JP2022512882A - 抗cd33免疫細胞癌療法 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、いくつかの実施形態において、CD33+悪性腫瘍などの癌の治療のための方法及び組成物(例えば、細胞組成物)が提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2018年11月7日に出願された米国仮特許出願第62/756,718号、2018年11月14日に出願された米国仮特許出願第62/767,388号、2018年11月14日に出願された米国仮特許出願第62/767,395号、2019年3月29日に出願された米国仮特許出願第62/826,643号、及び2019年3月29日に出願された米国仮特許出願第62/826,648号明細書の出願日の利益を主張する。前の出願の各々の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、遺伝的に改変されたT細胞を使用して、癌細胞をより特異的に且つ効率的に標的化し且つ死滅させる。T細胞が血液から回収された後、細胞は、それらの表面上にCARを含むように操作される。CARは、CRISPR/Cas9遺伝子編集技術を使用してT細胞に導入され得る。これらの異質遺伝子型のCAR T細胞が患者に注射されるとき、受容体は、T細胞が癌細胞を死滅させることを可能にする。
急性骨髄性白血病(AML)は、骨髄前駆細胞において蓄積された変異から生じる血液腫瘍であり、造血組織における骨髄芽球の蓄積をもたらす過剰増殖及び分化の遮断を引き起こす。標準的な導入化学療法に対する応答は、最初に高いが、AML患者の大部分に関して再発が一般的であり、予後は芳しくない(Talati and Sweet,2018)。近年、AMLのための新しい治療はほとんど承認されていない。
CD33(Siglec3、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン3、gp67、又はp67としても知られる)は、AML及び他の白血病、例えば、T細胞白血病の治療のための魅力的な標的である。それは、症状及び再発の両方でAML芽球及び亜集団(免疫表現型が定義された白血病幹細胞)の大部分で発現される(Haubner et al.,2018)。その発現は、正常な単球、顆粒球、造血前駆細胞及び免疫表現型が定義された造血性幹細胞集団中の一部の細胞に限定されると考えられる(Haubner et al.,2018)。マウスにおけるCD33のノックアウトは、いかなる明白な表現型ももたらさない(Brikman-Van der Linden et al.,2003)。さらに、抗CD33抗体薬物コンジュゲートゲムツズマブオゾガマイシン(gemtuzumab ozogmicin)(GO)は、AMLにおけるヒトでの使用に関して承認され、許容される安全性プロファイルを有する。しかしながら、GOは、全生存期間において中程度の改善のみを示す(Talati and Sweet,2018)。抗CD33CAR-T細胞などのさらなる強力なペイロードでCD33発現細胞を標的化することは、GOに対してAMLにおける有効性の改善を実証し得る。さらに、抗CD33CAR-T細胞は、他のCD33発現悪性腫瘍のための有効な治療選択肢となる。
本開示のいくつかの態様は、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む操作されたT細胞を提供し、CARは、CD33に特異的に結合する外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞はさらに、破壊されたT細胞受容体アルファ鎖定常領域(TRAC)遺伝子を含む。例えば、TRAC遺伝子は、CARをコードする核酸の挿入によって破壊され得る。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞はさらに、破壊されたベータ-2-ミクログロブリン(β2M)遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞はさらに、破壊されたCD33遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたTRAC遺伝子、破壊されたβ2M遺伝子、破壊されたCD33遺伝子、及び抗CD33抗原結合断片を含むCARをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたTRAC遺伝子を含み、破壊されたTRAC遺伝子は、抗CD33抗原結合断片を含むCARをコードする核酸、破壊されたβ2M遺伝子及び破壊されたCD33遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、CARは、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3z共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む。いくつかの例において、そのような操作されたT細胞は、野生型CD33遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び破壊されたCD33遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;及び(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び(iii)破壊されたCD33遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、野生型CD33を含む。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び(iii)破壊されたCD33遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたT細胞は、野生型CD33を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;並びに(iii)破壊されたCD33遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたT細胞は、野生型CD33を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び(iii)破壊されたCD33遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;及び(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたT細胞は、野生型CD33を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び(iii)破壊されたCD33遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団を提供する。いくつかの例において、操作されたT細胞は、野生型CD33を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び(iii)破壊されたCD33遺伝子を含む細胞の集団を提供する。
本明細書に記載される任意の操作されたT細胞は、ヒトT細胞であり得る。
CARの外部ドメインは、いくつかの実施形態において、抗CD33抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、抗CD33一本鎖可変断片(scFv)である。抗CD33 scFvは、いくつかの実施形態において、配列番号73、75、85、87、97、又は99のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗CD33 scFvは、配列番号65、77若しくは89のいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号66、78若しくは90のいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む。いくつかの実施形態では、抗CD33 scFvは、配列番号67、配列番号68、及び/又は配列番号69のCDRアミノ酸配列を含むVHを含み;且つ/又は抗CD33 scFvは、配列番号70、配列番号71、及び/又は配列番号72のCDRアミノ酸配列を含むVL配列を含む。いくつかの実施形態では、抗CD33 scFvは、配列番号79、配列番号80、及び/又は配列番号81のCDRアミノ酸配列を含むVHを含み;且つ/又は抗CD33 scFvは、配列番号82、配列番号83、及び/又は配列番号84のCDRアミノ酸配列を含むVL配列を含む。いくつかの実施形態では、抗CD33 scFvは、配列番号91、配列番号92、及び/又は配列番号93のCDRアミノ酸配列を含むVHを含み;且つ/又は抗CD33 scFvは、配列番号94、配列番号95、及び/又は配列番号96のCDRアミノ酸配列を含むVL配列を含む。
CARは、いくつかの実施形態において、CD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、CARは、CD28共刺激ドメイン又は41BB共刺激ドメインを含む。特定の例において、本明細書で開示されるCARは、抗CD33 scFv、CD28共刺激ドメイン、及びCD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。他の例において、本明細書で開示されるCARは、抗CD33 scFv、4-1BB共刺激ドメイン、及びCD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、TRAC遺伝子は、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、且つ/又はCARは、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116又は119のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、破壊されたβ2M遺伝子は、配列番号9~14のいずれか1つから選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、T細胞は、野生型CD33遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、T細胞は、破壊されたCD33遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたCD33遺伝子は、AGTTCATGGTACTGGTTCC(配列番号187)、AGTTCATGGTTCC(配列番号188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(配列番号189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(配列番号190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(配列番号191)、AGTTCATACTGGTTCC(配列番号192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(配列番号193)、及び/又はAGTTACTGGTTCC(配列番号194)のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたCD33遺伝子は、AGTTCATGGTTACTGGTTCC(配列番号186)を含む断片を欠く。
いくつかの実施形態では、破壊されたCD33遺伝子は、AAATCCTGGCACT(配列番号300)、AAATCCCTGGCACT(配列番号301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(配列番号304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(配列番号305)、AAATCCTCCCTGGCACT(配列番号306)、AAATCCCCTGGCACT(配列番号307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号308)、ACATCCTGGCACT(配列番号309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(配列番号310)、AAATCCTCATCTGGCACT(配列番号311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(配列番号312)、AAATCCTCTGGCACT(配列番号313)、AAATCCCCCTGGCACT(配列番号314)、AAATCCTCACT(配列番号315)、ACATCCCTGGCACT(配列番号316)、及び/又はAAATのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたCD33遺伝子は、AAATCCTCATCCCTGGCACT(配列番号299)を含む断片を欠く。
いくつかの実施形態では、破壊されたCD33遺伝子は断片を欠き、その3’セグメントは、AAATCCTCAT(配列番号317)、AAATCCTCATCCCT(配列番号318)、AAATCCTCATCCCTGG(配列番号320)、AAATCCTCATC(配列番号322)、又はAAATCCTCATCCCTGGCA(配列番号324)のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、破壊されたCD33遺伝子は断片を欠き、その5’セグメントは、CTCATCCCTGGCACT(配列番号323)のヌクレオチド配列を含む。
本明細書では、いくつかの態様において、操作されたT細胞(例えば、抗CD33 CARをコードする核酸を含む)の集団であって、集団のうちの少なくとも25%又は少なくとも50%の操作されたT細胞がCARを発現する集団も提供される。例えば、集団のうちの少なくとも70%の操作されたT細胞がCARを発現する。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも25%の操作されたT細胞は、インビトロ増殖の少なくとも7日後又は少なくとも14日後にCARを発現する。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのT細胞受容体(TCR)タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも90%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのTCRタンパク質を発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも70%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも20%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD33タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD33タンパク質を発現しない場合がある。
いくつかの実施形態では、集団の操作されたT細胞は、CD33を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、集団のうちの少なくとも50%の癌細胞の細胞溶解を誘導する。例えば、集団の操作されたT細胞は、集団のうちの少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%の癌細胞の細胞溶解を誘導し得る。いくつかの実施形態では、集団の操作されたT細胞は、癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、IFNγを分泌する。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞と癌細胞の比は、1:1~2:1である。癌細胞は、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)などの白血病であり得る。他の癌細胞が標的化されてもよい。
いくつかの実施形態では、集団の操作されたT細胞の増殖能は、対照細胞の増殖能の10%以内である。
本開示の他の態様は、本明細書に記載されるとおりの操作されたT細胞の集団を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、投与の5~10日後の対象の体重パーセントは、対象の初期の体重の10%以内であり、対象の初期の体重は、投与時の対象の体重である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト対象である。いくつかの実施形態では、対象は、癌を有する。癌は、例えば、CD33を発現する場合がある。癌は、例えば、ALL、AML、CLL及びCMLなどの白血病であり得る。
本開示のさらなる態様は、操作されたT細胞を生成する方法であって、(a)T細胞にRNA誘導型ヌクレアーゼ、TRAC遺伝子を標的化するgRNA、及びCD33に特異的に結合する外部ドメインを含むCARをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること(CARをコードする核酸は、TRAC遺伝子の左及び右相同性アームに隣接する)、並びに(b)操作されたT細胞を生成することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、TRAC遺伝子を標的化するgRNAは、配列番号18又は配列番号19のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号40のヌクレオチド配列を標的化する。
いくつかの実施形態では、方法はさらに、T細胞にβ2M遺伝子を標的化するgRNAを送達することを含む。いくつかの実施形態では、β2M遺伝子を標的化するgRNAは、配列番号20又は配列番号21のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号41のヌクレオチド配列を標的化する。
いくつかの実施形態では、方法はさらに、T細胞にCD33遺伝子を標的化するgRNAを送達することを含む。いくつかの実施形態では、CD33遺伝子を標的化するgRNAは、表10において提供されるとおりのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、Cas9ヌクレアーゼ、任意選択により、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、CARは、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116又は119のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む。
本開示のさらなる態様は、癌、例えば、白血病を有する対象に本明細書に記載されるとおりの操作されたT細胞の集団を投与することを含む、対象における腫瘍の体積を減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象における腫瘍の体積は、ベースライン対照に対して少なくとも50%減少され、任意選択により、集団の1×105個の細胞~1×107個の細胞が投与される。
エレクトロポレーション後の2週間目に選択された抗CD33 CARコンストラクトで編集されたT細胞上の抗CD33 CARの表面発現を示すフローサイトメトリープロットを含む。CTX-965b CARによるトランスフェクションは、高割合の抗CD33 CARを発現するT細胞をもたらした。全てのCAR T細胞は、TRAC-/β2M-(2KO)でもある。 エレクトロポレーション後の2週間目に選択された抗CD33 CARコンストラクトで編集されたT細胞上の抗CD33 CARの表面発現を示すフローサイトメトリープロットを含む。CTX-970 CAR及びCTX-965b CARによるトランスフェクションは、高割合の抗CD33 CARを発現するT細胞をもたらした。全てのCAR T細胞は、TRAC-/β2M-(2KO)でもある。 エレクトロポレーション後の1週間目に選択された抗CD33 CARコンストラクトで編集されたT細胞上の抗CD33 CARの表面発現を示すフローサイトメトリープロットを含む。CTX-981 CAR、CTX-981b CAR、CTX-982 CAR、及びCTX-982b CARによるトランスフェクションは全て、高割合の抗CD33 CARを発現するT細胞をもたらした。全てのCAR T細胞は、TRAC-/β2M-(2KO)でもある。 ドナーT細胞集団に対する遺伝子編集の効果を実証するフローサイトメトリープロットを含む。細胞表面TCR、β2M及び抗CD33 CARの発現を有する編集されたT細胞の集団が示される。さらに、CD4+及びCD8+であるT細胞の集団が示される。注目すべきことに、CTX-965b細胞は、遺伝子編集後の少なくとも1週間高いレベルのCD4/CD8の発現を保持する。 ある期間の間のTRAC-/β2M- T細胞においてCARを発現する細胞の%を示す。全ての抗CD33 CAR-T細胞は、2週間かけて増殖した。 ある期間の間のTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+の編集されたT細胞集団内のCD4+及びCD8+ T細胞の%を示す。上のパネルは、編集後の1及び2週目の7種の一次T細胞ドナーに由来するCTX-965b CAR T細胞中のCD4+及びCD8+細胞を示す。下のパネルは、編集後の1及び2週目に4種の一次T細胞ドナーに由来するCTX-970 CAR T細胞中のCD4+及びCD8+細胞を示す。 ある期間の間のTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞集団中のCD4+及びCD8+細胞の%を示す。特に、図は、編集後の1及び2週目の3種の一次T細胞ドナーに由来するCTX-982b CAR T細胞中のCD4+及びCD8+細胞を示す。 抗CD33 CAR-T細胞(CTX-965b)の集団、及び対照T細胞(RNPなし;TRAC-/β2M-)の集団の細胞増殖を示すグラフを含む。 様々な血液に由来する細胞株におけるCD33の表面発現レベルを示すグラフを含む。左のパネルは、THP-1(AML)及びPBMCが、CD33の高い表面発現を有することを示し、右のパネルは、AML癌細胞株:MV4-11、THP-1及びKG-1におけるCD33の高い表面発現を示す。右のパネルはまた、CD33ノックアウトで操作されたMV4-11細胞(MV4-11 CD33ノックアウト)が、CD33を発現しないことを示す。 TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b及びCTX-970)が、CD33を発現するAML細胞(THP-1、KG-1及びMV4-11)を死滅させることができることを実証するグラフを含む。図5Aは、4種の異なる一次T細胞ドナーから作製されたCTX-965b CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CTX-965b:THP-1の細胞比でTHP-1細胞において細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。図5Bは、1つのドナーから単離されたT細胞からそれぞれ作製されたCTX-965b及びCTX-970 CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CAR-T細胞:THP-1の細胞比でTHP-1細胞の細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。 図5Cは、4種の異なるドナーから単離されたT細胞から作製されたCTX-965b、及び1種の一次T細胞ドナーから作製されたCTX-970 CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CAR-T細胞:KG-1の細胞比でKG-1細胞において細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。図5Dは、1つのドナーから単離されたT細胞からそれぞれ作製されたCTX-965b及びCTX-970 CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CAR-T細胞:MV4-11の細胞比でMV4-11細胞において細胞溶解を誘導する際に効果的であることを示す。 TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b及びCTX-970)が、CD33を発現するAML細胞(THP-1、KG-1及びMV4-11)の存在下でIFNγを分泌できることを実証するグラフを含む。図6Aは、4種のドナーから作製されたCTX-965b CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CTX-965b:THP-1の細胞比でTHP-1細胞の存在下でIFNγを分泌する際に効果的であることを示す。図6Bは、CTX-965b及びCTX-970 CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CAR-T細胞:THP-1の細胞比でTHP-1細胞の存在下でIFNγを分泌する際に効果的であることを示す。 図6Cは、CTX-965b及びCTX-970 CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CAR-T細胞:MV-411の細胞比でMV-411細胞の存在下でIFNγを分泌する際に効果的であることを示す。図6Dは、CTX-965b及びCTX-970 CAR T細胞が、0.05:1~1:1 CAR-T細胞:KG1の細胞比でKG1細胞の存在下でIFNγを分泌する際に効果的であることを示す。 図6Eは、CTX-965b CAR T細胞増殖がサイトカイン依存的であることを示す。 TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b CAR T細胞)が、インビボマウスモデルで皮下THP-1 AML癌における腫瘍体積を減少させる際に効果的であることを示すグラフを含む。 TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b CAR T細胞)が、インビボマウスモデルで皮下THP-1 AML癌における十分に確立された腫瘍(およそ150mm3の開始腫瘍体積)の腫瘍体積を減少させる際に効果的であることを示すグラフを含む。 CD33を標的化する様々なsgRNAによる遺伝子編集の後の編集されたCD8+(左パネル)及びCD4+(右パネル)T細胞のパーセントを示す。 遺伝子編集後の7日目及び14日目におけるCD33破壊の有り無し両方でのTRAC-/β2M-編集されたT細胞における%CAR発現細胞を示す。データは、6種の異なるコンストラクト:CTX-981(981)、CTX-981b(981b)、CTX-982(982)、CTX-982b(982b)、CTX-970(970)、又はCTX-965b(965b)の1つに由来するCARを発現するT細胞に関して示される。 ある期間の間のTRAC-/β2M-編集されたT細胞及びTRAC-/β2M-/CD33-/抗CD33 CAR+編集されたT細胞における%CAR発現細胞を示す。データは、3種の異なるコンストラクト:CTX-965b(965b)、CTX-970(970)、又はCTX-982b(982b)の1つに由来するCARを発現するCAR+ T細胞に関して示される。黒色のバー=7日;灰色のバー:14日。 ある期間の間のTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+編集されたT細胞及びTRAC-/β2M-/CD33-/抗CD33 CAR+編集されたT細胞集団におけるCD4+及びCD8+細胞の%を示す。左のパネルは、編集後の1及び2週目のCAR T細胞におけるCD8+細胞を示す。右のパネルは、編集後の1及び2週目のCAR T細胞におけるCD4+ CD8+細胞を示す。 TRAC-/β2M-/CD33-/抗CD33 CAR+ T細胞が、AML癌細胞を死滅させる能力を保持することを示す。左のパネルは、単一の一次T細胞ドナーから作製されたCAR+ T細胞によるAML細胞の%細胞溶解を示す。右のパネルは、異なる一次T細胞ドナーから作製されたCAR+ T細胞によるAML細胞の%細胞溶解を示す。 2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T細胞及び3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T細胞が、同様のレベルでCD33を発現するAML細胞(MV4-11;MV4-11)においてIFNγ分泌を誘導できることを実証する。2種の異なる一次T細胞ドナーから作製されたCAR T細胞は、0.05:1~1:1 CAR T細胞:MV4-11の細胞比でIFNγ分泌を誘導する際に効果的である。 2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T細胞及び3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T細胞が、CD33を発現するAML細胞(MV4-11;MV4-11)においてIL-2分泌を誘導できることを実証する。データは、2種の異なる一次T細胞ドナーから作製されたCAR T細胞に関するものである。 1:1比(CAR+ T細胞:標的細胞)で播種されるときの2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T細胞又は3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T細胞に応答した野生型MV4-11細胞(左パネル)又はCD33ノックアウトMV4-11細胞(CD33- MV4-11)(右パネル)に関する%細胞溶解を示す。 CAR+ T細胞:CD33-/MV4-11細胞の0.25:1、0.5:1、1:1、及び2:1比で播種されるときの2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T細胞又は3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T細胞に応答したCD33ノックアウトMV4-11細胞(CD33- MV4-11)に関する%細胞溶解を示す。 CD33が欠損した癌細胞(CD33 KO、MV4-11細胞)に応答した2X KO(TRAC-/β2M-)抗CD33 CAR T細胞又は3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)抗CD33 CAR T細胞におけるIL-2分泌(左パネル)及びIFNγ分泌(右パネル)を示す。 TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b及びCTX-970)が、AMLのMV-4-11 NSGマウスモデルにおいて治療効果をもたらしたことを実証するグラフを含む。図19Aは、CTX-965b CAR T細胞の3種の異なる用量が、AMLのマウスモデルにおいて腫瘍量を減少させる際に効果的であったことを示す。 図19Bは、CTX-965b CAR T細胞の3種の異なる用量が、AMLのマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させる際に効果的であったことを示す。 図19Cは、CD33遺伝子のノックアウトの有り無し両方のCTX-965b CAR T細胞が、AMLのマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させる際に効果的であったことを示す。 図19Dは、CD33遺伝子のノックアウトの有り無し両方のCTX-970 CAR T細胞が、AMLのマウスモデルにおいて生存期間中央値を増加させる際に効果的であったことを示す。 図19Eは、CD33ノックアウトを有するか又は有しないCTX-965b又はCTX-970 CAR T細胞によるマウスの治療の後の33日目に生物発光イメージングによって測定された腫瘍量を示す。
