DK175362B1 - Oplöseligt funktionelt derivat af ICAM-1, rekombinant DNA-molekyle og fremgangsmåde til fremstilling af nævnte derivat, farmaceutisk præparat indeholdende et sådant derivat og derivatets anvendelse til fremstilling af et sådant præparat, samt.... - Google Patents
Oplöseligt funktionelt derivat af ICAM-1, rekombinant DNA-molekyle og fremgangsmåde til fremstilling af nævnte derivat, farmaceutisk præparat indeholdende et sådant derivat og derivatets anvendelse til fremstilling af et sådant præparat, samt.... Download PDFInfo
- Publication number
- DK175362B1 DK175362B1 DK199001289A DK128990A DK175362B1 DK 175362 B1 DK175362 B1 DK 175362B1 DK 199001289 A DK199001289 A DK 199001289A DK 128990 A DK128990 A DK 128990A DK 175362 B1 DK175362 B1 DK 175362B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- icam
- cells
- lfa
- antibody
- binding
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 103
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 title claims description 40
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 4
- 102000015271 Intercellular Adhesion Molecule-1 Human genes 0.000 title description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 353
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 claims description 163
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 114
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 57
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims description 48
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 34
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 33
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 28
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 28
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 28
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims description 22
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 22
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 claims description 19
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 18
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 claims description 17
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 17
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 claims description 16
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 claims description 15
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N azathioprine Chemical compound CN1C=NC([N+]([O-])=O)=C1SC1=NC=NC2=C1NC=N2 LMEKQMALGUDUQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 229960002170 azathioprine Drugs 0.000 claims description 9
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 8
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 230000035886 specific defense system Effects 0.000 claims description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000035781 nonspecific defense system Effects 0.000 claims description 5
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims description 4
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 3
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 claims description 3
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 claims description 3
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 claims description 3
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims description 3
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims 30
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 claims 5
- 208000019691 hematopoietic and lymphoid cell neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 159
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 84
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 82
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 73
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 72
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 58
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 49
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 38
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 38
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 38
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 37
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 36
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 36
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 34
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 34
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 30
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 30
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 30
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 29
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 29
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 29
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 27
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 22
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 22
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 22
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 21
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 20
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 20
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 20
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 19
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 19
- 101000616778 Homo sapiens Myelin-associated glycoprotein Proteins 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 18
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 18
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 18
- 101000876511 Homo sapiens General transcription and DNA repair factor IIH helicase subunit XPD Proteins 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 17
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 17
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 17
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 15
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 15
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 15
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 15
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 15
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 15
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 14
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 14
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 14
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 14
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 14
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 14
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 13
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 13
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 12
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 12
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 11
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 11
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 11
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 11
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 10
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 108010047620 Phytohemagglutinins Proteins 0.000 description 9
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 9
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 9
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 8
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 8
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 8
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 8
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 8
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 8
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 8
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 7
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 7
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 7
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 7
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 7
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 6
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 6
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 6
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 201000001779 Leukocyte adhesion deficiency Diseases 0.000 description 6
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 6
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 6
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 6
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 6
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 6
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 6
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 6
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 6
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 6
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 6
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HILUWRPVFKJTAD-ZGHMGGRHSA-N GA21 Chemical compound O=C(O)[C@H]1[C@@H]2[C@]3(C(=O)O)C(=O)O[C@@]2([C@H]2[C@]41CC(=C)[C@@](O)(C4)CC2)CCC3 HILUWRPVFKJTAD-ZGHMGGRHSA-N 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 5
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 239000000823 artificial membrane Substances 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 208000025638 primary cutaneous T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N (4s)-5-[[(2s)-6-amino-1-[[(2s,3s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(2r)-1-[[2-[[2-[[(1s)-3-amino-1-carboxy-3-oxopropyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxo-3-sulfanylpropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]a Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN)CC1=CC=C(O)C=C1 KPYXMALABCDPGN-HYOZMBHHSA-N 0.000 description 4
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 108010084313 CD58 Antigens Proteins 0.000 description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100456320 Homo sapiens NR3C2 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 4
- -1 NACM Proteins 0.000 description 4
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 4
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 4
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 4
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 4
- 230000000652 homosexual effect Effects 0.000 description 4
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 3
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000028180 Glycophorins Human genes 0.000 description 3
- 108091005250 Glycophorins Proteins 0.000 description 3
- 102000011786 HLA-A Antigens Human genes 0.000 description 3
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 3
- 102100040607 Lysophosphatidic acid receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 101710149745 Lysophosphatidic acid receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 3
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 3
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 3
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 201000011486 lichen planus Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 3
- 210000004967 non-hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108010078015 Complement C3b Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 101710180995 Endonuclease 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 2
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000985694 Polypodiopsida Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000031673 T-Cell Cutaneous Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 2
- 102000019400 Tissue-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 230000009172 bursting Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 2
- 229960001701 chloroform Drugs 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 201000002491 encephalomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 2
- 210000005004 lymphoid follicle Anatomy 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 201000005962 mycosis fungoides Diseases 0.000 description 2
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 2
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000001986 peyer's patch Anatomy 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 2
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N sodium metavanadate Chemical compound [Na+].[O-][V](=O)=O CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 2
- 229940072690 valium Drugs 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 229910000166 zirconium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N (1aR,1bS,4aR,7aS,7bS,8R,9R,9aS)-4a,7b,9,9a-tetrahydroxy-3-(hydroxymethyl)-1,1,6,8-tetramethyl-1,1a,1b,4,4a,7a,7b,8,9,9a-decahydro-5H-cyclopropa[3,4]benzo[1,2-e]azulen-5-one Chemical compound C1=C(CO)C[C@]2(O)C(=O)C(C)=C[C@H]2[C@@]2(O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@]3(O)C(C)(C)[C@H]3[C@@H]21 QGVLYPPODPLXMB-UBTYZVCOSA-N 0.000 description 1
- DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N (2r)-2-methyl-2-[(4r,8r)-4,8,12-trimethyltridecyl]-3,4-dihydrochromen-6-ol Chemical compound OC1=CC=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1 DFUSDJMZWQVQSF-XLGIIRLISA-N 0.000 description 1
- NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O NWXMGUDVXFXRIG-WESIUVDSSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n-[4-(4-methoxyphenyl)-1,3-thiazol-2-yl]-n-(3-methoxypropyl)acetamide Chemical compound S1C(N(C(=O)CCl)CCCOC)=NC(C=2C=CC(OC)=CC=2)=C1 KZMAWJRXKGLWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091071337 20 family Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100436100 Caenorhabditis elegans asp-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100022187 Caenorhabditis elegans mab-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000025985 Central nervous system inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241001429175 Colitis phage Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000032974 Gagging Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018366 Glomerulonephritis acute Diseases 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 101000882584 Homo sapiens Estrogen receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000840258 Homo sapiens Immunoglobulin J chain Proteins 0.000 description 1
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000713275 Homo sapiens Solute carrier family 22 member 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 1
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053180 Leukaemia cutis Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101150114886 NECTIN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 description 1
- 102100023064 Nectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108050003738 Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004792 Prolene Substances 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010038776 Retching Diseases 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 101710112930 Trypsin inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine tetrahydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.NNC1=CC=C(C=C1)C1=CC=C(NN)C=C1 GPKUGWDQUVWHIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- NFXWJYUDIOHFAW-UHFFFAOYSA-N acetic acid;tetradecanoic acid Chemical compound CC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCC(O)=O NFXWJYUDIOHFAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 231100000851 acute glomerulonephritis Toxicity 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000010062 adhesion mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000007801 affinity label Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000002744 anti-aggregatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011861 anti-inflammatory therapy Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 210000003969 blast cell Anatomy 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 230000002566 clonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000005354 coacervation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000007241 cutaneous T cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 1
- 230000003001 depressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 1
- 210000001102 germinal center b cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 108010053299 glycyl-arginyl-glycyl-aspartyl-seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010044896 glycyl-arginyl-glycyl-glutamyl-seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 230000000423 heterosexual effect Effects 0.000 description 1
- 201000008298 histiocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011862 kidney biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008384 membrane barrier Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940028444 muse Drugs 0.000 description 1
- 210000003007 myelin sheath Anatomy 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- FRZJZRVZZNTMAW-UHFFFAOYSA-N n,n-diethyl-3-(hydroxymethyl)benzamide Chemical compound CCN(CC)C(=O)C1=CC=CC(CO)=C1 FRZJZRVZZNTMAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N n-octyl beta-D-glucopyranoside Natural products CCCCCCCCOC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HEGSGKPQLMEBJL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 230000002232 neuromuscular Effects 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002815 nickel Chemical class 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940046781 other immunosuppressants in atc Drugs 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N phorbol Natural products C[C@@H]1[C@@H](O)[C@]2(O)[C@H]([C@H]3C=C(CO)C[C@@]4(O)[C@H](C=C(C)C4=O)[C@@]13O)C2(C)C QGVLYPPODPLXMB-QXYKVGAMSA-N 0.000 description 1
- XLCISDOVNFLSGO-VONOSFMSSA-N phorbol-12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(O)C1(C)C XLCISDOVNFLSGO-VONOSFMSSA-N 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108010086652 phytohemagglutinin-P Proteins 0.000 description 1
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000249 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Substances 0.000 description 1
- 235000010483 polyoxyethylene sorbitan monopalmitate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 210000001243 pseudopodia Anatomy 0.000 description 1
- 230000003353 pseudopodial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000011536 re-plating Methods 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000004176 reticulum cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000001020 rhythmical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000009118 salvage therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 206010040400 serum sickness Diseases 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- XREXPQGDOPQPAH-QKUPJAQQSA-K trisodium;[(z)-18-[1,3-bis[[(z)-12-sulfonatooxyoctadec-9-enoyl]oxy]propan-2-yloxy]-18-oxooctadec-9-en-7-yl] sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCC(OS([O-])(=O)=O)C\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(CCCCCC)OS([O-])(=O)=O)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CC(CCCCCC)OS([O-])(=O)=O XREXPQGDOPQPAH-QKUPJAQQSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/655—Somatostatins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70525—ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2821—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against ICAM molecules, e.g. CD50, CD54, CD102
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
- C07K16/2845—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily against integrin beta2-subunit-containing molecules, e.g. CD11, CD18
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/77—Internalization into the cell
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
ΡΜΒΕΛ·.· ·' - _. , ,: y.^WF.^J>.-^LJMWcgy · -Ν «"*«?--·’- :,· ; ., ν.^Β5^^™!™^··|··· DK 175362 Β1 ι
Den foreliggende opfindelse angår intercellulæ-re adhæsionsmolekyler, såsom ICAM-1, som er involve-- ret i processen, gennem hvilken populationer af lym focytter genkender og hæfter til cellesubstrater, så-5 ledes at de kan migrere til inflammationssteder og påvirke cellerne under inflammationsreaktioner. Opfindelsen angår nærmere angivet et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1.
Leukocytter skal være i stand til at fæstne til 10 cellesubstrater for på rette måde at forsvare værten mod fremmede invaderende, såsom bakterier eller vira.
Et udmærket overblik over forsvarssystemet er angivet af Eisen, H.W., (Microbiology, 3. udg., Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), s. 290-295 og 381-418). De 15 skal kunne fæstnes til endotelceller, således at de kan migrere fra kredsløbet til steder med fortsat inflammation. yderligere skal de være i stand til at fæstne til antigenpræsenterende celler, således at en normal specifik immunreaktion kan forekomme, og ende-20 lig skal de fæstne til egnede målceller, således at lysis af virus-inficerede celler eller tumorceller kan ske. 1 30
I DK 175362 B1 I
I 2 I
I For nylig identificeredes leukocytoverflademo- I
I lekyler, som er involveret i formidlingen af sådanne I
I fæstnelser, under anvendelse af hybridoma-teknologi. I
I I
I Kort fortalt identificeredes monoklonale antistoffer I
I 5 rettet mod humane T-celler (Davignon, D. et al., „ I
I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4535-4539 (1981)) og I
I musemiltceller (Springer, T. et al. Eur. J. Immunol. I
I 9:301-306 (1979)), hvilke bandt til leukocytoverfla- I
I der og inhiberede de fæstnelsesrelaterede funktioner I
I 10 beskrevet ovenfor (Springer, T. et al., Fed. Proc. I
I 44:2660-2663 (1985)). Molekylerne, der identificere- I
I des med disse antistoffer, kaldtes Mac-1 og lymfocyt- I
I funktionsassocieret antigen-1 (LFA-1). Mac-1 er en I
I heterodimer, som findes hos makrofager, granulocytter I
I 15 og store granulære lymfocytter. LFA-l er en heterodi- I
I mer, som findes hos de fleste lymfocytter (Springer, I
I T.A., et al. Immunol. Rev. 68: 111-135 (1982)). Disse I
I to molekyler plus et tredje molekyle, pl50,95 (som I
I har en vævsfordeling svarende til Mac-1) spiller en I
I 20 rolle ved cellulær adhæsion (Keizer, G. et al., Eur. I
I J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)). I
I i
I 25 I
I I
I 30 I
3 DK 175362 B1
Ovennævnte leukocytmolekyler har vist sig at være medlemmer af en beslægtet familie af glycopro-teiner (Sanchez-Madrid F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J.
5 Immunol, 15^1142-1147 (1985)). Denne glycopro- teinfamilie består af heterodimerer med én a-kæde og én β-kæde. Skønt hver af antigenernes a-kæde var forskellige fra hinanden, viste β-kæden sig at være bevaret i høj grad (Sanchez-Madrid, F. et 10 al., Exper. Med. 1^8:1785-1803 (1983)). Gly- coproteinfamiliens (undertiden omtalt som "CD18") β-kæde viste sig at have en molekylvægt på 95 kd, hvorimod α-kædernes molekylvæægt varierede fra 150 kd til 180 kd (Springer, T., Fed. Proc.
15 4^:2660-2663 (1985)). Skønt membranproteinernes α-underenheder ikke har den samme vidtstrakte ho-mologi som β-underenhederne, viste nærmere analyse af glycoproteinernes a-underenheder, at der er væsentlige ligheder mellem dem. Undersøgelser 20 over lighederne mellem a- og β-underenhederne i de LFA-1-relaterede glycoproteiner er angivet af Sanchez-Madrid, F. et al., (J. Exper. Med.
158:586-602 (1983); Exper. Med. 158:1785-1803 (1983)).
25
I DK 175362 B1 I
I I
I Man har identificeret en gruppe af perso- I
I ner, som ikke er I stand til at eksprimere norma- I
I le mængder af ethvert medlem af denne adhæsions- __ I
I proteinfamilie på deres leukocytcelleoverflade I
I 5 (Anderson, D.C. et al·., Fed. Proc. £4:2671-2677 I
I (1985); Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. I
152:668-689 (1985)). Lymfocytter fra disse pati- I
I . enter udviste in vitro defekter svarende til nor- I
male modparter, hvis LFA-l-familie af molekyler I
I 10 var blevet antagoniseret af antistoffer. Disse I
personer var yderligere ude af stand til at opnå I
en normal immunrespons på grund af deres cellers I
I manglende evne til at hæfte til cellesubstrater I
I (Anderson, D.C., et al., Fred. Proc. 44:2671-2677 I
I 15 (1985); Anderson, D.C., et al. , J. Infect. Dis. I
I 152:668-689 (1985)). Disse data viser at immunre- I
I aktioner dæmpes når lymfocytter ikke er i stand I
I til at fæstne på normal måde på grund af de mang- I
I lende funktionelle adhæsionsmolekyler af LFA-1- I
I 20 familien. I
I 25 I 30
Ms*' — '·ΐΜΡ.ι»τί? »wul·· .^gEsp^gr-yj?^.' · - .- -μίτ ,ll*'"--''",*,-‘,|,'F ^ · ||,ι,η"·~* DK 175362 B1 5
Lymfocytternes evne til at bevare et dyrs helbred og levedygtighed kræver således summarisk at lymfocytterne er i stand til at hæfte til andre celler (såsom endotelceller) . Denne hæftning 5 har vist sig at kræve celle-cellekontakter, som involverer specifikke receptormolekyler, der findes på lymfocytternes celleoverflade. Disse receptorer gør det muligt for en lymfocyt at fæstne sig til andre lymfocytter eller til endotelcel-10 ler, og andre ikke-vaskulære celler. Celleover-fladereceptormolekylerne har vist sig at være yderst beslægtede med hinanden. Personer, hvis lymfocytter mangler disse celleoverfladereceptor-molekyler, udviser kroniske og tilbagevendende 15 infektioner og andre kliniske symptomer, herunder defekte antistofreaktioner. 1 30 t.
v 25
I DK 175362 B1 I
i 6 I
I Da lymfocytadhæsionen er involveret i pro- I
I cessen gennem hvilken fremmed væv identificeres I
I og afvises, er en forståelse af denne proces af 1
I væsentlig værdi inden for organtransplantationen, I
I 5 vævstransplantationen, allergi og onkologi. - I
I Den foreliggende opfindelse vedrører inter- I
I cellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) og som ind- I
I ledningsvis anført angår opfindelsen nærmere an- I
I givet et opløseligt funktionelt derivat af ICAM- I
I 10 1. I
I Hensigtsmæssige former for det omhandlede I
I derivat er angivet i krav 2-4, I
I Opfindelsen angår desuden et rekombinant I
I DNA-molekyle, der er ejendommeligt ved, at det er I
I 15 i stand til at eksprimere et opløseligt funktio- I
I nelt derivat af ICAM-1 ifølge opfindelsen. I
I 20 I
I I
I 25 I
I 30 I
-. ......_ -7 . ^.. --. - · .··- ·ΜΒ^·Τ? —j- - --" » . «tffflMgtfPti JtZ . - .. .J 7 ' ~' ~~ . ... W**- . "J F .I^IJ
DK 175362 B1 7
En fremgangsmåde til udvinding af ICAM-1 på i det væsentligt ren form omfatter trinnene: (a) Opløseliggørelse af ICAM-1 fra membranerne fra celler, der eksprimerer ICAM-1, til 5 dannelse af et opløst ICAM-1-præparat, (b) introduktion af det opløste ICAM-1-præparat til en affinitetsmatrix, hvor matrixen indeholder antistof, der er i stand til at binde til ICAM-1, 10 (c) muliggørelse af at ICAM-1 binder til affinitetsmatrixens antistof, (d) fjernelse af enhver forbindelse, der ikke er i stand til at binde til antistoffet, fra matrixen, og 15 (e) udvinding af ICAM-1 på i det væsentlige ren form ved eluering af ICAM-1 fra matrixen.
Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk præparat, der er ejendommeligt ved, at det omfatter a) et opløseligt funktionelt derivat af ICAM- 20 1 ifølge opfindelsen og b) en bærer eller et ex-cipiens.
v 25 30
I DK 175362 B1 I
I 8 I
I Opfindelsen angår ydermere et opløseligt I
I funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge opfindelsen I
I til anvendelse som angivet i henholdsvis krav 7, I
I I
I 5 Opfindelsen angår endvidere antiinflammato- “ I
I riske midler som angivet i krav 10-13. I
I Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk I
I præparat, som er ejendommeligt ved, at det omfat- I
I ter: I
I 10 (a) et ant i inflammatorisk middel valgt I
I blandt: et antistof, der er i stand til at binde I
I til ICAM-1; et fragment af et antistof, hvor I
I fragmentet er i stand til at binde til ICAM-1; I
I ICAM-1, et funktionelt derivat af ICAM-1; og en I
I 15 ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1, og I
I (b) mindst ét immunosupressivt middel valgt I
I blandt: dexamethason, azathioprin og cyclosporin I
I A. I
I 20 I
I H
I 25 I
I 3 0 i 9 DK 175362 B1
Opfindelsen angår ydermere en fremgangsmåde til fremstilling af et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man dyrker en værtsmikroorganis-5 me, der er blevet transformeret med en rekombi-nant vektor, som koder for et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, under betingelser, hvor nævnte derivat eksprimeres og secerneres i„kulturmediet, 10 hvorefter man isolerer derivatet.
På tegningen viser: fig. 1, på diagramform, adhæsionen mellem en normal og en LFA-1 deficient celle.
Fig. 2 viser, på diagramform, normal/normal 15 celle-adhæsion-processen.
