JPH07507278A - Ｃｄ４３キメラ分子による細胞間相互作用の阻害 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ４３キメラ分子による細胞間相互作用の阻害発明の背景 本発明は細胞間相互作用、特に、炎症或いは病原性感染の原因となる相互作用を 阻害する方法に係わる。

細胞性免疫応答発生の重要な一段階は、リンパ球の相互の、或いは、免疫系の他 の細胞との接着である。これら細胞と細胞の接着相互作用については、いくつか の分子過程が定義されており（Ｓｐｒｉｎｇｃｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　２４［ｉ： ４２５−４３４．１９９０）、又、り間接着分子１　［１ｎｔｅｒｃｃｌｌｕｌ ａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｌ　（ＩＣＡＭ−１）］　ヘの結 合（ＲｏＬｈＩｅｉｎ、　Ｒ，ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　１ｓｓｕｎｏ１．、１３ ７：１２７０−１２７４．１９８８；　Ｍａｒｌｉｎ、　Ｓ、Ｄ、　ｅｔ@ａｔ 、。

Ｃｅ１ｌ　５１：８１３−８１９．１９８７）が、主要な接る過程を形成してい る。これら対向受容体の相互作用を阻害する抗体は、同型接ｍ　（Ｍｃｎｔｚｅ ｒ、　Ｓ、Ｊ、　ａｔ　ａｌ、＋　Ｊ、　１ａａｕｎｏ１．。

１３５：９−１１．１９８５；　ＲｏＬｈｌｅｉｎ、　Ｒ，ａｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、、　ｌＧ３：１１３２−１１４９．P９８６）、 及びＴ−リンパ球仲介の細胞傷害（Ｄａｖｉｇｎｏｎ、　Ｄ、　ａｔ　ａｌ、＋ 　Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、、　１２７：５９０−５９５、１９８１；　Ｓａｎｃ ｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　ＩＥｘｐ、　Ｍｅｄ、 、　１５８：１７８５−１８０R．１９８３） を阻止することが出来、正常免疫に対するこの接着過程の重要性を示唆している 。

更に、ＬＦＡ−１のβサブユニットの遺伝的欠損は、再発性の生命を行かす細菌 感染、及び接着依存性の白血球機能の！Ｉｆ篤な欠陥の起因となる（Ａｎｄｃｒ ｓｏ＋＋、　Ｄ、Ｃ，ａｔ　ａｔ。

、　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５２：６６ｇ−６８９，１９８５： ＾ｒｎａｏｕｔ、　Ｍ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌhｎ、　Ｉｎｖ Ｏ５Ｌ、＋　７４：１２９１−１３００．１９８４；　Ｒｏｓｓ、　Ｇ、Ｄ、　 ｃＬ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ、　６［ｉ：１１８２−８９０D１９８５＞。

ｔｐ＾−１のＩｃＡＭ−１への結合を高める制御機構が最近記載されており（Ｄ ｕｓｔｉｎ、　Ｍ、Ｌ′、、　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　 １０７：３２１−３３１．１９８８；　Ｄｕｓｔｆ、　Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｔ、 、　mａｔｕｒ ｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　３４１：６１９−６２４．１９８９）、リンパ球と非 免疫系細胞間のみならず、異型のリンパ球間の重要な相互作用を促進するように 機能する模様である。例えば、リンパ球の内皮細胞への結合は、内皮細胞を予め 起炎性サイトカインと反応させることにより増大し、又、高められた接着は、部 分的には、内皮細胞によるＩｃＡＭ−１発現の定量的な増加によるものである（ Ｄｕｓｔｌｎ、　Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｌｏｌ、。

１０７：３２１−３３１．１９８８）。又、Ｔ細胞受容体の架橋によるＴ細胞の 活性化は、ＬＦＡ−１発現のレベルを増加することなく、リンパ球ＬＦＡ−１の ＩｃＡＭ−１に対する著明な、しかしながら一過性の結合活性の向上をもたらす （Ｄｕｓｔｉｎ、　Ｍ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） 、　３４１：６１９−６２４．１９８９）。

リンパ球接着の制御は、又、細胞と細胞間の重要でない相互作用を制限する阻害 要素を含むものと見なすことも出来る。これに関連して、高度にシアリル化され た（従って、高度に陰荷電を帯びた）リンパ球の膜糖液がある役割を演じている と思われる（Ｂｅ１１．　Ｇ、１．　ｅＬ　ａｌ、、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｊ、 、　４５：１０５１−１０６４．１９８４）。陰荷電を帯びた糖被は、同様の荷 電を帯びた細胞を反発し、それ故に、細胞と細胞の接着相互作用を制限する様に 機能すると言われている（Ｂｒｏｗｎ、曾、Ｒ，Ａ、　ｅｔａｔ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２８９二４５６−４００．１９８１）ｏ　ＣＤ４３ 　ｒシアロホリン、またはロイコシアリン（ｓｉａｌｏｐｈｏｒｌｎ　ｏｒ　１ ｅｕｋｏｓｉａｌｉｎ）］は、リンパ球の糖液の主要で不可欠な成分であるので 、リンパ球間の接着を制御する分子の候補である（Ｂｒｏｗｎ、　Ｉｆ、Ｒ，Ａ 、　ａｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、　２８９：４５Ｂ−４ ６０，１９８１：　Ｒｅ５ｏｌｄ−０’Ｄｏｎｎｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　i、 　Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｗ、、２８１ニア５２Ｂ−７５３０，１９８６；　Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｓ 、Ｒ，ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｓ、、２６１：１２７７９−１２７ １１６．１９８６）。

発明の開示 出願者は、ＣＤ４３タンパク質は、細胞表面に出現した場合、そのＣＤ４３保持 細胞と、ＣＤ４３か又は何か他の陰ＴｓｔＩを帯びたタンパク質を細胞表面に表 現している他の細胞との相互作用を阻止することを発見した。ＣＤ４３の阻害効 果は、比較的、非特異的と思われるので、治療用のＣＤ４３キメラ分子をいくつ も構成して、有害な細胞間相互作用を遮断するのに用いることが可能である。こ の様なキメラ分子は、２つの機能領域を持つ、即ち、（ａ）相互作用が遮断され るべき細胞の一方、或いは両方の表面にある分子（例えば、受容体、リガンド、 或いは対向受容体）に対するキメラ分子の特異的結合を指令する細胞指向性領域 、及び（ｂ）細胞間相互作用に拮抗し、生理学的ｐｉにおいて陰荷電を帯びてい るＣＤ４３細胞外領域とである。

ある特例において、ＣＤ４３キメラ分子は、炎症の原因となる細胞間相互作用を 遮断するのに用いることが出来る。例えば、陰荷電のＣＤ４３細胞外領域は、白 血球の−細胞表面分子であるラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＰ　Ｉ ＩＩ）、或いはシアリルＬｅｖｉｓ”に共役結合する可能性がある。これらの分 子は、炎症応答の間に活性化される内皮細胞表面に発現するタンパク質、受容体 Ｐ−セレクチン（ＰＡＤＧＥＭ、ＧＭＰＩ４０、　ＣＤ６２）及びＣＬＡＮ−１ （夫々）に特異的に結合する化ａｒｓｅｎ、　ｅｔ　ａｌ、ｔ　Ｃｅ１ｌ　６３ ：４Ｂ？、　ｔ９９０；　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５６ ：１Ｇ３３．１９８９；＾ｒｕｒｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１戟@８７：３５ 、１９９１；　ａｎｄ　Ｖａｌｚ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２５０： １１３２．１９９０）、　ＣＤ４３：ＬＮＦ　ＩＩＩ、或い■A ＣＤ４３ニジアリルＬｅｖ　Ｉ　ｓ　”を投与すると、これらキメラタンパク質 は内皮細胞表面に結合し「被覆」して、免疫細胞リガンドの内皮細胞受容体への 接近防止と、又、恐らくはＣＤ４３高陰荷電の結果として、免疫細胞を非特異的 に反発することの両方によって、内皮細胞と高陰電荷免疫細胞間の相互作用を阻 止する。内皮細胞と免疫細胞との接着相互作用を阻害することによって、本発明 の治療用タンパク質は炎症を軽減し、或いは排除する。