本開示は、抗CD33 CAR+ T細胞が、腫瘍量を減少させ、急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルにおける生存期間中央値を増加させたという発見に少なくとも部分的に基づく。CD33が、活性化T細胞上で高度に発現され、それにより抗CD33 CAR+ T細胞による自己反応性死滅に感受性であり得ることもまた実証された。そのような自己反応性死滅は、本明細書で提供される遺伝子編集方法を使用して抗CD33 CAR+ T細胞において内在性のCD33遺伝子を破壊することによって低減され得るか又は解消され得る。したがって、本開示は、いくつかの態様において、破壊された内在性のCD33遺伝子を有する抗CD33 CAR+ T細胞を提供する。他の態様では、本開示は、野生型の内在性のCD33遺伝子を有する抗CD33 CAR+ T細胞を提供する。
本開示の態様は、破壊されたCD33遺伝子を有するか又は有しない抗CD33 CAR+ T細胞、そのような抗CD33 CAR+ T細胞を生成する方法、及び対象における癌(例えば、AML)を治療するためにそのような抗CD33 CAR+ T細胞を使用する方法を提供する。本明細書で開示される抗CD33 CAR+ T細胞を作製するための成分及びプロセス(例えば、遺伝子編集のためのCRISPR手法及びそこで使用される成分)もまた、本開示の範囲内である。
CD33癌抗原
いくつかの実施形態では、本開示のT細胞は、CD33を標的化するように設計されたキメラ抗原受容体(CAR)により操作される。Siglec3としても知られるCD33は、シアル酸に結合することが知られる骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。CD33は、癌細胞(例えば、急性骨髄性白血病)において発現されるため、CD33は、これらの悪性腫瘍を標的化するための細胞表面マーカーとなると考えられる。
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のT細胞は、抗CD33抗体(例えば、抗CD33 scFv)を含むCARを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、配列番号74、76、86、88、98、又は100のいずれか1つの配列によってコードされる抗CD33 scFvである。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、配列番号73、75、85、87、97、又は99のいずれか1つの配列を含む抗CD33 scFvである。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、配列番号65、77、又は89のいずれか1つのアミノ酸配列を含むVHを含む抗CD33 scFvである。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体は、配列番号66、78、又は90のいずれか1つのアミノ酸配列を含むVLを含む抗CD33 scFvである。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体を含むCARは、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116又は119のいずれか1つの配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体を含むCARは、配列番号101~108、111、114、117、又は120のいずれか1つの配列を含む。いくつかの実施形態では、抗CD33抗体を含むCARは、米国特許第9,359,442号明細書、米国特許第9,587,019号明細書、又は米国特許第5,773,001号明細書において記載されるとおりの抗CD33抗体を含む。
多重遺伝子編集
本開示の操作されたT細胞は、いくつかの実施形態において、例えば、2つ以上の遺伝子における2つ以上の遺伝子編集を含む。例えば、操作されたT細胞は、破壊されたT細胞受容体アルファ鎖定常領域(TRAC)遺伝子、破壊されたベータ-2-ミクログロブリン(β2M)遺伝子、破壊されたプログラム細胞死-1(PD-1又はPDCD1)遺伝子、破壊されたCD70遺伝子、又は前述の破壊された遺伝子の2つ以上の任意の組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたTRAC遺伝子、破壊されたβ2M遺伝子、及び破壊されたCD70遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたTRAC遺伝子、破壊されたβ2M遺伝子、及び破壊されたPD-1遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたTRAC遺伝子、破壊されたβ2M遺伝子、破壊されたCD70遺伝子及び破壊されたPD-1遺伝子を含む。
遺伝子破壊は、遺伝子編集(例えば、1つ以上のヌクレオチドを挿入するか又は欠失させるCRISPR/Cas遺伝子編集を使用する)を介する遺伝子改変を包含することが理解されるはずである。本明細書で使用する場合、用語「破壊された遺伝子」は、コードされた遺伝子産物の活性を実質的に低減するか又は完全に消失させるために野生型対応物に対して1つ以上の変異(例えば、挿入、欠失、又はヌクレオチド置換など)を含有する遺伝子を指す。1つ以上の変異は、非コード領域、例えば、プロモーター領域、転写又は翻訳を調節する調節領域;又はイントロン領域に位置してもよい。或いは、1つ以上の変異は、コード領域中(例えば、エクソン中)に位置してもよい。いくつかの場合において、破壊された遺伝子は、発現しないか又は実質的に低減されたレベルのコードされたタンパク質を発現する。他の場合において、破壊された遺伝子は、機能的ではないか又は実質的に低減された活性を有する変異形態のコードされたタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、機能性タンパク質をコードしない遺伝子である。いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子を含む細胞は、遺伝子によってコードされる検出可能なレベル(例えば、抗体によって、例えば、フローサイトメトリーによって)のタンパク質を、(例えば、細胞表面で)発現しない。検出可能なレベルのタンパク質を発現しない細胞は、ノックアウト細胞と呼ばれ得る。例えば、β2M遺伝子編集を有する細胞は、β2Mタンパク質が、β2Mタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して細胞表面で検出できない場合、β2Mノックアウト細胞とみなされ得る。
いくつかの実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型対応物に対して変異された断片を含むと記載され得る。変異された断片は、欠失、ヌクレオチド置換、付加、又はその組合せを含み得る。他の実施形態では、破壊された遺伝子は、野生型対応物において存在する断片の欠失を有すると記載され得る。いくつかの場合において、欠失された断片の5’末端は、本明細書に開示されるものなどの設計されたガイドRNAによって標的化される遺伝子領域(オンターゲット配列として知られる)内に位置してもよく、且つ欠失された断片の3’末端は、標的化される領域を越えてもよい。或いは、欠失された断片の3’末端は、標的化される領域内に位置してもよく、且つ欠失された断片の5’末端は、標的化される領域を越えてもよい。
本明細書では、いくつかの実施形態において、一定のパーセンテージの細胞が編集されて(例えば、β2M遺伝子が編集される)、特定の遺伝子及び/又はタンパク質を発現しない一定のパーセンテージの細胞をもたらす細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団のうちの少なくとも50%(例えば、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、又は85%)の細胞は、β2Mノックアウト細胞である。いくつかの実施形態では、集団のうちの少なくとも50%の細胞(例えば、T細胞)が、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、遺伝子編集された細胞の集団のうちの少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の細胞は、β2Mノックアウト細胞であってもよい。
細胞においてゲノム欠失をもたらす(例えば、細胞において遺伝子をノックアウトする)CRISPR-Cas遺伝子編集技術を使用する方法が知られている(Bauer DE et al.,Vis.Exp.2015;95;e52118)。
TRAC遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたTRAC遺伝子を含む。この破壊は、TCRの機能喪失をもたらし、且つ操作されたT細胞に同種移植への非アロ反応性及び適合性を与え、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。いくつかの実施形態では、内在性のTRAC遺伝子の発現は、移植片対宿主反応を予防するために除去される。いくつかの実施形態では、TRACゲノム領域を標的化するgRNAは、mRNA又はタンパク質の発現を破壊するTRAC遺伝子におけるインデルをもたらす。いくつかの実施形態では、TRAC遺伝子発現における破壊は、TRACゲノム領域を標的化するgRNAによりもたらされる。いくつかの実施形態では、TRAC遺伝子発現における破壊は、外来配列(例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸)をTRAC遺伝子にノックインすることによって(例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター及びドナー鋳型を使用して)もたらされる。いくつかの実施形態では、TRAC遺伝子におけるゲノム欠失は、gRNA及び/又は外来配列(例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸)をTRAC遺伝子にノックインすることによって(例えば、AAVベクター及びドナー鋳型を使用して)もたらされる。いくつかの実施形態では、TRAC遺伝子発現における破壊は、TRACゲノム領域を標的化するgRNA、及びキメラ抗原受容体(CAR)をTRAC遺伝子にノックインすることによりもたらされる。
TRAC遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のTRAC gRNA配列の非限定的な例は、表4において列挙される(例えば、配列番号18及び19)。また、参照により本明細書に組み込まれる、2018年5月11日に出願された国際出願番号PCT/US2018/032334号明細書も参照されたい。他のgRNA配列は、14番染色体上に位置するTRAC遺伝子配列を使用して設計され得る(GRCh38:14番染色体:22,547,506~22,552,154;.Ensembl;ENSG00000277734)。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞の集団のうちの少なくとも50%は、検出可能なレベルのT細胞受容体(TCR)表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%は、検出可能なレベルのTCR表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、50%~60%、60%~100%、60%~90%、60%~80%、60%~70%、70%~100%、70%~90%、70%~80%、80%~100%、80%~90%、又は90%~100%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのTCR表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ)を含有するリボ核タンパク質粒子(RNP)及びTRAC遺伝子(又は任意の他の目的の遺伝子)を標的化するgRNAが、T細胞(例えば、一次T細胞)に送達される。他の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びgRNAは、T細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子(RNP)は単に、gRNAと予め複合体を形成した/複合体を形成したRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。
いくつかの実施形態では、TRACゲノム領域を標的化するgRNAは、以下の表1における配列から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含むTRAC遺伝子においてインデルをもたらす。
Figure 2022512882000001
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子において15~30塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較して、TRAC遺伝子において15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子において30塩基対より多い欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子において20塩基対の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子においてAGAGCAACAGTGCTGTGGCC(配列番号325)の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子においてAGAGCAACAGTGCTGTGGCC(配列番号325)を含む欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子において配列番号40の欠失を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、未改変のT細胞と比較してTRAC遺伝子において配列番号40を含む欠失を含む。
β2M遺伝子編集
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたβ2M遺伝子を含む。β2Mは、MHC I複合体の共通の(不変の)構成要素である。遺伝子編集によってその発現を破壊することは、宿主対治療用異質遺伝子型T細胞反応を予防することになり、異質遺伝子型T細胞の持続の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、内在性のβ2M遺伝子の発現は、宿主対移植片反応を予防するために除去される。
β2M遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のβ2M gRNA配列の非限定的な例は、表4において列挙される(例えば、配列番号20及び21)。また、参照により本明細書に組み込まれる、2018年5月11日に出願された国際出願番号PCT/US2018/032334号明細書も参照されたい。他のgRNA配列は、15番染色体上に位置するβ2M遺伝子配列を使用して設計され得る(GRCh38の座標:15番染色体:44,711,477-44,718,877;Ensembl:ENSG00000166710)。
いくつかの実施形態では、β2Mゲノム領域を標的化するgRNAは、mRNA又はタンパク質の発現を破壊するβ2M遺伝子におけるインデルをもたらす。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞の集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのβ2M表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのβ2M表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、50%~60%、60%~100%、60%~90%、60%~80%、60%~70%、70%~100%、70%~90%、70%~80%、80%~100%、80%~90%、又は90%~100%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのβ2M表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ)を含有するリボ核タンパク質粒子(RNP)及びB2M遺伝子(又は任意の他の目的の遺伝子)を標的化するgRNAが、T細胞(例えば、一次T細胞)に送達される。他の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びgRNAは、T細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子(RNP)は単に、gRNAと予め複合体を形成した/複合体を形成したRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。
いくつかの実施形態では、編集されたβ2M遺伝子は、以下の表2における配列から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む。
Figure 2022512882000002
CD33遺伝子編集
CD33(Siglec3、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン3、gp67、又はp67としても知られる)は、骨髄系列の細胞上で発現される膜貫通受容体である。CD33は、シアル酸に結合し、したがって、レクチンのSIGLECファミリーのメンバーである。それは通常、骨髄特異的であると考えられるが、活性化T細胞を含む一部のリンパ球系細胞上でも見出され得る(Hernandez-Caselles et al.,2006)。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたCD33遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性CD33遺伝子の発現は、本開示のCAR T細胞の抗腫瘍効果を増強し、且つ兄弟殺しを減少させるために除去される。いくつかの実施形態では、CD33ゲノム領域を標的化するgRNAは、CD33 mRNA及び/又はCD33タンパク質の発現を破壊するCD33遺伝子中、その周囲、又はその近傍にインデルをもたらす。
CD33遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のCD33 gRNA配列の非限定的な例は、表10において列挙される、例えば、CD33-1 gRNA;
Figure 2022512882000003
。いくつかの例において、CD33-2又はCD33-10ガイドRNAを使用して、CD33遺伝子におけるゲノム破壊をもたらしてもよい。いくつかの例において、CD33遺伝子を破壊するために使用されるガイドRNAは、表10において列挙されるスペーサー配列を含む。他のgRNA配列は、19番染色体上に位置するCD33遺伝子配列を使用して設計され得る(GRCh38の座標:19番染色体:51,225,064-51,243,860;Ensembl:ENSG00000105383.14)。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたCD33遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞の集団のうちの少なくとも20%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD33表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD33表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの20%~75%、20~50%、30~50%、30%~75%、50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、50%~60%、60%~100%、60%~90%、60%~80%、60%~70%、70%~100%、70%~90%、70%~80%、80%~100%、80%~90%、又は90%~100%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD33表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ)を含有するリボ核タンパク質粒子(RNP)及びCD33遺伝子(又は任意の他の目的の遺伝子)を標的化するgRNAが、T細胞(例えば、一次T細胞)に送達される。他の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びgRNAは、T細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子(RNP)は単に、gRNAと予め複合体を形成した/複合体を形成したRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、変異された断片を含んでもよく、例えば、編集されたCD33遺伝子は、表13~22において提供される変異された断片(列「遺伝子編集された配列」)、例えば、表14及び/又は表22において提供されるもののうちの1つ以上を含む。例えば、CD33遺伝子は、野生型対応物に対して欠失を有する変異された断片を含んでもよく、例えば、編集されたCD33遺伝子は、GGATCCAAA-TTCTGGCTGC(配列番号175)(単一のヌクレオチド欠失は、ダッシュ(-)によって表される)として記載されるヌクレオチド配列を含んでもよい。別の例において、編集されたCD33遺伝子は、野生型対応物に対して挿入を有する変異された断片、例えば、GGATCCAAATTTTCTGGCTGC(配列番号176)(挿入は太字で示される)を含んでもよい。さらに別の例において、CD33遺伝子は、野生型対応物に対して欠失及び挿入、例えば、野生型対応物配列の配列番号174に対して配列番号175に示される欠失及び配列番号176に示される挿入の両方を有する変異された断片を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、野生型(又は未編集)遺伝子から欠失される断片に関して記載され得る。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、GGATCCAAATTTCTGGCTGC(配列番号174)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、AGTTCATGGTTACTGGTTCC(配列番号186)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、ACTCCCCAGTTCATGGTTAC(配列番号196)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、AGCCATTATATCCAGGGACT(配列番号207)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、TCAGTGACGGTACAGGAGGG(配列番号220)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT(配列番号243)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG(配列番号263)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、ACTACTCACTCCTCGGTGCT(配列番号268)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、CCCGATCTTCTCCTGGTTGT(配列番号285)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
例えば、編集されたCD33遺伝子は、AAATCCTCATCCCTGGCACT(配列番号299)、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含み得るその部分を含む断片を欠いてもよい。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)GGATCCAAATTCTGGCTGC(配列番号175)、GGATCCAAATTTTCTGGCTGC(配列番号176)、GGATCCTGGCTGC(配列番号177)、GGATCCAATTCTGGCTGC(配列番号178)、TCCTGGCTGC(配列番号179)、GGATCTGGCTGC(配列番号180)、GGATCC、及び/又はGGATCCATTCTGGCTGC(配列番号181)のヌクレオチド配列を含む;
(b)GGATCCAAATTTCTGGCTGC(配列番号174)を含む断片を欠く;並びに
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、GGATCCAAATTTC(配列番号182)、GGATCCAAATT(配列番号183)、又はGGATCCAAATTT(配列番号185)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号164(例えば、配列番号142のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)AGTTCATGGTACTGGTTCC(配列番号187)、AGTTCATGGTTCC(配列番号188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(配列番号189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(配列番号190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(配列番号191)、AGTTCATACTGGTTCC(配列番号192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(配列番号193)、及び/又はAGTTACTGGTTCC(配列番号194)のヌクレオチド配列を含む;並びに
(b)AGTTCATGGTTACTGGTTCC(配列番号186)を含む断片を欠く。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号165(例えば、配列番号143のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)ACTCCCCAGTTTCATGGTTAC(配列番号197)、ACTCCCCAGTCATGGTTAC(配列番号198)、ACTCCCCATGGTTAC(配列番号199)、ACTCCCCAGTTAC(配列番号200)、ACTCATGGTTAC(配列番号201)、ACTCCCCATCATGGTTAC(配列番号202)、ACTCCCCATTCATGGTTAC(配列番号203)、ACTCCCCAGTGTCATGGTTAC(配列番号204)、及び/又はACTCCCCAGTCTCATGGTTAC(配列番号205)のヌクレオチド配列を含む;
(b)ACTCCCCAGTTCATGGTTAC(配列番号196)を含む断片を欠く;並びに
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、ACTCCCCAGTTCATGGTT(配列番号206)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号166(例えば、配列番号144のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)AGCCATTATCCAGGGACT(配列番号208)、AGCCAGGGACT(配列番号209)、AGCCATTATTCCAGGGACT(配列番号210)、AGTCCAGGGACT(配列番号211)、AGCCATTATAATCCAGGGACT(配列番号212)、AGCCATTATCCGGGGACT(配列番号213)、AGCCATTATACAGGGACT(配列番号214)、AGCCATTATTCCGGGGACT(配列番号216)、及び/又はAGCCATTATAATCCGGGGACT(配列番号217)のヌクレオチド配列を含む;
(b)AGCCATTATATCCAGGGACT(配列番号207)を含む断片を欠く;並びに
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、AGCCATTATATCCA(配列番号218)又はAGCCATTATA(配列番号219)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号167(例えば、配列番号145のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)TCAGTGACAGGAGGG(配列番号221)、TCAGTGACGTACAGGAGGG(配列番号222)、TCAGGAGGG(配列番号223)、TCAGTGACGGAGGG(配列番号224)、TCAGTGACGGGAGGG(配列番号226)、TCAGTGACGGTTACAGGAGGG(配列番号227)、TCAGTGACGGACAGGAGGG(配列番号228)、TCAGTGACGGGTACAGGAGGG(配列番号229)、TCAGTACAGGAGGG(配列番号230)、TCAGTGACTACAGGAGGG(配列番号231)、TCAGTGACGGG(配列番号232)、TCAGTGACGG(配列番号233)、TCAGTGACGGCAGGAGGG(配列番号234)、TCAGTGACGGAGGAGGG(配列番号235)、TCAGTGATACAGGAGGG(配列番号236)、TCAGTGTACAGGAGGG(配列番号237)、及び/又はTCATACAGGAGGG(配列番号238)のヌクレオチド配列を含む;
(b)TCAGTGACGGTACAGGAGGG(配列番号220)を含む断片を欠く;
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、TCAGTGACGGTA(配列番号239)又はTCAGTGACGのヌクレオチド配列を含む;並びに
