CN108174604B - 用于实体瘤靶向的双特异性car t细胞 - Google Patents

用于实体瘤靶向的双特异性car t细胞 Download PDF

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Abstract

本文公开了双特异性T细胞的工程化方法，所述双特异性T细胞表达用于促进效应细胞的体内扩增和活化的嵌合抗原受体以及对肿瘤上的配体具有特异性的第二嵌合抗原受体或TcR。还提供了向有需要的受试者给予携带双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法。

Description

用于实体瘤靶向的双特异性CAR T细胞
以引用的方式将任意优先权申请并入
本申请要求2015年8月7日提交的美国临时专利申请No.62/202,698的优先权，以引用的方式将其全部公开内容整体并入本文。
序列表、表格或计算机程序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表作为题为SCRI.95WO.TXT的文件而提供，创建于2016年7月26日，大小为45kb。以引用的方式将序列表的电子格式中的信息整体并入本文。
技术领域
本文所述的本发明的方面包括用于提高携带过继性转移的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞针对实体瘤的治疗效力的方法、细胞和组合物。具体而言，本文提供了针对在各个T细胞中各自共表达两种CAR的CAR-T细胞产物的方法、细胞和组合物，例如用于促进效应细胞的体内扩增和活化的B细胞靶向“驱动(driver)”CAR，以及对靶向实体瘤而言具有期望特异性的CAR或T细胞受体(TcR)(随从(passenger)CAR/TcR)。
背景技术
多种细胞疗法已被纳入用于癌症治疗的标准方法中。细胞疗法对患有癌症或疾病的患者而言是将细胞物质(如活细胞)注射至有需要的患者体内。这可包括输注多克隆或抗原特异性T细胞、淋巴因子活化杀伤细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞以及巨噬细胞。在用于癌症治疗的过继性T细胞疗法的携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的开发方面已取得了进展，这对癌症免疫疗法和病毒疗法而言是有前景的治疗途径。
CAR T细胞疗法是一种免疫疗法，其中将患者自身的T细胞在实验室中分离，进行基因操作来表达合成受体以识别特定抗原或蛋白质，并回输至患者体内。CAR可由几个结构域组成。不受限制地，CAR可具有：(1)通常源于抗体的抗原结合区；(2)将CAR锚定到T细胞内的跨膜结构域；和/或(3)1个或多个细胞内T细胞信号传导结构域。第一代CAR通常包含源自单克隆抗体(mAb)的单链可变片段(scFv)加上来自TCRζ链的信号基序。具有共刺激活化基序的第二代CAR和第三代CAR是对第一代CAR的改善，可导致携带CAR的细胞的增殖、细胞毒性和持久性(persistence)在体内增强。临床试验以不充足的活化、持久性和向癌症组织归巢显示了抗肿瘤活性的一些迹象。例如，在B细胞淋巴瘤患者中已报道了一些抗肿瘤应答，而且在一些神经母细胞瘤(neuroblastoma)患者中已报道了部分应答、疾病稳定和缓解。第二代和第三代CAR修饰的T细胞已被证明能够在临床前试验中提供CAR修饰的T细胞的增强的活化信号、增殖、细胞因子的产生以及效应功能。证明了初始临床试验表现出了一些有前景的结果。
不幸的是，免疫治疗领域无法充分解决与携带CAR的T细胞相关的问题。这些问题可包括输注细胞后发生的未达最佳标准的细胞扩增和活化以及毒性作用。随着CAR T细胞的给予可发生几种类型的毒性。输注携带CAR的T细胞后的不良反应可包括B细胞发育不良、细胞因子释放综合征(CRS)和肿瘤溶解综合征。B细胞发育不良可由于有效靶向B细胞上的抗原而发生。然而，B细胞不是维持生命型的组织，可作为CAR T细胞的起始靶标。
在机体内扩增CAR T细胞可与CRS相关联。CRS的症状可包括发热、低血压、缺氧和神经病学变化(neurologic changes)。神经病学变化可包括癫痫、失语症和精神状态变化。可发生其它临床和生化变化，例如与铁蛋白和C反应蛋白显著升高相关联的转氨酶升高(transaminitis)和/或弥散性血管内凝血，这些被发现与巨噬细胞活化综合征或噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)相似。
不良作用还可包括显示植入(engraftment)失败，这可能是由于输注的T细胞向肿瘤转移部位的有限迁移和有限的实体瘤免疫刺激活性及其免疫抑制环境。由于CAR的开发仍处于初级阶段，为了规避治疗期间出现的不良作用，CAR T细胞疗法领域的进步仍是十分需要的。
发明内容
在第一方面，提供了编码嵌合抗原受体的核酸。所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫(de-immunized)细胞外间隔区(spacer)的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3＇末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列(ribosome skip sequence)或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列是T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶(Caspase)自杀基因系统。在一些可选方式中，药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬(tamoxifen)和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
在第二方面，提供了编码嵌合抗原受体的核酸。所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ IDNO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
在第三方面，提供了编码嵌合抗原受体的核酸。所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸序列共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ IDNO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原(neoantigens)、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(glypican-2，GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白(alphafetoprotein)、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白(adipophilin)、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白(alpha-foetoprotein)、激肽释放酶4(kallikrein4)、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子(midkine)、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素(survivin)、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
在第四方面，提供了编码嵌合抗原受体的核酸。所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸序列共价连接至所述第三核酸的3＇末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
在第五方面，提供了编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
在第六方面，提供了编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第四核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第七核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第九核酸，其中所述第九核酸共价连接至所述第八核酸的3＇末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、ClqR1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：38中所示的核酸序列进行编码。
在第七方面，提供了用于表达嵌合抗原受体的载体，所述嵌合抗原受体对促进B细胞的体内扩增和活化具有特异性。所述载体可包含本文所述的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：14中所示的核酸序列进行编码。所述前导序列可包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体可为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
在第八方面，提供了用于表达对靶向实体瘤具有特异性的嵌合抗原受体或TcR的载体。所述载体可包含本文所述的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸序列共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3＇末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸序列共价连接至所述第三核酸的3＇末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUCSAC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ IDNO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ IDNO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体可为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
在第九方面，提供了用于表达双特异性嵌合抗原受体的载体。所述双特异性嵌合抗原受体对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性并且对细胞表面肿瘤特异性分子也具有特异性。所述载体可包含本文所述的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5＇末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第四核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第七核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第九核酸，其中所述第九核酸共价连接至所述第八核酸的3＇末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ IDNO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
在第十方面，提供了由本文所述的任一可选方式中的核酸或载体编码的对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的嵌合抗原受体或TcR。所述载体可包含本文所述的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3＇末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
在第十一方面，提供了由本文所述的任一可选方式中的核酸或载体编码的对靶向实体瘤具有特异性的嵌合抗原受体或TcR。所述载体可包含本文所述的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸序列共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸序列共价连接至所述第三核酸的3＇末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
在第十二方面，提供了由本文所述的任一可选方式中的核酸或载体编码的双特异性嵌合抗原受体，所述双特异性嵌合抗原受体对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性并且对细胞表面肿瘤特异性分子也具有特异性。所述载体可包含本文所述的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第四核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第七核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第九核酸，其中所述第九核酸共价连接至所述第八核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
在第十三方面，提供了包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣(binding partner)。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，第一标记蛋白与所述第一嵌合抗原受体共表达，第二标记蛋白与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与所述第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与所述第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子(homeostatic cytokine)，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始
Figure BDA0001618722840000431
CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆(central memory)CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞(bulk CD8+ T-cells)。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞(bulk CD4+ T-cells)。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
在第十四方面，提供了包含双特异性嵌合抗原受体的细胞，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域：第一结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)；和第二结合结构域，其中所述第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF283、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对ROR1具有特异性。
在第十五方面，提供了制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法。所述方法可包括以下步骤：将包含编码第一嵌合抗原受体的多核苷酸序列的第一核酸或第一载体导入细胞中，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)；将包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的多核苷酸序列的第二核酸或第二载体导入所述细胞中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于不同的病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体和/或慢病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体作为包含所述病毒载体的组合物被共同导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统和/或mRNA载体。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达相关联，而所述第二嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达相关联；或者其中所述第一嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达相关联，而所述第二嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达相关联。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述病毒载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入包含编码自杀基因系统的序列的载体。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。
在第十六方面，提供了制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将第一载体和第二载体两种载体共同递送至细胞中，其中所述第一载体包含编码第一嵌合抗原受体的第一核酸序列，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二载体包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的第二多核苷酸序列，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒和/或微环转座子(minicircle transposon)。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为PiggyBac转座子或睡美人(Sleeping Beauty)转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。
在第十七方面，提供了制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将包含编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸序列的核酸导入细胞中，所述双特异性嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的第一结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)以及对实体瘤上的配体具有特异性的第二结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述多核苷酸位于病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体与标记蛋白共表达。在一些可选方式中，所述标记蛋白为EGFRt或Her2tg。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述病毒载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入包含编码自杀基因系统的序列的载体。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。
在第十八方面，提供了制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将载体导入细胞中，其中所述载体包含编码双特异性嵌合抗原受体的第一核酸，所述双特异性嵌合抗原受体包含第一结合结构域以及第二结合结构域，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，所述第二结合结构域包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为PiggyBac转座子或睡美人转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。
在第十九方面，提供了一种组合物，其中所述组合物包含本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞。在一些可选方式中，所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR。在一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域：第一结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)；以及第二结合结构域，其中所述第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/Fc εRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，第一标记蛋白与所述第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与所述第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与所述第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/Fc εRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，并且其中所述第二结合结构域对ROR1具有特异性。
在第二十方面，提供了在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法。所述方法可包括：鉴定用于治疗的未患有B细胞相关疾病的受试者；向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文提供的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文提供的任何可选方式中的任意一种或多种制备的细胞或本文所述的任何可选方式中的组合物。在一些可选方式中，所述方法包括：将载体导入细胞中，其中所述载体包含编码双特异性嵌合抗原受体的第一核酸，所述双特异性嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的第一结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)以及第二结合结构域，其中所述第二结合结构域包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为睡美人转座子或PiggyBac转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述组合物包含本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞。在一些可选方式中，所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR。在一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域：第一结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)；以及第二结合结构域，其中所述第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，第一标记蛋白与所述第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与所述第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与所述第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与所述第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，并且其中所述第二结合结构域对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述组合物包含本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文所述的可选方法中的任意一种或多种制备的细胞。在一些可选方式中，所述组合物包含CD8+ T细胞毒性淋巴细胞和/或CD4+ T辅助淋巴细胞，其中所述CD8+ T细胞毒性淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞，并且其中所述CD4+ T辅助淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述组合物具有的CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶10至10∶1。在一些可选方式中，CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶1。在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞相关疾病。在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴结(Nodal)边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤、炎症相关弥漫大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病中发生的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在一些可选方式中，疾病为癌症。在一些可选方式中，疾病为感染，其中所述感染为细菌性或病毒性感染。在一些可选方式中，所述癌症为实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由以下癌症组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述受试者患有顽固性和复发性神经母细胞瘤。在一些可选方式中，所述受试者经鉴定或选择以接受非B细胞相关疾病疗法、抗癌疗法、抗感染疗法、抗细菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括测量或评估对所述非B细胞相关疾病、癌症、感染、细菌性感染、病毒性感染或肿瘤的抑制。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文所述的可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文所述的可选方法中的任意一种或多种制备的细胞或本文所述的任一可选方式中的组合物之前、期间或之后，向该受试者导入、提供或给予另外的治疗剂(例如化疗剂、抗病毒剂或抗细菌剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述组合物包含本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文所述的可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞。在一些可选方式中，所述组合物包含CD8+ T细胞毒性淋巴细胞和/或CD4+ T辅助淋巴细胞，其中所述CD8+ T细胞毒性淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞，并且其中所述CD4+ T辅助淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述组合物具有的CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶10至10∶1。在一些可选方式中，CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶1。在一些可选方式中，通过过继性细胞转移将所述细胞或组合物导入、提供或给予所述受试者。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入、提供或给予诱导嵌合抗原受体或TcR表达的药物。在一些可选方式中，所述药物为类固醇。在一些可选方式中，所述药物为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述受试者为哺乳动物物种。在一些可选方式中，所述受试者为牛、羊、猪、马、狗、猫、灵长类动物或人。在一些可选方式中，所述受试者是人。在一些可选方式中，所述受试者处于小儿年龄(pediatric age)。在一些可选方式中，所述方法进一步包括对所述受试者的B细胞发育不良或细胞因子风暴的症状进行评估。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述受试者给予前药。在一些可选方式中，所述前药为爱必妥(Erbitux)、赫赛汀(Herceptin)、更昔洛韦、FK506或二聚化的化学诱导剂。在一些可选方式中，所述受试者患有顽固性和复发性神经母细胞瘤，并且其中所述方法包括给予本文所述的任一可选方式中的细胞。
附图说明
除了上述特征之外，基于对附图和示例性可选方式的以下描述，其它特征和变型将是显而易见的。应当理解的是，这些附图描绘了典型的可选方式，并不是旨在在范围方面进行限制。
图1示出了表达靶向B细胞的“驱动”嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，该“驱动”CAR与导向至肿瘤细胞的“随从”CAR共表达。
图2示出了本文可选方式中描述的CAR的主要序列的示意图。如所示出的，编码CAR的序列包含前导序列(例如用于将蛋白质靶向至细胞表面的序列)、抗原结合结构域(免疫球蛋白的可变轻链和可变重链序列以及接头)、间隔区结构域(IgG4铰链CH3区)、信号传导结构域(CD28跨膜区、4-1BB结构域、CD3ζ)、T2A核糖体跳跃序列和转导标记(EGFRt或Her2tg标记)。
图3示出了标记Her2t及其变体，基于它们各自的接头表现出对赫赛汀可变的结合亲和力。T淋巴细胞中使用的CAR是双重CD19CAR-T2A-Her2tG/CD20CAR-T2A-EGFRt。图3A)用含有Her2t变体(Her2t(CD28铰链)、Her2t(IgG4铰链)或Her2tG(gly-ser接头))的3μl慢病毒对H9T细胞进行转导。随后将转导的H9细胞培养5天，并用生物素化的赫赛汀(Herceptin-bio)和链霉亲和素缀合的第二荧光团(SA-PE)进行染色。结果表明，Her2t变体Her2tG呈现出结合赫赛汀的最优能力，Her2t(IgG4铰链)具有适中的赫赛汀结合，而Her2t(CD28铰链)具有最弱的赫赛汀结合。图3B)按照图4从PBMC分离的CD4+和CD8+原代T细胞的分离(D0)、生长(D0-21)、选择(D14和D21)以及扩增(REP-D21)的时间线。图3C)将CD8+ T细胞用两种单独的含有CD19CAR-T2A-Her2tG或CD20CAR-T2A-EGFRt的慢病毒以各慢病毒MOI＝1进行转导。在转导7天后(培养的D10)，将选择前的CD8+ T细胞用爱必妥-APC、生物素化的赫赛汀和链霉亲和素缀合的第二荧光团(SA-PE)进行染色，而选择后的细胞在S1Sp1D12进行染色(见图4)。图3D)表示细胞中蛋白质的Western印迹。在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中进行细胞裂解，用于Western印迹分析。通过BCA测定法(Pierce)对细胞裂解物进行分析，将其均匀上样到凝胶上，并且Western印迹用一抗抗CD247(CD3ζ)和二抗IRDye 800CW缀合的山羊抗小鼠抗体进行探测(LI-COR)。印迹在Odyssey红外成像系统(LI-COR)上成像。
图4示出了目的细胞S1Sp1D12的Western印迹。针对它们各自的标记对细胞进行了纯化。携带双CAR的CD8+ T细胞携带CD19CAR-T2A-Her2tG和CD20CAR-T2A-EGFRt。该western印迹特异性针对CAR的ζ部分。该western证明了CD8+ T细胞中的CAR表达。最重要地，在双转导CD8+ T细胞中证实了两种CAR(CD19CAR和CD20CAR)的表达。
图5：图5A)表明CD19-CAR T细胞和CD20-CAR T细胞针对K562靶谱细胞(panelcells)的特异性的4小时铬释放测定。以30∶1、10∶1、3.3∶1或1.1∶1的比率将CD8 Tcm与K562靶细胞进行共培养。只有双转导T细胞能够靶向所有表达抗原的K562细胞。CD19CAR-T2A-Her2t CD8 Tcm和CD19CAR-T2A-EGFRt CD8 Tcm表现出相似的裂解能力(lytic capacity)。图示为：Mock
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CD19CAR-Her2tG(方形)、CD19CAR-EGFRt(三角形)、CD20CAR-EGFRt(菱形)和CD19CAR-Her2tG/CD20CAR-EGFRt(倒三角形)。图5B)24小时细胞因子释放测定。以2∶1的T细胞∶靶细胞比率将CD8 Tcm与K562靶细胞共培养24小时，然后分析上清液中效应细胞因子的存在。相对于CD19CAR-T2A-EGFRt转导的CD8 Tcm，CD19CAR-T2A-Her2t转导的CD8Tcm产生更多样的图谱(repertoire)和更高水平的效应细胞因子。图5A和图5B中的子图相同(柱状图中从左到右：K562 CD19、K562 CD20和K562 CD19/CD20)。图5C)对于CD4 Tcm观察到相似的结果。图示为：Mock/>
Figure BDA0001618722840000592
CD19CAR-Her2tG(方形)、CD19CAR-EGFRt(三角形)、CD20CAR-EGFRt(菱形)和CD19CAR-Her2tG/CD20CAR-EGFRt(倒三角形)。
图6示出了用含有CD19靶向的CRISPR向导序列的质粒进行电穿孔的Raji细胞的实验结果。图6A)电穿孔7天后，使用CD19微珠对Raji细胞进行负向选择。耗尽CD19+细胞后，对CD19-细胞进行克隆选择并且进行扩增用于下游实验。图6B-图6C)使用来自图5的相同细胞进行的4小时铬释放测定和bioplex测定。图示为：Mock
Figure BDA0001618722840000601
CD19CAR-Her2tG(方形)、CD19CAR-EGFRt(三角形)、CD20CAR-EGFRt(菱形)和CD19CAR-Her2tG/CD20CAR-EGFRt(倒三角形)。针对Raji亲代克隆和3种Raji CRISPR克隆。图6C中以顺时针方向所示，左上图为Raji亲代、Raji CRISPR(3)、Raji CRISPR(15)和Raji CRISPR(27)。下图的结果从左到右为mock、CD19CAR-Her2tG、CD19CAR-EGFRt、CD20CAR-EGFRt和CD19CAR-Her2tG/CD20CAR-EGFRt(对于IL-2、IFN-γ和TNF-α)的结果。图6D)CD4+铬释放测定。
图7示出了注射5e6NSO-IL15细胞然后静脉内注射10e6Mock T细胞或表达CAR的T细胞的NSG小鼠的实验结果。如上面一行所示，在T细胞注射后第14天，采集小鼠骨髓并进行流式分析。上面一行门控(gate)存活的单细胞(live，singlets)。中间一行门控CD8+ x CD45+细胞。下面一行观察了CD45+细胞群以及对于标记Her2tG和EGFRt的染色。结果表明EGFRt和Her2tG可被用于有效地体内追踪T细胞。中间一行中的子图示出了针对活力细胞(viablecells)(93.6％淋巴细胞)、单个细胞(98.8％)和存活细胞(alive cells)(99.9％)进行门控的细胞。所示出的CD8和CD45染色从左至右为：Mock、CD19CAR-T2A-Her2t、CD19CAR-T2A-EGFRt Tcm和CD19CAR-Her2tg/CD20CAR-EGFRt。在活力细胞、单个细胞和存活细胞门内记录至少1×107个细胞。因此，尽管CD45+细胞代表约1％的群体，但是其相当于1×105个细胞。剩余的细胞是小鼠骨髓细胞。第三行：Her2t和EGFRt阳性T细胞的多重分选(multisort)纯化。将H9细胞(5×106亲代、Her2t+、EGFRt+或Her2t+/EGFRt+)混合在一起然后进行纯化。基于生物素化的赫赛汀和抗生物素多重分选珠对细胞进行初始纯化。然后除去多重分选珠，并且随后基于爱必妥-APC和抗APC微珠对阳性部分进行纯化。最终的阳性部分对Her2t和EGFRt而言是双重阳性的。图7D)铬释放测定。
图8示出了静脉内注射0.5e6Raji eGFP∶ffluc细胞然后以1∶1比率的CD4∶CD8注射10e6Mock T细胞或表达CAR的T细胞的NSG小鼠的实验结果。进行连续的肿瘤成像并对总通量进行作图以表现肿瘤生长或对肿瘤生长的抑制。结果表明，相对于Mock T细胞，表达单CAR或双CAR的T细胞能够抑制肿瘤生长。图示为：Mock
Figure BDA0001618722840000611
CD19CAR-Her2tG(方形)、CD19CAR-EGFRt(三角形)、CD20CAR-EGFRt(菱形)和CD19CAR-Her2tG/CD20CAR-EGFRt(倒三角形)。
图9A示出了CD4 T细胞和CD8 T细胞可用2个单独的编码CAR的慢病毒载体进行转导。CD4和CD8纯化的T细胞用CD3/CD28珠进行刺激，然后用编码第2代41BB-ζ短间隔区FMC63CD19CAR或第2代41BB-ζ短间隔区CE7CAR的临床级病毒进行共转导。每个CAR后接着读码框内(in-frame)T2A-EGFRt。转导的T细胞通过EGFRt进行纯化并在S1D14(CD4)或S1D15(CD8)进行冷冻。过程进展计划为PD0170。流式分析证明了转导的细胞基于EGFRt表达被纯化至同质。结果没有表现出在EGFRt+群体中表示出多少百分比的CD19-或CE7CAR或者T细胞是否的确被病毒双转导。
图9B示出了CD19和CE7CAR双转导的T细胞表现出针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的特异性裂解。以不同的效应细胞与靶细胞比率将Mock(CAR-)T细胞和双转导T细胞与靶细胞系共培养4小时。K562对CD19和L1CAM两个靶标而言都是阴性的。TM-LCL、TM-LCL-OKT3、K562+CD19和Raji是仅CD19阳性的。SK-N-DZ是仅L1CAM阳性的。SK-N-DZ+CD19对这两个靶标而言都是阳性的。结果表明，转导的CD8 T细胞或混合CD4∶CD8 T细胞引起高水平的CD19CAR活性。如针对SK-N-DZ细胞系所表明的，存在较低水平的CE7CAR活性。这些结果表明T细胞可用两种单独的编码CAR的病毒成功进行转导，并且所得到的T细胞群能够识别多种抗原。