又は、陰荷電のＣＤ４３の細胞外領域は、受容体であるＶＣＡＭ−１及びＩＣ八 へｌと融合して、キメラタンパク質であるＣＤ４３：ＶＣＡＭ−１及びＣＤ４３ ：Ｉｃ＾トｌを生成する。この様なタンパク質は、一定のタイプの白血球の表面 に結合、被覆して、内皮細胞の対向受容体との相互作用、従って、炎症の原因と なる免疫細胞と内皮細胞間の相互作用を遮断する。

ＣＤ４３キメラ分子は、又、病原性感染に必要な相互作用の阻害に有用である。

例えば、ライノウィルス及びマラリアのプラスモジウム属原生動物は共にＩＣ八 へｌに結合することが示されており、従って、ライノウィルス、或いはマラリア 原虫の結合を阻害するＣＤ４３：　ＩｃＡＭ−１キメラ分子は、風邪、或いはマ ラリアの治療、或いは防止に有用な薬であると証明されるかも知れない。他の例 では、ＣＤ４３：ＣＤ４キメラは、ヒトの免疫不全症ウィルスの外面を被覆する のに用いて、それにより、宿主細胞感染力を阻害することが出来る。毒素分子［ 例えば、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、或いは大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）毒素］に連結した陰荷電を帯びたＣＤ４３の細胞外領域を用いる類似 の手段も、毒素効果の阻害に使用出来る。

他の一般的研究手段において、陰荷電のＣＤ４３の細胞外領域は、特定の細胞表 面分子に特異的な抗体に共役結合してもよい。−例では、細胞外ＣＤ４３領域を 公表されている抗ＰＡＤＧＥＭ抗体（例えば、Ｌａｒｓｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　 Ｃｅ１ｌ　１３３：４６７、、１９９０参照）に連結して、白血球の内皮細胞へ の結合を阻害し、それによって炎症を防止するＣＤ４３キメラ分子を生成するこ とも出来る（前述の様に）。

従って、一般的に、本発明は、哺乳動物において第一の細胞と第二の細胞の間の 相互作用を阻害する方法を特徴とし、第一の細胞の表面上にあって生理的９Ｈに おいて正味の陰荷電を持つＣＤ４３の細胞外領域（ｂ）に共役結合している分子 を特異的に認識して結合する能力を持つ細胞指向性分子（ａ）を含む可溶性キメ ラ分子の提供し、このキメラ分子を哺乳動物に投与して細胞間相互作用を阻止す ることにある。

好適な態様において、第二の細胞は、その表面に陰荷電の分子（ｆｉｌえば、Ｃ Ｄ４３）を持ち、ＣＤ４３の細胞外領域はグリコジル化されており、ＣＤ４３の 細胞外領域は、ＣＤ４３タンパク質の配列のＮ末端の１８０個のアミノ酸を含み 、細胞指向性分子はＬＮＰＩ１１受容体タン受容体タンパ上質クチン結合部分で あり、細胞指向性分子はシアリルＬｅｖｉｓ”受容体タンパク質のＥＬＡＭ−１ −結合部分であり、細胞指向性分子はＩＣＡＭ−１受容体タンパク質のＬＦＡ− １−結合部分であり、細胞指向性分子はｖＣ＾トｌ受容体タンパク質のＶＬＡ− ４−結合部分であり、細胞指向性分子はＣＤ４のヒト免疫不全症ウィルス結合部 分であり、細胞指向性分子はＩＣＡＭ−１のライノウィルス結合部分であり、細 胞指向性分子は１Ｃ＾トｌのプラスモジウム（マラリア原虫）結合部分であり、 又、第一の細胞は、活性化された内皮細胞、或いは感染性病原体（例えば、ライ ノウィルス、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、或いはヒト免疫不全ウ ィルス）である。

第二の局面では、本発明は、ある細胞の表面上にあって、生理的ｐＨで正味の陰 荷電を帯びているＣＤ４３の細胞外領域（ｂ）に連結している分子を特異的に認 識して結合することの出来る細胞指向性分子（ａ）を含むキメラ分子を特徴とす る。

好適な態様において、ＣＤ４３細胞外領域はグリコジル化されており、ＣＤ４３ 細胞外領域はＣＤ４３タンパク質の配列のト末端１１１０個のアミノ酸残基を含 み、細胞指向性分子はＬＮＦＩＩ＋受容体タン受容体タンパ上質クチン結合部分 であり、細胞指向性分子シアリルＬｅｖｉｓ”受容体タンパク質のＣＬＡＮ−１ −結合タンパク質であり、細胞指向性分子はＩＣ八へｌ受容体タンパク質のＬＦ Ａ−１−結合部分であり、細胞指向性分子はＶＣＡＭ−１受容体タンパク質のＶ Ｌ＾−４−結合部分てあり、細胞指向性分子はＣＤ４の七ト免疫不全症ウィルス 結合部分であり、細胞指向性分子はＩＣＡＭ−１のライノウィルス結合部分であ り、細胞指向性分子はＩｃＡＭ−１のプラスモジウム（マラリア原虫）結合部分 であり、細胞指向性分子は活性化された内皮細胞表面上の分子を特異的に認識し て結合し、又、細胞指向性分子は感染性病原体を特異的に認識して結合する。

第三の局面では、本発明は、哺乳動物における炎症を軽減する方法を特徴とし、 この方法は、活性化内皮細胞の表面上にあって、生理的ｐｉで正味の陰電荷を帯 びているＣＤ４３の細胞外領域（ｂ）に連結している分子を特異的に認識して結 合出来る細胞指向性分子（ａ）を含むキメラ分子を提供し、及び、当該キメラ分 子を哺乳動物に投与して活性化内皮細胞と白血球との細胞間相互作用を阻害する ことを含む。

好適な！！様において、細胞指向性分子はＬＮＰＩＩ＋受容体タン受容体タンパ 上質クチン結合部分であり、又、細胞指向性分子はシアリルＬａｖｌｓｘ受容体 タンパク質のＥＬ＾トｌ−結合部分である。

第四の局面では、本発明は哺乳動物における病原体感染を治療する方法を特徴と し、この方法は、病原体表面上にあって、生理的ｐＨで正味の陰電荷を帯びてい るＣＤ４３細胞外領域（ｂ）に連結した分子を特異的に認識して結合出来る細胞 指向性分子（ａ）を含むキメラ分子を提供し、又、当該キメラ分子を咄乳動物に 投与して病原体と病原体が通常感染する哺乳動物細胞との細胞間相互作用を阻害 することを含む。

「細胞指向性分子」とは、細胞間相互作用の阻害が要望されている細胞の表面上 に存在する結合相手に特異的で高度な親和性を持って結合する分子を意味する。

この様な細胞指向性分子には、制限なしに、あらゆる細胞表面リガンド、受容体 、対向受容体、細胞接着分子、酵素、或いは基質、又は、標的細胞表面上の分子 に対して特異的なあらゆる抗体が含まれる。細胞指向性分子はタンパク質性、或 いは非タンパク質性であってもよい（例えば、細胞接着分子によって認識される 非ペプチド性補因子、或いは炭水化物）。同様に、細胞指向性分子は標的細胞上 のタンパク質性、或いは非タンパク質性分子に結合することもあり得る。

「隘荷電を帯びている」とは、細胞表面分子が生理的ｐ１１て陰荷電を帯びてい ることを意味する。

「活性化内皮細胞」とは、内皮細胞が、抗原刺激に応答して、細胞現象（例えば 、細胞表面タンパク質の発現）を開始していることを意味する。

当発明のＣＤ４３キメラ分子は、いくつかの治療上の利点を提供する。例えば、 ＣＤ４３キメラ分子が、適切な細胞表面の結合相手（パートナ−）と相互作用す る特異性は、治療用タンパク質の、病変部（例えば、炎症性内皮細胞）標的指向 を可能にし、この様な標的を定めた治療は、副作用を最小限にして、有害な細胞 相互作用の高度に有効な阻害を可能にする。２つの特例において、ＣＤ４３：Ｌ ＮＰ　Ｉｌｌ及びＣＤ４３ニジアリルＬｅｖｉｓ”キメラ分子は、炎症性の、健 全ではない、血管内皮細胞上に相当数存在する受容体に結合する。投与すると、 ＣＤ４３：ＬＮＦ　Ｉｌｌ及びＣＤ４３ニジアリルＬｃｖｌｓ”は、血管損傷部 位に蓄積し、健全な血管内皮に影響することなく、又、重要なことは、患者を全 般的に免疫抑制状態にすることなく、炎症治療の効力を最大限に高める。