(d)断片を欠き、その5’セグメントは、GTGACGGTACAGGAGGG(配列番号242)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号168(例えば、配列番号146のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)AGCTGGAGCT(配列番号244)、AGGTGAAGCTGGAGCT(配列番号245)、AGGTGAAGCT(配列番号246)、AGGTGAAGTTGGAGCT(配列番号247)、AGGTGAAGTCGCTGGAGCT(配列番号248)、AGGTGGAGCT(配列番号249)、AGGTGAAGCGCTGGAGCT(配列番号250)、AGGTGACGCTGGAGCT(配列番号252)、及び/又はAGGTGAAGTTTCGCTGGAGCT(配列番号253)のヌクレオチド配列を含む;
(b)AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT(配列番号243)を含む断片を欠く;
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、AGGTGAAGTTCG(配列番号256)、AGGTGAAGTTCGCTGGAG(配列番号259)、AGGTGAAGTTCGCTGG(配列番号260)、又はAGGTGAAGTT(配列番号261)のヌクレオチド配列を含む;並びに
(d)断片を欠き、その5’セグメントは、GGTGAAGTTCGCTGGAGCT(配列番号262)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号169(例えば、配列番号147のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)AGTTCGCTGGTGTG(配列番号264)及び/又はAGTTCGCTGAGCTGGTGTG(配列番号266)のヌクレオチド配列を含む;
(b)AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG(配列番号263)を含む断片を欠く;並びに
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、AGTTCGCTGG(配列番号267)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号170(例えば、配列番号148のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)ACTACTCACTTCCTCGGTGCT(配列番号269)、ACTACTCGGTGCT(配列番号270)、ACTACTCATCCTCGGTGCT(配列番号271)、ACTACT、ACTACTCACCCTCGGTGCT(配列番号272)、ACTACTCCTCGGTGCT(配列番号273)、ACTACTCACCTCGGTGCT(配列番号275)、ACTACTCACTCGGTGCT(配列番号276)、ACTACTCTCCTCGGTGCT(配列番号277)、ACTACTTCCTCGGTGCT(配列番号278)、ACTACTCACTTCGGTGCT(配列番号279)、及び/又はACTATCCTCGGTGCT(配列番号280)のヌクレオチド配列を含む;
(b)ACTACTCACTCCTCGGTGCT(配列番号268)を含む断片を欠く;並びに
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、ACTACTCACT(配列番号282)、ACTACTCACTCCTC(配列番号283)、又はACTACTCACTCCTCGGT(配列番号284)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号171(例えば、配列番号149のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)CCCGATCTTCCTGGTTGT(配列番号286)、CCCGATCCTGGTTGT(配列番号287)、CCCGATCTGGTTGT(配列番号288)、CCCTGGTTGT(配列番号289)、CCCGATCTTCTGGTTGT(配列番号290)、CCCGATCTTGGTTGT(配列番号291)、CCCGATCTCCTGGTTGT(配列番号292)、CCCGATCTTCCCTGGTTGT(配列番号293)、及び/又はCCCGATのヌクレオチド配列を含む;
(b)CCCGATCTTCTCCTGGTTGT(配列番号285)を含む断片を欠く;
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、CCCGATCTTCT(配列番号295)のヌクレオチド配列を含む;並びに
(d)断片を欠き、その5’セグメントは、TCCTGGTTGT(配列番号298)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号172(例えば、配列番号150のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
いくつかの実施形態では、編集されたCD33遺伝子は、以下の特徴のうちの1つ以上を有し得る:
(a)AAATCCTGGCACT(配列番号300)、AAATCCCTGGCACT(配列番号301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(配列番号304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(配列番号305)、AAATCCTCCCTGGCACT(配列番号306)、AAATCCCCTGGCACT(配列番号307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号308)、ACATCCTGGCACT(配列番号309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(配列番号310)、AAATCCTCATCTGGCACT(配列番号311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(配列番号312)、AAATCCTCTGGCACT(配列番号313)、AAATCCCCCTGGCACT(配列番号314)、AAATCCTCACT(配列番号315)、ACATCCCTGGCACT(配列番号316)、及び/又はAAATのヌクレオチド配列を含む;
(b)AAATCCTCATCCCTGGCACT(配列番号299)を含む断片を欠く;
(c)断片を欠き、その3’セグメントは、AAATCCTCAT(配列番号317)、AAATCCTCATCCCT(配列番号318)、AAATCCTCATCCCTGG(配列番号320)、AAATCCTCATC(配列番号322)、又はAAATCCTCATCCCTGGCA(配列番号324)のヌクレオチド配列を含む;並びに
(d)断片を欠き、その5’セグメントは、CTCATCCCTGGCACT(配列番号323)のヌクレオチド配列を含む。
そのような編集されたCD33遺伝子は、配列番号173(例えば、配列番号151のgRNA)のスペーサー配列を含むガイドRNAを使用して作製され得る。
PD-1遺伝子編集
PD-1は、活性化T細胞において下方制御される免疫チェックポイント分子であり、T細胞の応答を弱めるか又は止める働きをする。遺伝子編集によってPD-1を破壊すれば、より多くの持続的且つ/又は強力な治療的T細胞応答をもたらし、且つ/又は対象における免疫抑制を低減できるであろう。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたPD-1遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のPD-1遺伝子の発現は、本開示のCAR T細胞の抗腫瘍効果を増強するめに除去される。
PD-1遺伝子においてゲノム欠失をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のPD-1 gRNA配列の非限定的な例は、表4において列挙される(例えば、配列番号22及び23)。また、参照により本明細書に組み込まれる、2018年5月11日に出願された国際出願番号PCT/US2018/032334号明細書も参照されたい。他のgRNA配列は、2番染色体上に位置するPD-1遺伝子配列を使用して設計され得る(GRCh38の座標:2番染色体:241,849,881~241,858,908;Ensembl:ENSG00000188389)。
いくつかの実施形態では、PD-1ゲノム領域を標的化するgRNAは、PD-1 mRNA又はタンパク質の発現を破壊するPD-1遺伝子におけるインデルをもたらす。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたPD-1遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞の集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのPD-1表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのPD-1表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、50%~60%、60%~100%、60%~90%、60%~80%、60%~70%、70%~100%、70%~90%、70%~80%、80%~100%、80%~90%、又は90%~100%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのPD-1表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ)を含有するリボ核タンパク質粒子(RNP)及びPD-1遺伝子(又は任意の他の目的の遺伝子)を標的化するgRNAが、T細胞(例えば、一次T細胞)に送達される。他の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びgRNAは、T細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子(RNP)は単に、gRNAと予め複合体を形成した/複合体を形成したRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。
CD70遺伝子編集
表面抗原分類70(CD70)は、腫瘍壊死因子スーパーファミリーのメンバーであり、且つその発現は、活性化T及びBリンパ球及び成熟樹状細胞に限定される。CD70はまた、血液腫瘍及び癌腫上で検出されてきた。CD70は、そのリガンドであるCD27との相互作用を通して、腫瘍細胞及び制御性T細胞の生存に関係づけられる。遺伝子編集によってCD70を破壊することによって、細胞増殖を増加させ、且つ細胞枯渇を減少させる。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたCD70遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、内在性のCD70遺伝子の発現は、本開示のCAR T細胞の抗腫瘍効果を増強するために除去される。いくつかの実施形態では、CD70ゲノム領域を標的化するgRNAは、CD70 mRNA及び/又はタンパク質の発現を破壊するCD70遺伝子中、又はその周囲にインデルをもたらす。
CD70遺伝子においてゲノム破壊をもたらす本明細書で提供されるとおりに使用され得る改変及び未改変のCD70 gRNA配列の非限定的な例は、表4において列挙される(例えば、配列番号24~27)。また、参照により本明細書に組み込まれる、2019年5月10日に出願された国際出願番号PCT/IB2019/000500号も参照されたい。他のgRNA配列は、19番染色体上に位置するCD70遺伝子配列を使用して設計され得る(GRCh38の座標:19番染色体:6,583,183-6,604,103;Ensembl:ENSG00000125726)。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、破壊されたCD70遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞の集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD70表面タンパク質を発現しない。例えば、集団のうちの少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、又は少なくとも95%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD70表面タンパク質を発現しない場合がある。いくつかの実施形態では、集団のうちの50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、50%~60%、60%~100%、60%~90%、60%~80%、60%~70%、70%~100%、70%~90%、70%~80%、80%~100%、80%~90%、又は90%~100%の操作されたT細胞は、検出可能なレベルのCD70表面タンパク質を発現しない。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9ヌクレアーゼなどのCasヌクレアーゼ)を含有するリボ核タンパク質粒子(RNP)及びCD70遺伝子(又は任意の他の目的の遺伝子)を標的化するgRNAが、T細胞(例えば、一次T細胞)に送達される。他の実施形態では、RNA誘導型ヌクレアーゼ及びgRNAは、T細胞に別々に送達される。リボ核タンパク質粒子(RNP)は単に、gRNAと予め複合体を形成した/複合体を形成したRNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)である。
細胞表現型
いくつかの実施形態では、細胞の集団内の1つ以上の遺伝子編集は、細胞の増殖能、細胞の枯渇、細胞の生存能、細胞溶解能(例えば、サイトカイン産生及び/又は放出を増加させる)、又はこれらの任意の組合せにおける変化と関連する表現型をもたらす。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、対照T細胞と比較して、少なくとも20%高い細胞増殖能を示す。例えば、操作されたT細胞は、対照T細胞と比較して、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、又は少なくとも90%高い細胞増殖能を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、対照T細胞と比較して、20%~100%、20%~90%、20%~80%、20%~70%、20%~60%、20%~50%、30%~100%、30%~90%、30%~80%、30%~70%、30%~60%、30%~50%、40%~100%、40%~90%、40%~80%、40%~70%、40%~60%、40%~50%、50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、又は50%~60%高い細胞増殖能を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも20%の増大を示す。例えば、本開示の操作されたT細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、又は少なくとも90%の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、対照細胞と比較して、細胞生存能において20%~100%、20%~90%、20%~80%、20%~70%、20%~60%、20%~50%、30%~100%、30%~90%、30%~80%、30%~70%、30%~60%、30%~50%、40%~100%、40%~90%、40%~80%、40%~70%、40%~60%、40%~50%、50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、又は50%~60%の増大を示す。
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも20%の増大(少なくとも20%多く標的細胞を死滅させる)を示す。例えば、本開示の操作されたT細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、又は少なくとも90%の増大を示し得る。いくつかの実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、対照細胞と比較して、細胞溶解能において20%~100%、20%~90%、20%~80%、20%~70%、20%~60%、20%~50%、30%~100%、30%~90%、30%~80%、30%~70%、30%~60%、30%~50%、40%~100%、40%~90%、40%~80%、40%~70%、40%~60%、40%~50%、50%~100%、50%~90%、50%~80%、50%~70%、又は50%~60%の増大を示す。例えば、操作されたT細胞によって分泌されるサイトカイン(例えば、IL-2及び/又はIFN-ガンマ)のレベルは、対照T細胞によって分泌されるサイトカインのレベルより少なくとも2倍(例えば、少なくとも3倍、少なくとも4倍、又は少なくとも5倍)高くあり得る。
対照T細胞は、いくつかの実施形態において、操作されたT細胞(例えば、遺伝子編集されたT細胞)である。いくつかの実施形態では、対照T細胞は、破壊されたTRAC遺伝子、TRAC遺伝子に挿入されたCAR(例えば、抗CD33 CAR)をコードする核酸、及び/又は破壊されたβ2M遺伝子を含む操作されたT細胞である。いくつかの実施形態では、対照T細胞は、未編集のT細胞である。
遺伝子編集方法
遺伝子編集(ゲノム編集を含む)は、ヌクレオチド/核酸が、標的化された細胞のゲノム中などのDNA配列中に挿入され、欠失され、且つ/又は置換される一種の遺伝子操作である。標的化された遺伝子編集により、標的化された細胞のゲノム中(例えば、標的化された遺伝子又は標的化されたDNA配列中)の予め選択された部位での挿入、欠失、及び/又は置換が可能になる。内在性の遺伝子の配列が、例えば、ヌクレオチド/核酸の欠失、挿入又は置換によって編集されるとき、影響を受けた配列を含む内在性の遺伝子は、配列改変のためにノックアウト又はノックダウンされ得る。したがって、標的化された編集は、内在性の遺伝子発現を破壊するために使用され得る。「標的化された組込み」は、挿入部位での内在性の配列の欠失の有無にかかわらず、1つ以上の外来性の配列の挿入を含むプロセスを指す。標的化された組込みは、外来性の配列を含有するドナー鋳型が存在する場合、標的化された遺伝子編集から生じ得る。
標的化された編集は、ヌクレアーゼ非依存的な手法、又はヌクレアーゼ依存的な手法のいずれかを介して達成され得る。ヌクレアーゼ非依存的な標的化された編集手法において、相同組換えは、宿主細胞の酵素機構を介して内在性の配列に導入されることになる外来性のポリヌクレオチドに隣接する相同配列によって誘導される。外来性のポリヌクレオチドは、内在性の配列中においてヌクレオチドの欠失、挿入又は置換を導入し得る。
或いは、ヌクレアーゼ依存的な手法は、特異的なレアカッティングヌクレアーゼ(例えば、エンドヌクレアーゼ)による二重鎖切断(DSB)の特異的な導入を介して比較的高い頻度を有して標的化された編集を達成できる。このようなヌクレアーゼ依存的な標的化された編集はまた、DNA修復機構、例えば、DSBに応答して生じる非相同末端連結(NHEJ)を利用する。NHEJによるDNA修復は、少数の内在性のヌクレオチドのランダムな挿入又は欠失(インデル)を引き起こす場合が多い。NHEJに媒介される修復とは反対に、修復はまた、相同組換え修復(HDR)によって生じる場合がある。一対の相同性アームに隣接する外来性の遺伝子材料を含有するドナー鋳型が存在するとき、外来性の遺伝子材料は、外来性の遺伝子材料の標的化された組込みをもたらすHDRによってゲノムに導入され得る。
特異的且つ標的化されたDSBを導入できる利用可能なエンドヌクレアーゼとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、及びRNA誘導型CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ(CRISPR/Cas9;クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連9)が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、phiC31及びBxb1インテグラーゼを利用するDICE(二重インテグラーゼカセット交換)システムも、標的化された組込みのために使用され得る。
ZFNは、1つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的な様式でDNAに結合するポリペプチドドメインであるジンクフィンガーDNA結合ドメイン(ZFBD)に融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。ジンクフィンガーは、構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化されるジンクフィンガー結合ドメイン内の約30アミノ酸のドメインである。ジンクフィンガーの例としては、C2H2ジンクフィンガー、C3Hジンクフィンガー、及びC4ジンクフィンガーが挙げられるが、これらに限定されない。設計されたジンクフィンガードメインは、設計/組成物が主に、合理的な基準、例えば、既存のZFP設計及び結合データの情報を保管するデータベース中の情報を処理するための置換規則及びコンピューター処理されたアルゴリズムの適用からもたらされる、天然には存在しないドメインである。例えば、米国特許第6,140,081号明細書;同第6,453,242号明細書;及び同第6,534,261号明細書を参照されたい;国際公開第98/53058号パンフレット;国際公開第98/53059号パンフレット;国際公開第98/53060号パンフレット;国際公開第02/016536号パンフレット及び国際公開第03/016496号パンフレットも参照されたい。選択されたジンクフィンガードメインは、生成が主に、ファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などの実験的なプロセスからもたらされる、天然には存在しないドメインである。ZFNは、米国特許第7,888,121号明細書及び米国特許第7,972,854号明細書においてより詳細に記載される。ZFNの最も認知されている例は、FokIヌクレアーゼとジンクフィンガーDNA結合ドメインの融合物である。
TALENは、TALエフェクターDNA結合ドメインに融合されたヌクレアーゼを含む標的化ヌクレアーゼである。「転写活性化因子様エフェクターDNA結合ドメイン」、「TALエフェクターDNA結合ドメイン」、又は「TALE DNA結合ドメイン」は、TALエフェクタータンパク質のDNAへの結合に関与するTALエフェクタータンパク質のポリペプチドドメインである。TALエフェクタータンパク質は、キサントモナス(Xanthomonas)属の植物病原体によって感染中に分泌される。これらのタンパク質は、植物細胞の核に入り、それらのDNA結合ドメインを介してエフェクター特異的なDNA配列に結合し、且つそれらの転写活性化ドメインを介してこれらの配列で遺伝子転写を活性化する。TALエフェクターDNA結合ドメインの特異性は、2アミノ酸残基からなる可変領域(RVD)と呼ばれる選択された反復位置で多型を含むエフェクターにより可変の数の不完全な34アミノ酸反復に依存する。TALENは、米国特許出願公開第2011/0145940号明細書においてより詳細に記載される。当該技術分野におけるTALENの最も認知された例は、TALエフェクターDNA結合ドメインに対するFokIヌクレアーゼの融合ポリペプチドである。
本明細書に提供されるとおりの使用に好適な標的化ヌクレアーゼのさらなる例としては、個別に使用されようと、組み合わせて使用されようと、Bxb1、phiC31、R4、PhiBT1、及びWβ/SPBc/TP901-1が挙げられるが、これらに限定されない。
標的化ヌクレアーゼの他の非限定的な例としては、天然に存在するヌクレアーゼ及び組換えヌクレアーゼ、例えば、CRISPR/Cas9、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼホーミングエンドヌクレアーゼなどが挙げられる。
CRISPR-Cas9遺伝子編集
CRISPR-Cas9システムは、遺伝子編集のために使用されるRNA誘導型DNA標的化プラットフォームとして転用されてきた原核生物において天然に存在する防御機構である。それは、DNAの切断を標的化するDNAヌクレアーゼCas9、並びに2つの非コードRNAであるcrisprRNA(crRNA)及びトランス活性化RNA(tracrRNA)に依拠する。
crRNAは、通常標的DNA中の20ヌクレオチド(nt)配列とワトソン-クリック塩基対を介してCRISPR-Cas9複合体の配列認識及び特異性を促進する。crRNA中の5’ 20ntの配列の変化は、特定の座位へのCRISPR-Cas9複合体の標的化を可能にする。CRISPR-Cas9複合体は単に、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれる特定の短いDNAモチーフ(配列NGGを有する)に続いている場合、crRNA、シングルガイドRNA(sgRNA)の最初の20ntに一致する配列を含有するDNA配列に結合する。
TracrRNAは、crRNAの3’末端とハイブリダイズしてRNA二重鎖構造を形成し、Cas9エンドヌクレアーゼによって結合されて触媒活性のあるCRISPR-Cas9複合体を形成し、続いてこれにより標的DNAを切断できる。
CRISPR-Cas9複合体が標的部位でDNAに結合すると、Cas9酵素内の2つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれPAM部位の上流のDNA鎖の一方を切断し、DNAの両鎖が塩基対(平滑末端)で終結する二本鎖切断(DSB)を残す。
CRISPR-Cas9複合体が特定の標的部位でDNAに結合し、部位特異的なDSBが形成された後、次の鍵となるステップはDSBの修復である。細胞は、DSBを修復するために2つの主要なDNA修復経路を使用する:非相同末端連結(NHEJ)及び相同組換え修復(HDR)。
NHEJは、非分裂細胞を含む大多数の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。NHEJは誤りがちであり、多くの場合、DSBの部位にて1~数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす場合があるが、そのような改変は通常<20ntである。得られた挿入及び欠失(インデル)は、遺伝子のコード又は非コード領域を破壊する場合がある。代わりに、HDRは、内在的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーDNAを使用して、高い忠実度を有してDSBを修復する。HDRは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、NHEJが、修復オペラントとして利用される。
いくつかの実施形態では、Cas9(CRISPR関連タンパク質9)エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)に由来するが、他のCas9ホモログが使用されてもよい。本明細書に提供されるとおり、野生型Cas9が使用されてもよいし、Cas9の改変されたバージョンが使用されてもよい(例えば、Cas9の発展させたバージョン、又はCas9オルソログ若しくは変異体)ことが理解されるはずである。いくつかの実施形態では、Cas9は、Cpf1(クラスII CRISPR/Casシステム)などの別のRNA誘導型エンドヌクレアーゼと置き換えられてもよい。
ガイドRNA
本開示は、会合したポリペプチド(例えば、部位特異的ポリペプチド)の標的核酸内の特定の標的配列に対する活性を誘導できるゲノム標的化核酸を提供する。ゲノム標的化核酸は、RNAであり得る。ゲノム標的化RNAは、本明細書で「ガイドRNA」又は「gRNA」と呼ばれる。ガイドRNAは、目的の標的核酸配列、及びCRISPR反復配列にハイブリダイズする少なくとも1つのスペーサー配列を含む。II型システムにおいて、gRNAはまた、tracrRNA配列と呼ばれる第2のRNAを含む。II型ガイドRNA(gRNA)において、CRISPR反復配列及びtracrRNA配列は、互いにハイブリダイズして、二重鎖を形成する。V型ガイドRNA(gRNA)において、crRNAが、二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は、部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドRNA及び部位特異的ポリペプチドは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、その部位特異的ポリペプチドとの会合により、複合体に標的特異性をもたらす。したがって、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
当業者によって理解されるとおり、各ガイドRNAは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計される。Jinek et al.,Science,337,816-821(2012)及びDeltcheva et al.,Nature,471,602-607(2011)を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、二重分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、単一分子ガイドRNAである。
二重分子ガイドRNAは、RNAの二本鎖を含む。第1の鎖は、5’から3’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小CRISPR反復配列を含む。第2の鎖は、最小tracrRNA配列(最小CRISPR反復配列に相補的)、3’tracrRNA配列及び任意選択のtracrRNA延長配列を含む。
II型システムにおける単一分子ガイドRNA(sgRNA)は、5’から3’方向において、任意選択のスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小CRISPR反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小tracrRNA配列、3’tracrRNA配列及び任意選択のtracrRNA延長配列を含む。任意選択のtracrRNA延長は、ガイドRNAに対する追加の機能性(例えば、安定性)に寄与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小CRISPR反復及び最小tracrRNA配列を連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択のtracrRNA延長は、1つ以上のヘアピンを含む。