图9C示出了CD19-和CE7CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的细胞因子。以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将双转导的CD4和CD8 T细胞群与靶细胞系共培养24小时。在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-g或TNF-a的存在。双转导T细胞产生应答于表达CD19的所有悬浮细胞(LCL和K562)靶标的细胞因子。即使当第二代S-间隔区CE7CAR在100％的T细胞群中表达，仍然是几乎没有或者没有应答于并不罕见的SK-N-DZ的细胞因子产生。由于不知道多少百分比的T细胞群含有CE7CAR，当与图9B中的铬数据结合时，这并不令人惊讶。
图9D示出了双转导T细胞在颅内异种移植肿瘤模型中引发抗肿瘤活性。小鼠群(cohorts of mice)用0.2e6表达GFP：ffluc、CD19t和IL-2的SK-N-DZ进行颅内接种(i.c.)(第0天)并用2e6双转导的CD4∶CD8 T细胞(1∶1比率)进行颅内接种(第7天)。对用Mock(仅PBS，左图)或双转导的CD4∶CD8 CE7CAR T细胞(中图)处理的小鼠群中的肿瘤进行连续生物发光成像。处理组和对照组的存活率的Kaplan-Meier分析(右图)。如通过生物发光成像中延长的减少所证明的，双转导细胞能够消退和控制肿瘤生长。
图10A示出了CD4和CD8 T细胞可用两种单独的编码CAR的慢病毒载体进行转导，并且双阳性细胞群可通过相关标记进行鉴定。CD4和CD8纯化的T细胞用CD3/CD28珠进行刺激，然后用编码第2代41BB-ζ短间隔区FMC63CD19CAR或/和第2代41BB-ζ长突变体(L235D、N297Q)间隔区CE7CAR的慢病毒各自进行转导或进行共转导。CD19CAR后接着读码框内T2A-Her2tG，而CE7CAR后接着T2A-EGFRt。转导的T细胞通过EGFRt(CE7CAR)进行纯化并进行冷冻。流式分析在第9天进行，证明了转导的细胞基于EGFRt表达被纯化至同质。对CD4 T细胞而言，具有～56％的Her2tG(CD19CAR)阳性，而对CD8 T细胞而言，具有～44％的双阳性。
图10B示出了CD19和CE7CAR双转导的CD8+ T细胞表现出针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的特异性裂解。以不同的效应细胞与靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或CE7CAR)和双转导CD8+ T细胞与靶细胞系共培养4小时。K562对CD19和L1CAM两个靶标而言都是阴性的。K562-OKT3被用作阳性对照。Be2为仅L1CAM阳性的。Be2+CD19t对两个靶标而言均为阳性。结果证明，单转导CD8+ T细胞引发针对其同源(cognate)抗原的特异性裂解。然而，双转导T细胞有效地识别并且裂解表达CD19、L1CAM或两种抗原的细胞。所有CD8+ T细胞都能够针对K562-OKT3引发相似水平的细胞裂解。这些结果表明T细胞可用两种单独的编码CAR的病毒成功进行转导，通过选择标记进行纯化，并且所得到的T细胞群能够识别多种抗原。
图10C示出了CD19-和CE7CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的细胞因子。以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或CE7CAR)和双转导的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞与靶细胞系共培养24小时。在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-g或TNF-a的存在。双转导细胞能够针对所有表达靶标的细胞系释放细胞因子。虽然在表达单独的CE7CAR的T细胞和表达双CAR的T细胞之间针对Be2-CD19t的细胞因子产生没有差异，但在表达CD19CAR的T细胞和双转导T细胞之间针对K562-CD19t的细胞因子产生具有差异。该数据与双转导T细胞群的CD19CAR阳性相一致。
图10D示出了双转导T细胞在颅内异种移植肿瘤模型中引发抗肿瘤活性。小鼠群用0.2e6表达GFP：ffluc和IL-2的SK-N-DZ进行颅内接种(i.c.)(第0天)并用2e6双转导的CD4∶CD8 T细胞(1∶1比率)进行颅内接种(第7天)。对用Mock(未转导的，左图)、表达CE7CAR的T细胞(上面一行，中图)或双转导的CD4∶CD8 CE7CAR T细胞(上面一行，右图)处理的小鼠群中的肿瘤进行连续生物发光成像。处理组和对照组的存活率的Kaplan-Meier分析(下图)。如通过生物发光成像中延长的减少所证明的，单表达CE7CAR细胞和双转导细胞两者均能够消退和控制肿瘤生长。由于肿瘤长出(outgrowth)，在本研究的任意终点(arbitrary endpoint)之前将用单表达CE7CAR的T细胞处理的小鼠亚群处死。这些结果说明双转导T细胞能够以与单表达CE7CAR的T细胞相似的水平在体内根除肿瘤。因此，对双转导T细胞群而言，没有抑制CE7CAR活性。
图11A示出了CD4和CD8 T细胞可用两种单独的编码CAR的慢病毒载体进行转导，并且双阳性细胞群可通过相关标记进行鉴定。CD4和CD8纯化的T细胞用CD3/CD28珠进行刺激，然后用编码第2代41BB-ζ短间隔区FMC63CD19CAR或/和第2代41BB-ζ短间隔区ROR1CAR的慢病毒各自进行转导或进行共转导。CD19CAR后接着读码框内T2A-Her2tG，而ROR1CAR后接着T2A-EGFRt。转导的T细胞通过EGFRt(ROR1CAR)进行纯化并进行冷冻。流式分析在第9天进行，证明了转导的细胞基于EGFRt表达被纯化至同质。对CD4 T细胞而言，具有～86.7％的Her2tG(CD19CAR)阳性，而对CD8 T细胞而言，具有～88.1％的双阳性。
图11B示出了CD19和ROR1CAR双转导的CD8+ T细胞表现出针对CD19或ROR1阳性靶细胞系的特异性裂解。以不同的效应细胞与靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或ROR1CAR)和双转导CD8+ T细胞与靶细胞系共培养4小时。单ROR1CAR T细胞含有第二代41BB-ζ或CD28-ζ短间隔区。K562对CD19和ROR1两个靶标而言都是阴性的。K562-OKT3被用作阳性对照。对Raji(CD19+)进行转导以表达ROR1。Be2、SK-N-AS和SK-N-DZ是ROR1阳性的。结果证明，单转导CD8+ T细胞引发针对其同源抗原的特异性裂解。然而，双转导T细胞有效地识别并且裂解表达CD19、ROR1或两种抗原(Raji ROR1)的细胞。所有CD8+ T细胞都能够针对K562-OKT3引发相似水平的细胞裂解。这些结果表明T细胞可用两种单独的编码CAR的病毒成功进行转导，通过选择标记进行纯化，并且所得到的T细胞群能够识别多种抗原。
图11C示出了CD19-和ROR1CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或ROR1阳性靶细胞系的细胞因子。以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或ROR1CAR)和双转导的CD4+ T细胞与靶细胞系共培养24小时。在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-g或TNF-a的存在。双转导细胞能够以与表达单个CAR的T细胞相似的水平针对所有表达靶标的细胞系释放细胞因子。
图11D示出了CD19-和ROR1CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或ROR1阳性靶细胞系的细胞因子。以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或ROR1CAR)和双转导的CD8+ T细胞与靶细胞系共培养24小时。在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-g或TNF-a的存在。双转导细胞能够以与表达单个CAR的T细胞相似的水平针对所有表达靶标的细胞系释放细胞因子。
图11E示出了双转导T细胞在颅内异种移植肿瘤模型中引发抗肿瘤活性。小鼠群用0.2e6表达GFP∶ffluc的Be2进行颅内接种(i.c.)(第0天)并用2e6双转导的CD4∶CD8 T细胞(1∶1比率)进行颅内接种(第7天)。对用Mock(未转导的，左图)、表达ROR1CAR(中间左图)或双转导的CD4∶CD8 CE7CAR T细胞(中间右图)处理的小鼠群中的肿瘤进行连续生物发光成像。处理组和对照组的存活率的Kaplan-Meier分析(右图)。如通过生物发光成像中的短减少所证明的，单表达ROR1CAR细胞和双转导细胞两者均能够暂时消退肿瘤生长。单转导T细胞和双转导T细胞两者均能够显著延长存活。这些结果说明双转导T细胞能够以与单表达ROR1CAR的T细胞相似的水平在体内治疗肿瘤。因此，对双转导T细胞群而言，没有抑制ROR1CAR活性。
定义
提供以下定义以便于理解本发明的可选方式或替代方式。
如本文使用的，“一”或“一个/种”可意味着一个/种或多于一个/种。
如本文使用的，术语“约/大约”表示包括为确定数值所采用的方法的固有误差或者实验之间存在的误差在内的数值。
如本文所述的，“嵌合抗原受体”(Chimeric antigen receptor，CAR)是指基因工程化的蛋白质受体，其可为免疫效应细胞(比如例如T细胞)赋予特异性。不受限制地，使用携带CAR的T细胞可促进体内扩增和活化。CAR还可被设计成将T细胞重定向至表达特异性细胞表面抗原的靶细胞，在此它们可通过靶标识别激活淋巴细胞(例如T细胞)。CAR以通过载体促进其编码序列转移的方式将单克隆抗体或其结合片段或scFv的特异性嫁接到T细胞上。为了将CAR作为用于有需要的受试者的疗法使用，使用被称为过继性细胞转移的技术，其中将T细胞从受试者中取出并进行修饰以使得它们可表达对抗原具有特异性的CAR。该T细胞(其随后可识别并且靶向抗原)被重新导入患者体内。在一些可选方式中，描述了表达CAR的淋巴细胞，其中所述表达CAR的淋巴细胞可被递送至受试者以靶向特定细胞。在一些可选方式中，所述淋巴细胞可表达两种CAR以获得双特异性。在一些可选方式中，所述淋巴细胞可表达CAR和特异性T细胞受体(TcR)以获得双特异性。TcR是可识别抗原的T淋巴细胞或T细胞表面上的分子。在一些可选方式中，所述淋巴细胞可表达双特异性CAR以获得双特异性，其中所述双特异性CAR包含用于结合B细胞特异性配体的第一结构域和用于结合肿瘤(其为非B细胞特异性癌症)上的肿瘤特异性配体的第二结构域。在一些可选方式中，所述癌症不是B细胞恶性肿瘤(malignancy)。如本文所述的，B细胞特异性CAR促进效应细胞的体内扩增和活化。
CAR的结构可包含连接至跨膜结构域和胞质信号传导结构域的源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合。大多数CAR可包含连接至细胞内CD3ζ结构域的细胞外scFv(第一代CAR)。或者，scFv可连接至可增加它们在有需要的受试者的疗法中的效力的共刺激结构域(第二代CAR)。当T细胞表达该分子时，它们可识别并且杀死表达由CAR靶向的特异性抗原的靶细胞。
在一些可选方式中，针对CD19的CAR包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对CD20的CAR包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对CE7的CAR包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对ROR1的CAR包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对EGFR 806的CAR包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对Her2的CAR包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对GD2的CAR包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对EphA2的CAR包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，针对EphA2的CAR包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的多核苷酸包含编码GMCSF信号序列的序列。在一些可选方式中，所述GMCSF信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的多核苷酸包含编码信号序列的序列。在一些可选方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述多核苷酸编码对CD20具有特异性的scFv。
如本文所述的，“EGFR 806”是野生型EGFR的构象表位。
嵌合抗原受体可包含对配体具有特异性的结合部分。不受限制地，所述结合部分可包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在第一嵌合抗原受体的一些可选方式中，第一嵌合抗原受体包含结合部分，其中所述结合部分包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述结合部分对B细胞上的配体具有特异性。在第二嵌合抗原受体的一些可选方式中，第二嵌合抗原受体包含结合部分，其中所述结合部分包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述结合部分对肿瘤细胞上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述肿瘤不是B细胞相关癌症的肿瘤。如图1所示，用于B细胞靶向CAR(驱动)和肿瘤靶向CAR(随从)的载体由两个单独的慢病毒载体进行递送。随后将含有与两种CAR共表达的特异性标记的细胞进行纯化并用于治疗。
如图2所示，图2为本文可选方式中描述的CAR的主要序列的示意图。该CAR包含前导序列、抗原结合结构域(免疫球蛋白的可变轻链序列和可变重链序列以及接头)、间隔区结构域(IgG4铰链CH3区)、信号传导结构域(CD28跨膜区、4-1BB结构域、CD3ζ)、T2A核糖体跳跃序列和转导标记(EGFRt或Her2tg标记)。在一些可选方式中，本文所述的携带CAR的T细胞为CD19CAR-T2A-Her2tG、CD19CAR-T2A-EGFRt、CD20CAR-T2A-EGFRt或CD19CAR-T2A-Her2tG/CD20CAR-T2A-EGFRt。
如本文所述的，“共刺激”是指淋巴细胞的活化。在嵌合抗原受体的一些可选方式中，嵌合抗原受体包含内结构域(endodomain)，其中所述内结构域包含用于共刺激信号传导的共刺激结构域。在一些可选方式中，所述共刺激结构域包含跨膜CD28结构域、4-1BB结构域和/或CD3ζ结构域。在一些可选方式中，跨膜CD28结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：5；MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV)。在一些可选方式中，跨膜CD28结构域由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列(SEQ ID NO：6；
ATGTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTCGGAGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTCACCGTGGCCTTCATCATCTTTTGGGTG)进行编码。在一些可选方式中，4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：7；KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVK)。在一些可选方式中，4-1BB结构域由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列(SEQ ID NO：8；
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGCGGGTGAAG)进行编码。在一些可选方式中，CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：9；FSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR)。在一些可选方式中，CD3-ζ结构域由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列(SEQ ID NO：10；TTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAATCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGAAGGGAAGAGTACGACGTCCTGGATAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCCACCGCCACCAAGGATACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGG`)进行编码。
如本文所述的，“配体”是指可与生物分子形成复合物的物质。以示例的方式而非限制性的，配体可包括底物、蛋白质、小分子、抑制剂、活化剂、核酸和神经递质。结合可通过分子间作用力(例如离子键、氢键和范德华相互作用)发生。结合至受体蛋白的配体可改变三维结构并且确定其功能状态。配体结合的强度被称为结合亲和力，并且可通过直接相互作用和溶剂效应来确定。配体可被“配体结合结构域”结合。例如，配体结合结构域可指能够结合特定配体或蛋白质上特定表位的结构中的保守序列。配体结合结构域或配体结合部分可包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。不受限制地，配体结合结构域可为对(一个或多个)配体具有特异性的特定蛋白结构域或蛋白质上的表位。
如本文所述的，“B细胞配体”或“B细胞抗原”是指在受试者的B细胞内或B细胞表面上表达的靶抗原，其中该受试者或患者未患有B细胞相关疾病。在一些可选方式中，该受试者未患有B细胞相关疾病。在一些可选方式中，该受试者未患有B细胞相关疾病和/或正在接受实体瘤治疗。不受限制地，B细胞相关疾病的实例可包括B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤、炎症相关弥漫大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病中发生的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤以及结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在一些可选方式中，该患者未患有B细胞相关疾病。在一些可选方式中，该患者未患有B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤、炎症相关弥漫大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病中发生的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。
尽管罕见，但是淋巴瘤也可转变为恶性肿瘤或肿块(mass)并且转移或扩散至不在淋巴系统中的其它器官。在这种情况下，患者患有B细胞淋巴瘤和实体瘤。此外，例如，患有B细胞疾病(例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎)的患者也易感诸如实体瘤等癌症。在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞疾病和/或正在接受癌症治疗。在一些可选方式中，所述癌症为实体瘤。
在一些可选方式中，所述配体结合结构域为抗体或其部分。在一些可选方式中，所述配体结合结构域为抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述配体结合结构域为scFv。在本文所述的一些可选方式中，B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在本文所述的一些可选方式中，B细胞上的配体是B细胞特异性的。
如本文所述的，“B细胞”是指适应性免疫系统的体液免疫中的一类淋巴细胞。B细胞可通过B细胞外表面上的蛋白质(称为B细胞受体(BCR))的存在而区别于其它淋巴细胞(如T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))。这种特化的受体蛋白允许B细胞结合至特定抗原。在哺乳动物中，未成熟B细胞在骨髓中形成。B细胞的主要功能为应答于抗原而产生抗体，执行抗原呈递细胞(APC)的作用，并在通过抗原相互作用活化后发育为记忆B细胞。B细胞还释放用于传递免疫调节功能信号的细胞因子。当诱导免疫应答的刺激媒介被消除时，B细胞具有短寿命并且经历细胞凋亡。这是由停止持续暴露至生存所需的各种集落刺激因子而引发的。在本文所述的一些可选方式中，提供了嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其促进效应细胞的体内扩增和活化。在一些可选方式中，B细胞配体的结合导致细胞因子的释放。在本文所述的一些可选方式中，提供了双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，而第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述嵌合抗原受体对B细胞配体具有特异性，其中所述嵌合抗原受体对以下分子具有特异性：CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体上的第一结合结构域对以下分子具有特异性：CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或非B细胞肿瘤的肿瘤靶标。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。
在一些可选方式中，嵌合抗原受体与B细胞配体的结合引发细胞因子应答并且帮助T细胞扩增。
在一些可选方式中，提供了嵌合抗原受体，其中配体或靶分子为细胞表面分子，该细胞表面分子在肿瘤细胞上发现并且基本上不在正常组织上发现或者其表达限制在不重要的(non-vital)正常组织中。在一些可选方式中，所述肿瘤不是来源于B细胞相关的癌症。在一些可选方式中，所述配体或靶分子在肿瘤细胞以及正常组织上发现。在一些可选方式中，表达CAR(对肿瘤细胞和正常组织上的配体具有特异性)的细胞进一步包含自杀基因以限制治疗时间并增加其安全性(safety profile)。条件性自杀基因(conditional suicidegenes)也可应用于供体T细胞，以限制对可能表达肿瘤相关抗原或配体的正常组织的攻击。
如本文所述的，“效应细胞”是指已被诱导分化成另一种能够产生特异性免疫应答的细胞类型(例如执行一种或多种特定功能的终末分化白细胞)的淋巴细胞。例如，免疫系统的主要效应细胞为参与破坏病原体并将其从体内除去的活化淋巴细胞和吞噬细胞。例如，效应细胞可包括大颗粒淋巴细胞(例如自然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞)。在本文提供的细胞的一些可选方式中，所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，进行扩增和活化的细胞为淋巴细胞、吞噬细胞、大颗粒淋巴细胞、自然杀伤细胞和/或细胞毒性T淋巴细胞。
“癌抗原”、“肿瘤抗原”或“肿瘤标记物”是指在肿瘤细胞中产生的抗原物质，因此其可在宿主中触发免疫应答。这些癌抗原作为用于识别肿瘤细胞的标记物可以是有用的，其将成为治疗或疗法(“treatment”或“therapy”)过程中的潜在候选者。存在几种类型的癌抗原或肿瘤抗原。存在肿瘤特异性抗原(TSA)(仅存在于肿瘤细胞上而不存在于健康细胞上)和肿瘤相关抗原(TAA)(存在于肿瘤细胞中并也存在于一些正常细胞中)。在本文提供的嵌合抗原受体和方法的一些可选方式中，所述嵌合抗原受体对肿瘤特异性抗原具有特异性。在一些可选方式中，所述嵌合抗原受体对肿瘤相关抗原具有特异性。在本文所述的一些可选方式中，所述肿瘤不是来源于B细胞相关癌症。在一些可选方式中，表达CAR(对TAA具有特异性)的细胞进一步通过导入自杀基因进行修饰以限制CAR T细胞疗法的时间以及减少对表达TAA的正常组织的攻击。
在本文提供的方法的一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，癌抗原由肿瘤表达，其中该肿瘤不是B细胞相关癌症。
“特异性的”或“特异性”可指用于结合伴侣的配体的特征，或者用于配体的结合伴侣的特征，并且可包括用于结合的互补形状、电荷和疏水特异性。用于结合的特异性可包括立体特异性、区域选择性和化学选择性。在一些可选方式中，提供了嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体对B细胞配体具有特异性。在一些可选方式中，提供了嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体对肿瘤细胞配体具有特异性。
如本文所述的，“CE7”是L1CAM上的表位。
在一些可选方式中，淋巴细胞可表达CAR和特异性T细胞受体(TcR)以获得双特异性。在一些可选方式中，所述特异性T细胞受体对以下分子具有特异性：EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、ROR1或NY-ESO-1。
“诱导型表达的”或“诱导型表达”是指在基因转录水平上启动或增加蛋白质的产生。如果编码目标蛋白的基因处于启动子的控制下，则可发生蛋白质的诱导。如本文使用的，启动子可为组成型激活、阻遏型或诱导型的。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应答于诱导剂而增加。反之，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是公知的。在本文所述的一些可选方式中，第一嵌合抗原受体和/或第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，第一嵌合抗原受体和/或第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，阻遏型系统由使用多西环素的Tet-On/Off系统控制。在一些可选方式中，阻遏型系统由他莫昔芬控制。在一些可选方式中，可表达系统由核糖开关/小分子mRNA调节控制。在一些可选方式中，可表达系统由核糖开关、shRNA或microRNA控制。
如本文所述的，“调控元件”可指调控序列，是负责调节基因表达的任何DNA序列(例如启动子和操纵子)。调控元件可为能够在生物体内增加或减少特定基因表达的核酸分子的片段。在本文所述的一些可选方式中，提供了细胞，其中所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。
如本文所述的，“跨膜结构域”为可跨越细胞膜的整合蛋白。
“启动子”是指导结构基因转录的核苷酸序列。在一些可选方式中，启动子位于基因的5＇非编码区中，临近结构基因的转录起始位点。在转录起始中发挥功能的启动子中的序列元件通常特征在于共有核苷酸序列。不受限制地，这些启动子元件可包括：RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee等，Mol.Endocrinol.7：551(1993)；以引用的方式将其整体并入本文)、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990)；以引用的方式将其整体并入本文)、糖皮质激素应答元件(GRE)以及其它转录因子的结合位点，例如CRE/ATF(O′Reilly等，J.Biol.Chem.267：19938(1992)；以引用的方式将其整体并入本文)、AP2(Ye等，J.Biol.Chem.269：25728(1994)；以引用的方式将其整体并入本文)、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993)；以引用的方式将其整体并入本文)以及八聚体因子(octamer factors)(总体上见：Watson等编，Molecular Biology of the Gene，第4版(The Benjamin/Cummings Publishing Company，Inc.，1987；以引用的方式将其整体并入本文)以及Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303：1(1994)(以引用的方式将其整体并入本文)。如本文使用的，启动子可为组成型激活、阻遏型或诱导型的。如果启动子是诱导型启动子，则转录速率应答于诱导剂而增加。反之，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是公知的。在提供核酸的一些可选方式中，所述核酸包含启动子序列。在嵌合抗原的一些可选方式中，所述嵌合抗原应答于诱导剂进行诱导型表达。在一些可选方式中，TcR应答于诱导剂进行诱导型表达。
在一些可选方式中，本文使用的启动子可为诱导型启动子或组成型启动子。不受限制地，诱导型启动子可包括：例如他莫昔芬诱导型启动子、四环素诱导型启动子和多西环素诱导型启动子(例如tre启动子)。组成型启动子可包括：例如SV40、CMV、UBC、EF1α、PGK和CAGG。在一些可选方式中，调控元件是启动子。在一些可选方式中，所述启动子为他莫昔芬诱导型启动子、四环素诱导型启动子或多西环素诱导型启动子(例如tre启动子)。在本文提供的一些可选方式中，细胞上的嵌合抗原受体或TcR的表达由他莫昔芬和/或其代谢物进行诱导。他莫昔芬的代谢物为活性代谢物(如4-羟基他莫昔芬(afimoxifene)和N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(endoxifen)，其与雌激素受体的亲和力可比他莫昔芬本身高30-100倍。在一些可选方式中，他莫昔芬代谢物是4-羟基他莫昔芬(afimoxifene)和/或N-去甲基-4-羟基他莫昔芬(endoxifen)。在一些可选方式中，提供了载体，其中所述载体具有用于CAR/TcR的第一启动子和用于标记蛋白的第二启动子。
如本文所述的，“抗体”是指免疫系统用来识别和中和外来物体(如细菌和病毒)的浆细胞产生的大Y型蛋白。抗体蛋白可包含四条多肽链：通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。各条链由被称为免疫球蛋白结构域的结构性结构域组成。这些结构域可包含约70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个氨基酸或由这些值中任何两个所限定的范围内的任意数量的氨基酸，并且这些结构域根据它们的大小和功能被分为不同类别。在一些可选方式中，配体结合结构域包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，配体结合结构域为抗体片段，理想地，是其结合部分。在一些可选方式中，存在于CAR上的抗体片段或其结合部分对B细胞上的配体具有特异性。在一些可选方式中，存在于CAR或TcR上的抗体片段或其结合部分对肿瘤细胞上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述肿瘤不是源自B细胞相关癌症。在一些可选方式中，存在于CAR上的抗体片段或其结合部分对存在于肿瘤细胞上的配体具有特异性。在一些可选方式中，配体结合结构域是抗体片段或其结合部分(例如单链可变片段(scFv))。在一些可选方式中，配体包含肿瘤特异性突变。在一些可选方式中，存在于CAR上的抗体片段或其结合部分包含来自人源化抗体或其结合部分的一个或多个结构域。
如本文所述的，“ScFv”是由10个至约25个氨基酸的短接头肽连接的免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些可选方式中，提供了CAR，其中该CAR包含对细胞表面肿瘤分子具有特异性的ScFv。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对CD19具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对CD19具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对CD20具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对CD20具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对CE7具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对CE7具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对ROR1具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对ROR1具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对EGFR 806具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对EGFR 806具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对Her2具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对Her2具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对GD2具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对GD2具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对EphA2(2H4)具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对EphA2(2H4)具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含对EphA2(4H5)具有特异性的scFV。在一些可选方式中，对EphA2(4H5)具有特异性的scFV包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。
如本文所述的，“标记结构域”是指用作细胞标记的蛋白质。在本文所述的细胞的一些可选方式中，所述细胞共表达针对已表达的特定嵌合抗原蛋白的标记蛋白。在本文提供的细胞的一些可选方式中，嵌合抗原受体与特定的标记蛋白共表达。在本文提供的细胞的一些可选方式中，所述细胞包含编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。
如本文所述的，“核糖体跳跃序列”是指在翻译过程中迫使核糖体“跳过”核糖体跳跃序列并翻译核糖体跳跃序列之后的区域而不形成肽键的序列。例如，几种病毒具有核糖体跳跃序列，其允许在单个核酸上连续翻译几种蛋白，而不使这些蛋白通过肽键连接。如本文所述的，这是“接头”序列。在本文提供的核酸的一些可选方式中，所述核酸在嵌合抗原受体序列和标记蛋白序列之间包含核糖体跳跃序列，从而使得所述蛋白共表达而不通过肽键连接。在一些可选方式中，核糖体跳跃序列是P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，核糖体跳跃序列为T2A序列。在一些可选方式中，T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，标记蛋白为EGFRt蛋白。在一些可选方式中，标记蛋白为Her2tg蛋白。通过将标记基因置于核糖体跳跃基序之后，表达的标记蛋白将不与CAR结合，但是可用于测定或纯化表达目标CAR的细胞。在一些可选方式中，通过确认两种标记蛋白来将T细胞鉴定为双特异性T细胞，其中第一标记蛋白是存在B细胞特异性CAR的指示，并且第二标记蛋白是存在肿瘤特异性CAR的指示。标记蛋白的确认可通过免疫选择、结合至标记蛋白的抗体和本领域技术人员已知的其它选择方法进行。
在一些可选方式中，T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：34中所示的核酸序列进行编码。
如本文所述的，“内部核糖体进入位点(IRES)”是允许在信使RNA(mRNA)序列中间起始翻译的核苷酸序列，作为更大的蛋白质合成过程的一部分。
“双特异性嵌合抗原受体”是指包含两个结构域的CAR，其中第一结构域对第一配体具有特异性，并且其中第二结构域对第二配体具有特异性。在一些可选方式中，所述第一配体为B细胞特异性蛋白。在一些可选方式中，所述第二配体为肿瘤特异性配体。
如本文使用的，“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸(例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA))；寡核苷酸；由聚合酶链式反应(PCR)产生的片段；以及由连接、断裂、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任何方式产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸(例如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在的核苷酸的对映体形式)的单体或两者的组合组成。修饰的核苷酸可在糖部分中和/或在嘧啶碱基或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者可将糖官能化为醚或酯。此外，整个糖部分可被空间上和电子上相似的结构(如氮杂糖和碳环糖类似物)替代。碱基部分中的修饰的实例包括烷基化嘌呤和嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它众所周知的杂环替代物。核酸单体可通过磷酸二酯键或这种键的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含连接至聚酰胺骨架的天然存在的核酸碱基或修饰的核酸碱基。核酸可为单链的或者双链的。在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，提供了制备编码嵌合抗原受体的核酸的方法。在一些可选方式中，提供了编码对B细胞上的配体具有特异性的嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，提供了编码对肿瘤细胞上的配体具有特异性的嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸为编码嵌合抗原受体的DNA。在一些可选方式中，所述核酸为编码嵌合抗原受体的mRNA。在一些可选方式中，嵌合抗原受体是双特异性的。