Fig. 3 viser kinetikken af cellulær aggregation i fravær (X) eller nærværelse af 50 ng/ml PMA (·) . 1
I DK 175362 B1 I
I 10 I
I Fig. 4 viser coaggregation mellem LFA-1“ og I
I LFA-l+-celler. Carboxyfluoresceindiacetatmærkede EBV- I
I transformerede celler (104), som angivet i figuren bian- I
I dedes med 105 umærkede autologe celler (sorte søjler) I
I 5 eller JY-celler (ufarvede søjler) i nærværelse af PMA. - I
I Efter 1,5 timer optaltes de mærkede celler, i aggrega- I
I ter eller frie, idet den kvantitative prøve fra eksem- I
I pel 2 benyttedes. Procentdelen af mærkede celler i ag- I
I gregater er vist. Et repræsentativt eksperiment ud af I
I 10 to er vist. I
I Fig. 5 viser immunopræcipitationen af ICAM-1 I
I og LFA-1 fra JY-celler. Triton X-100 lysater fra JY- I
I celler (bane l og 2) eller kontrollysispuffer (bane 3 I
I og 4) immunopræcipiteredes med antistof, der er i stand I
I 15 til at binde til ICAM-1 (bane 1 og 3) eller antistof- I
I fer, der er i stand til at binde til LFA-1 (bane 2 og I
I 4). Panel A viser resultater under reducerende betin- I
I gelser; Panel B viser resultater opnået under ikke- I
reducerende betingelser. Molekylvægtstandarder bestem- I
I 20 tes i bane S. I
I Fig. 6 viser kinetikken af IL-1- og y-interfe- I
I ronvirkninger på ICAM-l-ekspression på humane, dermale I
I fibroblaster. Humane, dermale fibroblaster dyrkedes til I
I en tæthed på 8 x 104 celler/0,32 cm2/brønd. IL-1 (10 I
I 25 E/ml, sorte cirkler) eller rekombinant y-interferon I
(10 E/ml, ufarvede firkanter) tilsattes og på det angi- I
I vne tidspunkt afkøledes prøven til 4°C og en indirekte I
I bindingsprøve gennemførtes. Standardafvigelsen oversteg I
I ikke 10%. I
I 30 Fig. 7 viser koncentrationsafhængigheden af I
IL-l- og y-interferonvirkninger på ICAM-1. Humane, der- I
I male fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x ΙΟ4 I
I celler/0,32 cm2/brønd. IL-2 (ufarvede cirkler), rekom- I
I binant human IL-1 (ufarvede firkanter), rekombinant mu- I
35 se IL-1 (sorte firkanter), rekombinant human γ- I
I interferon (sorte cirkler), og rekombinant β-interferon I
(ufarvede trekanter) tilsattes ved den angivne fortyn- I
11 DK 175362 B1 ding og inkuberedes i 4 timer (IL-1) eller 16 timer (β-og y-interferon). De viste resultater er middelværdier fra firedobbelte bestemmelser; standardafvigelsen overskred ikke 10%.
5 Pig. 8 viser nukleotid- og aminosyresekvensen af ICAM-l-cDNA. Det første ATG er ved position 58. Translaterede sekvenser svarende til ICAM-1 tryptiske peptider er understreget. Det hydrofobe putative signalpeptid og transmembransekvenser har en kraftig 10 understregning. N-koblede glycosyleringssteder er indrammet. Polyadenyleringssignalet AATAAA ved position 2976 er angivet ved en streg ovenover signalet. Den viste sekvens er for HL-60 cDNA-klonen. Endotelcelle-cDNA'en sekvensbestemtes over det meste af dens længde 15 og viste kun mindre forskelle.
Fig. 9 viser de ICAM-1 homologe domæner og relationen til immunoglobulin-supergenfamilien. (A) opstilling af 5 homologe domæner (Dl-5). To eller flere identiske rester, som lå på linie, er indrammet. Rester 20 bevaret to eller flere gange i NCAM-domæner samt rester bevaret i domæner af sættene C2 og Cl opstilledes sammen med de ICMA-1 interne gentagelsesenheder. Lokaliseringen af de forudsagte β-strenge i ICAM-i-domænet er markeret med kraftige streger og små bogstaver ovenover 25 opstillingerne og den kendte lokalisering af β-strenge i immunoglobulin C domæner er markeret med kraftig streger og store bogstaver nedenunder opstillingen. Positionen af den putative disulfidbro indenfor ICAM-1-domæner er angivet med S-S. (B-D) optilling af protein-30 domæner homologe til ICAM-1 domæner; proteiner opstilledes til at begynde med ved søgning i NBRF-databaser under anvendelse af FASTP-programmet. Proteinsekvenserne er MAG, NACM, T-cellereceptor-a-underenhed-V-domæne, IgMp-kæde og a-l-B-glycoprotein.
35 Fig. 10 er en skematisk sammenligning mellem de sekundære strukturer af ICAM-1 og MAG.
I DK 175362 B1 I
I 12 I
I Fig. 11 viser LFA-l-positive EBV-transformerede I
B-lymfoblastoide cellers binding til ICAM-l i plane I
I membraner. I
Fig. 12 viser LFA-l-positive T-lymfoblaster og I
I 5 T-lymfomacellers binding til ICAM-l i plast-bundne I
I vesikler. I
I Fig. 13 viser inhiberingen af binding af JY B- - I
I lymfoblastoidcellebinding til ICAM-l i plast-bundne I
I vesikler ved forbehandling af celler eller vesikler med I
I 10 monoklonale antistoffer. I
I Fig. 14 viser virkningen af temperatur på bin- I
I ding af T-lymfoblaster til ICAM-l i plast-bundne vesik- I
I ler. I
I Fig. 15 viser behovet for divalente kationer til I
I 15 binding af T-lymfoblaster til ICAM-l i plast-bundne I
I vesikler. I
I Fig. 16 viser anti-adhæsion-antistoffers virk- I
I ning på perifere mononukleære blodcellers evne til I
I proliferation som svar på genkendelsen af det T-celle- I
I 20 associerede antigen OKT3. "OKT3" angiver tilsætningen I
I af antigen. I
Fig. 17 viser anti-adhæsion-antistoffers virk- I
I ning på perifere mononukleære blodcellers evne til pro- I
liferation som svar på genkendelsen af det ikke- I
I 25 specifikke T-cellemitogen, concanavalin A. "CONA" I
I angiver tilsætningen af concanavalin A. I
I Fig. 18 viser anti-adhæsion-antistoffers virk- I
I ning på perifere mononukleære blodcellers evne til I
I proliferation som svar på genkendelsen af "keyhole I
I 30 limpet-,,hæmocyaninantigenet. Tilsætningen af "keyhole I
I limpet-"hæmocyanin til cellerne er angivet ved "KLH". I
I Fig. 19 viser anti-adhæsion-antistoffers virk- I
I ning på perifere mononukleære blodcellers evne til I
I proliferation som svar på genkendelsen af tetanustoxo- I
I 35 idantigenet. Tilsætningen af tetanustoxoidantigen I
I til cellerne er angivet ved "AGN". I
13 DK 175362 B1
Fig. 20 viser bindingen af monoklonale antistoffer RR1/1, R6.5, LB2 and CL203 til ICAM-1 deletionsmu-tanter.
Fig. 21 viser bindingen af ICAM-1 deletionsmu-5 tanter til LFA-1.
Fig. 22 viser epitoperne genkendt af anti-ICAM-1 monoklonale antistoffer RR1/1, R6.5, LB2 og CL203.
Fig. 23 viser bindingsevnen af ICAM-1 domæne 2 mutanter til LFA-1.
10 Fig. 24 viser bindingsevnen af ICAM-1 domæne 3 mutanter til LFA-1.
Fig. 25 viser bindingsevnen af ICAM-1 domæne 1 mutanter til LFA-1.
Fig. 26 viser opstillingen af ICAM amino-termi-15 nåle domæner.
Et aspekt ifølge opfindelsen angår opdagelsen af en naturlig bindingsligand til LFA-1. Molekyler, såsom de i LFA-l-familien, der er involveret i den cellulære adhæsionsproces, betegnes som "adhæsionsmolekyler".
20 Den omhandlede naturlige bindingsligand betegnes ”Intercellulær Adhæsionsmolekyle-1" eller "ICAM-l”.
ICAM-1 er et 76-97 kd glycoprotein. ICAM-1 er ikke en heterodimer. Opfindelsen angår ICAM-1 og dets "funktionelle derivater". Et "funktionelt derivat" af 25 ICAM-1 er en forbindelse, som har en biologisk aktivitet (enten funktionelt eller strukturelt) som i det væsentlige er lig en biologisk aktivitet af ICAM-1. Udtrykket "funktionelle derivater" skal omfatte "fragmenter", "varianter”, "analoger" eller "kemiske deriva-30 ter" af et molekyle. Et "fragment" af et molekyle, såsom ICAM-1 skal betegne enhver polypeptiddel af molekylet. Fragmenter af ICAM-1, som har ICAM-1 virkning, og som er opløselige (dvs. ikke-membranbundne), er særlig foretrukne. En "variant" af et molekyle, såsom ICAM-1 35 skal betegne et molekyle, der i det væsentlige har samme struktur og funktion som enten hele molekylet eller
I DK 175362 B1 I
I 14 I
I et fragment deraf. Et molekyle siges at være "i det væ- I
I sentlige lig med” et andet molekyle, hvis begge moleky- I
I ler har i det væsentlige ens strukturer, eller hvis I
I begge molekyler har omtrent samme biologiske aktivitet. I
I 5 Forudsat at to molekyler har omtrent samme aktivitet, I
I betragtes de således som varianter, sådan som udtrykket I
I benyttes heri, selv hvis strukturen af et af molekyler- I
I ne ikke findes i det andet, eller hvis aminosyrerest- I
I sekvenserne ikke er identiske. En "analog" af et mole- I
I 10 kyle, såsom ICAM-1, skal betegne et molekyle, der i det I
I væsentlige har samme funktion som enten hele molekylet I
I eller som et fragment deraf. Sådan som det benyttes I
I heri, siges et molekyle at være et "kemisk derivat" af I
I et andet molekyle, når det indeholder yderligere kemi- I
I 15 ske dele, som normalt ikke er en del af molekylet. Så- I
I danne dele kan forbedre molekylets opløselighed, ab- I
I sorption og biologisk halveringstid, osv. Delene kan I
I alternativt mindske molekylets toxicitet, eliminere el- I
I ler dæmpe enhver uønsket bivirkning hos molekylet, osv. I
I 20 Dele, der i stand til at mediere sådanne virkninger er I
I angivet i Reminton1 s Pharmaceutical Sciences (1980). I
I "Toxin-afledte"-molekyler udgør en speciel klas- I
I se af "kemiske derivater". Et "toxin-afledt" molekyle I
I er et molekyle (såsom ICAM-1 eller et antistof), som I
I 25 indeholder en toxindel. Bindingen af et sådant molekyle I
I til en celle bringer toxindelen i umiddelbar nærhed af I
I cellen og fremmer derved celledød. Enhver egnet toxin- I
I del kan anvendes; det foretrækkes imidlertid at anvende I
I toxiner, såsom ricintoxinet, diphtheriatoxinet, radio- I
I 30 isotope toxiner, membrankanal-dannende toxiner, osv. I
I Fremgangsmåder til kobling af sådanne dele til et mole- I
I kyle er velkendte indenfor teknikken. I
I Et antigent molekyle, såsom ICAM-1 eller medlem- I
I mer af LFA-l-familien af molekyler eksprimeres natur- I
I 35 ligvis på overfladen af lymfocytter. Indføringen af så- I
I danne celler i egnede dyr, såsom ved intraperitoneal I
15 DK 175362 B1 injektion, osv., vil således resultere i produktionen af antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-l eller medlemmer af LFA-l-familien af molekyler. Serummet fra et sådant dyr kan, om ønsket, fjernes og benyt-5 tes som en kilde for polyklonale antistoffer, der er i stand til at binde til disse molekyler. Det foretrækkes imidlertid at fjernes splenocytter fra sådanne dyr, at sammensmelte sådanne miltceller med en myelomacelleli-nie og lade sådanne fusionsceller danne en hybridoma-10 celle som secernerer monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-l eller medlemmer af LFA-1 familien af molekyler.
Hybridomacellerne, opnået på samme måde som beskrevet ovenfor, kan underkastes screening ved en række 15 fremgangsmåder til identificering af ønskede hybrido-maceller, som secernerer antistof, der er i stand til at binde enten til ICAM-l eller til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler. Ved en foretrukket screeningsprøve identificeres sådanne molekyler ved deres evne 20 til at inhibere aggregationen af Epstein-Barr virustransformerede celler. Antistoffer, der er i stand til at inhibere sådanne aggregationer, underkastes dernæst yderligere screening for at bestemme hvorvidt de in-hiberer sådan aggregation ved binding til ICAM-l, eller 25 ved at binde til et medlem af LFA-l-familien af molekyler. Ethver middel, der er i stand til at skelne ICAM-l fra LFA-l-familien af molekyler kan anvendes i en sådan screening. Antigenet bundet af antistoffet kan således f.eks. analyseres ved immunfældning og 30 polyacrylamidgelelektroforese. Hvis det bundne antigen er et medlem af LFA-l-familien af molekyler vil det immunofældede antigen således vise sig at være en dimer, hvorimod en enkelt molekylvægtdel vil være blevet immunofældet, hvis det bundne antigen er ICAM-l. Det er 35 desuden muligt at skelne mellem de antistoffer, som binder til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler, og
I DK 175362 B1 I
I 16 I
I dem, som binder til ICAM-1, ved screening for antistof- I
I fets evne til at binde til celler, såsom granulocytter, I
I som eksprimerer LPA-1, men ikke ICAM-1. Evnen af et an- I
I tistof {som vides at inhibere cellulær aggregation) til I
I 5 at binde til granulocytter indikerer, at antistoffet er I
I i stand til at binde til LFA-1. Fraværet af sådan bin- I
I ding viser, at et antistof er i stand til at genkende · I
I ICAM-1. Et antistofs evne til at binde til en celle, I
I såsom en granulocyt, kan påvises ved metoder, der I
I 10 sædvanligvis anvendes af en fagmand. Sådanne metoder I
I omfatter immunoassays, cellulær agglutination, filter- I
I bindingsstudier, antistoffældning, osv. I
I De omhandlede anti-aggregationsantistoffer kan I
I alternativt identificeres ved måling af deres evne til I
I 15 differentielt at binde til celler, som eksprimerer I
I ICAM-1 (såsom aktiverede endotelceller), og deres I
I manglende evne til at binde til celler, som ikke ek- I
I sprimerer ICAM-1. Som det vil være klart for en fag- I
I mand, kan ovennævnte prøver modificeres, eller udføres I
I 20 i en anden rækkefølge til opnåelse af en række poten- I
I tielle screeningsprøver, som hver er i stand til at I
I identificere og skelne mellem antistoffer, der er i I
I stand til at binde til ICMA-1 kontra medlemmer af I
I LFA-1-familien af molekyler. I
I 25 De omhandlede anti-inflammatoriske midler kan I
I opnås ved naturlige processer {såsom ved at få et dyr, I
I en plante, svamp, bakterie, osv. til at producere en I
I ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1, eller ved at I
I få et dyr til at producere polyklonale antistoffer, der I
I 30 er i stand til at binde til ICAM-1); ved syntetiske I
I metoder (såsom under anvendelse af Merrifield's metode I
I til syntetisering af polypeptider til syntetisering af I
I ICAM-1, funktionelle derivater af ICAM-1, eller prot- I
I einantagonister af ICAM-l (enten immunoglobulin eller I
I 35 ikke-immunoglobulin)); ved hybridomateknologi (såsom I
I fremstilling af monoklonale antistoffer, der er i stand I
17 DK 175362 B1 til at binde til ICAM-1); eller ved rekombinant-teknologi (såsom fremstilling af de omhandlede anti-inflammatoriske midler i forskellige værter (dvs. gær, bakterier, svampe, dyrkede pattedyrsceller, osv.), el-5 ler fra rekombinante plasmider eller virusvektorer).
Valget af den fremgangsmåde, der skal benyttes vil afhænge af faktorer, såsom anvendelighed, ønsket udbytte, osv. Det er ikke nødvendigt kun at benytte én af ovennævnte fremgangsmåder, metoder eller teknologier til 10 fremstilling af et særligt antiinflammatorisk middel; de ovennævnte metoder, fremgangsmåder og teknologier kan kombineres for at opnå et særligt antiinflammatorisk middel.
15 A. Identifikation af LFA-l-bindinqspartneren (ICAM-1).
1. Prøver for LFA-l-afhængig aggregation.
Mange Epstein-Barr virustransformerede celler 20 udviser aggregation. Denne aggregation kan øges i nærværelse af phorbolestere. En sådan homotype aggregation (dvs. aggregation, der kun involverer en celletype) har vist sig at blive blokeret af anti-LFA-1-antistoffer (Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163; 25 1132-1149 (1986)), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisningen dertil). Graden af LFA-l-afhængig binding kan således bestemmes ved at bestemme graden af spontan eller phorbolesterafhængig aggregatdannelse.
Et middel som interfererer med LFA-l-afhængig 30 aggregation kan identificeres ved anvendelsen af en prøve, der er i stand til at bestemme hvorvidt et middel interfererer med den spontane eller den phorbole-ster-afhængige aggregation af Epstein-Barr virustransformerede celler. De fleste Epstein-Barr virus-35 transformerede celler kan anvendes i en sådan prøve så længe cellerne er i stand til at eksprimere LFA-l-
I DK 175362 B1 I
I 18 I
I receptormolekylet. Sådanne celler kan fremstilles i I
I overensstemmelse med teknikken angivet af Springer, I
I T.A. et al., J♦ Exper♦ Med. 160:1901-1918 (1984), I
I hvilken reference inkorporeres heri i kraft af hen- I
I 5 visningen dertil. Skønt enhver sådan celle kan anvendes - I
i den LPA-1-afhængige bindingsprøve ifølge opfindelsen, I
I foretrækkes det at benytte celler fra JY cellelinien I
(Terhost, C.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA I
I 7_3:910 (1976)). Cellerne kan dyrkes i erhvert egnet I
I 10 dyrkningsmedium; det foretrækkes imidlertid at dyrke I
I cellerne i RMPI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% I
I fetalt kalveserum og 50 yg/ml gentamycin (Gibco Labora- I
I tories, NY). Cellerne bør dyrkes under betingelser, der I
I er egnet for pattedyrcelleproliferation (dvs. ved en I
I 15 temperatur på sædvanligvis 37°C, i en atmosfære med I
I 5% C02, ved en relativ fugtighed på 95%, osv.). I
I 2. LFA-l binding til ICAM-1.
I 20 I Man har fundet mennesker, hvis lymfocytter mang- ler familien af LFA-l-receptormolekyler (Anderson, D.C.
I et al. , Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C.
I et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Sådanne I 25 mennesker siges at lide af leukocytadhæsionsmangel I (LAD). EBV-transformerede celler fra sådanne mennesker H aggregerer hverken spontant eller i nærværelse af phor- bolestere i ovennævnte aggregationsprøve. Når sådanne I celler blandes med LFA-l-eksprimerende celler obser- I 30 veredes aggregation (Rothlein, R. et al., J. Exper.
I Med. 163:1132-1149 (1986)) (fig. 1). Det er af stor I vigtighed, at disse aggregater ikke dannes, hvis disse celler inkuberedes i nærværelse af anti-LFA-1 anti- stoffer. Skønt aggregationen krævede LFA-l, indikerede I 35 LFA-l-deficiente cellers evne til at danne aggregater med LFA-l-holdige celler således at LFA-l bindings- | 19 DK 175362 B1 partneren ikke var LFA-1, men snarere et hidtil ukendt celleadhæsionsmolekyle. Fig. l viser den cellulære adhæsionsmekanisme.