本発明の他の特徴と利点は、以下の詳細な記述と請求の範囲から明らかになるで あろう。

図１は、ｌ１ｃＬａ細飽のトランスフェクション転換体及びヒトＴリンパ球によ るＣＤ４３の発現を示す一連のグラフである。細胞は、本明細書に記載の様に、 対照の正常マウス血／ｌ′Ｊ（右）、或いは抗ＣＤ４３単クローン性抗体である 抗Ｌｅｕ　２２　（左）によって染色された。（ａ）　ＣＤ４３−陰性１１ｅＬ ａ細胞。（ｂ）　ＣＤ４３−陽性細胞。（ｃ）　Ｐ）ＩＡにより活性化されたヒ トＴリンパ球。フィトヘマグルチニン（ＰＨ＾）で処理された１９２８球による ＣＤ４３発現レベルは、末梢血のＴ細胞、及び本明細書に記載の実験に使用され たすべてのＴ細胞系における発現レベルを代表するものである。

図２は、１９２８球のＨｅＬａ細胞のトランスフェクション転換体接着に対する ＣＤ４３の効果を示す一連の棒グラフである。カルボキシフルオレセイン標識リ ンパ球を、本明細書に記載の様に、微量定量ウェル中てＨｅＬａ細胞トランスフ ェクション転換体と接むさせておく。試験されたヒトリンパ球は、末梢血Ｔリン パ球（ＰＢＬ−Ｔ）　、ＩＬ−２中に維持されているＰＩＩＡ−活性化Ｔ細胞（ ＰＩＩＡ−Ｔ）　、胸腺細胞（ＴＩＩＹ）、Ｔ細胞性リンパ腫系（ＳｕｐＴｌ） 　、ヒトリンパ球指向性ウィルス１型により形質転換されたＴ細胞クローン（几 ８９）であった。本図面及び全ての以下の図面において、各々の棒表示は、３つ の実験からの結合リンパ球の平均パーセント±ＳＥＸを表す。

図３は、ＬＦＡ−１−仲介によるＴリンパ球接管金利するＣＤ４３の効果を示す 一連の棒グラフである。リンパ球は、正常マウス血清、或いはＬＦＡ−１に対す る（ＴＳＩ／２２）、又はＣＤ２に対する（ＴＳ２／１８）単クローン性抗体（ 含有）腹水（すべてｌ：４００　ｆ＆ｉ釈）と氷上で３０分子めインキュベート してから、１ＩｅＬａ細胞トランスフ工クシヨン転換体と３０分室温で接着させ た。（Ａ）　ＪＬ８９　Ｔ細胞クローンのｌＩｅＬａｍｌｌａ　トランスフェク ション転換体への結合。（Ｂ）　ＰＩＩＡ−Ｔ細胞のｌＩｃＬａ細胞トランスフ ェクション転換体への結合。

図４は、門＾−処理Ｔリンパ球の接着に対するＣＤ４３の効果を示す一連の棒グ ラフである。几８９Ｔリンパ球は、図３に対する前述の様に、正常マウスの血清 、或いはＴＳＩ／２２単クローン性り体と予めインキュベートしてから、ｌＩｃ Ｌａ細胞トランスフェクション転換体と３７℃で１時間接着させた。四人は、指 示のある場合は、５０ｎｇ／ｓｌの濃度で用いられた。

図５は、ＣＤ４３のＴリンパ金利着妨害に対するノイラミニダーゼの効果を示す 一連の棒グラフである。几８９Ｔリンパ球は、図３に対する前述の様に、正常マ ウスの血清、或いはＴＳＩ／２２単クローン性り体と予めインキュベートしてか ら、未処理或いはノイラミニダーゼ処理のｌ１ｃＬａ細胞トランスフ工クシヨン 転換体と接着させた。コレラ菌ｍｂｒｌｏ　ｃｈｏｌｅｒａ）のノイラミニダー ゼは、１１当たり０．０２単位（の濃度）で用いられた。

以下、ＣＤ４３タンパク質が細胞間接着を阻害する一連の実験の記述が続く。こ れらの実験は、又、ＣＤ４３は、ＬＦＡ−１−仲介の）０互作用を阻害すること によってＴリンパ球接着金利御する可能性を示唆している。

ＣＤ４３を発現する安定な１ｌｅＬａ細胞の生成と特性決定＋１ｅＬａ細胞が、 本来、白血球の接着分子であるＬＦＡ−１及びＣＤ２に対する対向受容体１ｃＡ Ｍ−１及びＬＰＡ−３を夫々発現するので、安定なＣＤ４３発現系を生成するた めに選ばれた。有用な細胞系を生成するために、ＣＤ４３をコードするＰＥＥＲ −３ｃＤＮＡクローン（ＰａｌｌａｎＬ、　Ａ、Ｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ、　８６：１３２８−１３R ２．１９８ ９）は、先ず、ＣＤＭ８発現ベクター（Ｓｅｅｄ、　Ｉｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　 （Ｌｏｎｄｏｎ）　３２９：［１４０−０２，１９８７）中に、Ａｒｄａａｎ、 　Ｂ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　（）、　Ｅｘｐ、　Ｍａｄ、、　１７２：１１５１ −１１５８．１９９０）に記載の様にしてサブクローンニングされた。次いで、 ｌ１ｅＬａ細胞（４ｘ１０６）が、電気さく礼法により、２μｇのｐｓＶ２ｎｃ ｏプラスミド（ネオマイシン耐性をコードする、５Ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　Ｈｏｔ、＾ｐｐ１．　Ｇｅｎｅｔ、　１：３２７．１９８２　）及 び２０μｇのＣＤＭ８−ＣＤ４３プラスミドにより同時トランスフェクトされる か、或いはｐｓＶ２ｎｃｏ単独でトランスフェクトされた。７２時間の培養後、 細胞は４００μｇ／ｍｌの０４１８硫酸塩（Ｇｅｎｅｔｉｃｌｎ；　ＧＩＢＣＯ ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　ＮＹ）で処理してｐｓＶ２ｎｃｏにより安定に トランスフェクトされた細胞の選択が行われた。２週間の培養後、同時トランス フェクトされた細胞がＣＤ４３発現に対して、免疫蛍光法により、抗Ｌｅｕ　２ ２　（Ｂｃｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ、　Ｎ Ｊ）と呼ばれる抗ＣＤ４３単クローン性抗体を用いて探索された。この方法によ って選別されたすべてのＣＤ４３陽性１１ｃＬａ細胞クローンは、この実験の継 続期間中（６ケ月以上）常にＣＤ４３を発現した。

陽性クローンによるＣＤ４３発現の度合は、フローサイトメトリーによって査定 され、ヒトＴリンパ球によるＣＤ４３発現と同等であることが判明した（図１） 。トランスフェクション転換体のＣＤ４３陽性、及びＣＤ４３陰性の表現型は、 放射標識細胞からの可溶化膜両分の抗Ｌｅｕ　２２免疫沈降法によって確認され た。即ち、ＨｅＬａ細胞のトランスフェクション転換体が、牛乳のラクトペルオ キダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｇ＋−Ｂｃｈｒｌｎｇ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 　Ｃ＾）を用いてＮａ１２５１　（Ａａｅｒｓｈａｍ、＾ｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｉ ｌｅｌｇｈｔｓ、　ＩＬ）■ 標識された。次いで、可溶化細胞溶液は＾ｒｄ■ａｎ、　Ｂ、＾、　ｅｔ　ａｌ 、の報文（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１７２：１１５１−１１５８．１９９ ０）に記載の様にして免疫沈降された。免疫沈降物は１０％ＳＤＳ／ＰＡＧＥに より還元条件下で溶解され、乾燥ゲルは、−７０℃で強調スクリーンを用いてオ ートラジオグラフィーを撮られた。ＣＤ４３タンパク質はＣＤ４３陽性ＩＩｅＬ ａ細胞で観察されたが、ＣＤ４３陰性細胞では観察されなかった。これに加えて 、ＣＤ４３陽性１１ｅＬａ細胞からの別の抗Ｌｅｕ　２２免疫沈降物標品が、Ｓ ＤＳ／ＰＡＧＥ分析前にノイラミニダーゼで処理された。ノイラミニダーゼ処理 後、ＣＤ４３のバンドは、ＣＤ４３の特徴であるより高分子ｍ域に移行した トランスフェクション転換１１ｃＬａ細胞によるＣＤ４３発現が、ＩＣＡＭ−１ 或いはＬＦＡ−３の発現変化に関連しているか否かを決定するために、ＣＤ４３ 陽性ＨｅＬａ細胞の免疫表現型が検討された。トランスフェクション転換体が、 以下の諸抗原に対する単クローン性抗体、ＬＰＡ−１αサブユニツト（ＴＳＩ／ ２２）、β２インテグリン・サブユニット（ＴＳ＋／１８）、ＩｃＡＭ−１（Ｒ ＲＩ／１）　、或いはＬＦＡ−３（ＴＳ２／９）　（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ， ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、@ｌ５ −ｕｎｏｌ、、１３７：１２７０−１２７４．　１９８６；　Ｓａｎｃｈｅｚ− Ｍａｄｒｉｄ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、ＥＸ＋）、Ｍａｄ、A１５ ８：１７８５−１８０３．１９８３；　Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　Ｆ、 　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　rｅｔ、　ＵＳＡ 、　７９ニア４８９−７４９３．１９８２）　（７）イづれかによりｌ：４００ 倍希釈で染色されたか、或イハ、精製単クローン性抗体、抗−Ｌｅｕ　２２によ り、５μｇ／ｓｌの濃度、間接免疫蛍光アッセイで、Ａｒｄｍａｎ、　Ｂ、Ａ、 　ｅｔ　ａｌ、の報文（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１７２：１１５１−１１ ５８．１９９０）記載の様にして染色された。１１水、或いは精製抗体の濃度を 予め測定し、飽和抗体レベルを含む様にした。ｌ：２００倍希釈の正常マウス血 清が陰性対照として用いられた。染色された細胞は、Ｃｏｕｌｔｅｒ　５４１フ ローサイトメーター（Ｃｏｕｌ　ｔｅｒ社製）で分析された。