V型システムにおける単一分子ガイドRNA(「sgRNA」又は「gRNA」と呼ばれる)は、5’から3’方向において、最小CRISPR反復配列及びスペーサー配列を含む。
sgRNAは、sgRNA配列の5’末端で20ヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の5’末端で20ヌクレオチド未満のスペーサー配列を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の5’末端で20ヌクレオチドより長いスペーサー配列を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の5’末端で17~30ヌクレオチドを有する可変長スペーサー配列を含み得る(表3を参照のこと)。
sgRNAは、sgRNA配列の3’末端にウラシルを含まない場合がある。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に1つ以上のウラシルを含み得る。例えば、sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に1個のウラシル(U)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に2個のウラシル(UU)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に3個のウラシル(UUU)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に4個のウラシル(UUUU)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に5個のウラシル(UUUUU)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に6個のウラシル(UUUUUU)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に7個のウラシル(UUUUUUU)を含み得る。sgRNAは、sgRNA配列の3’末端に8個のウラシル(UUUUUUUU)を含み得る。
sgRNAは、改変されない場合もあるし、改変される場合もある。例えば、改変されたsgRNAは、1つ以上の2’-O-メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。
Figure 2022512882000004
実例として、CRISPR/Cas/Cpf1システムにおいて使用されるガイドRNA、又は他のより小さいRNAは、下に説明され且つ当該技術分野において記載されるとおり、化学的手段によって容易に合成され得る。化学合成法が拡大し続けている一方で、ポリヌクレオチドの長さが百数十ヌクレオチドを超えて大幅に長くなると、高速液体クロマトグラフィー(HPLC、PAGEなどのゲルの使用を回避する)などの方法によるそのようなRNAの精製は、より難しくなる傾向がある。比較的長いRNAを生成するために使用される1つの手法は、ともに連結される2つ以上の分子を生成することである。Cas9又はCpf1エンドヌクレアーゼをコードするものなどのはるかに長いRNAは、より容易に酵素的に生成される。当該技術分野において記載されるとおり、様々な種類のRNA修飾、例えば、安定性を増強し、自然免疫応答の可能性若しくは程度を低減し、且つ/又は他の特質を増強する修飾が、RNAの化学合成及び/若しくは酵素的生成の間又は後に導入され得る。
スペーサー配列
gRNAは、スペーサー配列を含む。スペーサー配列は、目的の標的核酸の標的配列(例えば、ゲノム標的配列などのDNA標的配列)を定義する配列(例えば、20個のヌクレオチド配列)である。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、15~30個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、20個のヌクレオチドである。
「標的配列」は、PAM配列に隣接し、RNA誘導型ヌクレアーゼ(例えば、Cas9)によって改変される配列である。「標的核酸」は、二重鎖分子である:一方の鎖は、標的配列を含み、「PAM鎖」と呼ばれ、また他方の相補鎖は、「非PAM鎖」と呼ばれる。当業者は、gRNAスペーサー配列が、目的の標的核酸の非PAM鎖において位置する標的配列の逆相補鎖にハイブリダイズすることを認識している。したがって、gRNAスペーサー配列は、標的配列のRNA等価物である。例えば、標的配列が、5’-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3’(配列番号325)である場合、gRNAスペーサー配列は、5’-AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3’(配列番号19)である。gRNAのスペーサーは、ハイブリダイゼーション(すなわち、塩基対形成)を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。したがって、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に依存して変化する。
本明細書のCRISPR/Casシステムにおいて、スペーサー配列は、システムにおいて使用されるCas9酵素のPAMの5’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計される。スペーサーは、標的配列と完全に一致してもよいし、ミスマッチを有してもよい。各Cas9酵素は、それが標的DNA中で認識する特定のPAM配列を有する。例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)は、標的核酸において配列5’-NRG-3’(ここで、Rは、A又はGのいずれかを含み、Nは、任意のヌクレオチドであり、Nは、スペーサー配列によって標的化される標的核酸配列の3’のすぐ近くにある)を含むPAMを認識する。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、20個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、20個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、20個より多いヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも:5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で:5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、PAMの最初のヌクレオチドの5’のすぐ近くに20個の塩基を含む。例えば、
Figure 2022512882000005
を含む配列において、標的核酸は、N(複数)(ここで、Nは、任意のヌクレオチドであり、下線のNRG配列は、S.ピオゲネス(S.pyogenes)PAMである)に対応する配列を含む。
本明細書に提供されるとおりに使用され得るgRNAの非限定的な例は、表4、表10及び2018年5月11日に出願されたPCT/US2018/032334号において提供される。
Figure 2022512882000006
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞
キメラ抗原受容体は、腫瘍細胞によって発現される抗原を認識し、それに結合するように操作された人工の免疫細胞受容体を指す。一般に、CARは、T細胞のために設計され、T細胞受容体(TCR)複合体のシグナル伝達ドメイン及び抗原認識ドメイン(例えば、抗体の一本鎖断片(scFv)又は他の抗体断片)のキメラである(Enblad et al.,Human Gene Therapy.2015;26(8):498-505)。CARを発現するT細胞は、CAR T細胞と呼ばれる。CARは、MHCに制限されない様式で選択された標的に対するT細胞の特異性及び反応性を再指示する能力を有する。MHCに制限されない抗原認識は、CARを発現するT細胞に抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。さらに、T細胞において発現されるとき、CARは、内在性のT細胞受容体(TCR)アルファ及びベータ鎖と有利に二量体化しない。
4つの世代のCARが存在し、その各々は異なる構成要素を含有する。第一世代のCARは、抗体に由来するscFvをヒンジ及び膜貫通ドメインを介してT細胞受容体のCD3ゼータ(ζ又はz)細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のCARは、追加のドメイン、例えば、CD28、4-1BB(41BB)、又はICOSを組み込んで、共刺激シグナルを供給する。第三世代のCARは、TCR CD3ζ鎖に融合した2つの共刺激ドメインを含有する。第三世代の共刺激ドメインは、例えば、CD3ζ、CD27、CD28、4-1BB、ICOS、又はOX40の組合せを含み得る。CARは、いくつかの実施形態において、一本鎖可変断片(scFv)に一般に由来する外部ドメイン(例えば、CD3ζ)、ヒンジ、膜貫通ドメイン、並びにCD3Z及び/若しくは共刺激分子に由来する1つ(第一世代)、2つ(第二世代)、又は3つ(第三世代)のシグナル伝達ドメインを有する内部ドメインを含有する(Maude et al.,Blood.2015;125(26):4017-4023;Kakarla and Gottschalk,Cancer J.2014;20(2):151-155)。
CARは通常、それらの機能特性が異なる。T細胞受容体のCD3ζシグナル伝達ドメインは、結合される場合、T細胞の増殖を活性化し、且つ誘導することになるが、アネルギーを引き起こし得る(身体の防御機構による反応の欠如、末梢リンパ球寛容の直接的な誘導をもたらす)。リンパ球は、それらが特定の抗原に応答できない場合、アネルギー性であるとみなされる。第二世代のCARにおける共刺激ドメインの付加は、改変T細胞の複製能及び持続を向上させた。同様の抗腫瘍効果は、CD28又は4-1BB CARによりインビトロで観察されるが、前臨床インビボ研究は、4-1BB CARが、優れた増殖及び/又は持続をもたらし得ることを示唆する。臨床試験は、これらの第二世代のCARの両方が、インビボで実質的なT細胞増殖を誘導できることを示唆するが、4-1BB共刺激ドメインを含有するCARは、より長く持続するように見える。第三世代のCARは、効力を増強する複数のシグナル伝達ドメイン(共刺激)を組み合わせる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、第一世代のCARである。他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第二世代のCARである。さらに他の実施形態では、キメラ抗原受容体は、第三世代のCARである。
CARは、いくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン(例えば、scFvなどの抗体)、膜貫通ドメイン、及び細胞質(内)ドメインを含む細胞外(外部)ドメインを含む。
外部ドメイン
外部ドメインは、細胞外の体液に曝されるCARの領域であり、且ついくつかの実施形態において、抗原結合ドメイン、並びに任意選択によりシグナルペプチド、スペーサードメイン、及び/又はヒンジドメインを含む。いくつかの場合において、抗原結合ドメインは、抗体の断片である。下の議論を参照されたい。
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンのVL及びVHを含む一本鎖可変断片(scFv)である。リンカーは、いくつかの実施形態において、可動性のための一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を加えるための一続きのグルタミン酸及びリジンとともに親水性残基を含む。一本鎖可変断片(scFv)は、実際には抗体の断片ではないが、代わりに10~約25個のアミノ酸の短いリンカーペプチドと連結した免疫グロブリンの重(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、可動性のためにグリシン、及び溶解性のためにセリン又はスレオニンを豊富に含み、VHのN末端をVLのC末端に連結するか又はその逆のいずれかであり得る。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。抗CD33 scFvを作製するために使用され得るVH及びVLタンパク質配列の非限定的な例としては、配列番号65、77又は89(VH)及び配列番号66、78又は90(VL)のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のscFvは、ヒト化されている。他の実施形態では、scFvは、完全ヒトである。さらに他の実施形態では、scFvは、(例えば、マウス及びヒト配列の)キメラである。いくつかの実施形態では、scFvは、抗CD33 scFvである(CD33に特異的に結合する)。本明細書に提供されるとおりに使用され得る抗CD33 scFvタンパク質の非限定的な例は、配列番号54、68、75、82いずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。他のscFvタンパク質が使用されてもよい。
シグナルペプチドは、CAR結合の抗原特異性を増強し得る。シグナルペプチドは、CD8などであるがこれに限定されない抗体、及びGST又はFLAGなどであるがこれらに限定されないエピトープタグに由来し得る。シグナルペプチドの例としては、MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(配列番号162)及びMALPVTALLLPLALLLHAARP(配列番号121)が挙げられる。他のシグナルペプチドが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、CARの細胞外ドメイン(抗原結合ドメインを含む)と膜貫通ドメインの間、又はCARの細胞質内ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する。スペーサードメインは、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン及び/又は細胞質内ドメインに連結するのに機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。ヒンジドメインは、CAR、若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はCAR、若しくはそのドメインの立体障害を妨げるのに機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、スペーサードメイン又はヒンジドメインは、最大で300個のアミノ酸(例えば、10~100個のアミノ酸、又は5~20個のアミノ酸)を含み得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のドメインが、CARの他の領域に含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、CD8ヒンジドメインである。他のヒンジドメインが使用されてもよい。
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜をまたがる疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインは、CARの安定性をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるとおりのCARの膜貫通ドメインは、CD8膜貫通ドメインである。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインである。さらに他の実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8及びCD28膜貫通ドメインのキメラである。他の膜貫通ドメインが、使用されてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8a膜貫通ドメインである:
Figure 2022512882000007
他の膜貫通ドメインが使用されてもよい。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、アミノ酸配列:IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(配列番号163)を含むCD8a膜貫通ドメインである。
内部ドメイン
内部ドメインは、受容体の機能的な末端である。抗原認識の後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用される内部ドメインの構成要素は、CD3-ゼータであり、これは、3つの免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含有する。これは、抗原が結合された後に活性化シグナルをT細胞に伝達する。多くの場合、CD3-ゼータは、十分に能力のある活性化シグナルをもたらさない場合があり、したがって、共刺激シグナル伝達が使用される。例えば、CD28及び/又は4-1BBが、CD3-ゼータ(CD3ζ)とともに使用されて、増殖/生存シグナルを伝達し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるとおりのCARの共刺激分子は、CD28共刺激分子である。他の実施形態では、共刺激分子は、4-1BB共刺激分子である。いくつかの実施形態では、CARは、CD3ζ及びCD28を含む。他の実施形態では、CARは、CD3-ゼータ及び4-1BBを含む。さらに他の実施形態では、CARは、CD3ζ、CD28、及び4-1BBを含む。表5は、本明細書で提供されるとおりに使用され得るシグナル伝達分子の例を提供する。
Figure 2022512882000008
例示的なCAR配列は、下の表26において提供される。
Figure 2022512882000009
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抗体
抗体(複数の形態において互換的に使用される)は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介して炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合できる免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、インタクトな(すなわち、全長)モノクローナル抗体だけでなく、抗原結合断片(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、一本鎖可変断片(scFv)、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体(例えば、ラクダ又はラマVHH抗体)、多重特異性抗体(例えば、二重特性抗体)並びに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、及び共有結合的に修飾された抗体を含む、要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された配置も包含する。
典型的な抗体分子は、通常、抗原結合に関与する重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む。抗原結合に関与するこれらの領域/残基は、当該技術分野において知られる方法によって参照抗体(例えば、本明細書に記載されるCD33抗体)のVH/VL配列のアミノ酸配列から同定され得る。VH及びVL領域は、「フレームワーク領域」(「FR」)として知られる、より保存されている領域が挿入された、「相補性決定領域」(「CDR」)として知られる超可変領域にさらに細分することができる。各VH及びVLは通常、次の順でアミノ末端からカルボキシ末端に整列した、3つのCDR及び4つのFRで構成される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。フレームワーク領域及びCDRの範囲は、当該技術分野において知られる方法論を使用して、例えば、全てが当該技術分野においてよく知られるKabat定義、Chothia定義、AbM定義、及び/又はcontact定義によって、正確に同定され得る。本明細書で使用する場合、CDRは、当該技術分野において知られる任意の方法によって定義されるCDRを指し得る。同じCDRを有する2つの抗体は、2つの抗体が、同じ方法によって決定された当該CDRの同じアミノ酸配列を有することを意味する。例えば、Kabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242,Chothia et al.,(1989)Nature 342:877;Chothia,C.et al.(1987)J.Mol.Biol.196:901-917,Al-lazikani et al(1997)J.Molec.Biol.273:927-948;及びAlmagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)を参照されたい。hgmp.mrc.ac.uk及びbioinf.org.uk/absも参照されたい。
いくつかの実施形態では、抗体は、抗CD33 scFvなどのscFvである。抗体は、IgD、IgE、IgG、IgA、又はIgM(又はそのサブクラス)などの任意のクラスの抗体を含み、且つ抗体は、いずれかの特定のクラスのものである必要はない。重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、各種クラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのいくつかはさらに、サブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2に分けられ得る。免疫グロブリンの各種クラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。免疫グロブリンの各種クラスのサブユニット構造及び三次元配置は、よく知られている。
本明細書に提供されるとおりに使用されることになる抗体は、マウス、ラット、ヒト、又は任意の他の起源(キメラ抗体又はヒト化抗体を含む)であり得る。いくつかの例において、抗体は、免疫学的に不活性である、例えば、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)を刺激しない定常領域などの改変された定常領域を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその抗原結合断片である非ヒト(例えば、マウス)抗体の形態を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギなどの非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基により置き換えられたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDR又はフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに洗練させ、且つ最適化するために含まれる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て又は実質的に全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインを実質的に全て含むことになる。最適なヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域又はドメイン(Fc)の少なくとも一部も含むことになる。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体からの1つ以上のCDRに「由来する」1つ以上のCDRとも呼ばれる、元の抗体に関して改変された1つ以上のCDR(1、2、3、4、5、6つ)を有する。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴う場合がある。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒト抗体由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含み得るキメラ抗体である。キメラ抗体は、第1の種に由来する可変領域又は可変領域の部分及び第2の種に由来する定常領域を有する抗体を指す。通常、これらのキメラ抗体において、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、及びラットなどの非ヒト哺乳動物)の1つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体における配列と相同である。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、可変領域及び/又は定常領域においてなされ得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトCD33などの標的抗原に特異的に結合する。標的又はエピトープに「特異的に結合する」(本明細書で互換的に使用される)抗体は、当該技術分野でよく理解される用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法もまた、当該技術分野でよく知られている。分子は、それが、代替の標的よりも、特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、且つ/又はより高い親和性で反応又は会合する場合、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体は、それが、他の基質に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、且つ/又はより長い持続時間で結合する場合、標的抗原に「特異的に結合する」。例えば、CD33エピトープに特異的に(又は優先的に)結合する抗体は、それが、他のCD33エピトープ又は非CD33エピトープに結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より迅速に、且つ/又はより長い持続時間でこのCD33エピトープに結合する抗体である。それはまた、例えば、第1の標的抗原に特異的に結合する抗体が、第2の標的抗原に特異的に又は優先的に結合する場合もあるし、結合しない場合もあるというこの定義を読むことによっても理解される。そのため、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、必ずしも排他的結合を(含むことはできるが)必要とするものではない。一般に、必ずしもそうではないが、結合への参照は、優先的な結合を意味する。
いくつかの実施形態では、抗体とCD33の間の平衡解離定数(KD)は、100pM~1μMである。いくつかの実施形態では、抗体とCD33の間のKDは、1nM~100nMである。
本明細書に開示されるとおりの例示的な抗CD33抗体のいずれかの機能的バリアントもまた本開示の範囲内である。機能的バリアントは、参照抗体を基準としてVH及び/若しくはVL、又はHC CDRの1つ以上及び/若しくはVL CDRの1つ以上において1つ以上のアミノ酸残基の変異を含有し得るが、参照抗体と実質的に同様の結合活性及び生物学的活性(例えば、実質的に同様の結合親和性、結合特異性、阻害活性、抗腫瘍活性、又はこれらの組合せ)を保持している。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗CD33抗体は、抗体A(VH:配列番号65;VL:配列番号66)などの参照抗体のVH CDR1、VH CDR2、VH CDR3と比較して、10個以下のアミノ酸変異(例えば、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を合わせて含有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含む。「合わせて」は、3つのVH CDRの全てにおけるアミノ酸変異の総数が、既定の範囲内であることを意味する。或いは又は加えて、抗CD33抗体は、参照抗体のVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3と比較して、10個以下のアミノ酸変異(例えば、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個以下のアミノ酸変異)を合わせて含有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み得る。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗CD33抗体は、少なくとも1つが、抗体A(VH:配列番号65;VL:配列番号66)などの参照抗体の対応物のVH CDRと同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体A(VH:配列番号65;VL:配列番号66)などの参照抗体のVH CDR3と同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVH CDR3を含む。或いは又は加えて、抗CD33抗体は、少なくとも1つが、参照抗体の対応物のVL CDRと同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVL CDR1、VL CDR2、及びVL CDR3を含み得る。特定の例において、抗体は、参照抗体のVL CDR3と同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVL CDR3を含む。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗CD33抗体は、抗体B(VH:配列番号77;VL:配列番号78)などの参照抗体のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3と比較して、10個以下のアミノ酸変異(例えば、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を合わせて含有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含む。いくつかの例において、本明細書で開示される抗CD33抗体は、少なくとも1つが、抗体B(VH:配列番号77;VL:配列番号78)などの参照抗体の対応物VH CDRと同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体B(VH:配列番号77;VL:配列番号78)などの参照抗体のVH CDR3と同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVH CDR3を含む。