如本文所述的，“载体”为将编码蛋白的遗传物质或目的mRNA携带到另一细胞中，从而使其在该细胞中复制和/或表达的核酸媒介。存在几种类型的载体。不受限制地，载体可为质粒、病毒载体、粘粒、人工染色体或mRNA。所述载体可为线性的或环状的。在本文提供的一些可选方式中，病毒载体被用于携带编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体为逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体为γ逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为质粒。在一些可选方式中，所述载体为mRNA。在一些可选方式中，所述载体为线性的并且包含端粒。
如本文所述的，“质粒”是可独立于染色体进行复制的细胞中的遗传结构。不受限制地，所述质粒可为细菌或原生动物的细胞质中的小环状DNA链或者为线性核酸。
如本文所述的，“微环”(minicircle)是已从所有原核载体部分中释放(freed)的小环状质粒衍生物。微环可作为表达载体，其中它们已经作为转基因载体应用于哺乳动物细胞的基因修饰，具有的优点是它们不含细菌DNA序列，因此它们不太可能被认为是外源的而被破坏。因此，典型的转基因递送方法涉及含有外源DNA的质粒。微环较小的尺寸也扩大了它们的克隆能力而且有助于将它们递送至细胞内。不受限制地，制备微环可按照两步法，其可包括在大肠杆菌(E.coli)中生产亲本质粒(具有真核插入片段的细菌质粒)以及在该过程结束时但仍然在细菌中诱导位点特异性重组酶。这些步骤之后可通过两个重组酶-靶序列(在插入片段的两端)切除原核载体部分，并通过毛细管凝胶电泳(CGE)回收所得到的微环(用于高效修饰受体细胞的载体)和微质粒。
如本文所述的，“反向末端重复”(inverted terminal repeat)是下游为其反向互补序列并且发生在转座子的另一端的核苷酸序列。
如本文所述的，“转座因子”(transposable element，TE)、“转座子”(transposon)或“反转座子”(retrotransposon)可以指可改变其在基因组内的位置的DNA序列。转座子可产生或逆转突变并改变细胞基因组的大小。转座(transposition)通常会导致TE重复。TE可构成真核细胞C值的大部分。如本文所述的，“C值”是指以皮克表示的在真核生物的单倍体细胞核内含有的DNA的量(二倍体体细胞一半的量)。在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的核酸位于载体内，其中所述载体为微环转座子。在一些可选方式中，所述载体包含转座子。
如本文所述的，“睡美人转座子系统”由睡美人(SB)转座酶和转座子组成，在1997年被设计以将特定DNA序列插入脊椎动物的基因组中。DNA转座子可以以简单的剪切-粘贴的方式从一个DNA位点易位到另一个位点。转座是一个精确的过程，其中将限定的DNA片段从一个DNA分子中切出并移动到相同或不同DNA分子或基因组中的另一个位点。在本文提供的载体的一些可选方式中，所述载体包含睡美人转座子。
SB转座酶可将转座子插入受体DNA序列中的TA二核苷酸碱基对中。插入位点可位于同一个DNA分子的其它位置或者位于另一个DNA分子(或染色体)中。在哺乳动物(包括人)基因组中，大约有2亿个TA位点。TA插入位点在转座子整合过程中复制。TA序列的这种复制是转座的标志并被用于在一些实验中确定机制。转座酶可在转座子内进行编码，或者转座酶可由另一个来源提供(在这种情况下，转座子成为非自主(non-autonomous)元件)。
如本文所述的，“PiggyBac(PB)转座子”是指通过“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间进行有效转座的可移动遗传元件。在转座过程中，PB转座酶识别位于转座子载体两端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且有效地移动来自原始位点的内容物(content)并有效地将它们整合至TTAA染色体位点中。PiggyBac转座子系统的强大活性使得PB载体中两个ITR之间的目的基因很容易地被移动到靶基因组中。
在一些可选方式中，所述载体为PiggyBac转座子。PiggyBac(PB)转座子是通过“剪切和粘贴”机制在载体和染色体之间进行有效转座的可移动遗传元件。在转座过程中，PB转座酶识别位于转座子载体两端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且有效地移动来自原始位点的内容物并有效地将它们整合至TTAA染色体位点中。PiggyBac转座子系统的强大活性使得PB载体中两个ITR之间的目的基因很容易地被移动到靶基因组中。
在一些可选方式中，PB含有连接至编码与遗传标签可操作地连接的嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子。可采用一个或多个PB转座子。在一些可选方式中，一个PB包含连接至编码嵌合抗原受体和第一遗传标签的多核苷酸的启动子，另一个PB包含连接至编码嵌合抗原受体和不同的第二遗传标签的多核苷酸的启动子。构建体的各个元件由核酸(例如编码自切割T2A序列的核酸)分隔。在一些可选方式中，各PB在嵌合抗原受体方面彼此不同，包括但不限于间隔区长度和序列、细胞内信号传导结构域和/或遗传标签序列。
如本文所述的，“过继性细胞转移”是指将细胞转移至患者体内。在一些可选方式中，提供了在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法，其中所述方法包括向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或组合物。在一些可选方式中，所述细胞通过过继性细胞转移来给予。
如本文所述的，“前导序列”也被称为信号序列，其可将蛋白质导向至细胞表面。在CAR背景下的前导序列是指在CAR中指导表面表达的第一氨基酸序列。该前导序列或信号序列可以是蛋白质表面表达所需的。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述信号序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。
如本文所述的，“去免疫间隔区”是指几乎不引起或不引起来自患者的免疫应答的间隔区。在一些可选方式中，嵌合抗原受体包含间隔区，其中所述间隔区在有需要的受试者中不引起免疫应答。
所述去免疫间隔区可包含多肽链，其长度范围可为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个或240个氨基酸的长度或者在由上述任何两个长度所限定的范围内的长度。为了在嵌合抗原受体中产生期望长度的多肽链，去免疫间隔区可以以任何顺序包含20种氨基酸中的任意氨基酸，包括氨基酸精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸。去免疫间隔区序列可为嵌合抗原受体的跨膜结构域和scFv之间的接头。在一些可选方式中，提供了制备编码嵌合抗原受体的核酸的方法。在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含去免疫间隔区的序列。在一些可选方式中，所述去免疫间隔区包含具有以下长度的序列：10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个或240个氨基酸的长度或者在由上述任何两个长度所限定的范围内的长度。在一些可选方式中，所述去免疫间隔区位于嵌合抗原受体的跨膜区和scFv之间。
在一些可选方式中，间隔区区域具有至少10个氨基酸至229个氨基酸、10个氨基酸至200个氨基酸、10个氨基酸至175个氨基酸、10个氨基酸至150个氨基酸、10个氨基酸至125个氨基酸、10个氨基酸至100个氨基酸、10个氨基酸至75个氨基酸、10个氨基酸至50个氨基酸、10个氨基酸至40个氨基酸、10个氨基酸至30个氨基酸、10个氨基酸至20个氨基酸或10个氨基酸至15个氨基酸，或者在由上述任何两个氨基酸长度所限定的范围内的长度。在一些可选方式中，间隔区区域具有12个以下氨基酸但多于1个氨基酸、119个以下氨基酸但多于1个氨基酸、或者229个以下氨基酸但多于1个氨基酸。
在一些可选方式中，所述间隔区包含IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：1；ESKYGPPCPPCP)。在一些可选方式中，所述间隔区由SEQ ID NO：2中所示的序列(SEQ ID NO：2；
GAGAGCAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT)进行编码。
在一些可选方式中，所述间隔区包含IgG4-CH3铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：3；ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK)。在一些可选方式中，所述间隔区由SEQ ID NO：4中所示的序列(SEQ ID NO：4；GAGAGCAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCTGGCCAGCCTCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTCTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG)进行编码。
在一些可选方式中，所述去免疫间隔区包含IgG4-CH2间隔区(L235D，N297Q突变体)。在一些可选方式中，IgG4-CH2间隔区(L235D，N297Q突变体)包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。
在一些可选方式中，所述去免疫间隔区包含IgG4铰链。在一些可选方式中，所述去免疫间隔区包含CD8α铰链。在一些可选方式中，所述去免疫间隔区包含CD28铰链以及它们与IgG分子的CH2结构域和/或CH3结构域的融合。
如本文所述的，“信号传导结构域”是嵌合抗原受体上可以促进细胞因子释放、体内T细胞存活和肿瘤消除的结构域。在本文的一些可选方式中，信号传导结构域包含CD28胞质结构域、4-1BB胞质结构域和/或CD3-ζ胞质结构域。
如本文所述的，“类固醇”是指具有共同特征的小环状有机化合物，其包含在四环结构内的十七个碳原子的排列。在本文提供的一些可选方式中，CAR的表达由类固醇(如雌激素、睾酮或糖皮质激素或视黄酸)进行诱导。在本文所述的一些可选方式中，类固醇他莫昔芬被用于诱导CAR或TcR的表达。在一些可选方式中，雌激素或糖皮质激素被用于诱导CAR或TcR的表达。
“非B细胞相关疾病”是指与B细胞癌或疾病无关的任何癌症或疾病。因此，在本文所述的可选方式中，作为癌症标记物而在细胞表面上表达的特定蛋白质是那些不是由任何B细胞相关异常引起的疾病的标记物。不受限制地，非B细胞相关疾病可包括：B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤、炎症相关弥漫大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病中发生的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。
如本文所述的，“实体瘤”是指组织的恶性癌性肿块(malignant cancerousmass)。在本文提供的在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法的一些可选方式中，所述方法包括向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或组合物或由本文的可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞。在一些可选方式中，所述受试者患有癌症。在一些可选方式中，所述癌症是实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由以下癌症组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
如本文所述的，“神经母细胞瘤”是指童年和婴儿时期的颅外实体癌，其是可由交感神经系统的神经嵴成分产生的神经内分泌肿瘤。不受限制地，肿瘤可起源于例如肾上腺以及颈部、胸部、腹部和/或盆腔的神经组织。在本文所述方法的一些可选方式中，通过过继性细胞转移将包含双特异性嵌合抗原受体或用于获得双特异性的两种嵌合抗原受体的T细胞给予有需要的受试者。在一些可选方式中，所述有需要的受试者患有神经母细胞瘤。在一些可选方式中，所述有需要的受试者为处于小儿年龄的人。如本文所述的，小儿年龄是指24岁以下的人。处于小儿年龄的人的年龄处于0岁、1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁、19岁、20岁、21岁、22岁、23岁、24岁或在上述任何两个值之间的范围内的任何其它年龄。
如本文所述的，“顽固性和复发性神经母细胞瘤”是指对治疗完全没有应答并被标记为顽固性的被认为是“高风险”的儿童。被认为是高风险的儿童被从一线疗法中移除，并被认为有资格进行可使用新疗法的临床试验。对一线疗法曾有良好应答但出现疾病再发(复发)的儿童被认为是高风险的，也有资格接受临床试验中测试的新疗法。在本文所述方法的一些可选方式中，患者患有顽固性和/或复发性神经母细胞瘤。在一些可选方式中，所述有需要的受试者为处于小儿年龄的人。如本文所述的，小儿年龄是指24岁以下的人。处于小儿年龄的人的年龄处于0岁、1岁、2岁、3岁、4岁、5岁、6岁、7岁、8岁、9岁、10岁、11岁、12岁、13岁、14岁、15岁、16岁、17岁、18岁、19岁、20岁、21岁、22岁、23岁、24岁或在上述任何两个值之间的范围内的任何其它年龄。在一些可选方式中，所述患者正在接受癌症疗法。在一些可选方式中，所述癌症疗法包括向所述患者给予131I-MIBG。
如本文所述的，“自杀基因疗法”、“自杀基因”和“自杀基因系统”可指通过细胞凋亡破坏细胞的方法，所述方法需要会通过细胞凋亡导致细胞杀死自身的自杀基因。由于对需要CAR疗法的患者的安全性顾虑，正在制定策略以预防或减轻不良事件。CAR T细胞疗法的不良作用可包括“细胞因子风暴”，细胞因子风暴是一种细胞因子释放综合征，其中输注的T细胞将细胞因子释放到血流中，可导致危险的高热以及血压急剧下降。迄今为止，细胞因子释放综合征是用CAR T细胞治疗的患者中的常见问题，并且在接受CAR T细胞之前患有最广泛性病变(extensive disease)的患者被证明更可能经历严重状况的细胞因子释放综合征。如果肿瘤特异性抗原也在健康组织中表达，还可发生脱靶不良作用。
自杀基因疗法可被用于增加嵌合抗原受体重定向T细胞的安全性并管理输注携带CAR的T细胞后可能发生的不良事件。需要药理学疗法、自杀基因或新策略来将细胞毒性作用限制为仅针对恶性细胞。有几种方法针对自杀基因疗法。不受限制地，所述方法可包括基因导向酶产生疗法(gene-directed enzyme producing therpy)或病毒导向酶前药疗法。对基因导向酶产生疗法(GDEPT)而言，从癌细胞中获取基因并然后用其它基因对其进行修饰以形成对健康细胞无害的酶。将这种外源酶插入肿瘤细胞中，其在此处释放前药(对健康细胞无害但对癌细胞具有破坏性的小分子)。修饰的自杀基因将无毒前药转化为细胞毒性物质。对病毒导向酶前药疗法而言，使用作为运载体(carrier)或载体(vector)的病毒(例如单纯疱疹病毒或感冒病毒)将修饰的基因递送至癌细胞中。对所有癌性肿瘤而言，自杀基因疗法并不是必然有望能完全消除对化疗和放射治疗的需求。然而，对肿瘤细胞造成的损伤使得它们更容易受到化疗或辐射的影响。这种方法已被证明对前列腺癌和膀胱癌是有效的。自杀基因疗法的应用也正在扩展到几种其它形式的癌症。癌症患者的免疫系统经常受到抑制，因此他们可能会受到使用病毒作为递送剂的一些副作用。对CAR T细胞疗法的不良作用的管理可通过在启动子的控制下表达CAR来进行。如之前在几篇综述中所述的，表达CAR的T淋巴细胞可进一步用自杀基因进行离体(ex vivo)基因修饰。不受限制地，自杀基因可为编码能够在细胞水平上将无毒前药转化为毒性化合物的因子的基因。在通过过继性细胞转移输注CAR T细胞之后可能发生的不良作用期间，可将该前药给予遭受不良作用的受试者，该前药可选择性地消除自杀基因修饰的T细胞而不干扰由未修饰的T细胞操作的免疫重建过程。使用单纯疱疹胸苷激酶(Hsv-tk)/更昔洛韦(GCV)自杀系统的自杀系统已有描述(Casucci等，2011，Journal of Cancer 2011，2；将其整体并入本文)。在一些可选方式中，提供了包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体的细胞，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，提供了包含双特异性嵌合抗原受体的细胞，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，并且第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含自杀基因系统。
在一些可选方式中，所述自杀基因系统为EGFRt自杀基因系统，其中将爱必妥作为前药给予患者。在一些可选方式中，每天给予受试者0.04mg/cm2爱必妥。在一些可选方式中，其中爱必妥为前药，0.04mg/cm2可被认为是初始剂量，而在一些可选方式中，包括在给予初始剂量后每周给予0.025mg/cm2剂量的爱必妥。在一些可选方式中，其中患者出现皮疹(rash)，每周剂量可降至0.03mg/cm2、0.02mg/cm2或0.01mg/cm2或者上述值中任何两个之间的任何其它剂量。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为Her2tG自杀基因系统，其中将赫赛汀作为前药给予患者。在一些可选方式中，给予受试者2mg/kg、3mg/kg或4mg/kg的赫赛汀或者上述值中任何两个之间的任何其它剂量的赫赛汀。在制备包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞的方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码自杀基因的核酸导入细胞中。在一些可选方式中，所述编码自杀基因的核酸位于载体上。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：36中所示的核酸序列进行编码。
如本文所述的，“单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统”是使用来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因联合前药更昔洛韦的自杀基因系统。
在制备包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞的方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码自杀基因系统的核酸导入细胞中。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统。在一些可选方式中，编码自杀基因的核酸位于载体上。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述自杀基因位于携带编码嵌合抗原受体的核酸的载体上，其中所述自杀基因系统位于所述编码嵌合抗原受体的核酸的上游或下游，并且其中所述自杀基因系统与所述编码嵌合抗原受体的核酸由编码可切割接头的基因分隔。在一些可选方式中，一天三次将1000mg的更昔洛韦随着食物给予有需要的受试者。
在一些可选方式中，其中更昔洛韦为前药，可以每12h以恒定的速率持续1h、2h或3h或上述任何两个值之间的任何时间量通过静脉内(IV)给予患者5mg/kg剂量的更昔洛韦作为诱导疗法(induction therapy)，持续14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天或上述任何两个值之间的范围内的任何天数。在一些可选方式中，其中更昔洛韦为前药，维持患者中更昔洛韦的量，其中以恒定的速率持续1h、2h或3h或上述任何两个值之间的范围内的任何时间量通过静脉内(IV)给予所述患者5mg/kg剂量的更昔洛韦。在一些可选方式中，更昔洛韦每天给药一次，每周7天。在一些可选方式中，其中更昔洛韦是前药，维持患者中更昔洛韦的量，其中以恒定的速率持续1h、2h或3h或上述任何两个值之间的任何时间量通过静脉内(IV)给予所述患者6mg/kg剂量的更昔洛韦，每天一次，每周五天。
在制备包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞的方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码自杀基因系统的核酸导入细胞中。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为基于半胱天冬酶的自杀基因系统。不受限制地，可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统的实例可包括可诱导的半胱天冬酶-9自杀基因系统和半胱天冬酶-8自杀基因系统。可诱导的半胱天冬酶9(iCasp9)介导的自杀的使用是基于由人蛋白构建的促凋亡分子的条件性二聚化作用，并且不太可能是免疫原性的。在一些可选方式中，其中使用iCasp9自杀系统，该iCasp9蛋白包含人FK506结合蛋白。
在一些可选方式中，所述自杀基因系统是半胱天冬酶系统，例如半胱天冬酶9自杀基因系统。在一些可选方式中，前药为FK506或另一种二聚化化学诱导剂。在制备包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞的方法的一些可选方式中，所述方法包括将编码自杀基因的核酸导入细胞中。在一些可选方式中，所述编码自杀基因的核酸位于载体上。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些可选方式中，给予受试者前药以诱导细胞凋亡。在一些可选方式中，前药为FK506。在一些可选方式中，给予受试者的剂量为0.075mg/kg/天、0.1mg/kg/天、0.125mg/kg/天、0.150mg/kg/天、0.175mg/kg/天或0.2mg/kg/天或者在上述值中任何两个之间的范围内的任何剂量。
在一些可选方式中，所述自杀基因系统包含用于他莫昔芬诱导型细胞凋亡的自杀载体。具体而言，可使用具有Fas-雌激素受体融合蛋白的诱导型细胞凋亡系统以快速消除转导的细胞。在一些可选方式中，该系统可独立于内源表达的雌激素而诱导细胞凋亡。
如本文所述的，“前药”是以药理学上无活性的形式给予、然后通过正常代谢过程转化成活性形式的药物。在一些可选方式中，提供了在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法，其中所述方法包括向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或组合物或由本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括对受试者的B细胞发育不良或细胞因子风暴的症状进行评估。在一些可选方式中，所述受试者患有高热、血压升高或降低、低血压、缺氧、癫痫或失语症。在一些可选方式中，所述受试者的铁蛋白和/或C-反应蛋白升高。在本文提供的方法的一些可选方式中，其中所述细胞包含自杀基因系统，所述方法进一步包括向受试者给予前药。
在一些可选方式中，其中转导的T细胞包含自杀基因系统，其中所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶9自杀基因系统，所述前药为FK506。在一些可选方式中，向受试者给予0.075mg/kg/天-0.2mg/kg/天的FK506。在一些可选方式中，向受试者给予的剂量为0.075mg/kg/天、0.1mg/kg/天、0.125mg/kg/天、0.150mg/kg/天、0.175mg/kg/天或0.2mg/kg/天或在上述值中任何两个之间的范围内的任何剂量。
在一些可选方式中，其中转导的T细胞包含自杀基因系统，其中所述自杀基因系统为包含用于他莫昔芬诱导型细胞凋亡的自杀载体的自杀基因系统，所述前药为他莫昔芬。在一些可选方式中，向受试者给予20mg/天的他莫昔芬。
在一些可选方式中，其中转导的T细胞包含自杀基因系统，其中所述自杀基因系统为包含用于他莫昔芬诱导型细胞凋亡的自杀载体的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)自杀基因系统，所述前药为GCV。在一些可选方式中，每天3次将1000mg GCV随着食物口服给予受试者。
如本文所述的，“植入”是指将移植(grafted)组织并入宿主体内。有效的CAR T细胞的几个特征包括显示足够的植入迹象，这是应答所必需的。例如，通过聚合酶链式反应对CAR转基因的检测不能提供关于CAR表面表达的信息，而CAR表面表达是对效力有重要影响的唯一形式。因此，用于通过流式细胞术或本领域技术人员已知的其它方法来特异性检测细胞表面上的CAR的试剂的可用性对理解CAR T细胞的活性和植入而言是至关重要的。在本文所述的可选方式中，过继性转移的CAR的治疗效力通过允许B细胞靶向CAR来驱动输注的CAR T细胞的活化、增殖和扩散来提高，所述CAR T细胞具有提供重定向杀死实体瘤的第二CAR。在本文所述的一些可选方式中，相比于仅包含对肿瘤配体具有特异性的CAR的T细胞，包含具有B细胞特异性的CAR的方法和细胞造成了植入水平提高这一惊人效果。如本文可选方式中所述的，显示植入失败的障碍通过允许B细胞靶向CAR来驱动输注的CAR T细胞的活化、增殖和扩散来克服，所述CAR T细胞具有提供重定向杀死实体瘤的CAR。
如本文所述的，“受试者”或“患者”是指可在其上使用或给予本文所述的可选方式(例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的)的任何生物体。受试者或患者包括例如动物。在一些可选方式中，所述受试者为小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物和人。在一些可选方式中，所述受试者为牛、羊、猪、马、狗、猫、灵长类动物或人。
具体实施方式
尽管在本文提供的各种示例性可选方式和实施方式中对本发明进行了描述，但应当理解的是，在一个或多个单独的可选方式中各自描述的各种特征、方面和功能在它们的适用性方面并不限于特定可选方式(利用这些可选方式对它们进行描述)。相反，不管是否描述了该可选方式或者是否将该特征作为所描述的可选方式的一部分提出，它们都可单独或者以各种组合应用于本发明的一个或多个其它可选方式中。本发明的广度和范围不应受到本文描述或示出的任何示例性可选方式的限制。
本发明的方面涉及用于增强过继性转移的携带嵌合抗原受体(CAR)的T细胞针对实体瘤的治疗效力的方法、细胞和组合物。具体而言，本文提供了针对CAR T细胞产品的方法、细胞和组合物，所述CAR T细胞产品在各个T细胞中共表达两种CAR：用于促进效应细胞的体内扩增和活化的B细胞靶向“驱动”CAR；以及用于靶向实体瘤的具有所期望的特异性的CAR或T细胞受体(TcR)(随从CAR/TcR)。
表达第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体的细胞
根据一些优选的可选方式，提供了细胞，其中所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在所述细胞的一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或作为非B细胞肿瘤的肿瘤上的肿瘤靶标。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，第一标记蛋白与第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。
在一些可选方式中，所述淋巴细胞可表达CAR和特异性T细胞受体(TcR)以获得双特异性。在一些可选方式中，所述特异性T细胞受体对以下分子具有特异性：EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。
在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含第一配体结合结构域，而所述第二嵌合抗原受体包含第二配体结合结构域。在一些可选方式中，所述配体结合结构域包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体、肽和/或多肽亲和分子。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体、肽和/或多肽亲和分子。在一些可选方式中，第一标记蛋白与第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与第二嵌合抗原受体共表达。在一些可选方式中，与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与第二嵌合抗原受体共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与第二嵌合抗原受体共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
本文所述的一些可选方式采用新策略来提高过继性转移的CAR重定向T细胞针对实体瘤的治疗效力。可选方式还包括在各T细胞(CD4+和CD8+ T细胞亚群)中共表达两种CAR的CAR T细胞产品，其并入了用于促进体内扩增和活化的B细胞靶向“驱动”CAR(对CD19、CD22、CD20、CD10、CD79c、ROR1或由B细胞表达的另一种细胞表面分子具有特异性)以及用于靶向实体瘤的具有所期望的特异性的CAR或TcR(随从CAR/TcR)。可通过使用本文所述的可选方式中开发的两种细胞表面标签来鉴定和选择双CAR(或CAR/TcR)T细胞，所述标签由修饰的人EGFR和HER2多肽组成，分别为EGFRt和HER2tg。此外，为实现针对B细胞和实体瘤的双特异性，容纳B细胞靶向结构域和实体瘤靶向结构域的单个CAR也在设想之列。设想通过多种基因转移方法(包括病毒载体、非病毒转座子载体和mRNA)来产生双特异性CAR T细胞。此外，在设想之列的是一种基因系统，其中B细胞靶向CAR被置于药物调节表达形式(如TamR)。该系统的优选可选方式为共表达CD19特异性CAR以及被开发用于实体瘤疗法的CAR或TcR，所述CD19特异性CAR理想地容纳人scFv结合结构域、去免疫细胞外间隔区以及4-1BB：ζ第二代胞质尾区连同EGFRt或HER2tg(或其它合适的细胞表面标签)，其经由连接cDNA的基因元件(例如核糖体跳跃序列或IRES)而共表达；并且所述用于实体瘤疗法的CAR或TcR与第二细胞表面标签共表达。该系统的一次重复(iteration)允许不同的慢病毒载体容纳各CAR/标签(或TcR/标签)以及使用两种慢病毒的混合物来共转导人T细胞。这些可选方式期望实现允许对表达细胞表面标签及其相应CAR两者的转导T细胞进行纯化的细胞选择(免疫磁性、细胞分选、其它)。
双CAR(或CAR/TcR)T细胞可通过使用本文开发和描述的两种细胞表面标签来鉴定和选择，并且可由标记蛋白(例如修饰的人EGFR和HER2多肽，分别为EGFRt和HER2tg)组成。此外，为实现针对B细胞和实体瘤的双特异性，还在本文中设想并且提供了容纳B细胞靶向结构域和实体瘤靶向结构域的单个CAR。设想通过多种基因转移方法(包括病毒载体、非病毒转座子载体和mRNA)来产生双特异性CAR T细胞。此外，在设想之列的是一种基因系统，其中B细胞靶向CAR被置于药物调节表达形式(如TamR)。该系统的优选可选方式为共表达CD19特异性CAR以及被开发用于实体瘤疗法的CAR或TcR，所述CD19特异性CAR也可容纳人scFv结合结构域、去免疫细胞外间隔区以及4-1BB：ζ第二代胞质尾区连同细胞表面标签(例如EGFRt或HER2tg)，或者所述CAR可经由连接cDNA的基因元件(例如核糖体跳跃序列或IRES)而共表达；并且所述用于实体瘤疗法的CAR或TcR与第二细胞表面标签共表达。该系统的一个可选方式允许不同的慢病毒载体容纳各CAR/标签(或TcR/标签)以及使用两种慢病毒的混合物来共转导人T细胞。本文所述的可选方式期望实现允许对表达细胞表面标签及其相应CAR两者的转导T细胞进行纯化的细胞选择(免疫磁性、细胞分选、其它)。
双特异性CAR T细胞(容纳靶向正常B细胞的驱动CAR和靶向实体瘤的第二随从CAR)的新特征源自于由本文所述的几种可选方式得出的观察结果，其中注入白血病患者内的CD19 CAR T细胞经历了多log扩增并且被活化以介导全身性白血病(包括中枢神经系统(CNS))的消退。这种现象已在对由非恶性B细胞引起的活化作出应答而具有CD19CAR T细胞扩增的缓解期患者中观察到。B细胞介导的扩增反映了它们对CD19 CAR T细胞的独特免疫刺激特性以及它们在血液、淋巴结和骨髓(静脉内输注后，注入的CAR T细胞迁移至此处)中的分布。
相比之下，在涉及转移性神经母细胞瘤患者的临床试验中使用的靶向实体瘤的CAR T细胞(例如CE7CAR T细胞)显示植入失败，这可能是由于注入的T细胞向肿瘤转移部位的有限迁移以及有限的实体瘤免疫刺激活性及其免疫抑制环境。本文所述的细胞通过允许B细胞靶向CAR来驱动输注的CAR T细胞的活化、增殖和扩散来克服该障碍，所述CAR T细胞具有提供重定向杀死实体瘤的第二随从CAR。
在本文所述的几种可选方式中，已产生可证明以下内容的数据：1)人T细胞可与两种慢病毒共转导，所述慢病毒容纳CD19CAR-T2AEGFRt和第二CAR(抗CD20)-T2A-HER2t；2)共转导的人T细胞具有部分共表达EGFRt和HER2t这二者的细胞；3)使用对EGFRt(爱必妥)和HER2(赫赛汀)具有特异性的免疫磁性选择试剂可将双阳性T细胞纯化至同质；4)双CAR T细胞保留了CD19重定向特异性和获得性第二特异性(例如CD20)；5)TamR调节的转基因表达基因系统允许实现CD19CAR的他莫昔芬依赖性表达；6)正在进行的实验是对表达CD19驱动×L1CAM随从双CAR的T细胞被B细胞活化并随后表现出增强的抗实体瘤活性的情况进行测试。
本文所述的可选方式的预期用途是增强CAR T细胞疗法对人类癌症(特别是实体瘤)的治愈潜力。由于其存在随从CAR并且通过识别B细胞谱系细胞表面抗原(例如CD19)的驱动CAR克服了给予患者后未达最佳标准的活化和扩增，该驱动/随从CAR产品可被用于治疗患有任何实体瘤的患者。在一个可选方式中，所述驱动CAR被置于药物调节的表达系统(例如TamR-tf)中，允许实现如下过程的循环：驱动CAR扩增继以“静息(rest)”期和B细胞重建期。此外，通过输注源自患者的B细胞和表达细胞表面B细胞抗原的T-APC，增强这种效果以实现增强的肿瘤靶向是在预期内的。该策略可被用于如下环境：借助其内源性TcR或导入的TcR分离肿瘤反应性T细胞从而实现肿瘤特异性；并且驱动子是B细胞抗原特异性CAR。
在一些可选方式中，证明了可使用与慢病毒的共转导来导入双CAR构建体。在考虑之列的是将载体作用(vectorization)压缩至单个载体中，例如使用非病毒转座子系统(如睡美人转座子转座酶)。
携带CAR的T细胞表现出针对经治疗患者中延长的B细胞发育不良的潜力。因此，TamR调节的表达系统被考虑用于开启和关闭CD19驱动CAR的反应性，从而允许阵发性(episodic)B细胞重建。或者，使CAR T细胞配置有自杀基因以允许B细胞恢复期和/或在CART细胞消融(ablation)后重新输注患者B细胞。在一些可选方式中，B细胞靶向CAR处于药物的控制之下。
然而，本发明的携带CAR的T细胞的其它不良作用也可包括细胞因子风暴。因此，对CAR T细胞疗法的不良作用的管理可通过在启动子控制下表达CAR或通过本领域技术人员已知的离体方法并入自杀基因系统来进行。在本文提供的细胞的一些可选方式中，所述细胞进一步包含自杀基因系统。
表达双特异性嵌合抗原受体的细胞
如本文所述，还提供了包含双特异性CAR的细胞。在一些可选方式中，提供了细胞，其中所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，而第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或作为非B细胞肿瘤的肿瘤的靶标。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，结合L1CAM的表位是CE7表位。在一些可选方式中，结合L1CAM的靶标是CE7表位。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。
提供了表达双特异性CAR的T细胞，其中所述双特异性CAR包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，而第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性；由于B细胞结合结构域促进效应细胞的体内扩增和活化，所以预期还会增强过继性转移的CAR重定向T细胞针对实体瘤的治疗效力。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。
携带双特异性CAR的T细胞具有针对经治疗患者中延长的B细胞发育不良的潜力。这通过使用TamR调节的表达系统开启和关闭双特异性CAR的反应性来缓解，从而允许阵发性B细胞重建。或者，可使双特异性CAR T细胞配置有自杀基因以允许B细胞恢复期和/或在双特异性CAR T细胞消融后重新输注患者B细胞。在一些可选方式中，所述双特异性CAR处于药物的控制之下。
在某些情况下，携带双特异性CAR的T细胞可能会引起细胞因子风暴。对双特异性CAR T细胞疗法的这些不良作用的管理可通过在启动子控制下表达双特异性CAR或通过本领域技术人员已知的离体方法并入自杀基因系统来进行。在本文提供的细胞的一些可选方式中，所述细胞进一步包含自杀基因系统。
组合物
在所述方法和组合物的一些可选方式中，所述方法和组合物被用于在患有癌症的人内治疗、改善或消除癌症。在本文提供的方法和组合物的一些可选方式中，有需要的患者为患有复发性顽固性神经母细胞瘤的处于小儿年龄的人。在一些可选方式中，所述癌症为实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由以下癌症组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
细胞产品将是限定组分CD4+和CD8+亚群产品。所述产品将与SCR慢病毒共转导，所述SCR慢病毒指导CD19CAR(4-1BB：ζ)和EGFRt以及CE7R CAR(4-1BB：ζ)和EGFRt的表达。在本文所述的一些可选方式中，试验采用了使用EGFRt和HER2tg的CAR/慢病毒对。
如本文所述的，开发了CD19特异性CAR和实体瘤靶向CAR。本文所述的可选方式为通过在T细胞中表达多种CAR或进行双特异性CAR的工程化而产生的双特异性CAR产品。使用与随从CAR或TcR(具有实体瘤特异性)共表达的驱动CAR(对B细胞具有特异性)作为用于驱动高水平植入以增强肿瘤应答的策略的概念是原创的。