ＣＤ４３陰性　ＣＤ４３陽性 抗体　抗原　＋１ｅＬａ細胞　＋１ｅＬａ細胞ＰＲＩ／ｌ　ＩｃＡＭ−１１１２ １０９丁Ｓ２ノ９　ＬＰＡ−３２９２２ 抗−Ｌｅｕ　２２　ＣＤ４３　＜２　１０８ＴＳＩ／２２　ＬＦＡ−１α鎖　＜ ２（２ＴＳＩ／１８　β２−インテグリン　＜２＜２＊正常マウス血ｎ７染色に よるバックグラウンド蛍光を差引いた後の検査抗体て処理された細胞の平均蛍光 強度 ＣＤ４３陽性及びＣＤ４３陰性ＨｅＬａ細胞は、実質的に同等レベルのＩＣＡＭ −１を発現した（表１）。ＨｅＬａ細胞トランスフェクション転換体によるＬＰ Ａ−３発現は、ＩＣＡＭ−１発現よりも大幅に少なく、転換体間では、ＣＤ４３ 陽性細胞はＣＤ４３陰性細胞よりＬＦＡ−３発現が２５％少なかった（表１）。

ＬＰＡ−１α鎖、或いはβ２−インテグリン鎖の発現は、いずれのＨｅＬａ細胞 トランスフェクション転換体にも検出されなかった。別々のＩＩｅＬａ細胞トラ ンスフェクション転換体によるＩｃＡＭ−１発現が同様であったので、ＬＰＡ− １を介するＴ−リンパ球の１ｌｅＬａ細胞への結合に対するＣＤ４Ｂの効果を検 査することが可能である。

リンパ球のｌ１ｅＬａ細胞への結合に対するＣＤ４３の効果異型接着検定が、懸 濁リンパ球の、接着性のトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞への結合定量に用 いられた。トランスフェクトされたｌ１ｅＬａ細胞へのリンパ球結合を測定する 全ての検定は、　９８ウエルの微量定量プレート（Ｃｏｓｔａｒ、　Ｃａ■ｂｒ ｉｄｇｅ、　ＨＡ）で行われた。ウェルには、完全培地中の２５Ｘ１０３個の１ ｌｅＬａ細胞を分配した。

細胞が接着し、且つ、密集成長に達した時（２４−３０時間後）、ウェルはマル チチャネルピペッタ−を用いてＲＰＭｌ　１６４０培地で２回洗浄し、次いで、 ５０μｌの完全培地で再充填した。リンパ球（５ＸｌＯ’　）はＲＰＭＩ　ｌ［ ｉ４０培地で２回洗浄し、ＲＰＭＩ　１８４０培地１ｓｌ中の２°、７°−ビス （２−カルボキシメチル）−５，６−カルボキシフルオレセイン、アセトキメチ ルエステル（ＢＣＥＣＰ；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）で２０分、室 温で標識して、洗浄し、次いで、ＲＰＭＩ培地に再懸濁して１１当たり５−６ｘ １０５個細胞の濃度になる様にした。リンパ球（１００μｌ）　はＨｅＬａ細胞 に３０分、室温で接着させ、次いで、ウェルは、１ウエル当たり２００μｍのリ ン酸緩衝食塩水をマルチチャネルピペッタ−を用いて静かに加え、交互四隅真空 吸引（２５−ゲージ注射針）により４回洗浄した。細胞は、次いで、０．３７％ のホルマリン中で固定し、プレートは自動微量蛍光光度計（Ｐａｎｄｃ社製）で 読み取られた。全ての検定は、同じ試料４通りで行われ、３回反復された。対で はない試料に対する５Ｌｕｄｅｎｔのｔ−検定が統計的計算に用いられた。

最初の実験は、種々の供給源からのＣＤ４３陽性ヒトＴリンパ球の、ＣＤ４３陰 性及びＣＤ４３陽性のＨｅＬａ細胞と結合する能力が検定された。細胞は以下の 供給源から得られた。正常の献血者からの末梢血液がＦｉｅｏｌ　Ｉ／Ｈｙｐａ ｑｕｅ遠心分離による単核細胞の分離に用いられた。末梢血液の単核細胞は、プ ラスチック接着で単球を除き、又、ナイロン繊維ａ過でＢリンパ球を除くことに よって、１９２８球が濃縮された。

その結果得られたＴ細胞標品は９０％以上ＣＤ３陽性であった。Ｔ細胞の幼若化 細胞は、末梢血単核細胞を５μｇ／ａｔのフィトヘマグルチニン（Ｓｉｇｍａ） 中で３日間、及び１００単位の組換えインターロイキン２　（ＩＬ−２）　（Ｃ ｃｔｕｓ、　Ｎｏｒｖａｌｋ、　ＣＴ）中で１０−１７日間成育することによっ て作製された。正常のヒト胸腺細胞はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｍｅｄｌｃａｌ 　Ｃｅｎｔｅｒで心臓矯正手術を受けている小児から採取された。使用されたヒ トリンパ球細胞系は、５ＵＰＴＩ　（Ｔ細胞リンパ腫）、几８９　（ＩＬ−２依 存性Ｔ細胞クローン）、及びＣ９１／ＰＬ　（ヒトＴリンパ球刺激ウィルスｌ型 により形質転換されたＴ細胞系）であった。１ＩｃＬａ細胞及びリンパ球細胞系 は、１０％のウシ胎児血Ｉｎ　（ＨｙＣＩｏｎｃ社）　、２　ｒａＭのＬ−グル タミン、及びペニシリンとストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌ含むＲＰＭＩ 　１８４０培地中で成育された。

末梢血液Ｔリンパ球、ＰＩＩＡ−Ｔ細胞の芽細胞、胸腺細胞、２つの形質転換Ｔ 細胞系、及び１１．−依存性Ｔ細胞クローンを含め、検査された全ての細胞型は 、ＣＤ４３陽性ＨｅＬａ細胞よりも、ＣＤ４３陰性細胞に有意によく結合した（ 図２）。同様の結果は、別のクローンから誘導された他の二組のｌ１ｅＬａ細胞 トランスフ工クシヨン転換体を用いて得られた（データは示さず）。これらのデ ータは、ｌ１ｅＬａ細胞トランスフ工クシヨン転換体によるＣＤ４３発現が１９ ２８球の接着を阻害することを証明した。

