個基因編輯，其中斷 TGFBRII基因之表現。此類靶位點可基於用於製造基因工程改造之T細胞之基因編輯方法來鑑定。基因編輯之示例性靶位點可包括外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5或其組合。在一些情況下，一或多個基因編輯可在外顯子5中發生。此種基因編輯可藉由基因編輯技術(例如，CRISPR/Cas技術)使用適合之向導RNA來誘導，例如，靶向 TGFBRII基因中之CCCCTACCATGACTTTATTC (SEQ ID NO:31)位點之gRNA。靶向 Reg1基因之示例性gRNA在下文之 表 17中提供。在一些實施例中，經編輯之 TGFBRII基因可包含選自 表 20中所列之彼等的一或多個核苷酸序列，其可使用單個gRNA (例如， 表 17中所列之彼等)產生。亦參見WO2022064428，相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之主題及目的。
TGFBRII基因之中斷可消除TGFBRII之表面表現且降低轉化生長因子β (TFG-β)在腫瘤微環境中之免疫抑制作用。
CD83 基因編輯
在一些實施例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 CD83基因。CD83為免疫球蛋白(Ig)超家族之成員且以膜結合或可溶性形式表現。膜結合之CD83含有細胞外V型免疫球蛋白樣結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域。可溶性形式僅含有-型免疫球蛋白樣結構域。編碼CD83之基因位於人類染色體6p23上。人類CD83基因之結構為此項技術中已知的，例如，Gene ID ENSG00000112149。
CD83在各種類型之免疫細胞中表現，包括調控性T細胞、樹突狀細胞、B細胞及T細胞。據報導CD83可能涉及於炎症中且充當芳烴受體之結合位點。
在一些實例中，基因工程改造之T細胞可包含中斷之 CD83基因，使得T細胞中CD83之表現實質上降低或完全消除。中斷之 CD83基因可在一或多個適合之靶位點處(例如，在編碼區中或在非編碼調控區，諸如啟動子區中)包含一或多個基因編輯，其中斷 CD83基因之表現。此類靶位點可基於用於製造基因工程改造之T細胞之基因編輯方法來鑑定。基因編輯之示例性靶位點可包括外顯子2、外顯子3或其組合。在一些實例中，一或多個基因編輯可在外顯子2中發生。此種基因編輯可藉由基因編輯技術(例如，CRISPR/Cas技術)使用適合之向導RNA來誘導，例如，靶向 CD83基因中之GTAGGGAACCTGCGGATCCCAGG (SEQ ID NO:25)位點之gRNA。靶向 Reg1基因之示例性gRNA在下文之 表 17中提供。亦參見2022年9月13日提交之國際申請案第PCT/IB2022/058633號，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。在另一個實例中，基因編輯系統(例如，CRISPR/Cas介導之基因編輯系統)可包含靶向CD83基因中之AGGTTCCCTACACGGTCTCC (SEQ ID NO: 101)位點之gRNA。
TRAC 基因編輯
在一些實施例中，如本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步包含中斷之 TRAC基因。此中斷導致TCR功能喪失，且促使工程改造之T細胞不具有同種異體反應性且適合於同種異體移植，從而使移植物抗宿主病之風險降至最低。在一些實施例中，消除內源 TRAC基因之表現以防止移植物抗宿主反應。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。
在一些實施例中，經編輯之 TRAC基因可包含選自 表 18中所列之彼等的一或多個核苷酸序列。熟習此項技術者已知，經編輯之基因，諸如經編輯之 TRAC基因中之不同核苷酸序列(例如， 表 18中之彼等)可由單個gRNA，諸如 表 17(TA-1)中所列者產生。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。
β2M基因編輯
在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步包含中斷之 β2M基因。β2M為MHC I複合物之通用(不變)組分。藉由基因編輯中斷其表現將防止宿主對治療性同種異體T細胞之反應，從而增加同種異體T細胞持久性。在一些實施例中，消除內源 β2M基因之表現以防止宿主抗移植物反應。
在一些實施例中，經編輯之 β2M基因可包含選自 表 19中所列之彼等的一或多個核苷酸序列。熟習此項技術者已知，經編輯之基因，諸如經編輯之 β2M基因中之不同核苷酸序列(例如， 表 19中之彼等)可由單個gRNA，諸如 表 17中所列者(β2M-1或β2M-4)產生。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。
本文所揭示之基因工程改造之T細胞可進一步包含一或多個額外基因編輯(例如，基因敲入或剔除)以改良T細胞功能。實例包括敲入或剔除基因以改良靶細胞溶解，敲入或剔除基因以增強治療性T細胞，諸如自基因工程改造之T細胞製備之CAR-T細胞之效能。
應了解，多於一個適合之靶位點/gRNA可用於本文所揭示之各靶基因，例如，此項技術中已知或本文所揭示之彼等。額外實例可在例如WO2019097305中找到，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。
(b) 本文所揭示之基因工程改造之 T 細胞之示例性改良特徵
具有中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因、視情況存在之中斷之 CD83基因及視情況存在之一或多個額外基因編輯，例如中斷之 TRAC基因、中斷之 β2M基因、CAR編碼核酸插入或其組合的基因工程改造之T細胞中之任一者可在培養物中可擴增超過4週，例如，超過5週、超過6週、超過8週及超過10週。在一些實例中，基因工程改造之T細胞在培養物中6週後(例如，7週後、8週後、9週後或10週後)可擴增。此類基因工程改造之T細胞可在培養物中6週後(例如，7週後、8週後、9週後或10週後)維持活化之能力。此外，此類基因工程改造之T細胞具有增加之擴增能力，其可比非工程改造之對應物高至少10倍(例如，至少15倍)。
此外，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可展現出增強之T細胞持久性。如本文所用，「T細胞持久性」係指T細胞在培養物中繼續生長、增殖、自我更新、擴增及維持健康活性之趨勢。在一些情況下，T細胞持久性可由T細胞可在活體外生長及擴增之持續時間來表示，此可藉由本文所述之習用方法及/或檢定來量測。在其他情況下，T細胞持久性可由細胞死亡(例如，細胞凋亡)之減少或以衰竭或複制性衰老為特徵之細胞狀態的減少來表示。在其他情況下，T細胞持久性可由培養物中T細胞活化能力之維持來呈現。
替代地或另外，所揭示之基因工程改造之T細胞可比非工程改造之T細胞生長更快及更長時間，例如，如在活體外細胞培養物中所觀測。在一些情況下，基因工程改造之T細胞相比非工程改造之T細胞在習用活體外T細胞培養物(例如，如以下實例中所述)中可生長至少50% (例如 ，至少1倍、至少2倍、至少5倍或更多倍)。在其他情況下，基因工程改造之T細胞可在活體外維持高生長速率(例如，具有實質上相同之生長速率或僅略微降低)，持續至少20天(例如，至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少45天、至少50天或更長時間)。
另外，基因工程改造之T細胞相對於非工程改造之T細胞對應物可展現出降低之細胞衰竭水準。在一些情況下，整個T細胞群體中更高之中央記憶T細胞水準反映降低之細胞衰竭水準。與非工程改造之T細胞對應物相比，所揭示之基因工程改造之T細胞群體可包含更高數目之中央記憶T細胞。舉例而言，在一些情況下，與非工程改造之T細胞對應物相比，基因工程改造之T細胞群體包括更高數目之中央記憶T細胞，其特徵在於CD27及/或CD45RO之表現增強。在一些情況下，與非工程改造之T細胞對應物相比，所揭示之基因工程改造之T細胞群體展現出減少之T細胞衰竭，其特徵在於例如PD-1及/或TIM3之表現降低。
此外，基因工程改造之T細胞(例如，CAR-T細胞)與非工程改造之對應物相比可展現出增強之細胞毒性活性，例如，針對表現由CAR-T細胞中表現之CAR所靶向之抗原的非所需之細胞(例如，腫瘤細胞)。此類基因工程改造之T細胞(例如，CAR-T細胞)亦可對TGFβ信號傳導及/或纖維母細胞(例如，TME中)介導之抑制作用有抗性。舉例而言，具有中斷之 TGFBRII基因之基因工程改造之T細胞可對纖維母細胞分泌之抑制因子有抗性。
如在異種移植小鼠模型中所觀測，發現具有CD83基因、 TGFBRII基因及 Reg1基因之三重中斷之CAR-T細胞在癌症治療中比對應T細胞更強效。因此，將預期具有至少三重中斷之CAR-T細胞顯示出優異之癌症治療功效。
(c) 製造基因工程改造之 T 細胞的方法
可經由習用基因編輯方法或本文所述之彼等對親本T細胞或其前驅細胞進行基因編輯來製備本文所揭示之基因工程改造之T細胞。
(i) T 細胞
在一些實施例中，T細胞可來源於一或多種適合之哺乳動物，例如，一或多種人類供體。T細胞可自許多來源獲得，包括但不限於外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。在某些實施例中，T細胞可使用技術人員已知之眾多技術自個體所收集之血液單位獲得，該等技術諸如沈降，例如FICOLL™分離。
在一些實例中，T細胞可自免疫細胞(例如，本文所述之彼等)之混合物中分離以產生分離之T細胞群體。舉例而言，在分離外周血單核細胞(PBMC)後，細胞毒性T淋巴細胞及輔助T淋巴細胞均可在活化、擴增及/或基因修飾之前或之後歸類為初始T細胞、記憶T細胞及效應T細胞亞群。
可藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離表現一或多種以下細胞表面標誌物之特定T細胞亞群：TCRab、CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CD38、CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD122、CD95、CD197、CCR7、KLRG1、MCH-I蛋白及/或MCH-II蛋白。在一些實施例中，藉由陽性或陰性選擇技術進一步分離表現一或多種選自由TCRab、CD4及/或CD8組成之群之標誌物的特定T細胞亞群。在一些實施例中，可在基因工程改造前及/或基因工程改造後藉由陽性或陰性選擇來分離T細胞亞群。
分離之T細胞群體可表現一或多種T細胞標誌物，包括但不限於CD3+、CD4+、CD8+或其組合。在一些實施例中，自供體或個體分離T細胞，且在經歷基因編輯之前首先在活體外活化及刺激增殖。
在一些情況下，T細胞群體包含自一或多個人類供體分離之初級T細胞。此類T細胞終末分化，未轉化，取決於細胞介素及/或供生長之生長因子，及/或具有穩定基因體。
或者，T細胞可經由活體外分化而來源於幹細胞(例如，HSC或iPSC)。
可對來自適合來源之T細胞進行一或多輪刺激、活化及/或擴增。一般可使用例如美國專利第6,352,694號、第6,534,055號、第6,905,680號、第6,692,964號、第5,858,358號、第6,887,466號、第6,905,681號、第7,144,575號、第7,067,318號、第7,172,869號、第7,232,566號、第7,175,843號、第5,883,223號、第6,905,874號、第6,797,514號及第6,867,041號中所述之方法活化及擴增T細胞。在一些實施例中，在將基因體編輯組合物引入T細胞中之前，可活化及擴增T細胞持續約1天至約4天、約1天至約3天、約1天至約2天、約2天至約3天、約2天至約4天、約3天至約4天、或約1天、約2天、約3天或約4天。
在一些實施例中，在將基因編輯組合物引入T細胞中之前，活化及擴增T細胞持續約4小時、約6小時、約12小時、約18小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時。在一些實施例中，在將基因體編輯組合物引入T細胞中同時活化T細胞。在一些情況下，可在如本文所揭示之基因編輯之後擴增及/或活化T細胞群體。藉由本文所述之基因編輯方法中之任一者產生的T細胞群體或分離之T細胞亦在本揭示案之範疇內。
(ii) 基因編輯方法
可使用習用基因編輯方法或本文所述之彼等對本文所揭示之一或多個靶基因進行編輯(靶向編輯)來製備基因工程改造之T細胞中之任一者。靶向編輯可經由核酸酶非依賴性方法或經由核酸酶依賴性方法來達成。在核酸酶非依賴性靶向編輯方法中，由位於外源多核苷酸側翼之同源序列引導同源重組，以經由宿主細胞之酶促機構引入內源序列中。外源多核苷酸可在內源序列中引入核苷酸之缺失、插入或置換。
或者，核酸酶依賴性方法可經由特異性稀有切割核酸酶(例如，核酸內切酶)特異性引入雙股斷裂(DSB)，以更高頻率達成靶向編輯。此種核酸酶依賴性靶向編輯亦利用DNA修復機制，例如，對DSB作出反應而發生之非同源末端連接(NHEJ)。藉由NHEJ進行之DNA修復通常會導致少量內源核苷酸之隨機插入或缺失(插入缺失(indel))。與NHEJ介導之修復成對比，修復亦可藉由同源定向修復(HDR)而進行。當存在含有側接有一對同源臂之外源遺傳物質之供體模板時，可藉由HDR將外源遺傳物質引入基因體中，從而引起外源遺傳物質之靶向整合。
在一些實施例中，基因中斷可藉由使用兩個向導RNA使基因體序列缺失而發生。使用CRISPR-Cas基因編輯技術在細胞中產生基因體缺失(例如，剔除細胞中之基因)的方法為已知的(Bauer DE等人, Vis. Exp.2015; 95:e52118)。
能夠引入特異性及靶向DSB之可用核酸內切酶包括但不限於鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)及RNA引導之CRISPR-Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9；規律間隔重複短迴文序列簇9)。另外，利用phiC31及Bxb1整合酶之DICE (雙整合酶卡匣交換)系統亦可用於靶向整合。下文詳細揭示一些示例性方法。
(a) CRISPR-Cas9 基因編輯系統
CRISPR-Cas9系統為原核生物中天然存在之防禦機制，已將其重新用作用於基因編輯之RNA引導之DNA靶向平台。該系統依賴於DNA核酸酶Cas9及兩種非編碼RNA，crisprRNA (crRNA)及反式活化RNA (tracrRNA)，以靶向DNA之裂解。CRISPR為規律間隔重複短迴文序列簇之縮寫，此為在細菌及古細菌基因體中發現之DNA序列家族，其含有與先前暴露於細胞之外源DNA (例如，藉由已感染或攻擊原核生物之病毒)具有相似性之DNA片段(間隔子DNA)。原核生物使用此等DNA片段來偵測及破壞再引入後之類似外來DNA，例如，在後續攻擊期間來自類似病毒。CRISPR基因座之轉錄得以形成包含間隔子序列之RNA分子，該RNA分子與能夠識別及切割外來之外源DNA的Cas (CRISPR相關)蛋白締合並靶向該等Cas蛋白。已描述許多類型及類別之CRISPR/Cas系統(參見例如Koonin等人, (2017) Curr Opin Microbiol37:67-78)。
crRNA經由典型地與靶DNA中之20個核苷酸(nt)序列進行瓦生-克立克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)來驅動CRISPR-Cas9複合物之序列識別及特異性。改變crRNA中之5' 20nt序列允許將CRISPR-Cas9複合物靶向特異性基因座。若靶序列後繼之以特異性短DNA模體(序列為NGG)，稱作原型間隔子相鄰模體(PAM)，則CRISPR-Cas9複合物僅結合含有與crRNA之前20 nt序列匹配之DNA序列。
tracrRNA與crRNA之3'端雜交形成RNA雙鏈體結構，該結構由Cas9核酸內切酶結合以形成催化活性CRISPR-Cas9複合物，該複合物接著可使靶DNA裂解。
一旦CRISPR-Cas9複合物在靶位點處與DNA結合，Cas9酶內之兩個獨立核酸酶結構域各自使PAM位點上游之一股DNA裂解，留下雙股斷裂(DSB)，其中兩股DNA終止於鹼基對(平端)。
CRISPR-Cas9複合物在特異性靶位點處與DNA結合且形成位點特異性DSB之後，下一個關鍵步驟為修復DSB。細胞使用兩個主要DNA修復路徑來修復DSB：非同源末端連接(NHEJ)及同源定向修復(HDR)。
NHEJ為在包括非分裂細胞在內之大多數細胞類型中呈現高度活性之穩固修復機制。NHEJ為易錯的且通常可導致在DSB位點處移除或添加一個至數百個核苷酸，但此類修飾典型地＜ 20 nt。由此產生之插入及缺失(插入缺失)可中斷基因之編碼或非編碼區。或者，HDR使用內源或外源提供之一長段同源供體DNA，以高保真度修復DSB。HDR僅在分裂細胞中有活性，且在大多數細胞類型中以相對較低頻率發生。在本揭示案之許多實施例中，NHEJ用作修復操作。
用於 CRISPR 之核酸內切酶
在一些實施例中，Cas9 (CRISPR相關蛋白9)核酸內切酶用於CRISPR方法中，以製造如本文所揭示之基因工程改造之T細胞。Cas9酶可為來自釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)之酶，但亦可使用其他Cas9同源物。應了解，如本文所提供，可使用野生型Cas9或可使用Cas9之修飾型式(例如，Cas9之進化型式，或Cas9直系同源物或變異體)。在一些實施例中，Cas9可用另一種RNA引導之核酸內切酶，諸如Cpf1 (屬於II類CRISPR/Cas系統)替代。
在一些實施例中，CRISPR/Cas系統包含來源於I型、II型或III型系統之組分。CRISPR/Cas基因座之更新分類方案定義1類及2類CRISPR/Cas系統，具有I型至V型或VI型(Makarova等人, (2015) Nat Rev Microbiol, 13(11):722-36；Shmakov等人, (2015) Mol Cell, 60:385-397)。2類CRISPR/Cas系統具有單蛋白效應子。II型、V型及VI型Cas蛋白為單蛋白、RNA引導之核酸內切酶，本文中稱為「2類Cas核酸酶」。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白。Cpf1核酸酶(Zetsche等人, (2015) Cell 163:1-13)與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶結構域。
在一些實施例中，Cas核酸酶來自II型CRISPR/Cas系統(例如，來自CRISPR/Cas9系統之Cas9蛋白)。在一些實施例中，Cas核酸酶來自2類CRISPR/Cas系統(單蛋白Cas核酸酶，諸如Cas9蛋白或Cpf1蛋白)。如本文進一步描述，Cas9及Cpf1蛋白家族為具有DNA核酸內切酶活性之酶，且其可藉由設計適當向導RNA來指導以使所需核酸標靶裂解。