在一些可选方式中，提供了组合物，其中所述组合物包含本文所述的任何一种或多种细胞。在一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，而第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或作为非B细胞肿瘤的肿瘤的靶标。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。
在一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，而第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或作为非B细胞肿瘤的肿瘤的靶标。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。
如本文所述的，“药物赋形剂”或“药物载体”可指用作溶剂的运载体或惰性介质，在其中配制和/或给予用于治疗的药用活性剂或T细胞。载体可包括聚合物胶束、脂质体、基于脂蛋白的运载体、纳米颗粒运载体、树枝状聚合物和/或本领域技术人员已知的用于T细胞的其它载体。理想的载体或赋形剂可为无毒的、生物相容的、非免疫原性的、可生物降解的并且可避免被宿主的防御机制识别的。
在一些可选方式中，提供了用于人类疗法的组合物或产品组合，其中所述组合物或产品组合包含药物赋形剂和本文所述的任何可选方式中的至少一种遗传修饰的T细胞群。在一些可选方式中，所述赋形剂为药物载体。在一些可选方式中，所述药物载体包括药物组合物。
所述组合物可进一步包含载体或药物载体。如本文所述的，载体可指用于运送活性药物或用于给予的细胞的无治疗价值的物质。如本文所述的，药物载体可指可指用作溶剂的运载体或惰性介质，在其中配制和/或给予药用活性剂。理想的载体可为无毒的、生物相容的、非免疫原性的、可生物降解的并且可避免被宿主的防御机制识别的。在本文所述的几种可选方式中，描述了包含有助于维持T细胞完整性的载体或赋形剂的组合物。在一些可选方式中，所述载体为药物载体。在一些可选方式中，所述药物载体包括药物组合物。
在一些可选方式中，所述组合物包含CD8+ T细胞毒性淋巴细胞和/或CD4+ T辅助淋巴细胞，其中所述CD8+ T细胞毒性淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞，并且其中所述CD4+ T辅助淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述组合物具有的CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶10至10∶1。在一些可选方式中，CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶1。
制备包含两种嵌合抗原受体以获得双特异性的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备包含嵌合抗原受体的细胞的方法。在一些可选方式中，所述方法包括：将包含编码第一嵌合抗原受体的多核苷酸序列的第一核酸导入细胞中，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)；将包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的多核苷酸序列的第二核酸导入所述细胞中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于两个不同的载体上。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于同一个载体上。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于两个不同的病毒载体上。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于同一个载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体和/或慢病毒载体。在所述方法的一些可选方式中，所述载体在包含两种载体的混合物的组合物中被导入所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和/或所述第二核酸通过质粒或微环转座子导入。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸的导入同时进行，其中所述第一核酸和所述第二核酸被制备成组合物用于递送至细胞。在一些可选方式中，第一嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达关联，而第二嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达关联；或者其中第一嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达关联，而第二嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达关联。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白是抑制性蛋白的显性负性形式或促增殖蛋白、T细胞信号调节蛋白或肿瘤微环境响应性蛋白的组成型活性形式。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白是双特异性T细胞衔接器(bi-specific T-cell engager，BiTE)。如本文所述的，BiTE是可用作抗癌药物的人工双特异性单克隆抗体。在一些可选方式中，BiTE为博纳吐单抗(Blinatomomab)或Solitomab。BiTE为包含不同抗体的单链可变片段或来自四种不同基因的氨基酸序列的融合蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子、融合蛋白或肽。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12和/或IL15。在所述方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括刺激细胞。在一些可选方式中，对于CD8细胞，细胞用50U/ml白细胞介素-2(IL-2)刺激(S1)。在一些可选方式中，对于CD4细胞，细胞用白细胞介素-7(IL-7)刺激。在一些可选方式中，细胞用抗CD3/CD28珠刺激。
在一些方面，采用Her2tg或EGFRt标签作为遗传标签/标记允许对表达目的转基因的细胞疗法的同质群进行离体选择和纯化。此外，Her2tg可用于在体内追踪细胞疗法；例如，Her2tg可用作血液、骨髓和脑脊髓液抽吸物的赫赛汀染色的靶标，以检查表达转基因的细胞疗法的持久性，从而跟进癌症缓解，直至患者得到持续性治疗。当与另一种遗传标签(如EGFRt)一起使用时，Her2tg通过允许表达多种转基因的细胞进行协同纯化来扩展CAR疗法的治疗范围。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫磁性选择或细胞分选来选择细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫结合细胞表面上的标记蛋白来选择细胞。在一些可选方式中，所述标记蛋白为Her2tg和/或EGFRt。
用转座酶系统来制备包含两种嵌合抗原受体的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备包含嵌合抗原受体的细胞的方法。在一些可选方式中，所述方法包括：将第一载体和第二载体两种载体共同递送至细胞中，其中所述第一载体包含编码第一嵌合抗原受体的第一核酸，其中所述嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二载体包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的第二核酸序列，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于两个反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为睡美人反向末端重复基因序列或PiggyBaC反向末端重复基因序列。在一些可选方式中，所述载体为质粒或微环转座子。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述细胞中导入多核苷酸，其中所述多核苷酸序列编码mRNA，其中所述mRNA编码转座酶。在一些可选方式中，所述转座酶为睡美人转座酶或Piggyback转座酶。在一些可选方式中，第一嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达关联，而第二嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达关联；或者其中第一嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达关联，而第二嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达关联。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。
在一些可选方式中，所述载体含有连接至编码与遗传标签可操作地连接的嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子。可采用一个或多个PiggyBac转座子。在一些可选方式中，一个PB包含连接至编码嵌合抗原受体和第一遗传标签的多核苷酸的启动子，另一个PiggyBac包含连接至编码嵌合抗原受体和不同的第二遗传标签的多核苷酸的启动子。构建体的各个元件由核酸(例如编码自切割T2A序列的核酸)分隔。在一些可选方式中，各PiggyBac在嵌合抗原受体方面彼此不同，包括但不限于间隔区长度和序列、细胞内信号传导结构域和/或遗传标签序列。
在一些方面，采用Her2tg或EGFRt标签作为遗传标签/标记允许对表达目的转基因的细胞疗法的同质群进行离体选择和纯化。此外，Her2tg可用于在体内追踪细胞疗法；例如，Her2tg可用作血液、骨髓和脑脊髓液抽吸物的赫赛汀染色的靶标，以检查表达转基因的细胞疗法的持久性，从而跟进癌症缓解，直至患者得到持续性治疗。当与另一种遗传标签(如EGFRt)一起使用时，Her2tg通过允许表达多种转基因的细胞进行协同纯化来扩展CAR疗法的治疗范围。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫磁性选择或细胞分选来选择细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫结合细胞表面上的标记蛋白来选择细胞。在一些可选方式中，所述标记蛋白为Her2tg和/或EGFRt。
制备包含双特异性嵌合抗原受体以获得双特异性的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将包含编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸序列的核酸导入细胞中，所述双特异性嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的第一结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)以及对实体瘤上的配体具有特异性的第二结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述多核苷酸位于病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述病毒载体为γ逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体与标记蛋白共表达。在一些可选方式中，所述标记蛋白为EGFRt或Her2tg。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码可溶性蛋白的载体导入所述细胞中。
在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫磁性选择或细胞分选来选择细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫结合细胞表面上的标记蛋白来选择细胞。
在一些方面，采用Her2tg或EGFRt标签作为遗传标签/标记允许对表达目的转基因的细胞疗法的同质群进行离体选择和纯化。此外，Her2t可用于在体内追踪细胞疗法；例如，Her2t可用作血液、骨髓和脑脊髓液抽吸物的赫赛汀染色的靶标，以检查表达转基因的细胞疗法的持久性，从而跟进癌症缓解，直至患者得到持续性治疗。当与另一种遗传标签(如EGFRt)一起使用时，Her2t通过允许表达多种转基因的细胞进行协同纯化来扩展CAR疗法的治疗范围。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫磁性选择或细胞分选来选择表达双特异性CAR的细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫结合细胞表面上的标记蛋白来选择表达双特异性标记的细胞。在一些可选方式中，所述标记蛋白为Her2tg和/或EGFRt。
用转座酶系统来制备包含双特异性嵌合抗原受体以获得双特异性的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备包含双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法。在一些可选方式中，所述方法包括：将载体导入细胞中，其中所述载体包含编码双特异性嵌合抗原受体的第一核酸，所述双特异性嵌合抗原受体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，所述第二结合结构域对实体瘤上的配体具有特异性；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述第一反向末端重复基因序列和所述第二反向末端重复基因序列为睡美人反向末端重复基因序列或PiggyBaC反向末端重复基因序列。在一些可选方式中，所述载体为质粒或微环转座子。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向所述细胞中导入多核苷酸，其中所述多核苷酸序列编码mRNA，其中所述mRNA编码转座酶。在一些可选方式中，所述转座酶为睡美人转座酶或Piggyback转座酶。在一些可选方式中，双特异性嵌合抗原受体的表达与EGFRt或Her2tg的共表达关联。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。
在一些可选方式中，所述载体含有连接至编码与遗传标签可操作地连接的嵌合抗原受体的多核苷酸的启动子。可采用一个或多个PiggyBac转座子。在一些可选方式中，一个PB包含连接至编码嵌合抗原受体和第一遗传标签的多核苷酸的启动子，另一个PiggyBac包含连接至编码嵌合抗原受体和不同的第二遗传标签的多核苷酸的启动子。构建体的各个元件由核酸(例如编码自切割T2A序列的核酸)分隔。在一些可选方式中，各PiggyBac在嵌合抗原受体方面彼此不同，包括但不限于间隔区长度和序列、细胞内信号传导结构域和/或遗传标签序列。
在一些方面，采用Her2tg或EGFRt标签作为遗传标签/标记允许对表达目的转基因的细胞疗法的同质群进行离体选择和纯化。此外，Her2tg可用于在体内追踪细胞疗法；例如，Her2tg可用作血液、骨髓和脑脊髓液抽吸物的赫赛汀染色的靶标，以检查表达转基因的细胞疗法的持久性，从而跟进癌症缓解，直至患者得到持续性治疗。当与另一种遗传标签(如EGFRt)一起使用时，Her2tg通过允许表达多种转基因的细胞进行协同纯化来扩展CAR疗法的治疗范围。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫磁性选择或细胞分选来选择细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括通过免疫结合细胞表面上的标记蛋白来选择细胞。在一些可选方式中，所述标记蛋白为Her2tg和/或EGFRt。
在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法
在一些可选方式中，提供了在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法，其中所述方法包括：向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种细胞或组合物或由本文所述的任何可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞。在一些可选方式中，给予的细胞通过同种异体转移进行提供。在一些可选方式中，给予的细胞通过自体转移进行提供。在一些可选方式中，所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体对肿瘤上的配体具有特异性。在所述细胞的一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或作为非B细胞肿瘤的肿瘤上的肿瘤靶标。
在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体、肽和/或多肽亲和分子。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体、肽和/或多肽亲和分子。在一些可选方式中，第一标记蛋白与第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与第二嵌合抗原受体共表达。在一些可选方式中，与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与第二嵌合抗原受体共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与第二嵌合抗原受体共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+ T细胞。
在一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域，其中第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，而第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148、EMMPRIN/CD147和/或作为非B细胞肿瘤的肿瘤的靶标。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，细胞表面肿瘤特异性分子为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。
在一些可选方式中，对受试者的B细胞发育不良进行监测。在一些可选方式中，给予受试者药物以诱导B细胞特异性CAR表达。
在一些可选方式中，CAR的表达处于可由药物诱导的第一启动子的控制之下。根据以下方面来选择药物：安全性记载、有利的药代动力学谱、组织分布、细胞外空间和胞质溶胶(cytosol)之间的低分配系数(partition coefficient)、低免疫原性、低毒性和/或在淋巴细胞中高表达。在具体的可选方式中，对药物进行选择，所述药物经FDA批准，在淋巴细胞中提供转基因表达，不激活其它不期望的基因表达，并且对不含任何异种组分的启动子进行诱导。在一些可选方式中，诱导型启动子由与药物相互作用的转录激活因子激活。转录激活因子在存在药物的情况下被激活或者能够结合并且激活诱导型启动子。
药物的具体可选方式为结合至转录激活因子的雌激素受体配体结合结构域的药物。在一些可选方式中，所述药物包括他莫昔芬、其代谢物、类似物以及它们的药学上可接受的盐和/或水合物或溶剂化物(solvate)。在一些可选方式中，药物的具体可选方式为结合至转录激活因子的雌激素受体配体结合结构域的药物。在一些可选方式中，所述药物为雌激素或糖皮质激素。
他莫昔芬(CAS RN：10540-29-1)也被称为2-(4-((1Z)-1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基)-N，N-二甲基-乙胺或(Z)-2-(对-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基)-N，N-二甲基胺(IUPAC)，分子式为C26H29NO，M.W.为371.52。他莫昔芬是一种具有组织特异性活性的选择性雌激素受体调节剂。他莫昔芬在乳腺组织中作为抗雌激素剂(抑制剂)起作用，而在胆固醇代谢、骨密度和子宫内膜中的细胞增殖中作为雌激素(刺激剂)起作用。他莫昔芬经常作为药学上可接受的盐来口服给予。例如，他莫昔芬柠檬酸盐(RN 54965-24-1，M.W.为563.643)适用于治疗转移性乳腺癌，并且在乳房切除术腋窝清扫和乳腺照射后的妇女中作为治疗乳腺癌的辅助剂。他莫昔芬柠檬酸盐也适用于降低处于乳腺癌高风险的妇女中乳腺癌的发病率。
大鼠、小鼠和人乳腺癌患者中的他莫昔芬代谢物，包括主要代谢物N-去甲基他莫昔芬(RN 31750-48-8，M.W.为357.494)和4-羟基他莫昔芬(4-OHT)(RN 68392-35-8，M.W.为387.52，Afimoxifene)，公开于Robinson等，Metabolites，pharmacodynamics，andpharmacokinetics of tamoxifen in rats and mice compared to the breast cancerpatient.Drug Metab Dispos January 1991 19：36-43，以引用的方式将其全部内容并入本文。其它细胞色素P-450代谢物公开于Crewe等，2002，包括顺式-4-羟基他莫昔芬(RN174592，M.W.为387.52；Afimoxifene，E-异构体)和4′-羟基他莫昔芬((Z)-4-(1-(4-(2-(二甲基氨基)乙氧基)苯基)-1-苯基丁-1-烯-2-基)苯酚)。参见Crewe等，2002，Metabolism ofTamoxifen bv recombinant human cytochrome P-450enzymes：Formation of the 4-hydroxy，4’-hydroxy and N-desmethyl metabolites and isomerization of trans-4-hydroxytamoxifen，Drug Metab Dispos，30(8)：869-874，图1，以引用的方式将其全部内容并入本文。
与他莫昔芬具有结构相似性的化合物包括但不限于：顺式他莫昔芬(RN 13002-65-8，M.W.为371.521)、4-甲基他莫昔芬(RN 73717-95-5，M.W.为385.548)、N-去甲基他莫昔芬(RN 31750-48-8，M.W.为357.494)、(Z)-去乙基甲基他莫昔芬(RN 15917-50-7，M.W.为357.494)、(E)-去乙基甲基他莫昔芬(RN 31750-45-5，M.W.为357.494)、反式-4-羟基他莫昔芬(RN 68047-06-3，M.W.为387.52)、Afimoxifene(RN 68392-35-8，M.W.为387.52，4-羟基他莫昔芬)、Afimoxifene的E-异构体(RN 174592-47-3，M.W.为387.52)、4-氯代他莫西芬(RN 77588-46-6，M.W.为405.966)、4-氟代他莫西芬(RN 73617-96-6，M.W.为389.511)、托瑞米芬(Toremifene)(RN 89778-26-7，M.W.为405.966)、去乙基他莫昔芬(RN 19957-51-8，M.W.为343.47)、(E)-去乙基他莫昔芬(RN 97151-10-5，M.W.为343.47)、(Z)-去乙基他莫昔芬(RN 97151-11-6，M.W.为343.47)、米泼昔芬(Miproxifene)(RN 129612-87-9，M.W.为429.6)、2-(对-(β-乙基-α-苯基苯乙烯基)苯氧基)三乙胺(RN 749-86-0，M.W.为399.575)、屈洛昔芬(Droloxifene)(RN 82413-20-5，M.W.为387.52)、4-碘代他莫昔芬(RN116057-68-2，M.W.为497.413)、二氢他莫昔芬(RN 109640-20-2，M.W.为373.537)、(E)-N，N-二甲基-2-(4-(1-(2-甲基苯基)-2-苯基-1-丁烯基)苯氧基)乙胺(RN 97150-96-4，M.W.为385.548)或4-羟基托瑞米芬(RN110503-62-3，M.W.为421.965)；和/或它们的药学上可接受的盐和/或水合物或溶剂化物。
例如，他莫昔芬的柠檬酸盐或与他莫昔芬具有结构相似性的化合物的柠檬酸盐包括但不限于：他莫昔芬柠檬酸盐(RN 54965-24-1，M.W.为563.64)、2-(对-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基)-N，N-二甲基乙胺柠檬酸盐(RN 7244-97-5，M.W.为563.64)、(E)-他莫昔芬柠檬酸盐(RN76487-65-5，M.W.为563.64)、托瑞米芬柠檬酸盐(RN 89778-27-8，M.W.为598.088)、屈洛昔芬柠檬酸盐(RN 97752-20-0，M.W.为579.64)、2-(对-(1，2-双(对-甲氧基苯基)-1-丁烯基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐(RN 42920-39-8，M.W.为651.748)、2-(4-(1，2-二苯基乙烯基)苯氧基)-N，N-二乙基-乙胺2-羟基-1，2，3，-丙烷三羧酸酯(RN 40297-42-5，M.W.为563.643)、2-(对-(α-苯基苯乙烯基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐(RN 102433-95-4，M.W.为563.64)、2-(对-(2-(对-甲氧基苯基)-1-苯基-1-丁烯基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐(1∶1)(RN 42824-34-0，M.W.为637.72)、2-(对-(1-(对-甲氧基苯基)-2-苯基丙烯基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐(RN 13554-24-0，M.W.为607.696)、2-(对-(α-(对-甲氧基苯基)苯乙烯基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐一水合物(RN 13542-71-7，M.W.为593.669)、2-(对-(对-甲氧基-α-苯基苯乙基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐(RN 16421-72-0，M.W.为595.685)、α-(对-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-β-乙基-对-甲氧基-α-苯基苯乙醇柠檬酸盐(1∶1)(RN 35263-93-5，M.W.为639.737)、1-(对-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-2-(对-甲氧基苯基)-1-苯乙醇柠檬酸盐(M.W.为611.68)、α-对-(2-(二乙基氨基)乙氧基)苯基)-β-乙基-α-(对-羟基苯基)-对-甲氧基苯乙醇柠檬酸盐(RN 35263-96-8，M.W.为655.737)和/或2-(对-(对-甲氧基-α-甲基苯乙基)苯氧基)三乙胺柠檬酸盐(RN 15624-34-7，M.W.为533.614)。
在一些可选方式中，用于诱导嵌合抗原受体表达的药物的有效量是使转基因表达增加(与未诱导的表达水平和/或基础表达水平相比)的量。在一些可选方式中，可以使用药物的已知剂量和药代动力学曲线容易地确定该量。
在一些可选方式中，诱导型启动子具有低水平的基础活性。当使用慢病毒载体时，与细胞被诱导而表达基因时相比，未被诱导的细胞中的基础活性水平为20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更少。基础活性水平可通过使用流式细胞术在不存在诱导剂(例如药物)的情况下测量转基因(例如标记基因)的表达量来确定。
在一些可选方式中，相比于未诱导的活性或基础活性，诱导型启动子提供了高水平的诱导活性。在一些可选方式中，诱导状态下的活性水平是未诱导状态下的活性水平的2倍、4倍、6倍、8倍或10倍或更高。在一些可选方式中，在缺少反式激活因子(transactivator)的情况下，在小于10天、8天、6天、4天、2天或1天(不包括0天)内，处于诱导型启动子控制下的转基因表达被关闭。
在一些可选方式中，诱导型启动子可被设计和/或修饰以提供低水平的基础活性、高水平的诱导性和/或短时间的可逆性。在一些可选方式中，所述诱导型启动子为7xHBD/mE1b启动子。
在一些可选方式中，给予受试者药物以诱导对肿瘤靶向具有特异性的CAR。在一些可选方式中，向受试者给予他莫昔芬或其活性代谢物，其中他莫昔芬或其活性代谢物诱导B细胞特异性CAR的表达。在一些可选方式中，其中受试者被诊断患有B细胞发育不良，停止他莫昔芬或其代谢物的给予。在一些可选方式中，所述方法进一步包括给予他莫昔芬或其代谢物和静息期的循环。在一些可选方式中，所述方法进一步包括向有需要的受试者给予源于受试者的B细胞。在一些可选方式中，所述方法进一步包括给予表达细胞表面B细胞配体或抗原的T-APC。在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞相关疾病。在一些可选方式中，所述疾病为癌症。在一些可选方式中，所述疾病为感染。在一些可选方式中，所述感染为细菌性感染或病毒性感染。在一些可选方式中，所述癌症为实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由以下癌症组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述受试者经鉴定或选择以接受非B细胞相关疾病疗法、抗癌疗法、抗感染疗法、抗细菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括测量或评估对所述非B细胞相关疾病、癌症、感染、细菌性感染、病毒性感染或肿瘤的抑制。在一些可选方式中，所述方法进一步包括测量或评估对所述非B细胞相关疾病、癌症、感染、细菌性感染、病毒性感染或肿瘤的抑制。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在向受试者导入、提供或给予本文提供的细胞或组合物中的任意一种或多种或由本文提供的方法中的任意一种或多种制备的细胞之前、期间或之后，向该受试者导入、提供或给予另外的治疗剂(例如化疗剂、抗病毒剂或抗细菌剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，通过过继性细胞转移将所述细胞或组合物导入、提供或给予所述受试者。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入、提供或给予诱导嵌合抗原受体表达的药物。在一些可选方式中，所述药物为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述药物为类固醇。在一些可选方式中，所述受试者为哺乳动物物种。在一些可选方式中，所述受试者是牛、羊、猪、马、狗、猫、灵长类动物或人。在一些可选方式中，所述受试者为人。
在一些可选方式中，所述方法进一步包括对受试者的B细胞发育不良或细胞因子风暴的症状进行评估。在一些可选方式中，所述受试者患有高热、血压升高或降低、低血压、缺氧、癫痫或失语症。在一些可选方式中，所述受试者的铁蛋白和/或C-反应蛋白升高。在本文提供的方法的一些可选方式中，其中所述细胞包含自杀基因系统，所述方法进一步包括向受试者给予前药。
在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤、炎症相关弥漫大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病中发生的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在一些可选方式中，所述受试者患有乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤或卵巢癌。在一些可选方式中，所述受试者患有顽固性和复发性神经母细胞瘤。
编码嵌合抗原受体或双特异性嵌合抗原受体的核酸以及制备编码嵌合抗原受体 或双特异性嵌合抗原受体的核酸的方法
在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头序列为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，第一启动子是可由类固醇(例如能够结合至雌激素受体的化合物或雌激素受体配体)诱导的。在一些可选方式中，所述类固醇为flustravant。
在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对由B细胞表达的细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头序列为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由flustravant诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由类固醇(例如雌激素、糖皮质激素)诱导的。
在一些可选方式中，提供了编码双特异性嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头序列为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，第五核酸序列进一步在该第五核酸序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第二核酸编码抗体或其结合片段或scFv，并且其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，而所述第三核酸包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性；或者其中所述第二核酸编码抗体或其结合片段或scFv，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，而所述第三核酸包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性。
在一些可选方式中，提供了编码自杀基因系统的核酸。
载体
在一些可选方式中，提供了用于表达嵌合抗原受体的载体，所述嵌合抗原受体对促进B细胞的体内扩增和活化具有特异性，其中所述载体包含本文所述的任何可选方式中的核酸。在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5＇末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头序列为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，第一启动子是可由类固醇诱导的。
在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对由B细胞表达的细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头序列为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由flustravant诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由类固醇诱导的。
在一些可选方式中，所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头序列为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，第五核酸序列进一步在该第五核酸序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第二核酸编码抗体或其结合片段或scFv，并且其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，而所述第三核酸包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列，并且其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性；或者其中所述第二核酸编码抗体或其结合片段或scFv，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，而所述第三核酸包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性。
在一些可选方式中，所述载体表达对促进B细胞的体内扩增和活化具有特异性的嵌合抗原受体。在一些可选方式中，所述载体表达对靶向实体瘤具有特异性的嵌合抗原受体。在一些可选方式中，所述载体包含编码第一启动子序列的第一序列，其中所述第一启动子序列促进所述嵌合抗原受体的表达，并且其中所述载体包含编码第二启动子序列的第二序列，其中所述第二启动子序列促进标记蛋白的表达。
在一些可选方式中，所述载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述载体包含两个反向重复，其中所述核酸位于所述两个反向重复之间。在一些可选方式中，所述载体是微环。在一些可选方式中，所述反向重复是睡美人反向重复或PiggyBac反向重复。
其它可选方式
显著表达标记EGFRt和HertG及它们附加的CAR
如图3所示，标记Her2t及其变体基于它们各自的接头表现出对赫赛汀可变的结合亲和力。T淋巴细胞中使用的CAR是双重CD19CAR-T2A-Her2tG/CD20CAR-T2A-EGFRt。如图3A所示，用含有Her2t变体(Her2t(CD28铰链)、Her2t(IgG4铰链)或Her2tG(gly-ser接头))的3μl慢病毒对H9T细胞进行转导。随后将转导的H9细胞培养5天，并用生物素化的赫赛汀(Herceptin-bio)和链霉亲和素缀合的第二荧光团(SA-PE)进行染色。结果表明，Her2t变体Her2tG呈现出结合赫赛汀的最优能力，Her2t(IgG4铰链)具有适中的赫赛汀结合，而Her2t(CD28铰链)具有最弱的赫赛汀结合。这些细胞从未用CD3/CD28珠进行刺激(图3C)。如图3B所示，图3B为按照下图4从PBMC分离的CD4+和CD8+原代T细胞的分离(D0)、生长(D0-21)、选择(D14和D21)以及扩增(REP-D21)的时间线。这些细胞是用两种单独的含有CD19CAR-T2A-Her2tG或CD20CAR-T2A-EGFRt的慢病毒以各慢病毒MOI＝1进行转导的CD8+ T细胞。在转导7天后(培养的D10)，将选择前的CD8+ T细胞用爱必妥-APC、生物素化的赫赛汀和链霉亲和素缀合的第二荧光团(SA-PE)进行染色，而选择后的细胞在S1Sp1D12进行染色(见图4)。如图3D所示，在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中进行细胞裂解，用于Western印迹分析。通过BCA测定法(Pierce)对细胞裂解物进行分析，将其均匀上样到凝胶上，并且Western印迹用一抗抗CD247(CD3ζ)和二抗IRDye 800CW缀合的山羊抗小鼠抗体进行探测(LI-COR)。印迹在Odyssey红外成像系统(LI-COR)上成像。