これらの結果は、又、ＣＤ４３の１９２８球に対する抗接着効果がリンパ球の成 熟段階には依存しないことを示唆している。

ＬＦＡ−■仲介のリンパ球接着に対するＣＤ４３の効果ＣＤ４３がＬＰＡ−１仲 介のリンパ球接着を阻害し得る可能性を決定するために、我々発明者は、ＬＦＡ −１を介して各セントのｌｌｃＬａｍ胞トランスフェクション転換体に結合する Ｔ細胞の比率を測定した。これらの実験に対して、ヒトのＩし一２依存性Ｔ細胞 系（ＪＬ８９）及び円１＾−丁細胞（Ｐ晶で３日間刺激されＩＬ−２中に１０日 以内維持されたＴ細胞）が用いられた。リンパ球は、３０分氷上で、正常マウス 血清、或いは１．ＰＡ−１仲介の接着を阻害するために抗ＬＲＰＡ−１抗体（Ｍ ａｒｌｌｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ　５１：８１３−８１９、１９８７）　 、又ハ、ＣＤ２仲介の接着を阻害するために抗ＣＤ２　（ＴＳ２／１８）とＲＰ Ｉ４＋１６４０培地中、ｌ：２００倍希釈で予めインキュベートした。次いで、 リンパ球はＣＤ４３陽性或いはＣＤ４３陰性のＨｅＬａ細胞に接着させた。Ｌｌ ’＾−１仲介のリンパ球接着に対するＣＤ４３の効果は、別のＨｅＬａ細胞トラ ンスフェクション転換体への結合を阻害されたリンパ球のパーセントと比較して 決定された。

ＣＤ４３陰性１１ｃＬａ細胞に対する几８９リンパ球の結合は、ＣＤ４３陽性細 胞に対するよりも２．５倍大きかった（図３＾）。几８９リンパ球を単クローン 性抗体ＴＳＩ−２２と予めインキュベートすると、両セットのＨｅＬａ細胞に対 するリンパ球結合の阻害が約８０％に達する結果となった（図３Ａ）。これらの データは、几８９の両セットのｌ１ｅＬａ細胞に対する結合の相当な部分がＬＦ Ａ−１を介すること、及び、観察されたＣＤＩＩＩにょるＴ細胞結合の阻害は、 大部分、そのＬＦＡ−１を介する接着の阻害であることを示唆するものである。

ＬＰＡ−１を介する接着に対する同程度のＣＤ４３による阻害は、又、ｐＨ＾− Ｔ細胞の芽細胞に対しても観察され（図３Ｂ）、この様な阻害が、几８９７細胞 クローンに特異的な特色に二次的ではないことを確証した。１ｌｅｌａ細胞トラ ンスフ工クシヨン転換体を抗１ｃＡＭ−１腹水（ＲＲＩ／１）と予めインキュベ ートする逆阻害実験は、ＨｅＬａ細胞によるＣＤ４３発現がＬＦＡ−１仲介のＴ 細胞結合を阻害することを確証した（データは示さず）。リンパ球をＣＤ２に対 する単クローン性抗体（ＴＳ２−１８）と予めインキュベーションしても、この 検査系ではＴ細胞の結合を阻害せず、この結果は、部分的に、ＩＩｅＬａＨｅＬ ａ細胞ＦＡ−３低発現に係わる様に思われた（表１）。

ＰＭＡにより活性化された１９２８球の接着に対するＣＤ４３の効果リンパ球の ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）処理による活性化が その同型接着を増加することが証明されている（Ｒｏｔｈｃｌｅｉｎ　ｅｔ　ａ ｔ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６３：１１３２−１１４９．１９８６） 　ｏこの増加接着の機構は、ＰＭＡに誘導されたしＦＡ−１のＩＣＡＭ−１に対 する結合活性の増加の結果である（Ｄｕｓｔｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒ ｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３４１：６１９−６２４．１９８９）　、　ＬＰＡ−１ の１０八トｌに対する結合活性の向上が、リンパ球接着のＣＤ４３による阻害を 克服出来るがどぅがを検討するために、リンパ球を５゜ｎｇ／ｍｌ　（最終濃度 ）のＰＭＡ（Ｓｌ：ａａ、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｎｏ）存在下、６０分、３ ７℃で、５％の００２を含む加湿インキュベーター内で、ＨｅＬａ細胞と接着さ せた。几８９Ｔ細胞クローンＣＤ４３陰性、及びＣＤ４３陽性の１ＩｅＬａ細胞 への結合が、次いで、ＰＭＡによるＴ細胞活性化の前後に比較された。同時イン キュベーション期間中の細胞凝集を防ぐために、通常用いられるＴ細胞数の５０ ％　（即ち、２５ｘ１０３個の細胞）が各ウェルに加えられた。

ＰＭＡの添加は、Ｔ細胞のＣＤ４３陰性、及びＣＤ４３陽性のトランスフェクシ ョン転換体の両方に対する結合を増大する結果となった（図４）。しかしながら 、ＣＤ４３陰性細胞に結合するリンパ球のパーセントの増加は、ＣＤ４３陽性１ １ｅＬａ細胞に結合する増加よりも大きかった（夫々、３５％対１４％）。ＰＨ ＾処理リンパ球を抗ＬＦＡ−１抗体Ｔ３１−２２と予めインキュベーションする と（前述の様に）、両セットの）＋ｅＬａ細胞トランスフェクション転換体に対 するＴ細胞の７０−７５％阻害をもたらす結果となった。

リンパ球によるＬＦＡ−１発現量も、別々の１ｌｅＬａ細胞トランスフ工クシヨ ン転換体によるＩｃＡＭ−１発現量も、ＰＨ＾処理後に変化せず（データは示さ ず）、受容体発現の定量的差異が結合の差異の原因となる可能性を除外した。こ れらのデータは、ＣＤ４３の抗接若効果は１９２８球のＰＨＩ＾処理によっては 克服されないことを示唆した。

これらの結果は、又、ＣＤ４３がＬＦＡ−１を介するＴ細胞接着を、Ｌｒ’Ａ− １のＩＣ八へ１に対する結合活性に係わらず、阻害出来ることを示唆する。

ＬＦＡ−１仲介の接着のＣＤ４３による阻害に対するノイラミニダーゼの効果Ｃ Ｄ４３の著名な特徴は、陰荷電のシアル酸残基による広範な置換である（Ｒｅｓ ｏｌｄｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２［ｉ１ニア５２Ｂ、 　１９８６；　Ｃａｒｌｓｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉ’３奄盾P．　ｃ ｈｅｔ ２６に１２７７９．１９８６）。これらのシアル酸残基は、細胞表面に正味の陰 荷電を提供することによって、ＣＤ４３に抗接着機能を与え、ＣＤ４３陽性細胞 間の反発をもたらすものと提唱されている（Ｂｒｏｗｎ　ａｔ　ａｔ、、　Ｎａ ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２８９：４５６−４（ｉｏ、　１９１１１）。Ｃ Ｄ４３のシアル酸残基が細胞同志の接着の阻害に寄与するかどうかを決定するた めに、１１ｅＬａ細胞トランスフ工クシヨン転換体をＴ細胞接着を検査する前に ノイラミニダーゼで処理した。１ＩｅＬａ細胞がコレラ菌のノイラミニダーゼ（ ｌ−１当たり０．０２単位）とＲＰＭＩ　１６４０培地中で１時間、３７℃でイ ンキュベートした後、細胞を十分に洗浄した。ノイラミニダーゼのこの濃度（ｌ 　ａｌ当たり０．０２単位）は予め決定されて、抗Ｌｅｕ　２２によって認識さ れるシアル酸依存性の抗原決定基を完全に除去するが、ポリスチレンウェルへの 細胞接着には影響しない様にした。

１１ｅＬａ細胞のノイラミニダーゼ処理は、ＣＤ４３陰性およびＣＤ４３陽性の トランスフェクション転換体の両方に対するＴ細胞の接着を増大した（図５）。

しかしながら、ＣＤ４３陽性のＨｅＬａ細胞へのＴリンパ球結合０増大は、ＣＤ ４３陰性の１ｌｅＬａ細胞に対するリンパ球結合の増大よりも有意に大きかった （夫々、１８，５％対８．８％、図５参照）。

ノイラミニダーゼで処理されたリンパ球を抗ＬＦＡ−１抗体ＴＳＩ／２２と予め インキュベートすると、両セットの１ＩｅＬａ細胞トランスフ工クシヨン転換体 に対するＴ細胞の接着の８０％阻害の結果となった。これらの結果は、ＣＤ４３ からのシアル酸残基の除去がＣＤ４３陽性１１ｅＬａ細胞へのＴ細胞接着の不釣 合な増加の原因であり、又、この増大した接着がＬＦＡ−１仲介であることを示 唆した。しかしながら、ノイラミニダーゼ処理にも拘らず、１９２８球のＬＦＡ −１を介するＣＤ４３陽性１１ｅＬａ細胞への結合の　゛総パーセントは、ＣＤ ４３陰性細胞に対するよりも著しく低いままであった（夫々、３２．７対４６． ０％、図５参照）。総合すると、これらのデータは、ＣＤ４３のシアル酸残基は 、そのＬＦＡ−１仲介のＴリンパ球接着を阻害する能力に寄与するが、原因の全 てではないことを示唆する。