在一些實施例中，Cas核酸酶可包含多於一個核酸酶結構域。舉例而言，Cas9核酸酶可包含至少一個RuvC樣核酸酶結構域(例如，Cpf1)及至少一個HNH樣核酸酶結構域(例如，Cas9)。在一些實施例中，Cas9核酸酶在靶序列中引入DSB。在一些實施例中，Cas9核酸酶經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，Cas9核酸酶經修飾以使得核酸酶結構域之一發生突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，Cas9核酸酶經修飾以不含功能性RuvC樣核酸酶結構域。在其他實施例中，Cas9核酸酶經修飾以不含功能性HNH樣核酸酶結構域。在其中僅一個核酸酶結構域有功能之一些實施例中，Cas9核酸酶為能夠將單股斷裂(「切口」)引入靶序列中之切口酶。在一些實施例中，Cas9核酸酶結構域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶切口酶包含RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。RuvC樣核酸酶結構域中之示例性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9核酸酶)。在一些實施例中，切口酶包含HNH樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。HNH樣核酸酶結構域中之示例性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9核酸酶)。以下為釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶之胺基酸序列： MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD (SEQ ID NO:1)
在一些實施例中，Cas核酸酶來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。舉例而言，Cas核酸酶為Cas3核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於IV型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於V型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶來源於VI型CRISPR/Cas系統。
向導 RNA (gRNA)
CRISPR技術涉及使用基因體靶向核酸，該核酸可將核酸內切酶引導至靶基因內之特異性靶序列，以在特異性靶序列處進行基因編輯。基因體靶向核酸可為RNA。基因體靶向RNA在本文中稱作「向導RNA」或「gRNA」。向導RNA至少包含與用於編輯之靶基因內之靶核酸序列雜交之間隔子序列，及CRISPR重複序列。
在II型系統中，gRNA亦包含第二個RNA，稱為tracrRNA序列。在II型gRNA中，CRISPR重複序列與tracrRNA序列相互雜交以形成雙鏈體。在V型gRNA中，crRNA形成雙鏈體。在兩個系統中，雙鏈體結合定點多肽，以使得向導RNA及定點多肽形成複合物。在一些實施例中，基因體靶向核酸藉助於其與定點多肽之締合為複合物提供標靶特異性。因此，基因體靶向核酸指導定點多肽之活性。
如一般熟習此項技術者應了解，各向導RNA經設計以包括與其基因體靶序列互補之間隔子序列。參見Jinek等人, Science, 337, 816-821 (2012)及Deltcheva等人, Nature, 471, 602-607 (2011)。
在一些實施例中，基因體靶向核酸(例如，gRNA)為雙分子向導RNA。在一些實施例中，基因體靶向核酸(例如，gRNA)為單分子向導RNA。
雙分子向導RNA包含兩股RNA分子。第一股在5'至3'方向上包含視情況存在之間隔子延伸序列、間隔子序列及最小CRISPR重複序列。第二股包含最小tracrRNA序列(與最小CRISPR重複序列互補)、3' tracrRNA序列及視情況存在之tracrRNA延伸序列。
II型系統中之單分子向導RNA (稱作「sgRNA」)在5'至3'方向上包含視情況存在之間隔子延伸序列、間隔子序列、最小CRISPR重複序列、單分子向導連接子、最小tracrRNA序列、3' tracrRNA序列及視情況存在之tracrRNA延伸序列。視情況存在之tracrRNA延伸可包含為向導RNA提供額外功能性(例如，穩定性)之元件。單分子向導連接子連接最小CRISPR重複及最小tracrRNA序列以形成髮夾結構。視情況存在之tracrRNA延伸包括一或多個髮夾。V型系統中之單分子向導RNA在5'至3'方向上包含最小CRISPR重複序列及間隔子序列。
gRNA中之間隔子序列為定義所關注之靶基因之靶序列(例如，DNA靶序列，諸如基因體靶序列)的序列(例如，20個核苷酸之序列)。在一些實施例中，間隔子序列之範圍為15至30個核苷酸。舉例而言，間隔子序列可含有15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸。在一些實施例中，間隔子序列含有20個核苷酸。
「靶序列」在與PAM序列相鄰之靶基因中且為將由RNA引導之核酸酶(例如，Cas9)修飾之序列。「靶序列」在「靶核酸」中所謂的PAM股上，該靶核酸為包含PAM股及互補非PAM股之雙股分子。一般熟習此項技術者認識到，gRNA間隔子序列與位於所關注之靶核酸之非PAM股中之互補序列雜交。因此，gRNA間隔子序列為靶序列之RNA等效物。舉例而言，若靶序列為5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC**-3' (SEQ ID NO:7)，則gRNA間隔子序列為5'-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC**-3' (SEQ ID NO:4)。gRNA之間隔子經由雜交(亦即，鹼基配對)以序列特異性方式與所關注之靶核酸相互作用。因此，間隔子之核苷酸序列取決於所關注之靶核酸之靶序列而變化。
在本文之CRISPR/Cas系統中，間隔子序列經設計以與靶核酸之區域雜交，該區域位於PAM之5'且由系統中使用之Cas9酶可識別。間隔子可與靶序列完全匹配或可具有錯配。各Cas9酶具有在靶DNA中識別之特定PAM序列。舉例而言，釀膿鏈球菌在靶核酸中識別包含序列5'-NRG-3'之PAM，其中R包含A或G，其中N為任何核苷酸且N緊鄰間隔子序列靶向之靶核酸序列之3'。
在一些實施例中，靶核酸序列之長度為20個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度小於20個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度大於20個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度為至少：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸之長度為至多：5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個或更多個核苷酸。在一些實施例中，靶核酸序列具有緊鄰PAM之第一個核苷酸之5'的20個鹼基。舉例而言，在包含5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'之序列中，靶核酸可為對應於N之序列，其中N可為任何核苷酸，且加下劃線之NRG序列為釀膿鏈球菌PAM。
本文所揭示之向導RNA可經由crRNA中之間隔子序列靶向所關注之任何序列。在一些實施例中，向導RNA之間隔子序列與靶基因中之靶序列之間的互補程度可為約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，向導RNA之間隔子序列與靶基因中之靶序列為100%互補的。在其他實施例中，向導RNA之間隔子序列及靶基因中之靶序列可含有至多10個錯配，例如，至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個錯配。
對於本文所提供之gRNA序列中之任一者，未明確指示修飾之彼等意欲涵蓋未修飾之序列及具有任何適合修飾之序列兩者。
本文所揭示之gRNA中之任一者中的間隔子序列之長度可取決於CRISPR/Cas9系統及用於編輯本文亦揭示之靶基因中之任一者的組分。舉例而言，來自不同細菌種類之不同Cas9蛋白具有變化之最佳間隔子序列長度。因此，間隔子序列之長度可為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50個或多於50個核苷酸。在一些實施例中，間隔子序列之長度可為18-24個核苷酸。在一些實施例中，靶向序列之長度可為19-21個核苷酸。在一些實施例中，間隔子序列可包含20個核苷酸長度。
在一些實施例中，gRNA可為sgRNA，其可在sgRNA序列之5'端包含20個核苷酸之間隔子序列。在一些實施例中，sgRNA可在sgRNA序列之5'端包含少於20個核苷酸之間隔子序列。在一些實施例中，sgRNA可在sgRNA序列之5'端包含多於20個核苷酸之間隔子序列。在一些實施例中，sgRNA在sgRNA序列之5'端包含具有17-30個核苷酸之可變長度間隔子序列。實例在下文之 表 17中提供。在此等示例性序列中，「n」之片段係指5'端之間隔子序列。
在一些實施例中，sgRNA在sgRNA序列之3'端不包含尿嘧啶。在其他實施例中，sgRNA可在sgRNA序列之3'端包含一或多個尿嘧啶。舉例而言，sgRNA可在sgRNA序列之3'端包含1-8個尿嘧啶殘基，例如，在sgRNA序列之3'端包含1、2、3、4、5、6、7或8個尿嘧啶殘基。
本文所揭示之gRNA中之任一者，包括sgRNA中之任一者，可為未修飾的。或者，其可含有一或多個修飾之核苷酸及/或修飾之骨架。舉例而言，修飾之gRNA (諸如sgRNA)可包含一或多個2'-O-甲基硫代磷酸酯核苷酸，其可位於5'端、3'端或兩端。
在某些實施例中，多於一個向導RNA可與CRISPR/Cas核酸酶系統一起使用。各向導RNA可含有不同靶向序列，以使得CRISPR/Cas系統使多於一個靶核酸裂解。在一些實施例中，一或多個向導RNA可具有相同或不同特性，諸如Cas9 RNP複合物內之活性或穩定性。在使用多於一個向導RNA之情況下，各向導RNA可在相同或不同載體上進行編碼。用於驅動多於一個向導RNA表現之啟動子為相同或不同的。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 Reg1基因，例如，靶向 Reg1基因之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5或外顯子6內之位點。此種gRNA可包含與 Reg1基因之外顯子2或外顯子4中之靶序列(完全或部分)互補之間隔子序列或其片段。 Reg1之示例性靶序列及示例性gRNA序列在下文之 表 17中提供。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 TGFBRII基因，例如，靶向 TGFBRII基因之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5或外顯子6內之位點。此種gRNA可包含與 TGFBRII基因之外顯子5中之靶序列(完全或部分)互補之間隔子序列或其片段。TGFBRII之示例性靶序列及示例性gRNA序列在下文之 表 17中提供。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 CD83基因，例如，靶向 CD83基因之外顯子2或外顯子3內之位點。在一些實例中，gRNA可靶向 CD83基因之外顯子2。此種gRNA可包含與 CD83基因之外顯子2或外顯子3中之靶序列(完全或部分)互補之間隔子序列或其片段。 CD83基因中之示例性靶序列及示例性gRNA序列在下文之 表 17中提供。在一個實例中，靶向CD83基因之gRNA可為CD83_外顯子2_ G2 (亦稱為CD83-2)。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 β2M基因，例如，靶向 β2M基因內之適合位點。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。其他gRNA序列可使用位於染色體15上之 β2M基因序列來設計(GRCh38坐標：染色體15：44,711,477-44,718,877；Ensembl：ENSG00000166710)。在一些實施例中，靶向 β2M基因體區域之gRNA及RNA引導之核酸酶在 β2M基因體區域中產生斷裂，導致 β2M基因中之插入缺失，從而中斷mRNA或蛋白質之表現。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA靶向 TRAC基因。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之主題及目的。其他gRNA序列可使用位於染色體14上之 TRAC基因序列來設計(GRCh38：染色體14：22,547,506-22,552,154；Ensembl；ENSG00000277734)。在一些實施例中，靶向 TRAC基因體區域之gRNA及RNA引導之核酸酶在 TRAC基因體區域中產生斷裂，導致 TRAC基因中之插入缺失，從而中斷mRNA或蛋白質之表現。
示例性間隔子序列及靶向 β2M基因或 TRAC基因之gRNA在下文之 表 17中提供。亦參見WO2019097305，其相關揭示內容以引用之方式併入本文中以用於本文所提及之目的及主題。
舉例說明，如下文所說明及此項技術中所述，CRISPR/Cas/Cpf1系統中使用之向導RNA或其他較小RNA可容易地藉由化學方式合成。儘管化學合成程序不斷擴展，但藉由諸如高效液相層析(HPLC，避免使用凝膠，諸如PAGE)之程序純化此類RNA往往變得更具挑戰性，此係因為多核苷酸長度顯著增加超過約一百個核苷酸。一種用於產生更長RNA之方法為產生兩個或更多個接合在一起之分子。更長RNA，諸如編碼Cas9或Cpf1核酸內切酶之彼等，更容易酶促產生。如此項技術中所述，可在RNA之化學合成及/或酶促產生期間或之後引入各種類型之RNA修飾，例如，增強穩定性、降低先天免疫反應之可能性或程度及/或增強其他屬性之修飾。
在一些實例中，本揭示案之gRNA可藉由活體外轉錄(IVT)、合成及/或化學合成方法或其組合來產生。利用酶促(IVT)、固相、液相、組合合成方法、小區域合成及接合方法。在一個實施例中，使用IVT酶促合成方法製造gRNA。藉由IVT製造多核苷酸之方法為此項技術中已知的且描述於WO2013/151666中。因此，本揭示案亦包括用於活體外轉錄本文所述之gRNA的多核苷酸，例如，DNA、構築體及載體。
如此項技術中所述，可在RNA之化學合成及/或酶促產生期間或之後引入各種類型之RNA修飾，例如，增強穩定性、降低先天免疫反應之可能性或程度及/或增強其他屬性之修飾。在一些實施例中，可在合成期間或合成後將非天然修飾之核鹼基引入本文所揭示之gRNA中之任一者中。在某些實施例中，修飾在核苷間鍵、嘌呤或嘧啶鹼基或糖上。在一些實施例中，藉由化學合成或聚合酶在gRNA之末端引入修飾。修飾之核酸及其合成之實例揭示於WO2013/052523中。修飾之多核苷酸之合成亦描述於Verma及Eckstein, Annual Review of Biochemistry, 第76卷, 99-134 (1998)中。
在一些實施例中，酶促或化學接合方法可用於將多核苷酸或其區域與不同功能部分，諸如靶向或遞送劑、螢光標記、液體、奈米粒子等結合。多核苷酸及修飾之多核苷酸之結合物在Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 第1(3)卷, 165-187 (1990)中綜述。
在本揭示案之一些實施例中，用於對本文所揭示之靶基因中之任一者進行基因編輯之CRISPR/Cas核酸酶系統可包括至少一個向導RNA。在一些實例中，CRISPR/Cas核酸酶系統可含有多個gRNA，例如，2、3或4個gRNA。此類多個gRNA可靶向同一靶基因中之不同位點。或者，多個gRNA可靶向不同基因。在一些實施例中，向導RNA及Cas蛋白可形成核糖核蛋白(RNP)，例如，CRISPR/Cas複合物。向導RNA可將Cas蛋白引導至一或多個靶基因上之靶序列，如本文所揭示之彼等，其中Cas蛋白在靶位點處使靶基因裂解。在一些實施例中，CRISPR/Cas複合物為Cpf1/向導RNA複合物。在一些實施例中，CRISPR複合物為II型CRISPR/Cas9複合物。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9蛋白。在一些實施例中，CRISPR/Cas9複合物為Cas9/向導RNA複合物。
在一些實施例中，包含一或多個特異性gRNA之特定CRISPR/Cas核酸酶系統之插入缺失頻率(編輯頻率)可使用TIDE分析來確定，該分析可用於鑑定用於編輯靶基因之高效gRNA分子。在一些實施例中，高效gRNA產生高於80%之基因編輯頻率。例如，若gRNA產生至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%之基因編輯頻率，則認為該gRNA為高效的。
將向導 RNA 及核酸酶遞送至 T 細胞
可將包含一或多個gRNA及至少一個RNA引導之核酸酶，視情況包含如下文所揭示之供體模板的本文所揭示之CRISPR/Cas核酸酶系統遞送至靶細胞(例如，T細胞)，用於經由習用方法對靶基因進行基因編輯。在一些實施例中，可將如本文所揭示之CRISPR/Cas核酸酶系統之組分獨立地、同時或依序遞送至靶細胞。在其他實施例中，可將CRISPR/Cas核酸酶系統之組分一起(例如，作為複合物)遞送至標靶中。在一些情況下，gRNA及RNA引導之核酸酶可預複合在一起以形成核糖核蛋白(RNP)，可將其遞送至靶細胞中。
RNP適用於基因編輯，至少係因為其使富含核酸之細胞環境中發生混雜相互作用之風險降至最低且保護RNA免於降解。用於形成RNP之方法為此項技術中已知的。在一些實施例中，可將含有RNA引導之核酸酶(例如，Cas核酸酶，諸如Cas9核酸酶)及靶向一或多個所關注基因之一或多個gRNA的RNP遞送至細胞(例如，T細胞)。在一些實施例中，可藉由電穿孔將RNP遞送至T細胞。
在一些實施例中，可將RNA引導之核酸酶在DNA載體中遞送至細胞，該DNA載體在細胞中表現RNA引導之核酸酶。在其他實例中，可將RNA引導之核酸酶在編碼RNA引導之核酸酶且在細胞中表現核酸酶之RNA中遞送至細胞。替代地或另外，可將靶向基因之gRNA作為RNA或在細胞中表現gRNA之DNA載體遞送至細胞。
可經由直接注射或使用已知方法之細胞轉染，例如電穿孔或化學轉染來進行RNA引導之核酸酶、gRNA及/或RNP之遞送。可使用其他細胞轉染方法。
(b) 其他基因編輯方法
除本文所揭示之CRISPR方法以外，如此項技術中已知之額外基因編輯方法亦可用於製造本文所揭示之基因工程改造之T細胞。一些實例包括涉及鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化因子樣效應核酸酶(TALEN)、限制性核酸內切酶、大範圍核酸酶歸巢核酸內切酶及類似物之基因編輯方法。
ZFN為包含與鋅指DNA結合結構域(ZFBD)融合之核酸酶的靶向核酸酶，ZFBD為經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之多肽結構域。鋅指為鋅指結合結構域內約30個胺基酸之結構域，其結構經由鋅離子之配位而穩定。鋅指之實例包括但不限於C2H2鋅指、C3H鋅指及C4鋅指。經設計之鋅指結構域為自然界中不存在之結構域，其設計/組成主要源於合理之準則，例如，應用替代規則及電腦化演算法來處理存儲現有ZFP設計及結合數據之資訊的數據庫中之資訊。參見例如美國專利第6,140,081號、第6,453,242號及第6,534,261號；亦參見WO 98/53058、WO 98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536及WO 03/016496。選定之鋅指結構域為自然界中未發現之結構域，其產生主要源於經驗過程，諸如噬菌體呈現、相互作用阱或雜交選擇。ZFN更詳細地描述於美國專利第7,888,121號及美國專利第7,972,854號中。ZFN之最公認實例為FokI核酸酶與鋅指DNA結合結構域之融合。