选择CD4 T细胞和CD8 T细胞
从源自于健康供体的血液丢弃包(blood discard kits)(Puget Sound血液中心)的人外周血单核细胞(PBMC)中分离CD4和CD8混合(bulk)T细胞。按照制造商的方案，使用CD4或CD8分离试剂盒(Miltenyi Biotec)将来自各个供体的PBMC分成两组(CD4或CD8混合分离)并且用Automacs耗尽(depleted)。然后用50U/ml白细胞介素-2(IL-2)(针对CD8)、5ng/ml白细胞介素-7(IL-7)(针对CD4)、1ng/ml白细胞介素-15(IL-15)和抗CD3/CD28珠(Life Technologies)对分离的细胞进行刺激(S1)。在使用硫酸鱼精蛋白(1∶100稀释)和MOI为1的病毒进行活化后第3天，对CD4和CD8 T细胞进行转导，随后在32℃下以800×g离心30分钟。借助生物素缀合的赫赛汀或爱必妥和抗生物素微珠(Miltenyi)通过免疫磁性选择来富集各细胞系的Her2t+或EGFRt+亚群。转导后12天至18天，通过刺激对选定的CD19CAR+ T细胞和/或CD20CAR+ T细胞进行扩增，该刺激在存在50U/ml IL-2(CD8)、5ng/ml IL-7(CD4)和1ng/ml IL-15的情况下用经辐射(8000rad)的TM-LCL以1：7的T细胞：TM-LCL比率进行(Sp1)。在刺激后第12天(D12)收集细胞并且对其进行流式分析。
Western印迹中目的细胞是S1Sp1D12(见图3)并且已针对它们各自的标记进行了纯化。双转导细胞为含有CD19CAR-T2A-Her2tG和CD20CAR-T2A-EGFRt的CD8+ T细胞。该western印迹特异性针对CAR的ζ部分。它不涉及两种标记蛋白Her2tG或EGFRt的表达(见图3C和图4)。该western印迹证明了CD8+ T细胞中的CAR表达。最重要地，在双转导CD8+ T细胞中看到两种CAR(CD19CAR和CD20CAR)的表达。
CD19和CD20 CAR T细胞针对K562靶谱细胞的特异性
以30∶1、10∶1、3.3∶1或1.1∶1的比率将CD8 Tcm与K562靶细胞进行共培养。只有双转导T细胞能够靶向所有表达抗原的K562细胞。如图5A所示，进行了4小时铬释放测定，表明CD19-CAR T细胞和CD20-CAR T细胞特异性地针对K562靶谱细胞。以30∶1、10∶1、3.3∶1或1.1∶1的比率将CD8 Tcm与K562靶细胞进行共培养。只有双转导T细胞能够靶向所有表达抗原的K562细胞。CD19CAR-T2A-Her2t CD8 Tcm和CD19CAR-T2A-EGFRt CD8 Tcm表现出相似的裂解能力。还使用针对K562靶细胞的携带CD19、CD20和CD19/CD20的细胞进行了24小时细胞因子释放测定。以2∶1的T细胞∶靶细胞比率将CD8 Tcm与K562靶细胞共培养24小时，然后分析上清液中效应细胞因子的存在。相对于CD19CAR-T2A-EGFRt转导的CD8 Tcm，CD19CAR-T2A-Her2t转导的CD8 Tcm产生更多样的图谱和更高水平的效应细胞因子。图5A和图5B中的子图相同(从左到右：K562 CD19、K562 CD20和K562 CD19/CD20)。对于CD4Tcm观察到相似的结果。CD19CAR-T2A-Her2t CD8 Tcm和CD19CAR-T2A-EGFRt CD8 Tcm表现出类似的裂解能力，表明了携带CAR的T细胞的效力。如图5C所示，对于CD4 Tcm观察到相似的结果。
用含有CD19靶向的CRISPR向导序列的质粒进行电穿孔的Raji细胞
图6A-图6D示出的是用含有CD19靶向的CRISPR向导序列的质粒进行电穿孔的Raji细胞的实验结果。使用CD19微珠对Raji细胞进行负向选择。耗尽CD19+细胞后，对CD19-细胞进行克隆选择并且进行扩增用于下游实验。电穿孔7天后，使用CD19微珠对Raji细胞进行负向选择(图6A)。然后使用来自图5B和图5C的相同细胞进行4小时铬释放测定和bioplex测定。同样使用CD4+细胞进行铬释放测定。
用表达CAR的T细胞注射的NSG小鼠
图7示出的是注射5e6NSO-IL15细胞然后静脉内注射10e6Mock T细胞或表达CAR的T细胞的NSG小鼠的实验结果。在T细胞注射后第14天，采集小鼠骨髓并进行流式分析。上面一行示出的是门控活细胞和单个细胞。中间一行门控示出CD8+x CD45+细胞。下面一行观察了CD45+细胞群以及对于标记Her2tG和EGFRt的染色。结果表明EGFRt和Her2tG可被用于有效地体内追踪T细胞(图7，上面一行)。图7中间一行中示出的是针对活力细胞(93.6％淋巴细胞)、单个细胞(98.8％)和存活细胞(99.9％)进行门控的细胞。所示出的CD8和CD45染色的细胞从左至右为Mock、CD19CAR-T2A-Her2t、CD19CAR-T2A-EGFRt Tcm和CD19CAR-Her2tg/CD20CAR-EGFRt。在活力细胞、单个细胞、存活细胞门内记录至少1×107个细胞。因此，尽管CD45+细胞代表约1％的群体，但是其相当于1×105个细胞。剩余的细胞是小鼠骨髓细胞。图7最后一行中所示的是Her2t和EGFRt阳性T细胞的多重分选纯化。对于该实验，将H9细胞(5×106亲代、Her2t+、EGFRt+或Her2t+/EGFRt+)混合在一起然后进行纯化。基于生物素化的赫赛汀和抗生物素多重分选珠对细胞进行初步纯化。然后除去多重分选珠，并且随后基于爱必妥-APC和抗APC微珠对阳性部分进行纯化。最终的阳性部分对Her2t和EGFRt而言是双重阳性的。
小鼠表达CAR T细胞以抑制肿瘤生长
将表达eGFP:ffluc的Raji靶细胞(106)静脉注射至6-10周龄的小鼠内。7天后，将总共107个CAR-Her2t+、CAR-EGFRt+或表达双CAR的T细胞(1∶1比率的CD4∶CD8)进行静脉内(IV)注射。以如下方式每周进行生物发光成像：腹膜内(i.p.)注射4.29mg/小鼠D-荧光素(Xenogen)、异氟烷麻醉并使用IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)在注射D-荧光素10分钟后成像。使用活体成像软件4.3版(Perkin Elmer)对萤光素酶活性进行分析，并且在目的区域内对光子通量进行分析。如图8所示，相对于Mock T细胞，表达单CAR或双CAR的T细胞能够抑制肿瘤生长。
CD4 T细胞和CD8 T细胞可用两种单独的编码CAR的慢病毒载体进行转导
CD4和CD8纯化的T细胞用CD3/CD28珠进行刺激，然后用编码第2代41BB-ζ短间隔区FMC63CD19CAR或第2代41BB-ζ短间隔区CE7CAR的临床级病毒进行共转导。每个CAR后接着读码框内T2A-EGFRt。转导的T细胞通过EGFRt进行纯化并在S1D14(CD4)或S1D15(CD8)进行冷冻。过程进展计划为PD0170。如图9A所示，流式分析证明了转导的细胞基于EGFRt表达被纯化至同质。结果没有表现出在EGFRt+群体中表示出多少百分比的CD19-或CE7CAR或者T细胞是否的确被病毒双转导。FMC63CD19CAR包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：12中所示的序列编码。在一些可选方式中，FMC63CD19CAR包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的序列编码。
CD19和CE7CAR双转导的T细胞表现出针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的特异性裂 解
以不同的效应细胞与靶细胞比率将Mock(CAR-)T细胞和双转导T细胞与靶细胞系共培养4小时。K562对CD19和L1CAM两个靶标而言都是阴性的。TM-LCL、TM-LCL-OKT3、K562+CD19和Raji是仅CD19阳性的。SK-N-DZ是仅L1CAM阳性的。SK-N-DZ+CD19对这两个靶标而言都是阳性的。如图9B所示，转导的CD8 T细胞或混合CD4∶CD8 T细胞引起高水平的CD19CAR活性。如针对SK-N-DZ细胞系所表明的，存在较低水平的CE7CAR活性。这些结果表明T细胞可用两种单独的编码CAR的病毒成功进行转导，并且所得到的T细胞群能够识别多种抗原。
CD19-和CE7CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的细胞因子
以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将双转导的CD4和CD8 T细胞群与靶细胞系共培养24小时。如图9C所示，在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-g或TNF-a的存在。双转导T细胞产生应答于表达CD19的所有悬浮细胞(LCL和K562)靶标的细胞因子。即使当第二代S-间隔区CE7CAR在100％的T细胞群中表达，仍然是几乎没有或者没有应答于并不罕见的SK-N-DZ的细胞因子产生。由于不知道多少百分比的T细胞群含有CE7CAR，当与图9B中的铬数据结合时，这并不令人惊讶。
双转导T细胞在颅内异种移植肿瘤模型中引发抗肿瘤活性
小鼠群用0.2e6表达GFP：ffluc、CD19t和IL-2的SK-N-DZ进行颅内接种(i.c.)(第0天)并用2e6双转导的CD4∶CD8 T细胞(1∶1比率)进行颅内接种(i.c.)(第7天)。图9D所示的为对用Mock(仅PBS，左图)或双转导的CD4∶CD8 CE7CAR T细胞(中图)处理的小鼠群中的肿瘤进行连续生物发光成像的结果。处理组和对照组的存活率的Kaplan-Meier分析(右图)。如通过生物发光成像中延长的减少所证明的，双转导细胞能够消退和控制肿瘤生长。然而，随着时间推移确实长出肿瘤，而小鼠缓慢地死于肿瘤生长并被处死。
CD4 T细胞和CD8 T细胞可用两个单独的编码CAR的慢病毒载体进行转导并且双阳 性细胞群可通过相关标记进行鉴定
CD4和CD8纯化的T细胞用CD3/CD28珠进行刺激，然后用编码第2代41BB-ζ短间隔区FMC63CD19CAR或/和第2代41BB-ζ长突变体(L235D、N297Q)间隔区CE7CAR的慢病毒各自进行转导或进行共转导。CD19CAR后接着读码框内T2A-Her2tG，而CE7CAR后接着T2A-EGFRt。转导的T细胞通过EGFRt(CE7CAR)进行纯化并进行冷冻。流式分析在第9天进行，证明了转导的细胞基于EGFRt表达被纯化至同质(见图10A)。对CD4 T细胞而言，具有～56％的Her2tG(CD19CAR)阳性，而对CD8 T细胞而言，具有～44％的双阳性。
CD19和CE7CAR双转导的CD8+ T细胞表现出针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的特异 性裂解
以不同的效应细胞与靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或CE7CAR)和双转导CD8+ T细胞与靶细胞系共培养4小时。K562对CD19和L1CAM两个靶标而言都是阴性的。K562-OKT3被用作阳性对照。Be2为仅L1CAM阳性的。Be2+CD19t对两个靶标而言均为阳性。结果证明，单转导CD8+ T细胞引发针对其同源抗原的特异性裂解。然而，双转导T细胞有效地识别并且裂解表达CD19、L1CAM或两种抗原的细胞。所有CD8+ T细胞都能够针对K562-OKT3引发相似水平的细胞裂解。这些结果表明T细胞可用两种单独的编码CAR的病毒成功进行转导，通过选择标记进行纯化，并且所得到的T细胞群能够识别多种抗原(见图10B)。
CD19-和CE7CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或L1CAM阳性靶细胞系的细胞因子
以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或CE7CAR)和双转导的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞与靶细胞系共培养24小时。如图10C所示，在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-g或TNF-a的存在。双转导细胞能够针对所有表达靶标的细胞系释放细胞因子。虽然在表达单独的CE7CAR的T细胞和表达双CAR的T细胞之间针对Be2-CD19t的细胞因子产生没有差异，但在表达CD19CAR的T细胞和双转导T细胞之间针对K562-CD19t的细胞因子产生具有差异。这与双转导T细胞群的CD19CAR阳性相一致。
双转导T细胞在颅内异种移植肿瘤模型中引发抗肿瘤活性
小鼠群用0.2e6表达GFP:ffluc和IL-2的SK-N-DZ进行颅内接种(i.c.)(第0天)并用2e6双转导的CD4∶CD8 T细胞(1∶1比率)进行颅内接种(i.c.)(第7天)。对用Mock(未转导的，左图)、表达CE7CAR的T细胞(中图)或双转导的CD4∶CD8 CE7CAR T细胞(右图)处理的小鼠群中的肿瘤进行连续生物发光成像。处理组和对照组的存活率的Kaplan-Meier分析(下图)。如通过生物发光成像中延长的减少所证明的，单表达CE7CAR细胞和双转导细胞两者均能够消退和控制肿瘤生长。由于肿瘤长出，在本研究的任意终点之前将用单表达CE7CAR的T细胞处理的小鼠亚群处死。这些结果说明双转导T细胞能够以与单表达CE7CAR的T细胞相似的水平在体内根除肿瘤。因此，对双转导T细胞群而言，没有抑制CE7CAR活性(见图10D)。
CD4 T细胞和CD8 T细胞可用两个单独的编码CAR的慢病毒载体进行转导并且双阳 性细胞群可通过相关标记进行鉴定
CD4和CD8纯化的T细胞用CD3/CD28珠进行刺激，然后用编码第2代41BB-ζ短间隔区FMC63CD19CAR或/和第2代41BB-ζ短间隔区ROR1CAR的慢病毒各自进行转导或进行共转导。CD19CAR后接着读码框内T2A-Her2tG，而ROR1CAR后接着T2A-EGFRt。转导的T细胞通过EGFRt(ROR1CAR)进行纯化并进行冷冻。流式分析在第9天进行，证明了转导的细胞基于EGFRt表达被纯化至同质(见图11A)。对CD4 T细胞而言，具有～86.7％的Her2tG(CD19CAR)阳性，而对CD8 T细胞而言，具有～88.1％的双阳性。
CD19和ROR1CAR双转导的CD8+ T细胞表现出针对CD19或ROR1阳性靶细胞系的特异 性裂解
以不同的效应细胞与靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或ROR1CAR)和双转导CD8+ T细胞与靶细胞系共培养4小时。单ROR1CAR T细胞含有第二代41BB-ζ或CD28-ζ短间隔区。K562对CD19和ROR1两个靶标而言都是阴性的。K562-OKT3被用作阳性对照。对Raji(CD19+)进行转导以表达ROR1。Be2、SK-N-AS和SK-N-DZ是ROR1阳性的。结果证明，单转导CD8+ T细胞引发针对其同源抗原的特异性裂解。然而，双转导T细胞有效地识别并且裂解表达CD19、ROR1或两种抗原(Raji ROR1)的细胞。所有CD8+ T细胞都能够针对K562-OKT3引发相似水平的细胞裂解。这些结果表明T细胞可用两种单独的编码CAR的病毒成功进行转导，通过选择标记进行纯化，并且所得到的T细胞群能够识别多种抗原(见图11B)。
CD19-和ROR1CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或ROR1阳性靶细胞系的细胞因子
以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或ROR1CAR)和双转导的CD4+ T细胞与靶细胞系共培养24小时。在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-γ或TNF-α的存在。双转导细胞能够以与表达单个CAR的T细胞相似的水平针对所有表达靶标的细胞系释放细胞因子(见图11C)。
CD19-和ROR1CAR双转导的T细胞群产生针对CD19或ROR1阳性靶细胞系的细胞因子
以2∶1的效应细胞对靶细胞比率将Mock(CAR-)、单转导(CD19CAR或ROR1CAR)和双转导的CD4+ T细胞与靶细胞系共培养24小时。在24小时孵育期后，通过Bioplex测定来分析共培养物的上清液中IL-2、IFN-γ或TNF-α的存在。双转导细胞能够以与表达单个CAR的T细胞相似的水平针对所有表达靶标的细胞系释放细胞因子(见图11D)。
双转导T细胞在颅内异种移植肿瘤模型中引发抗肿瘤活性
小鼠群用0.2e6表达GFP:ffluc的Be2进行颅内接种(i.c.)(第0天)并用2e6双转导的CD4∶CD8 T细胞(1∶1比率)进行颅内接种(i.c.)(第7天)。对用Mock(未转导的，左图)、表达ROR1CAR(中间左图)或双转导的CD4∶CD8 CE7CAR T细胞(中间右图)处理的小鼠群中的肿瘤进行连续生物发光成像。处理组和对照组的存活率的Kaplan-Meier分析(右图)。如通过生物发光成像中的短减少所证明的，单表达ROR1CAR细胞和双转导细胞两者均能够暂时消退肿瘤生长。然而，随后小鼠快速死于(succumbed to)Be2肿瘤长出。单转导T细胞和双转导T细胞两者均能够显著延长存活。这些结果说明双转导T细胞能够以与单表达ROR1CAR的T细胞相似的水平在体内治疗肿瘤(见图11D)。因此，对双转导T细胞群而言，没有抑制ROR1CAR活性。
更多可选方式
编码对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的嵌合抗原受体的核酸
在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列是T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：38中所示的核酸序列进行编码。
编码对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的可诱导的嵌合抗原受体的核酸
在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
编码对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的嵌合抗原受体的核酸
在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸序列共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
编码对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的可诱导的嵌合抗原受体的核酸
在一些可选方式中，提供了编码嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸序列共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
编码双特异性嵌合抗原受体的核酸
在一些可选方式中，提供了编码双特异性嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ IDNO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ IDNO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
编码可诱导的双特异性嵌合抗原受体的核酸
在一些可选方式中，提供了编码双特异性嵌合抗原受体的核酸，其中所述核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3＇末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第四核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3＇末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码跨膜结构域的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第七核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第九核酸，其中所述第九核酸共价连接至所述第八核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ IDNO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。
用于表达对促进B细胞的体内扩增和活化具有特异性的嵌合抗原受体的载体
在一些可选方式中，提供了用于表达对促进B细胞的体内扩增和活化具有特异性的嵌合抗原受体的载体，其中所述载体包含本文提供的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
用于表达对靶向实体瘤具有特异性的嵌合抗原受体或TcR的载体
在一些可选方式中，提供了用于表达对靶向实体瘤具有特异性的嵌合抗原受体或TcR的载体，其中所述载体包含本文提供的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸序列共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸序列共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ IDNO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
用于表达双特异性嵌合抗原受体的载体
在一些可选方式中，提供了用于表达双特异性嵌合抗原受体的载体，其中所述双特异性嵌合抗原受体对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性并且对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，所述载体包含本文提供的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3＇末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第四核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第七核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第九核酸，其中所述第九核酸共价连接至所述第八核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3＇末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的嵌合抗原受体或TcR
在一些可选方式中，提供了由任一可选方式中的核酸或载体编码的对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的嵌合抗原受体或TcR。在一些可选方式中，所述载体用于表达对促进B细胞的体内扩增和活化具有特异性的嵌合抗原受体，其中所述载体包含本文提供的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5＇末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3＇末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3＇末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3＇末端；包含编码信号传导结构域的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域和/或CD3-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3＇末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3＇末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3＇末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ IDNO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的嵌合抗原受体或TcR
在一些可选方式中，提供了由任一可选方式中的核酸或载体编码的对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的嵌合抗原受体或TcR。在一些可选方式中，所述载体用于表达对靶向实体瘤具有特异性的嵌合抗原受体或TcR，其中所述载体包含本文提供的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第三核酸，其中所述第三核酸序列共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第五核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述编码嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸序列共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、1D01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ IDNO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性并且对细胞表面肿瘤特异性分子具有特 异性的双特异性嵌合抗原受体
在一些可选方式中，提供了由任一可选方式中的核酸或载体编码的对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性并且对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的双特异性嵌合抗原受体。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性，并且对细胞表面肿瘤特异性分子也具有特异性，所述载体包含本文提供的任一可选方式中的核酸。在一些可选方式中，编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸序列；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第二核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第四核酸，其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第六核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第七核酸，其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸包含：包含编码前导序列的序列的第一核酸；包含编码可由药物诱导的第一启动子的序列的第二核酸，其中所述第一核酸共价连接至所述第二核酸的5′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第三核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第三核酸共价连接至所述第二核酸的3′末端；包含编码抗体或其结合片段或scFv的序列的第四核酸，其中所述抗体或其结合片段或scFv对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性或者对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性，并且其中所述第四核酸共价连接至所述第三核酸的3′末端；包含编码去免疫细胞外间隔区的序列的第五核酸，其中所述第五核酸共价连接至所述第四核酸的3′末端；包含编码跨膜结构域的序列的第六核酸，其中所述第六核酸共价连接至所述第五核酸的3′末端；包含编码信号传导结构域序列的序列的第七核酸，其中所述信号传导结构域包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域包含4-1BB结构域、CD3-ζ结构域和/或CD28-ζ结构域，并且其中所述第七核酸共价连接至所述第六核酸的3′末端；包含编码接头的序列的第八核酸，其中所述第八核酸共价连接至所述第七核酸的3′末端；以及包含编码标记结构域的序列的第九核酸，其中所述第九核酸共价连接至所述第八核酸的3＇末端，从而得到所述编码双特异性嵌合抗原受体的核酸。在一些可选方式中，所述接头为核糖体跳跃序列或IRES序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为P2A序列、T2A序列、E2A序列或F2A序列。在一些可选方式中，所述核糖体跳跃序列为T2A。在一些可选方式中，所述T2A序列包含SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：34中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述接头进一步在该接头的5′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由他莫昔芬和/或其代谢物诱导的。在一些可选方式中，所述第一启动子是可由药物诱导的。在一些可选方式中，所述编码跨膜结构域的序列进一步在该编码跨膜结构域的序列的3′末端包含IRES序列。在一些可选方式中，所述B细胞特异性细胞表面分子为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述核酸进一步包含编码自杀基因系统的多核苷酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述药物为类固醇(例如雌激素受体的配体)。在一些可选方式中，所述类固醇为他莫昔芬和/或其代谢物。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为癌抗原。在一些可选方式中，所述细胞表面肿瘤特异性分子为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述间隔区是IgG4铰链间隔区。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQID NO：1中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：2中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：4中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述间隔区包含SEQ ID NO：39中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：40中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，CD28-ζ结构域包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：6中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述4-1BB结构域包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：8中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述CD3-ζ结构域包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：10中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD19具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：12中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对CD20具有特异性。在一些可选方式中，对B细胞特异性细胞表面分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：14中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对L1CAM上的CE7表位具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：16中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：18中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EGFR 806具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列并且由SEQ IDNO：20中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对Her2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：22中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对GD2具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：24中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(2H4)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ ID NO：25中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：26中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，对细胞表面肿瘤特异性分子具有特异性的所述抗体或其结合片段或scFv对EphA2(4H5)具有特异性。在一些可选方式中，所述抗体或其结合片段或scFv包含SEQ IDNO：27中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：28中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列。在一些可选方式中，所述粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号序列包含SEQ ID NO：29中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：30中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述前导序列包含SEQID NO：31中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：32中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含Her2tG。在一些可选方式中，Her2tG包含SEQ ID NO：35中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：36中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述标记结构域包含EGFRt。在一些可选方式中，EGFRt包含SEQ ID NO：37中所示的氨基酸序列并且由SEQ ID NO：38中所示的核酸序列进行编码。在一些可选方式中，所述载体为病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体或泡沫病毒载体。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统或mRNA载体。
包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞
在一些可选方式中，提供了包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR的细胞，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/Fc εRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，第一标记蛋白与第一嵌合抗原受体共表达，第二标记蛋白与第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
包含双特异性嵌合抗原受体的细胞
在一些可选方式中，提供了包含双特异性嵌合抗原受体的细胞，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域：第一结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)；以及第二结构域，其中所述第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对ROR1具有特异性。
制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将包含编码第一嵌合抗原受体的多核苷酸序列的第一核酸或第一载体导入细胞中，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)；将包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的多核苷酸序列的第二核酸或第二载体导入所述细胞中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于不同的病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体和/或慢病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体作为包含所述病毒载体的组合物被共同导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统和/或mRNA载体。在一些可选方式中，第一嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达相关联，而第二嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达相关联；或者其中第一嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达相关联，而第二嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达相关联。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述病毒载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入包含编码自杀基因系统的序列的载体。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在所述方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括刺激所述细胞。在一些可选方式中，对于CD8细胞，细胞用白细胞介素-2(IL-2)刺激。在一些可选方式中，对于CD4细胞，细胞用白细胞介素-7(IL-7)刺激。在一些可选方式中，细胞用抗CD3/CD28珠刺激。