ＣＤ４３は細胞の相互作用を阻害するように作用する前記載の結果は、ＣＤ４３ 　（ロイコシアリン或いはシアロホリン）が、対向する細胞に発現された場合、 抗接着分子として機能することを証明するものである。１ｌｅＬａ細胞によるＣ Ｄ４３の発現は、元来ＣＤ４３を発現する細胞である１９２８球の接着を著しく 阻害した。この阻害は、ＨｅＬａ細胞トランスフェクション転換体による生理的 レベルのＣＤ４３発現で起こり、又、１９２８球の供給源、或いは起源には無関 係に観察された。これらの結果は、又、対向する細胞によるＣＤ４３の発現がＬ ＦＡ−１仲介のＴ細胞接着を阻害することを示している。用いられた検査条件下 では、大抵のＴ細胞接着はＬＦＡ−１を介するものであった（図３参照）。従っ て、観察されたＣＤ４３によるＴ細胞結合の阻害は、ＬＦＡ−１仲介の接着阻害 を表したものである。Ｌｌ’Ａ−１を介する接着は、リンパ球間の支配的な接着 経路を構成するので（Ｍｅｎｔｚｃｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ 、　１３５：９−１１．１９８５；　Ｒｏｔｈｌｅｌｎ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、@ｆ６３：１１３ ２−１１４９．１９８１ｉ）　、本明細書記載の結果は、ＣＤ４３がＬＰＡ−１ を介する接着を阻害することによってＴリンパ球間の接着を制御している可能性 を示唆する。

ＬＦＡ−１はいくつかの活性化依存性の細胞間接着分子の１つで、ＬＰＡ−１陽 性細胞のＰＨ＾処理によって、ＩＣ八へｌに対するその結合活性を著しく高めら れる（Ｄｕｓｔｉｎｅｔ　ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ化ｏｎｄｏｎ）　３４１：６ １９−６２４．１９８９）。ＰＨ＾処理は、ＣＤ４３陰性でＩＣ＾トｌ陽性のＨ ｅＬａ細胞に対するＴ細胞結合のパーセントを増大したので、前記の結果は、こ れらのデータと一致する。しかしながら、ＰＭＡにより誘導されＣＤ４３陽性１ ｅＬａ細胞に対するＴ細胞結合の増大は、ＣＤ４３陰性＋１ｃＬａ細胞に対する 増大と比較するとそれ程著明でもなかった（図４参照）。これらの結果は、ＣＤ ４３の抗接着効果はＩｃＡＭ−１に対するＬＰＡ−１の結合活性の向上によって は克服されないことを示唆する。

ＣＤ４３の２つの著明な特徴は、その細胞外領域の広範な０−グルコシル化とシ アリル化とである（Ｒｅｍｏｄ−０’Ｄｏｎｎｅｌｌ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、　 Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｔ　２８１ニア５２Ｂ−７５３０，１９８６；Ｃａｒｌｓｓｏ ｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｔ　２ｆｉ１：１２７７９−１２７８ ８．　１９８６；　Ｐａ１ｌａｎｔ　ｅｔ　≠煤A。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８８：１３２８−１ ３３２．１９８９；　５ｈｃｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ盾メA　Ｎａ１１ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８６：２［１１９−２８２３，１９８９） 。シアル酸残基は、ＣＤ４３に陰荷電を与え、同じ荷電の反発によりＣＤ４３陽 性細胞相互の連結を制限する可能性がある。本研究のノイラミニダーゼ処理実験 の結果は、ＣＤ４３のシアル酸残基は、その抗接着効果に寄与するが、全ての原 因ではないことを示唆する（図５参照）。ノイラミニダーゼ処理の効力は、ＣＤ ４３陽性＋１ｅＬａ細胞からＣＤ４３のシアル酸依存性の抗原決定基（抗Ｌｅｕ 　２２反応性）を除去する能力によって測定されたので、ＣＤ４３上の他のシア ル酸残基は無傷の侭で残った可能性がある。これらの条件下では、ＣＤ４３の抗 接着効果に対するシアル酸の寄与は過少評価されたかも知れない。しかしながら 、ＨｅＬａ細胞トランスフェクション転換体が、前記で用いられたよりも５倍高 い濃度（１ａｌ当たり０．１単位）のノイラミニダーゼで処理された他の実験に おいて、それ以上のＴ細胞結合の特異的な増加は認められなかった。これらの観 察は、シアル酸が、ＣＤ４３の抗接若効果の原因の全てではないことを示唆する 。

ＣＤ４３の全細胞外領域にわたる多数の〇一連結炭水化物（平均して３アミノ酸 当たり１個の有力な〇一連結部位）　（Ｐａｌｌａｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：１３２ｇ−１３３ ２，１９８９；　５ｏｕｔｈｅｒｎ　ｅｉ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．＾ｐｐ１ ．　Ｇｅｎｅｔ、　１：３２７−３４１D１９８２） は、ＣＤ４３が細胞表面に広がり折りたたまれない構造として存在することを示 唆する（Ｊｅｎｔｏｆｔ　、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｌｏｃｈｅｓ、　Ｓｃｉ、　１５ ：２９１−２９４．１９９０）　ｏ最近、ラットのＣＤ４３の細胞外領域が４５ 　ｎｍに広がるとＩＩＩＩ定されている（Ｃｙｓｔｃｒ　ｅｔ　ａｔ、、　ＥＭ ＢＯＪ、　ｌｏ：８９３−９０２．１９９１）　、　ＣＤ４３のこれらの構造的 特徴は、２５−３０　ｎ−の膜間距離内（Ｓｐｒｌｎｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ　（ Ｌｄｎｄｏｎ）　３４８：４２５−４３４．１９９０）で起こると予言されてい る相互作用である、そのＬＰＡ−１を介するＴ細胞結合の阻害能力に一致してい る。他の受容体・対向受容体対（例えば、ＣＤ２／ＬＦＡ−３）は、ＬＦＡ−１ ／ＩｃＡＭ−１に対するよりも実際小さな膜間距離を要すると予想されており、 これらの相互作用する能力はＣＤ４３発現により有意に減少することを示唆して いる。本明細書に記載の実験は、主としてＬＰＡ−１を介するＴ細胞の接着に対 するＣＤ４３の効果を検出するために計画されたが、他の実験では、ＣＤ４３陽 性のＨｅＬａ細胞は、懸濁状態で、凝集しないが、一方、ＣＤ４３陰性のＩＩｅ ＬａＨｅＬａ細胞凝集体を形成するという観察がされている（データは示されず ）。ＨｅＬａ細胞はＬＦＡ−１を発現しないので、ＣＤ４：ｌ陽性のＨｅＬａ細 胞の凝集不能性は、ＣＤ４３の細胞同志の接着阻害が、ＬＦＡ−１を介する結合 阻害に特異的に限られないという概念を支持する。

他の研究者は、ＣＤ４３が接着指向性特徴を持ち（Ｐａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３５０ニア０Ｂ−７０９，１９９１）、直接１ ｃＡＭ−１に結合出来ることを示している（Ｒｏｓｅｎｓｔｅｌｎ　ａｔａｔ、 、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３５４：２３３−２３５．１９９１）。

後者の研究では、バーキットリンパ腫由来のＢ細胞系の１つであるＤａｕｄｉ　 （ＣＤ４３陰性）がＣＤ４３に結合すること、又、ヒトのＣＤ４３を発現してい るマウスのハイブリドーマＩｃＡＭ−１に結合することが示された。ＣＤ４３陽 性のＨｅＬａ細胞が精製した可溶性ＣＤ４３に結合するという証明は今のところ 無いが、この様な矛盾する結果は、異なった条件下で、高度にグリコジル化され た神経細胞接着分子であるＮＣＡＭで観察されたのと同様に（Ｒｕｔｉｓｈａｕ ｓｅｒ　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：５３−５７．１９８８）　 、ＣＤ４３が向接着性及び抗接着性活性の両方を持ち得ることを示唆しているの かも知れない。前記の研究で用いられた接着検定の条件は、ＣＤ４３陽性リンパ 球間の相互作用を模倣することを目的にして、対向細胞によるＣＤ４３発現の効 果を検出するために設定された。