TALEN為包含與TAL效應子DNA結合結構域融合之核酸酶的靶向核酸酶。「轉錄活化因子樣效應子DNA結合結構域」、「TAL效應子DNA結合結構域」或「TALE DNA結合結構域」為負責TAL效應蛋白與DNA結合之TAL效應蛋白之多肽結構域。TAL效應蛋白係由黃單胞菌屬之植物病原體在感染期間分泌。此等蛋白質進入植物細胞核，經由其DNA結合結構域結合效應子特異性DNA序列，且經由其反式活化結構域活化此等序列處之基因轉錄。TAL效應子DNA結合結構域之特異性取決於不完全34胺基酸重複之效應子可變數目，該等重複包含選定重複位置處之多態性，稱為重複可變雙殘基(RVD)。TALEN更詳細地描述於美國專利申請案第2011/0145940號中。此項技術中TALEN之最公認實例為FokI核酸酶與TAL效應子DNA結合結構域之融合多肽。
適合用於如本文所提供之用途的靶向核酸酶之額外實例包括但不限於Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1及Wβ/SPBc/TP901-1，無論個別使用抑或組合使用。
本文所揭示之核酸酶中之任一者可使用載體系統遞送，包括但不限於質體載體、DNA微環、反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體；疱疹病毒載體及腺相關病毒載體，及其組合。
可使用習用基於病毒及非病毒之基因轉移方法將編碼核酸酶之核酸及供體模板引入細胞(例如，T細胞)中。非病毒載體遞送系統包括DNA質體、DNA微環、裸核酸及與諸如脂質體或泊洛沙姆(poloxamer)之遞送載體複合之核酸。病毒載體遞送系統包括DNA及RNA病毒，其在遞送至細胞後具有游離基因體或整合基因體。
核酸之非病毒遞送方法包括電穿孔、脂轉染(lipofection)、顯微注射、生物彈道(biolistics)、病毒體、脂質體、免疫脂質體、聚陽離子或脂質:核酸結合物、裸DNA、裸RNA、加帽RNA、人工病毒粒子及劑增強之DNA攝取。使用例如Sonitron 2000系統(Rich-Mar)之聲致穿孔亦可用於遞送核酸。下文提供一些特定實例。
II. 表現嵌合抗原受體 ( CAR) 之基因工程改造之 T 細胞
本文揭示基因工程改造之T細胞，其包含編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD83 CAR)之核酸、中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因或其組合，且視情況包含中斷之 CD83基因。視情況，此類基因工程改造之T細胞可包含額外中斷基因中之一或多者，例如，如本文所揭示之 β2M、 TRAC或其組合。
(a) 嵌合抗原受體 (CAR)
嵌合抗原受體(CAR)係指人工免疫細胞受體，其經工程改造以識別及結合由非所需之細胞(例如，疾病細胞，諸如癌細胞)表現之抗原。表現CAR多肽之T細胞稱作CAR T細胞。CAR具有以非MHC限制之方式將T細胞特異性及反應性重定向至選定標靶之能力。非MHC限制之抗原識別為CAR-T細胞提供獨立於抗原加工而識別抗原之能力，由此避開腫瘤逃逸之主要機制。此外，當在T細胞上表現時，CAR有利地不與內源T細胞受體(TCR) α及β鏈二聚化。
存在多代CAR，各代含有不同組分。第一代CAR經由鉸鏈及跨膜結構域將源自抗體之scFv連接至T細胞受體之CD3zeta (ζ或z)細胞內信號傳導結構域。第二代CAR併有額外共刺激結構域，例如，CD28、4-1BB (41BB)或ICOS，以提供共刺激信號。第三代CAR含有兩個與TCR CD3ζ鏈融合之共刺激結構域(例如，CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40之組合)。(Maude等人, Blood.2015; 125(26):4017-4023；Kakarla及Gottschalk, Cancer J.2014; 20(2):151-155)。各代CAR構築體中之任一者在本揭示案之範疇內。
一般而言，CAR為融合多肽，其包含識別靶抗原之細胞外結構域(例如，抗體或其他抗體片段之單鏈片段(scFv))及包含T細胞受體(TCR)複合物之信號傳導結構域之細胞內結構域(例如，CD3ζ)，且在大多數情況下為共刺激結構域。(Enblad等人, Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505)。CAR構築體可進一步包含介於細胞外結構域與細胞內結構域之間的鉸鏈及跨膜結構域，以及用於表面表現之N末端信號肽。信號肽之實例包括下文之 表 22中提供之SEQ ID NO:82及SEQ ID NO:83。可使用其他信號肽。
(i) 抗原結合細胞外結構域
抗原結合細胞外結構域為當CAR在細胞表面上表現時暴露於細胞外液之CAR多肽區域。在一些情況下，信號肽可位於N末端以促進細胞表面表現。在一些實施例中，抗原結合結構域可為單鏈可變片段(scFv，其可包括抗體重鏈可變區(V H)及抗體輕鏈可變區(V L) (在任一取向上)。在一些情況下，V H及V L片段可經由肽連接子連接。在一些實施例中，連接子包括親水性殘基，帶有用於可撓性之甘胺酸及絲胺酸段以及用於增加溶解度之麩胺酸及離胺酸段。scFv片段保留scFv片段所來源之親本抗體之抗原結合特異性。在一些實施例中，scFv可包含人源化V H及/或V L結構域。在其他實施例中，scFv之V H及/或V L結構域為完全人類的。
抗原結合細胞外結構域可為特異性CD83，其為免疫細胞，例如自體反應性免疫細胞或同種異體反應性免疫細胞上之細胞表面受體，以及某些癌細胞，諸如白血病細胞上之細胞表面受體。
在一些實施例中，抗原結合細胞外結構域可為結合如本文所揭示之腫瘤抗原之單鏈可變片段(scFv)。scFv可包含抗體重鏈可變區(V H)及抗體輕鏈可變區(V L)，其視情況可經由可撓性肽連接子連接。在一些情況下，scFv可具有V H至V L取向(自N末端至C末端)。或者，scFv可具有V L至V H取向(自N末端至C末端)。
在一些實例中，抗原結合細胞外結構域可為結合人類CD83之單鏈可變片段(scFv)。在一些情況下，抗CD83 scFv可包含(i)重鏈可變區(V H)，其包含與SEQ ID NO:77中之彼等相同之重鏈互補決定區(CDR)；及(ii)輕鏈可變區(V L)，其包含與SEQ ID NO:78中之彼等相同之輕鏈CDR。在一些特定實例中，本文所揭示之抗CD83抗體可包含如藉由Kabat方法確定的分別如SEQ ID NO: 71、72及73所示之重鏈CDR1、重鏈CDR2及重鏈CDR3。替代地或另外，本文所揭示之抗CD83抗體可包含如藉由Kabat方法確定的分別如SEQ ID NO: 74、75及76所示之輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3。在一個特定實例中，抗CD83 scFv可包括包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列之V H及包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列之V L。參見下文之 表 22。亦參見美國臨時申請案第63/303,666號，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。
具有相同V H及/或V LCDR之兩種抗體意指當藉由相同方法(例如，如此項技術中已知之Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、Contact方法或IMGT方法，參見例如bioinf.org.uk/abs/或abysis.org/abysis/sequence_input)確定時，其CDR為相同的。
(ii) 跨膜結構域
本文所揭示之CAR多肽可含有跨膜結構域，其可為跨膜之疏水性α螺旋。如本文所用，「跨膜結構域」係指在細胞膜，較佳為真核細胞膜中熱力學穩定之任何蛋白質結構。跨膜結構域可為含有此類之CAR提供穩定性。
在一些實施例中，如本文所提供之CAR之跨膜結構域可為CD8跨膜結構域。在其他實施例中，跨膜結構域可為CD28跨膜結構域。在其他實施例中，跨膜結構域為CD8及CD28跨膜結構域之嵌合體。如本文所提供，可使用其他跨膜結構域。在一些實施例中，跨膜結構域為含有如下文之 表 22中所提供之SEQ ID NO:87之序列的CD8a跨膜結構域。可使用其他跨膜結構域。
(iii) 鉸鏈結構域
在一些實施例中，鉸鏈結構域可位於CAR之細胞外結構域(包含抗原結合結構域)與跨膜結構域之間，或位於CAR之細胞質結構域與跨膜結構域之間。鉸鏈結構域可為任何寡肽或多肽，其功能在於將跨膜結構域連接至多肽鏈中之細胞外結構域及/或細胞質結構域。鉸鏈結構域之功能可在於為CAR或其結構域提供可撓性，或防止CAR或其結構域之空間位阻。
在一些實施例中，鉸鏈結構域可包含至多300個胺基酸(例如，10至100個胺基酸，或5至20個胺基酸)。在一些實施例中，一或多個鉸鏈結構域可包括於CAR之其他區域中。在一些實施例中，鉸鏈結構域可為CD8鉸鏈結構域。可使用其他鉸鏈結構域。
(iv) 細胞內信號傳導結構域
CAR構築體中之任一者含有一或多個細胞內信號傳導結構域(例如，CD3ζ，及視情況存在之一或多個共刺激結構域)，其為受體之功能末端。抗原識別後，受體簇集且將信號傳輸至細胞。
CD3ζ為T細胞受體複合物之細胞質信號傳導結構域。CD3ζ含有三(3)個基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)，其在T細胞與同源抗原嚙合後將活化信號傳輸至T細胞。在許多情況下，CD3ζ提供初級T細胞活化信號，但不為完全有效之活化信號，此需要共刺激信號傳導。
在一些實施例中，本文所揭示之CAR多肽可進一步包含一或多個共刺激信號傳導結構域。舉例而言，CD28及/或4-1BB之共刺激結構域可用於傳輸完全增殖/存活信號，以及由CD3ζ介導之初級信號傳導。在一些實例中，本文所揭示之CAR包含CD28共刺激分子。在其他實例中，本文所揭示之CAR包含4-1BB共刺激分子。在一些實施例中，CAR包括CD3ζ信號傳導結構域及CD28共刺激結構域。在其他實施例中，CAR包括CD3ζ信號傳導結構域及4-1BB共刺激結構域。在其他實施例中，CAR包括CD3ζ信號傳導結構域、CD28共刺激結構域及4-1BB共刺激結構域。
表 22提供可在本文中使用之來源於4-1BB、CD28及CD3-ζ之信號傳導結構域之實例。在特定實例中，本文所揭示之抗CD83 CAR可包含SEQ ID NO:80 (有信號肽)或SEQ ID NO:81 (無信號肽)之胺基酸序列，其可由SEQ ID NO:95之核苷酸序列編碼。參見下文之 表 19及 表 20 。
(b) 將 CAR 構築體遞送至 T 細胞
在一些實施例中，可藉由熟習此項技術者已知之方法將編碼CAR之核酸引入本文所揭示之基因工程改造之T細胞中之任一者中。舉例而言，可將CAR之編碼序列選殖至載體中，可將該載體引入基因工程改造之T細胞中以用於表現CAR。此項技術中已知之多種不同方法可用於將本文所揭示之核酸或表現載體中之任一者引入免疫效應細胞中。將核酸引入細胞中之方法的非限制性實例包括：脂轉染、轉染(例如，磷酸鈣轉染、使用高度分支之有機化合物之轉染、使用陽離子聚合物之轉染、基於樹枝狀聚合物之轉染、光學轉染、基於粒子之轉染(例如，奈米粒子轉染)，或使用脂質體(例如，陽離子脂質體)之轉染)、顯微注射、電穿孔、細胞擠壓、聲致穿孔、原生質體融合、穿刺轉染、流體動力遞送、基因槍、磁轉染、病毒轉染及核轉染。
在特定實例中，可使用腺相關病毒(AAV)將編碼CAR構築體之核酸遞送至細胞。AAV為小病毒，其以位點特異性方式整合至宿主基因體中且因此可遞送轉殖基因，諸如CAR。反向末端重複(ITR)存在於AAV基因體及/或所關注之轉殖基因側翼且充當複制起點。AAV基因體中亦存在rep及cap蛋白，其在轉錄時形成衣殼，該衣殼囊封AAV基因體以遞送至靶細胞中。此等衣殼上之表面受體賦予AAV血清型，此決定衣殼主要結合哪些靶器官且因此決定AAV最有效地感染哪些細胞。當前已知有十二種人類AAV血清型。在一些實施例中，用於遞送CAR編碼核酸之AAV為AAV血清型6 (AAV6)。
出於若干原因，腺相關病毒為基因療法最頻繁使用之病毒之一。首先，AAV在向哺乳動物(包括人類)投與後不會引起免疫反應。其次，將AAV有效地遞送至靶細胞，特別為在考慮選擇適當AAV血清型時。最後，AAV具有感染分裂細胞及非分裂細胞兩者之能力，此係因為基因體可在宿主細胞中持續存在而無需整合。此種特性使其成為基因療法之理想候選者。
可設計編碼CAR之核酸以插入宿主T細胞中所關注之基因體位點中。在一些實施例中，靶基因體位點可在安全港基因座中。
在一些實施例中，可設計編碼CAR之核酸(例如，經由供體模板，該供體模板可由病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，以使其可插入所關注之基因內之位置中來中斷所關注之基因的表現。在一些情況下，可設計病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體，以使其可插入 TRAC基因內之位置中來中斷基因工程改造之T細胞中之 TRAC基因且表現CAR多肽。 TRAC之中斷導致內源TCR之功能喪失。舉例而言， TRAC基因之中斷可用核酸內切酶，諸如本文所述之彼等及靶向一或多個 TRAC基因體區域之一或多個gRNA產生。參見下文之 表 17。對 TRAC基因及本文所揭示之靶區域具有特異性之gRNA中之任一者可用於此目的。
在一些實施例中，中斷之所關注基因可包含片段之缺失，該片段可為用於製造中斷基因之向導RNA之靶位點。在一些情況下，缺失之片段可由包含編碼CAR多肽之核苷酸序列之供體模板置換。
在一些實例中，可藉由同源定向修復或HDR (例如，使用供體模板，該供體模板可為病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體之一部分)來產生 TRAC基因之基因體缺失及由CAR編碼區段進行之置換。在一些實施例中， TRAC基因之中斷可用核酸內切酶，如本文所揭示之彼等及靶向一或多個 TRAC基因體區域且將CAR編碼區段插入 TRAC基因中之一或多個gRNA產生。
在一些實施例中，可設計編碼CAR之核酸(例如，經由供體模板，該供體模板可由病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，以使其可插入 β2M基因內之位置中來中斷基因工程改造之T細胞中之 β2M基因且表現CAR多肽。 β2M之中斷導致內源MHC I類複合物之功能喪失。舉例而言， β2M基因之中斷可用核酸內切酶，諸如本文所述之彼等及靶向一或多個 β2M基因體區域之一或多個gRNA產生。對 β2M基因及本文所揭示之靶區域具有特異性之gRNA中之任一者可用於此目的。
在一些實例中，可藉由同源定向修復或HDR (例如，使用供體模板，該供體模板可為病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體之一部分)來產生 β2M基因之基因體缺失及由CAR編碼區段進行之置換。在一些實施例中， β2M基因之中斷可用核酸內切酶，如本文所揭示之彼等及靶向一或多個 β2M基因體區域且將CAR編碼區段插入 β2M基因中之一或多個gRNA產生。
在一些實施例中，可設計編碼CAR之核酸(例如，經由供體模板，該供體模板可由病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，以使其可插入 CD83基因內之位置中來中斷基因工程改造之T細胞中之 CD83基因且表現CAR多肽。 CD83之中斷導致內源CD83蛋白之功能喪失。舉例而言， CD83基因之中斷可用核酸內切酶，諸如本文所述之彼等及靶向一或多個 CD83基因體區域之一或多個gRNA產生。對 CD83基因及本文所揭示之靶區域具有特異性之gRNA中之任一者可用於此目的。
在一些實例中，可藉由同源定向修復或HDR (例如，使用供體模板，該供體模板可為病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體之一部分)來產生 CD83基因之基因體缺失及由CAR編碼區段進行之置換。在一些實施例中， CD83基因之中斷可用核酸內切酶，如本文所揭示之彼等及靶向一或多個 Reg1基因體區域且將CAR編碼區段插入 CD83基因中之一或多個gRNA產生。
在一些實施例中，可設計編碼CAR之核酸(例如，經由供體模板，該供體模板可由病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，以使其可插入 Reg1基因內之位置中來中斷基因工程改造之T細胞中之 Reg1基因且表現CAR多肽。 Reg1之中斷導致內源Reg1蛋白之功能喪失。舉例而言， Reg1基因之中斷可用核酸內切酶，諸如本文所述之彼等及靶向一或多個 Reg1基因體區域之一或多個gRNA產生。對 Reg1基因及本文所揭示之靶區域具有特異性之gRNA中之任一者可用於此目的。
在一些實例中，可藉由同源定向修復或HDR (例如，使用供體模板，該供體模板可為病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體之一部分)來產生 Reg1基因之基因體缺失及由CAR編碼區段進行之置換。在一些實施例中， Reg1基因之中斷可用核酸內切酶，如本文所揭示之彼等及靶向一或多個 Reg1基因體區域且將CAR編碼區段插入 Reg1基因中之一或多個gRNA產生。
在一些實施例中，可設計編碼CAR之核酸(例如，經由供體模板，該供體模板可由病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體攜帶)，以使其可插入 TGFBRII基因內之位置中來中斷基因工程改造之T細胞中之 TGFBRII基因且表現CAR多肽。 Reg1之中斷導致內源TGFBRII受體之功能喪失。舉例而言， TGFBRII基因之中斷可用核酸內切酶，諸如本文所述之彼等及靶向一或多個 TGFBRII基因體區域之一或多個gRNA產生。對 TGFBRII基因及本文所揭示之靶區域具有特異性之gRNA中之任一者可用於此目的。
在一些實例中，可藉由同源定向修復或HDR (例如，使用供體模板，該供體模板可為病毒載體，諸如腺相關病毒(AAV)載體之一部分)來產生 TGFBRII基因之基因體缺失及由CAR編碼區段進行之置換。在一些實施例中， TGFBRII基因之中斷可用核酸內切酶，如本文所揭示之彼等及靶向一或多個 TGFBRII基因體區域且將CAR編碼區段插入 TGFBRII基因中之一或多個gRNA產生。
如本文所揭示之供體模板可含有CAR之編碼序列。在一些實例中，CAR編碼序列可側接有兩個同源區域以允許使用此項技術中已知之基因編輯方法在所關注之基因體位置處，例如在 TRAC基因處進行有效HDR。在一些實例中，可使用基於CRISPR之方法。在此種情況下，靶基因座處之兩股DNA可由對靶基因座具有特異性之gRNA引導之CRISPR Cas9酶切割。接著進行HDR以修復雙股斷裂(DSB)且插入編碼CAR之供體DNA。為使其正確發生，供體序列經設計具有與靶基因(下文稱為「同源臂」)，諸如 TRAC基因中之DSB位點周圍之序列互補之側翼殘基。此等同源臂充當DSB修復之模板且使HDR成為基本上無錯誤之機制。同源定向修復(HDR)率為突變與切割位點之間距離的函數，因此選擇重疊或附近之靶位點為重要的。模板可包括由同源區域側接之額外序列，或可含有與基因體序列不同之序列，由此允許序列編輯。
或者，供體模板可能不具有與DNA中之靶向位置同源之區域，且可在靶位點處裂解後藉由NHEJ依賴性末端連接進行整合。
供體模板可為單股及/或雙股DNA或RNA，且可呈線性或環狀形式引入細胞中。若以線性形式引入，則可藉由熟習此項技術者已知之方法保護供體序列之末端(例如，免於核酸外切降解)。舉例而言，將一或多個雙去氧核苷酸殘基添加至線性分子之3'末端及/或將自身互補之寡核苷酸連接至一端或兩端。參見例如Chang等人, (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963；Nehls等人, (1996) Science272:886-889。保護外源多核苷酸免於降解之額外方法包括但不限於添加末端胺基及使用修飾之核苷酸間連接，諸如硫代磷酸酯、胺基磷酸酯及O-甲基核糖或去氧核糖殘基。