5 B. Intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1).
Det omhandlede intercellulære adhæsionsmolekyle ICAM-1 blev først identificeret og delvis karakterise-10 ret i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Rothlein, R. et al. (J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)), hvilken reference inkorporeres heri i kraft af henvisningen dertil. Til påvisning af ICAM-1-molekylet fremstilledes monoklonale antistoffer ud fra miltceller fra 15 mus, immuniseret med celler fra mennesker med genetisk defekt i LFA-l-ekspression. De opnåede antistoffer underkastedes screening for deres evne til at inhibere aggregationen af LFA-1-eksprimerende celler (fig. 2). Nærmere angivet immuniseredes mus med EBV-transformere-20 de B-celler fra LAD-patienter, som ikke eksprimerer LFA-l-antigenet. Milcellerne fra disse dyr fjernedes dernæst, sammensmeltedes med myelomaceller og fik lov til at blive monoklonale antistof-producerende hybrido-maceller. EBV-transformerede B-celler fra normale men-25 nesker, som eksprimerer LFA-1, inkuberedes dernæst i nærværelse af det monoklonale antistof fra hybridoma-cellen til identificering af ethvert monoklonalt antistof, som var i stand til at inhibere den phorbolester-medierede, LFA-l-afhængige, spontane aggregation af de 30 EBV-transformerede B-celler. Eftersom hybridomacellerne stammede fra celler, som aldrig havde stødt på LFA-l-antigenet, produceredes der intet monoklonalt antistof mod LFA-1. Ethvert antistof, som viste sig at inhibere aggregation, må således være i stand til at binde til 35 et antigen som, skønt det ikke er LFA-1, deltager i LFA-l-adhæsionsprocessen. Skønt enhver fremgangsmåde
I DK 175362 B1 I
I 20 I
I til opnåelse af sådanne monoklonale antistoffer kan be- I
I nyttes, foretrækkes det at opnå ICAM-1-bindende mono- I
I klonale antistoffer ved immunisering af BALB/C-mus, I
I idet de metoder og planer, der er beskrevet af I
I 5 Rothlein, R. et al., (J. Immunol. 137: 1270-1274 I
I (1986)), benyttes med Epstein-Barr virustransformerede, I
I perifere mononukleære blodceller fra mennesker med en - I
I LFA-l-defekt. sådanne celler er angivet af Springer, I
I T.A., et al., (J. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984)). I
I 10 ved en foretrukken fremgangsmåde til frembrin- I
I gelse og påvisning af antistoffer, der er i stand til I
I at binde til ICAM-1, immuniseres mus med enten EBV- I
I transformerede B-celler, som eksprimerer både ICAM-1 I
I og LFA-1, eller mere foretrukket med TNF-aktiverede I
I 15 endotelceller, der eksprimerer ICAM-1, men ikke LFA-1. I
I Ved den mest foretrukne fremgangsmåde til frembringelse I
I af hybridomaceller, som producerer anti-ICAM-l-anti- I
I stoffer, immuniseredes en Balb/C-mus efter hinanden med I
I JY-celler og med differentierede U937-celler (ATCC CRL- I
I 20 1593). Miltcellerne fra sådanne dyr fjernedes, sammen- I
I smeltedes med myelomaceller og fik lov til at udvikle I
I sig til antistofproducerende hybridomaceller. Antistof- I
I ferne underkastes screening for deres evne til at inhi- I
I bere den LFA-l-afhængige, phorbolester-inducerede ag- I
I 25 gregation af en EBV-transformeret celleline, såsom JY- I
I celler, der eksprimerer både LFA-1-receptoren og ICAM- I
I 1. Som vist af Rothlein, R., et al., (J. Immunol. 137: I
I 1270-1274 (1987)), testes antistoffer, der er i stand I
I til at inhibere en sådan aggregation, dernæst for deres I
I 30 evne til at inhibere den phorbolesterinducerede aggre- I
I gation af en cellelinie, såsom SKW3 (Dustin, M., et I
I al., J. Exper. Med. 165:672-692 (1987)) hvis evne til I
I spontan aggregation i nærværelse af en phorbolester I
I inhiberes af antistof, der er i stand til at binde I
I 35 LFA-1, men ikke inhiberes af anti-ICAM-l-antistoffer. I
I Antistoffer, der er i stand til at inhibere den phorbo- I
21 DK 175362 B1 lester-inducerede aggregation af celler, såsom JY-celler, men som ikke er i stand til inhibere den phor-bolesterinducerede aggregation af celler, såsom SKW3-celler er sandsynligvis anti-ICAM-l-antistoffer. Alter-5 nativt kan antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1 identificeres ved screening for antistoffer, som er i stand til at inhibere den LFA-1-af hasngige ag-, gregation af LFA-ekspressionsceller (såsom JY-celler), men som ikke er i stand til at binde til celler, der 10 eksprimerer LFA-1, men kun lidt eller intet ICAM-1 (såsom normale granulocytter), eller som er i stand til at binde til celler, som eksprimerer ICAM-1, men ikke LFA-1 (såsom TNF-aktiverede endotelceller). Et andet alternativ er immunofældning fra celler, der eksprime-15 rer ICAM-l, LFA-1, eller begge, under anvendelse af antistoffer, der inhiberer den LFA-l-afhængige aggregation af celler, såsom JY-celler, og bestemmelse af visse molekylegenskaber af molekylet, der udfældede med antistoffet, gennem SDS-PAGE eller en ækvivalent 20 metode. Hvis egenskaberne er de samme som for ICAM-1, kan det antages, at antistoffet er et anti-ICAM-l-anti-stof.
Idet man benytter monoklonale antistoffer, der er fremstillet analogt med ovennævnte, rensedés ICAM-25 1-celleoverflademolekylet, og dets egenskaber bestemtes. ICAM-1 rensedes fra humane celler eller væv, idet monoklonalt-antistof-affinitetschromatogra-fi benyttedes, ved en sådan fremgangsmåde kobles et monoklonalt antistof, der er reaktivt med ICAM-l til en 30 inert kolonnematrix. Enhver fremgangsmåde til opnåelse af en sådan kobling kan benyttes; det foretrækkes imidlertid at benyttet fremgangsmåden beskrevet af Oettgen, H.C. et al., J. Biol. Chem. 259:12034 (1984)). Når et cellelysat passerer gennem matrixen adsorberes de til-35 stedeværende ICAM-1-molekyler og tilbageholdes af matrixen. Ved at ændre pH-værdien eller ionkoncentratio- I DK 175362 B1 I 22
I nen i kolonnen kan de bundne ICAM-1-molekyler elueres I
I fra kolonnen. Skønt enhver egnet matrix kan benyttes, I
I foretrækkes det at anvende Sepharose (Pharmacia) som I
matrixmaterialet. Fremstillingen af kolonnematricer, og I
I 5 deres anvendelse indenfor proteinrensning er velkendt I
indenfor teknikken. I
I På en måde som forstås af en fagmand, kan oven- I
nævnte prøver benyttes til identificering af forbindel- I ser, der er i stand til at dæmpe eller irihibere graden 10 eller udstrækningen af cellulær adhæsion.
I ICAM-1 er et celleoverfladeglycoprotein ekspri- I meret på ikke-hematopoietiske celler, såsom vaskulære I endotelceller, thymusepitelcéller, visse andre epitel- I celler, og fibroblaster, og på hæmatopoietiske celler, I 15 såsom vævsmakrofager, mitogen-stimulerede T-lymfocyt- I blaster, og germinale, centrerede B-celler og dendrit- I celler i tonsiler, lymfeknuder og "Peyer's-patches".
I ICAM-1 eksprimeres stærkt på vaskulære endotelceller I i T-celleområder i lymfeknuder og tonsiler, der udviser I 20 reaktiv hyperplasia. ICAM-l eksprimeres i små mængder I på perifere blodlymfocytter. Phorbolesterstimuleret I differentiering af visse myelomonocytiske cellelinier øger ICAM-l-ekspressionen kraftigt. ICAM-1 eksprimeres I således fortrinsvis på steder med inflammation og eks- 25 primeres generelt ikke af passive celler. ICAM-l-eks- pression på dermale fibroblaster øges 3-5 gange med en- I ten interleukin 1 eller y-interferon i koncentrationer I på 10 E/ml i løbet af henholdsvis 4 eller 10 timer.
I Induktionen er afhængig af protein- og mRNA-syntese og I 30 er reversibel.
ICAM-l udviser molekylvægtuensartethed i forskellige celletyper med en molekylvægt på 97 kd i fibroblaster, 114 kd i den myelomonocytiske celleline U937 og 90 kd i B-lymfoblastoidcellen JY. ICAM-I-bio-35 syntese har vist sig at involvere en ca. 7 3 kd inter-cellulær precursor. Den ikke-N-glycosylerede form, der 23 DK 175362 B1 stammer fra tunicamycinbehandling (som inhiberer glyco-sylering) har en molekylvægt på 55 kd.
ICAM-1 isoleret fra phorbolesterstimulerede U937-celler eller fra fibroblastceller giver et til-5 svarende hovedprodukt med en molekylvægt på 60 kd efter kemisk deglycosylering. ICAM-1 monoklonale antistoffer interfererer med adhæsionen af phytohæmagglu-tininblaster til LFA-l-deficiente celleliner. Forbehandling af fibroblaster, men ikke lymfocytter, med 10 monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde ICAM-1, inhiberer lymfocyt-fibroblastadhæsion. Forbehandling af lymfocytter, men ikke fibroblaster, med antistoffer mod LFA-1 har også vist sig at inhibere lymfocyt-fibroblastadhæsion.
15 ICAM-1 er således CD 18 kompleksets bindings ligand på leukocytter. Det er inducerbart på fibroblaster og endotelceller in vitro ved inflammatoriske mediatorer, såsom IL-1, γ-interferon og tumornecrosisfaktor indenfor en tidsramme, der er i overensstemmelse 20 med infiltrationen af lymfocytter i inflammatoriske læsioner in vivo (Dustin, M.L., et al., J. Immunol 137 :245-254, (1986); Prober, J.S., et. al♦, J. Immunol 137:1893-1896, (1986)). ICAM-1 eksprimeres yderligere på ikke-hæmatopoietiske celler, såsom vaskulære endotel-25 celler, thymusepitelceller, andre epitelceller, og fibroblaster og på hæmatopoietiske celler, såsom vævsmakrofager, mitogen-stimulerede T-lymfocytblaster, og germinalcenter-B-celler og dendritceller i tonsiler, lymfeknuder og "Peyer's patches" (Dustin, M.L. et.
30 al., Immunol 137:245-254, (1986)). ICAM-1 eksprimeres på keratinocytter i godartede inflammationsskader såsom allergisk eksem, lichen ruber, exanthema, urticaria og sygdomme med blæredannelse. Allergiske hudreaktioner, provokeret ved påførsel af et hapten på huden 35 overfor hvilket patienten er allergisk, viste også en kraftig ICAM-1-ekspression på keratinocytter. På den
I DK 175362 B1 I
I 24 I
I anden side viste toxiske lapper på huden ikke ICAM-1- I
I ekspression på keratinocytterne. ICAM-1 findes på kera- I
I tinocytter fra biopsier af hudskader fra forskellige I
I dermatologiske sygdomme og ICAM-l-ekspression induceres I
I 5 på skader fra allergiske lappetests, medens keratino- I
I cytter fra toxiske lappetestskader ikke eksprimerede I
I ICAM-1. I
I ICAM-1 er derfor et cellesubstrat til hvilket I
I lymfocytter kan fæstnes, således at lymfocytterne kan I
I 10 migrere til steder med en inflammation og/eller gennem- I
I føre forskellige effektorfunktioner som bidrager I
I til denne inflammation. Sådanne funktioner omfatter I
I produktionen af antistof, lysis af virusinficerede I
I målceller, osv. Udtrykket "inflammation", sådan som I
I 15 det benyttes heri, skal kun omfatte reaktioner fra det I
I specifikke og ikke-specifikke forsvarssystem. Sådan som I
I det benyttes heri skal udtrykket "specifikt forsvars- I
I system" referere til den bestanddel i immunsysternet, I
I som reagerer i nærværelse af specifikke antigener. In- I
I 20 flammation siges at opstå som en reaktion fra det spe- I
I cifikke forsvarssystem, hvis inflammationen er forårsa- I
I get af, medieret af, eller knyttet til en reaktion fra I
det specifikke forsvarssystem. Eksempler på inflamma- I
I tioner, som opstår fra en reaktion fra det specifikke I
I 25 forsvarssystem omfatter reaktionen overfor antigener, I
I såsom rubellavirus, autoimmunsygdomme, forsinket type I
I af hypersensitivitetreaktion medieret af T-celler (som I
I det f.eks. ses hos mennesker, hvis test er "positiv" i I
I Mantaux-testen), osv. I
I 30 En "ikke-specifik forsvarssystemsreaktion" er en I
I reaktion medieret af leukocytter uden immunologisk I
I hukommelsesevne. Sådanne celler indbefatter granulocyt- I
I ter og makrofager. Som anvendt heri siges inflammation I
I at opstå som en reaktion fra det ikke-specifikke for- I
I 35 svarssystem, hvis inflammationen er forårsaget af, me- I
I dieret af eller knyttet til en reaktion fra det ikke- I
—- — · -- 1 — -· - - -g!--r^a—wit^.·; · .-- - - ?» . ΡΓ· ' v <· . ··· !. "II — ^ · ^' —g.· r* r^-m DK 175362 B1 25 specifikke forsvarssystem. Eksempler på inflammation, som hidrører i det mindste delvis fra en reaktion fra det ikke-specifikke forsvarssystem, indbefatter inflammation forbundet med tilstande såsom: "adult 5 respiratory distress syndrom (ARDS) eller multiple organlæsionssyndromer som sekundære syndromer til septicaemia eller trauma, reperfusionslæsion af myocardia-væv eller andre væv, akut glomerulonephritis, reaktiv arthritis, dermatoser med akutte imflammatoriske kompo-10 nenter; akut purulent meningitis eller andre imflammat-oriske lidelser i centralnervesystemet; termisk beskadigelse, hæmodialyse; leukapheresis, ulcerativ colitis,
Crohn's sygdom; nekrotiserende enterocolitis; granulo-cyt-transfusionassocierede syndromer, og cytokin-indu-15 ceret toksicitet.
I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan ICAM-1 funktionelle derivater, og specielt sådanne derivater som omfatter fragmenter eller mutantvarianter af ICAM-1, der har domæner 1, 2 og 3, anven-20 des til behandling eller terapi af sådanne reaktioner fra det ikke-specifikke forsvarssystem. Mere foretrukket til sådan behandling eller terapi er ICAM-1 fragmenter eller mutant-varianter, der indeholder domæne 2 fra ICAM-1. Mest foretrukket til sådan behandling eller 25 terapi er ICAM-1 fragmenter eller mutant-varianter, der indeholder domæne 1 fra ICAM-1.
Desuden påtænker man ifølge den foreliggende opfindelse at anvende ICAM-1 og dets funktionelle derivater til behandling af astma.
30 C. Kloning af ICAM-l-qenet.
Enhver af en række forskellige metoder kan benyttes til kloning af lCAM-l-genet. En sådan frem-35 gangsmåde medfører analyse af et pendulvektorbibliotek af cDNA-indføj eiser (stammende fra en ICAM-1-eksprime- ___ i
I DK 175362 B1 I
I 26 I
I rende celle) for tilstedeværelsen af en indføjelse, som I
I indeholder ICAH-l-genet. En sådan analyse kan gennemfø- I
I res ved transfektion af celler med vektoren og dernæst I
prøvning for ICAM-l-ekspression. Den foretrukne frem- I
I 5 gangsmåde til kloning af dette gen medfører bestemmelse I
af ICAM-l-molekylets aminosyresekvens. Til gennemførsel I
I af denne opgave skal lCAM-1-protein renses og analyse- I
res af automatiserede sekvenatorer. Molekylet kan al- I
ternativt underkastes fragmentering med bromcyan eller I
I 10 med proteaser, såsom papain, chymotrypsin eller trypsin I
I (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257:9751-9758 (1982); I
I Liu, C. et al., Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215 I
I (1983)). I
I Skønt det er muligt at bestemme ICAM-I’s hele I
15 aminosyresekvens, foretrækkes det at bestemme sekvensen I
I af peptidfragmenter af molekylet. Hvis peptiderne er I
mere end 10 aminosyrer lange, er sekvensinformationen I
I sædvanligvis tilstrækkelig til at man kan klone et gen, I
såsom genet for ICAM-l. I
I 20 Sekvensen af aminosyrerester i et peptid be- I
tegnes heri enten gennem anvendelsen af deres sædvan- I
I ligt anvendte 3-bogstavsbetegnelser eller ved deres I
I enkelt-bogstavsbetegnelser. En liste af disse 3-bog- I
I stavs- og l-bogstavsbetegnelser kan findes i lære- I
I 25 bøger såsom Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publis- I
I hers, New York, NY (1970). Når en sådan sekvens opføres I
I lodret, er det meningen at amino-terminal-resten skal I
I stå øverst på listen og carboxy-terminal-resten af I
I peptidet skal stå nederst på listen. Når sekvensen op- I
I 30 føres vandret er „det på samme måde meningen at amino- I
I terminal-resten skal stå til venstre, hvorimod I
I carboxy-terminal-resten skal stå til højre. Aminosyre- I
I resterne i et peptid kan adskilles med bindestreger. I
I Sådanne bindestreger tilsigter alene at lette præsen- I
I 35 tationen af en sekvens. Som et rent illustrativt eksem- I
I pel indikerer aminosyresekvensen betegnet: I
. .......- · »* . . HPUT^^ — -_1__-d^3 DK 175362 B1 27 -Gly-Ala-Ser-Phe- at en Ala-rest er bundet til Gly's carboxygruppe, og at 5 en Ser-rest er bundet til Ala-restens carboxygruppe og til en Phe-rests aminogruppe. Betegnelsen indikerer yderligere at aminosyresekvensen indeholder tetrapepti-det Gly-Ala-Ser-Phe. Det er ikke hensigten at betegnelsen skal begrænse amiosyresekvensen til dette ene te-10 trapeptid, men det er hensigten at inkludere (1) tetrapeptidet indeholdende en eller flere aminosyreréster, bundet til· enten dets amino- eller carboxyende, (2) tetrapeptidet indeholdende en eller flere aminosyre-rester, bundet til både dets amino- og carboxyende, 15 (3) tetrapeptidet uden nogen yderligere aminosyre-rester.
Når først et eller flere passende egnede peptidfragmenter er blevet sekvenseret, undersøges DNA-se-kvenser, der er i stand til at kode for dem. Fordi den 20 genetiske kode er degenereret, kan mere end et kodon benyttes til at kode for en bestemt aminosyre (Watson, J.D., I: Molecular Biology of the Gene, 3. udg., W.A.
Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), s. 356-357).
Peptidfragmenterne analyseres til identificering af 25 sekvenser af aminosyrer, som kan kodes af oligonukleo-tider med den laveste grad af degenerering. Dette gennemføres fortrinsvis ved identificering af sekvenser, som indeholder aminosyrer, der kun kodes af et enkelt kodon. Skønt sådanne aminosyresekvenser en gang imellem 30 kan kodes af kun et enkelt oligonucleotid kan aminosyresekvensen ofte kodes af et vilkårlig nucleotid fra et sæt af lignende oligonucleotider. Medens alle medlemmer af sættet indeholder oligonucleotider, som er i stand til at kode for peptidfragmentet, og således 35 potentielt indeholder den samme nucleotidsekvens som genet, der koder for peptidfragmentet, er det væsent-
I DK 175362 B1 I
I 28 I
I ligt at kun et medlem af sættet indholder en nucleotid- I
I sekvens, der er identisk med dette gens nukleotid- I
sekvens. Fordi dette medlem findes i sættet og er i I
I stand til at hybridisere til DNA, selv i nærværelse af I
I 5 andre medlemmer i sættet, er det muligt at benytte I
det ufraktionerede sæt af oligonucleotider på samme må- I
I de som man ville anvende en enkelt oligonucleotid til I
I kloning af genet, som koder for peptidet. I
I På en måde nøjagtigt analog med ovennævnte kan I
I 10 man anvende et oligonucleotid (eller sæt af oligonu- I
I cleotider), som indeholder en nucleotidsekvens, som er I
I komplementær til oligonucleotidsekvensen eller sættet I
I af sekvenser, der er i stand til at kode for peptid- I
I fragmentet. I
I 15 Et egnet oligonucleotid eller sæt af oligo- I
I nucleotider, som er i stand til at kode for et frag- I
I ment af ICAM-l-genet (eller som er komplementært til I
et sådant oligonucleotid, eller sæt af oligonucleoti- I
I der) identificeres (idet ovennævnte fremgangsmåde be- I
I 20 nyttes), syntetiseres og hybridiseres, ved metoder der I
I er velkendte indenfor teknikken, overfor et DNA eller, I
I mere foretrukket, et cDNA-præparat, som stammer fra hu- I
I mane celler, der er i stand til at eksprimere ICAM-1- I
gensekvenser. Metoder til nucleinsyrehybridisering er I
25 angivet af Maniatis, T. et al., I : Molecular Cloning, I
I a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982), og I
I af Haymes, B.D. et al., I: Nucleic Acid Hybrization, a I
I Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), I
I hvilke referencer inkorporeres heri ved henvisning. I
I 30 Den benyttede DNA eller cDNA kilde vil fortrinsvis være I
I blevet beriget for ICAM-l-sekvenser. En sådan be- I
I rigelse kan lettest opnås ud fra c DNA opnået ved I
I ekstraktion af RNA fra celler dyrket under betingelser I
I som inducerer ICAM-l-syntese (såsom U937 dyrket i nær- I
I 35 værelse af phorbolestere, osv.). I
I Teknikker såsom, eller svarende til dem, der er I
I beskrevet ovenfor, har med succes muliggjort kloning af I
DK 175362 B1 29 gener til human aldehyd-dehydrogenaser (Hsu, L.C.
et_al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 82:3771-3775 (1985))/ fibronectin (Suzuki, S. et al., Eur. Mol.