細胞間相互作用の有効限界値は、ＣＤ４３が相互作用する細胞の一方或いは両方 によって発現されるかどうかに大いに依存している可能性がある。例えば、ＣＤ ４３陽性のリンパ球間の結合有効限界値は、リンパ球とＣＤ４３陰性細胞（例え ば、高内皮細静脈）との間の結合有効限界値より大きいと予測される。又、ＣＤ ４３のインビボ効果は、その組織分布に加えて、そのシアリル化の程度に依存す る可能性もある。

不完全シアリル化ＣＤ４３、これは本来、胸腺細胞（Ａｒｄｍａｎ　ａｔ　ａｌ 、、　Ｊ、　ＥＸＩＴ、　ＭＣｄ。

１７２：１１５１−１１５Ｌ　１９９０；　Ｒｅ５ｏｌｄ−０’Ｄｏｎｎｅｌｌ 　ｅＬ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　７０：１０４−１０９．　{９１１７；　Ｂ。

ｒｃｈｅ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｓｓｕｎｏ１．１７：１５２３ −１５２６．１９８７）、及び、恐らくは、活性化された経中心のＢリンパ球（ ＩｌｕＬｃｈｅｒ　ｅＬ　ａｌ、＋　Ｊ、　Ｉ＊ｍｕｎｏ１．１２９：２Ｇ９ｇ −２７０７，１９８６）による発現型であるが、近接する細胞或いは形質膜への 細胞接着を促進する可能性のあるオリゴ糖に富むコア構造を露出している。これ に対し、成熟Ｔリンパ球によって発現される完全シアリル化型は（Ｒｅ５ｏｌｄ −０’Ｄｏｎｎｃｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｏｄ　７０：ｌ０４−１０９． 　＋９８７：　Ｂｏｒｃｈｅ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｓ＊ｕｎｏ １．１７：１５２３−１５２６．１９W７）、ＣＤ ４３陽性細胞間の接着を制限する様に機能出来る筈である。

ＣＤ４３キメラの構成 ＣＤ４３タンパク質は、細胞の相互作用を阻害するので、このタンパク質は一般 に標的細胞の表面を被覆して有害な細胞間を０互作用、例えば、炎症の原因とな るこれらの細胞相互作用を阻止するのに用いることが出来る。ＣＤ４３タンパク 質を正しい標的細胞表面に指向するために、ＣＤ４３キメラ分子が構成され、こ れには、（ａ）相互作用が停止されるべき一方、又は両方の細胞の表面にある分 子（例えば、受容体、リガンド、或いは対向受容体）へのキメラ分子の特異的結 合を指示する細胞指向性分子、及び（ｂ）細胞相互作用に対抗し、生理的ｐ＋＋ において正味の陰荷電を帯びるＣＤ４３の細胞外領域が含まれる。この様なキメ ラタンパク質は、投与を容易にするために可溶性であるべきである。

２つの特に好適なキメラタンパク質は、ＣＤ４３：ＬＮＦ　ＩＩＩ及びＣＤ４３ ：　シアリルＬｅｗＩｓｘである。ＬＮＦＩＩＩ及びシアリルＬｃｗｉｓｘ（両 分子とも白血球の表面上にある）は、炎症の間に活性化された内皮細胞の表面に 存在する受容体であるＰ−セレクチン及びＥＬＡＭ−１と（夫々）特異的に相互 作用し、この様な免疫細胞と内皮細胞との相互作用が炎症応答の進行に必要であ る。従って、治療用のＣＤ４３：ＬＦＮ　ＩＩＩ或いはＣＤ４３：　シアリルＬ ｃｗｉｓｘキメラ分子は、内皮細胞表面をＣＤ４３タンパク質で被覆しく特異的 に免疫細胞との相互作用を阻害し）、それによって炎症の治療と防止のために投 与することが出来る。

炎症を治療する別の研究方法では、陰荷電を帯びたＣＤ４３の細胞外領域を受容 体であるＶＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−１と融合してキメラタンパク質ＣＤ４３： ＶＣＡＭ−１及びＣＤ４３：ＩＣＡＭ−１を生成する。この様なタンパク質はあ るタイプの白血球の表面を被覆して、やはり、炎症の原因となる免疫細胞と内皮 細胞間の細胞相互作用を阻害する。

ＣＤ４３二ＬＮＰ　ＩＩＩ、ＣＤ４３　：　シアリルＬｅｖｉｓ”　、　ＣＤ４ ３：ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４３：ＶＣＡＭ−１、或いはいかなるＣＤ４３キメラに せよ、これらを構成するためには、生理的ｐｌ＋で正味の陰荷電を帯びているＣ Ｄ４３タンパク質の細胞外（可溶性）部分が、選択された細胞指向性分子に共役 結合される。好適には、ＣＤ４３領域は陰荷電を帯びるだけでなく、又、細胞間 相互作用を物理的に阻害するに足る十分なサイズのものであるべきである。好適 には、ＣＤ４３領域は、ＣＤ４３配列のＮ末端１１１０個のアミノ酸を、更に好 適には、Ｎ末端の２２０個から２３３個のアミノ酸を含む（例えば、５ｈｃｌｌ ｙ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８６：２１１１９．１９Ｆｉ９；　Ｐａ１ｌａｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ 、　mａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＩＳＡ　８６：１３２ｇ、　１９８９に記載されている様に）。

細胞指向性分子は、リガンド、受容体、対向受容体、抗体、炭水化物、或いは標 的細胞上の表面分子と特異的な相互作用をする能力を持ついかなる分子からでも 選ぶことが出来る。細胞指向性領域は、又、可溶性であるべきで、更に、漂的細 胞表面上のその結合相手との特異的な相互作用を指示するに十分なサイズと構成 成分を持つものでなければならない。ＩＣＡＭ−１に対しては、細胞指向性領域 は、好適には、５Ｌａｕｎｔｏｎら（Ｃｅｌｌ　５２：９２５．１９１１８）に よって記載されているＩＣ＾Ｃエト列のＮ−末端の４３０個からＮ−末端の４５ ２藺の間のアミノ酸を、ｖＣ八へ１に対しては、細胞指向性領域は、好適には、 ０ｓｂｏｒｎら（Ｃｅｌｌ　５９：１２０９．１９１１９）によって記載されて いるＶＣ＾Ｃエト列のＮ−末端の５８０個からＮ−末端の６０６個の間のアミノ 酸を、及び、ＣＤ４に対しては、細胞指向性領域は、好適には、Ｍａｄｄｏｎら （Ｃｅｌｌ　４２：９３．１９１１０）及びｌ１ｕｓｓｅｙら（Ｎａｔｕｒｅ　 ３３１ニア８．１９８８）によって記載されているＣＤ４配列のＮ−末端の３５ ０個からＮ−末端の３７１個の間のアミノ酸を含む。

キメラタンパク質内のＣＤ４３と細胞指向性領域の相対的位置は、Ｎ−末端一細 胞指向性分子−ＣＤ４３−　Ｃ−末端という位置づけが好適ではあるが、キメラ 分子の機能にとって重大ではない。これら領域の柔軟性を向上し、各領域が他の 分子（例えば、対抗するＣＤ４３分子、或いは細胞表面リガンド、受容体、或い は対抗受容体）と相互作用する容易性を増加するために、種々の長さのプロリン 残基に富むヒンジ領域が２つの領域の間に挿入されてもよい。

本発明のキメラ分子は、好適には、分子生物学の標準技法を用いて着想し構成さ れたキメラ融合遺伝子から発現されたキメラタンパク質である（例えば、５ａＩ Ｄｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　＾　Ｌ ａｂｏｒａＬｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、２ｄ　ｅｄ、、Ｃｏ１ｄ　rｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｌ；　ｌ１ａｒｂｏｒ、　 ＮＹ；　或いは、＾ｕｓｕｂｃｌ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｕｒ窒■獅■ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｉｌｅ ｙ　ＩｎＬｃｒｓｃｉｅｎｃｅ、　１９１！９参照）。しか■■ がら、キメラ分子は、又、キメラのタンパク質、タンパク質断片、或いは分子の 化学的連結によっても生成し得る。化学的連結研究手段は、ＣＤ４３：ＬＮＦ　 ＩＩＩ及びＣＤ４３、シアリルＬｃｖｉｓｘの様なＣＤ４３　炭水化物キメラに 対する選り抜きの方法である。