制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将第一载体和第二载体两种载体共同递送至细胞中，其中所述第一载体包含编码第一嵌合抗原受体的第一核酸序列，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)；和第二载体，其中所述第二载体包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的第二多核苷酸序列，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒和/或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为睡美人转座子或PiggyBac转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括刺激所述细胞。在一些可选方式中，对于CD8细胞，细胞用白细胞介素-2(IL-2)刺激。在一些可选方式中，对于CD4细胞，细胞用白细胞介素-7(IL-7)刺激。在一些可选方式中，细胞用抗CD3/CD28珠刺激。
制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将第一载体和第二载体两种载体共同递送至细胞中，其中所述第一载体包含编码第一嵌合抗原受体的第一核酸序列，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)；以及第二载体，其中所述第二载体包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的第二多核苷酸序列，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒和/或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为睡美人转座子或PiggyBac转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括刺激所述细胞。在一些可选方式中，对于CD8细胞，细胞用白细胞介素-2(IL-2)刺激。在一些可选方式中，对于CD4细胞，细胞用白细胞介素-7(IL-7)刺激。在一些可选方式中，细胞用抗CD3/CD28珠刺激。
制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将包含编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸序列的核酸导入细胞中，所述双特异性嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的第一结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)，以及对实体瘤上的配体具有特异性的第二结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述多核苷酸位于病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述多核苷酸位于转座子、整合酶载体系统和/或mRNA载体上。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体与标记蛋白共表达。在一些可选方式中，所述标记蛋白为EGFRt或Her2tg。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述病毒载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入包含编码自杀基因系统的序列的载体。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在所述方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括刺激所述细胞。在一些可选方式中，对于CD8细胞，细胞用白细胞介素-2(IL-2)刺激。在一些可选方式中，对于CD4细胞，细胞用白细胞介素-7(IL-7)刺激。在一些可选方式中，细胞用抗CD3/CD28珠刺激。
制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法
在一些可选方式中，提供了制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法，其中所述方法包括：将载体导入细胞中，其中所述载体包含编码双特异性嵌合抗原受体的第一核酸，所述双特异性嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的第一结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)以及第二结合结构域，其中所述第二结合结构域包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为睡美人转座子或PiggyBac转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。在所述方法的一些可选方式中，所述方法进一步包括刺激所述细胞。在一些可选方式中，对于CD8细胞，细胞用白细胞介素-2(IL-2)刺激。在一些可选方式中，对于CD4细胞，细胞用白细胞介素-7(IL-7)刺激。在一些可选方式中，细胞用抗CD3/CD28珠刺激。
组合物
在一些可选方式中，提供了包含任意一种或多种可选方式中的任意一种或多种细胞的组合物。在一些可选方式中，所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF283、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，第一标记蛋白与第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域：第一结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)；以及第二结合结构域，其中所述第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对L1CAM具有特异性。在一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对ROR1具有特异性。
在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法
在一些可选方式中，提供了在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关疾病的方法，其中所述方法包括：鉴定用于治疗的未患有B细胞相关疾病的受试者；向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文任意一种或多种可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文任意一种或多种可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞或本文任意一种或多种可选方式中的组合物。在一些可选方式中，所述组合物包含本文任意一种或多种可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文所述的任一种可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞。在一些可选方式中，所述组合物包含CD8+ T细胞毒性淋巴细胞和/或CD4+ T辅助淋巴细胞，其中所述CD8+ T细胞毒性淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+ T细胞；并且其中所述CD4+ T辅助淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述组合物具有的CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶10至10∶1。在一些可选方式中，CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶1。在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞相关疾病。在一些可选方式中，所述受试者未患有B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、原发纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、Waldenstrom巨球蛋白血症、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性皮肤弥漫大B细胞淋巴瘤(腿型)、老年EBV阳性弥漫大B细胞淋巴瘤、炎症相关弥漫大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、HHV8相关多中心性Castleman病中发生的大B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、具有介于弥漫大B细胞淋巴瘤和经典型霍奇金淋巴瘤之间的特征的不能分类的B细胞淋巴瘤、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤。在一些可选方式中，疾病为癌症。在一些可选方式中，疾病为感染，其中所述感染为细菌性或病毒性感染。在一些可选方式中，所述癌症为实体瘤。在一些可选方式中，所述实体瘤选自于由以下癌症组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。在一些可选方式中，所述受试者患有顽固性和复发性神经母细胞瘤。在一些可选方式中，所述受试者经鉴定或选择以接受非B细胞相关疾病疗法、抗癌疗法、抗感染疗法、抗细菌疗法、抗病毒疗法或抗肿瘤疗法。在一些可选方式中，所述方法进一步包括测量或评估对所述非B细胞相关疾病、癌症、感染、细菌性感染、病毒性感染或肿瘤的抑制。在一些可选方式中，所述方法进一步包括：在向用于治疗的受试者导入、提供或给予本文所述的任一种可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文所述的任一种可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞或本文所述的任一种可选方式中的组合物之前、期间或之后，向该受试者导入、提供或给予另外的治疗剂(例如化疗剂、抗病毒剂或抗细菌剂)或辅助疗法(例如放射疗法和/或手术)。在一些可选方式中，所述组合物包含本文所述的任一种可选方式中的任意一种或多种细胞或由本文所述的任一种可选方式中的任意一种或多种方法制备的细胞。在一些可选方式中，所述组合物包含CD8+ T细胞毒性淋巴细胞和/或CD4+T辅助淋巴细胞，其中所述CD8+ T细胞毒性淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞；并且其中所述CD4+ T辅助淋巴细胞选自于由以下细胞组成的组：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述组合物具有的CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶10至10∶1。在一些可选方式中，CD4+ T辅助淋巴细胞与CD8+ T淋巴细胞的比率为1∶1。在一些可选方式中，所述组合物包含任意一种或多种可选方式中的任意一种或多种细胞。在一些可选方式中，所述细胞包含第一嵌合抗原受体和第二嵌合抗原受体或TcR，其中所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性(其促进效应细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二嵌合抗原受体或TcR对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2 RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、Clq R1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在所述细胞的一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在所述细胞的一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在所述细胞的一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR在所述细胞中是诱导型表达的。在所述细胞的一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体和/或所述第二嵌合抗原受体或TcR的表达处于调控元件的控制下。在所述细胞的一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在所述细胞的一些可选方式中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含抗体或其结合片段或scFv、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在所述细胞的一些可选方式中，第一标记蛋白与第一嵌合抗原受体共表达，而第二标记蛋白与第二嵌合抗原受体或TcR共表达。在一些可选方式中，与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为EGFRt，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为Her2tg；或者与第一嵌合抗原受体共表达的第一标记蛋白为Her2tg，而与第二嵌合抗原受体或TcR共表达的第二标记蛋白为EGFRt。在所述细胞的一些可选方式中，所述细胞包含双特异性嵌合抗原受体，其中所述双特异性嵌合抗原受体包含两个结合结构域：第一结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，以及第二结合结构域，其中所述第二结合结构域对肿瘤上的配体具有特异性。在一些可选方式中，所述B细胞上的配体为CD1d、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23/FcεRII、CD24、CD25/IL-2RαCD27/TNFRSF7、CD32、CD34、CD35、CD38、CD40(TNFRSF5)、CD44、CD45、CD45.1、CD45.2、CD54(ICAM-1)、CD69、CD72、CD79、CD80、CD84/SLAMF5、LFA-1、CALLA、BCMA、B细胞受体(BCR)、IgM、IgD、B220/CD45R、ClqR1/CD93、CD84/SLAMF5、BAFF R/TNFRSF13C、B220/CD45R、B7-1/CD80、B7-2/CD86、TNFSF7、TNFRSF5、ENPP-1、HVEM/TNFRSF14、BLIMP1/PRDM1、CXCR4、DEP-1/CD148或EMMPRIN/CD147。在所述细胞的一些可选方式中，所述肿瘤上的配体为癌抗原。在一些可选方式中，所述癌抗原为EGFR、HER2、间皮素、癌睾丸抗原、L1CAM、O-乙酰化GD2、GD2、新抗原、Var2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2(GPC2)、HPV抗原、甲胎蛋白、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原、p53或ras的异常产物、EphA2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-C2、PRAME、SSX2、脂肪分化相关蛋白、AIM2、ALDH1A1、BCLX、EpCAM、CS274、CPSF、细胞周期蛋白D1、DKK1、ENAH、EpCAM、EphA3、EZH2、FGF5、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、G250、HLA-DOB、Hepsin、ID01、IGF2B3、IL13Rα2、肠羧酸酯酶、α-胎儿蛋白、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、M-CSF、MCSP、mdm-2、Meloe、中期因子、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC5AC、p53、PAX5、PBF、PRAME、PSMA、RAGE-1、RGS5、RhoC、RNF43、RUF43、FU2AS、secernin 1、SOX10、STEAP1、存活素、端粒酶、TPBG、VEGF、WT1、NY-ESO-1或ROR1。在所述细胞的一些可选方式中，所述癌抗原为L1CAM。在一些可选方式中，所述癌抗原为ROR1。在一些可选方式中，所述第一结合结构域和所述第二结合结构域包含抗体或其部分、受体配体或其突变体、肽和/或多肽亲和分子或结合伴侣。在一些可选方式中，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在所述细胞的一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。在所述细胞的一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+ T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+ T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+ T细胞、调节性CD8+ T细胞、IPS衍生CD8+ T细胞、效应记忆CD8+ T细胞和混合CD8+ T细胞。在一些可选方式中，所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+ T辅助淋巴细胞：初始CD4+ T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+ T细胞、调节性CD4+ T细胞、IPS衍生CD4+ T细胞、效应记忆CD4+ T细胞和混合CD4+ T细胞。在一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对L1CAM具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在所述细胞的一些可选方式中，所述第一嵌合抗原受体对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二嵌合抗原受体对ROR1具有特异性，并且其中所述嵌合抗原受体进一步包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。在所述细胞的一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对L1CAM具有特异性。在所述细胞的一些可选方式中，所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性，其中所述B细胞上的配体为CD19，而其中所述第二结合结构域对ROR1具有特异性。在一些可选方式中，制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法包括：将包含编码第一嵌合抗原受体的多核苷酸序列的第一核酸或第一载体导入细胞中，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)；将包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的多核苷酸序列的第二核酸或第二载体导入所述细胞中，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于不同的病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体和/或慢病毒载体。在一些可选方式中，所述病毒载体作为包含所述病毒载体的组合物被共同导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述载体为转座子、整合酶载体系统和/或mRNA载体。在一些可选方式中，第一嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达相关联，而第二嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达相关联；或者其中第一嵌合抗原受体的表达与Her2tg的共表达相关联，而第二嵌合抗原受体的表达与EGFRt的共表达相关联。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述病毒载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入包含编码自杀基因系统的序列的载体。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法包括：将第一载体和第二载体两种载体共同递送至细胞中，其中所述第一载体包含编码第一嵌合抗原受体的第一核酸序列，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二载体包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的第二多核苷酸序列，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒和/或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为PiggyBac转座子或睡美人转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，制备具有嵌合抗原受体的细胞的方法包括：将第一载体和第二载体两种载体共同递送至细胞中，其中所述第一载体包含编码第一嵌合抗原受体的第一核酸序列，所述第一嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二载体包含编码第二嵌合抗原受体或TcR的第二多核苷酸序列，所述第二嵌合抗原受体或TcR包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒和/或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸和所述第二核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为PiggyBac转座子或睡美人转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法包括：将包含编码双特异性嵌合抗原受体的多核苷酸序列的核酸导入细胞中，所述双特异性嵌合抗原受体包含对B细胞上的配体具有特异性的第一结合结构域(其促进B细胞的体内扩增和活化)以及对实体瘤上的配体具有特异性的第二结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述多核苷酸位于病毒载体上。在一些可选方式中，所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体、泡沫病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些可选方式中，所述多核苷酸位于转座子、整合酶载体系统和/或mRNA载体上。在一些可选方式中，所述双特异性嵌合抗原受体与标记蛋白共表达。在一些可选方式中，所述标记蛋白为EGFRt或Her2tg。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。在一些可选方式中，所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。在一些可选方式中，所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。在一些可选方式中，所述病毒载体进一步包含编码自杀基因系统的核酸。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，所述方法进一步包括导入包含编码自杀基因系统的序列的载体。在一些可选方式中，所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。在一些可选方式中，制备具有双特异性嵌合抗原受体的细胞的方法包括：将载体导入细胞中，其中所述载体包含编码双特异性嵌合抗原受体的第一核酸，所述双特异性嵌合抗原受体包含第一结合结构域和第二结合结构域，其中所述第一结合结构域对B细胞上的配体具有特异性(其促进B细胞的体内扩增和活化)，并且其中所述第二结合结构域包含对实体瘤上的配体具有特异性的结合结构域；扩增所述细胞并分离所述细胞。在一些可选方式中，所述载体为质粒或微环转座子。在一些可选方式中，所述第一核酸位于第一反向末端重复基因序列和第二反向末端重复基因序列之间。在一些可选方式中，所述反向末端重复基因序列为PiggyBac转座子或睡美人转座子的反向重复。在一些可选方式中，所述方法进一步包括将编码睡美人转座酶或PiggyBac转座酶的载体导入所述细胞中。
序列表
<110> Seattle Children's Hospital
d/b/a Seattle Children's Research Institute
Jensen, Michael C.
<120> 容纳与B淋巴细胞具有反应性的CAR
和靶向实体瘤抗原的CAR或TCR的用于
靶向实体瘤的双特异性CAR T细胞
<130> SCRI.095WO
<150> 62/202698
<151> 2015-08-07
<160> 40
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> IgG4 hinge spacer（IgG4铰链间隔区）
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> IgG4 hinge spacer（IgG4铰链间隔区）
<400> 2
gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> IgG4-CH3 hinge spacer（IgG4-CH3铰链间隔区）
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> IgG4-CH3 hinge spacer（IgG4-CH3铰链间隔区）
<400> 4
gagagcaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccctggcc agcctcgcga gccccaggtg 60
tacaccctgc ctccctccca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 120
gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag 180
aacaactaca agaccacccc tcccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc 240
cggctgaccg tggacaagag ccggtggcag gaaggcaacg tctttagctg cagcgtgatg 300
cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgtccct gggcaag 357
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Transmembrane CD28 domain（跨膜CD28结构域）
<400> 5
Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Transmembrane CD28 domain（跨膜CD28结构域）
<400> 6
atgttctggg tgctggtggt ggtcggaggc gtgctggcct gctacagcct gctggtcacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtg 84
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> 4-1BB domain（4-1BB结构域）
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
35 40 45
<210> 8
<211> 135
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> 4-1BB domain（4-1BB结构域）
<400> 8
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactgcggg tgaag 135
<210> 9
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CD3-zeta domain（CD3-ζ结构域）
<400> 9
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
1 5 10 15
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
20 25 30
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
35 40 45
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
50 55 60
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
65 70 75 80
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
85 90 95
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105
<210> 10
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CD3-zeta domain（CD3-ζ结构域）
<400> 10
ttcagcagaa gcgccgacgc ccctgcctac cagcagggcc agaatcagct gtacaacgag 60
ctgaacctgg gcagaaggga agagtacgac gtcctggata agcggagagg ccgggaccct 120
gagatgggcg gcaagcctcg gcggaagaac ccccaggaag gcctgtataa cgaactgcag 180
aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagcg gaggcggggc 240
aagggccacg acggcctgta tcagggcctg tccaccgcca ccaaggatac ctacgacgcc 300
ctgcacatgc aggccctgcc cccaagg 327
<210> 11
<211> 244
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> FMC63 CD19scFv
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Leu Gly Asp
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu
115 120 125
Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val
130 135 140
Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp
145 150 155 160
Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp
165 170 175
Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser
195 200 205
Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr
210 215 220
Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 12
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> FMC63 CD19scFv
<400> 12
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 13
<211> 266
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CD20scFv
<400> 13
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser
35 40 45
Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys
50 55 60
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg
85 90 95
Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe
100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
145 150 155 160
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
165 170 175
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
180 185 190
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
195 200 205
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
210 215 220
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
245 250 255
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 14
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CD20scFv
<400> 14
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60
gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120
atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360
accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420
ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480
tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540
gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600
gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660
agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720
gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780
acggtcaccg tctcctca 798
<210> 15
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CE7scFv
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Thr Ser Tyr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala
145 150 155 160
Asn Glu Asp Ile Asn Asn Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly
165 170 175
Asn Ser Pro Arg Leu Leu Ile Ser Gly Ala Thr Asn Leu Val Thr Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Thr Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Glu Leu Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 16
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CE7scFv
<400> 16
caggtgcagc tgcagcagcc tggcgccgag ctggtgaagc caggcgccag cgtgaagctg 60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc ggctactgga tgcactgggt gaagcagaga 120
cccggccacg gcctggaatg gatcggcgag atcaacccca gcaacggccg gaccaactac 180
aacgagcggt tcaagagcaa ggccaccctg accgtggaca agagcagcac caccgccttc 240
atgcagctgt ccggcctgac cagcgaggac agcgccgtgt acttctgcgc cagggactac 300