いくつかの例において、本明細書で開示される抗CD33抗体は、抗体C(VH:配列番号89;VL:配列番号90)などの参照抗体のVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3と比較して、10個以下のアミノ酸変異(例えば、9、8、7、6、5、4、3、2又は1個以下のアミノ酸変異)を合わせて含有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含む。いくつかの例において、本明細書で開示される抗CD33抗体は、少なくとも1つが、抗体C(VH:配列番号89;VL:配列番号90)などの参照抗体の対応物VH CDRと同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVH CDR1、VH CDR2、及びVH CDR3を含み得る。特定の例において、抗体は、抗体C(VH:配列番号89;VL:配列番号90)などの参照抗体のVH CDR3と同程度に、5個以下のアミノ酸変異(例えば、4、3、2、又は1個以下のアミノ酸変異)を含有するVH CDR3を含む。
場合によっては、アミノ酸残基の変異は、保存的なアミノ酸残基置換であり得る。本明細書で使用する場合、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷又はサイズの特徴を変えないアミノ酸置換を指す。バリアントは、そのような方法をまとめた参考文献、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,J.Sambrook,et al.,eds.,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989,又はCurrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel,et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,New Yorkに見出されるような、当業者に知られるポリペプチド配列を改変するための方法に従って作製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の中でなされる置換を含む:(a)A→G、S;(b)R→K、H;(c)N→Q、H;(d)D→E、N;(e)C→S、A;(f)Q→N;(g)E→D、Q;(h)G→A;(i)H→N、Q;(j)I→L、V;(k)L→I、V;(l)K→R、H;(m)M→L、I、Y;(n)F→Y、M、L;(o)P→A;(p)S→T;(q)T→S;(r)W→Y、F;(s)Y→W、F;及び(t)V→I、L。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される抗体は、抗体A(VH:配列番号65;VL:配列番号66)などの参照抗体のVH CDRと合わせて少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、又は98%)同一のVH CDRを含み得る。或いは又は加えて、抗体は、参照抗体のVL CDRと合わせて少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、又は98%)同一のVL CDRを含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体A(VH:配列番号65;VL:配列番号66)などの参照抗体のVHと少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、又は98%)同一のVH及び/又は参照抗体のVL可変領域と少なくとも80%(例えば、85%、90%、95%、又は98%)同一のVLを含み得る。
ドナー鋳型
CARをコードする核酸は、ドナー鋳型と本明細書で呼ばれる(ドナーポリヌクレオチドとも呼ばれる)ものを含むT細胞にベクターを使用して(例えばAAVベクター)送達され得る。ドナー鋳型は、目的のゲノム位置で効率的なHDRを可能にする2つの相同な領域に隣接したCARをコードする核酸などの非相同配列を含有し得る。或いは、ドナー鋳型は、DNA中の標的化された位置と相同な領域を有しない場合があり、標的部位での切断後のNHEJ依存的末端連結によって組み込まれ得る。
ドナー鋳型は、一本鎖及び/又は二重鎖のDNA又はRNAであってもよく、直鎖状又は環状形態で細胞に導入され得る。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に知られる方法によって(例えば、エキソヌクレアーゼ分解から)保護され得る。例えば、1つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の3’末端に付加され、且つ/又は自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方又は両方の末端に連結される。例えば、Chang et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959-4963;Nehls et al.,(1996)Science 272:886-889を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、末端アミノ基の付加、並びに、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びO-メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾されたヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム又はポロクサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として導入され得るか、又はウイルス(例えば、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス(IDLV))によって送達され得る。
ドナー鋳型は、いくつかの実施形態において、その発現が、組込み部位の内在性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように挿入される。しかしながら、いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、外来性プロモーター及び/又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、内在性プロモーターは、配列番号129の配列を含むEF1αプロモーターである。他のプロモーターが使用されてもよい。
さらに、外来性配列はまた、転写又は翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、2Aペプチドをコードする配列及び/又はポリアデニル化シグナルを含み得る。
送達方法及びコンストラクト
ヌクレアーゼ及び/又はドナー鋳型は、プラスミドベクター、DNA小環、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター;ヘルペスウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクター、及びその組合せを含むが、これらに限定されないベクター系を使用して送達され得る。
従来のウイルス及び非ウイルス系遺伝子導入方法を使用して、細胞(例えば、T細胞)においてヌクレアーゼをコードする核酸及びドナー鋳型を導入することができる。非ウイルスベクター送達系としては、DNAプラスミド、DNA小環、裸の核酸、及びリポソーム又はポロクサマーなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞に送達された後にエピソーム又は組込みゲノムのいずれかを有するDNA及びRNAウイルスが挙げられる。
核酸の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質:核酸コンジュゲート、裸のDNA、裸のRNA、キャップ付きRNA、人工ビリオン、及び薬剤で増強されたDNAの取込みが挙げられる。例えば、ソニトロン 2000システム(Rich-Mar)を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達のために使用され得る。
アデノ随伴ウイルス送達
CARコンストラクトをコードするドナー核酸は、アデノ随伴ウイルス(AAV)を使用して細胞に送達され得る。AAVは、宿主ゲノムに部位特異的に組込み、したがって、CARなどの導入遺伝子を送達できる小型のウイルスである。逆位末端配列(ITR)は、AAVゲノム及び/又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、AAVゲノムには、転写されたときにAAVゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するrepタンパク質及びcapタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体は、AAVの血清型を付与し、カプシドが主にどの標的臓器に結合するかを決定し、したがって、AAVが最も効率的に感染することになる細胞を決定する。現在知られているヒトAAVの血清型は12種類である。いくつかの実施形態では、AAVは、AAV血清型6(AAV6)である。
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの1つである。第一に、AAVは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、AAVは、特に適切なAAV血清型を選択することを考慮するとき、標的細胞に効率的に送達される。最後に、AAVは、ゲノムが組込みを伴わずに宿主細胞において存続できるため、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この形質により、それらが遺伝子療法の理想的な候補となる。
相同組換え修復(HDR)
CARをコードするドナー核酸は、相同組換え修復(HDR)によって標的遺伝子座位に挿入される。標的部位でのDNAの両方の鎖が、CRISPR Cas9酵素によって切断される。次に、HDRが発生して、二重鎖切断(DSB)を修復し、ドナーDNAを挿入する。これが正しく発生するために、ドナー配列は、標的遺伝子のDSB部位を取り囲む配列に相補的な隣接している残基(以下、「相同性アーム」)を有するように設計される。これらの相同性アームは、DSB修復のための鋳型として機能し、本質的に誤りのない機構であるHDRを可能にする。相同組換え修復(HDR)の割合は、変異部位と切断部位の間の距離の関数であり、そのため、重複している配列又は近くの標的を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含んでもよいし、ゲノム配列と異なる配列を含有してもよく、したがって、配列編集が可能になる。
標的遺伝子は、対象において免疫応答と関連する場合があり、ここで、標的遺伝子の少なくとも一部を持続的に欠失させることが、免疫応答を調節することになる。例えば、CAR T細胞を生成するために、標的遺伝子は、TCRα定常領域(TRAC)であり得る。TRACの破壊は、内在性TCRの機能の喪失をもたらす。
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、セーフハーバー座位にある。
操作されたT細胞
本開示の操作された(遺伝子編集された)CAR T細胞は、自己由来(「自己」)の又は非自己由来(「非自己」、例えば、異質遺伝子型、同一遺伝子又は異種間)であり得る。「自己由来」は、同じ対象からの細胞を指す。「異質遺伝子型」は、対象と同じ種であるが、対象中の細胞と遺伝的に異なる細胞を指す。いくつかの実施形態では、T細胞は、哺乳動物から得られる。いくつかの実施形態では、T細胞は、ヒトから得られる。
T細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺排出、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むが、これらに限定されないいくつかの供給源から得ることができる。ある種の実施形態では、T細胞は、遠心沈降、例えば、FICOLL(商標)分離などの当業者に知られる任意の数の技術を使用して対象から回収される血液の単位から得ることができる。
いくつかの実施形態では、T細胞の単離された集団が使用される。いくつかの実施形態では、末梢血単核球(PBMC)の単離の後、細胞傷害性及びヘルパーTリンパ球の両方が、活性化、増殖、及び/又は遺伝的改変の前又は後のいずれかでナイーブ、メモリー、及びエフェクターT細胞亜集団に分別され得る。
以下の細胞表面マーカー:TCRab、CD3、CD4、CD8、CD27 CD28、CD38 CD45RA、CD45RO、CD62L、CD127、CD122、CD95、CD197、CCR7、KLRG1、MCH-Iタンパク質及び/又はMCH-IIタンパク質の1つ以上を発現するT細胞の特定の亜集団がさらに、陽性又は陰性選択手法によって単離され得る。いくつかの実施形態では、TCRab、CD4及び/又はCD8からなる群から選択されるマーカーの1つ以上を発現するT細胞の特定の亜集団はさらに、陽性又は陰性選択手法によって単離され得る。いくつかの実施形態では、操作されたT細胞集団は、以下のマーカー:CD70、CD57、CD244、CD160、PD-1、CTLA4、HΜ3、及びLAG3の1つ以上を発現しないか又は実質的に発現しない。いくつかの実施形態では、T細胞の亜集団は、遺伝子操作の前及び/又は遺伝子操作の後に陽性又は陰性選択によって単離され得る。
いくつかの実施形態では、T細胞の単離された集団は、CD3+、CD4+、CD8+、又はその組合せを含むが、これらに限定されないマーカーの1つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、T細胞は、ドナー、又は対象から単離され、遺伝子編集を受ける前に、最初に活性化され、インビトロで増殖するように刺激される。
T細胞組成物の十分な治療用量を実現するために、T細胞は、1回以上の刺激、活性化及び/又は増殖にかけられる場合が多い。T細胞は、一般に、例えば、米国特許第6,352,694号明細書;同第6,534,055号明細書;同第6,905,680号明細書;同第6,692,964号明細書;同第5,858,358号明細書;同第6,887,466号明細書;同第6,905,681号明細書;同第7,144,575号明細書;同第7,067,318号明細書;同第7,172,869号明細書;同第7,232,566号明細書;同第7,175,843号明細書;同第5,883,223号明細書;同第6,905,874号明細書;同第6,797,514号明細書;及び同第6,867,041号明細書において記載されるとおりの方法を使用して、活性化及び増殖され得る。いくつかの実施形態では、T細胞は、ゲノム編集組成物のT細胞への導入の前に約1日~約4日、約1日~約3日、約1日~約2日、約2日~約3日、約2日~約4日、約3日~約4日、又は約1日、約2日、約3日、若しくは約4日間活性化及び増殖される。
いくつかの実施形態では、T細胞は、ゲノム編集組成物のT細胞への導入の前に約4時間、約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、約48時間、約60時間、又は約72時間活性化及び増殖される。
いくつかの実施形態では、T細胞は、遺伝子編集組成物がT細胞に導入されるのと同時に活性化される。
治療方法及び組成物
本明細書では、いくつかの実施形態において、癌(例えば、白血病、例えば、急性骨髄性白血病)を治療するための方法が提供される。本明細書で提供されるとおりに治療され得る白血病の非限定的な例としては、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)が挙げられる。いくつかの実施形態では、方法は、本開示のCAR T細胞(例えば、抗CD33 CAR T細胞)を、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)を含む癌(例えば、白血病)を有する対象に送達することを含む。
投与する工程は、所望の効果がもたらされるように、腫瘍などの所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在をもたらす方法又は経路による、対象への細胞、例えば、操作されたT細胞の配置(例えば、移植)を含み得る。操作されたT細胞は、移植された細胞又は細胞の構成要素の少なくとも一部が生存したままである対象における所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間、例えば、24時間という短い期間、数日、数年もの間、或いは対象の寿命、すなわち、長期の生着であり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様において、有効量の操作されたT細胞は、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与される。
対象は、診断、治療、又は療法が望まれる任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
ドナーは、治療されている対象ではない個体である。ドナーは、患者ではない個体である。いくつかの実施形態では、ドナーは、治療されている癌を有しないか又は有すると疑われていない個体である。いくつかの実施形態では、複数のドナー、例えば、2以上のドナーが使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与されている操作されたT細胞集団は、1つ以上のドナーから得られた異質遺伝子型のT細胞を含む。異質遺伝子型は、1つ以上の座位での遺伝子がレシピエント(例えば、対象)と同一ではない細胞、細胞集団、又は同じ種の1つ以上の異なるドナーから得られた細胞を含む生体試料を指す。例えば、対象に投与されている操作されたT細胞集団は、1以上の血縁ではないドナー、又は1以上の同一ではない同胞に由来し得る。いくつかの実施形態では、遺伝的に同一のドナー(例えば、同一の双子)から得られたものなど、同一遺伝子の細胞集団が使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、自己細胞である;すなわち、操作されたT細胞は、対象から得られるか又は単離され、同じ対象に投与される、すなわち、ドナー及びレシピエントが同じである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法に従って投与されている操作されたT細胞集団は、対象において毒性を誘導しない、例えば、操作されたT細胞は、非癌細胞において毒性を誘導しない。いくつかの実施形態では、投与されている操作されたT細胞集団は、補体に媒介される溶解を誘発しないか、又は抗体依存性細胞傷害(ADCC)を刺激しない。
有効量は、医学的状態(例えば、癌)の少なくとも1つ以上の徴候又は症状を予防するか又は軽減するのに必要な操作されたT細胞の集団の量を指し、所望の効果をもたらす、例えば、医学的状態を有する対象を治療する組成物の十分な量に関する。有効量はまた、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変えるか(例えば、疾患の症状の進行を遅くすることに限定されない)、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量を含む。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、当業者によって通常の実験を用いて決定され得ることが理解される。
本明細書に記載される様々な態様における使用に関して、有効量の細胞(例えば、操作されたT細胞)は、少なくとも102細胞、少なくとも5×102細胞、少なくとも103細胞、少なくとも5×103細胞、少なくとも104細胞、少なくとも5×104細胞、少なくとも105細胞、少なくとも2×105細胞、少なくとも3×105細胞、少なくとも4×105細胞、少なくとも5×105細胞、少なくとも6×105細胞、少なくとも7×105細胞、少なくとも8×105細胞、少なくとも9×105細胞、少なくとも1×106細胞、少なくとも2×106細胞、少なくとも3×106細胞、少なくとも4×106細胞、少なくとも5×106細胞、少なくとも6×106細胞、少なくとも7×106細胞、少なくとも8×106細胞、少なくとも9×106細胞、又はその複合を含む。細胞は、1つ以上のドナーに由来するか、又は自己の供給源から得られる。本明細書に記載されるいくつかの例において、細胞は、必要とする対象への投与の前に培養において増殖される。
投与の様式は、注射、注入、点眼、又は経口摂取を含む。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、及び胸骨内注射及び注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
いくつかの実施形態では、操作されたT細胞は、全身的に投与され、これは、標的部位、組織、又は臓器に直接的ではなく、対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様の過程にかけられるような細胞の集団の投与を指す。
医学的状態の治療のための組成物を含む治療の有効性は、熟達した臨床医によって判定され得る。治療は、一例ではあるが、任意の1つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる(例えば、少なくとも10%増加する)、又は疾患(例えば、癌)の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善又は緩和される場合、「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、入院又は医学的介入の必要性によって評価されるとおり、対象が悪化しないことによって測定され得る(例えば、疾患の進行が止まるか、又は少なくとも遅くなる)。これらの指標を測定する方法は、当業者に知られており、且つ/又は本明細書に記載される。治療は、対象における疾患の任意の治療を含み、且つ(1)疾患を阻害すること、例えば、症状の進行を止めるか、又は遅くすること;又は(2)疾患を軽減すること、例えば、症状の退行をもたらすこと;及び(3)症状の発症の可能性を予防するか又は減少させることを含む。
他の実施形態
本開示は、以下の実施形態に関する。この節全体にわたって、実施形態という用語は、順序の前の「E」として省略される。例えば、E1は、実施形態1に等しい。
E1.キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む操作されたT細胞であって、CARが、CD33に特異的に結合する外部ドメインを含む操作されたT細胞。
E2.破壊されたT細胞受容体アルファ鎖定常領域(TRAC)遺伝子をさらに含む、実施形態1の操作されたT細胞。
E3.CARをコードする核酸が、TRAC遺伝子に挿入される、実施形態2の操作されたT細胞。
E4.破壊されたベータ-2-ミクログロブリン(β2M)遺伝子をさらに含む、実施形態1~3のいずれか1つの操作されたT細胞。
E5.CARの外部ドメインが、抗CD33抗体を含む、実施例1~4のいずれか1つの操作されたT細胞。
E6.抗CD33抗体が、抗CD33一本鎖可変断片(scFv)である、実施形態5の操作されたT細胞。
E7.抗CD33 scFvが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン(VH)相補性決定領域(CDR)及び同じ軽鎖可変ドメイン(VL)CDRを含み、参照抗体が、
(i)配列番号65に記載されるVH及び配列番号66に記載されるVL、
(ii)配列番号77に記載されるVH及び配列番号78に記載されるVL、又は
(iii)配列番号89に記載されるVH及び配列番号90に記載されるVL
を含む、実施形態6の操作されたT細胞。
E8.抗CD33 scFvが、参照抗体と同じVH及びVL鎖を含む、実施形態7の操作されたT細胞。
E9.抗CD33 scFvが、配列番号73、75、85、87、97、又は99のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、実施形態7の操作されたT細胞。
E10.CARがさらに、CD28共刺激ドメイン又は41BB共刺激ドメインを含む、実施形態1~9のいずれか1つの操作されたT細胞。
E11.CARがさらに、CD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態10の操作されたT細胞。
E12.TRAC遺伝子が、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、且つ/又はCARが、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116又は119のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態3~11のいずれか1つの操作されたT細胞。
E13.破壊されたβ2M遺伝子が、配列番号9~14のいずれか1つから選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、実施形態4~14のいずれか1つの操作されたT細胞。
E14.T細胞が、野生型CD33遺伝子を含む、実施形態1~15のいずれか1つの操作されたT細胞。
E15.T細胞がさらに、破壊されたCD33遺伝子を含む、実施形態1~15のいずれか1つの操作されたT細胞。
E16.破壊されたCD33遺伝子が、AGTTCATGGTACTGGTTCC(配列番号187)、AGTTCATGGTTCC(配列番号188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(配列番号189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(配列番号190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(配列番号191)、AGTTCATACTGGTTCC(配列番号192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(配列番号193)、及び/又はAGTTACTGGTTCC(配列番号194)のヌクレオチド配列を含む、実施形態17の操作されたT細胞。
E17.破壊されたCD33遺伝子が、AGTTCATGGTTACTGGTTCC(配列番号186)を含む断片を欠く、実施形態17又は実施形態18の操作されたT細胞。
E18.破壊されたCD33遺伝子が、AAATCCTGGCACT(配列番号300)、AAATCCCTGGCACT(配列番号301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(配列番号304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(配列番号305)、AAATCCTCCCTGGCACT(配列番号306)、AAATCCCCTGGCACT(配列番号307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号308)、ACATCCTGGCACT(配列番号309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(配列番号310)、AAATCCTCATCTGGCACT(配列番号311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(配列番号312)、AAATCCTCTGGCACT(配列番号313)、AAATCCCCCTGGCACT(配列番号314)、AAATCCTCACT(配列番号315)、ACATCCCTGGCACT(配列番号316)、及び/又はAAATのヌクレオチド配列を含む、実施形態17の操作されたT細胞。
E19.破壊されたCD33遺伝子が、AAATCCTCATCCCTGGCACT(配列番号299)を含む断片を欠く、実施形態20の操作されたT細胞。
E20.破壊されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、AAATCCTCAT(配列番号317)、AAATCCTCATCCCT(配列番号318)、AAATCCTCATCCCTGG(配列番号320)、AAATCCTCATC(配列番号322)、又はAAATCCTCATCCCTGGCA(配列番号324)のヌクレオチド配列を含む、実施形態20又は実施形態21の操作されたT細胞。
E21.破壊されたCD33遺伝子が断片を欠き、その5’セグメントが、CTCATCCCTGGCACT(配列番号323)のヌクレオチド配列を含む、実施形態20~22のいずれか1つの操作されたT細胞。
E22.実施形態1~21のいずれか1つの操作されたT細胞を含む操作されたT細胞の集団であって、集団のうちの少なくとも25%又は少なくとも50%の操作されたT細胞が、CARを発現する、操作されたT細胞の集団。
E23.集団のうちの少なくとも70%の操作されたT細胞が、CARを発現する、実施形態22の集団。
E24.集団のうちの少なくとも25%の操作されたT細胞が、インビトロ増殖の少なくとも7日後又は少なくとも14日後にCARを発現する、実施形態22の集団。
E25.集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのT細胞受容体(TCR)タンパク質を発現しない、実施形態22~24のいずれか1つの集団。
E26.集団のうちの少なくとも90%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのTCRタンパク質を発現しない、実施形態25の集団。
E27.集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない、実施形態22~26のいずれか1つの集団。
E28.集団のうちの少なくとも70%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない、実施形態27の集団。
E29.集団のうちの少なくとも20%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのCD33タンパク質を発現しない、実施形態22~28のいずれか1つの集団。
E30.集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのCD33タンパク質を発現しない、実施形態29の集団。
E31.集団の操作されたT細胞が、CD33を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、集団のうちの少なくとも10%、少なくとも25%、又は少なくとも50%の癌細胞の細胞溶解を誘導する、実施形態22~30のいずれか1つの集団。
E32.集団の操作されたT細胞が、CD33を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、集団のうちの少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%の癌細胞の細胞溶解を誘導する、実施形態31の集団。
E33.集団の操作されたT細胞が、癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、IFNγを分泌する、実施形態31又は実施形態32の集団。