或原 本発明のＣＤ４３キメラ分子は、一般に、有害な細胞間相互作用を阻害するのに 有用であり、又、特に、炎症の原因となる内皮細胞と免疫細胞との相互作用、及 び病原体感染の原因となる宿主細胞と病原体細胞との１口互作用に対抗するのに 有用である。

投与のために、治療用のＣＤ４３キメラ分子は生理食塩水の様な適当な薬剤学的 に許容されるＷ？Ｆｊ液に処方される。治療製剤は処理すべき状況に従って投与 される。

通常、製剤は、有害な細胞間相互作用に対し適切な拮抗をもたらすｍｍで、静脈 内に投与され、この様な用量は、普通、０．Ｏｌから１００１ｇ／ｋｇ／日の範 囲で、好適には０．１から５　ｍｇ／ｋｇ／日である。代わりに、治療薬を経口 的、鼻腔内、非経口的、皮下、或いは局所的に、例えば軟膏、溶液、或いはスプ レーとして投与するのも便利である。変形関節炎に対しては、治療製剤は直接、 炎症を起こしている関節に注射してもよい。又、用量は前記の様である。治療は 病気の症状の軽減、或いは阻止のため必要なたけ反復してもよい。

ＣＤ４３：ＬＮＦ　ＩＩＩ、ＣＤ４３：　ン７１Ｊ　ルＬｃｖｉｓｘ、　Ｃ’Ｄ ４３：ＩＣＡＭ−１、及びＣＤ４３　：ＶＣＡＭ−１治療用タンパク質は特に白 血球と活性化内皮細胞間の相互作用の阻害に有用であり、それ故に、炎症性疾病 、例えば、脈管炎障害、狼唐、及び変形関節炎の治療或いは阻止に、又、例えば 、器官拒絶の原因となる末期免疫応答の低減にも有用である。ＣＤ４３：　ＩＣ ＡＭ−１は、又、ウィルス感染に二次的に起こる細胞性、器官特異的炎症の遮断 に用いても良く、従って、ウィルス性心筋炎の様な疾病の治療に有用てあり得る 。

本明細書に記載の方法及び治療は、いかなる唾乳動物、例えば、ヒト、家庭愛玩 動物、或いは家畜の疾病の治療に用いてもよい。ヒト以外の哺乳動物が治療され る場合、治療用ＣＤ４３キメラタンパク質の構成に使用されるＣＤ４３或いは細 胞指向性タンパク質はその動物種に特異的であることが望ましい。

他の態様は以下の請求の範囲に述べられる。

請求の範囲の内容は以下の通りである。

結合したリンパ球　１％ 結合したリンパ球　０％ フロントページの続き Ｃ０７Ｋ　１９１００　８３１８−４ＨＣ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４ Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０９ （Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．可溶性キメラ分子の使用であって、当該分子が、第一細胞の表面上の分子を 特異的に認識して結合することが出来る細胞指向性分子（ａ）で、生理的ｐＨで 正味の陰荷電を帯びているＣＤ４３の細胞外領域（ｂ）に共役結合する構成を持 ち、哺乳動物における疾病の治療のために第一と第二の細胞間の相互作用を阻害 することを特徴とする。
2. ２．請求項１に記載の使用であって、その中で第二の細胞がその細胞表面上に陰 荷電の分子を持つことを特徴とする。
3. ３．請求項２に記載の使用であって、その中で当該陰荷電の細胞表面分子がＣＤ ４３であることを特徴とする。
4. ４．請求項１に記載の使用であって、その中で当該ＣＤ４３の細胞外領域がグリ コシル化されていることを特徴とする。
5. ５．請求項１に記載の使用であって、その中で当該ＣＤ４３の細胞外領域がＣＤ ４３タンパク質の配列のＮ−末端１８０個のアミノ酸からなることを特徴とする 。
6. ６．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＬＦＮ　Ｉ ＩＩ受容体タンパク質のＰ−セレクチン結合部分であることを特徴とする。
7. ７．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がシアリルＬ ｅｖｉｓｘ受容体タンパク質のＥＬＡＭ−１結合部分であることを特徴とする。
8. ８．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＩＣＡＭ− １受容体タンパク質のＬＦＡ−１結合部分であることを特徴とする。
9. ９．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＶＣＡＭ− １受容体タンパク質のＶＬＡ−４結合部分であることを特徴とする。
10. １０．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＣＤ４の ヒト免疫不全症ウイルス結合部分であることを特徴とする。
11. １１．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＩＣＡＭ −１のうイノウイルス結合部分であることを特徴とする。
12. １２．請求項１に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＩＣＡＭ −１のプラスモジウム（マラリア原虫）結合部分であることを特徴とする。
13. １３．請求項１に記載の使用であって、その中で当該第一の細胞が活性化された 内皮細胞であることを特徴とする。
14. １４．請求項１に記載の使用であって、その中で当該第一の細胞が感染性病原体 であることを特徴とする。
15. １５．請求項１４に記載の使用であって、その中で当該感染性病原体がライノウ イルス、熱帯熱マラリア原虫（ＰＩａｓｍｏｄｌｕｍ　ｆａｌｃｌｐａｒｕｍ） 、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｍａｌａｒｌａｅ）、或いはヒ ト免疫不全症ウイルスであることを特徴とする。
16. １６．キメラ分子であって、ある細胞の表面上の分子を特異的に認識して結合す る能力があり、生理的ｐＨで正味の陰荷電を帯びているＣＤ４３の細胞外領域（ ｂ）に結合している細胞指向性分子（ａ）からなることを特徴とする。
17. １７．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該ＣＤ４３細胞外領 域がグリコシル化されていることを特徴とする。
18. １８．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該ＣＤ４３細胞外領 域がＣＤ４３タンパク質配列のＮ−末端１８０個のアミノ酸からなることを特徴 とする。
19. １９．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が ＮＦＩＩＩ受容体タンパク質のＰ−セレクチン結合部分であることを特徴とする 。
20. ２０．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が シアリルＬｅｖｉｓｘ受容体タンパク質のＥＬＡＭ−１結合部分であることを特 徴とする。
21. ２１．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が ＩＣＡＭ−１受容体タンパク質のＬＦＡ−１結合部分であることを特徴とする。
22. ２２．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が ＶＣＡＭ−１受容体タンパク質のＶＬＡ−４−結合部分であることを特徴とする 。
23. ２３．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が ＣＤ４のヒト免疫不全症ウイルス結合部分であることを特徴とする。
24. ２４．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が ＩＣＡＭ−１のライノウイルス結合タンパク質であることを特徴とする。
25. ２５．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が ＩＣＡＭ−１のブラスモジウム（マラリア原虫）結合部分であることを特徴とす る。
26. ２６．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が 活性化された内皮細胞の表面上の分子を特異的に認識して結合することを特徴と する。
27. ２７．請求項１６に記載のキメラ分子であって、その中で当該細胞指向性分子が 感染性病原体を特異的に認識して結合することを特徴とする。
28. ２８．活性化された内皮細胞の表面上の分子を特異的に認識して結合する能力が あり、生理的ｐｌｌで正味の陰荷電を帯びているＣＤ４３の細胞外領域（ｂ）に 結合している細胞指向性分子（ａ）からなるキメラ分子を使用して、哺乳動物に おける炎症の治療のため当該活性化内皮細胞と白血球間の細胞間相互作用を阻害 することを特徴とする。
29. ２９．請求項２８に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がＬＮＦ ｌｌｌ受容体タンパク質のＰ−セレクチン結合部分であることを特徴とする。
30. ３０．請求項２８に記載の使用であって、その中で当該細胞指向性分子がシアリ ルＬｗｉｓｘ受容体タンパク質であることを特徴とする。
31. ３１．病原体の表面上の分子を特異的に認識して結合する能力があり、生理的ｐ Ｈで正味の陰荷電を帯びているＣＤ４３の細胞外領域（ｂ）に結合している細胞 指向性分子（ａ）からなるキメラ分子を使用して、当該病原体による哺乳動物の 感染の治療のため、当該病原体とそれが通常感染する哺乳動物細胞との間の細胞 間相互作用を阻害することを特徴とする。
32. ３２．請求項３１の使用であって、その中で当該病原体がヒト免疫不全症ウイル スであることを特徴とする。