Biol. Organ. J. 4:2519-2524 (1985)), det humane 5 estrogen-receptorgen (Walter, P. et al♦, Proc, Natl.
Acad. Sci♦ USA 82:7889-7893 (1985)), vævstype plasmino-gen-aktivator (Pennica, D. et al., Nature 301:214-221 (1983)) og humant ende-placental-alkalisk-phosphatase-komplementært-DNA (Kam, W. et al., Proc. Natl♦ Acad.
10 Sci, USA 82:8715-8719 (1985)).
Ved en foretrukken alternativ fremgangsmåde til kloning af ICAM-l-genet fremstilles et bibliotek af ekspressionsvektorer ved kloning af DNA eller, mere foretrukket cDNA, fra en celle, der er i stand til at 15 eksprimere ICAM-1 ind i en ekspressionsvektor. Biblioteket screenes dernæst for medlemmer, der er i stand til at eksprimere et protein, som binder til anti-ICAM-1-antistof, og som har en nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for polypeptider, som har den samme 20 aminosyresekvens som ICAM-1 eller fragmenter af ICAM-1.
Det klonede ICAM-l-gen, opnået gennem ovennævnte fremgangsmåder, kan bindes operabelt til en ekspressionsvektor og indføres i bakterie- eller eukaryotiske 25 celler til produktion af ICAM-l-protein. Teknikker for sådanne manipulationer er angivet af Maniatis. T. et al., supra, og er velkendte indenfor teknikken.
30 D. Anvendelser af prøver for LFA-l-afhængig aggregation.
Ovennævnte prøve, hvor man er i stand til at måle LFA-l-afhængig aggregation kan benyttes til identi-35 fikation af mdiler, der virker som antagonister til inhibering af omfanget af LFA-l-afhængig aggregation.
I DK 175362 B1
I 30 I
I Sådanne antagonister kan virke ved at svække LFA-1 el- I
I ler ICAM-1's evne til at formidle aggregation. Sådanne I
I midler omfatter således immunoglobuliner, såsom et an- I
I tistof der er i stand til at binde til enten LFA-1 el- I
I 5 ler ICAM-1. Ikke-immunoglobuline (dvs. kemiske) midler I
I kan yderligere undersøges under anvendelse af ovennævn- I
I te prøve, for at bestemme om de er antagonister til I
I LFA-l-aggregation. I
I 10 I
E. Anvendelser af antistoffer, der er i stand til at I
I binde til ICAM-1 receptorproteiner. I
I I. Anti-inflammatoriske midler. I
I 15 I
I Monoklonale antistoffer til medlemmer af CD I
I 18-komplekset inhiberer mange leukocytters adhæsionsaf- I
I hængige funktioner, herunder binding til endothelium I
I (Haskard, D., et al. , J. Immunol. 137:2901-2906 I
I 20 (1986)), homotypiske adhæsioner (Rothlein, R., et al., I
I J. Exp. Med. 163:1132-1149 (1986)), antigen- og mito- I
I geninduceret proliferation af lymfocytter (Davignon, I
I D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78^:4535-4539 I
I (1981)), antistofdannelse (Fischer, A., et al., J. I
I 25 Immunol♦ 136:3198-3203 (1986)), og alle leukocytters I
I effektorfunktioner, såsom cytotoxiske T-cellers lytiske I
I aktivitet (Krensky, A.M., et al. J. Immunol. 132: I
I 2180-2182 (1984)), makrofager (Strassman, G., et al. I
I J. Immunol. 136:4328-4333 (1986)), og alle celler in- I
I 30 volveret i antistof-afhængige cellecytotoxiske reaktio- I
I ner (Kohi, S., et al., J. Immunol. 133:2972-2978 I
I (1984)). I alle ovennævnte funktioner inhiberer anti- I
I stofferne leukocyttens evne til at hæfte til det pas- I
I sende cellesubstrat, som på sin side inhiberer det en- I
I 35 delige resultat. I
I Som omtalt ovenfor er bindingen af ICAM-1-mole- I
I kyler til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler af I
31 DK 175362 B1 stor vigtighed ved cellulær adhæsion. Gennem adhæsionsprocessen er lymfocytter i stand til kontinuert at undersøge et dyr for nærværelsen af fremmede antigener.
Skønt disse processer normalt er ønskelige, er de også 5 årsagen til organtransplantationafvisning, vævstrans-plantationafvisning og mange autoimmune sygdomme. Ethvert middel, der er i stand til at dæmpe eller inhibe-re cellulær adhæsion, vil således være meget ønskværdigt hos patienter, der underkastes organtransplanta-10 tioner, vævstransplantationer eller hos autoimmune patienter.
Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, er særdeles egnede som antiinflamma-toriske midler hos et pattedyr eller menneske. Sådanne 15 midler adskiller sig i væsentlig grad fra sædvanlige antiinflammatoriske midler, idet de er i stand til selektivt at inhibere adhæsion og ikke giver andre bivirkninger såsom nephrotoxicitet, som findes hos sædvanlige midler. Monoklonale antistoffer, der er i stand 20 til at binde til ICAM-1 kan derfor benyttes til at hindre organ- eller vævsafvisning, eller modificere autoimmune reaktioner uden frygt for sådanne bivirkninger hos pattedyret eller mennesket.
Det er af stor vigtighed, at anvendelsen af mo-25 noklonale antistoffer, der er i stand til at genkende ICAM-1, muliggør gennemførsel af organtransplantationer selv mellem individer med stort HLA-uensartethed.
30 2. Suppressorer af forsinket-type-hypersensibili- tetsreaktion.
Da ICAM-l-molekyler oftest eksprimeres på steder med inflammation, såsom de steder, der er in-35 volveret i forsinket-type-hypersensibilitetsreaktion, har antistoffer (især monoklonale antistoffer), der er
___ I
I DK 175362 B1
I 32 I
I i stand til at binde til ICAM-l-molekyler, tera- I
I peutisk mulighed for at dæmpe eller eliminere sådanne I
I reaktioner. Denne mulige terapeutiske anvendelse kan I
I udnyttes på to måder. For det første kan et middel in- I
I 5 deholdende et monoklonalt antistof overfor ICAM-1 admi- I
I nistreres til en patient, der lider af forsinket- I
I type-hypersensibilitetsreaktion. Sådanne midler kan I
I f.eks. gives til et individ, som har været i kontakt I
I med antigener såsom giftig efeu, giftig eg, osv. Ved en I
10 anden udførelsesform administreres det monoklonale an- I
I tistof, der er i stand til at binde til ICAM-1, til I
I en patient sammen med et antigen, for at hindre en I
I efterfølgende inflammationsreaktion. Denne co- I
I administrering af et antigen og et ICAM-l-bindende I
15 monoklonalt antistof kan således midlertidigt få et in- I
I divid til efterfølgende at tolerere udsættelse for det- I
I te gen. I
I 20 3. Behandling af kronisk inflammationssyqdom. I
I Eftersom LAD-patienter som mangler LFA-1 ikke I
opnår en inflammatorisk reaktion, formodes det at anta- I
I gonisme af LFA-i's naturlige ligand, ICAM-1, også vil I
I 25 inhibere en inflammatorisk reaktion. Antistoffers evne I
I til overfor ICAM-1 at inhibere inflammation tilveje- I
I bringer det grundlæggende for deres terapeutiske anven- I
delse ved behandlingen af kroniske inflammationssygdom- I me og autoimmune sygdomme, såsom lupus erythematosus, I 30 autoimmun thyroiditis, eksperimentel allergisk encepha- lomyelitis (EAE) multipel sclerosis, visse former for I diabetes Reynaud's syndrom, rheumatoid arthritis, osv.
I Sådanne antistoffer kan også anvendes som terapi ved I behandling af psoriasis. De monoklonale antistoffer, 35 der er i stand til at binde ICAM-1, kan sædvanligvis I anvendes til behandingen af disse sygdomme, der for ti- DK 175362 B1 33 den behandles gennem steroidterapi.
4. Diagnostiske og prognostiske anvendelser.
5
Da ICAM-1 oftest eksprimeres på steder med inflammation kan monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, anvendes som et middel til at beskrive eller visualisere steder med infektion og 10 inflammation hos en patient, ved en sådan anvendelse mærkes de monoklonale antistoffer detekterbart gennem anvendelsen af radioisotoper, affinitetsmærker (såsom biotin, avidin, osv.) fluorescerende markører, para-magnetiske atomer, osv. Fremgangsmåder til gennemførel-15 se af en sådan mærkning er velkendte inden for teknikken. Klinisk anvendelse af antistoffer til diagnostisk beskrivelse er angivet af Grossman, H.B., Urol. Clin.
North Amer. 1^3:465-474 (1986)), Unger, E.C. et al.,
Invest. Radiol. 20:693-700 (1985)), og Khaw, B.A. et 20 al., Science 209:295-297 (1980)).
Tilstedeværelsen af inflammationen kan desuden påvises gennem anvendelsen af bindingsligander, såsom mRNA, cDNA eller DNA, som binder til ICAM-1-gensekvenser eller til ICAM-1-mRNA-sekvenser hos celler 25 som eksprimerer ICAM-1. Teknikker til gennemførelse af sådanne hybridiseringsprøver er beskrevet af Maniatais, T. (supra).
Påvisningen af foci af sådanne detekterbart mærkede antistoffer er angivende for et sted med inflamma-30 tion eller tumorudvikling, ved en udførelsesform gennemføres denne undersøgelse for inflammation ved at fjerne vævsprøver eller blod og inkubere sådanne prøver i nærværelse af detekterbart mærkede antistoffer. Ved en foretrukken udførelsesform gennemføres denne teknik 35 på en ikke-invasiv måde gennem anvendelse af magnetisk billedoptagelse, fluorografi, osv. En sådan diagnostisk
I DK 175362 B1 I
I 34 I
I test kan benyttes ved overvågning af organtransplantat- I
I modtagere for tidlige tegn på potentiel vævsafvisning. I
Sådanne prøver kan desuden gennemføres i forsøg på at I
I bestemme et individs predilektion for rheumatoid I
5 arthritis eller andre kroniske inflammationssygdomme. I
I 5. Supplement til Indføringen af antiqent materiale I
I administreret til terapeutiske eller diagnostiske I
10 formål. I
I Immunreaktioner overfor terapeutiske eller dia- I
I gnostiske midler, såsom bovint insulin, interferon, I
I vævstype-plasminogen-aktivator eller murine monoklonale I
I 15 antistoffer, svækker i væsentlig grad den terapeutiske I
I eller diagnostiske værdi af sådanne midler, og kan I
I faktisk forårsage sygdomme såsom, serumsygdom. En sådan I
I situation kan afhjælpes gennem anvendelsen af de om- I
handlede antistoffer. Ved denne udførelsesform vil så- I
I 20 danne antistoffer blive administreret sammen med det I
I terapeutisk eller diagnostisk middel. Tilsætningen I
I af antistofferne hindrer modtageren i at genkende mid- I
I let og hindre derfor modtageren i initiering af en im- I
I munreaktion overfor dette. Fravær af en sådan immun- I
I 25 reaktion gør det muligt for patienten at modtage yder- I
I ligere administreringer af det terapeutiske eller diag- I
nostiske middel. I
30 F. Anvendelser af intercellulær adhæsionsmolekyle-1 I
I (ICAM-1). I
I ICAM-1 er en bindingspartner af LFA-1. ICAM-1 I
I eller dets funktionelle derivater kan som sådan an- I
I 35 vendes ombytteligt med antistoffer, der er i stand til I
I at binde til LFA-1, ved behanding af sygdom. I opløst I
DK 175362 B1 35 form kan sådanne molekyler således anvendes til in-hibering af inflammation, organafvisning, vævsafvisning, osv. ICAM-1 eller dets funktionelle derivater kan benyttes på samme måde som anti-ICAM-l-antistoffer 5 til at mindske immunogeniciteten af terapeutiske eller diagnostiske midler.
ICAM-1, dets funktionelle derivater og dets antagonister kan benyttes til blokering af metastasis eller proliferation af tumorceller, som eksprimerer 10 enten ICAM-1 eller LFA-1 på deres overflader. En lang række fremgangsmåder kan benyttes til opnåelse af et sådant mål. Migreringen af hæmatopoietiske celler kræver f.eks. LFA-1-ICAM-1-binding. Antagonister af en sådan binding undertrykker derfor denne migrering og 15 blokerer metastasis af tumorceller af leukocyt-herkomst. Toxin-derivatiserede molekyler, der er i -stand til at binde til enten ICAM-1 eller et medlem af LFA-1-familien af molekyler kan alternativt administreres til en patient. Når sådanne toxinafledte molekyler 20 binder til tumorceller, der eksprimerer ICAM-1 eller et medlem af LFA-l-familien af molekyler, dræber tilstedeværelsen af toxinet tumorcellerne, hvorved proliferation af tumoren inhiberes.
25 G. Anvendelser af ikke-immunoqlobuline antagonister af ICAM-l-afhænqiq adhæsion.
ICAM-1-afhængig adhæsion kan inhiberes ved hjælp 30 af ikke-immunoglobuline antagonister, der er i stand til at binde til enten ICAM-1 eller LFA-1. Et eksempel på en ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1 er LFA-1. Et eksempel på en ikke-immunoglobulin antagonist, som binder til LFA-1, er ICAM-1. Gennem anvendel-35 sen af de ovennævnte prøver kan yderligere ikke-immunoglobuline antagonister identificeres og renses. Ikke- I DK 175362 B1 I 36
immunoglobuline antagonister af ICAM-l-afhængig adhæ- I
I sion kan benyttes til det samme formål som antistoffer I
mod LPA-l eller antistoffer mod ICAM-1. I
5
I H. Administrering af de omhandlede midler. I
I De terapeutiske virkninger af ICAM-l kan opnås I
ved at forsyne en patient med hele ICAM-1-molekylet el-
I 10 ler ethvert terapeutisk aktivt peptidfragment deraf. I
ICAM-1 og dets funktionelle derivater kan opnås I
I enten syntetisk, gennem anvendelsen af rekombinant-DNA- I
I teknologi, eller ved proteolyse. De terapeutiske forde- I
I le ved ICAM-1 kan øges gennem anvendelsen af funktio- I
I 15 nelle derivater af ICAM-1, der indeholder yderligere I
tilsatte aminosyrerester, for at øge koblingen til I
I bærere eller øge aktiviteten af ICAM-l. Opfindelsen I
I omfatter yderligere funktionelle derivater af ICAM-1, I
I som mangler visse aminosyrerester, eller som inde-
I 20 holder ændrede aminosyrerester, så længe sådanne I
I derivater besidder evnen til celluæradhæsionspåvirk- I
I ning. I
I Både de omhandlede antistoffer og det nævnte ICAM-l-molekyle siges at være "i det væsentlige uden I 25 naturlig forurening", hvis præparaterne, som indeholder I disse, i det væsentlige ikke indeholder materialer, som normalt og naturligt findes i disse produkter.
I Den foreliggende opfindelse angår antistoffer I og biologisk aktive fragmenter deraf (enten polyklonale I 30 eller monoklonale), som er i stand til at binde til I ICAM-1. Sådanne antistoffer kan fremstilles enten i dyr eller på vævskulturer eller ved rekombinant-DNA- I midler.
I Når man giver en patient antistoffer, eller 35 fragmenter deraf, der er i stand til at binde til ICAM-1, eller når man giver ICAM-l (eller et fragment, DK 175362 B1 37 variant eller derivat deraf) til en modtagende patient, vil dosis af administreret middel variere afhængigt af sådanne faktorer som patientens alder, vægt, højde, køn, generelle medicinske tilstand, tidligere medicin-5 ske historie, osv. Det er sædvanligvis ønskeligt at forsyne modtageren med en dosis antistof, som ligger indenfor området fra ca. l pg/kg til 10 mg/kg (patientens kropsvægt), idet dog en mindre eller større dosis kan administreres. Når man til en patient administrerer 10 ICAM-1-molekyler eller deres funktionelle derivater, foretrækkes det at administrere sådanne molekyler i en dosis, som også ligger i området fra ca. l pg/kg til 10 mg/kg (patientens kropsvægt), idet dog en mindre eller større dosis også kan administreres.
15 Som omtalt nedenfor kan den terapeutiske virk ningsfulde dosis mindskes, hvis anti-ICAM-l-anti-stoffet co-administreres med et anti-LFA-l-antistof.
Som benyttet heri siges en forbindelse at blive co-ad-ministreret med en anden forbindelse, når administre-20 ringen af de to forbindelser tidsmæssigt ligger så tæt på hinanden, at begge forbindelser kan påvises samtidig i patientens serum.
Både antistoffet, der er i stand til at binde til ICAM-1, og ICAM-1 i sig selv kan administreres til 25 patienter intravenøst, intramuskulært, subkutant, en-teralt eller parenteralt. Når antistof eller ICAM-1 administreres ved injektion, kan administreringen ske ved kontinuer infusion, eller ved hjælp af en enkel eller flere boli.
30 Det er med de omhandlede anti-inflammatoriske midler tilsigtet at give dem til modtagende individer i en mængde, der er tilstrækkelig til at undertrykke inflammation. En mængde siges at være tilstrækkelig til at "undertrykke" inflammation, hvis dosis, administra-35 tionsmåde, osv af midlet, er tilstrækkelig til at dæmpe eller hindre inflammation.
I DK 175362 B1 38
I Anti-ICAM-l-antistof, eller et fragment heraf, I
I kan administreres enten alene eller i kombination med I
I et eller flere yderligere immunosuppressive midler I
I (specielt til en modtager af et organ- eller vævstrans- I 5 plantat). Administreringen af en sådan eller sådanne I forbindelser kan have enten et "profylaktisk" eller I "terapeutisk" formål. Ved profylaktisk administrering I administreres den eller de immunosuppressive forbindel- I ser før nogen som helst inflammatorisk reaktion eller I 10 symptom (f.eks. før, samtidig med eller kort efter tidspunktet for en organ- eller vævstransplantation, I men forud for nogen som helst symptomer på organafvis- ning eller -afstødning). Den profylaktiske administre- I ring af forbindelsen eller forbindelserne tjener til I 15 at forhindre eller svække enhver efterfølgende inflam- I matorisk reaktion (som f.eks. afstødning af et trans- I planteret organ eller væv osv.), ved terapeutisk admi- I nistrering administreres den eller de immunosuppressive I forbindelser ved (eller kort efter) indtræden af et I 20 symptom på egentlig inflammation (som f.eks. organ- I eller vævsafstødning. Den terapeutiske administrering I af forbindelsen eller forbindelserne tjener til at I svække enhver egentlig inflammation (som f.eks. afstød- I ningen af et transplanteret organ eller væv). De anti- I 25 inflammatoriske midler ifølge den foreliggende opfin- delse kan således administreres enten før indtræden af I inflammation (til undertrykkelse af en forventet in- I flammation) eller efter starten af inflammationen.
Et middel siges at være "farmakologisk accepta- 30 belt" hvis dets administrering kan tolereres af en modtagende patient. Et sådant middel siges at blive I administreret i en "terapeutisk virkningsfuld mængde", I hvis den administrerede mængde er fysiologisk signifi- I kant. Et middel er fysiologisk signifikant, hvis dets I 35 tilstedeværelse resulterer i en påviselig ændring i fysiologien hos en modtagende patient.
—jwws—·· · ir- —r·-.' ." f.iwBMWgM—wmw5^i»wiii· » -»».g · ·· Jr*-; '« , ;^μ«>.ιμ; a?Jf jp 'g!*WW
DK 175362 B1 39
Antistoffet og ICAM-1-molekyler ifølge opfindelsen kan formuleres i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder til fremstilling af farmaceutisk nyttige midler, hvor disse materialer eller deres funktionelle 5 derivater kombineres i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærevehikel. Egnede vehikler og deres formulering, herunder andre humane proteiner, f.eks. humant serum albumin, er beskrevet f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences (16. udg., Osol, A., Ed., Mack, 10 Easton PA (1980)). For at danne et farmaceutisk acceptabelt middel, der er egnet til effektiv administrering, vil sådanne midler indeholde en virkningsfuld mængde af anti-lCAM-antistof eller ICAM-1-molekyle eller deres funktionelle derivater, sammen med en egnet 15 mængde af et bærevehikel.