E34.操作されたT細胞と癌細胞の比が、1:1~2:1である、実施形態31~33のいずれか1つの集団。
E35.癌細胞が、白血病を含む、実施形態31~34のいずれか1つの集団。
E36.癌細胞が、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)を含む、実施形態31~34のいずれか1つの集団。
E37.実施形態22~36のいずれか1つの操作されたT細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
E38.対象が、ヒト対象である、実施形態37の方法。
E39.対象が、癌を有する、実施形態37又は38の方法。
E40.癌が、白血病、任意選択により、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)である、実施形態39の方法。
E41.癌が、CD33を発現する癌細胞を含む、実施形態39又は実施形態40の方法。
E42.操作されたT細胞の集団を対象に投与することが、ベースライン対照に対して癌性の腫瘍体積の減少をもたらす、実施形態39~41のいずれか1つの方法。
E43.操作されたT細胞を生成するための方法であって、
(a)T細胞に
(i)RNA誘導型ヌクレアーゼ、
(ii)TRAC遺伝子を標的化するgRNA、及び
(iii)CD33に特異的に結合する外部ドメインを含むCARをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクターを送達すること;並びに
(b)破壊されたTRAC遺伝子を有し且つCARを発現する操作されたT細胞を生成することを含む方法。
E44.TRAC遺伝子を標的化するgRNAが、配列番号18又は配列番号19のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号40のヌクレオチド配列を標的化する、実施形態43の方法。
E45.CARをコードする核酸が、TRAC遺伝子に対する左及び右の相同性アームと隣接する、実施形態43又は44の方法。
E46.T細胞にβ2M遺伝子を標的化するgRNAを送達することをさらに含む、実施形態43~45のいずれか1つの方法。
E47.β2M遺伝子を標的化するgRNAが、配列番号20又は配列番号21のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号41のヌクレオチド配列を標的化する、実施形態46の方法。
E48.RNA誘導型ヌクレアーゼが、Cas9ヌクレアーゼ、任意選択によりS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである、実施形態43~47のいずれか1つの方法。
E49.T細胞にCD33遺伝子を標的化するgRNAを送達することをさらに含む、実施形態43~48のいずれか1つの方法。
E50.CD33遺伝子を標的化するgRNAが、表10において提供されるとおりのヌクレオチド配列を含む、実施形態49の方法。
E51.CARの外部ドメインが、抗CD33抗体である、実施例43~50のいずれか1つの方法。
E52.抗CD33抗体が、抗CD33一本鎖可変断片(scFv)である、実施形態51の方法。
E53.抗CD33 scFvが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン(VH)相補性決定領域(CDR)及び同じ軽鎖可変ドメイン(VL)CDRを含み、参照抗体が、(i)配列番号65に記載されるVH及び配列番号66に記載されるVL、(ii)配列番号77に記載されるVH及び配列番号78に記載されるVL、又は(iii)配列番号89に記載されるVH及び配列番号90に記載されるVLを含む、実施形態52の方法。
E54.抗CD33 scFvが、参照抗体と同じVH及びVL鎖を含む、実施形態52の方法。
E55.抗CD33 scFvが、配列番号73、75、85、87、97、又は99のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、実施形態54の方法。
E56.CARが、CD28共刺激ドメイン又は41BB共刺激ドメインを含む、実施形態43~55のいずれか1つの方法。
E57.CARがさらに、CD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、実施形態56の方法。
E58.ドナー鋳型が、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、実施形態43~57のいずれか1つの方法。
E59.CARが、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116、又は119のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態43~58のいずれか1つの方法。
E60.癌を有する対象において腫瘍の体積を減少させるための方法であって、実施形態22~36のいずれか1つの操作されたT細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
E61.対象における腫瘍の体積が、ベースライン対照に対して少なくとも50%減少され、任意選択により、集団の1×105個の細胞~1×107個の細胞が投与される、実施形態60の方法。
E62.操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、
(i)破壊されたTRAC遺伝子;
(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び
(iii)抗CD33抗原結合断片を含むCARをコードする核酸を含む細胞の集団。
E63.CARが、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、実施形態62の細胞の集団。
E64.破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含む、実施形態62又は実施形態63の細胞の集団。
E65.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態62~64のいずれか1つの細胞の集団。
E66.操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団。
E67.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態63の細胞の集団。
E68.操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団。
E69.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態68の細胞の集団。
E70.操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;及び
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団。
E71.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態70の細胞の集団。
E72.操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、操作されたT細胞が、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む細胞の集団。
E73.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態72の細胞の集団。
E74.操作されたT細胞であって、
(i)破壊されたTRAC遺伝子;
(ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び
(iii)抗CD33抗原結合断片を含むCARをコードする核酸を含む操作されたT細胞。
E75.CARが、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、実施形態74の操作されたT細胞。
E76.破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含む、実施形態74又は実施形態75の操作されたT細胞。
E77.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態74~76のいずれか1つの操作されたT細胞。
E78.操作されたT細胞であって、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む操作されたT細胞。
E79.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態75の操作されたT細胞。
E80.操作されたT細胞であって、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む操作されたT細胞。
E81.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態77の操作されたT細胞。
E82.操作されたT細胞であって、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;及び
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む操作されたT細胞。
E83.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態82の操作されたT細胞。
E84.操作されたT細胞であって、
(i)破壊されたTRAC遺伝子であって、破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び
(ii)破壊されたβ2M遺伝子を含む操作されたT細胞。
E85.破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、実施形態84の操作されたT細胞。
E86.T細胞が、ヒトT細胞である、実施形態1~21及び74~85のいずれか1つの操作されたT細胞。
E87.実施形態62~73のいずれか1つの細胞の集団を対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法。
E88.癌が、白血病、任意選択により、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)である、実施形態87の方法。
E89.癌が、CD33を発現する細胞を含む、実施形態87又は実施形態88の方法。
E90.実施形態43~59の方法のいずれか1つによって生成される操作されたT細胞。
E91.実施形態項43~59の方法のいずれか1つによって生成される細胞の集団。
E92.CARが、配列番号104、105、107、111、114、117、又は120のアミノ酸配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E93.CARが、配列番号104のアミノ酸配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E94.編集されたCD33遺伝子が、GGATCCAAATTCTGGCTGC(配列番号175)、GGATCCAAATTTTCTGGCTGC(配列番号176)、GGATCCTGGCTGC(配列番号177)、GGATCCAATTCTGGCTGC(配列番号178)、TCCTGGCTGC(配列番号179)、GGATCTGGCTGC(配列番号180)、GGATCC、及び/又はGGATCCATTCTGGCTGC(配列番号181)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E95.編集されたCD33遺伝子が、GGATCCAAATTTCTGGCTGC(配列番号174)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E96.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、GGATCCAAATTTC(配列番号182)、GGATCCAAATT(配列番号183)、又はGGATCCAAATTT(配列番号185)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E97.編集されたCD33遺伝子が、ACTCCCCAGTTTCATGGTTAC(配列番号197)、ACTCCCCAGTCATGGTTAC(配列番号198)、ACTCCCCATGGTTAC(配列番号199)、ACTCCCCAGTTAC(配列番号200)、ACTCATGGTTAC(配列番号201)、ACTCCCCATCATGGTTAC(配列番号202)、ACTCCCCATTCATGGTTAC(配列番号203)、ACTCCCCAGTGTCATGGTTAC(配列番号204)、及び/又はACTCCCCAGTCTCATGGTTAC(配列番号205)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E98.編集されたCD33遺伝子が、ACTCCCCAGTTCATGGTTAC(配列番号196)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E99.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、ACTCCCCAGTTCATGGTT(配列番号206)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E100.編集されたCD33遺伝子が、AGCCATTATCCAGGGACT(配列番号208)、AGCCAGGGACT(配列番号209)、AGCCATTATTCCAGGGACT(配列番号210)、AGTCCAGGGACT(配列番号211)、AGCCATTATAATCCAGGGACT(配列番号212)、AGCCATTATCCGGGGACT(配列番号213)、AGCCATTATACAGGGACT(配列番号214)、AGCCATTATTCCGGGGACT(配列番号216)、及び/又はAGCCATTATAATCCGGGGACT(配列番号217)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E101.編集されたCD33遺伝子が、AGCCATTATATCCAGGGACT(配列番号207)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E102.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、AGCCATTATATCCA(配列番号218)又はAGCCATTATA(配列番号219)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E103.編集されたCD33遺伝子が、TCAGTGACAGGAGGG(配列番号221)、TCAGTGACGTACAGGAGGG(配列番号222)、TCAGGAGGG(配列番号223)、TCAGTGACGGAGGG(配列番号224)、TCAGTGACGGGAGGG(配列番号226)、TCAGTGACGGTTACAGGAGGG(配列番号227)、TCAGTGACGGACAGGAGGG(配列番号228)、TCAGTGACGGGTACAGGAGGG(配列番号229)、TCAGTACAGGAGGG(配列番号230)、TCAGTGACTACAGGAGGG(配列番号231)、TCAGTGACGGG(配列番号232)、TCAGTGACGG(配列番号233)、TCAGTGACGGCAGGAGGG(配列番号234)、TCAGTGACGGAGGAGGG(配列番号235)、TCAGTGATACAGGAGGG(配列番号236)、TCAGTGTACAGGAGGG(配列番号237)、及び/又はTCATACAGGAGGG(配列番号238)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E104.編集されたCD33遺伝子が、TCAGTGACGGTACAGGAGGG(配列番号220)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E105.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、TCAGTGACGGTA(配列番号239)又はTCAGTGACGのヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E106.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その5’セグメントが、GTGACGGTACAGGAGGG(配列番号242)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E107.編集されたCD33遺伝子が、AGCTGGAGCT(配列番号244)、AGGTGAAGCTGGAGCT(配列番号245)、AGGTGAAGCT(配列番号246)、AGGTGAAGTTGGAGCT(配列番号247)、AGGTGAAGTCGCTGGAGCT(配列番号248)、AGGTGGAGCT(配列番号249)、AGGTGAAGCGCTGGAGCT(配列番号250)、AGGTGACGCTGGAGCT(配列番号252)、及び/又はAGGTGAAGTTTCGCTGGAGCT(配列番号253)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E108.編集されたCD33遺伝子が、AGGTGAAGTTCGCTGGAGCT(配列番号243)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E109.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、AGGTGAAGTTCG(配列番号256)、AGGTGAAGTTCGCTGGAG(配列番号259)、AGGTGAAGTTCGCTGG(配列番号260)、又はAGGTGAAGTT(配列番号261)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E110.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その5’セグメントが、GGTGAAGTTCGCTGGAGCT(配列番号262)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E111.編集されたCD33遺伝子が、AGTTCGCTGGTGTG(配列番号264)及び/又はAGTTCGCTGAGCTGGTGTG(配列番号266)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E112.編集されたCD33遺伝子が、AGTTCGCTGGAGCTGGTGTG(配列番号263)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E113.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、AGTTCGCTGG(配列番号267)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E114.編集されたCD33遺伝子が、ACTACTCACTTCCTCGGTGCT(配列番号269)、ACTACTCGGTGCT(配列番号270)、ACTACTCATCCTCGGTGCT(配列番号271)、ACTACT、ACTACTCACCCTCGGTGCT(配列番号272)、ACTACTCCTCGGTGCT(配列番号273)、ACTACTCACCTCGGTGCT(配列番号275)、ACTACTCACTCGGTGCT(配列番号276)、ACTACTCTCCTCGGTGCT(配列番号277)、ACTACTTCCTCGGTGCT(配列番号278)、ACTACTCACTTCGGTGCT(配列番号279)、及び/又はACTATCCTCGGTGCT(配列番号280)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E115.編集されたCD33遺伝子が、ACTACTCACTCCTCGGTGCT(配列番号268)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E116.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、ACTACTCACT(配列番号282)、ACTACTCACTCCTC(配列番号283)、又はACTACTCACTCCTCGGT(配列番号284)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E117.編集されたCD33遺伝子が、CCCGATCTTCCTGGTTGT(配列番号286)、CCCGATCCTGGTTGT(配列番号287)、CCCGATCTGGTTGT(配列番号288)、CCCTGGTTGT(配列番号289)、CCCGATCTTCTGGTTGT(配列番号290)、CCCGATCTTGGTTGT(配列番号291)、CCCGATCTCCTGGTTGT(配列番号292)、CCCGATCTTCCCTGGTTGT(配列番号293)、及び/又はCCCGATのヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E118.編集されたCD33遺伝子が、CCCGATCTTCTCCTGGTTGT(配列番号285)を含む断片を欠く、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E119.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、CCCGATCTTCT(配列番号295)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
E120.編集されたCD33遺伝子が断片を欠き、その5’セグメントが、TCCTGGTTGT(配列番号298)のヌクレオチド配列を含む、1~21の実施形態のいずれか1つの操作されたT細胞。
実施例1:TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞の作製。
この実施例は、T細胞受容体(TCR)遺伝子(TCRアルファ定常(TRAC)領域において遺伝子編集された)、β2-ミクログロブリン(β2M)遺伝子の発現を欠き、CD33及びCD33+癌を標的化するキメラ抗原受容体(CAR)を発現する異質遺伝子型のヒトT細胞の生成を記載する。CD28共刺激ドメインを含む4種の固有の抗CD33 CAR(CTX-965、CTX-964、CTX-969及びCTX-970)は、実験及び評価に関してTRAC-/β2M- T細胞において別々に発現された。追加の抗CD33 CAR(CTX-965b、CTX-964b、CTX-969b、及びCTX-970b)もまた、CD28の代わりに4-1BB共刺激ドメインとともに作製された。追加のCARは、表6において示されるとおりに作製され得る。
Figure 2022512882000045
活性化一次ヒトT細胞を、Cas9:gRNA RNP複合体で電気穿孔し、TRAC座位と相同性を有する抗CD33 CARドナー鋳型を含有するアデノ随伴アデノウイルスベクター(AAV)で感染させて、TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞を作製した。CARドナー鋳型(配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118)を含む組換えAAV血清型6(AAV6)が、Cas9:sgRNA RNP(1μM Cas9、5μM gRNA)とともに活性化ヒトT細胞に送達された。以下のsgRNAが使用された:TRAC(配列番号28)及びβ2M(配列番号30)。gRNAの未改変のバージョン(又は他の改変バージョン)もまた使用され得る(例えば、配列番号18又は配列番号20)。表4を参照されたい。
エレクトロポレーションの約1週間後、遺伝子編集されたT細胞を、抗CD33 CARを発現した細胞集団のパーセンテージを評価するためにフローサイトメトリーによって分析した。細胞表面の抗CD33 CARの標識は、ビオチン及びストレプトアビジン-APC二次試薬にコンジュゲートされたCD33タンパク質(AcroBiosystems)の組合せによりなされた(図1A、図1B及び図1C)。RNPを伴わずに処理されたT細胞(例えば、「RNPなし」)及びTRAC及びB2M遺伝子破壊を有するがCARの挿入を有しないT細胞(例えば、TRAC-/B2M-又は「TB-」)を含む対照細胞は、予想されるとおり抗CD33 CAR表面タンパク質の発現を示さなかった。対照的に、TRAC及びB2M遺伝子破壊並びにCARコンストラクトにより作製されたある種のT細胞は、抗CD33 CARを発現した高いパーセンテージの集団をもたらした。これは、CTX-965b、CTX-969、又はCTX-970 CARコンストラクトで作製されたT細胞にも当てはまった。しかしながら、CARコンストラクトで作製された全てのT細胞がCAR発現を有したというわけではなかった。例えば、CTX-964、CTX-964b、CTX-965、CTX 970b、又はCTX-969b CARコンストラクトで作製されたT細胞は、対照と比較してCAR発現T細胞の増加を実証しなかった(表8;図1A及び図1B)。驚くべきことに、所与のscFvを有するCAR T細胞に関して、使用される共刺激ドメイン(例えば、41BBに対してCD28)は、CAR発現について陽性であったT細胞のパーセンテージに影響を及ぼした。例えば、CTX-965b及びCTX-965 CARコンストラクトは同じscFvを有したが、4-1BB共刺激ドメインを有したCTX-965bコンストラクトは、CD28共刺激ドメインを有したCTX-965コンストラクトより著しく多いCAR陽性細胞をもたらした(図1A)。さらに、scFvの方向づけは、CAR発現細胞の相対的な量に影響を及ぼした。例えば、CTX-964は、CTX-965と同じVH及びVLドメインで構成されているにもかかわらず、基本的にはCAR発現を有する細胞をもたらさなかった。実際に、この結果は、CAR共刺激ドメインを切り替えることによって変わらなかった(例えば、CTX-964bと比較してCTX-964)。
追加のTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞は、CTX-981、CTX-981b、CTX-982及びCTX-982bにより作製された。CARのこのセットに関して、発現は、使用される重鎖及び軽鎖又は共刺激ドメインの方向づけによって影響されるように見えなかった。代わりに、CARコンストラクトのこのセットで作製されたT細胞集団の各々は、細胞表面でのCAR発現について陽性であった高い比率の集団をもたらした(図1C)。
CAR発現について評価された12種のCARコンストラクトのうちの3種が、下の実施例における追加の分析のために選択された。
Figure 2022512882000046
遺伝子編集されたT細胞を作製するために使用されたヒトドナーにかかわらずCAR発現が達成されることを実証するため、抗CD33 CAR-T細胞は、(CTX-965b CAR T細胞と呼ばれるTRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T細胞を作製するための)上の遺伝子編集プロトコルに従って、2つの追加の一次T細胞ドナーに由来するCTX-965b CARコンストラクトを使用して作製された。エレクトロポレーションの約1週間後、細胞を、編集された細胞集団の細胞表面でのTRAC(Miltenyi Biotech,Auburn,CAからのPE-抗ヒトTCRαβ、クローンBW242/412を使用して)、β2M(BiolegendからのPE-Cy7-抗ヒトβ2M、クローン2M2を使用して)、CD4(BiolegendからのAPC-Cy7-抗ヒトCD4、クローンRPA-T4を使用して)、CD8(BiolegendからのPacific Blue-抗ヒトCD8、クローンSK1を使用して)及び抗CD33 CAR(ビオチン(AcroBiosystems)及びストレプトアビジン-APCにコンジュゲートされたCD33タンパク質を使用して)の発現レベルを評価するためにフローサイトメトリーによって分析した(図2A)。CTX-965bで編集された細胞に関して、集団の高い比率が、抗CD33 CARの発現の陽性を有し、且つTCR及びβ2Mの発現の枯渇を有した。同等のCAR発現は、ドナー供給源の両方について見られ、これはT細胞が由来するドナー供給源が異なる場合でさえ効率的な遺伝子編集が達成されることを示している。さらに、TRAC-/β2M-/CAR+細胞の細胞表面上でのCD4及びCD8のレベルが、対照細胞(TRAC+ T細胞及びTRAC-/β2M- T細胞)上でのものと同等であることが見出され、これは、CARの挿入がこれらの重要な表現型マーカーの発現を変えていないことを示している(図2A)。
以下の抗体がフローサイトメトリーのために使用された(表7)。
Figure 2022512882000047
CTX-965b CAR-T細胞は、合計で7種のT細胞ドナーから生成された。加えて、CTX-970 CAR及びCTX-982b CARを使用して、4種のT細胞ドナーからTRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-970 CAR T細胞及びCTX-982b CAR T細胞とも呼ばれる)を作製した。
CAR発現に加えて、編集されたT細胞集団は、CRISPR/Cas9による遺伝子破壊に起因するTCRαβ及びβ2Mの表面発現の枯渇を有する細胞のパーセンテージについて分析された(表8)。上記のとおり、エレクトロポレーションの約1週間後、細胞を、編集された細胞集団の細胞表面上での抗CD33 CAR発現レベルを評価するフローサイトメトリーのために処理した。TCRαβ及びβ2M発現もまた、上記のとおりの抗体で細胞を染色することによって評価された。高いパーセンテージの編集された細胞が、TCRαβ及びβ2Mの両方の表面発現の枯渇を実証した(表8)。さらに、使用されたCARコンストラクトに応じて、高いパーセンテージの編集された細胞が、抗CD33 CARの発現に関して陽性であった。これらのデータは、健常ドナーからのT細胞がCRISPR/Cas9により編集されて、TRAC及びB2M破壊並びに抗CD33 CARの発現をもたらす遺伝子挿入を生成できることを示す。
Figure 2022512882000048
驚くべきことに、且つ予想外にも、抗CD33-CARを発現する細胞の集団は、エレクトロポレーション/rAAV感染後の1週目に分析された細胞に対して、培養の2週目に増加した。この傾向は、異なるドナーから得られ且つ異なるCARコンストラクト:CTX-965b(6個のドナー)、CTX-970(4個のドナー)又はCTX-982b(3個のドナー)でトランスフェクトされたT細胞の集団に関して一致した(図2B)。