tacggcacca gctacaactt cgactactgg ggccagggca ccacactgac cgtgagcagc 360
ggcggagggg gctctggcgg cggaggatct gggggagggg gcagcgacat ccagatgacc 420
cagagcagca gcagcttcag cgtgagcctg ggcgaccggg tgaccatcac ctgtaaggcc 480
aacgaggaca tcaacaaccg gctggcctgg tatcagcaga cccccggcaa cagccccagg 540
ctgctgatca gcggcgccac caacctggtg accggcgtgc ccagccggtt tagcggcagc 600
ggctccggca aggactacac cctgaccatc acaagcctgc aggccgagga cttcgccacc 660
tactactgcc agcagtactg gtccaccccc ttcaccttcg gcagcggcac cgagctggaa 720
atcaaa 726
<210> 17
<211> 250
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> ROR1scFv
<400> 17
Pro Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala
20 25 30
Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp
50 55 60
Val Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val
65 70 75 80
Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp
100 105 110
Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr
145 150 155 160
Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser
195 200 205
Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu
210 215 220
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly Gly
245 250
<210> 18
<211> 745
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> ROR1scFv
<400> 18
ccaggaacag ctcgtcgaaa gcggcggcag actggtgaca cctggcggca gcctgaccct 60
gagctgcaag gccagcggct tcgacttcag cgcctactac atgagctggg tccgccaggc 120
ccctggcaag ggactggaat ggatcgccac catctacccc agcagcggca agacctacta 180
cgccacctgg gtgaacggac ggttcaccat ctccagcgac aacgcccaga acaccgtgga 240
cctgcagatg aacagcctga cagccgccga ccgggccacc tacttttgcg ccagagacag 300
ctacgccgac gacggcgccc tgttcaacat ctggggccct ggcaccctgg tgacaatctc 360
tagcggcgga ggcggatctg gtggcggagg aagtggcggc ggaggatctg agctggtgct 420
gacccagagc ccctctgtgt ctgctgccct gggaagccct gccaagatca cctgtaccct 480
gagcagcgcc cacaagaccg acaccatcga ctggtatcag cagctgcagg gcgaggcccc 540
cagatacctg atgcaggtgc agagcgacgg cagctacacc aagaggccag gcgtgcccga 600
ccggttcagc ggatctagct ctggcgccga ccgctacctg atcatcccca gcgtgcaggc 660
cgatgacgag gccgattact actgtggcgc cgactacatc ggcggctacg tgttcggcgg 720
aggcacccag ctgaccgtga ccggc 745
<210> 19
<211> 242
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EGFR 806 scFv
<400> 19
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
115 120 125
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Met Ser Val Ser Leu Gly Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ser Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Asn Ser Asn Ile Gly Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Lys
165 170 175
Ser Phe Lys Gly Leu Ile Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln
210 215 220
Tyr Ala Gln Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys Arg
<210> 20
<211> 725
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EGFR 806 scFv
<400> 20
atgtgcagct gcaggaatca ggcccaagcc tggtcaaacc ctcccagtct ctgagtctga 60
cctgtacagt gactgggtac tccatcacat ctgatttcgc atggaactgg attaggcagt 120
ttccaggcaa taagctggag tggatgggct acatctcata tagcgggaac actcgctata 180
atcccagtct gaaatcacgg atcagcatta ctagagacac cagcaagaac cagttctttc 240
tgcagctgaa ttccgtgacc attgaggata ccgccacata ctattgcgtc acagctggca 300
gaggctttcc atactgggga cagggcacac tggtgactgt cagcgccggc tccacctctg 360
ggagtggaaa acctggctcc ggggaaggat ctacaaaggg agacatcctg atgactcagt 420
ccccaagctc catgtcagtg agcctgggcg acaccgtctc tattacatgt cactctagtc 480
aggatatcaa cagtaatatt ggctggctgc agcagcgacc cggcaagtct ttcaaagggc 540
tgatctatca tggaactaac ctggacgatg aagtgcctag cagattttcc ggctctggga 600
gtggagctga ttacagtctg accatttcaa gcctggagtc agaagacttc gcagattact 660
attgcgtcca gtatgcccag ttcccctgga cttttggcgg gggaaccaag ctggagatca 720
aacgg 725
<210> 21
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Her2scFv
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile
165 170 175
Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp
210 215 220
Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 22
<211> 735
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Her2scFv
<400> 22
gatatccaga tgacccagtc cccgagctcc ctgtccgcct ctgtgggcga tagggtcacc 60
atcacctgcc gtgccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggaaaagctc cgaaactact gatttactcg gcatccttcc tctactctgg agtcccttct 180
cgcttctctg gttccagatc tgggacggat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccg 240
gaagacttcg caacttatta ctgtcagcaa cattatacta ctcctcccac gttcggacag 300
ggtaccaagg tggagatcaa aggcagtact agcggcggtg gctccggggg cggatccggt 360
gggggcggca gcagcgaggt tcagctggtg gagtctggcg gtggcctggt gcagccaggg 420
ggctcactcc gtttgtcctg tgcagcttct ggcttcaaca ttaaagacac ctatatacac 480
tgggtgcgtc aggccccggg taagggcctg gaatgggttg caaggattta tcctacgaat 540
ggttatacta gatatgccga tagcgtcaag ggccgtttca ctataagcgc agacacatcc 600
aaaaacacag cctacctgca gatgaacagc ctgcgtgctg aggacactgc cgtctattat 660
tgttctagat ggggagggga cggcttctat gctatggact actggggtca aggaaccctg 720
gtcaccgtct cgagt 735
<210> 23
<211> 239
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> huGD2scFv
<400> 23
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20 25 30
Val Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Phe Gly
85 90 95
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Pro Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Val
130 135 140
Ser Gly Phe Ser Val Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Ile
165 170 175
Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Phe Met Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp
180 185 190
Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
195 200 205
Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Gly His Tyr Gly Tyr
210 215 220
Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 24
<211> 717
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> huGD2scFv
<400> 24
gagatcgtga tgacccagac ccccgccacc ctgagcgtga gcgccggcga gagggtgacc 60
atcacctgca aggccagcca gagcgtgagc aacgacgtga cctggtacca gcagaagccc 120
ggccaggccc ccaggctgct gatctacagc gccagcaaca ggtacagcgg cgtgcccgcc 180
aggttcagcg gcagcggcta cggcaccgag ttcaccttca ccatcagcag cgtgcagagc 240
gaggacttcg ccgtgtactt ctgccagcag gactacagca gcttcggcca gggcaccaag 300
ctggagatca agaggggtgg cggtggcagc ggcggtggtg gttccggagg cggcggttct 360
caggtgcagc tggtggagag cggccccggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggatc 420
agctgcgccg tgagcggctt cagcgtgacc aactacggcg tgcactgggt gaggcagccc 480
cccggcaagg gcctggagtg gctgggcgtg atctgggccg gcggcatcac caactacaac 540
agcgccttca tgagcaggct gaccatcagc aaggacaaca gcaagaacac cgtgtacctg 600
cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccatgtact actgcgccag caggggcggc 660
cactacggct acgccctgga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 717
<210> 25
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EphA2 (2H4) scFv
<400> 25
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Ser Arg Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr His Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn
145 150 155 160
Asn Tyr His Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
165 170 175
Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile
195 200 205
Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asn Val Phe
210 215 220
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 26
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EphA2 (2H4) scFv
<400> 26
caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgtcttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc attagtagtc gtggtactta cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagct 300
atctttactc actggggccg tggcaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc 420
ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgca aggcgagtca ggacattaat 480
aactatcaca gctggtacca gcagaaacct ggccaggctc ccaggctcct catctatcgt 540
gcaaacagat tggtcgatgg ggtcccagac aggttcagtg gcagcgggta tggaacagat 600
tttaccctca caattaataa catagaatct gaggatgctg catattactt ctgtctgaaa 660
tataatgtgt ttccgtacac gttcggccaa gggaccaagg tggagatcaa a 711
<210> 27
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EphA2 (4H5) scFv
<400> 27
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ala Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ala Ile Phe Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
130 135 140
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu
165 170 175
Leu Ile Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Asp Arg Phe
180 185 190
Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile
195 200 205
Glu Ser Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Lys Tyr Asp Val Phe
210 215 220
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
225 230 235
<210> 28
<211> 711
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EphA2 (4H5) scFv
<400> 28
caggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatacca tgtcttgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag cgcttgagtg gatgggaacc attagtagtg gtggtactta cacctactat 180
ccagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagaagct 300
atctttactt actggggccg tggcaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360
ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttct gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc 420
ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc aagtgaacgt tccgctcagt cctgtaatta 480
ttgataaatt cgaccatggt cgtctttgga ccggtccgag ggtccgagga gtagatagca 540
cgtttgtcta aggtagatgg ggtcccagac aggttcagtg gcagcgggta tggaacagat 600
tttaccctca caattaataa catagaatct gaggatgctg catattactt ctgtctgaaa 660
tatgatgtgt ttccgtacac gttcggccaa gggaccaagg tggagatcaa a 711
<210> 29
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> GMCSF signal sequence（GMCSF信号序列）
<400> 29
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> GMCSF signal sequence（GMCSF信号序列）
<400> 30
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 31
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CD20scFv signal sequence（CD20scFv信号序列）
<400> 31
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 32
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> CD20scFv signal sequence（CD20scFv信号序列）
<400> 32
atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60
<210> 33
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> T2A sequence（T2A序列）
<400> 33
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 34
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> T2A sequence（T2A序列）
<400> 34
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta gg 72
<210> 35
<211> 142
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Her2tG sequence（Her2tG序列）
<400> 35
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly
20 25 30
Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala
35 40 45
His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val
50 55 60
Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu
65 70 75 80
Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp
85 90 95
Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile
115 120 125
Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile
130 135 140
<210> 36
<211> 426
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> Her2tG sequence（Her2tG序列）
<400> 36
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccatgcc accctgagtg tcagccccag aatggctcag tgacctgttt tggaccggag 120
gctgaccagt gtgtggcctg tgcccactat aaggaccctc ccttctgcgt ggcccgctgc 180
cccagcggtg tgaaacctga cctctcctac atgcccatct ggaagtttcc agatgaggag 240
ggcgcatgcc agccttgccc catcaactgc acccactcct gtgtggacct ggatgacaag 300
ggctgccccg ccgagcagag agccagcccg ttaacgggtg gaggcagcgg aggtggctcg 360
tagtagagac gccaccaacc gtaagacgac cagcaccaga acccccacca gaaaccctag 420
gagtag 426
<210> 37
<211> 357
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EGFRt sequence（EGFRt序列）
<400> 37
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 38
<211> 1071
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> EGFRt sequence（EGFRt序列）
<400> 38
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120
aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180
ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240
ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300
gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360
caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420
tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480
gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540
agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600
cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660
ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720
aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780
acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840
gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900
gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960
ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020
ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat g 1071
<210> 39
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> IgG4-CH2(L235D, N297Q) mutant（IgG4-CH2(L235D, N297Q) 突变体）
<400> 39
Ala Pro Glu Phe Asp Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence（人工序列）
<220>
<223> IgG4-CH2(L235D, N297Q) mutant（IgG4-CH2(L235D, N297Q) 突变体）
<400> 40
gcccccgagt tcgacggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 60
ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 120
cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180
cccagagagg aacagttcca gagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 240
caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 300
agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag 330

Claims (40)

1.一种细胞，所述细胞包含：第一嵌合抗原受体(CAR)，所述第一CAR包含对B细胞特异性细胞表面配体具有特异性的第一配体结合结构域；以及第二CAR，所述第二CAR包含对实体瘤细胞表面癌抗原具有特异性的第二配体结合结构域，其中，
所述第一配体结合结构域对CD19具有特异性并且由SEQ ID NO：12的核苷酸序列编码；
所述第二配体结合结构域对L1CAM或ROR1具有特异性并且由SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：18的核苷酸序列编码；以及
所述第一CAR和所述第二CAR各自包含4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
2.如权利要求1所述的细胞，其中所述第二配体结合结构域对L1CAM具有特异性并且由SEQ ID NO：16的核苷酸序列编码。
3.如权利要求1所述的细胞，其中所述第二配体结合结构域对ROR1具有特异性并且由SEQ ID NO：18的核苷酸序列编码。
4.如权利要求1-3中任一项所述的细胞，其中所述第一CAR和/或所述第二CAR在所述细胞中是诱导型表达的。
5.如权利要求1所述的细胞，其中，第一标记蛋白与所述第一CAR共表达；和/或第二标记蛋白与所述第二CAR共表达。
6.如权利要求5所述的细胞，其中，所述第一标记蛋白和所述第二标记蛋白彼此不同，并且选自于Her2tg多肽或EGFRt多肽。
7.如权利要求1所述的细胞，其中所述4-1BB结构域包含SEQ IDNO：7中所示的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的细胞，其中所述CD3-ζ结构域包含SEQ IDNO：9中所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的细胞，所述细胞进一步包含编码自杀基因系统的核酸。
10.如权利要求9所述的细胞，其中所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。
11.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞表达用于治疗的可溶性蛋白。
12.如权利要求11所述的细胞，其中所述可溶性蛋白为稳态细胞因子，所述稳态细胞因子选自于IL2、IL7、IL12或IL15。
13.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞为T细胞。
14.如权利要求13所述的细胞，其中所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。
15.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：初始CD8+T细胞、CD8+记忆T细胞、中枢记忆CD8+T细胞、调节性CD8+T细胞、IPS衍生CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和混合CD8+T细胞。
16.如权利要求14所述的细胞，其中所述细胞为选自于由以下细胞组成的组中的CD4+T辅助淋巴细胞：初始CD4+T细胞、CD4+记忆T细胞、中枢记忆CD4+T细胞、调节性CD4+T细胞、IPS衍生CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和混合CD4+T细胞。
17.制备如权利要求1-16中任一项所述的细胞的方法，所述方法包括：
将编码所述第一CAR的第一核酸和编码所述第二CAR的第二核酸导入细胞中；
扩增包含所述第一核酸和所述第二核酸的所述细胞；以及
分离表达所述第一CAR和所述第二CAR的所述细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中载体包含所述第一核酸和所述第二核酸中的至少一者。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述载体为病毒载体。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述病毒载体选自于逆转录病毒载体、泡沫病毒载体或慢病毒载体。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述病毒载体为γ逆转录病毒载体。
22.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括将包含编码可溶性蛋白的序列的载体导入所述细胞中。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述可溶性蛋白为稳态细胞因子。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述稳态细胞因子为IL2、IL7、IL12或IL15。
25.如权利要求17所述的方法，所述方法进一步包括将编码自杀基因系统的核酸导入所述细胞中。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述自杀基因系统为单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)/更昔洛韦(GCV)自杀基因系统或可诱导的半胱天冬酶自杀基因系统。
27.包含如权利要求1-16中任一项所述的细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
28.包含如权利要求1-16中任一项所述的细胞的细胞群，所述细胞群用于在受试者内治疗、改善或抑制非B细胞相关癌症或感染。
29.如权利要求28所述的细胞群，其中所述细胞群以CD4+T辅助淋巴细胞与CD8+T细胞毒性淋巴细胞的比率为1:10至10:1的比率包含CD4+T辅助淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。
30.如权利要求28所述的细胞群，其中所述非B细胞相关疾病为感染。
31.如权利要求28所述的细胞群，其中所述非B细胞相关疾病为癌症。
32.如权利要求31所述的细胞群，其中所述癌症为实体瘤并且包含L1CAM+细胞或ROR+细胞。
33.如权利要求32所述的细胞群，其中所述实体瘤选自于由以下癌症组成的组：乳腺癌、脑癌、肺癌、肝癌、胃癌、脾癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、子宫癌、皮肤癌、头癌、颈癌、肉瘤、神经母细胞瘤和卵巢癌。
34.如权利要求28所述的细胞群，其中所述受试者患有顽固性神经母细胞瘤或复发性神经母细胞瘤。
35.如权利要求28所述的细胞群，所述细胞群与另外的治疗剂或疗法组合，所述另外的治疗剂或疗法选自于：化疗剂；抗病毒剂；抗细菌剂；放射疗法；手术；前药；以及选自于他莫昔芬、他莫昔芬代谢物或类固醇中的药物。
36.如权利要求35所述的细胞群，其中所述另外的治疗剂包含西妥昔单抗(爱必妥)或曲妥珠单抗(赫赛汀)。
37.如权利要求28所述的细胞群，其中通过过继性细胞转移将所述细胞群给予所述受试者。
38.如权利要求28所述的细胞群，其中所述受试者为哺乳动物。
39.如权利要求38所述的细胞群，其中所述受试者为人。
40.如权利要求39所述的细胞群，其中所述受试者处于小儿年龄。
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Families Citing this family (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106536558A (zh) 2014-04-10 2017-03-22 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 转基因遗传标签和使用的方法
US11458167B2 (en) 2015-08-07 2022-10-04 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
WO2017136829A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 City Of Hope Administration of engineered t cells for treatment of cancers in the central nervous system
US11066479B2 (en) 2016-08-02 2021-07-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies targeting glypican-2 (GPC2) and use thereof
MX2019006631A (es) 2016-12-12 2019-11-12 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Variantes quimericas de factores de transcripcion con sensibilidad aumentada a induccion por ligando de farmaco de expresion transgenica en celulas mamiferas.