Yderligere farmaceutiske fremgangsmåder kan anvendes til at kontrollere virkningsvarigheden. Præparater med kontrolleret frigivelse kan opnås ved anvendelsen af polymere til kompleksdannelse eller absorp-20 tion af anti-ICAM-1-antistof eller ICAM-1 eller deres funktionelle derivater. Den kontrollerede tilførsel kan gennemføres ved at vælge passende makromolekyler (f.eks. polyestere, polyaminosyrer, polyvinylpyrroli-don, ethylenvinylacetat, methylcellulose, carboxyme-25 thylcellulose eller protamin-sulfat) og koncentrationen af makromolekyler samt fremgangsmåderne til inkorporering, for at kontrollere frigivelse. En anden egnet fremgangsmåde til at kontrollere virkningsvarighed hos præparater med kontrolleret frigivelse er inkorporering 30 af anti-ICAM-l-antistof eller ICAM-l-molekyler, eller deres funktionelle derivater, i partikler af et polymert materiale, såsom polyestere, polyaminosyrer, hy-drogeler, poly(mælkesyre) eller ethylenvinylacetatco-polymerer. I stedet for inkorporering af disse midler i 35 polymere partikler er det alternativt muligt at indeslutte disse materialer i mikrokapsler fremstillet I DK 175362 B1 I 40 f.eks. ved coacerveringsteknikker eller ved grænsefla- I depolymerisation, f.eks. henholdsvis hydroxymethyl- cellulose- eller gelatinemikrokapsler og poly(methyl- I methacrylat)mikrokapsler, eller i kolloide medikament- I 5 tilførselssystemer, f.eks. liposomer, albumin-mikro- I kugler, mikroemulsioner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsioner. Sådanne teknikker er beskrevet I i Reminton's Pharmaceutical Sciences (1980).
I Efter således at have bekrevet opfindelsen gene- 10 relt, belyses den nu nærmere ved hjælp af de efterføl- gende eksempler, som ikke skal være begrænsende for opfindelsen, med mindre det er angivet nærmere.
Eksempel l I 15 Dyrkning af pattedyrceller.
De omhandlede EBV-transformerede og hybridoma- celler opbevaredes generelt i RMPI 1640 dyrknings- I medium, suppleret med 20 mM L-glutamin, 50 yg/ml genta- micin og 10% fetal bovin- (eller fetal kalve-) serum.
20 Cellerne dyrkedes ved 37 °C i en atmosfære med 5% C02, I 95% luftfugtighed.
Til etablering af Epstein-Barr virus-(EBV-) I transformanter inkuberedes 10® T-celle-fattige perifere I mononukleære blodceller/ml i RPMI 1640 medium, supple- I 25 ret med 20% fetal kalveserum (FCS), og 50 yg/ml genta- I micin i 16 timer med EBV-holdig supernatant af I B95-8-celler (Thorley-Lawson, D.A. et al., J, Exper.
I Med. 146:495 (1977)). Celler i 0,2 ml aliquot anbragtes
I i 10 mikrotiterbrønde. Mediet erstattedes med RPMI
I 30 1640 medium (suppleret med 20% fetal kalveserum og I 50 yg/ml gentamicin) indtil cellevækst konstateredes.
Cellerne voksede i de fleste brønde og ekspanderedes i J
det samme medium. Phytohæmagglutinin (PHA)-blaster et- ableredes ved 10® celler/ml i RPMI 1640 medium I 35 (suppleret med 20% fetal kalveserum) indeholdende en | 1:800 fortynding af PHA-P (Difco Laboratories, Inc., B---^1 · " m> ~ . ------------- ·—>·· ~ · ^.t· · »?·· '.f » .Τ' 'ffrysSE? tt*" ' '**> *" yjPaWBr'VT·'' " ^'T^'KTg’ar.fg-- DK 175362 B1 41
Detroit, MI). PHA-linier ekspanderedes med interleukin 2 (IL-2)-konditioneret medium og pulseredes ugentlig med PHA (Cantrell, D.A. et al., J. Exper. Med. 158:1895 (1983)). Ovennævnte fremgangsmåde er angivet 5 af Springer, T. et al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisningen dertil. Celler opnået gennem ovennævnte fremgangsmåde screenes dernæst med anti-LPA-l-antistoffer til bestemmelse af hvorvidt de eksprimerer LFA-l-anti-10 genet. Sådanne antistoffer er angivet af Sanches-Madrid, P. et al., J. Exper. Med. 158:1785 (1983).
Eksempel 2.
Prøver for cellulær aggregation og adhæsion.
15 For at prøve udstrækningen af cellulær adhæsion anvendtes aggregationsprøver. De i sådanne prøver benyttede cellelinier vaskedes 2 gange med RPMI 1640 medium indeholdende 5 mM Hepes-puffer (Sigma Chemical Co., St. Louis) og genopslæmmedes til en koncentration .20 på 2 x 106 celler/ml. Til fladbundede, 96-brøndes mikrotiterplader (no. 3596; Costar, Cambridge, MA) sattes 50 μΐ af passende monoklonalt antistof-supernatant eller 50 μΐ komplet medium med eller uden rensede monoklonale antistoffer, 50 μΐ fuldstændigt medium in-25 deholdende 200 ng/ml af phorbolesteren phorbolmyrista-tacetat (PMA) og 100 μΐ celler i en koncentration på 2 x 106 celler/ml i fuldstændigt medium. Dette gav en endelig koncentration på 50 ng/ml PMA og 2 x 105 celler/brønd. Cellerne fik lov til spontant at sætte 30 sig, og graden af aggregationen registreredes på forskellige tidspunkter. Resultater lå på fra 0-5+, hvor 0 indikerer at i det væsentlige ingen celler fandtes i klynger; 1+ indikerede at højst 10% af cellerne var i aggregater; 2+ indikerede at højst 50% af celler-35 ne var samlet; 3+ indikerede at op til 100% af cellerne var i små, løse klynger; 4+ indikerede at op-
I DK 175362 B1 I
I 42 I
I til 100% af cellerne var samlet i større klynger; I
og 5+ indikerede at 100% af cellerne var i store, meget I
I kompakte aggregater. Til opnåelse af en mere kvantita- I
I tiv vurdering af cellulær adhæsion sattes reagenser og I
I 5 celler til 5 ml polystyrenrørglas på samme måde som I
I ovenfor. Rørglassene anbragtes i et stativ på en rota- I
tionsryster ved 37eC. Efter en time ved ca. 200 omdr./ I
I min. anbragtes 10 μΐ cellesuspensionen i et hæmocytome- I
I ter, og antallet af frie celler bestemtes. Procent ag- I
I 10 gregation betemtes ved den følgende ligning: I
I % aggregation = 100 x (1 - ant-al·, cel3-er ) I
antal tilførte celler I
I 15 Antallet af tilførte celler i ovennævnte formel I
I er antallet af celler per ml i et kontrolrør, der kun I
I indeholder celler og fuldstændigt medium som ikke er I
I blevet inkuberet. Antallet af frie celler i ovennævnte I
I ligning svarer til antallet af ikke-aggregerede celler I
I 20 per ml fra eksperimentalrør. Ovennævnte fremgangsmåde I
I er beskrevet af Rothlein, R., et al., J.Exper. Med. I
I 163:1132-1149 (1986). I 1
Eksempel 3. I
I 25 LFA-1-afhængig cellulær aggregation. I
I Den kvalitative aggregationsprøve beskrevet i I
I eksempel 2 gennemførtes med anvendelse af den Epstein- I
I Barr-transformerede cellelinie JY. ved tilsætning af I
I PMA til dyrkningsmediet i mikrotiterpladerne observere- I
I 30 des aggregation af celler. Tidsforkortede videooptagel- I
I ser viste, at JY-cellerne på bunden af mikrotiterbrøn- I
I dene var bevægelige og udviste aktiv membrankrusning og I
I pseudopodiabevægelse. Kontakt mellem nabocellers pseu- I
I dopodia resulterede ofte i celle-celleadhærence. Hvis I
35 adhærence fastholdtes bevægede området med cellekontakt I
I sig til uropodet. Kontakt kunne opretholdes til trods I
43 DK 175362 B1 for kraftige cellebevægelser og cellernes trækken i modsatte retninger. Den primære forskel mellem PMA-behandlede og ubehandlede celler viste sig at være stabiliteten af disse kontakter når de først var dan-5 net. Med PMA udvikledes klynger af celler, der voksede i størrelse efterhånden som yderligere celler hæftedes til deres periferi.
Som et andet middel til måling af adhæsion benyttedes den kvantitative prøve beskrevet i eksempel 2.
10 Cellesuspensioner rystedes ved 200 omdr./min. i 2 timer, overførtes til et hæmocytometer, og celler, der ikke var i aggregater optaltes. I fravær af PMA var 42% (standardafvigelse = 20%, N = 6) af JY-cellerne i aggregater efter 2 timer, medens JY-celler inkuberet 15 under identiske betingelser med 50 ng/ml PMA havde 87% (standardafvigelse = 8%, N = 6) af cellerne i aggregater. Kinetiske studier af aggregation viste at PMA øgede hastigheden og størrelsen af aggregation på alle testede tidspunkter (fig. 3).
20
Eksempel 4.
Inhiberinq af aggregation af celler under anvendelse af anti-LFA-l-monoklonale antistoffer.
For at undersøge virkningen af anti-LFA-l mono-25 klonale antistoffer på PMA-induceret cellulær aggregation sattes sådanne antistoffer til celler inkuberet i overensstemmelse med den kvalitative aggregationsprøve fra eksempel 2. De monoklonale antistoffer viste sig at inhibere dannelsen af celleaggregater enten i nær-30 værelse eller fravær af PMA. Både Ffab1^- og Fab'-fragmenterne af monoklonale antistoffer overfor LFA-l's α-kæde var i stand til at inhibere cellulær aggregation. Medens i det væsentlige 100% celler dannede aggregater i fravær af anti-LFA-l-antistof, viste det sig 35 at højst 20% af cellerne var i aggregater når antistof tilsattes. Resultaterne af dette forsøg er beskrevet af ----- . 1^ I DK 175362 B1 I 44
Rothlein, R, et al« (J. Exper. Med. 163:1132-1149 I
I (1986).
I Eksempel 5.
I 5 Cellulær aggregation behøver LFA-1-receptoren.
I EBV-transformerede lymfoblastoidceller frem- I stilledes fra patienter analogt med metoden beskrevet i I eksempel 1. Sådanne celler underkastedes screening over I for monoklonale antistoffer, der er i stand til at gen- I 10 kende LFA-l og cellerne viste sig at være LFA-l-defi- ciente.
I Den kvalitative aggregationsprøve beskrevet i I eksempel 2 anvendtes, idet de ovennævnte LFA-l-defi- I ciente celler benyttedes. Sådanne celler var ikke i I 15 stand til spontant at danne aggregater, selv i nær- I værelse af PMA.
Eksempel 6 I Opdagelsen af ICAM-1.
I 20 De LFA-1-deficiente celler fra eksempel 5 mær- I kedes med carboxyfluoresceindiacetat (Patarroyo, M. et I al., Cell. Immunol. 63:237-248 (1981)). De mærkede celler blandedes i et forhold på 1:10 med autologe el- ler JY-celler, og procentdelen af fluorescein-mærkede I 25 celler i aggregatet bestemmes i overensstemmelse med I fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., J. Exper. Med.
I 163:1132-1149 (1986). De LFA-l-deficiente celler viste I sig at være i stand til at coaggregere med LFA-1 eksprimerende celler (fig. 4).
I 30 For at afgøre om LFA-1 kun var vigtig ved dan- I nelse af aggregater eller ved deres bevarelse sattes antistoffer, der er i stand til at binde til LFA-1, til I de ovennævnte præformede aggregater. Tilsætningen af I antistof viste sig kraftigt at sprænge den præformede 35 aggregation. Tidsforkortet videooptagelse bekræftede I at tilsætningen af de monoklonale antistoffer til præ- 45 DK 175362 B1 formede aggregater startede sprængning indenfor 2 timer (Tabel. 1). Efter tilsætning af monoklonale antistoffer mod LFA-1 fortsatte pseudopodiale bevægelser og formændringer hos individuelle celler indenfor aggregatet 5 uændret. Individuelle celler disassocierede gradvis fra aggregatets periferi; efter 8 timer var de fleste celler dispergerede. Ved baglæns kørsel af tidsforkortet videooptagelse viste sprængningen af præformede aggregater med LFA-1-monoklonale antistoffer sig at være 10 ækvivalent med aggregationsprocessen i fravær af LFA-1-monoklonalt antistof.
I DK 175362 B1 I '46 I Tabel 1 I Anti-LFA-l-monoklonale antistoffers evne til at sprænge præformede PMA-inducerede JY-celle-aggregater.
I 5 I Forsøg Aggreqationsreqistrerinq I 18 timer H _2 timer3_-mAb_+mAb 10 1 4+ 4+ l+b
2 3+4+ 1+C
I 3_5+_ 5+_1+f_
Aggregation i den kvalitative mikrotiter-pladeprøve re- 15 gistreredes visuelt. Med anti-LFA-l tilstede gennem hele prøveperioden var aggregationen højst 1+.
20 aMængden af aggregation lige før tilsætning af mono- klonalt antistof efter 2 timer.
I bTSl/18 + TS1/22.
I CTS1/18.
I 25 dTSl/22.
I Eksempel 7.
I Behovet for divalente ioner til LFA-l-afhænqig aggregation.
I 30 LFA-1-afhængige adhæsioner mellem cytotoxiske T-celler og målceller kræver tilstedeværelsen af magne- I sium (Martz, E. J. Cell. Biol. 84:584-598 (1980)).
I PMA-induceret JY-celleaggregation testedes for divalent kationafhængighed. JY-celler dannede ikke aggregater I 35 (idet prøven fra eksempel 2 benyttedes ) i medium I uden calcium- eller magnesiumioner. Tilsætningen af 47 DK 175362 B1 divalent magnesium understøttede aggregation ved koncentrationer helt ned til 0,3 mM. Tilsætningen af calciumioner alene havde kun ringe effekt. Calciumioner viste sig imidlertid at øge magnesiumioners evne til 5 at understøtte PMA-induceret aggregation. Når 1,25 mM calciumioner sattes til mediet, viste magnesiurn-ionkoncentr at ioner helt ned til 0,02 mM sig at støtte aggregationen. Disse data viser at den LFA-1 afhængige aggregation af celler kræver magnesiumioner, og at 10 calciumioner, skønt de i sig selv er utilstrækkelige, kan virke synergistisk med magnesiumioner til at give mulighed for aggregation.
Eksempel 8 15 Isoleringen af hybrldomaceller, der er i stand til at “ eksprimere anti-lCAM-l-monoklonale antistoffer.
Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, isoleredes i overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al♦, J. immunol.
20 137:1270-1274 (1986), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisningen dertil. 3 BALC/C-mus immuniseredes intraperitonealt med EBV-transformerede perifere blodmononukleære celler fra et LFA-1-deficient individ (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901 25 (1984)). Ca. 107 celler i 1 ml RPMI 1640 medium be nyttedes til hver immunisering. Immuniseringerne administreredes 45, 29 og 4 dage før miltceller fjernedes fra musene til produktion af de ønskede hybridoma-cellelinier. På dag 3 før fjernelsen af miltcellerne 30 modtog musene yderligere 107 celler i 0,15 ml medium (intravenøst).
Isolerede miltceller fra ovennævnte dyr fusioneredes med P3X73Ag8.653 myelomaceller i et forhold på 4:1 i overensstemmelse med Galfre, G. et al., Nature 35 266:550 (1977). Aliquoter af de opnåede hybridomaceller indførtes i 96-brønds mikrotiterplader. Hybridomasuper-
I DK 175362 B1 I
I 48 I
I natanterne underkastedes screening for inhibering af I
I aggregation og én inhiberende hybridoma (af over 600 I
I testede brønde) klonedes og subklonedes ved grænsefor- I
tynding. Denne subklon betegnedes RRl/l.l.l (herefter I
I 5 betegnet "RRl/l"). I
I Monoklonalt antistof RRl/l viste sig konsekvent I
I at inhibere den LFA-l-eksprimerede cellelinie JY's I
I PMA-stimulerede aggregation. Det RRl/l-monoklonale I
I antistof inhiberede aggregation tilsvarende, eller en I
10 smule mindre end visse monoklonale antistoffer mod I
I LFA-1-α eller -β-underenheder. Kontrolmonoklonalt anti- I
I stof over for HLA, som eksprimeres rigeligt på JY-cel- I
I ler, inhiberede i modsætning hertil ikke aggregation. I
I Antigenet bundet af monoklonalt antistof RRl/l define- I
I 15 res som det intercellulære adhæsionsmolekyle-1 I
(ICAM-1).
I Eksempel 9. I
Anvendelse af anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer til I
I 20 karakterisering af ICAM-1 molekylet. I
I For at bestemme ICAM-1’s natur og især hvorvidt I
I ICAM-1 var forskellig fra LFA-1, immunofældedes I
I celleproteiner under anvendelse af monoklonalt anti- stof RRl/l. Immunopræcipitationen gennemførtes i over- I 25 ensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., I J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)). JY-celler lyseredes I ved 5 x 107 celler/ml i 1% Triton X-100, 0,14 m NaCl, I 10 mM Tris, pH 8,0, med frisk tilsat 1 mM phenylmethyl- sulfonylfluorid, 0,2 enheder per ml trypsin-inhibitor I 30 aprotinin (lysis puffer) i 20 minutter ved 4°C. Lysatet I centrifugeredes ved 10.000 x g i 10 min. og præklaredes I med 50 yl af en 50%'s suspension af CNBr-aktiveret, I glycin-quenched Sepharose C1-4B i 1 time ved 4°C. 1 ml I lysat immunopræcipiteredes med 20 μΐ af en 50%'s su- I 35 spension af monoklonalt antistof RRl/l koblet til
I Sepharose C1-4B (1 mg/ml) natten over ved 4eC
49 DK 175362 B1 (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901 (1984)). Sepharose-bundet monoklonalt antistof fremstilledes, idet CNBr-aktivering af Sepharose CL-4B i carbonat-puffer benyttedes, i overensstemmelse med fremgangsmå-5 den af March, S. et al. (Anal. Blochem. 60:149 (1974)).
Vaskede immunopræcipitater underkastedes SDS-PAGE og sølvfarvning i overensstemmelse med fremgangsmåden af Morrissey, J.H. Anal. Biochem. 117:307 (1981).
Efter eluering af proteiner med SDS-prøvepuffer 10 (Ho, M.K. et al., J. Biol. Chem. 258-636 (1983)) ved 100°C, halveredes prøverne og udsattes for elektrofore-se (SDS-8% PAGE) under reducerende (fig. 5A) eller ikke-reducerende betingelser (fig. 5B). Bånd med molekylvægte på 50 kd og 25 kd svarede til de tunge og let-15 te kæder af immunoglobuliner fra det monoklonale anti-stof-Sepharose (fig. 5A, bane 3). Varierende mængder af andre bånd i 25-50 kd vægtområdet observeredes desuden, men ikke i præcipitater fra lodne leukemiaceller, som kun gav et 90 kd molekylvægtbånd. LFA-l's 177 kd a-20 underenhed og 95 kd β-underenhed viste sig at migrere forskelligt fra ICAM-l under både reducerende (fig. 5A, bane 2) og ikke-reducerende (fig. 5B, bane 2) betingelser.
For at bestemme monoklonalt antistof RRl/l's 25 virkning på PHA-lymfoblast-aggregation anvendtes den kvantitative aggregationsprøve beskrevet i eksempel 2. T-celle-blastceller stimuleredes således i 4 dage med PHA, vaskedes grundigt og dyrkedes dernæst i 6 dage i nærværelse af IL-2 konditioneret medium. PHA viste 30 sig at blive internaliseret under denne 6 dages dyrkning og bidrog ikke til aggregationsprøven. I tre forskellige prøver med forskellige T-celle-blastpræparater inhiberede ICAM-l monoklonale antistoffer konsekvent aggregation (Tabel 2).