T細胞比率アッセイ。CD4+ T細胞又はCD8+ T細胞であった遺伝子編集されたT細胞の比率は、表7において列挙されるCD4+及びCD8+標識抗体を使用して、編集後の1及び2週目(すなわち、7日目及び14日目)のフローサイトメトリーによって評価された。驚くべきことに、編集された細胞集団中のCD4+細胞のパーセンテージは、編集後の1週目に対して編集後の2週目に減少した。CD4 T細胞のこの枯渇は、抗CD33 CARの発現を欠いた対照T細胞において観察されなかった(例えば:RNPなし)(図2C)。しかしながら、CAR発現T細胞に関して、経時的なCD4 T細胞のこの枯渇は、異なるCARコンストラクトで編集され、且つ異なるドナー:CTX-965b(図2C)、CTX-970(図2C)、又はCTX-982b(図2D)から得られたT細胞に関して観察された。
CD33は、活性化培養T細胞上で発現された(図4、左パネル)。さらに、より高い比率のCD4+ T細胞が、CD8+ T細胞と比較してCD33発現について陽性である(それぞれ58%対31%)。
抗CD33 CAR-T培養物中のCAR+細胞の増殖及びCD4+細胞の減少は、抗CD33 CAR-T細胞が、同じ培養物中においてCD33発現T細胞に対して反応している可能性があることを示唆する。実際に、表面CD33発現の完全な消失が、対照に対して抗CD33 CAR-T(例えば、CTX-965b)において観察され(36%の細胞が、RNPなしでトランスフェクトされたT細胞においてCD33を発現し、TRAC-B2M-培養物中で30%、CTX-965b培養物中ではほんの0.21%である)、CD33発現T細胞が抗CD33 CAR発現T細胞によって除去されることを示唆している。さらに、CD4+ T細胞がより高いレベルのCD33を発現するとすれば、それらは、CAR発現T細胞による自己反応性死滅により感受性であり得る。この自己反応性は、T細胞培養物中で経時的に観察されるCD4+ T細胞のパーセンテージの減少を説明し得る(図2C)。自己反応性死滅はまた、CAR+ T細胞を刺激し、活性化するために機能して、経時的に観察されるCAR+ T細胞の増殖をもたらし得る(図2B)。このデータに基づいて、T細胞培養物中のCD33の遺伝子破壊は、自己反応性死滅を妨げ、且つ均整のとれたCD4/CD8 CAR-T比率の維持を可能にし得る。T細胞中のCD33の遺伝子破壊は、下に示されるとおり、sgRNA配列を使用して実施され得る。
次に、CTX-965bで遺伝子編集されたT細胞はインビトロで2週間増殖されて、遺伝子編集されたT細胞が対照細胞(TRAC+ T細胞及びTRAC-/β2M- T細胞)と同程度に成長し、増殖できることを実証した。CTX-965b細胞は、対照細胞と同様に約100倍増殖した(図3)。
実施例2:抗CD33 CAR+ T細胞の機能的性能。
TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(例えば:CTX-965b CAR T細胞又はCTX-970 CAR T細胞)は、実施例1において記載されるとおりに作製された。遺伝子編集されたCAR T細胞集団は、複数のT細胞ドナーから作製された。TCR+ T細胞及びTRAC-/β2M- T細胞の集団は、対照としての使用のために同様に作製された。
トランスフェクションによる編集されたT細胞の作製の後、CAR T細胞の機能活性を、フローサイトメトリーに基づく細胞障害性アッセイを使用して検証した。CAR T細胞又は対照T細胞(TCR+ T細胞及びTCR-B2M- T細胞)は、CD33発現癌細胞株と共培養された。3種の異なるヒトAML由来細胞株(「標的細胞」と呼ばれる)が試験された:THP-1(ATCC TIB-202)、KG-1(ATCC CCL-246)、又はMV4-11(ATCC CRL-9591)。標的細胞は、5μM efluor670(eBiosciences)で標識され、洗浄され、様々な比(0.05:1~1:1 T細胞:標的細胞)でのCTX-965b CAR T細胞(TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+)又はCTX-970 CAR T細胞(TRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+)との共培養物中においてインキュベートされた。標的細胞は、96ウェル、U底プレートにおいてウェル当たり50,000細胞で播種された。共培養物は、一晩インキュベートされた。翌日、ウェルは洗浄され、培地は、5mg/mL DAPI(Molecular Probes)の1:500希釈物を含有する200μLの培地で置き換えられた。次に、25μLのCountBrightビーズ(Life Technologies)が、各ウェルに加えられ、細胞培養物が、フローサイトメトリーによって細胞生存率について分析された(すなわち、生存細胞はDAPI染色について陰性である)。
次に、標的細胞(例えば、THP-1、KG-1又はMV4-11)の細胞溶解パーセントが、以下の式を使用して決定された:
細胞溶解パーセント=(1-((試験試料における標的細胞の総数)÷(対照試料における標的細胞の総数))X100;
式中、試験試料は、1)CTX-965b CAR T細胞;2)CTX-970 CAR T細胞;3)TRAC+ T細胞;又は4)TRAC-/β2M- T細胞と共培養された標的細胞(例えば、THP-1細胞)であり、
対照試料は、共培養されていない単独の標的細胞であった。
CTX-965b CAR T細胞は、試験されたCTX-965b T細胞とTHP-1細胞の全て比でTHP-1細胞を死滅させる(すなわち、細胞傷害性を誘導する)際に効果的であった(図5A)。CTX-965b CAR T細胞はまた、他のAML癌細胞(KG-1及びMV4-11)を死滅させる際に効果的であった(図5C及び図5D)。加えて、交互の抗CD33 CAR、CTX-970もまた、試験されたAML癌細胞株の全てを死滅させる際に効果的であった(図5B~図5D)。これらのデータは、本明細書に記載されるとおりの抗CD33 CAR T細胞が、CD33発現AML細胞株の強力な細胞溶解を誘導することを実証する。これらの結果は、異質遺伝子型のCAR-T細胞集団が異なるドナー供給源から生成されるときでさえ再現性がある(図5A)。
サイトカイン放出アッセイ。THP-1、KG-1又はMV4-11標的細胞の存在下でサイトカイン分泌/放出を誘導するTRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(例えば、CTX-965b CAR T細胞及びCTX-970 CAR T細胞)の機能的な能力は、対照T細胞(例えば、TCR+ T細胞及びTRAC-/β2M- T細胞)と比較して試験された。サイトカイン放出を測定するために、T細胞を標的細胞と24時間共培養した。上清培地が、製造業者の指示書(RD Systems)に従うELISAに基づくアッセイ(RD Systems)によるIFNγ又はIL-2サイトカインの測定のために回収された。CTX-965b CAR T細胞及びCTX-970 CAR T細胞は、標的細胞に対するCAR T細胞の低い比でさえ、THP-1細胞に応答して対照に対してはるかに高いレベルのIFNγを産生した(図6A~図6D)。これらの結果は、CTX-965b又はCTX-970 CARコンストラクトのいずれかを使用して導入された抗CD33 CARの発現が、CD33発現標的細胞の存在下でT細胞に対するエフェクター機能を与えることを示す。
サイトカイン依存性。遺伝子編集が、制御されない細胞増殖などの有害な特性を有する細胞を生成し得る望まれないオフターゲット編集をもたらしたかどうかを判定するため、サイトカイン及び/又は血清の非存在下で増殖するTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+細胞の能力が評価された。1×106個のTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞は、遺伝子編集のおよそ2週間後の0日目に蒔かれた。生存細胞の数は、完全培地、サイトカイン(IL-2及びIL-7)を伴わない5%ヒト血清、又は血清及びサイトカインを欠く基本培地のいずれかにおいて蒔いた7日、14日及び21日後に数え上げられた。2種のドナーから作製されたTRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+ T細胞が試験された。サイトカインを欠いた培地において蒔かれたとき、細胞増殖は14日目又は21日目に検出されなかったが、これは、ゲノム編集によるいずれかの潜在的なオフターゲット作用が、細胞に対して増殖因子非依存性の増殖活性を誘導しなかったことを示唆している。細胞は、図6Eにおいて示されるとおり、サイトカインの存在下(サイトカインを含有する完全培地)でのみ増殖し、血清単独の存在下では増殖しなかった。したがって、インビボでは、サイトカイン、増殖因子又は抗原刺激の非存在下では、任意のオフターゲットゲノム編集のために、TRAC-/β2M-/抗CD33 CAR+細胞は増殖することが期待されない。
実施例3:NOGマウスのAML異種移植モデルにおけるTRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T細胞の有効性。
CRISPR/Cas9及びAAV6を、上のとおりに使用して(例えば、実施例1を参照のこと)、TRAC座位に挿入されたCD33を標的化するCARコンストラクト(CTX-965b;配列番号56(核酸);配列番号104(アミノ酸))の同時の発現を伴ってTCR及びβ2Mの発現を欠いたヒトT細胞を作製した。活性化T細胞はまず、TRACを標的化するsgRNA(配列番号28)を含有する一方及びβ2Mを標的化するsgRNA(配列番号30)を含有する他方の2種の異なるCas9:sgRNA RNP複合体により電気穿孔された。TRAC座位でのDNA二重鎖切断は、キメラ抗原受容体カセット(遺伝子発現に関する-/+調節エレメント)に隣接するTRAC座位に対して右及び左の相同性アームを含有するAAV6で送達されるDNA鋳型(配列番号55)(配列番号104のアミノ酸配列を含む抗CD33 CAR CTX-965bをコードする)による相同組換え修復によって修復された。得られた改変T細胞は、2X KO(TRAC-/β2M-)、抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b T細胞)である。
小型腫瘍モデルにおける治療
CD33+癌細胞株によって引き起こされる疾患を回復させる改変された抗CD33 CAR+ T細胞(2X KO(TRAC-/β2M-)、抗CD33 CAR+ T細胞)の能力は、Translational Drug Development,LLC(Scottsdale,AZ)によって利用される方法を使用して、NOGマウスにおいて評価された。簡潔には、12頭の5~8週齢雌、CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)マウスは、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育され、試験の開始前の5~7日間病原体を含まない条件下で維持された。マウスは、右後側腹部において5×106個のTHP-1、ヒトAML由来細胞/マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、25~75mm3(約50mm3の標的)に達した後、マウスはさらに、表9に示されるとおりの3つの治療群に分けられた。1日目、治療群2及び3は、表9に従って、単回の200μlの静注投与量の抗CD33 CAR+ T細胞(CTX-965b T細胞)を受容した。
Figure 2022512882000049
腫瘍体積は、治療開始日から始めて週に3回測定された。5日目までに、抗CD33 CAR+ T細胞で治療された全ての動物(治療群2及び3)が、腫瘍体積の減少を示し始めた。6~8日目までに、抗CD33 CAR T細胞で治療された動物(治療群2及び3)は、治療されなかった動物(治療群1)と比較して腫瘍成長の有意な低減を実証した(図7)。これらのデータは、異質遺伝子型の抗CD33 CAR+ T細胞が、インビボでCD33+ AMLの成長及び増殖を迅速且つ効率的に低減できることを実証している。異質遺伝子型の抗CD33 CAR+ T細胞による治療に起因するCD33+ AML腫瘍の完全な退縮が、試験の期間中に達成され、持続された。群2に関して、全てのマウスは22日目に、群3に関しては24日目に0mm3の腫瘍を有した。
大型腫瘍モデルにおける治療
CD33+癌細胞株によって引き起こされる大型腫瘍を縮小する改変された抗CD33 CAR+ T細胞(2X KO(TRAC-/β2M-)、抗CD33 CAR+ T細胞)の能力は、Translational Drug Development,LLC(Scottsdale,AZ)によって利用される方法を使用して、NOGマウスにおいて評価された。簡潔には、12頭の5~8週齢雌マウス、CIEA NOG(NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Sug/JicTac)は、換気されたマイクロアイソレーターケージにおいて個別に飼育され、試験の開始前の5~7日間病原体を含まない条件下で維持された。マウスは、5x106個のTHP-1、ヒトAML由来細胞/マウスの皮下接種を受けた。平均腫瘍サイズが、125~175mm3(約150mm3の標的)に達した後、マウスはさらに、表9に示されるとおりの3つの治療群に分けられた。
1日目、治療群2及び3は、表9に従って、単回の静注投与量の抗CD33 CAR+ T細胞を受容した。腫瘍体積は、治療開始日から始めて週に3回測定された。5日目までに、抗CD33 CAR+ T細胞で治療された全てのマウス(治療群2及び3)が、腫瘍体積の最初の減少を示し始めた(図8)。この減少は、試験の30日目までの間、中程度の用量のCAR-T細胞を受容する動物の大部分において持続された。腫瘍成長は、高用量の抗CD33 CAR+ T細胞を受容した群3において実質的に遅延された。実際に、高用量の抗CD33 CAR T細胞を受容した5頭の動物のうちの2頭が、CAR+ T細胞の投与から観察期間の最後(73日目)までほとんど又は全く腫瘍成長を示さなかった。特に、ある動物は、73日目に157mm3の低い腫瘍体積を有し、別の動物は、43日目までに腫瘍の完全な消失を示し、これは観察期間の最後(73日目)まで続いた。これらのデータは、異質遺伝子型の抗CD33 CAR+ T細胞が、インビボでの大型のCD33+ AML腫瘍の成長及び増殖を著しく阻害できるか又は低減できることを実証している。
実施例4:CD33遺伝子編集のためのgRNAの設計。
この実施例は、抗CD33 CAR+ T細胞において自己反応性のリスクを排除するためのCRISPR/Cas9遺伝子編集を使用したエクスビボでの一次ヒトT細胞におけるCD33遺伝子の効率的な編集を記載する。CD33遺伝子の最初の2つのタンパク質コードエクソン(エクソン2及び3)を含有するCD33遺伝子のゲノムセグメントが、gRNA設計ソフトウェアへの入力として使用された。所望のgRNAは、コード配列における挿入又は欠失を導入し、それにより遺伝子発現を損なうアウト・オブ・フレーム変異又は未成熟終止コドンを生成することになる(すなわち、「CD33ノックアウト」と呼ばれるアウト・オブ・フレーム/機能喪失型アレルを与える)ものであった。CD33遺伝子を標的化する10個のインシリコで同定されたgRNAスペーサー配列は、予測された低リスクのオフターゲット遺伝子編集に基づいて選択された(配列番号132~141)。gRNAは、表10において示されるとおりに合成され、特異的に修飾された。表10におけるgRNAは2’-O-メチルホスホロチオエート修飾で修飾されたが、未修飾gRNA、又は他の修飾を有するgRNAが使用されてもよい。
Figure 2022512882000050
Figure 2022512882000051
Figure 2022512882000052
一次ヒトT細胞は、Cas9ヌクレアーゼ及びCD33遺伝子を標的化する合成的に修飾されたsgRNA(表10の配列)を含有するリボ核タンパク質粒子(RNP)又は対照(Cas9なし、gRNAなし)でトランスフェクト(電気穿孔)された。トランスフェクションの4~6日後、細胞は、細胞表面でのCD33発現レベルを評価するためにフローサイトメトリー(一次抗体:抗ヒトCD33抗体、Biolegend cat#366608)によって処理された。試験されたgRNAの一部に関して、T細胞のほとんど全てが、遺伝子破壊を意味する表面CD33発現の消失を有した(すなわち、CD33陰性)(例えば、図9に示されるとおりのCTX33-2、CTX33-5、及びCTX33-10)。
3種のgRNAはさらに、表11に示されるとおり、TIDE分析によって試験された。これらのうちの2種のgRNAは、高い効率の編集を達成し、97%を超える編集頻度を有した。
Figure 2022512882000053
最初の実験は、最高の%インデル及びタンパク質発現の%ノックダウンを示すガイドを使用して実施された。
T細胞におけるオフターゲット及びオンターゲットプロファイルの分析。
表12のCD33 gRNAの相同性依存的評価は、CD33-2(配列番号165)が、88%の平均オンターゲットインデル頻度を有し、0.2%より高いインデル頻度を有するオフターゲット部位を有しないことを示した。対照的に、90%を超える高い平均オンターゲットインデル頻度を有する他のCD33 gRNA(例えば、CD33-5、CD33-8及びCD33-10)は、>1%の複数のオフターゲットインデルを生成し、優先順位が下げられた。分析は、次世代シークエンシングと合わせたハイブリッドキャプチャにより履行され、表12に列挙される10種のガイドの各々で編集されたT細胞遺伝子を起点とした。編集された細胞の2つの細胞集団は、2つの異なるドナーT細胞(1及び2と呼ばれる)から作製され、このアッセイのために使用された。オフターゲットデータは、さらなる分析のための特定のCD33 gRNA(CD33-2)の選択を導いた。
Figure 2022512882000054
T細胞におけるオンターゲットインデルプロファイルの分析。
オフターゲット編集を定量化するために使用されるデータは、表12に列挙される全てのCD33ガイドに関して最も多いオンターゲットインデルを定量化し、要約するためにも使用された。このデータは、2種のドナー(1及び2と呼ばれる)における次世代シークエンシングと合わせたCD33座位のハイブリッドキャプチャから作成された。
遺伝子編集に続いて、CD33- T細胞を生成するCRISPR/Cas9遺伝子編集後のT細胞の集団におけるCD33座位のハイブリッドキャプチャ分析は、特定のインデル頻度をもたらし、CD33座位で編集された遺伝子配列をもたらす(表13~22;ダッシュが欠失及び太字が挿入)。
ハイブリッドキャプチャデータから個々の配列を定量化するために、切断部位の20bp上流及び下流のCD33オンターゲット部位にわたって整列する配列リードが、インデル配列定量化のために選択され、検討された。選択されたリードから、各推定上の切断部位の10bp上流及び下流以内にある配列(PAMの約3bp上流(Jinek,et al.,Science 2012)は、オンターゲット非相同末端連結(NHEJ)編集の代表的な領域として定量化された。これらのオンターゲット遺伝子編集された配列のデータは、下の表において提示され、これらの配列の頻度は、各切断部位の20bp上流及び下流以内のオンターゲット部位に及ぶ全ての配列のパーセントを表す。各ガイドのインデルは、表13~22におけるオンターゲット参照配列に対して示される。参照配列は、いずれかの方向において10bpを伴い、PAMの3’の4bpで終わる切断部位の中央に置かれる。
Figure 2022512882000055
Figure 2022512882000056
Figure 2022512882000057
Figure 2022512882000058
Figure 2022512882000059
Figure 2022512882000060
Figure 2022512882000061
Figure 2022512882000062
Figure 2022512882000063
Figure 2022512882000064
Figure 2022512882000065
Figure 2022512882000066
実施例5.CAR発現及びCD33ノックアウトを有するCD4/CD8細胞集団の安定化
この実施例は、エクスビボでCRISPR/Cas9遺伝子編集を使用して一次ヒトT細胞においてCD33遺伝子を編集する驚くほど有利な効果を記載する。CRISPR/Cas9及びAAV6を、上のとおりに使用して(例えば、実施例1~3を参照のこと)、CD33を標的化するCARコンストラクトを使用してTRAC座位からの同時の発現を伴ってTCR、β2M及びCD33の発現を欠いたヒトT細胞を作製した。
活性化T細胞はまず、TRAC座位を標的化するsgRNA(配列番号28)を含有するもの、β2M座位を標的化するsgRNA(配列番号30)を含有する第2のもの及びCD33を標的化するsgRNA(CD33-10:配列番号151)を含有する第3のものである3種の異なるCas9:sgRNA RNP複合体により電気穿孔された。TRAC座位でのDNA二重鎖切断は、AAV6で送達されるDNA鋳型(例えば、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118)(配列番号101、102、103、104、105、106、107、108、111、114、117、120のアミノ酸配列を含む抗CD33 CARをコードする)による相同組換え修復によって修復された。抗CD33 CARコンストラクトは、キメラ抗原受容体カセット(遺伝子発現のための-/+調節エレメント)に隣接したTRAC座位に対応する右及び左相同性アームで構成された。得られた改変T細胞は、3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)、抗CD33 CAR+ T細胞である。3X KO抗CD33 CAR T細胞は、上記のとおりに作製された2X KO(TRAC-/β2M-)、抗CD33 CAR T細胞に対して比較された。
抗CD33 CAR発現及びCD4/CD8細胞集団は、実施例2において記載されるとおりに評価された。
実施例1において記載されるとおり、TRAC-/B2M-/CAR+(2X KO、CAR+)編集されたT細胞は、CAR+であった細胞の経時的なパーセンテージの増加を実証した(図2B)。CD33をノックアウトすることがCAR+ T細胞集団を安定化することになるかどうかを評価するため、T細胞は、6種の異なるCARコンストラクト(CTX-981、CTX-981b、CTX-982、CTX-982b、CTX-970、CTX-965b)で編集され、CAR発現を安定化するCD33 KOの能力について評価された。図10は、CAR発現に関して陽性である細胞のパーセンテージが、2X KO(TRAC-/β2M-)及び抗CD33 CARで編集されたT細胞について7~14日の間に増加した。しかしながら、3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)及び抗CD33 CARで編集されたT細胞に関して、CAR発現細胞のパーセンテージにおけるそのような増加は、7~14日の間に観察されなかった。
試験は、3種の異なる一次T細胞ドナーから作製された抗CD33 CAR T細胞で繰り返された。2X KO、抗CD33 CAR T細胞(CTX-965b、CTX-970及びCTX-982b)は、3X KO、抗CD33 CAR+(TRAC-/β2M-/CD33-/CAR+)T細胞において観察されなかった7日~14日の間にCAR+である細胞の比率において増加を再び示した(図11)。代わりに、3KO CAR+ T細胞は、7日目及び14日目に同様のレベルのCAR発現細胞を維持した。
これらの結果は、抗CD33 CARを発現するように編集されたT細胞においてCD33遺伝子をノックアウトすることが、CAR+である編集された細胞の部分の拡大を妨げることを実証している。編集されたT細胞集団におけるCAR発現細胞のこの安定化は、再現性のあるCAR T細胞製品の作製を可能にする。
CD4及びCD8 T細胞の比率はCD33ノックアウトで安定化される。
以前に、2X KO(TRAC-/β2M-)及び抗CD33 CAR+になるように編集されたT細胞は、7~14日の間にCD4+ T細胞の比率の減少及びCD8+ T細胞の比率の増加を示した(図2C)。CD4及びCD8細胞の比に対する経時的なCD33ノックアウトの効果を判定するため、3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)、抗CD33 CAR+ T細胞が、7日目及び14日目にフローサイトメトリーによって評価された。CD4+及びCD8+ T細胞の比率は、異なるCARコンストラクト(CTX-981、CTX-981b、CTX-982、CTX-982b、CTX-970、CTX-965b)で編集された細胞について決定された。同じ測定が、2X KO(TRAC-/β2M-)及び抗CD33 CAR+になるように編集されたT細胞について実施された。CD4+ T細胞の増加及びCD8+細胞の減少は、7~14日の間に2X KO CAR+ T細胞について再び観察されたが、そのような変化は、3X KO CAR+ T細胞については観察されなかった(図12)。特に、CTX-982b、CTX-970、又はCTX-965b CARコンストラクトで編集された3X KO CAR+ T細胞は、CD4+であり、且つCD8+であった細胞の比率において変化をほとんど示さなかった。これらのデータは、CD33をノックアウトすることが、編集されたT細胞集団においてCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の比を経時的に安定化することを実証している。
3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)、抗CD33 CAR+ T細胞による標的細胞の死滅及びサイトカイン分泌
癌細胞を死滅させる2X KO(TRAC-/B2M-)CAR+ T細胞の能力は、上の実施例2において記載されるとおりに評価された。同様に、CD33+腫瘍細胞を消失させる3X KO(TRAC-/B2M-/CD33-)CAR+ T細胞の能力が判定された。これは、上記のとおりになされ、CAR+ T細胞は、CD33発現AML細胞株MV4-11(ATCC CRL-9591)と共培養された。2X KO CAR+ T細胞及び3X KO CAR+ T細胞の直接的な比較が実施された。それぞれの場合において、T細胞は2種の異なるヒトドナーから作製され、CARコンストラクトCTX-965b、CTX-970又はCTX-982で編集された。T細胞は、0.05:1~1:1のCAR T細胞と標的細胞の比でMV4-11細胞とともにインキュベートされ、MV4-11細胞間の細胞溶解のパーセンテージは、上記のとおりに決定された。2X KO CAR+ T細胞及び3X KO CAR+ T細胞の両方が、低いCAR T細胞:標的細胞比でさえMV4-11細胞の効率的な死滅を実証した(図13)。この結果は、異なるドナーから作製されたT細胞に関して一致した。ドナーにかかわらず、2X KO及び3X KO CAR+ T細胞の両方は、1:1比で播種されたときにほぼ完全な標的細胞の死滅を達成した。
標的細胞の存在下でサイトカイン分泌を誘導するTRAC-/B2M-/抗CD33 CAR+ T細胞(例えば:CTX-965b CAR T細胞及びCTX-970 CAR T細胞)の機能的な能力は、実施例2において記載される手順に従って評価された。サイトカイン放出を測定するため、3X KO CAR+ T細胞は、0.05:1~1:1の範囲の抗CD33 CAR-TとMV411の比でCD33発現MV4-11標的細胞とともに24時間共培養された。上清培地が回収され、上清中に存在するサイトカイン(例えば、IFNγ及びIL-2)が、製造業者の指示書(RD Systems)に従ってIFNγ又はIL-2 ELISAアッセイ(RD Systems)を使用して定量化された。3X KO CAR+ T細胞によるサイトカイン産生は、2X KO(TRAC-/β2M-)、CAR+ T細胞及び対照T細胞(例えば、TRAC+ T細胞及びTRAC-/β2M- T細胞)によるサイトカイン産生と比較された。IFNγ産生の定量化は、3X KO CAR+ T細胞が、対照T細胞と比較して高いレベルのIFNγを誘導し、且つ試験された各CARコンストラクトに関して2X KO CAR+ T細胞に対して同等のレベルのIFNγ産生を誘導することを示した(図14)。したがって、CD33ノックアウトは、IFNγを分泌するCAR+ T細胞の能力を変えるようには見えなかった。同様に、標的細胞刺激に応答してIL-2を産生するCAR+ T細胞の能力が評価された。IL-2産生のレベルは、T細胞を作製するために使用されるCARコンストラクトに依存した。CTX-965b CARで作製された抗CD33 CAR+ T細胞は、対照T細胞に対して高いレベルのIL-2を産生したが、CTX-970又はCTX-982b CARコンストラクトを使用して作製されたものは、対照T細胞よりほんのわずかに高いレベルのIL-2を産生した(図15)。CTX-970又はCTX-982b CARコンストラクトで作製されたT細胞について観察された低いIL-2産生は、2X KO CAR+ T細胞及び3X KO CAR+ T細胞の両方について観察されたが、これはCD33ノックアウトがIL-2産生をレスキューしなかったことを示している。しかしながら、CTX-965b CARで作製されたT細胞に関して、3X KO(TRAC-/β2M-/CD33-)を有したT細胞は、2X KO(TRAC-/β2M-)のみを有したT細胞より高いレベルのIL-2を産生した。
実施例6.抗CD33 CAR+ T細胞の選択性。
この実施例は、CD33欠損癌細胞株の作製及びCD33発現標的細胞の選択的な死滅を達成する遺伝子編集されたCAR+ T細胞の能力を評価するためのこの細胞株の使用を記載する。
CD33 KO MV4-11 AML細胞株の作製
CD33欠損癌細胞株を作製するため、MV4-11細胞は、Cas9:CD33を標的化するsgRNA(CD33-10;配列番号151)で電気穿孔された。細胞は、ウェル当たり約1細胞で蒔かれ、3週間増殖させられた。次に、いくつかのクローン株は、フローサイトメトリー及び抗CD33抗体(PE-抗ヒトCD33、Biolegend カタログ#366608)を使用してCD33表面発現について試験され、野生型MV4-11(WT MV4-11)は高いレベルの表面CD33を有したが、1つの特定のクローン株は、バックグラウンドを超えるCD33染色を示さなかった。次に、このクローン株(CD33 KO MV4-11細胞と呼ばれる)を使用して、抗CD33 CAR+ T細胞によるCD33選択的死滅を評価した。
抗CD33 CAR+ T細胞による選択的な死滅は、WT MV4-11又はCD33 KO MV4-11の存在下での標的細胞溶解及びサイトカイン産生を測定することによって評価された。選択的であると定義されたCAR+ T細胞は、CD33発現WT MV4-11細胞の存在下で細胞溶解及びサイトカイン産生を誘導したが、CD33 KO MV4-11の存在下で応答を呈しなかったものであった。この結果は、抗CD33 CAR+ T細胞が、細胞の死滅を媒介するために標的細胞の表面上のCD33抗原の認識を必要とすることを示している。選択的死滅は、実施例2において記載されるとおりに標的細胞溶解及びCAR+ T細胞サイトカイン産生を測定することによって評価された。選択性は、3種の異なるCARコンストラクト(CTX-965b、CTX-970、及びCTX-982b)で作製されたCAR+ T細胞並びに2X KO CAR+ T細胞及び3X KO CAR+ T細胞の両方について測定された。したがって、6種のCAR+ T細胞が、1:1のCAR+ T細胞:標的細胞比でWT MV4-11又はCD33 KO MV4-11細胞のいずれかとともに24時間共培養されたときの選択的な標的細胞溶解及びサイトカイン産生について評価された。評価されたCAR+ T細胞は、以下のとおりである:
Figure 2022512882000067
2X KO CAR+ T細胞及び3X KO CAR+ T細胞の両方が、WT MV4-11標的細胞のほぼ完全な死滅を達成した(図16、左パネル)。対照的に、WT MV4-11の死滅は、対照群(例えば、MV4-11単独又はRNP T細胞、TRAC-/B2M- T細胞、若しくはTRAC-/B2M-/CD33- T細胞を伴わずに共培養されたMV4-11)に関しては見られなかった。CD33 KO MV4-11細胞を死滅させるCAR+ T細胞の能力もまた評価された。CTX-965b CAR又はCTX-970 CARにより作製されたCAR+ T細胞は、対照群と比較して無視できるレベル~低レベルの細胞の死滅を誘導した(図16、右パネル)。これは、2X KO CAR+及び3X KO CAR+ T細胞の両方に当てはまった。対照的に、CTX-982b CARにより作製された2X KO CAR+及び3X KO CAR+ T細胞の両方が、60%より高いレベルでCD33 KO MV4-11細胞の死滅を誘導した。合わせると、これらの結果は、CTX-965b又はCTX-970 CARにより作製された2X KO又は3X KO抗CD33 CAR+ T細胞が、CD33発現標的細胞を死滅させるのに選択的であるが、CAR-982bにより作製されたT細胞は、非選択的であり、且つCD33発現において欠損のある細胞(すなわち、オフターゲット細胞)の望ましくない死滅を誘導することを示す。
CTX-965b CAR又はCTX-970 CARを発現するCAR+ T細胞による選択的な死滅が、癌細胞に対するCAR+ T細胞の高い比で維持されるかどうかを判定するため、様々な比が評価された。CAR+ T細胞は、0.25:1~2:1の範囲の比でCD33 KO MV4-11細胞とともに共培養された。CTX-965 CAR又はCTX-970 CARにより作製されたCAR+ T細胞が、試験された最も高い比でさえ低いレベル又は無視できるレベルの細胞溶解を示した一方で、CTX-982b CARにより作製されたCAR+ T細胞は、試験された全ての比で高いレベルの細胞の死滅を誘導した(図17)。これらの結果は、CTX-965又はCTX-970 CAR T細胞が、癌細胞に対して高い存在比で培養されたときでさえ選択的であるが、CTX-982b CAR T細胞は、試験されたいずれの播種比でも選択的ではないことを実証している。
選択性の追加の尺度を提供するために、CD33 KO MV4-11細胞の存在下でのCAR+ T細胞によるサイトカイン産生が評価された。CAR+ T細胞が標的細胞上の抗原の認識時にサイトカインを産生するとすれば、選択的なCAR+ T細胞は、CAR特異的抗原を発現する標的細胞が存在するときにサイトカインを専ら産生することが予想される。CTX-965 CAR又はCTX-970 CARを有するCAR+ T細胞が、CD33発現標的細胞の溶解を誘導するのに選択的であったとすれば(図16)、同様に、それらはCD33欠損細胞の存在下ではなくCD33発現標的細胞の存在下でサイトカインを専ら産生することになると予想された。これがその場合であったかどうかを判定するため、CAR+ T細胞は、CD33 KO MV4-11細胞と共培養され、上清中のIL-2及びIFNγが、実施例2において記載されるとおりにELISAによって測定された。興味深いことに、CD33 KO MV4-11細胞と共培養したとき、いずれのCAR+ T細胞もIL-2を産生しなかった(図18、左パネル)。これは、上記のとおりに非選択的キラーとして同定されたCTX-982b CAR T細胞に関してさえ当てはまった。しかしながら、CTX-982b CAR T細胞は、CD33 KO MV4-11細胞とインキュベートしたときに有意なレベルのIFNγを誘導した(図18、右パネル)。これは、CTX-982b CARにより作製された2X KO CAR+及び3X KO CAR+ T細胞の両方に当てはまった。対照的に、CTX-965又はCTX-970 CARにより作製された2X KO CAR+及び3X KO CAR+ T細胞は、CD33 KO MV4-11細胞とインキュベートされたときにIFNγを誘導しなかった。CD33欠損細胞の存在下でのIFNγ産生のこれらの相違は、CTX-982b CARにより作製されたCAR+ T細胞が非選択的である一方で、CTX-965又はCTX-970 CARにより作製されたCAR+ T細胞は、CD33発現標的細胞又は癌細胞の存在下でのみ選択的な活性化及び死滅を達成できるという結論を実証している。
実施例7.インビボでの抗CD33 CAR T細胞の効果。
この実施例は、急性骨髄性白血病(AML)の動物モデル(MV-4-11 NSGモデル)における抗CD33 CAR+ T細胞の治療効果を評価するために実施された試験を記載する。
MV-4-11ヒトAML由来細胞株は、インビボイメージング試験のためにルシフェラーゼ及びmCherry(MV-4-11-Luc-mCh-Puro)遺伝子の両方を発現するように作製された。生物発光イメージング(BLI)は、腫瘍量に相関し、したがって、BLIは、腫瘍量を評価するために定量化された。BLIを測定するため、IVIS S5 Lumina(Perkin Elmer)を使用してルシフェラーゼを測定する前にマウスにルシフェリンを注射した。0日目において、MV-4-11-Luc-mCh-Puro細胞を、5~6週齢雌NSGマウス(The Jackson Laboratory)(2×106細胞/マウス)に注射した。抗CD33 CAR-T細胞(CTX-965b)は、MV-4-11 NSGモデルにおいて3種の用量(1.5×106細胞/マウス、3.0×106細胞/マウス、及び6.0×106細胞/マウス)で試験された。抗CD33 CAR-T細胞(CTX-965b)は、5日目にマウスに注射された。臨床所見及び体重測定は、2~4日毎に実施され、BLIは、週に1回測定された。
3種全ての用量は、未治療のマウスに対して腫瘍量を減少させ(図19A)、腫瘍成長の開始を遅らせ、且つマウスの生存の増加をもたらした(図19B及び表23)。
Figure 2022512882000068
追加の試験を実施して、AMLのMV-4-11 NSGマウスモデルにおいてCD33遺伝子(ガイドCD33-2)のノックアウトを有するか又は有しない抗CD33 CAR+ T細胞の治療効果を評価した。これらの試験において、マウスに、3×106細胞/マウスの用量でCD33遺伝子のノックアウトを有するか若しくは有しないCTX-965b又はCTX-970を注射した。各治療群におけるマウスは、未治療の対照群におけるマウスと比較して生存の増加を示した(図19C~19D及び表24)。
Figure 2022512882000069
CD33ノックアウトを有するか又は有しないCTX-965b CAR+ T細胞は、CTX-970群のものと比較して、CTX-965b群に関して33日目に検出されたより低い発光測定値によって示されるとおり、腫瘍量制御の点でより効果的であるように見えた(図19E及び表25)。
Figure 2022512882000070
まとめると、これらの結果は、抗CD33 CAR+ T細胞が、AMLのマウスモデルにおいて治療効果を有することを実証している。そのような治療効果は、CD33遺伝子のノックアウトを有するか又は有しない抗CD33 CAR+ T細胞によってもたらされた。
均等物
本明細書で開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含する場合がある。
本明細書及び特許請求の範囲において使用される不定冠詞「a」及び「an」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも1つ」を意味するものと理解されるべきである。
また、反対に明確に示されない限り、2つ以上の工程又は行為を含む本明細書で請求される任意の方法において、方法の工程又は行為の順序は、必ずしも方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことが理解されるべきである。
特許請求の範囲及び上記明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「保有する」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などの全ての移行句は、オープンエンド、すなわち、以下を含むがこれらに限定されないことを意味するものと理解される。「からなる」及び「本質的にからなる」という移行句のみが、United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures 2111.03に規定されるとおり、それぞれクローズド又はセミクローズド移行句となるものとする。
数値に先行する「約」及び「実質的に」という用語は、列挙された数値の±10%を意味する。
値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限の間の各値は、本明細書において具体的に企図され、記載される。

Claims (89)

  1. キメラ抗原受容体(CAR)をコードする核酸を含む操作されたT細胞であって、前記CARが、CD33に特異的に結合する外部ドメインを含む操作されたT細胞。
  2. 破壊されたT細胞受容体アルファ鎖定常領域(TRAC)遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の操作されたT細胞。
  3. 前記CARをコードする前記核酸が、前記TRAC遺伝子に挿入される、請求項2に記載の操作されたT細胞。
  4. 破壊されたベータ-2-ミクログロブリン(β2M)遺伝子をさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  5. 前記CARの前記外部ドメインが、抗CD33抗体を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  6. 前記抗CD33抗体が、抗CD33一本鎖可変断片(scFv)である、請求項5に記載の操作されたT細胞。
  7. 前記抗CD33 scFvが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン(VH)相補性決定領域(CDR)及び同じ軽鎖可変ドメイン(VL)CDRを含み、前記参照抗体が、
    (i)配列番号65に記載されるVH及び配列番号66に記載されるVL、
    (ii)配列番号77に記載されるVH及び配列番号78に記載されるVL、又は
    (iii)配列番号89に記載されるVH及び配列番号90に記載されるVL
    を含む、請求項6に記載の操作されたT細胞。
  8. 前記抗CD33 scFvが、前記参照抗体と同じVH及びVL鎖を含む、請求項7に記載の操作されたT細胞。
  9. 前記抗CD33 scFvが、配列番号73、75、85、87、97、又は99のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項7に記載の操作されたT細胞。
  10. 前記CARがさらに、CD28共刺激ドメイン又は41BB共刺激ドメインを含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  11. 前記CARがさらに、CD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、請求項10に記載の操作されたT細胞。
  12. 前記TRAC遺伝子が、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118のいずれか1つのヌクレオチド配列を含み、且つ/又は前記CARが、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116又は119のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項3~11のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  13. 前記破壊されたβ2M遺伝子が、配列番号9~14のいずれか1つから選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む、請求項4~12のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  14. 前記T細胞が、野生型CD33遺伝子を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  15. 前記T細胞がさらに、破壊されたCD33遺伝子を含む、請求項1~13のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  16. 前記破壊されたCD33遺伝子が、AGTTCATGGTACTGGTTCC(配列番号187)、AGTTCATGGTTCC(配列番号188)、AGTTCATGTACTGGTTCC(配列番号189)、AGTTCATGGTTTACTGGTTCC(配列番号190)、AGTTCC、AGTACTGGTTCC(配列番号191)、AGTTCATACTGGTTCC(配列番号192)、AGTTCATGGTATACTGGTTCC(配列番号193)、及び/又はAGTTACTGGTTCC(配列番号194)のヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の操作されたT細胞。
  17. 前記破壊されたCD33遺伝子が、AGTTCATGGTTACTGGTTCC(配列番号186)を含む断片を欠く、請求項15又は請求項16に記載の操作されたT細胞。
  18. 前記破壊されたCD33遺伝子が、AAATCCTGGCACT(配列番号300)、AAATCCCTGGCACT(配列番号301)、AAATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号302)、AAATCCTCACCCTGGCACT(配列番号304)、AAATCCTCCCCTGGCACT(配列番号305)、AAATCCTCCCTGGCACT(配列番号306)、AAATCCCCTGGCACT(配列番号307)、ACATCCTCATTCCCTGGCACT(配列番号308)、ACATCCTGGCACT(配列番号309)、AAATCCTCTCCCTGGCACT(配列番号310)、AAATCCTCATCTGGCACT(配列番号311)、AAATCCT、AAACCCTGGCACT(配列番号312)、AAATCCTCTGGCACT(配列番号313)、AAATCCCCCTGGCACT(配列番号314)、AAATCCTCACT(配列番号315)、ACATCCCTGGCACT(配列番号316)、及び/又はAAATのヌクレオチド配列を含む、請求項15に記載の操作されたT細胞。
  19. 前記破壊されたCD33遺伝子が、AAATCCTCATCCCTGGCACT(配列番号299)を含む断片を欠く、請求項18に記載の操作されたT細胞。
  20. 前記破壊されたCD33遺伝子が断片を欠き、その3’セグメントが、AAATCCTCAT(配列番号317)、AAATCCTCATCCCT(配列番号318)、AAATCCTCATCCCTGG(配列番号320)、AAATCCTCATC(配列番号322)、又はAAATCCTCATCCCTGGCA(配列番号324)のヌクレオチド配列を含む、請求項18又は請求項19に記載の操作されたT細胞。
  21. 前記破壊されたCD33遺伝子が断片を欠き、その5’セグメントが、CTCATCCCTGGCACT(配列番号323)のヌクレオチド配列を含む、請求項18~20のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  22. 請求項1~21のいずれか一項に記載の操作されたT細胞を含む操作されたT細胞の集団であって、前記集団のうちの少なくとも25%又は少なくとも50%の操作されたT細胞が、前記CARを発現する、操作されたT細胞の集団。
  23. 前記集団のうちの少なくとも70%の操作されたT細胞が、前記CARを発現する、請求項22に記載の集団。
  24. 前記集団のうちの少なくとも25%の操作されたT細胞が、インビトロ増殖の少なくとも7日後又は少なくとも14日後に前記CARを発現する、請求項22に記載の集団。
  25. 前記集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのT細胞受容体(TCR)タンパク質を発現しない、請求項22~24のいずれか一項に記載の集団。
  26. 前記集団のうちの少なくとも90%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのTCRタンパク質を発現しない、請求項25に記載の集団。
  27. 前記集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない、請求項22~26のいずれか一項に記載の集団。
  28. 前記集団のうちの少なくとも70%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのβ2Mタンパク質を発現しない、請求項27に記載の集団。
  29. 前記集団のうちの少なくとも20%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのCD33タンパク質を発現しない、請求項22~28のいずれか一項に記載の集団。
  30. 前記集団のうちの少なくとも50%の操作されたT細胞が、検出可能なレベルのCD33タンパク質を発現しない、請求項29に記載の集団。
  31. 前記集団の操作されたT細胞が、CD33を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、前記集団のうちの少なくとも10%、少なくとも25%、又は少なくとも50%の前記癌細胞の細胞溶解を誘導する、請求項22~30のいずれか一項に記載の集団。
  32. 前記集団の操作されたT細胞が、CD33を発現する癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、前記集団のうちの少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%の癌細胞の細胞溶解を誘導する、請求項31に記載の集団。
  33. 前記集団の操作されたT細胞が、癌細胞の集団とインビトロで共培養されるとき、IFNγを分泌する、請求項31又は32に記載の集団。
  34. 操作されたT細胞と癌細胞の比が、1:1~2:1である、請求項31~33のいずれか一項に記載の集団。
  35. 前記癌細胞が、白血病を含む、請求項31~34のいずれか一項に記載の集団。
  36. 前記癌細胞が、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)を含む、請求項31~34のいずれか一項に記載の集団。
  37. 請求項22~36のいずれか一項に記載の操作されたT細胞の集団を対象に投与することを含む方法。
  38. 前記対象が、ヒト対象である、請求項37に記載の方法。
  39. 前記対象が、癌を有する、請求項37又は38に記載の方法。
  40. 前記癌が、白血病、任意選択により、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)である、請求項39に記載の方法。
  41. 前記癌が、CD33を発現する癌細胞を含む、請求項39又は40に記載の方法。
  42. 操作されたT細胞の前記集団を対象に投与することが、ベースライン対照に対して癌性の腫瘍体積の減少をもたらす、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 操作されたT細胞を生成するための方法であって、
    (a)T細胞に
    (i)RNA誘導型ヌクレアーゼ、
    (ii)TRAC遺伝子を標的化するgRNA、及び
    (iii)CD33に特異的に結合する外部ドメインを含むCARをコードする核酸を含むドナー鋳型を含むベクター
    を送達すること;並びに
    (b)破壊されたTRAC遺伝子を有し且つ前記CARを発現する操作されたT細胞を生成すること
    を含む方法。
  44. 前記TRAC遺伝子を標的化する前記gRNAが、配列番号18又は配列番号19のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号40のヌクレオチド配列を標的化する、請求項43に記載の方法。
  45. 前記CARをコードする前記核酸が、前記TRAC遺伝子に対する左及び右の相同性アームと隣接する、請求項43又は44に記載の方法。
  46. 前記T細胞に前記β2M遺伝子を標的化するgRNAを送達することをさらに含む、請求項43~45のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記β2M遺伝子を標的化する前記gRNAが、配列番号20又は配列番号21のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号41のヌクレオチド配列を標的化する、請求項46に記載の方法。
  48. 前記RNA誘導型ヌクレアーゼが、Cas9ヌクレアーゼ、任意選択によりS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9ヌクレアーゼである、請求項43~47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記T細胞に前記CD33遺伝子を標的化するgRNAを送達することをさらに含む、請求項43~48のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記CD33遺伝子を標的化する前記gRNAが、表10において提供されるとおりのヌクレオチド配列を含む、請求項49に記載の方法。
  51. 前記CARの前記外部ドメインが、抗CD33抗体である、請求項43~50のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記抗CD33抗体が、抗CD33一本鎖可変断片(scFv)である、請求項51に記載の方法。
  53. 前記抗CD33 scFvが、参照抗体と同じ重鎖可変ドメイン(VH)相補性決定領域(CDR)及び同じ軽鎖可変ドメイン(VL)CDRを含み、前記参照抗体が、(i)配列番号65に記載されるVH及び配列番号66に記載されるVL、(ii)配列番号77に記載されるVH及び配列番号78に記載されるVL、又は(iii)配列番号89に記載されるVH及び配列番号90に記載されるVLを含む、請求項52に記載の方法。
  54. 前記抗CD33 scFvが、前記参照抗体と同じVH及びVL鎖を含む、請求項52に記載の方法。
  55. 前記抗CD33 scFvが、配列番号73、75、85、87、97、又は99のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項54に記載の方法。
  56. 前記CARが、CD28共刺激ドメイン又は41BB共刺激ドメインを含む、請求項43~55のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記CARがさらに、CD3ζ細胞質内シグナル伝達ドメインを含む、請求項56に記載の方法。
  58. 前記ドナー鋳型が、配列番号49、51、53、55、57、59、61、63、109、112、115、又は118のいずれか1つのヌクレオチド配列を含む、請求項43~57のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記CARが、配列番号50、52、54、56、58、60、62、64、110、113、116、又は119のいずれか1つのヌクレオチド配列によってコードされる、請求項43~58のいずれか一項に記載の方法。
  60. 癌を有する対象において腫瘍の体積を減少させるための方法であって、請求項22~36のいずれか一項に記載の操作されたT細胞の集団を前記対象に投与することを含む方法。
  61. 前記対象における前記腫瘍の前記体積が、ベースライン対照に対して少なくとも50%減少され、任意選択により、前記集団の1×105個の細胞~1×107個の細胞が投与される、請求項60に記載の方法。
  62. 操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたT細胞が、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子;
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び
    (iii)抗CD33抗原結合断片を含むCARをコードする核酸
    を含む細胞の集団。
  63. 前記CARが、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、請求項62に記載の細胞の集団。
  64. 前記破壊されたTRAC遺伝子が、前記CARをコードする前記核酸を含む、請求項62又は63に記載の細胞の集団。
  65. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項62~64のいずれか一項に記載の細胞の集団。
  66. 操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたT細胞が、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、細胞の集団。
  67. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項63に記載の細胞の集団。
  68. 操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたT細胞が、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、細胞の集団。
  69. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項68に記載の細胞の集団。
  70. 操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたT細胞が、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、前記核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104の前記CARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;及び
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、細胞の集団。
  71. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項70に記載の細胞の集団。
  72. 操作されたT細胞を含む細胞の集団であって、前記操作されたT細胞が、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、細胞の集団。
  73. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項72に記載の細胞の集団。
  74. 操作されたT細胞であって、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子;
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子;及び
    (iii)抗CD33抗原結合断片を含むCARをコードする核酸
    を含む操作されたT細胞。
  75. 前記CARが、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含む、請求項74に記載の操作されたT細胞。
  76. 前記破壊されたTRAC遺伝子が、前記CARをコードする前記核酸を含む、請求項74又は75に記載の操作されたT細胞。
  77. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項74~76のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  78. 操作されたT細胞であって、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、(a)抗CD33抗原結合断片を含む外部ドメイン、(b)CD8膜貫通ドメイン、並びに(c)41BB共刺激ドメイン及びCD3ζ共刺激ドメインを含む内部ドメインを含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む操作されたT細胞。
  79. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項75に記載の操作されたT細胞。
  80. 操作されたT細胞であって、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号104のアミノ酸配列を含むCARをコードする核酸を含む破壊されたTRAC遺伝子;並びに
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、細胞の集団。
  81. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項77に記載の操作されたT細胞。
  82. 操作されたT細胞であって、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、CARをコードする核酸を含み、前記核酸配列が、配列番号56と少なくとも90%同一であり、且つ配列番号104のCARをコードする破壊されたTRAC遺伝子;及び
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、操作されたT細胞。
  83. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項82に記載の操作されたT細胞。
  84. 操作されたT細胞であって、
    (i)破壊されたTRAC遺伝子であって、前記破壊されたTRAC遺伝子が、配列番号55の核酸配列を含む破壊されたTRAC遺伝子;及び
    (ii)破壊されたβ2M遺伝子
    を含む、操作されたT細胞。
  85. 破壊されたCD33遺伝子をさらに含む、請求項84に記載の操作されたT細胞。
  86. 前記T細胞が、ヒトT細胞である、請求項1~21及び74~85のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
  87. 対照において癌を治療する方法であって、前記対象に請求項62~73のいずれか一項に記載の細胞の集団を投与することを含む方法。
  88. 前記癌が、白血病、任意選択により、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)及び慢性骨髄性白血病(CML)である、請求項87に記載の方法。
  89. 前記癌が、CD33を発現する細胞を含む、請求項87又は88に記載の方法。
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