US20200215111A1 (en) * 2017-06-30 2020-07-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
US20200157518A1 (en) * 2017-06-30 2020-05-21 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
US20200268794A1 (en) * 2017-06-30 2020-08-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy
US10442867B2 (en) * 2017-07-31 2019-10-15 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-CD19/CD20 immunotherapy
CN109423495A (zh) * 2017-08-24 2019-03-05 上海恒润达生生物科技有限公司 一种双靶向嵌合抗原受体及其用途
KR20200096758A (ko) 2017-10-18 2020-08-13 인트렉손 코포레이션 스페이서를 포함하는 폴리펩타이드 조성물
CA3082010A1 (en) * 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen (bcma)
SG11202003688PA (en) * 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
KR20200080270A (ko) 2017-11-10 2020-07-06 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 종양 항원을 타겟으로 하는 키메릭 항원 수용체
WO2019111250A1 (en) * 2017-12-05 2019-06-13 The Medical Research Infrastructure And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center T-cells comprising two different chimeric antigen receptors and uses thereof
ES2949855T3 (es) 2017-12-05 2023-10-03 Medical Res Infrastructure & Health Services Fund Tel Aviv Medical Ct Linfocitos T que comprenden receptores antigénicos quiméricos anti-CD38 y ant-CD138 y los usos de los mismos
CN109970864A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 一种双向激活共刺激分子受体及其用途
CN109970867B (zh) * 2017-12-28 2022-10-18 上海细胞治疗研究院 一种cd40双向激活共刺激分子受体及其用途
CN109970866B (zh) * 2017-12-28 2022-10-04 上海细胞治疗研究院 一种cd28双向激活共刺激分子受体及其用途
EP3544618A4 (en) * 2018-01-11 2020-02-12 Innovative Cellular Therapeutics Inc. MODIFIED CELL EXPANSION AND USES THEREOF
US10561686B2 (en) 2018-01-12 2020-02-18 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
GB201807862D0 (en) * 2018-05-15 2018-06-27 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
WO2019222579A1 (en) * 2018-05-17 2019-11-21 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric antigen receptors with myd88 and cd40 costimulatory domains
US20200080106A1 (en) 2018-06-06 2020-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Circular rna for translation in eukaryotic cells
EP3810755A4 (en) * 2018-06-19 2021-12-01 Nantcell, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT FOR HIV
EP3820888A4 (en) * 2018-07-13 2022-04-27 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. CO-RECEPTOR SYSTEMS FOR THE TREATMENT OF INFECTIOUS DISEASES
CN108948211B (zh) * 2018-07-24 2021-08-20 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于靶向gd2的嵌合抗原受体及其应用
CN113286811A (zh) * 2018-07-30 2021-08-20 南加利福尼亚大学 改善过继性细胞疗法的效力和安全性
CN112585163A (zh) * 2018-08-08 2021-03-30 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-2的高亲和力单克隆抗体及其用途
CN110845621A (zh) * 2018-08-21 2020-02-28 上海恒润达生生物科技有限公司 一种靶向egfr和cd19双靶点的嵌合抗原受体方法
KR20210087017A (ko) * 2018-08-28 2021-07-09 이뮤노테크 바이오팜 씨오., 엘티디. 개선된 렌티 바이러스 벡터
US20220348682A1 (en) 2018-08-30 2022-11-03 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Chimeric antigen receptor cells for treating solid tumor
CN109503716B (zh) * 2018-10-08 2021-04-27 浙江生研生物科技有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体分子及其在肿瘤治疗上的应用
CN109266618B (zh) * 2018-10-18 2021-04-23 赛元生物科技(杭州)有限公司 能够靶向肿瘤细胞的巨噬细胞及其制备方法
CN109400710A (zh) * 2018-11-02 2019-03-01 山西大医院（山西医学科学院） 一种靶向kif20a阳性胰腺癌双特异性抗体及其制备方法和应用
JP2022513099A (ja) * 2018-11-19 2022-02-07 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 自殺遺伝子
US10918667B2 (en) 2018-11-20 2021-02-16 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expressing therapeutic agent and uses thereof
US20240025963A1 (en) * 2018-12-14 2024-01-25 2Seventy Bio, Inc. Dimerizing agent regulated immunoreceptor complexes
CN111748017A (zh) * 2019-03-26 2020-10-09 上海瑞可新生物科技有限公司 一种抗原多肽及其表达载体、组合药物、试剂盒和应用
JP2022526856A (ja) * 2019-04-12 2022-05-26 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 臨床的に意義のあるｅｇｆｒ変異型タンパク質との交差反応性を有する高親和性キメラ抗原受容体（ｃａｒ）を含む、組成物および方法
CN114026128A (zh) * 2019-04-30 2022-02-08 阿塔拉生物制药股份有限公司 抗原特异性靶向cd19的car-t细胞
US20220315665A1 (en) * 2019-05-07 2022-10-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric antigen receptors targeting glypican-2
AU2020280105A1 (en) 2019-05-22 2022-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Circular RNA compositions and methods
US20200384029A1 (en) * 2019-06-07 2020-12-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Dual car expressing t cells individually linked to cd28 and 4-1bb
CN114555815A (zh) * 2019-07-30 2022-05-27 大学健康网络 T细胞受体及其使用方法
US20210128617A1 (en) * 2019-08-27 2021-05-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania SYNTHETIC CARS TO TREAT IL13R-alpha-2 POSITIVE HUMAN AND CANINE TUMORS
TW202134278A (zh) * 2019-11-08 2021-09-16 美商胡曼尼根公司 用於治療腫瘤之ｅｐｈａ３導向ｃａｒ－ｔ細胞
ES2961245T3 (es) 2019-12-04 2024-03-11 Orna Therapeutics Inc Composiciones y métodos de ARN circular
CN113106067A (zh) * 2020-01-10 2021-07-13 南京大学 一种嵌合抗原受体-单核/巨噬细胞(car-m)的构建及其应用
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
EP3892720A1 (en) * 2020-04-06 2021-10-13 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Presenting cell and use thereof in cell therapy
US11826386B2 (en) 2020-05-05 2023-11-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating cancer
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
US20220177599A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-09 Affyimmune Therapeutics, Inc. Dual chimeric antigen receptor targeting epcam and icam-1
CN114685683A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 博生吉医药科技(苏州)有限公司 靶向gd2的car-t细胞及其制备和应用
WO2023168436A1 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-cd19 and anti-cd79b chimeric antigen receptors and methods of use thereof
CN114573711A (zh) * 2022-03-04 2022-06-03 陕西师范大学 一种TanCAR的构建及其应用
CN114605560B (zh) * 2022-03-30 2024-02-20 江苏蒙彼利生物科技有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法与应用
CN117338914A (zh) * 2023-10-27 2024-01-05 中山市珈钰生物医药有限公司 一种同种异体树突细胞肿瘤疫苗及其制备方法和应用

Family Cites Families (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992008796A1 (en) 1990-11-13 1992-05-29 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
US20020111474A1 (en) 1990-12-14 2002-08-15 Capon Daniel J. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
JPH07507278A (ja) 1992-06-01 1995-08-10 ニューイングランド　メディカル　センター　ホスピタルズ　インク Ｃｄ４３キメラ分子による細胞間相互作用の阻害
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US6660257B1 (en) 1996-10-25 2003-12-09 Pharmacia Corporation Circular permuteins of flt3 ligand
WO2000023573A2 (en) 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies
GB0015119D0 (en) 2000-06-20 2000-08-09 Angeletti P Ist Richerche Bio Methods and means for regulation of gene expression
CA2413156C (en) 2000-07-03 2009-08-18 Gala Design, Inc. Expression vectors
EP1334188B1 (en) 2000-11-07 2006-08-30 City of Hope Cd19-specific redirected immune cells
CA2440221C (en) 2001-03-07 2013-02-05 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung Expression technology for proteins containing a hybrid isotype antibody moiety
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
WO2002097099A1 (en) 2001-05-29 2002-12-05 Valentis, Inc. Regulated expression of ghrh
WO2003025228A1 (en) 2001-09-18 2003-03-27 Proteologics, Inc. Methods and compositions for treating hcap associated diseases
US20030148982A1 (en) 2001-11-13 2003-08-07 Brenner Malcolm K. Bi-spcific chimeric T cells
MXPA04009809A (es) 2002-04-11 2004-12-13 Amgen Inc Moleculas de tirosina cinasa del receptor her-2 y uso de las mismas.
US20040115814A1 (en) 2002-09-30 2004-06-17 Protein Design Labs, Inc. Efficient generation of stable expression cell lines through the use of scorable homeostatic reporter genes
US20040158329A1 (en) 2003-02-10 2004-08-12 Waldemar Link (Gmbh & Co.) Hip joint prosthesis with shaft inserted into femur
JP5356648B2 (ja) 2003-02-20 2013-12-04 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 抗ｃｄ７０抗体−医薬結合体、ならびに癌および免疫障害の処置のためのそれらの使用
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US20060160090A1 (en) 2003-04-11 2006-07-20 Macina Robert A Composition splice variants and methods relating to cancer specific genes and proteins
WO2005017102A2 (en) 2003-05-30 2005-02-24 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to ovarian specific nucleic acids and proteins
CN101173282B (zh) 2003-07-21 2011-04-06 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 编码人表皮生长因子2/neu抗原的合成基因及其用途
EP1680447A2 (en) 2003-10-24 2006-07-19 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Orthogonal gene switches
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
US8071364B2 (en) 2003-12-24 2011-12-06 Transgenrx, Inc. Gene therapy using transposon-based vectors
US20090098142A1 (en) 2004-06-09 2009-04-16 Kasaian Marion T Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders
US7910101B2 (en) 2004-10-25 2011-03-22 Centocor, Inc. Melanocortin receptor binding mimetibodies, compositions, methods and uses
JP2009521474A (ja) 2005-12-21 2009-06-04 メディミューン，エルエルシー ＥｐｈＡ２ＢｉＴＥ分子およびその使用
CN101511994A (zh) 2006-05-22 2009-08-19 海普罗塞尔有限公司 使用真核细胞系生成蛋白质
WO2008012237A1 (en) 2006-07-24 2008-01-31 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa Multi-antigen construct and uses thereof
US7709253B2 (en) 2006-08-04 2010-05-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligand-regulable transactivation systems, methods of use thereof, methods of detecting estrogen receptor ligands, and methods of differentiating estrogen receptor ligand agonists and antagonists
WO2009013359A2 (en) 2007-07-25 2009-01-29 Fraunhofer Gesellschaft Zur Förderung Der Angewandten Forschung E. V. Self coupling recombinant antibody fusion proteins
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
EP2279253B1 (en) 2008-04-09 2016-11-16 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
DK3006459T3 (da) 2008-08-26 2021-12-06 Hope City Fremgangsmåde og sammensætninger til forbedring af t-cellers antitumoreffektorfunktion
US8829173B2 (en) 2008-09-26 2014-09-09 Tocagen Inc. Recombinant vectors
WO2010045002A2 (en) 2008-09-26 2010-04-22 Tocagen Inc. Gene therapy vectors and cytosine deaminases
US8329882B2 (en) 2009-02-18 2012-12-11 California Institute Of Technology Genetic control of mammalian cells with synthetic RNA regulatory systems
WO2010141543A1 (en) 2009-06-02 2010-12-09 Targeted Molecular Diagnostics, Llc Methods for the detection and quantitation of the p95 component of her2/neu (erbb2)
US8075895B2 (en) 2009-09-22 2011-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Identification of antigenic peptides from multiple myeloma cells
EP2496698B1 (en) 2009-11-03 2019-01-09 City of Hope TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION
JP5285678B2 (ja) 2010-06-18 2013-09-11 株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ 移動通信方法及びコアネットワーク装置
DK3012268T3 (en) 2010-09-08 2018-02-19 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
JP5947311B2 (ja) 2010-12-09 2016-07-06 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌を治療するためのキメラ抗原受容体改変ｔ細胞の使用
US9402865B2 (en) 2011-01-18 2016-08-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
AU2012230780B2 (en) 2011-03-23 2016-10-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
JP2014514927A (ja) 2011-04-13 2014-06-26 イミュニカム・エイビイ 抗原特異的ｔ細胞の増殖のための方法
ES2773891T3 (es) 2011-06-01 2020-07-15 Prec Biosciences Inc Procedimientos para la producción de líneas celulares de mamífero modificadas con transgenes amplificados
MX354663B (es) 2011-06-22 2018-03-14 Hoffmann La Roche Eliminación de células diana por parte de células t citotóxicas específicas de virus utilizando complejos que comprenden mhc de clase i.
DE102011118018B4 (de) 2011-10-25 2017-10-26 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen
US10391126B2 (en) 2011-11-18 2019-08-27 Board Of Regents, The University Of Texas System CAR+ T cells genetically modified to eliminate expression of T-cell receptor and/or HLA
CA2861491C (en) 2012-02-13 2020-08-25 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
ITRM20120058A1 (it) 2012-02-20 2013-08-21 Pisanelli Giovanni Codacci Famiglia di molecole a base di zuccheri ad uso terapeutico e relativo procedimento di produzione
ES2816450T3 (es) 2012-02-22 2021-04-05 Univ Pennsylvania Uso de CAR basados en ICOS para mejorar la actividad antitumoral y la persistencia del CAR
BR112014024893B8 (pt) 2012-04-11 2022-09-06 Us Health Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada que codifica um receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso, cars isolados ou purificados, vetores, métodos para destruir células cancerígenas e polinucleotídeo
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
US9540657B2 (en) 2012-05-25 2017-01-10 California Institute Of Technology Expression of secreted and cell-surface polypeptides
MX2014014650A (es) 2012-05-30 2015-10-14 Univ Washington Minivectores superenrollados como una herramienta para la reparacion, alteración y reemplazo de ácido desoxirribonucleico.
EP2669378A1 (en) 2012-05-31 2013-12-04 Helmut Hanenberg Cytochrome P450 suicide gene system
CN104350709B (zh) 2012-06-01 2018-03-13 日本电气株式会社 交换机系统、线路卡、交换卡、fdb学习方法及fdb学习调停方法
KR102135239B1 (ko) * 2012-08-20 2020-07-17 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
WO2014039044A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t memory stem cell populations
ES2743738T3 (es) * 2012-10-02 2020-02-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Composiciones y métodos para inmunoterapia
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
WO2014099671A1 (en) 2012-12-20 2014-06-26 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
EP3456818B1 (en) 2013-03-07 2020-05-20 Baylor College of Medicine Targeting cd138 in cancer
EP2777711A1 (en) 2013-03-11 2014-09-17 Icon Genetics GmbH Her2/Neu cancer vaccine
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
US9701758B2 (en) 2013-05-24 2017-07-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-CD19 scFv (FMC63) polypeptide
WO2015066551A2 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
SG11201603484PA (en) 2013-11-21 2016-05-30 Ucl Business Plc Cell
US10239948B2 (en) * 2013-12-20 2019-03-26 Cellectis Method of engineering multi-input signal sensitive T cell for immunotherapy
CN107074957B (zh) * 2014-01-13 2021-05-07 希望之城公司 在Fc间隔物区中具有突变的嵌合抗原受体(CAR)及其使用方法
ES2764471T3 (es) 2014-02-14 2020-06-03 Univ Texas Receptores de antígeno quimérico y procedimientos de fabricación
EP3593812A3 (en) 2014-03-15 2020-05-27 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
CN106536558A (zh) 2014-04-10 2017-03-22 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 转基因遗传标签和使用的方法
DE112014006656B4 (de) 2014-05-14 2018-05-17 Carsgen Therapeutics Limited Nukleinsäure zur Kodierung eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins und T-Lymphozyt zur Expression eines chimären Antigen-Rezeptor-Proteins
US10287350B2 (en) 2014-06-02 2019-05-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric antigen receptors targeting CD-19
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
CA2965347C (en) 2014-10-27 2023-03-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for boosting the efficacy of adoptive cellular immunotherapy
GB201503742D0 (en) 2015-03-05 2015-04-22 Ucl Business Plc Chimeric antigen receptor
EP3466967A1 (en) 2015-05-18 2019-04-10 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
IL309167A (en) 2015-06-10 2024-02-01 Immunitybio Inc Modified NK-92 cells for cancer treatment
EP3845557B1 (en) 2015-06-12 2023-08-02 Lentigen Technology, Inc. Method to treat cancer with engineered t-cells
US11458167B2 (en) 2015-08-07 2022-10-04 Seattle Children's Hospital Bispecific CAR T-cells for solid tumor targeting
WO2017136829A1 (en) 2016-02-05 2017-08-10 City Of Hope Administration of engineered t cells for treatment of cancers in the central nervous system
WO2017172952A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Promab Biotechnologies, Inc. Flag tagged cd19-car-t cells
TWI828334B (zh) 2016-09-28 2024-01-01 美商凱特製藥公司 抗原結合分子類和使用彼等之方法
DK3523326T3 (da) 2016-10-04 2020-08-03 Prec Biosciences Inc Samstimulerende domæner til anvendelse i genetisk modificerede celler
MX2019006631A (es) 2016-12-12 2019-11-12 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Variantes quimericas de factores de transcripcion con sensibilidad aumentada a induccion por ligando de farmaco de expresion transgenica en celulas mamiferas.
JOP20180042A1 (ar) 2017-04-24 2019-01-30 Kite Pharma Inc نطاقات ربط مولد ضد متوافقة مع البشر وطرق الاستخدام
US10869888B2 (en) 2018-04-17 2020-12-22 Innovative Cellular Therapeutics CO., LTD. Modified cell expansion and uses thereof
US11104732B2 (en) 2019-04-24 2021-08-31 Innovative Cellular Therapeutics Holdings, Ltd. Reducing immune inhibition induced by SIGLEC-15

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