可將供體模板作為具有額外序列，諸如復制起點、啟動子及編碼抗生素抗性之基因之載體分子的一部分引入細胞中。此外，可將供體模板作為裸核酸、作為與諸如脂質體或泊洛沙姆之劑複合之核酸引入細胞中，或可由病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、反轉錄病毒、慢病毒及整合酶缺陷慢病毒(IDLV))遞送。
在一些實施例中，可將供體模板插入內源啟動子附近(例如，下游或上游)之位點，以使其表現可由內源啟動子驅動。在其他實施例中，供體模板可包含外源啟動子及/或增強子，例如，組成型啟動子、誘導型啟動子或組織特異性啟動子以控制CAR基因之表現。在一些實施例中，外源啟動子為EF1α啟動子，參見例如下文之 表 23中提供之SEQ ID NO:94。可使用其他啟動子。
此外，外源序列亦可包括轉錄或轉譯調控序列，例如，啟動子、增強子、絕緣子、內部核糖體進入位點、編碼2A肽之序列及/或聚腺苷酸化信號。
當需要時，可將額外基因編輯(例如，基因敲入或剔除)引入如本文所揭示之治療性T細胞中以改良T細胞功能及治療功效。舉例而言，若可進行 β2M中斷以降低宿主抗移植物反應之風險或防止宿主抗移植物反應。其他實例包括敲入或剔除基因以改良靶細胞溶解，敲入或剔除基因以增強治療性T細胞，諸如CAR-T細胞之效能。
在一些實例中，用於遞送抗CD83 CAR之供體模板可為插入有核酸片段之AAV載體，該核酸片段包含抗CD83 CAR之編碼序列，且視情況包含用於表現抗CD83 CAR之調控序列(例如，啟動子，諸如下文之 表 23中提供之EF1α啟動子)，其可側接有用於將編碼序列及調控序列插入所關注之基因體基因座中之同源臂。在一些實例中，將核酸片段插入內源 TRAC基因座中，從而中斷 TRAC基因之表現。在特定實例中，核酸可置換 TRAC基因中之片段，例如，包含SEQ ID NO:7之核苷酸序列之片段。在一些特定實例中，用於遞送抗CD83 CAR之供體模板可包含SEQ ID NO:95之核苷酸序列，可將其插入中斷之 TRAC基因中，例如，置換SEQ ID NO:7之片段。
具有中斷之 Reg1基因、額外中斷之基因(例如， β2M及/或 TRAC)且進一步表現嵌合抗原受體(CAR)的基因工程改造之T細胞可藉由連續靶向所關注之基因而產生。舉例而言，在一些實施例中，可首先中斷 Reg1基因，繼而中斷 TRAC及 β2M基因且插入CAR。在其他實施例中，可首先中斷 TRAC及 β2M基因，繼而插入CAR且中斷 Reg1基因。因此，在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可藉由多個連續電穿孔事件而產生，其中多個RNP靶向所關注之基因，例如， Reg1、 β2M、 TRAC等。
具有中斷之 TGFBRII基因、額外中斷之基因(例如， β2M及/或 TRAC)且進一步表現嵌合抗原受體(CAR)的基因工程改造之T細胞可藉由連續靶向所關注之基因而產生。舉例而言，在一些實施例中，可首先中斷 TGFBRII基因，繼而中斷 TRAC及 β2M基因且插入CAR。在其他實施例中，可首先中斷 TRAC及 β2M基因，繼而插入CAR且中斷 TGFBRII基因。因此，在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可藉由多個連續電穿孔事件而產生，其中多個RNP靶向所關注之基因，例如， TGFBRII、 β2M、 TRAC等。
具有中斷之 CD83基因、額外中斷之基因(例如， β2M及/或 TRAC)且進一步表現嵌合抗原受體(CAR)的基因工程改造之T細胞可藉由連續靶向所關注之基因而產生。舉例而言，在一些實施例中，可首先中斷 CD83基因，繼而中斷 TRAC及/或 β2M基因且插入CAR。在其他實施例中，可首先中斷 TRAC及/或 β2M基因，繼而插入CAR且中斷 CD83基因。因此，在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可藉由多個連續電穿孔事件而產生，其中多個RNP靶向所關注之基因，例如， CD83及視情況存在之 β2M及/或 TRAC。
在其他實施例中，本文所揭示之基因工程改造之CAR T細胞可藉由單個電穿孔事件而產生，其中RNP複合物包含RNA引導之核酸酶且多個gRNA靶向所關注之基因，例如， Reg1、 TGFBRII 、 CD83 、 β2M及/或 TRAC。
(c) 表現嵌合抗原受體 (CAR) 之示例性基因工程改造之 T 細胞
應了解，基因中斷包括經由基因編輯進行之基因修飾(例如，使用CRISPR/Cas基因編輯來插入或缺失一或多個核苷酸)。中斷之基因相對於野生型對應物可含有一或多個突變(例如，插入、缺失或核苷酸取代等)，從而實質上降低或完全消除編碼之基因產物的活性。一或多個突變可位於非編碼區，例如啟動子區、調控轉錄或轉譯之調控區、或內含子區中。或者，一或多個突變可位於編碼區中(例如，外顯子中)。在一些情況下，中斷之基因不表現編碼蛋白質或表現水準實質上降低之編碼蛋白質。在其他情況下，中斷之基因以突變形式表現編碼蛋白質，該蛋白質無功能或具有實質上降低之活性。在一些實施例中，中斷之基因為不編碼功能蛋白質之基因。在一些實施例中，包含中斷基因之細胞不表現(例如，在細胞表面處)可偵測水準(例如藉由抗體，例如藉由流式細胞術)之由該基因編碼之蛋白質。不表現可偵測水準之蛋白質的細胞可稱作剔除細胞。舉例而言，若使用特異性地結合CD83蛋白之抗體無法在細胞表面處偵測到CD83蛋白，則具有 CD83基因編輯之細胞可視為 CD83剔除細胞。
在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之免疫細胞(諸如T細胞)群體表現CAR (例如，抗CD83 CAR)、中斷之Reg1基因、中斷之TGFBRII基因或其組合，且視情況表現中斷之 CD83基因。基因工程改造之T細胞可進一步包含中斷之 TRAC基因及/或中斷之 β2M基因。可將編碼CAR之核苷酸序列插入所關注之基因體位點中，例如，中斷之 TRAC基因中(例如，置換由sgRNA，諸如下文之 表 17中提供之TA-1靶向之位點)、中斷之 β2M基因中(置換sgRNA，諸如下文之 表 17中提供之β2M-1靶向之位點)、中斷之 CD83基因中(例如，置換sgRNA，諸如下文之 表 17中提供之彼等靶向之位點)、中斷之Reg1基因中(例如，置換由 表 17中列出之sgRNA靶向之位點)，或中斷之TGFBRII基因中(例如，置換由 表 17中列出之sgRNA靶向之位點)。
在一些實例中，此種基因工程改造之T細胞群體可包含至少50%之Reg1 -細胞，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多之Reg1 -細胞。在一些實例中，此種基因工程改造之T細胞群體可包含至少50%之TGFBRII -細胞，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多之TGFBRII -細胞。
在一些實例中，此種基因工程改造之T細胞群體可包含至少50%之CD83 -細胞，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多之CD83 -細胞。替代地或另外，基因工程改造之T細胞群體可包含至少50%之TCR -細胞，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更高之TCR -細胞。替代地或另外，基因工程改造之T細胞群體可包含至少50%之β2M -細胞，例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更高之β2M -細胞。在一些情況下，基因工程改造之T細胞群體可包含至少40%之CAR+細胞(例如，抗CD83 CAR+細胞)，例如，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多之CAR+細胞。
在一些實例中，基因工程改造之T細胞群體可包含至少50%之工程改造之T細胞，該等T細胞表現可偵測水準之CAR (例如，抗CD83 CAR)且在細胞表面上不表現可偵測水準之CD83。
本文所揭示之抗CD83 CAR-T細胞中之任一者可進一步表現第二嵌合抗原受體，其可對不同於CD83之腫瘤抗原具有特異性。在一些情況下，第二嵌合抗原受體可為相對於抗CD83 CAR之獨立多肽。在其他情況下，第二嵌合抗原受體可與抗CD83 CAR形成雙特異性CAR。在一些實施例中，腫瘤抗原為「腫瘤相關抗原」，其係指免疫原性分子，諸如蛋白質，其在腫瘤細胞中之表現水準一般高於非腫瘤細胞中之水準，在非腫瘤細胞中其可能根本不表現，或僅以低水準表現。在一些實施例中，由帶有腫瘤之宿主之免疫系統識別的腫瘤相關結構稱作腫瘤相關抗原。在一些實施例中，若腫瘤相關抗原由大多數類型之腫瘤廣泛表現，則其為通用腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤相關抗原為分化抗原、突變抗原、過表現之細胞抗原或病毒抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為「腫瘤特異性抗原」或「TSA」，其係指腫瘤細胞所特有之免疫原性分子，諸如蛋白質。腫瘤特異性抗原僅在腫瘤細胞中，例如在特定類型之腫瘤細胞中表現。示例性腫瘤抗原包括但不限於CD19、BCMA、CD70及CD33。
(d) 消炎劑
在一些實施例中，本文所揭示之抗CD83 CAR-T細胞中之任一者可與一或多種消炎劑共同使用。如本文所揭示之消炎劑係指能夠抑制炎性反應之任何劑(例如，多肽或蛋白質)。在一些實施例中，消炎劑可為促炎細胞介素(例如，IL-1、IL-6、TNF-α及B細胞活化因子(BAFF))之拮抗劑(例如，抗體)。在其他實施例中，消炎劑可為抑制T細胞共活化之劑，例如，結合T細胞共刺激受體或其配位體之抗體或配位體，從而阻斷共刺激信號傳導路徑。在一些實施例中，消炎劑可為CTLA-4-Fc融合多肽。
細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)，亦稱為CD152，為在負反饋迴路中發揮作用以減少或減弱T細胞活化之共抑制分子。其與CD28競爭結合至CD80或CD86，從而抑制T細胞共刺激。CTLA-4為充分表徵之蛋白質。來自各種物種之CTLA-4蛋白可在公共數據庫，例如GenBank中找到。舉例而言，人類CTLA-4之結構資訊可在GenBank中以Gene ID: 1493找到，且相應基因轉錄物之相應胺基酸序列可例如以NM_005214.5及NM_001037631.3找到。
本文所揭示之CTLA-4-Fc融合多肽可包含與抗體重鏈恆定區之Fc片段融合的CTLA-4蛋白(例如，人類CTLA-4)之細胞外結構域。本文所揭示之CTLA-4-Fc融合多肽之CTLA-4部分可來自野生型CTLA-4蛋白(例如，野生型人類CTLA-4蛋白)。或者，CTLA-4部分相對於野生型對應物可包含一或多個突變以改良一或多種所需特徵。舉例而言，CTLA-4部分在位置A29、位置L104或其組合處可包含突變。在一些情況下，突變為胺基酸殘基取代，例如，A29Y及/或L104E。替代地或另外，CTLA-4部分相對於野生型對應物可包含一或多個保守變異。在特定實例中，本文所揭示之CTLA-4-Fc融合多肽中之CTLA-4部分與阿巴西普中之CTLA-4部分相同。在其他特定實例中，本文所揭示之CTLA-4-Fc融合多肽中之CTLA-4部分與貝拉西普中之CTLA-4部分相同。
用於製造CTLA-4-融合多肽中之任一者的Fc片段可來自任何抗體亞組，例如IgG、IgA、IgE、IgD或IgG，例如抗體重鏈之鉸鏈-CH2-CH3結構域。在一些情況下，Fc片段可來自IgG分子之亞家族，例如，IgG1或IgG4。在一些實例中，Fc片段屬於野生型免疫球蛋白重鏈。或者，Fc片段相對於野生型對應物可包含一或多個突變，用於調節效應活性及/或用於減少非所需之二硫鍵形成。此類突變可包括鉸鏈結構域中之突變(例如，半胱胺酸至絲胺酸之取代)。
III. 治療應用
將預期使用本文所揭示之基因工程改造之T細胞產生之治療性T細胞維持藉由 Reg1基因之中斷、 TGFBRII基因之中斷及視情況 CD83基因之中斷或其組合實現的T細胞健康。舉例而言，維持T細胞健康可在製造期間延長擴增，從而增加產率及一致性。在另一個實例中，維持T細胞健康可挽救衰竭/不健康之T細胞，從而能夠潛在降低患者之劑量且產生更穩固之反應。亦將預期本文所揭示之抗CD83 CAR-T細胞降低與CAR-T療法相關之GvHD風險。
可向個體投與本文所揭示之治療性T細胞以用於治療目的，例如，治療自體免疫疾病或癌症。
投與步驟可包括藉由使治療性T細胞至少部分定位於所需位點，諸如腫瘤位點之方法或途徑將治療性T細胞置放(例如，移植)至個體中，從而可產生所需作用。可藉由遞送至個體中之所需位置的任何適當途徑投與治療性T細胞，在該位置處至少一部分植入細胞或細胞組分保持存活。向個體投與後細胞之存活期可短至數小時，例如二十四小時，至數天，至長達數年，或甚至個體之一生，亦即，長期植入。舉例而言，在本文所述之一些態樣中，可經由全身投藥途徑，諸如腹膜內或靜脈內途徑投與有效量之治療性T細胞。
在一些實施例中，全身投與治療性T細胞，其係指以除向靶位點、組織或器官中直接投與之方式投與細胞群體，使其實際上進入個體之循環系統且因此經歷代謝及其他類似過程。適合之投藥模式包括注射、輸注、滴注或攝入。注射包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、心室內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、腦脊髓內及胸骨內注射及輸注。在一些實施例中，途徑為靜脈內。
個體可為需要診斷、治療或療法之任何個體。在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人。
在一些情況下，治療性T細胞對於個體而言可為自體的(「自身的」)，亦即，細胞來自同一個體。或者，治療性T細胞對於個體而言可為非自體的(「非自身的」，例如，同種異體的、同基因的或異種的)。「同種異體」意指治療性T細胞不來源於接受治療之個體，而來源於與個體相同物種之不同個體(供體)。供體為並非所治療之個體的個體。供體為並非患者之個體。在一些實施例中，供體為未患有或未疑似患有所治療之癌症的個體。在一些實施例中，使用多個供體，例如，兩個或更多個供體。
在一些實施例中，根據本文所述之方法投與之工程改造之T細胞群體包含自一或多個供體獲得之同種異體T細胞。同種異體係指自相同物種之一或多個不同供體獲得之細胞、細胞群體或包含細胞之生物樣品，其中一或多個基因座處之基因與接受體(例如，個體)不同。舉例而言，向個體投與之工程改造之T細胞群體可來源於一或多個不相關之供體，或來源於一或多個不同之同胞。在一些實施例中，可使用同基因細胞群體，諸如自基因相同之供體(例如，同卵雙胞胎)獲得之彼等。在一些實施例中，細胞為自體細胞；亦即，工程改造之T細胞自個體中獲得或分離且向同一個體投與，亦即，供體與接受體為相同的。
有效量係指預防或減輕醫學疾患(例如，癌症)之至少一或多種體徵或症狀所需之工程改造之T細胞群體的量，且涉及足以提供所需作用，例如治療患有醫學疾患之個體之組合物的量。有效量亦包括足以預防或延緩疾病症狀之發展、改變疾病症狀之過程(例如但不限於減緩疾病症狀之進展)或逆轉疾病症狀之量。應了解，對於任何給定之情況，可由一般熟習此項技術者使用常規實驗來確定適當有效量。
由於本文所揭示之治療性T細胞之持久性及功效增強，因此本文所提供之治療性T細胞之劑量將低於藉由習用方法製備之CAR-T細胞的標準劑量(例如，使用不具有本文所揭示之基因編輯事件中之一或多者的T細胞，該等基因編輯事件包括中斷之 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因及/或中斷之 CD83基因)。在一些實例中，本文所揭示之治療性T細胞之有效量可比CAR-T療法之標準劑量低至少2倍、低至少5倍、低至少10倍、低至少20倍、低至少50倍或低至少100倍。在一些實例中，本文所揭示之治療性T細胞之有效量可少於10 6個細胞，例如，10 5個細胞、5x10 4個細胞、10 4個細胞、5x10 3個細胞或10 3個細胞。在本文所述之一些實例中，細胞在向有需要之個體投與之前在培養物中擴增。
使用本文所揭示之治療性T細胞之治療功效可由熟練之臨床醫師確定。若以有益方式改變(例如，增加至少10%)體徵或症狀中之任一者或全部，如僅舉一例，功能標靶之水準，或者改良或改善其他臨床上接受之疾病(例如，癌症)症狀或標誌物，則治療視為「有效的」。亦可藉由個體未能發生如藉由住院治療或需要醫療干預所評估之惡化來量測功效(例如，疾病之進展停止或至少減緩)。量測此等指標之方法為熟習此項技術者已知的及/或描述於本文中。治療包括對個體疾病之任何治療且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或減緩症狀之進展；或(2)減輕疾病，例如，引起症狀消退；及(3)預防或減少症狀發展之可能性。
在一些實施例中，本文所揭示之基因工程改造之T細胞可用於消除非所需之CD83+細胞。在一些實例中，非所需之細胞為癌細胞(例如，CD83+癌細胞)。表現抗CD83 CAR之基因工程改造之T細胞可用於治療CD83+癌症。在其他實例中，非所需之細胞為免疫細胞(例如，CD83+ B細胞或CD83+樹突狀細胞)。在一些情況下，表現抗CD83 CAR之基因工程改造之T細胞可用於治療免疫病症，例如，CD83+免疫細胞在其中起作用之彼等。免疫病症可為自體免疫疾病、敗血症、風濕病、糖尿病或氣喘。
可向個體投與具有中斷之Reg1及/或TGFBRII基因，視情況具有中斷之CD83基因且視情況具有中斷之 TRAC及/或 β2M基因之基因工程改造之抗CD83 CAR-T細胞中之任一者以用於治療目的，例如，治療與CD83+疾病細胞相關之疾病(例如，癌症或免疫疾病，諸如自體免疫疾病)。示例性免疫疾病包括狼瘡以及慢性及急性GvHD。示例性癌症可為造血系統癌症，例如，AML、CD19+白血病或CD19+淋巴瘤。在一些情況下，第二個CAR-T細胞群體可與如本文所揭示之具有中斷之CD83基因之工程改造之免疫細胞共同使用。舉例而言，抗CD19 CAR-T細胞可與CD83中斷之免疫細胞共同使用以用於治療涉及CD19+細胞之疾病，諸如AML、CD19+白血病或CD19+淋巴瘤。