I DK 175362 B1
I 50 I
I Tabel 2 I
Inhibering af PMA-stimuleret PHA-lymfoblast I
I aggregation af RR1/1 monoklonalt antistof3 I
I 5 % % I
I Forsag PMA Mab_Aggregation Inhibering I
I lc Kontrol 9 I
I + Kontrol 51 0 I
I 10 + HLA-A,B 58 -14d I
+ LFA-1-α 31 39 I
I + ICAM-1 31 39 I
2e Kontrol 10 I
I + Kontrol 78 0 I
I 15 + LFA-1-β 17 78 I
+ ICAM-1 50 36 I
I 3f - ----- 7 I
I + Kontrol 70 I
I + HLA-A,B 80 -14 I
20 + LFA-3 83 -19 I
I + LFA-1-α 2 97 I
I + LFA-1-β 3 96 I
+ ICAM-1 34 51 I
I 25 I
I Aggregation af PHA-inducerede lymfoblaster stimuleret I
med 50 ng/ml PMA mængdebestemtes indirekte ved mikro- I
I skopisk tælling af antallet af ikke-aggregerede celler I
I som beskrevet i eksempel 2. I
30 I
I ^Procent inhibering i forhold til celler behandlet med I
I PMA og X63 monoklonalt antistof. I
Aggregation måltes 1 time efter den samtidige til- I
I 35 sætning af monoklonalt antistof og PMA. Celler rystedes I
I ved 175 omdr./min. I
ί· ..Γ ^τ,ττ · — ,. TW· ., ·»»·-» ,-é, - ..1 —Γ- - ΙΙ· -^ - . · - - ~· -¾ ~ ry-1 -~ 1 ’ -^Γ ’fr --.¾¾¾ DK 175362 B1 51 dEt negativt tal indikerer procent aggregationsforøgelse.
Aggregation måltes 1 time efter den samtidige til-5 sætning af et monoklonalt antistof og PMA. Celler pelleteredes ved 200 x G i 1 min., inkuberedes ved 37°C i 15 min., resuspenderedes forsigtigt og rystedes i 45 min. ved 100 omdr./min.
10 ^Celler forbehandledes med PMA i 4 timer ved 37ec. Efter at monoklonalt antistof var tilsat inkuberedes rørene ved 37°C stationært i 20 min. og rystedes ved 75 omdr./min. i 100 min.
I DK 175362 B1 I
I 52 I
I LFA-1-monoklonale antistoffer var konsekvent me- I
re inhiberende end ICAM-l-monoklonale antistoffer, I
I hvorimod HLA-A, B og LFA-3 monoklonale antistoffer var I
I uden virkning. Disse resultater indikerer at af de te- I
I 5 stede monoklonale antistoffer var kun de, der var i I
I stand til at binde til LFA-1 eller ICAM-1, i stand til I
I at inhibere cellulær adhæsion. I
I Eksempel ίο I
I 10 Fremstilling af monoklonalt antistof mod ICAM-1. I
I Immunisering. I
I En Balb/C mus immuniseredes intraperitonealt I
I (i.p) med 0,5 ml 2 x 107 JY-celler i RPMI medium 103 I
I 15 dage og 24 dage før fusion. På 4. og 3. dagen før fu- I
sion immuniseredes mus i.p. med 107 celler af PMA- I
I differentierede U937-celler i 0,5 ml RPMI medium. I
I Differentiering af U937-celler. I
I 20 U937-celler (ATCC CRL-1593) differentieredes I
I ved inkubering af disse ved 5 x 105/ml i RPMI med 10% I
I fetal bovin serum , 1% glutamin og 50 pg/ml gentamyin I
I (fuldstændigt medium) indeholdende 2 ng/ml phorbol-12- I
I myristatacetat (PMA) i en steril polypropylenbeholder. I
I 25 På 3. dagen af denne inkubering fjernedes halvdelen af I
volumenet af mediet og erstattedes med frisk, fuldstæn- I
I digt medium indeholdende PMA. På dag 4 fjernedes cel- I
I ler, vaskedes og præpareredes til immunisering. I
I 30 Fusion. I
I Miltceller fra de immuniserede mus fusioneredes I
I med P3x63 Ag8.653 myelomaceller i et forhold på 4:1 i I
I overensstemmelse med Galfre et al♦, (Nature 266:550 I
I (1977)). Efter fusionen udpladedes cellerne i en I
I 35 96 brøndes fladbundet mikrotiterplade med 105 milt- I
I celler/brønd. I
53 DK 175362 B1
Selektion af antl-ICAM-1 positive celler.
Efter én uge underkastedes 50 yl supernatant screening ved den kvalitative aggregationsprøve ifølge eksempel 2, idet både JY og SKW-3 benyttedes som 5 aggregerende cellelinier. Celler fra supernatanter, der inhiberer JY-celleaggregation, men ikke SKW-3, udvalgtes og klonedes to gange under anvendelse af grænsefortynding.
Dette forsøg resulterede i identifikationen 10 og kloningen af tre separate hybridomalinier, som frembragte anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer. Antistofferne produceret af disse hybridomalinier var henholdsvis lgG2a, IgG2b og igM. Hybridomacellelinien, som producerede IgG2a anti-ICAM-1-antistoffet til-15 deles betegnelsen R6,5'D6'E9'B2. Antistsoffet produceret af den foretruken hybridomacellelinie betegnedes R6'5'D6'E9'B2 (herefter omtalt som "R6-5-D6").
Eksempel il 20 Ekspressionen og reguleringen af ICAM-1.
For at måle ICAM-l-ekspressionen udvikledes en radioimmunprøve. I denne prøve ioderedes renset RR1/1 under anvendelse af iodogen til en specifik aktivitet på 10 yCi/yg. Endotelceller dyrkedes i I
25 96 brøndes plader og behandledes som beskrevet for hvert forsøg. Pladerne afkøledes til 4eC ved anbringelse i et koldt rum i 0,5-1 time, ikke direkte på is. Monolagene vaskedes 3 gange med kolde, fuldstændige medier og inkuberedes dernæst 30 min. ved 4°C 30 med 125I RRi/i. Monolagene vaskedes dernæst 3 gange med fuldstændige medier. Det bundne 125i frigjordes under anvendelse af 0,1 N NaOH og taltes. Den specifikke aktivitet af 125I rri/i indstilledes, ved hjælp af ikke-mærket RRI/I, til opnåelse af et linært signal in-35 denfor de antigentætheder, man støder på under dette studium. Ikke-specifik binding bestemtes i nærværelse I DK 175362 B1 I 54
I af et tusind gange overskud af ikke-mærket RR1/1 og I
I substraheredes fra den totale binding til opnåelse af I
den specifikke binding. I
I ICAM-l-ekspression, målt under anvendelse af I
I 5 ovennævnte radioimmunprøve, øges på humane umbilical- I
I vene-endotelceller (HUVEC) og humane saphenevene- I
I endotelceller (HSVEC) af IL-1, TNF, LPS og IFN-y (Tabel I
I 3). Saphenevene-endotelceller anvendtes i dette studium I
I til bekræftelse af resultaterne fra umbilicalvene- I
I 10 endotelceller i dyrkede store vene-endotelceller fra I
I fuldt udviklet væv. Den basale ekspression af ICAM-1 I
I er 2 gange højere på saphenevene-endotelceller end I
I på umbilicalevene-endotelceller. Udsættelse af I
umbilicalvene-endotelcelle for rekombinant-IL-1- I
I 15 a, lL-1-β og TNF-γ øger ICAM-l-ekspression 10-20 gange. I
I IL-1-α, TNF og LPS var blandt de mest potente inducere I
I og IL-1 var mindre potent på vægtbasis og desuden I
I ved mætningskoncentrationer for responsen (Tabel 3). I
I IL-1-β ved 100 ng/ml øgede ICAM-l-ekspression 9 gange I
I 20 på HUVEC og 7,3 gange på HSVEC med halv-maksimal øgning I
I forekommende ved 15 ng/ml. rTNF ved 50 ng/ml øgede I
I ICAM-l-ekspressionen 16 gange på HUVEC og 11 gange på I
I HSVEC med halv-maksimale virkninger ved 0,5 ng/ml. I
I Interferon-γ frembragte en signifikant øgning i I
I 25 ICAM-l-ekspression på 5,2 gange på HUVEC eller 3,5 I
I gange på HSVEC ved 10.000 E/ml. Virkningen af LPS ved I
I 10 yg/ml var af tilsvarende størrelsesorden som rTNF. I
I Parvise kombinationer af disse mediatorer resulterede i I
I additive eller lidt mindre end additive virkninger I
I 30 på ICAM-1 ekspression (Tabel 3). Kryds-titrering af I
I rTNF med rIL-1-β eller rIFN-y viste ingen synergisme I
I mellem disse ved suboptimale eller optimale koncentra- I
I tioner. I
I Eftersom LPS øgede ICAM-l-ekspression på endo- I
I 35 telceller i koncentrationer, der under tiden findes I
I i dyrkningsmedier, undersøgtes den mulighed at den ba- I
55 DK 175362 B1 sale ICAM-1-ekspression kan skyldes LPS. Når adskillige serumbatches testedes viste det sig, at lav-endotoxin-serum gav lavere lCAM-1-basal-ekspression ved 25%. Alle de her angivne resultater var for endotelceller dyr-5 ket 1 lav-endotoxinserum. Inkluderingen af det LPS-neutraliserende antibiotikum polymyxin B ved 10 yg/ml mindskede imidlertid kun ICAM-l-ekspressionen yderligere 25% (Tabel 3). Øgningen i ICAM-l-ekspresion ved behandling med IL-1 eller TNF påvirkedes ikke ved nær-10 værelse af 10 yg/ml polymyxin B, hvilket er i overensstemmelse med de lave endotoxinkoncentrationer i disse præparater (Tabel 3).
I DK 175362 B1
I 56 I
I Tabel 3 I
I Anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer. I
I Tilstand (16 timer) 125I Specifik bundet (CPM) I
I 5 HUVEC HSVEC I
I Kontrol 603 + 11 - 1132 + 31 I
100 ng/ml rIL-1 beta 5680 + 633 9x 8320 +766 7,3x I
I 50 ng/ml rIL-1 alpha 9910 + 538 16x - - I
50 ng/ml rTNF alpha 9650 ± 1500 16x 12690 +657 11,2x I
10 øg/ml IPS 9530 ± 512 16x 10459 + 388 9,2x υ 10 ng/ml riFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 + 664 3,5x
I rlL-1 beta + rTNF 1469 ± 1410 24x 16269 + 660 14x I
rIL-1 beta + LPS 13986 + 761 . 23x 10870 + 805 lOx
I rIL-1 beta + rIFN gamma 7849 + 601 13x 8401 + 390 7,4x I
rTNF + LPS 15364 + 1241 24x 1614Γ+ 1272 14x I
rTNF + rIFN gamma 13480 + 1189 22x 13238 + 761 12x I
15 LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 + 668 ΙΟχ I
I polymyxin B (10 /ig/ml) 480 + 23 - I
I polymyxin B + rIL-1 5390 +97 lix - I
I polymyxin B + rTNF 9785 + 389 20x - - I
1 /xg/ml LPS 7598 + 432 13x -
polymyxin B + LPS 510 + 44 Ι,ΐχ I
I 20 I
I Opregulering af ICAM-l-ekspression på HVEC og HSVEC- I
I HUVEC eller HSVEC podedes i plader med 96-brønde ved I
I 25 1:3 fra et sammenflydende monolag og fik lov til at gro I
I til sammenløb. Cellerne behandledes dernæst med de I
I angivne materialer eller medier i 16 timer, og RIA I
udførtes son ved fremgangsmåder. Alle punkter gennemførtes I
I 4 gange. I
I 30
I Eksempel 12 I
I Kinetik af interleukin 1 og γ-interferon- I
I induktion af ICAM-1.
I Kinetikken af interleukin 1 og y-interferon- I
I 35 virkninger på ICAM-l-ekspression på dermale fibro- I blaster bestemtes under anvendelse af 125l gede- --~ · ' 1 ~ T .....------ ~ v··*- ~Γί~^ - v-'.,r?^ :-V- ·-*·» ::.<-^^wm DK 175362 B1 57 anti-muse-lgG-bindingsprøven ifølge Dustin, M.L. et al.
(J, Immunol. 137:245-254 (1986); hvilken reference inkorporeres heri i kraft af henvisning dertil). Til gennemførelse af denne bindingsprøve, dyrkedes humane, 5 dermale fibroblaster i en 96-brøndes mikrotiterplade til en tæthed på 2-8 x 104 celler/brønd (0,32 cm2).
Cellerne vaskedes 2 gange med RPMI 1640 medium suppleret som beskrevet i eksempel 1. Cellerne vaskedes yderligere en gang med Hanks balancerede saltopløsning 10 (HBSS), 10 mM HEPES, 0,05% NaN3 og 10% varmeinaktiveret fetal bovin serum. Vaskning med denne bindingspuffer gennemførtes ved 4eC. Til hver brønd sattes 50 yl af ovennævnte bindingspuffer og 50 μΐ af den pågældende hybridoma-supernatant med X63 og W6/32 som henholdsvis 15 de negative og positive kontroller. Efter inkubering i 30 minutter ved 4°C under forsigtig omrøring vaskedes brøndene to gange med bindingspuffer, og det andet antistof 125I-gede-anti-muse-IgG, tilsattes ved 50 nCi i 100 yl. 12^I-gede-anti-muse-antistoffet fremstilledes 20 under anvendelse af Iodogen (Pierce) i overensstemmelse med fremgangsmåden af Fraker, P.J. et al. (Biochem.
Biophys. Res. Commun. 80:849 (1978)). Efter 30 min.
ved 4°C vaskedes brøndene to gange med 200 μΐ bindingspuffer og cellelaget opløstes ved tilsætning af 100 25 pi 0,1 N NaOH. Dette og en 100 yl vask taltes i en Beckman 5500 γ-counter. Det specifikke antal counts per min. beregnedes som [cpm med monoklonalt antistof]-[cpm med X63]. Alle trin, herunder induktion med specifikke reagenser, gennemførtes 4 gange.
30 virkningen af interleukin 1 med en halverings tid for ICAM-1-induktion på 2 timer var hurtigere end virkningen af γ-interferon med en halveringstid på 3,75 timer (fig. 6). Tidsforløbet til returnering til resterende koncentrationer af ICAM-1 viste sig at være af-35 hængig af cellecyklusen eller hastigheden af celle- ! vækst. I hvilende celler er interleukin 1 og y- I DK 175362 B1 56 H interferonvirkninger stabile i 2-3 dage, hvorimod ICAM-l-ekspressionen afbildet som logfasekulturer er nær grundlinien 2 dage efter fjernelsen af disse indu- ærende midler.
5 Dosis-responskurver for induktionen af ICAM-1 ved rekombinant muse- og human interleukin 1 og for H rekombinant human γ-interferon er vist i fig. 7. y- interferon og interleukin 1 viste sig at have ens H koncentrationsafhængigheder med næsten identiske virk- H 10 ninger ved 1 ng/ml. Humant og rekombinant muse-inter- H leukin 1 havde også næsten ens kurver, men er mindre virkningsfulde end human interleukin 1-præparater ved inducering af ICAM-l-ekspression.
Cyclohexamid, en inhibitor for proteinsyntese, H 15 og actinomycin-D, en inhibitor for mRNA-syntese, op- hæver virkningerne af både interleukin 1 og y-inter- I feron på ICAM-l-ekspression på fibroblaster (Tabel 4).
H Tunicamycin, en inhibitor for N-bundet glycosylering, inhiberede yderligere kun interleukin 1-virkningen 20 med 43%. Disse resultater indikerer at protein- og mRNA-syntese, men ikke N-bundet glycosylering er nød- H vendig for interleukin l- og y-interferon-stimulerede øgninger i ICAM-l-ekspression.
DK 175362 B1 59 TABEL 4
Virkninger af cycloheximid, actinomycin D og tunica-mycin på ICAM-1-induktion med IL-l og γ-IFN på humane, dermale fibroblaster3.
5 3I Gede-Anti-Muse IgG
Specifikt bundet (cmp)
Behandling_anti-ICAM-1 anti-HLA-A.B.C
Kontrol (4 timer) 1524 ± 140 11928 + 600 + cycloheximide 1513 ± 210 10678 + 471 10 + actinomycin D 1590 + 46 12276 ± 608 + tunicamycin 1461 ± 176 12340 + 940 IL 1 (10 U/ml) (4 timer) 4264 ± 249 12155 + 510 + cycloheximide 1619 ± 381 12676 + 446 + actinomycin D 1613 ± 88 12294 ± 123 + tunicamycin 3084 ± 113 13434 i 661 15 IFN-γ (10 U/ml) (18 timer) 4659 ± 109 23675 ± 500 + cycloheximide 1461 + 59 10675 + 800 + actinomycin D 1326 ± 186 12089 + 550 1 aHumane fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x 104 celler/0,32 cm2 brønd. Behandlinger gennemførtes i et slutvolumen på 50 yl indeholdende de angivne reagenser.
25 Cycloheximid, actinomycin D og tunicamycin tilsattes i henholdsvis 20 yg/ml, 10 yM og 2 yg/ml samtidig med cytokinerne. Alle punkter er middelværdier fra fire bønde + standardafvigelse.
Η I
I DK 175362 B1 I 60
I Eksempel 13 I
I ICAM-l1 s vævsfordeling.
I Histokemiske studier gennemførtes på frosset væv H fra menneskeorganer til bestemmelse af fordelingen af H 5 ICAM-l i thymus, lymfeknuder, tarm, hud, nyrer og I lever. Til gennemførelse af en sådan analyse fikseredes I frosne vævsstykker (4 μιη tyk) af normalt, humant væv i acetone i 10 min. og farvedes med det monoklonale anti- stof RRl/l ved en immunoperoxidaseteknik, under anven- 10 delse af avidin-biotin-kompleksmetoden (Vector Labora- tories, Burlingame, CA) beskrevet af Cerf-Bensussan, N.
I ' et al. (J. Immunol. 130:2615 (1983)). Efter inkubering med antistoffet, inkuberedes stykkerne fortløbende med H biotinylerede heste-anti-muse-IgG og avidin- 15 biotinylerede peroxidasekomplekser. Stykkerne dyppedes til sidst i en opløsning indeholdende 3-amino-9-ethyl- I carbazol (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) til udvikling af en farvereaktion. Stykkerne fikseredes dernæst i 4% formaldehyd i 5 min. og modfarvedes med I 20 hematoxylin. Kontroller omfattede stykker inkuberet med ikke-relaterede monoklonale antistoffer i stedet for I RRl/l-antistoffet.
ICAM-l viste sig at have en fordeling, der i det væsentlige er lig med den hos størstedelen af I 25 histokompatibilitétskompleks (MHC) klasse II antigener- I ne. De fleste blodkar (både små og store) i alt væv I viste farvning af endotelceller med ICAM-l-antistof.
Den vaskulære endotelfarvning var mere intens i de I interfoliikulære (paracorticale) områder i lymfeknuder,
I 30 tonsiler og Peyer's "patches" i sammenligning med I
I kar i nyre, lever og normal hud. I leveren var farvnin- I gen i det væsentlige begrænset til sinusformede be- I klædningsceller; hepatocytterne og endotelcellerne, som indvendigt beklæder de fleste portalvenerne og ar- 35 terierne var ikke farvede.
I I thymusmarven observeredes diffus farvning af
I store celler og et dentritisk farvningsmønster. I
61 DK 175362 B1 cortex var farvningsmønsteret focalt og i det væsentlige dentritisk. Thymocytter var ikke farvede. I det perifere lymfoide væv var de sekundære lymfoide folliklers germinale centerceller intenst farvede. I nogle 5 lymfoide follikler var farvningsmønstret i det væsentlige dentritisk uden genkendelig farvning af lymfocytter. Der observeredes desuden svag farvning af celler i kappezonen. Dendritiske celler med cytoplasmiske udstrækninger (interdigiterende reticulumceller) og et 10 lille antal lymfocytter i de interfollikulære eller paracorticale områder var desuden farvet med ICAM-1-bindingsantistoffet.
Celler, der lignende makrofager, var farvet i lymfeknuderne og tyndtarmens lamina propria. Fibro-15 blast-lignende celler (spindelformede celler) og dendritiske celler spredt i stroma og de fleste af de undersøgte organer farves med ICAM-l-bindingsanti-stoffet. Der konstateredes ingen farvning i de Langerhanske/indeterminante celler i epidermis. Der 20 konstateredes ingen farvning i glat muskelvæv.
Farvningen af epitelceller kunne tilsvarende ses i tonsilernes mucosa. Skønt hepatocytter, galdekanal-epitelium, intestinale epitelceller og rørformede epitelceller i nyrer i de fleste tilfælde ikke farves, 25 viste stykker af normal nyrevæv, opnået fra et nephrek-tomiprøvestykke med nyrecellecarcinoma, farvning af mange proximale rørformede celler for ICAM-1. Disse rørformede epitelceller farves desuden med et anti-HLA-DR-bindingsantistof.
30 Sammenfattende eksprimeres ICAM-1 på ikke-hema- topoietiske celler, såsom vaskulære endotelceller og på hæmatopoietiske celler, såsom vævsmakrofager og mitogen-stimulerede T-lymfocytblaster. ICAM-1 viste sig at blive eksprimeret i små mængder på perifere blod-35 lymfocytter.