在一些實例中，目標疾病可為B細胞介導之自體免疫疾病。實例包括但不限於弛緩不能、急性瀰漫性腦脊髓炎(ADEM)、艾迪森氏病(Addison's disease)、痛性肥胖病、成人史迪爾氏病(Adult Still's disease)、無γ球蛋白血症、斑禿、類澱粉變性症、僵直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗N-甲基-D-天冬胺酸(抗NMDA)受體腦炎、抗磷脂症候群、抗合成酶症候群、再生障礙性貧血、自體免疫血管性水腫、自體免疫自主神經功能異常、自體免疫腦脊髓炎、自體免疫腸病、自體免疫肝炎、自體免疫內耳病(AIED)、自體免疫淋巴增生症候群、自體免疫心肌炎、自體免疫卵巢炎、自體免疫睪丸炎、自體免疫胰臟炎、1型自體免疫多內分泌症候群(APS)、2型自體免疫多內分泌症候群(APS)、3型自體免疫多內分泌症候群(APS)、自體免疫視網膜病變、自體免疫蕁麻疹、軸突及神經元神經病(AMAN)、巴洛病(Baló disease)、白塞氏病(Behcet's disease)、良性黏膜類天皰瘡、比克斯塔夫氏腦炎(Bickerstaff's encephalitis)、大疱性類天疱瘡、卡斯特萊曼病(Castleman disease，CD)、乳糜瀉、卻格司氏病(Chagas disease)、慢性發炎脫髓鞘性多發神經病變(CIDP)、慢性複發性多灶性骨髓炎(CRMO)、查格-施特勞斯症候群(Churg-Strauss Syndrome，CSS)或嗜酸性球性肉芽腫病(EGPA)、瘢痕性類天皰瘡、科根氏症候群(Cogan's syndrome)、冷凝集素病、先天性心臟傳導阻滯、柯薩奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST症候群、克羅恩氏病(Crohn's disease)、疱疹樣皮炎、皮肌炎、德維克氏病(Devic's disease) (視神經脊髓炎)、盤狀狼瘡、德雷斯勒氏症候群(Dressler's syndrome)、藥物誘發性狼瘡、子宮內膜異位症、附著點炎相關關節炎、嗜酸性球性食管炎(EoE)、嗜酸性球性筋膜炎、後天性水疱性表皮鬆解症、結節性紅斑、原發性混合性冷球蛋白血症、伊文斯症候群(Evans syndrome)、費爾蒂症候群(Felty Syndrome)、纖維肌痛、纖維化肺泡炎、巨細胞動脈炎(顳動脈炎)、巨細胞心肌炎、腎小球腎炎、古德帕斯氏症候群(Goodpasture's syndrome)、肉芽腫病伴多血管炎、格雷夫斯氏病(Graves' disease)、吉蘭-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、橋本氏腦病(Hasimoto's encephalopathy)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、溶血性貧血、亨諾-許蘭紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)、妊娠疱疹或妊娠類天皰瘡(PG)、化膿性汗腺炎(HS) (反常性痤瘡)、低γ球蛋白血症、IgA腎病、IgA血管炎、IgG4相關硬化病、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)、包涵體肌炎(IBM)、間質性膀胱炎(IC)、幼年型關節炎、幼年型糖尿病(1型糖尿病)、幼年型肌炎(JM)、川崎病(Kawasaki disease)、蘭伯特-伊頓症候群(Lambert-Eaton syndrome)、白細胞破碎性血管炎、扁平苔蘚、硬化性苔蘚、木質性結膜炎、線性IgA病(LAD)、狼瘡、狼瘡性腎炎、狼瘡性血管炎、慢性萊姆病(Lyme disease chronic)、美尼爾氏病(Meniere's disease)、顯微鏡下多血管炎(MPA)、混合性結締組織病(MCTD)、莫倫氏潰瘍(Mooren's ulcer)、硬斑病、穆查-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性運動神經病(MMN)或MMNCB、多發性硬化症、重症肌無力、肌炎、發作性睡病、新生兒狼瘡、視神經脊髓炎、神經性肌強直、嗜中性球減少症、眼部瘢痕性類天皰瘡、視神經炎、奧德氏甲狀腺炎(Ord's thyroiditis)、迴文風濕病(PR)、PANDAS、副腫瘤性小腦變性(PCD)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、帕瑞-羅伯格症候群(Parry Romberg syndrome)、睫狀體扁平部炎(外周葡萄膜炎)、帕森納-特納症候群(Parsonage-Turner syndrome)、天疱瘡、外周神經病變、靜脈周腦脊髓炎、惡性貧血(PA)、急性痘瘡樣苔蘚樣糠疹、POEMS症候群、結節性多動脈炎、I型、II型、III型多腺症候群、風濕性多肌痛、多發性肌炎、心肌梗塞後症候群、心包切開術後症候群、原發性膽汁性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、黃體酮皮炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、純紅血球再生不良(PRCA)、壞疽性膿皮病、雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon)、反應性關節炎、反射性交感神經失養症、復發性多軟骨炎、不寧腿症候群(RLS)、腹膜後纖維化、風濕熱、類風濕性關節炎、類肉瘤病、施密特症候群(Schmidt syndrome)、施尼茨勒症候群(Schnitzler syndrome)、鞏膜炎、硬皮病、薛格倫氏症候群(Sjögren's syndrome)、精子及睪丸自體免疫、僵人症候群(SPS)、亞急性細菌性心內膜炎(SBE)、蘇薩克氏症候群(Susac's syndrome)、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、交感性眼炎(SO)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、高安氏動脈炎(Takayasu's arteritis)、顳動脈炎/巨細胞動脈炎、血小板減少症、血小板減少性紫癜(TTP)、甲狀腺眼病(TED)、托洛薩-亨特症候群(Tolosa-Hunt syndrome，THS)、橫貫性脊髓炎、1型糖尿病、潰瘍性結腸炎(UC)、未分化結締組織病(UCTD)、蕁麻疹性血管炎、葡萄膜炎、血管炎、白斑病及伏格特-小柳-原田病(Vogt-Koyanagi-Harada Disease)。
本揭示案亦涵蓋組合療法。舉例而言，本文所揭示之治療性T細胞可與其他治療劑共同使用，用於治療相同適應症，或用於增強治療性T細胞之功效及/或減少治療性T細胞之副作用。在一些情況下，本文所揭示之抗CD83 CAR-T細胞可與靶向一或多種腫瘤抗原(諸如本文所揭示之彼等)之一或多種額外CAR-T療法組合使用。
包含用於治療醫學疾患之組合物之治療的臨床結果可由熟練之臨床醫師確定。若以有益方式改變(例如，增加至少10%)體徵或症狀中之任一者或全部，如僅舉一例，功能標靶之水準，或者改良或改善其他臨床上接受之疾病(例如，GvHD或自體免疫疾病)症狀或標誌物，則治療視為有效的。亦可藉由個體未能發生如藉由住院治療或需要醫療干預所評估之惡化來量測臨床結果(例如，疾病之進展停止或至少減緩)。量測此等指標之方法為熟習此項技術者已知的及/或描述於本文中。治療包括對個體疾病之任何治療且包括：(1)抑制疾病，例如，阻止或減緩症狀之進展；或(2)減輕疾病，例如，引起症狀消退；及(3)預防或減少症狀發展之可能性。
在一些實施例中，本文提供一種抑制個體之免疫反應的方法。此方法包括向有需要之個體投與(a)有效量之如上文及本文所述之基因工程改造之T細胞群體，及(b)有效量之消炎劑。在一些情況下，基因工程改造之T細胞群體及消炎劑(例如，抗CTLA-4-Fc融合多肽，諸如貝拉西普)可調配於獨立組合物中，該等組合物可獨立地或一起、同時或依序向需要治療之個體投與。
在本文所揭示之組合療法中之任一者中，消炎劑為抑制促炎細胞介素之抗體。或者，消炎劑可為抑制T細胞共刺激之劑。在一些實施例中，消炎劑為CTLA4-Fc融合蛋白。在一些實例中，CTLA4-Fc融合蛋白為貝拉西普。或者，CTLA-4-Fc融合蛋白為阿巴西普。本文所揭示之消炎劑中之任一者可在其N末端包含信號肽。非限制性實例包括內源CTLA4之信號肽或免疫球蛋白重鏈之信號肽。
在一些實施例中，個體為人類患者。此種人類患者可能患有免疫疾病(例如，自體免疫疾病，如本文所揭示之彼等)或移植物抗宿主病(GvHD)或處於其風險下。在一些實例中，人類患者患有自體免疫疾病。在一些實例中，人類患者處於GvHD之風險下或患有GvHD。此種人類患者可能已經歷同種異體細胞療法(例如，同種異體CAR-T細胞療法)，或將藉由同種異體細胞療法治療。
IV. 套組
本揭示案亦提供用於產生基因工程改造之T細胞、治療性T細胞及用於治療用途之套組。
在一些實施例中，本文所提供之套組可包含用於對 Reg1基因、 TGFBRII基因及 CD83基因中之一或多者進行基因編輯之組分，且視情況包含將進行基因編輯之免疫細胞群體(例如，白血球單采(leukopak))。白血球單采樣品可為自外周血收集之經富集之白血球去除術產物。其典型地含有多种血細胞，包括單核細胞、淋巴細胞、血小板、血漿及紅血球。用於對靶基因中之一或多者進行基因編輯之組分可包含適合之核酸內切酶，諸如RNA引導之核酸內切酶及一或多個核酸向導，其指導核酸內切酶使一或多個適合之基因體位點裂解。舉例而言，套組可包含Cas酶(諸如Cas 9)及一或多個靶向 Reg1基因、 TGFBRII基因及/或 CD83基因之gRNA。套組中可包含對此等靶基因具有特異性之gRNA中之任一者。此種套組可進一步包含用於進一步基因編輯之組分，例如，gRNA及視情況存在之額外核酸內切酶，用於編輯其他靶基因，諸如 β2M及/或 TRAC。
在一些實施例中，本文所提供之套組可包含如本文所揭示之基因工程改造之T細胞群體，及一或多種用於產生亦如本文所揭示之治療性T細胞之組分。此類組分可包含適合用於基因編輯之核酸內切酶及編碼所關注之CAR構築體(諸如抗CD83 CAR)之核酸。CAR編碼核酸可為如本文所揭示之供體模板之一部分，其可含有位於CAR編碼序列側翼之同源臂。在一些情況下，供體模板可由病毒載體，諸如AAV載體攜帶。
套組可進一步包含對 TRAC基因具有特異性之gRNA，用於將CAR編碼序列插入 TRAC基因中。在其他實例中，套組可進一步包含對 β2M基因具有特異性之gRNA，用於將CAR編碼序列插入 β2M基因中。在其他實例中，套組可進一步包含對 CD83基因具有特異性之gRNA，用於將CAR編碼序列插入 CD83基因中。在其他實例中，套組可進一步包含對 Reg1基因具有特異性之gRNA，用於將CAR編碼序列插入 Reg1基因中。在其他實例中，套組可進一步包含對 TGFBRII基因具有特異性之gRNA，用於將CAR編碼序列插入 TGFBRII基因中。
在其他實施例中，本文所揭示之套組可包含如所揭示用於預期治療目的之治療性T細胞群體。
本文所揭示之套組中之任一者可進一步包含用於製造治療性T細胞或治療性T細胞之治療應用的說明書。在一些實例中，所包括之說明書可包含關於使用基因編輯組分對靶基因(例如， Reg1、 TGFBRII、 CD93或其組合)中之一或多者進行基因工程改造之描述。在其他實例中，所包括之說明書可包含如何將編碼CAR構造之核酸引入T細胞中以用於製造治療性T細胞之描述。
或者，套組可進一步包含用於投與如本文所揭示之治療性T細胞以達成預期活性，例如消除由在治療性T細胞上表現之CAR靶向之疾病細胞的說明書。套組可進一步包含基於鑑定個體是否需要治療來選擇適合於治療之個體的描述。與本文所述之治療性T細胞之使用有關的說明書一般包括有關預期治療之劑量、給藥方案及投藥途徑之資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。本揭示案之套組中提供之說明書典型地為標籤或包裝插頁上之書面說明書。標籤或包裝插頁指示治療性T細胞用於治療個體之疾病或病症、延遲疾病或病症發作及/或減輕疾病或病症。
本文所提供之套組在適合之包裝中。適合之包裝包括但不限於小瓶、瓶、廣口瓶、軟包裝及類似包裝。亦考慮與特定裝置，諸如用於投與治療性T細胞之輸注裝置組合使用之包裝。套組可具有無菌入口(例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有皮下注射針可刺穿之塞的小瓶)。容器亦可具有無菌入口。
套組可視情況提供額外組分，諸如緩衝液及解釋性資訊。通常，套組包括容器及在容器上或與容器相關聯之標籤或包裝插頁。在一些實施例中，本揭示案提供包含上文所述之套組之內容物的製品。
一般技術
除非另有指示，否則本揭示案之實踐將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習用技術，該等技術在此項技術之技能範圍內。此類技術在文獻中有完整解釋，諸如 Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版 (Sambrook等人, 1989) Cold Spring Harbor Press； Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait編, 1984)； Methods in Molecular Biology, Humana Press； Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis編, 1989) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney編, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell編, 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel等人編, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practice approach (D. Catty.編, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995)； DNA Cloning: A practical Approach,第I卷及第II卷 (D.N. Glover編 1985)； Nucleic Acid Hybridization(B.D. Hames及S.J. Higgins編 1985)； Transcription and Translation(B.D. Hames及S.J. Higgins編, 1984)； Animal Cell Culture(R.I. Freshney編, 1986)； Immobilized Cells and Enzymes(lRL Press, 1986)；及B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning(1984); F.M. Ausubel等人 (編)。
無需贅述，據信熟習此項技術者基於上述描述可最大限度地利用本發明。因此，以下特定實施例僅解釋為說明性的，而不以任何方式限制本揭示案之其餘部分。本文引用之所有出版物以引用之方式併入以用於本文所提及之目的或主題。 實例
上文所论述之實施例之一些態樣在以下實例中更詳細地揭示，該等實例不以任何方式意欲限制本揭示案之範疇。
實例 1 ： CAR T 細胞產生及 CAR 表現
產生缺乏 TRAC基因、 β2M基因、CD83基因、 TGFBRII基因及 Regnase-1基因之表現且表現靶向CD83之嵌合抗原受體(CAR)的同種異體人類T細胞。相對於具有野生型CD83基因之T細胞對應物，此種基因工程改造之免疫細胞顯示出增強之總體T細胞擴增、降低之促炎細胞介素產生水準及增加之CD8+細胞頻率，而對CAR-T細胞功能無負面影響。
在第一代及第二代IO CAR-T框架中引入CD83剔除。兩代CAR-T細胞均缺乏 TRAC基因及 β2M基因之表現。參見下文之 表 1。
表 1. 具有 CD83 剔除 (KO) 之 CAR-T 細胞
細胞 TRAC KO β2M KO CD83 CAR CD83 KO TGFBRII KO Regnase KO
CD83 CAR：83 KO (第一代) 是 是 是 是 否 否
CD83 CAR：83+R+T KO (第2代) 是 是 是 是 是 是
簡言之，將PBMC解凍且用TransAct活化。0-3天后，用Cas9:sgRNA RNP複合物對細胞進行電穿孔且用腺相關腺病毒載體(AAV)轉導，以產生具有CD83 KO (表示為CD83 CAR+ 83 KO)之抗CD83 CAR T細胞或具有 CD83、 Regnase-1及 TGFBRII剔除(表示為CD83 CAR +83 KO + R/T KO)之抗CD83 CAR T細胞。可在單個或多個電穿孔事件中將與Cas9酶形成RNP之sgRNA引入T細胞中。電穿孔後，用重組AAV轉導細胞以引入編碼抗CD83 CAR之供體模板。將包含編碼抗CD83 CAR (SEQ ID NO:95)之核苷酸序列之一的重組AAV血清型6 (AAV6) 與Cas9:sgRNA RNP (1 µM Cas9、5 µM gRNA)一起遞送至活化之同種異體人類T細胞。使用以下sgRNA：CD83 (SEQ ID NO: 20或21)、TRAC (SEQ ID NO: 2或3)、β2M (SEQ ID NO: 8、9、14或15)、TGFBRII (SEQ ID NO: 26或27)及REG-1 (SEQ ID NO: 32或33)。亦可使用sgRNA之未修改型式(或其他修飾型式)。參見下文之表 17中提供之代表性gRNA序列，包括未修飾型式及修飾型式兩者。
T 細胞擴增之評估
以規律之時間間隔對細胞進行計數以評估T細胞擴增。結果呈現於 圖 1及下文之 表 2中。數據證明 Regnase及 TGFBRII剔除編輯對細胞生長無影響。編輯之細胞以與未編輯之T細胞類似之速率擴增。
表 2. T 細胞數目
細胞名稱 T 細胞數目 (x10 6)
第 0 天 第 6 天 第 12 天 第 18 天
對照細胞(無RNP) 5 216 495 951
CD83 CAR：83 KO 5 152 485 915
CD83 CAR：83+R+T KO 5 118 439 833
編輯效率之評估
亦以規律之時間間隔量測CAR表現。藉由使用1-10 µg/mL His標記之CD83抗原，繼之以抗His APC結合抗體以及藉由ddPCR進行CAR偵測。流式細胞術結果以兩個供體之平均值呈現，且ddPCR為下文之 表 3中復制之3個平均複本數。在具有CD83 KO之CAR T細胞中，Regnase及TGFBRII KO之CAR表現無顯著差異。
表 3. CAR+ 細胞
細胞名稱 CAR+ 細胞 ( 群體 %)
藉由流式 藉由 ddPCR
CD83 CAR：83 KO 21 0.97
CD83 CAR：83+R+T KO 20 0.86
亦藉由流式細胞術及TIDE分析評估 TRAC、 β2M、 CD83、 TGFBRII及 Regnase剔除之編輯效率。結果呈現於下文之 表 4中。在存在或不存在Regnase及TGFBRII之情況下觀測到類似水準之 TRAC、 β2M及 CD83編輯效率。
表 4. 編輯效率
樣品 編輯效率 (%)
TRACKO (流式) β2MKO (流式) CD83KO (TIDE) TGFBRIIKO (TIDE) RegnaseKO (TIDE)
CD83 CAR：83 KO 97 97 95 N/A N/A
CD83 CAR：83+R+T KO 94 93 96 81 92
CD4:CD8 比率之評估
第6天及第13天，亦藉由流式細胞術確定此等細胞群中CD4及CD8 T細胞之頻率。平均頻率列於 圖 2A-2B及下文之 表 5中。 Regnase及 TGFBRII基因編輯對細胞群體中之CD4+與CD8+細胞比率無顯著影響。
表 5. CD4+ 及 CD8+ 細胞百分比
細胞名稱 群體 %
CD4+ CD8+
對照細胞(無RNP) 62 31
CD83 CAR：83 KO 60 34
CD83 CAR：83+R+T KO 52 37
免疫檢查點分子之評估
在細胞群體中評價兩種免疫檢查點分子PD1及Lag3之表現。PD1作為免疫檢查點分子在免疫反應期間下調T細胞活性以防止自體免疫組織損傷(Jubel等人, Front. Immunol.2020)。淋巴細胞活化基因3 (LAG-3)為與癌症、傳染病及自體免疫相關之重要免疫檢查點(Graydon等人, Front. Immunol.2021)。作為共抑制免疫檢查點，LAG3抑制其宿主細胞之活化且一般促進更具抑制性之免疫反應。
第13天及第24天量測表現水準且呈現於下文之 表 6-7中。數據證明具有或不具有 Regnase及 TGFBRII編輯之抗CD83 CAR T細胞之間的PD1及Lag3水準無顯著變化。對於所測試之兩種基因型，PD-1及Lag3水準在第13天與第24天之間下降。
表 6. PD1+ 細胞水準
細胞名稱 PD1 + 細胞 ( 群體 %)
第 13 天 第 24 天
對照細胞(無RNP) 10 1.7
CD83 CAR：83 KO 5 1.3
CD83 CAR：83+R+T KO 4 0.8
表 7. Lag3+ 細胞水準