I DK 175362 B1 I
I 62 I
I Eksempel 14 I
I Rensningen af ICAM-l ved monoklonalt antistof I
I afflnltetschromatoqrafl I
I 5 Generelt rensningsskema. I
I ICAM-l rensedes fra humane celler eller væv un- I
I der anvendelse af monoklonalt antistof-affinitetschro- I
matografi. Monoklonalt antistof, RRl/l, reaktivt over- I
I for ICAM-l rensedes først og kobledes til en inert ko- I
I 10 lonnematrix. Dette antistof er beskrevet af Rothlein, I
I R et al. J. Immunol. 137:1270-1274 (1986), og Dustin, I
I M.L. et al. (J. Immunol. 137:245 (1986). ICAM-l solubi- I
I liseredes fra cellemembraner ved lysering af cellerne I
I i en ikke-ionisk detergent, Triton X-100, nær en neu- I
I 15 tral pH-værdi. Cellelysatet indeholdende opløst ICAM-l I
I passeredes dernæst gennem prækolonner bestemt til fjer- I
I nelse af materialer, der binder ikke-specifikt til ko- I
I lonnematrixmaterialet, og dernæst gennem den monoklona- I
I le antistof-kolonnematrix, der gør det muligt for I
I 20 ICAM-l at binde til antistoffet. Antistofkolonnen va- I
I skedes dernæst med en serie af detergentvaskepuffere I
med stigende pH-værdi op til pH 11,0. Under disse vask- I
I ninger forblev ICAM-l bundet til antistofmatrixen, me- I
I dens ikke-bindende og svagt bindende forurenende mate- I
I 25 rialer fjernedes. Det bundne ICAM-l elueredes dernæst I
I specifikt fra kolonnen ved tilførsel af en detergent- I
I puffer med pH 12,5. I
I Rensning af monoklonalt antistof RRl/l og covalent kob- I
30 ling til Sepharose CL-4B. I
I Det anti-ICAM-1 monoklonale antistof RRl/l ren- I
I sedes fra ascitesvæske fra hybridoma-bærende mus, el- I
I ler fra hybridoma-kultursupernatanter ved standard- I
I teknikker for ammoniumsulfatudfældnings- og protein A- I
I 35 affinitetschromatografi (Ey et al., Immunochem. 15: I
429 (1978)). Det rensede IgG, eller rotte-IgG (Sigma I
Μ»—m— -«'»«iwiv-,··, ir .-i-- — iwl·» ·— .. - -----r-ττ.__ *. ·- πτ'-^φ^ -. · ,·.......- r*'· -m DK 175362 B1 63
Chemical Co., St. Louis, MO) kobledes covalent til Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Sverige) under anvendelse af en modifikation af fremgangsmåden af March et al. (Anal. Biochem. 60:149 (1974)). Kort for-5 talt vaskedes Sepharose CL-4B i destilleret vand, aktiveret med 40 mg/ml CNBr i 5 M K2HP04 (pH ca. 12) i 5 min. og vaskedes dernæst ekstensivt med 0,1 mM HCl ved 4°C. Det filtrerede, aktiverede Sepharose resuspen-deredes med en tilsvarende mængde renset antistof 10 (2-10 mg/ml i 0,1 M NaHC03, 0,1 M NaCl). Suspensionen inkuberedes i 18 timer ved 4°C under nænsom "end-over-end"-rotation. Supernatanten kontrolleredes dernæst for ubundet antistof ved absorbans ved 280 nm, og resterende reaktive steder på det aktiverede Sepharose blev 15 mættet ved tilsætning af glycin til 0,05 M. Koblingsvirkningsgraden var sædvanligvis over 90%.
Deterqentsolubillsering af membraner fremstillet ud fra human milt.
20 Alle fremgangsmåder gennemlførtes ved 4°C. Fros sen, human milt (200 g fragmenter) fra patienter med hårcelleleukemi optøedes på is i 200 ml Tris-saltop-løsning (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4 ved 4°C) indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,2 25 E/ml aprotinin og 5 mM iodacetamid. Vævet blev skåret i små stykker og homogeniseret ved 4°C med en Tekmar power homogenisator. Voluminet øgedes dernæst til 300 ml med Tr is-sal topløsning, og 100 ml 10% Tween 40 (polyoxyethylensorbitanmonopalmitat) i Tris- 30 saltopløsning tilsattes til opnåelse af en endelig koncentration på 2,5% Tween 40.
Til fremstilling af membraner ekstraheredes homogenatet med tre slag fra en Dounce eller, mere foretrukket, en Teflon Potter Elvejhem homogenisator 35 og centrifugeredes dernæst ved 1000 x g i 15 min. Supernatanten bevaredes og pelleten reekstraheredes med I DK 175362 B1 I 64
I 200 ml 2,5% Tween 40 i Tris-saltopløsning. Efter een- I
I trifugering ved 1000 x g i 15 min. samledes superna- I
I tanterne fra begge ekstraktioner og centrifugeredes ved I
150.000 x g i 1 time til pelletering af membranerne.
I 5 Membranerne vaskedes ved genopslæmning i 200 ml Tris- I saltopløsning og centrifugeredes ved 150.000 x g i I 1 time. Membranpelleten genopslaEmmedes i 200 ml Tris- saltopløsning og homogeniseredes med en motoriseret ho- mogenisator og en teflonstøder indtil suspensionen var 10 ensartet uklar. Voluminet øgedes dernæst til 900 ml med
Tris-saltopløsning og N-lauroylsarcosin tilsattes til I en slutkoncentration på 1%. Efter omrøring ved 4°C i 30 I min. fjernedes uopløseligt materiale i detergentlysatet I ved centrifugering ved 150.000 x g i 1 time. Triton 15 X-100 sattes dernæst til supernatanten til en slutkon- I centration på 2%, og lysatet omrørtes ved 4°C i 1 time.
I Detergentsolubiliserinq af JY B-lymfoblastoidceller.
20 Den EBV-transformerede B-lymfoblastoidcelle- I linie JY dyrkedes i RPMI-1640 indeholdende 10% fetal I kalveserum (FCS) og 10 mM HEPES til en tæthed på I ca. 0,8-1,0 x 106 celler/ml. For at øge celleoverflade- I ekspressionen af ICAM-1 tilsattes phorbol-12-myristat- I 25 13-acetat (PMA) til 25 ng/ml i 8-12 timer før høst af cellerne. Natriumvanadat (50 μΜ) sattes også til I kulturerne i dette tidsrum. Cellerne pelleteredes
I ved centrifugering ved 500 x g i 10 min., og vaskedes J
2 gange i Hank's balancerede saltopløsning (HBSS) ved 30 genopslæmning og centrifugering. Cellerne (ca. 5 g per I 51 kultur) lyseredes i 50 ml lysispuffer (0,14 M NaCl, I 50 mM Tris pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,2 E/ml aprotinin, I 1 mM PMSF, 50 μΜ natriumvandat) under omrøring ved 4°C i 30 min. Ikke-lyserede kærner og uopløselige brud- I 35 stykker fjernedes ved centrifugering ved 10.000 x g i I 15 min. efterfulgt af centrifugering af supernatanten 65 DK 175362 B1 ved 150.000 x g i 1 time og filtrering af supernatanten gennem Whatman 3 mm filterpapir.
Affinltetschromatoqrafi af ICAM-1 til strukturunder-5 søqelser.
Til rensning i stor skala af ICAM-1, som skal benyttes ved strukturstudier, benyttedes en kolonne med 10 ml RRl/l-Sepharose CL-4B (koblet ved 2,5 mg antistof/ml gel), og to 10 ml præ-kolonner med CNBγιο aktiveret, glycin-quenched Sepharose CL-4B, og rotte-IgG koblet til Sepharose CL-4B (2 mg/ml) benyttedes. Kolonnerne blev serieforbundet og præ-vasket méd 10 kolonne-voluminer lysispuffer, 10 kolonnevoluminer puffer på pH 12,5 (50 mM triethylamin, 0,1% Triton X-100, 15 pH 12,5 ved 4°C), efterfulgt af ligevægtsindstilling med 10 kolonnevoluminer lysispuffer. En liter af deter-gentlysat af human milt tilførtes med en strømhastighed på 0,5-1,0 ml per min. De to præ-kolonner benyttedes til fjernelse af ikke-specifikt bindingsmateriale fra 20 lysatet før passage gennem RRl/l-Sepharose-kolonnen.
Efter tilsætningen vaskedes RRl/l-Sepharose-kolonnen og bundet ICAM-1 fortløbende med en strømhastighed på 1 ml/min. med mindst 5 kolonnevoluminer af hver af de efterfølgende: 1) lysispuffer, 2) 20 mM 25 Tris pH 8,0/0,14 M NaCl/0,1% Triton X-100, 3) 20 mM glycin pH 10,0/0,1% Triton X-100, og 4) 50 mM tri ethylamin pH 11,0/0,1% Triton X-100. Alle vaskpuffere indeholdt 1 mM PMSF og 0,2 E/ml aprotinin. Efter vask-ningen elueredes det resterende bundne ICAM-1 med 30 5 kolonnevoluminer elueringspuffer (50 mM triethyl- amin/0,1% Triton X-100/pH 12,5 ved 4°C) med en strømningshastighed på 1 ml/3 min. Det eluerede ICAM-1 opsamledes i 1 ml fraktioner og neutraliseredes straks ved tilsætning af 0,1 ml 1 M Tris, pH 6,7. Fraktionerne 35 indeholdende ICAM-1 identificeredes ved SDS-polyacryl-amidelektroforese af 10 yl aliquoter (Springer et al.,
I DK 175362 B1 I
I 66 I
I Exp. Med. 160:1901 (1984)), efterfulgt af sølvfarv- I
I ning (Morrissey, J.H., Anal. Biochem♦ 117:307 (1981)). I
I Under disse betingelser var hovedmængden af ICAM-1 I
elueret i ca. 1 kolonnevolumen og var mere end 90% rent I
5 bedømt ud fra sølvfarvede elektropherogrammer (en lille I
I mængde igG, udvasket fra affinitetsmatrixen, var den I
I største forurener). Fraktionerne indeholdene ICAM-1 I
samledes i en pulje og koncentreredes ca. 20 gange ved I
hjælp af Centricon-30-mikrokoncentratorer (Amicon, I
I 10 Danvers, MA). Det rensede ICAM-1 mængdebestemtes ved I
I Lowry-proteinprøve af en ethanol-præcipiteret aliquot I
I fra puljen: Ca. 500 yg rent ICAM-1 produceredes ud fra I
I 200 g human milt. |
I Ca. 200 yg renset ICAM-1 udsattes for en I
15 andentrins rensning ved præparativ SDS-polyacrylamid- I
gel-elektroforese. Båndet, der repræsenterer ICAM-1, I
blev gjort synligt ved gennemblødning af gelen i 1 Μ I
I KCl. Det gelområde, som indeholdt ICAM-1, blev dernæst I
udskåret og elektroelueret i overensstemmelse med frem- I
I 20 gangsmåden af Hunkapiller et al., Meth. Enzymol. 91: I
I 227-236 (1983). Det rensede protein var mere end 98% I
I rent bedømt ved SDS-PAGE og sølvfarvning. I
I Affinitetsrensning af ICAM-1 til funktionelle studier. I
I 25 ICAM-1 til anvendelse i funktionelle studier I
I rensedes fra detergentlysater af JY-celler som be- I
I skrevet ovenfor, men i mindre målestok (en 1 ml kolonne I
af RRl/l-Sepharose) og med følgende modifikationer. I
I Alle opløsninger indeholdt 50 yM natriumvanadat. Efter I
30 vaskning af kolonnen med pH 11,O-puffer indeholdende I
0,1% Triton X-100, vaskedes kolonnen igen med fem I
I kolonnevoluminer af den samme puffer indeholdende I
I 1% n-octyl-p-D-glucopyranosid (octylglucosid) i stedet I
I for 1,0% Triton X-100. Octylglucosid-detergenten I
I 35 fortrænger Triton X-100 bundet til ICAM-1 og modsat I
Triton X-100 kan det senere fjernes ved dialyse. I
67 DK 175362 B1 ICAM-1 elueredes dernæst med pH 12,5-puffer indeholdende 1% octylglucosid i stedet for 0,1% Triton X-100, og analyseredes og koncentreredes som beskrevet ovenfor.
5 Eksempel 15
Karakteristika af renset ICAM-1.
ICAM-l renset fra human milt migrerer i SDS-polyacrylamid-geler som et bredt bånd med Mr på 72.000 til 91.000. ICAM-1 renset fra JY-celler migrerer også 10 som et bredt bånd med Mr på 76.500 til 97.000. Disse Mr ligger indenfor det angivne område for ICAM-l immuno-præcipiteret fra forskellige cellekilder: Mr=90.000 for JY-celler, 114.000 på den myelomonocytiske cellelinie U937 og 97.000 på fibroblaster (Dustin et al., J.
15 Immunol. 137:245 (1986)). Dette brede område i Mr tilskrives en extensiv, men variabel grad af glyco-sylering. Den ikke-glycosylerede precursor har en Mr på 55.000 (Dustin et al.). Proteinet renset enten fra JY-celler eller human milt bevarer dets antigene virk-20 ning som godtgjort af dets evne til at genbinde til den oprindelige affinitetskolonne og ved immunopræcipita-tion med RRl/l-Sepharose og SDS-polyacrylamidelektro-forese.
Til fremstilling af peptidfragmenter af ICAM-1 25 reduceredes ca. 200 yg med 2 mM dithiothreitol/2% SDS, efterfulgt af alkylering med 5 mM iodeddikesyre. Proteinet udfældedes med ethanol og genopløstes i 0,1 M NH4CO3/O,1 mM CaCl2/0,l% zwittergent 3-14 (Calbio-chem), og underkastedes digestion med 1 vægt% trypsin 30 ved 37°C i 4 timer, efterfulgt af yderligere digestion med 1% trypsin i 12 timer ved 37°C. De tryptiske peptider rensedes ved omvendt-fase HPLC under anvendelse af en 0,4 x 15 cm C4-kolonne (Vydac). Peptiderne elueredes med en lineær gradient på 0% til 60% acetonitril i 0,1% 35 trifluoreddikesyre. Udvalgte peptider underkastedes sekvensanalyse på en gasfasemikrosekVenator (Applied I DK 175362 B1
I 68 I
Biosystems). Sekvensinformationen opnået fra dette I
studium er vist i Tabel 5. I
DK 175362 B1 69
Tabel 5
Aminosvresekvenser af iCAM-i-tryptlske peptider.
Amino- Peptid syre- _ 5 rest 50a 5Qb 46a 46b 1 45 K AA J U 0 Ml
1 [T/V] A (V/A) E VS LE A L V L
2 F SQ PEFNLGLTl/E
3 L IT ALPPDSGL P/(G)
4 T SF AATLVI P
SV LP P P VR LE G/Y
in 6 Y G L LNTPVT N/L
iU 7 P W P P V Y Q T P (N) 8 T P I I T/I G G C P/V (Q) 9 S F G (G) L - L S K (E) 10 E E (Q) - D E T (D)
11 A S D/P K S L S
12 G/S V V P F F C
13 A T DQSED
15 14 G V W V/L A - Q
15 I K T P
16 S K
17 A
18 P
19 X
20 Q
20 21 L
( ) = Lav konfidenssekvens.
[ ] = Meget lav konfidenssekvens.
25 / - Indikerer flertydelighed i sekvensen; den mest sandsynelige aminosyre er angivet først, a = Større peptid, b. = Mindre peptid.
I DK 175362 B1 I 70 I Eksempel 16 I Kloning af ICAM-l-genet.
I Genet for ICAM-1 kan klones under anvendelse af I enhver af en lang række fremgangsmåder. F.eks. kan ami- I 5 nosyresekvensinformationen, opnået gennem sekvenserin-
I gen af de tryptiske fragmenter af ICAM-1 (Tabel 5), be- I
I nyttes til identificering af en oligonucelotidsekvens,
I som vil svare til ICAM-l-genet. ICAM-l-genet kan alter- I
nativt klones under anvendelse af anti-ICAM-l-antistof
I 10 til detektering af kloner, som producerer ICAM-1. I
I Kloning af genet for ICAM-1 gennem anvendelsen af I
I oligonucleotidprober. I
I Under anvendelse af den gentiske kode (Watson, I
I 15 J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3. udg. Ed., I
I W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), kan et el- I
I ler flere forskellige oligonucleotider identificeres, I
I som hver især vil være i stand til at kode for de ICAM- I
I 1 tryptiske peptider. Sandsynligheden for at et særligt I
I 20 oligonucleotid i virkeligheden udgør den aktuelle ICAM- I
I 1-kodende sekvens kan bedømmes ved betragtning af I
I abnorme baseparforhold og hyppigheden med hvilken et I
I særligt codon faktisk benyttes (for at kode for en I
I særlig aminosyre) i eukaryotiske celler. Sådanne "codon I
I 25 kutymeregler" er angivet af Lathe, R., et al., J. I
I Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Ved anvendelse af "codon I
I kutymereglerne" af Lathe, identificeres et enkelt I
I oligonucleotid, eller et sæt af oligonucelotider, I
I som indeholder en teoretisk "mest sandsynlig" nucleo- I
I 30 tidsekvens (dvs. den nucleotidsekvens, der har det I
I mindste overskud), som er i stand til at kode for I
I de ICAM-1 tryptiske peptidsekvenser. I
I Oligonucleotidet eller sættet af oligonucleoti- I
I der, der indeholder den teoretiske "mest sandsynlige" I
I 35 sekvens, der er i stand til at kode for ICAM-1 fragmen- I
I terne benyttes til identificering af sekvensen af et I
71 DK 175362 B1 komplementært oligonucleotid eller sæt af oligonucleo-tider, som er i stand til at hybridisere til den "mest sandsynlige" sekvens, eller sæt af sekvenser. Et oligonucleotid indeholdende en sådan komplementær sekvens 5 kan anvendes som en probe til identificering og isolering af ICAM-l-genet (Maniatis, T., et al.. Molecular Cloning A Laborlatorv Manual, Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, NY (1982).
Som beskrevet i afsnit C ovenfor, er det muligt 10 at klone ICAM-l-genet fra eukaryoetiske DNA-præparater, som formodes at indeholde dette gen. Til identificering og kloning af genet, som koder for ICAM-1-proteinet, underkastes et DNA-bibliotek screening for dets evne til at hybridisere med de ovennævnte oligonucleotidpro-15 ber. Da det er sandsynligt at der kun vil være to kopier af genet for ICAM-1 i en normal diploid celle, og fordi det er muligt at dette ICAM-l-gen kan indeholde store ikke-transkriberede mellemliggende sekvenser (introner), hvis kloning ikke er ønsket, er det ønske-20 ligt at isolere ICAM-l-kodende sekvenser fra et cDNA-bibliotek fremstillet ud fra mRNA fra en ICAM-1-producerende celle fremfor fra genomisk DNA. Egnede DNA eller cDNA præparater spaltes enzymatisk eller klippes tilfældigt og ligeres i rekombinant vektorer.
25 Disse rekombinante vektorers evne til at hybridisere til ovennævnte oligonucleotidprober måles dernæst. Fremgangsmåder til hybridisering er angivet f.eks. i Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) 30 eller i Haymes, B.T., et al., Nucleic Acid Hybridization a Practicial Approach, IRL Press, Oxford, England (1985). Vektorer, som viste sig at være i stand til en sådan hybridisering analyseres dernæst til bestemmelse af udstrækningen og naturen af de ICAM-l-sekvenser som 35 de indeholder. Baseret på rent statistiske betragtninger kunne et gen, såsom det der koder for ICAM-1-
I DK 175362 B1 I
I 72 I
I molekylet, identificeres entydigt (via hybridiserings- I
I screening) under anvendelse af en oligonucleotidprobe I
I med kun 18 nucleotider. I
I Den aktuelle identifikation af ICAM-1-peptid- I
I 5 sekvenser tillader således kort fortalt identifikatio- I
nen af en teoretisk "mest sandsynlig" DNA-sekvens eller I
I et sæt af sådanne sekvenser, der er i stand til at kode I
I for et sådant peptid. Ved konstruktion af et oligonu- I
cleotid komplementært til denne teoretiske sekvens I
I 10 (eller ved konstruktion af et sæt af oligonucleotider I
I komplementære til sættet af de "mest sandsynlige" oli- I
I gonucleotider), opnås et DNA-molekyle (eller sæt af I
I DNA-molekyler), der er i stand til at fungere som en I
I probe til identifikation og isolering af ICAM-l-genet. I
I 15 Under anvendelse af de i tabel 5 angivne ICAM-1- I
I peptidsekvenser, bestemtes sekvensen af den "mest sand- I
I synlige" sekvens af et oligonucleotid, der er i stand I
I til at kode for AA- og J-peptider (henholdsvis Tabel 6 I
I og 7). Oligonucleotider komplementære til disse sekven- I
I 20 ser syntetiseredes og rensedes til anvendelse som pro- I
ber til isolering af ICAM-l-gensekvenser. Egnede I
I størrelse-selekterede cDNA-biblioteker produceredes ud I
fra poly(A)+ RNA fra begge PMA-inducerede HL-60 celler I
I og fra PS-stimulerede umbilicalveneendotelceller. Et I
I 25 størrelse-selekteret cDNA-bibliotek fremstilledes un- I
I der anvendelse af poly(A)+ RNA fra PMA-inducerede I
HL-60 celler i overensstemmelse med fremgangsmåden af I
I Gubier, U., et al. ((Gene 25:263-269 (1983)) og Corbi, I
A., et al. (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)), hvilke refe- I 30 rencer inkorporeres heri ved henvisningerne dertil.