細胞名稱 Lag3 + 細胞 ( 群體 %)
第 13 天 第 24 天
對照細胞(無RNP) 14 7
CD83 CAR：83 KO 16 5
CD83 CAR：83+R+T KO 18 5
總之，本實例中提供之結果指示用中斷之 TRAC、 β2M及 CD83基因對抗CD83 CAR-T細胞中之 Reg1基因及 TGFBRII基因進行基因中斷對CAR-T細胞特性，例如T細胞生長、基因編輯效率、CD4:CD8比率及免疫檢查點標誌物水準無顯著影響。
實例 2 ：抗 CD83 CAR T 細胞之活體外細胞毒性
細胞殺傷(細胞毒性)檢定用於評估 實例 1中所述之CAR +T細胞群體在A498癌細胞株中引起細胞溶解之能力。如下進行活體外再攻擊檢定。
用30,0000個靶細胞接種CAR T細胞(每孔7,500個細胞)。在培育第2天、第5天及第7天，將60,000個細胞、120,000個細胞及100,000個細胞之額外A498細胞添加至培養物中。對活靶細胞及T細胞之數目進行計數且呈現於 圖 3A-3B及下文之 表 8-9中。數據證明具有 Regnase及 TGFBRII編輯之CAR T細胞之靶細胞殺傷得到改良且在由靶細胞活化時擴增增加。
表 8. 靶細胞數目
細胞名稱 第 2 天 第 5 天 第 7 天 第 10 天
CD83 CAR：83 KO 4,694 26,145 55,766 61,725
CD83 CAR：83+R+T KO 529 1,321 5,665 16,273
表 9. CAR T 細胞數目
細胞名稱 第 2 天 第 5 天 第 7 天 第 10 天
CD83 CAR：83 KO 916 4,270 3,475 2,263
CD83 CAR：83+R+T KO 1,280 6,498 9,026 6,628
實例 3 ：抗 CD83 CAR T 細胞之活體內細胞毒性
在NSG小鼠中建立之THP-1人類急性單核細胞白血病異種移植模型中評價如 實例 1中所述而產生之CAR T細胞。向雌性NSG小鼠之右側腹皮下植入50% Matrigel/50%培養基中之5 x 10 6個腫瘤細胞。十(10)天后，當腫瘤體積為約50 mm 3(在25-75 mm 3範圍內)時，將小鼠隨機分為5組且以每隻小鼠10 7個CAR+細胞靜脈內注射CAR T細胞。此等組示於 圖 4A-4C及下文之 表 10中。
每隔數天評價腫瘤體積。腫瘤體積呈現於 表 10中。亦評價小鼠之存活期且呈現於 表 10中。『N/A』指示在彼時間點無存活小鼠。數據證明具有CD83 KO之CD83 CAR細胞中Regnase及TGFBRII之剔除顯著增強抗腫瘤活性。
表 10. 腫瘤體積
細胞名稱 腫瘤體積 (mm 3)
第 1 天 第 8 天 第 15 天 第 18 天 第 22 天 第 25 天 第 29 天 第 36 天 第 43 天 第 50 天 第 61 天 第 67 天 第 71 天 第 81 天 第 88 天 第 95 天
未經處理 53 297 937 1437 2147 1965 2081 N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A N/A
CD83 CAR：83 KO 53 67 13 9 6 7 18 39 60 125 285 611 10 29 0 0
CD83 CAR：83+R+T KO 52 62 14 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
小鼠之存活期示於 圖 5A-5C及下文之 表 11中且確認此等細胞中CD83、Regnase及TGFBRII之剔除顯著增加抗腫瘤活性，且在CD83 CAR +83 KO + R/T KO群體中之5隻小鼠中有2隻觀察到對原發性腫瘤攻擊之完全反應。
表 11. 中位存活期
細胞名稱 天
未經處理 22
CD83 CAR：83 KO 未達到
CD83 CAR：83+R+T KO 未達到
在投與測試物品後第45天，將來自第3組(CD83 CAR：83 KO)及第5組(CD83 CAR：83 KO +R/T KO)之小鼠用植入左側腹之5 x 10 6個THP-1腫瘤細胞再攻擊。亦向小鼠之對照組植入腫瘤，但未接受任何CAR T細胞接種。腫瘤體積及存活期示於 圖 6A-6C及下文之 表 12-13中，此確認 Reg1及 TGFBRII基因之剔除增強具有CD83 KO之抗CD83 CAR T細胞之活性。
表 12. 再攻擊後之腫瘤體積
細胞名稱 腫瘤體積 (mm 3)
第 5 天 第 12 天 第 19 天 第 26 天 第 33 天 第 36 天 第 40 天 第 43 天 第 50 天
未經處理 30 53 117 426 1225 1870 N/A N/A N/A
CD83 CAR：83 KO 26 63 167 628 1432 2240 1045 1237 2208
CD83 CAR：83+R+T KO 22 45 67 153 448 748 1334 1161 1306
表 13. 中位存活期
細胞名稱 天
未經處理 36
CD83 CAR：83 KO 36
CD83 CAR：83+R+T KO 43
總之，如在動物模型中所觀測，本實例中提供之結果證明 Reg1及 TGFBRII基因之基因中斷顯著增強具有中斷之 TRAC、 β2M及 CD83基因之抗CD83 CAR-T細胞之活體內抗腫瘤活性。因此，將預期具有中斷之 Reg1及 TGFBRII基因且視情況具有中斷之 TRAC、 β2M及 CD83基因之抗CD83 CAR-T細胞展現出對涉及CD83之疾病，例如CD83+腫瘤之優異治療功效。
實例 4 ： CD83 、 Regnase 及 TGFBRII 剔除對活體內 CD83 CAR T 細胞活性之影響
本實例使用小鼠之異種移植物抗宿主病(GvHD)模型以及小鼠中建立之THP-1異種移植腫瘤來評估中斷活體內CD83 CAR T細胞中之CD83、Regnase及TGFBRII基因之影響。
預防性 GvHD 模型研究
在研究開始前5-7天，將NSG小鼠個別地圈養於通風之微隔離籠中，維持於無病原體條件下。小鼠各自接受20 x 10 6個PBMC/小鼠之皮下接種以誘發GvHD。將小鼠進一步分為4個處理組，且向處理組2至5共同投與單次靜脈內劑量之T細胞。CAR T細胞自與用於對NSG小鼠進行人源化之PBMC供體而言同種異體之供體製成。CD83_外顯子2_3 gRNA (參見下文之表 17)用於本研究以中斷CD83基因。
小鼠組之存活期示於 圖 7中。本研究中使用之CAR-T細胞與PBMC供體為同種異體的。觀測到抗CD83 CAR 83/R/T KO細胞在1M CAR+劑量水準下預防GvHD至少直至第99天，而抗CD83 CAR 83 KO細胞在1M CAR+劑量水準下延緩GvHD直至第84天。如 圖 7中所示，單獨注射PBMC之小鼠中無一者存活超過第42天，而注射PBMC及同種異體抗CD83 CAR T細胞之小鼠存活至第59天。結果顯示中斷CD83、Regnase-1及TGFBRII基因顯著增強抗CD83 CAR-T細胞在預防性GvHD模型中之活性。此與顯示在擴增期間經受自相殘殺之CD83 CAR T細胞展現出衰竭表型之數據一致，該表型降低該等細胞之活體外及活體內效力。
建立之腫瘤異種移植模型研究
在NSG小鼠中建立之THP-1人類急性單核細胞白血病異種移植模型中評價CAR T細胞。向雌性NSG小鼠之右側腹皮下植入50% Matrigel/50%培養基中之5 x 10 6個腫瘤細胞。十天后，當腫瘤體積為約50mm 3(在25-75 mm 3範圍內)時，將小鼠隨機分為5組且以每隻小鼠10 7個CAR+細胞靜脈內注射CAR T細胞。
亦評價小鼠之存活期且呈現於 圖 8中。荷瘤對照小鼠無法存活超過第29天，而用同種異體抗CD83 CAR T細胞處理之小鼠存活至第67天。僅一隻來自具有CD83 KO之抗CD83 CAR T細胞之小鼠第67天死亡，而用具有CD83、Regnase-1及TGFBRII剔除之抗CD83 CAR T細胞處理之所有小鼠至少存活至第80天。結果顯示CD83、Regnase-1及TGFBRII基因之剔除顯著增強抗CD83 CAR T細胞對THP-1異種移植腫瘤之抗腫瘤活性。
實例 5 ：貝拉西普處理對活體內 CD83 CAR T 細胞活性之影響
本實例探索貝拉西普與抗CD83 CAR-T細胞之組合的活體內作用，作為用消炎劑有效載荷裝備抗CD83 CAR-T細胞(例如，表現貝拉西普之CAR-T細胞)之概念驗證。
在研究開始前5-7天，將NSG小鼠個別地圈養於通風之微隔離籠中，維持於無病原體條件下。各小鼠接受20 x 10 6個PBMC/小鼠之靜脈內接種以誘發GvHD。將小鼠分為4組。向處理組#2-4共同投與單次靜脈內劑量之T細胞、多次腹膜內劑量之貝拉西普(12 x 100 µg劑量，每週3次，持續4週)或兩者( 表 14)。CAR T細胞自與用於對NSG小鼠進行人源化之PBMC供體而言同種異體之供體製成。關於具有中斷之CD83基因(CD83剔除，以CD83_外顯子2_3 gRNA為例)之抗CD83 CAR-T細胞之資訊可見於美國專利申請案第63/254,332號中，其相關揭示內容以引用之方式併入以用於本文所提及之主題及目的。
表 14. 處理組
組 組名稱 PBMC (IV) CAR-T ( 單次劑量 ) 貝拉西普 ( 重複給藥 ) N
1 無處理 20x10 6 --- --- 6
2 CD83 CAR+CD83KO 20x10 6 1M CD83 CAR T --- 6
3 貝拉西普 20x10 6 --- 12 x 100 µg 每週3次，持續4週 4
4 CD83 CAR +CD83KO + 貝拉西普 20x10 6 1M CD83 CAR T 12 x 100 µg 每週3次，持續4週 4
以規律之時間間隔量測小鼠之體重作為移植物抗宿主病(GvHD)發展之指標，且當體重減輕達到起始體重之20%或更多時，對小鼠實施安樂死。 表 15中呈現之數據顯示CD83 CAR T細胞及貝拉西普延緩異種GvHD之發作，此為對單獨之個別處理的改良。N/A指示無可用之小鼠用於體重量測。亦參見 圖 9A-9D。
表 15. 體重變化 ( 超過基線之 %)
組 組名稱 第 6 天 第 10 天 第 20 天 第 31 天 第 43 天 第 55 天 第 65 天 第 73 天 第 83 天 第 91 天 第 100 天
1 無處理 4 10 8 -14 -8 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
2 CD83 CAR+CD83KO 4 8 9 4 -12 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
3 貝拉西普 3 2 9 12 -0.4 -14* -10* -4* -24* N/A N/A
4 CD83 CAR+CD83KO + 貝拉西普 7 7 14 19 19 19 2 -3 -14 1* 6*
*一隻小鼠存活
將CD83靶向CAR T與CD83KO及貝拉西普組合之影響亦藉由比較各處理組中小鼠之中位存活時間顯而易見( 表 16及 圖 10)。用具有CD83基因KO之CD83 CAR T處理將中位存活時間自38天延長至53天，而組合將中位存活時間延長至85天。
表 16. 存活率
組 組名稱 小鼠數目 中位存活期 ( 天 ) p 值 ( 無處理對比其他組 )
1 無處理 6 38 -
2 CD83 CAR+CD83KO 6 53 0.0374 *
3 貝拉西普 4 50 0.1129 ns
4 CD83 CAR+CD83KO + 貝拉西普 4 85 0.0033 **
第56天植入水準之分析揭露在貝拉西普 + CD83 CAR T組合組中存在循環T細胞( 圖 11A 及 11B)。高劑量CD83 CAR-T KO組之人類CD45植入仍較低，而組合組中可偵測之人類CD45+細胞主要為T細胞。
序列表
表 17. sRNA 序列及靶序列
名稱 未修飾之序列 修飾之序列 靶序列 (PAM)
TRACsgRNA (TA-1) AGAGCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 2) A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 3) AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 6) AGAGCAACAGTGCTGTGGCC (SEQ ID NO: 7)
TRACsgRNA間隔子 AGAGCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO: 4) A*G*A*GCAACAGUGCUGUGGCC (SEQ ID NO: 5)
β2M-1sgRNA GCUACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 8) G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 9) GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (TGG) (SEQ ID NO: 12) GCTACTCTCTCTTTCTGGCC (SEQ ID NO: 13)
β2M-1sgRNA間隔子 GCUACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ ID NO: 10) G*C*U*ACUCUCUCUUUCUGGCC (SEQ ID NO: 11)
β2M-4sgRNA CAGUAAGUCAACUUCAAUGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 14) C*A*G*UAAGUCAACUUCAAUGUguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 15) CAGTAAGTCAACTTCAATGT(CGG) (SEQ ID NO:18) CAGTAAGTCAACTTCAATGT (SEQ ID NO: 19)
β2M-4sgRNA間隔子 CAGUAAGUCAACUUCAAUGU (SEQ ID NO: 16) C*A*G*UAAGUCAACUUCAAUGU (SEQ ID NO: 17)
CD83外顯子2_3 sgRNA GUAGGGAACCUGCGGAUCCCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 20) G*U*A*GGGAACCUGCGGAUCCCAGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*U*U*U (SEQ ID NO: 21) GTAGGGAACCTGCGGATCCCAGG(GGG) (SEQ ID NO: 24) GTAGGGAACCTGCGGATCCCAGG (SEQ ID NO: 25)
CD83外顯子2_3 sgRNA間隔子 GUAGGGAACCUGCGGAUCCCAGG (SEQ ID NO: 22) G*U*A*GGGAACCUGCGGAUCCCAGG (SEQ ID NO: 23)
CD83_外顯子2_ G2 sgRNA (+) AGGUUCCCUACACGGUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU (SEQ ID NO: 96) A*G*G*UUCCCUACACGGUCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGU*G*C*U (SEQ ID NO: 97) AGGTTCCCTACACGGTCTCC (TGG) (SEQ ID NO: 100) AGGTTCCCTACACGGTCTCC (SEQ ID NO: 101)
CD83_外顯子2_ G2間隔子 AGGUUCCCUACACGGUCUCC (SEQ ID NO: 98) A*G*G*UUCCCUACACGGUCUCC (SEQ ID NO: 99)
TGFBRII sgRNA (EX5_T1) CCCCUACCAUGACUUUAUUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 26) C*C*C*CUACCAUGACUUUAUUCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 27) CCCCTACCATGACTTTATTC (TGG) (SEQ ID NO: 30) CCCCTACCATGACTTTATTC (SEQ ID NO: 31)
TGFBRII sgRNA (EX5_T1)間隔子 CCCCUACCAUGACUUUAUUC (SEQ ID NO: 28) C*C*C*CUACCAUGACUUUAUUC (SEQ ID NO: 29)
REG1-Z10 sgRNA (EX4_T7) ACGACGCGUGGGUGGCAAGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcUUUU (SEQ ID NO: 32) A*C*G*ACGCGUGGGUGGCAAGCguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcU*U*U*U (SEQ ID NO: 33) ACGACGCGTGGGTGGCAAGC(GGG) (SEQ ID NO: 36) ACGACGCGTGGGTGGCAAGC (SEQ ID NO: 37)
REG1-Z10 sgRNA (EX4_T7)間隔子 ACGACGCGUGGGUGGCAAGC (SEQ ID NO: 34) A*C*G*ACGCGUGGGUGGCAAGC (SEQ ID NO: 35)
示例性 sgRNA 式
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu (SEQ ID NO: 38)
nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc (SEQ ID NO: 39)
n ( 17-30)guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuug aaaaaguggcaccgagucggugcu (1-8)(SEQ ID NO: 40)
*：2'-O-甲基硫代磷酸酯殘基
表 18. 中斷之 TRAC 基因中之示例性核苷酸序列
描述 序列(缺失由破折號(-)指示；插入由 粗體指示) SEQ ID NO:
TRAC基因編輯 AA---------------------GAGCAACAAATCTGACT 41
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGT-GCCTGGAGCAACAAATCTGACT 42
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGTG-------CTGGAGCAACAAATCTGACT 43
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGT------GCCTGGAGCAACAAATCTGACT 44
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGTG---------------------CTGACT 45
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGT GGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT 46
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGTGC--TGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT 47
TRAC基因編輯 AAGAGCAACAGTGCTGTG TGCCTGGAGCAACAAATCTGACT 48
表 19. 中斷之 β2M 基因中之示例性核苷酸序列
描述 序列(缺失由破折號(-)指示；插入由 粗體指示) SEQ ID NO:
β2M基因編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCT-GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 49
β2M基因編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTC--GCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 50
β2M基因編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTT-----CTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 51
β2M基因編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTCTG GATAGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 52
β2M基因編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGC-------------------------GCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 53
β2M基因編輯 CGTGGCCTTAGCTGTGCTCGCGCTACTCTCTCTTTC TGTGGCCTGGAGGCTATCCAGCGTGAGTCTCTCCTACCCTCCCGCT 54
表 20. 中斷之 TGFBRII 基因中之示例性核苷酸序列
描述 基因編輯序列 b SEQ ID NO:
TGFBRII基因編輯 CATGA-------CTGGAAGA 55
TGFBRII基因編輯 CATGAC----TTCTGGAAGA 56
TGFBRII基因編輯 CATGACT---TTCTGGAAGA 57
TGFBRII基因編輯 CATGACTTTA TTTCTGGAAGA 58
TGFBRII基因編輯 CATGACTTT AATTCTGGAAGA 59
TGFBRII基因編輯 CA-----------TGGAAGA
TGFBRII基因編輯 CATGACTT--TTCTGGAAGA 60
TGFBRII基因編輯 CAT------------GAAGA
TGFBRII基因編輯 C------------------A
TGFBRII基因編輯 --------------------
TGFBRII基因編輯 CATGA---------------
TGFBRII基因編輯 CAT---------------GA
TGFBRII基因編輯 CA---------TCTGGAAGA 61
TGFBRII基因編輯 CATGACTTT-TTCTGGAAGA 62
TGFBRII基因編輯 CATGACTTTA-TCTGGAAGA 63
TGFBRII基因編輯 CATGACTTT-------AAGA 64
TGFBRII基因編輯 ----------TTCTGGAAGA 65
TGFBRII基因編輯 CATGACTTTA--CTGGAAGA 66
表 21. 中斷之 Reg1 基因中之示例性核苷酸序列
描述 基因編輯序列 b SEQ ID NO:
Reg1基因編輯 GTGGGTGGCA AAGCGGGTGGT 67
Reg1基因編輯 GT-----------GGGTGGT
Reg1基因編輯 -----------GCGGGTGGT
Reg1基因編輯 GTGGGTGGC-AGCGGGTGGT 68
Reg1基因編輯 ---------------GTGGT
Reg1基因編輯 GTG--------------GGT
Reg1基因編輯 ------------CGGGTGGT
Reg1基因編輯 --------------------
Reg1基因編輯 GTGGGTGGC-----------
Reg1基因編輯 GTGGGTGGCAT AGCGGGTGGT 69
Reg1基因編輯 GTGGGTG-------------
Reg1基因編輯 GTGG----------------
Reg1基因編輯 GTGGGTGG--AGCGGGTGGT 70
表 22. 抗 CD83 CAR 組分之示例性序列
名稱 序列 SEQ ID NO:
抗CD83抗體 VH CDR1 TGGYWWT 71
抗CD83抗體 VH CDR2 YIFSSGNTNYNPSIKS 72
抗CD83抗體 VH CDR3 AYGKLGFDY 73
抗CD83抗體 VL CDR1 TLSSQHSTYTIG 74
抗CD83抗體 VL CDR2 VNSDGSHSKGD 75
抗CD83抗體 VL CDR3 GSSDSSGYV 76
抗CD83 VH QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVS 77
抗CD83 VL QPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVL 78
抗CD83 scFv QVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVL 79
抗CD83 CAR MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLKESGPGLVKPSQSLSLTCSVTGFSITTGGYWWTWIRQFPGQKLEWMGYIFSSGNTNYNPSIKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEGDTARYYCARAYGKLGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSPSASASLGNSVKITCTLSSQHSTYTIGWYQQHPDKAPKYVMYVNSDGSHSKGDGIPDRFSGSSSGAHRYLSISNIQPEDEADYFCGSSDSSGYVFGSGTQLTVLRAAATTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 80 (含信號肽) 81 (無信號肽)
信號肽1 MALPVTALLLPLALLLHAARP 82
信號肽2 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP 83
4-1BB CoS KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 84
CD28 CoS SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS 85
CD3ζ信號傳導 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 86
CD8a TM/鉸鏈 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC 87
表 23. 示例性 AAV 供體模板序列
名稱 序列 SEQ ID NO:
左ITR (5' ITR) TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 88
左ITR (5' ITR) (替代性) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 89
右ITR (3' ITR) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA 90
右ITR (3' ITR) (替代性) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 91
TRAC-LHA (800bp) GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCA 92
TRAC-RHA (800bp) TGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG 93
EF1α GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA 94
LHA-CD83 CAR-RHA GAGATGTAAGGAGCTGCTGTGACTTGCTCAAGGCCTTATATCGAGTAAACGGTAGTGCTGGGGCTTAGACGCAGGTGTTCTGATTTATAGTTCAAAACCTCTATCAATGAGAGAGCAATCTCCTGGTAATGTGATAGATTTCCCAACTTAATGCCAACATACCATAAACCTCCCATTCTGCTAATGCCCAGCCTAAGTTGGGGAGACCACTCCAGATTCCAAGATGTACAGTTTGCTTTGCTGGGCCTTTTTCCCATGCCTGCCTTTACTCTGCCAGAGTTATATTGCTGGGGTTTTGAAGAAGATCCTATTAAATAAAAGAATAAGCAGTATTATTAAGTAGCCCTGCATTTCAGGTTTCCTTGAGTGGCAGGCCAGGCCTGGCCGTGAACGTTCACTGAAATCATGGCCTCTTGGCCAAGATTGATAGCTTGTGCCTGTCCCTGAGTCCCAGTCCATCACGAGCAGCTGGTTTCTAAGATGCTATTTCCCGTATAAAGCATGAGACCGTGACTTGCCAGCCCCACAGAGCCCCGCCCTTGTCCATCACTGGCATCTGGACTCCAGCCTGGGTTGGGGCAAAGAGGGAAATGAGATCATGTCCTAACCCTGATCCTCTTGTCCCACAGATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATGGACTTCAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGACCACCATGGCGCTTCCGGTGACAGCACTGCTCCTCCCCTTGGCGCTGTTGCTCCACGCAGCAAGGCCGCAGGTTCAGCTGAAAGAATCTGGCCCCGGCCTGGTTAAACCGAGTCAGAGTTTGAGCTTGACTTGTTCTGTGACTGGATTCTCAATAACAACCGGTGGATACTGGTGGACCTGGATACGACAATTTCCGGGCCAAAAGCTCGAGTGGATGGGCTATATCTTTAGTAGCGGCAACACTAACTATAATCCTTCAATCAAGAGCAGGATAAGTATCACCCGAGACACCAGTAAGAACCAATTCTTTTTGCAGCTTAACAGCGTTACGACTGAAGGTGACACCGCAAGGTATTACTGCGCGAGGGCCTACGGAAAACTTGGTTTTGATTATTGGGGTCAAGGGACACTGGTAACGGTTTCTAGTGGGGGAGGTGGTAGTGGCGGTGGAGGTTCCGGGGGTGGAGGATCCCAACCCGTCCTTACCCAGAGTCCTTCTGCGTCCGCTAGTCTCGGAAATAGTGTTAAGATTACGTGCACTTTGAGTAGCCAACATTCCACTTATACCATCGGCTGGTATCAGCAACACCCAGATAAAGCCCCGAAATATGTGATGTATGTCAATTCCGACGGTTCTCATTCAAAAGGCGACGGGATCCCCGACAGATTCAGCGGTAGTTCATCTGGAGCTCACCGCTATCTGTCAATATCCAATATTCAGCCGGAAGATGAAGCTGACTATTTTTGCGGGAGCAGTGATAGTTCCGGTTATGTCTTCGGCAGTGGTACACAGCTTACCGTACTCAGAGCAGCCGCTACAACAACTCCTGCACCGCGACCTCCAACGCCTGCCCCTACCATTGCGTCACAACCACTTAGCCTTAGGCCAGAAGCGTGCCGACCTGCAGCAGGCGGGGCCGTTCATACTAGGGGTCTTGACTTCGCGTGCGATATCTACATATGGGCACCTCTGGCGGGAACCTGTGGTGTGTTGCTTCTTAGTCTGGTAATTACACTCTACTGTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGCGTGAAGTTTTCACGATCTGCAGATGCCCCGGCATATAAACAAGGTCAGAACCAGTTGTACAATGAATTGAACCTTGGTAGAAGGGAGGAGTATGACGTCCTCGACAAGAGAAGAGGGCGCGACCCGGAGATGGGCGGTAAGCCAAGGAGAAAAAATCCGCAAGAGGGGCTTTATAATGAACTCCAGAAGGATAAGATGGCTGAGGCTTACAGTGAGATTGGTATGAAAGGAGAAAGAAGACGCGGAAAGGGACATGATGGGTTGTACCAAGGGCTCAGCACTGCTACCAAGGACACTTATGACGCGCTCCATATGCAAGCCCTTCCCCCTAGATAATAATAAAATCGCTATCCATCGAAGATGGATGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGTGGAGCAACAAATCTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATTCCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGGTAAGGGCAGCTTTGGTGCCTTCGCAGGCTGTTTCCTTGCTTCAGGAATGGCCAGGTTCTGCCCAGAGCTCTGGTCAATGATGTCTAAAACTCCTCTGATTGGTGGTCTCGGCCTTATCCATTGCCACCAAAACCCTCTTTTTACTAAGAAACAGTGAGCCTTGTTCTGGCAGTCCAGAGAATGACACGGGAAAAAAGCAGATGAAGAGAAGGTGGCAGGAGAGGGCACGTGGCCCAGCCTCAGTCTCTCCAACTGAGTTCCTGCCTGCCTGCCTTTGCTCAGACTGTTTGCCCCTTACTGCTCTTCTAGGCCTCATTCTAAGCCCCTTCTCCAAGTTGCCTCTCCTTATTTCTCCCTGTCTGCCAAAAAATCTTTCCCAGCTCACTAAGTCAGTCTCACGCAGTCACTCATTAACCCACCAATCACTGATTGTGCCGGCACATGAATGCACCAGGTGTTGAAGTGGAGGAATTAAAAAGTCAGATGAGGGGTGTGCCCAGAGGAAGCACCATTCTAGTTGGGGGAGCCCATCTGTCAGCTGGGAAAAGTCCAAATAACTTCAGATTGGAATGTGTTTTAACTCAGGGTTGAGAAAACAGCTACCTTCAGGACAAAAGTCAGGGAAGGGCTCTCTGAAGAAATGCTACTTGAAGATACCAGCCCTACCAAGGGCAGGGAGAGGACCCTATAGAGGCCTGGGACAGGAGCTCAATGAGAAAGG 95
其他實施例
本說明書中揭示之所有特徵可按任何組合形式組合。本說明書中揭示之各特徵可由用於相同、等效或類似目的之替代性特徵代替。因此，除非另有明確規定，否則所揭示之各特徵僅為一系列通用之等效或類似特徵之實例。
自以上描述，熟習此項技術者可容易地確定本發明之基本特徵，且在不脫離其精神及範疇之情況下，可對本發明進行各種改變及修改以使其適於各種用途及條件。因此，其他實施例亦在申請專利範圍內。 等效物
儘管本文已描述及說明若干發明性實施例，但一般熟習此項技術者將容易地設想用於執行功能及/或獲得結果之多種其他方式及/或結構及/或本文所述之一或多個優點，且此類變化及/或修改中之每一者應視為在本文所述之發明性實施例之範疇內。更一般而言，熟習此項技術者將容易地了解，本文所述之所有參數、尺寸、材料及配置意欲為示例性的且實際參數、尺寸、材料及/或配置將取決於使用發明性教義之特定應用。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之特定發明性實施例之許多等效物。因此，應了解，前述實施例僅以實例之方式呈現，且在所附申請專利範圍及其等效物之範疇內，可按不同於特定描述及主張之方式來實踐發明性實施例。本揭示案之發明性實施例涉及本文所述之各個別特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料、套組及/或方法之任何組合包括於本揭示案之發明範疇內。
如本文所定義及使用之所有定義應理解為主導字典定義、以引用之方式併入之文獻中之定義及/或所定義之術語的普通含義。
本文所揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案關於各自引用之主題以引用之方式併入，在一些情況下可涵蓋文獻全文。
除非有相反明確指示，否則如本文在說明書及申請專利範圍中使用之不定冠詞「一個」及「一種」應理解為「至少一個/種」。
如本文在說明書及申請專利範圍中使用之片語「及/或」應理解為意指如此聯合之要素中之「任一者或兩者」，亦即，在一些情況下聯合存在且在其他情況下分開存在之要素。以「及/或」列出之多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此聯合之要素中之「一或多者」。除由「及/或」條款特定標識之要素以外，可視情況存在其他要素，無論與彼等特定標識之要素相關抑或不相關。因此，作為一個非限制性實例，當與諸如「包含」之開放式語言聯合使用時，對「A及/或B」之引用在一個實施例中可指代僅A (視情況包括除B以外之要素)；在另一個實施例中，僅B  (視情況包括除A以外之要素)；在又一個實施例中，A及B兩者(視情況包括其他要素)；等。
如本文在說明書及申請專利範圍中使用之「或」應理解為具有與如上文所定義之「及/或」相同之含義。舉例而言，當分隔清單中之項目時，「或」或「及/或」應解釋為包括性的，亦即，包括許多或一系列要素中之至少一者，但亦包括多於一者，且視情況包括額外未列出之項目。僅有相反明確指示之術語，諸如「僅一個」或「恰好一個」，或當在申請專利範圍中使用時，「由……組成」將指代恰好包括許多或一系列要素中之一個要素。一般而言，如本文使用之術語「或」當前置有排他性術語，諸如「任一個」、「其中一個」 「僅一個」或「恰好其中一個」時，僅應解釋為指示排他性替代方案(亦即，「一者或另一者，而非兩者」)。「基本上由……組成」當在申請專利範圍中使用時，應具有專利法領域中使用之普通含義。
如本文使用之術語「約」意指在一般熟習此項技術者確定之特定值之可接受誤差範圍內，此將部分取決於量測或確定該值之方式，亦即，量測系統之限制。举例而言，根據此項技術中之實踐，「約」可意指在可接受之標準偏差內。或者，「約」可意指给定值之至多± 20%、較佳至多± 10%、更佳至多± 5%且甚至更佳至多± 1%之範圍。在申請案及申請專利範圍中描述特定值之情況下，除非另有規定，否則術語「約」為隱含的且在此情形中意指在對於特定值可接受之誤差範圍內。
如本文在說明書及申請專利範圍中使用，關於一或多個要素之清單的片語「至少一個」應理解為意指選自要素清單中之任何一或多個要素的至少一個要素，但不一定包括要素清單內特定列出之每個要素中之至少一者，且不排除要素清單中之要素的任何組合。此定義亦允許除片語「至少一個」所指之要素清單內特定標識之要素以外的要素可視情況存在，無論與彼等特定標識之要素相關抑或不相關。因此，作為一個非限制性實例，「A及B中之至少一者」(或等效地「A或B中之至少一者」，或等效地「A及/或B中之至少一者」)在一個實施例中可指代至少一個，視情況包括多於一個A，不存在B (且視情況包括除B以外之要素)；在另一個實施例中，至少一個，視情況包括多於一個B，不存在A (且視情況包括除A以外之要素)；在又一個實施例中，至少一個，視情況包括多於一個A，及至少一個，視情況包括多於一個B (且視情況包括其他要素)；等。
亦應了解，除非有相反明確指示，否則在本文主張之包括多於一個步驟或動作之任何方法中，方法之步驟或動作之次序不一定限於敘述方法之步驟或動作的次序。
無
圖 1說明在存在或不存在 Reg1及 TGFBRII基因之基因中斷之情況下對CD83 CAR T細胞擴增之評估。無RNP為對照細胞。CD83 CAR: 83 KO為表現抗CD83 CAR之CD83剔除細胞。CD83 CAR: 83+R+T KO為表現抗CD83 CAR之CD83+Reg1+TGFBRII剔除細胞。
圖 2A-2B說明第6天( 圖 2A)及第13天( 圖 2B)藉由流式細胞術確定的在CD83 CAR T細胞群中CD4及CD8 T細胞(CD4/CD8)之頻率。
圖 3A-3B說明抗CD83 CAR T細胞之活體外細胞毒性。 圖 3A：第2天、第5天、第7天及第10天計數之活靶細胞數目。 圖 3B：第2天、第5天、第7天及第10天計數之T細胞數目。
圖 4A-4C說明抗CD83 CAR T細胞之活體內細胞毒性。 圖 4A：未經處理之小鼠中之腫瘤生長。 圖 4B：經CD83 CAR: 83 KO T細胞處理之小鼠中之腫瘤生長。 圖 4C：經CD83 CAR: 83+R+T KO T細胞處理之小鼠中之腫瘤生長。
圖 5A-5C說明由CD83剔除之抗CD83 CAR-T細胞遞送之抗腫瘤活性的增強。 圖 5A：經CD83 CAR: 83 KO T細胞處理之小鼠中之腫瘤生長。 圖 5B：經CD83 CAR: 83+R+T KO T細胞處理之小鼠中之腫瘤生長。 圖 5C：未經處理或經抗CD83 CAR T細胞處理之小鼠的存活概率。
圖 6A-6C說明CAR T細胞處理後腫瘤再攻擊之結果。 圖 6A：CD83 CAR: 83 KO T細胞處理後45天用THP-1腫瘤細胞再攻擊之小鼠與無處理組相比的腫瘤生長。 圖 6B：CD83 CAR: 83 KO + R/T KO T細胞處理後45天用THP-1腫瘤細胞再攻擊之小鼠與無處理組相比的腫瘤生長。 圖 6C：CAR-T處理後45天用THP-1腫瘤細胞再攻擊之小鼠與無處理組相比的存活概率。
圖 7為顯示CD83、Regnase-1及TGFBRII基因中斷之抗CD83 CAR T細胞與無CD83基因中斷或僅有CD83基因中斷之對應抗CD83 CAR-T細胞相比改良小鼠移植物抗宿主病(GvHD)模型之動物存活率的圖。
圖 8為顯示CD83、Regnase-1及TGFBRII基因中斷之抗CD83 CAR T細胞與無CD83基因中斷或僅有CD83基因中斷之對應抗CD83 CAR-T細胞相比提高小鼠THP1異種移植腫瘤模型之存活率的圖。
圖 9A-9D包括顯示各種處理組之小鼠在處理過程中之體重變化的圖。 圖 9A ：未經處理之動物。 圖 9B ：單獨注射CD83 CAR-T KO細胞之動物。 圖 9C ：單獨注射貝拉西普之動物。 圖 9D ：組合注射CD83 CAR-T KO細胞及貝拉西普之動物。
圖 10為顯示如所指示之各種處理組之存活曲線的圖。
圖 11A-11B包括顯示如所指示之處理組之代表性植入分析的圖。 圖 11A：注射與或不與貝拉西普一起之CD83 CAR-T KO細胞之動物中之CD45+細胞水準。 圖 11B：注射CD83 CAR-T KO及貝拉西普之動物中之CD3+細胞水準。
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Claims (66)

  1. 一種基因工程改造之T細胞群體，該群體包含： (i) 編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR) (抗CD83 CAR)之核酸；及 (ii) 中斷之 Regnase-1( Reg1)基因；中斷之轉化生長因子β受體II ( TGFBRII)基因，或其組合。
  2. 如請求項1之基因工程改造之T細胞群體，該群體包含該中斷之 Reg1基因及該中斷之 TGFBRII基因兩者。
  3. 如請求項1或2之基因工程改造之T細胞群體，該群體進一步包含(iii)中斷之CD83基因。
  4. 如請求項1至3中任一項之基因工程改造之T細胞群體，該群體進一步包含(iv)中斷之T細胞受體α鏈恆定區( TRAC)基因、中斷之β-2-微球蛋白( β2M)基因或其組合。
  5. 如請求項1之基因工程改造之T細胞群體，該群體包含： (i) 編碼該抗CD83 CAR之該核酸； (ii) 該中斷之 Reg1基因及該中斷之 TGFBRII基因； (iii) 該中斷之 CD83基因；及 (iv) 該中斷之 TRAC基因及該中斷之 β2M基因。
  6. 如請求項1至5中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該中斷之 Reg1基因在外顯子4中進行基因編輯。
  7. 如請求項1至6中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該中斷之 TGFBRII基因在外顯子5中進行基因編輯。
  8. 如請求項1至7中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該中斷之 CD83基因在外顯子2或外顯子3中進行基因編輯。
  9. 如請求項1至8中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該中斷之 CD83基因、該中斷之 Reg1基因、該中斷之 TGFBRII基因、該中斷之 TRAC基因及/或該中斷之 β2M基因係由CRISPR/Cas介導之基因編輯系統進行基因編輯。
  10. 如請求項9之基因工程改造之T細胞群體，其中該CRISPR/Cas介導之基因編輯包含： (a) 靶向該 Reg1基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO:36或37之核苷酸序列； (b) 靶向該 TGFBRII基因中之位點的gRNA，該gRNA包含SEQ ID NO: 30或31之核苷酸序列；及/或 (c) 靶向該 CD83基因中之位點的gRNA，該gRNA包含SEQ ID NO: 24或25或者SEQ ID NO: 100或101之核苷酸序列。
  11. 如請求項9或10之基因工程改造之T細胞群體，其中該CRISPR/Cas介導之基因編輯包含： (d) 靶向該 TRAC基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 6或7之核苷酸序列；及/或 (e) 靶向該 β2M基因中之位點的gRNA，該gRNA包含SEQ ID NO: 12或13或者SEQ ID NO: 18或19之核苷酸序列。
  12. 如請求項10或11之基因工程改造之T細胞群體，其中該CRISPR/Cas介導之基因編輯包含： (a) 靶向該 Reg1基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 34之核苷酸序列； (b) 靶向該 TGFBRII基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 28之核苷酸序列； (c) 靶向該 CD83基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 22或98之核苷酸序列； (d) 靶向該 TRAC基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列；及/或 (e) 靶向該 β2M基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO:10或16之核苷酸序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中編碼該抗CD83 CAR之該核酸插入該等T細胞之基因體中。
  14. 如請求項13之基因工程改造之T細胞群體，其中編碼該抗CD83 CAR之該核酸插入該中斷之 CD83基因、該中斷之 Reg1基因、該中斷之 TGFBRII基因、該中斷之 TRAC基因或該中斷之 β2M中。
  15. 如請求項14之基因工程改造之T細胞群體，其中編碼該抗CD83 CAR之該核酸插入該中斷之 TRAC基因中。
  16. 如請求項15之基因工程改造之T細胞群體，其中編碼該抗CD83 CAR之該核酸置換該 TRAC基因中包含SEQ ID NO:7之缺失片段。
  17. 如請求項1至16之基因工程改造之T細胞群體，其中該CAR包含對CD83具有特異性之細胞外抗原結合結構域、4-1BB或CD28之共刺激信號傳導結構域及CD3ζ之細胞質信號傳導結構域。
  18. 如請求項17之基因工程改造之T細胞群體，其中該細胞外抗原結合結構域為結合CD83之單鏈可變片段(scFv) (抗CD83 scFv)，且其中該抗CD83 scFv包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。
  19. 如請求項18之基因工程改造之T細胞群體，其中該V H包含分別如SEQ ID NO:71、72及73所示之重鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3；及/或其中該V L包含分別如SEQ ID NO:74、75及76所示之輕鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3。
  20. 如請求項19之基因工程改造之T細胞群體，其中該V H包含SEQ ID NO: 77之胺基酸序列，及/或其中該V L包含SEQ ID NO: 78之胺基酸序列。
  21. 如請求項20之基因工程改造之T細胞群體，其中該抗CD83 scFv包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列。
  22. 如請求項21之基因工程改造之T細胞群體，其中結合CD83之該CAR包含SEQ ID NO: 80或81之胺基酸序列。
  23. 如請求項1至22中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等基因工程改造之T細胞來源於一或多個人類供體之初級T細胞。
  24. 如請求項1至23中任一項之基因工程改造之T細胞群體，其中該等T細胞進一步表現結合腫瘤抗原之嵌合抗原受體(CAR)，該腫瘤抗原視情況為CD19、BCMA或CD70。
  25. 一種用於製備基因工程改造之T細胞群體之方法，該方法包括： (a) 提供複數個細胞，該等細胞為T細胞或其前驅細胞； (b) 向該等T細胞遞送編碼結合CD83之嵌合抗原受體(CAR) (「抗CD83 CAR」)之核酸； (c) 對 Reg1基因、 TGFBRII基因或其組合進行基因編輯； 從而產生表現該抗CD83 CAR且具有 Reg1基因、中斷之 TGFBRII基因或其組合之基因工程改造之T細胞群體。
  26. 如請求項25之方法，其中(a)中之該複數個細胞包含中斷之 CD83基因、中斷之 TRAC基因、中斷之 β2M基因或其組合。
  27. 如請求項25之方法，其中該方法進一步包括： (d) 對 CD83基因進行基因編輯，及/或 (e) 對 TRAC基因、 β2M基因或其組合進行基因編輯。
  28. 如請求項25或26之方法，其中步驟(c)係由一或多個CRISPR/Cas介導之基因編輯系統來執行。
  29. 如請求項27或28之方法，其中步驟(d)及/或步驟(e)係由一或多個CRISPR/Cas介導之基因編輯系統來執行。
  30. 如請求項25至29中任一項之方法，其中將RNA引導之核酸酶及一或多個靶向該 Reg1基因、該 TGFBRII基因、該 CD83基因、該 TRAC基因及/或該 β2M基因之gRNA遞送至該複數個細胞。
  31. 如請求項30之方法，其中該RNA引導之核酸酶及該一或多個gRNA形成一或多個核糖核蛋白粒子(RNP)。
  32. 如請求項30或31之方法，其中該RNA引導之核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶。
  33. 如請求項32之方法，其中該Cas9核酸酶為釀膿鏈球菌( S. pyogenes) Cas9核酸酶。
  34. 如請求項25至33中任一項之方法，其中編碼該抗CD83 CAR之該核酸係在AAV載體中。
  35. 如請求項25至34中任一項之方法，其中編碼該抗CD83 CAR之該核酸包含位於編碼該CAR之該核苷酸序列側翼之左同源臂及右同源臂；且其中該左同源臂及該右同源臂與該等T細胞中之基因體基因座同源，從而允許將該核酸插入該基因體基因座中。
  36. 如請求項35之方法，其中該基因體基因座係在該 CD83基因中、該 Reg1基因中、該 TGFBRII基因中、該 TRAC基因中或該 β2M中。
  37. 如請求項36之方法，其中該基因體基因座係在該 TRAC基因中。
  38. 如請求項25至37中任一項之方法，其中步驟(c)係藉由向該複數個T細胞遞送以下各物來執行： (a) 靶向該 Reg1基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 36或37之核苷酸序列；及/或 (b) 靶向該 TGFBRII基因中之位點的gRNA，該gRNA包含SEQ ID NO: 30或31之核苷酸序列。
  39. 如請求項27至38中任一項之方法，其中步驟(d)係藉由向該複數個T細胞遞送以下各物來執行： (c) 靶向該CD83基因中之位點的gRNA，該gRNA包含SEQ ID NO: 24或25或者SEQ ID NO: 100或101之核苷酸序列。
  40. 如請求項27至39中任一項之方法，其中步驟(e)係藉由向該複數個T細胞遞送以下各物來執行： (d) 靶向該 TRAC基因中之位點的向導RNA (gRNA)，該gRNA包含SEQ ID NO: 6或7之核苷酸序列；及/或 (e) 靶向該 β2M基因中之位點的gRNA，該gRNA包含SEQ ID NO: 12或13或者SEQ ID NO: 18或19之核苷酸序列。
  41. 如請求項38至40中任一項之方法，其中： (a) 靶向該 Reg1基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 34之核苷酸序列； (b) 靶向該 TGFBRII基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 28之核苷酸序列； (c) 靶向該 CD83基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 22或98之核苷酸序列； (d) 靶向該 TRAC基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 4之核苷酸序列；及/或 (e) 靶向該 β2M基因之該gRNA包含間隔子，該間隔子包含SEQ ID NO: 10或16之核苷酸序列。
  42. 如請求項41之方法，其中該gRNA進一步包含支架序列。
  43. 如請求項42之方法，其中： (a) 靶向該 Reg1基因之該gRNA包含SEQ ID NO: 32或33之核苷酸序列； (b) 靶向該 TGFBRII基因之該gRNA包含SEQ ID NO: 26或27之核苷酸序列； (c) 靶向該 CD83基因之該gRNA包含SEQ ID NO: 20或21或者SEQ ID NO: 96或97之核苷酸序列； (d) 靶向該 TRAC基因之該gRNA包含SEQ ID No: 2或3之核苷酸序列；及/或 (e) 靶向該 β2M基因之該gRNA包含SEQ ID NO: 8、9、14或15之核苷酸序列。
  44. 如請求項25至43中任一項之方法，其中該抗CD83 CAR包含對CD83具有特異性之細胞外抗原結合結構域、4-1BB或CD28之共刺激信號傳導結構域及CD3ζ之細胞質信號傳導結構域。
  45. 如請求項44之方法，其中該細胞外抗原結合結構域為結合CD83之單鏈可變片段(scFv) (抗CD83 scFv)，且其中該抗CD83 scFv包含重鏈可變區(V H)及輕鏈可變區(V L)。
  46. 如請求項45之方法，其中該V H包含分別如SEQ ID NO:71、72及73所示之重鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3；及/或其中該V L包含分別如SEQ ID NO:74、75及76所示之輕鏈互補決定區(CDR) 1、CDR2及CDR3。
  47. 如請求項46之方法，其中該V H包含SEQ ID NO:77之胺基酸序列，及/或其中該V L包含SEQ ID NO:78之胺基酸序列。
  48. 如請求項47之方法，其中該抗CD83 scFv包含SEQ ID NO:79之胺基酸序列。
  49. 如請求項48之方法，其中該結合CD83之抗CD83 CAR包含SEQ ID NO:80或81之胺基酸序列。
  50. 如請求項25至49中任一項之方法，該方法進一步包括向該複數個T細胞遞送對腫瘤抗原具有特異性之嵌合抗原受體，該腫瘤抗原視情況為CD19、BCMA或CD70。
  51. 一種基因工程改造之T細胞群體，該群體係藉由如請求項25至50中任一項之方法製備。
  52. 一種用於消除個體中非所需之細胞的方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項1至24及51中任一項之基因工程改造之T細胞群體。
  53. 如請求項52之方法，其中該等非所需之細胞為表現CD83之疾病細胞。
  54. 如請求項53之方法，其中該等表現CD83之疾病細胞為CD83+癌細胞或CD83+自體反應性免疫細胞。
  55. 如請求項52至54中任一項之方法，其中該個體為患有癌症或免疫病症之人類患者。
  56. 如請求項52至55中任一項之方法，其中該基因工程改造之T細胞群體對於該個體而言為同種異體的。
  57. 如請求項52至56中任一項之方法，該方法進一步包括向該個體投與表現嵌合抗原受體之基因工程改造之T細胞，該嵌合抗原受體靶向腫瘤抗原，該腫瘤抗原視情況為CD19、BCMA或CD70。
  58. 如請求項52至57中任一項之方法，該方法進一步包括向該個體投與有效量之消炎劑。
  59. 如請求項58之方法，其中將該基因工程改造之免疫細胞群體及該消炎劑調配於獨立組合物中。
  60. 如請求項58或59之方法，其中該消炎劑為抑制促炎細胞介素之抗體或抑制T細胞共刺激之劑。
  61. 如請求項60之方法，其中該消炎劑為CTLA4-Fc融合蛋白。
  62. 如請求項61之方法，其中該CTLA4-Fc融合蛋白為貝拉西普(belatacept)或阿巴西普(abatacept)。
  63. 如請求項55至62中任一項之方法，其中該人類患者患有免疫疾病或處於免疫疾病之風險下。
  64. 如請求項63之方法，其中該免疫疾病為自體免疫疾病。
  65. 如請求項63之方法，其中該免疫疾病為移植物抗宿主病(GvHD)。
  66. 如請求項65之方法，其中該人類患者已經歷或正經歷同種異體細胞療法，該療法視情況為同種異體CAR-T療法。
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