Et størrelse-selekteret cDNA-bibliotek fremstil- I ledes under anvendelse af poly(A)+ RNA fra umbilicalve- I ne-endotelceller, som havde været stimuleret i 4 timer med PS 5 pg/ml. RNA ekstraheredes ved homogenisering af I 35 cellerne i 4 M guanidiniumisothiocyanat og udsættelse af supernatanten for ultracentrifugering gennem en CsCl 73 DK 175362 B1 gradient (Chirgwin, J. M., et al., Biochem. 18:5294-5299 (1979)). Poly(A)+ RNA isoleredes fra blandingen af totale RNA-stykker via anvendelsen af oligo-(dT)-cellu-losechromatografi (Type 3, Collaborative Research) 5 ( Aviv, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69: 1408-1412 (1972).
I DK 175362 B1 I
I 74 I
I Tabel 6 I
I Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige I
I nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for I
I iCAM-l-AA-peptidet. I
I 5____ I
I Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær I
I syrerest AA-peptid sekvens, der sekvens I
I af ICAM-1 koder for AA- I
| peptid I
I —-1 s7 r I
I 10 162 GI u G C I
I A T I
I G C I
I 163 Leu C G I
I T A I
I G C I
I 164 Asp G C I
I AT I
I 15 CG I
I 165 Leu C G I
I T A I
I G C I
I 166 Arg CG I
I G C I
I G C I
I 20 167 Pro c G I
I CG I
I C G I
I 168 Gin c G I
I A T I
I G C I
I 169 Gly G C I
I 25 G C I
U CG I
I 170 Leu C G I
I T A I
I G C I
I 171 Glu G C I
I AT I
I G C I
I 30 172 Leu C G I
I T A I
I G C I
I 173 Phe T A I
I T A I
I T A I
I 174 Glu G C I
I 35 AT I
I G C l
I 3' 5' I
DK 175362 B1 75
Tabel 6 (forsat)
Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for ICAM-l-AA-peptidet.
5 ________
Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der sekvens af ICAM-1 koder for AA- peptid _, - - - m__ r * -~~ · -----
10 175 Asn A T
C G
176 Thr A T
u C G
C G
177 Ser U A
1 C G
15 A
3' 5' i
I DK 175362 B1 I
I 76 I
I Tabel 7 I
I Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige I
I nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for I
I ICAM-1-J-peptidet. I
I 5 __
I Amino- ICAM-l Mest sandsynlig Komplementær I
I syrerest AA-peptid sekvens, der sekvens I
I af ICAM-1 koder for AA-
I peptid__ I
I 10 5' 3' I
I 19 Val G C
I T A I
G C I
I 20 Thr A T I
I C G I
CG
I 15 21 Cys J i
I CG
22 Ser T A I
I CG
I CG
I 23 Thr AT
I i . i
I 24 Ser T A I
I C G I
I CG
I 25 Cys l c
I T A I
25 26 Asp 6 c I
I AT
I CG
I 27 Gin C G I
I a T I
I G C I
I 28 Pro CG I
I O c
I 29 Lys A T I
ATI
I 3' 5' I
- — - · - --I. - w»Bsr:;rc — .77·- ·_ΐ - · v: 'TFUm,1»' .ιμ.μ.,^ΊΜ· DK 175362 B1 77 Første streng-cDNA syntetiseredes under anvendelse af 8 pg poly(A)+ RNA, avian myeloblastosis virus revers transkriptase (Life Sciences) og en oligo(dT) primer. DNA-RNA-hybridet underkastedes digestion med 5 RNase H (BRL) og den anden streng syntetiseredes under anvendelse af DNA-polymerase I (New England Biolabs).
Produktet methyleredes med Eco Rl-methylase (New England Biolabs), blunt-end ligeredes til Eco Rl-linke-re (New England Biolabs), underkastedes digestion med 10 Eco RI og størrelse-selekteredes på en agarosegel med lavt smeltepunkt. cDNA større end 500bp ligeredes til XgtiO, som i forvejen havde været underkastet digestion med Eco Ri og dephosphoryleret (Stratagene). Ligeringsproduktet pakkedes dernæst (Stratagene gold).
15 Umbilicalveneendotelcellen og HL-60 cDNA- biblioteker udpladedes dernæst ved 20.000 PFU/150 mm plade. Rekombinant DNA dobbeltoverførtes til nitrocellulosefiltre, denatureredes i 0,5 M NaOH/l,5M NaCl, neutraliseredes i 1M Tris, pH 7,5/l,5M NaCl og bagtes 20 ved 80eC i 2 timer (Benton, W.D., et al., Science 196: 180-182 (1977)). Filtre præhybridiseredes og hybridi-seredes i 5X SSC indeholdende 5X Denhardt’s opløsning, 50 mM NaP04 og 1 yg/ml laksesperm DNA. Præhybridise-ring gennemførtes ved 45°C i 1 time.
25 Hybridiseringen gennemførtes under anvendelse af 32bp (5 '-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) eller 47bp ( 5 ' -GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC) anti-sense oligonucleotider baseret på, analogt med ovennævnte, henholdsvis de ICAM-l-tryptiske peptider 30 J og AA (Tabel 6 og 7) (Lathe, R., J. Molec. Biol., 183:1-12 (1985)). Oligonucleotider endemærkedes med γ_(32ρ)Ατρ under anvendelse af T4 polynucleotid-kinase og de betingelser, der anbefales af fabrikanten (New England Biolabs). Efter hybridisering natten over 35 vaskedes filtrene to gange med 2X SSC/0,1% SDS i 30 min. ved 45°C. Fager isoleredes fra disse plaques, I DK 175362 B1 I 78
I hvilke udviste hybridisering og rensedes ved efterfølg- I
I ende genudpladning og rescreening. I
I Kloning af genet for ICAM-1 gennem anvendelsen af anti- I
I 5 ICAM-antistof. I
Genet for ICAM-1 kan alternativt klones gennem anvendelsen af anti-lCAM-l-antistof. DNA eller mere H foretrukket cDNA ekstraheres og renses fra en celle, I som er i stand til at eksprimere ICAM-1. Det rensede I 10 cDNA underkastes fragmentering (ved klipning, endo- I nuclease digestion, osv.) til frembringelse af en pulje H af DNA- eller cDNA-fragmenter. DNA- eller cDNA- fragmenter fra denne pulje kloner dernæst i en ekspres- sionsvektor til produktion af et genomisk bibliotek af 15 ekspressionsvektorer, hvis medlemmer hver indeholder et unikt klonet DNA- eller cDNA-fragment.
Eksempel 17
Analyse af cDNA-klonerne.
20 Fag DNA fra positive kloner underkastedes diges- tion med Eco RI og undersøgtes ved Southern analyse under anvendelse af et cDNA fra én klon som en probe.
Maksimale størrelse-cDNA-indføjninger som kryds- hybridiserede, subklonedes i Eco Rl-stedet i plasmid- I 25 vektor pGEM 4Z (Promega). HL-60 subkloner indeholdende cDNA i begge orienteringer deleteredes ved exonuclease I Ill-digestion (Henikoff, S., Gene 28:351-359 (1984)) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger (Erase- I a-Base, Promega). Progressivt deleterede cDNA1er klone- I 30 des dernæst og udsattes for dideoxynucleotidkædetermi- neringssekvensering (Sanger, F. et al., Proc. Nat'l.
I Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467 (1977) i overensstemmelse I med fabrikantens anbefalinger (Seguenase, U.S.
I Biochemical). HL-60 cDNA 5' og kodende områder sekven- I 35 seredes komplementært på begge strenge og 3'-området I sekvenseredes ca. 70% på begge strenge. En representa- 79 DK 175362 B1 tiv endotel cDNA sekvenseredes over det meste af dens længde ved shotgun kloning af 4bp-genkendelsesrestrik-tionsenzymfragmenter.
cDNA-sekvensen af én HL-60 og én endotelcelle 5 cDNA etableredes (fig. 8). 3023 bp-sekvensen indeholder et kort 5'-ikke-translateret område og et 1,3 kb 3'-ikke-translateret område med et consensus polyadenyle-ringssignal i position 2966. Den længst åbne læseramme begynder med det første ATG i position 58 og slutter 10 med ert TGA terminerende triplet i position 1653. Identitet mellem den translaterede aminosyresekvens og sekvenser bestemt ud fra otte forskellige tryptiske peptider med i alt 91 aminosyrer (understreget i fig. 8) bekræftede at autentiske ICAM-l cDNA-kloner var blevet 15 isoleret. Aminosyresekvenserne af ICAM-l tryptiske peptider er vist i tabel 8.
Tabel 8
Aminosyresekvenser af ICAM-l tryptiske peptider.
20
Peptid Rester Sekvens
J 14- 29 X G S V L VTCSTSCDQPK
U 30-39 L L G I E T P L (P) (K)
50 78- 85 (T) F L T V Y X T
25 X 89-95 V E L A P L P
AA 161-182 X ELDLRPQGLE —
L F E X T S A P X Q L
K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK
45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) 30 _ — Indikerer at sekvensen fortsætter på næste linie. Understregede sekvenser benyttedes til fremstilling af oligonucleotidprober.
Hydrofobicitetsanalyse (Kyte, J. et al ♦, J.
Molec. Biol., 157:105-132 (1982)) foreslår tilstedevæ- 35
I DK 175362 B1 I
I 80 I
I reisen af en 27 restsignalsekvens. Udpegelsen af +1 I
I glutaminet er 1 overensstemmelse med vores manglende I
I evne til at opnå N-terminalsekvens på 3 forskellige I
I ICAM-1-proteinpræparater; glutamin kan cydisere til I
I 5 pyroglutaminsyre, hvilket resulterer i en blokkeret N- I
I terminus. Den translaterede sekvens fra 1-453 er i det I
I væsentlige hydrofil, efterfulgt af et 24 rest-hydrofo- I
I bisk formodet transmembrandomæne. Transmembrandomænet I
I efterfølges af adskillige ladede rester indeholdt i et I
I 10 27 rest formodet cytoplasmisk domæne. I
I Den forudsatte størrelse af den fuldt udviklede I
I polypeptidkæde er 55.219 dalton, hvilket er i udmærket I
I overensstemmelse med den observerede størrelse på I
55.000 for deglycosylerede ICAM-1 (Dustin, M.L. et al., I
I 15 J. Immunol. 3^37;245-254 (1986)). Otte N-linkede glyco- I
I syleringssteder er forudsagt. Manglende asparagin i I
de tryptiske peptidsekvenser af to af disse steder be- I
I kræfter deres glycosylering og deres ekstracellulære I
I orientering. Antages 2.500 dalton pr. høj-mannose N- I
H I
20 bundet carbonhydrat, forudsiges en størrelse på 75.000 I
I dalton for ICAM-1-precursoren i sammenligning med de I
I observerede seks på 73.000 dalton (Dustin, M.L., et I
I al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Efter omdannelse I
I af høj-mannosé til kompleks carbonhydrat ligger det I
I 25 fuldt udviklede ICAM-l glycoprotein på 76 til 114 kd, I
I afhængig af celletype 1(Dustin, M.L., et al., J. Immu- I
I nol. 137:245-254 (1986)). ICAM-1 er således et kraftigt I
glycosyleret, men ellers et typisk integralmembran- I
protein. I
I 30
I Eksempel 18 I
ICMA-1 er et inteqrin-bindingsmedlem af immunoglobulin I
I supergenfamilien. I
I Gruppering af ICAM-l-interne gentagelser gennem- I
I 35 førtes under anvendelse af "Microgenie protein align- I
I ment programmet" (Queen, C., et al., Nucl. Acid. Res., I
81 DK 175362 B1 12: 581-599 (1984)) efterfulgt af inspektion. Gruppering af ICAM-1 overfor IgM, N-CAM og MAG gennemførtes under anvendelse af "Microgenie and the ALIGN programmet" (Dayhoff, M.O., et al., Meth. Enzymol. 91:524-545 5 (1983)). Fire proteinsekvensdatabaser, opbevaret ved the National Biomedical Research Foundation, gennemsøg-tes for proteinsekvensligheder under anvendelse af FASTP-programmet af Williams og Pearson (Lipman, D.J., et al., Science 227:1435-1439 (1985)).
10 Eftersom ICAM-1 er en ligand af et integrin, var det uventet, at det ville være et medlem af immunoglobulinsupergenfamilien. Inspektion af ICAM-1-sekvensen viser imidlertid, at den opfylder alle kriterier, der foreslås for medlemsskab af immunoglobulin-15 supergenfamilien. Disse kriterier omtales efter tur i det efterfølgende.
Hele det ektr acellulære område af ICAM-1 er konstrueret ud fra 5 homologe immunoglobulin-lignende områder, som er vist opstillet i fig. 9A. Områder 1-4 20 er henholdsvis 88, 97, 99 og 99 rester lang og er således af typiske Ig områdestørrelse; område 5 er afkortet indenfor 68 rester. Søgninger i NBRF-databasen under anvendelse af FASTP-programmet afslørede signifikante homologier mellem medlemmer af immunoglobulin-25 supergenfamilien, herunder IgM og IgG C områder, T-cellereceptor-a-underenhed variabelt område og α-1-β-glycoprotein (fig. 9B-D).
Under anvendelse af ovennævnte information sammenlignedes aminosyresekvensen af ICAM-1 med aminosyre-30 sekvenserne af andre medlemmer af immunoglobulinsupergenfamilien .
Tre typer af Ig superfamilieområder, V, Cl og C2 er differentieret. Både v- og C-områder er konstrueret ud fra 2 β-plader bundet sammen ved intraområde-35 disulfidbindingen; v-områder indeholder 9 anti-parallelle β-strenge, mens C-områder indeholder 7. Kon- I DK 175362 B1 82 I stante områder deltes i Cl- og C2-sæt baseret på I karakteristiske rester vist i fig. 9A. Cl-sættet omfat- I ter proteiner, der er involveret i antigen-genkendelse.
H C2-sættet omfatter adskillige Fc-receptorer og protei- I 5 ner indvolveret i call-adhæsion herunder CD2, LFA-3, MAG og NCAM. ICAM-l-områder viste sig at være kraftigst homologe med områder fra C2-sættet anbringende ICAM-1 I i dette sæt; dette afspejles i stærkere lighed med be- varede rester i C2- end i Cl-områder som vist for β- 10 strengene B-F i fig. 9. ICAM-områder står således meget
bedre på linie med β-strenge A og G i C2-områder end I
med disse strenge i V- og Cl-områder, hvilket muliggør
gode grupperinger på tværs af hele C2 område-styrken. I
Opstillinger med C2-områder fra NCAM, MAG og αΐ-β-gly- I 15 coprotein er vist i fig. 9B og 9C; identitet varierer I fra 28 til 33%. Opstillinger med en T-cellereceptor να, 27% identitet og igM C område 3 34% er også vist (fig.
I 9B, 9D).
En af de vigtigste karakteristika for immuno- 20 globulinområder er de disulfid-bundne cysteiner, der danner brobindinger mellem B og F β-strenge, som stabi- liserer β-lagsandwichen; i ICAM-l er cysteinerne beva- I ret i alle tilfælde undtagen i streng f i område 4, I hvor et leucin findes, som kan være rettet mod sand- H 25 wichen og stabilisere kontakten som foreslået for visse I andre V- og C2-sæt områder. Afstanden mellem cysteiner- ne (43, 50, 52 og 37 rester) er som beskrevet for C2- sættet.
I Til test for tilstedeværelsen af intrakæde- I 30 disulfidbindinger i ICAM-1 udsattes endotelcelle- ICAM-1 for SDS-PAGE under reducerende og ikke-reduce- I rende betingelser. Endotelcelle-lCAM-l benyttedes I fordi det udviser mindre glycosyleringsheterogenitet I end JY eller hårcellemilt-lCAM-l og tillader større 35 følsomhed overfor skift i Mr. ICAM-1 rensedes derfor I fra 16 timer LPS (5 pg/ml) stimulerede umbilicalvene- . - ·» iiCTsasa»muWT····-.».· -. t- - - - ....."' .^'-'v^^··1 '.· '·.*.!f" il'-J^l.'JMl DK 175362 B1 83 endotelcellekulturer ved immunoaffinitetschromatografi som beskrevet ovenfor. Acetoneudfældet ICAM-1 genop-slæmmedes i prøvepuffer (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970)) med 0,25% 2-mercaptoethanol eller 25 mM 5 iodacetamid og bragtes til 100°C i 5 min. Prøverne underkastedes SDS-PAGE 4670 og sølvfarvning 4613. Endo-telcelle-ICAM-1 havde et tilsyneladende Mr på 100 kd under reducerende betingelser og 96 kd under ikke-reducerende betingelser, hvilket i høj grad tyder på 10 nærværelsen af intrakædedisulfider i nativ ICAM-1.
Anvendelsen af den primære sekvens til forudsigelse af den sekundære struktur (Chou, P.Y., et al.,
Biochem. l_3:211-245 (1974)) viste de 7 forventede β-strenge i hvert ICAM-l-område, mærket a-g øverst i 15 fig. 9A, hvilket præcis opfylder forudsigelsen for et immunoglobulinområde og svarer til positionerne af strenge A-H i immunoglobuliner (nederst fig. 9A). Område 5 mangler A- og C-strengene, men da disse danner rammer om lagene, kan lagene stadig formes, f.eks.
20 hvor streng D erstatter streng C, som foreslået for andre C2 områder; og den karakteristiske disulfidbin-ding mellem B- og F-strengene ville være upåvirket.
Kriterierne for område-størrelse, sekvenshomologi, bevarelse af cysteiner, der danner den formodede intra-25 område-disulfidbinding, tilstedeværelse af disulfidbindinger, og forudsagt β-lagstruktur opfyldes således alle til inkludering af ICAM-1 i immunoglobulin-supergenfamilien.
ICAM-1 viste sig at være yderst stærkt homolog 30 med NCAM- og MAG-glycoproteinerne fra C2-sættet. Dette er af særlig interesse eftersom både NCAM og MAG medierer celle-celleadhæstion. NCAM er vigtig i neuron-neuron og neuro-muskulære interaktioner (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)), medens MAG er vig-35 tig i neuron-oligodendrocyt og oligodendrocyt-oligo-dendrocyt interaktioner under myelinering (Poltorak, I DK 175362 B1
I 84 I
M., et al^, J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987)). Cel-
I leoverfladeekspressionen af NCAM og MAG reguleres ud- I
I viklingsmæssigt under henholdsvis nervesystemdannelse og myelinering analogt med den regulerede indføring af 5 ICAM-1 ved inflammation (Springer, T.A., et al., Ann.
I Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)). ICAM-1, NCAM (Cunning-
I ham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)) og MAG
(Salzer, J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957-965 Η (1987)) er ens i hovedstrukturen samt homologe efter- 10 som hver er et integreret membranglycoprotein konstrue- ret ud fra 5 C2-områder, der danner det N-terminale ekstracellulære område, skønt nogle yderligere ikke-Ig- lignende sekvenser findes i NCAM mellem det sidste C2- område og det transmembrane område. ICAM-1 står over 15 hele dets længde, herunder i de transmembrane og cyto- plasmiske områder på linie med MAG med 21%'s identitet; den samme % identitet findes ved sammenligning af de 5 områder i ICAM-1 og NCAM-l. En skematisk sammenligning mellem de sekundære strukturer af ICAM-1 og MAG er vist 20 i fig. 10. Område-for-område-sammenligninger viser at homologiniveauet mellem områderne indenfor ICAM-1 og NCAM-molekylerne (x + standardafvigelse, henholdsvis H 21 + 2,8% og 18,6 + 3,8%) er det samme som homologini- H veauet ved sammenligning af ICAM-1 områder med NCAM- og I 25 MAG-områder (henholdsvis 20,4 + 3,7 og 21,9 + 2,7).
I Skønt der er tegn på alternativ splejsning i de C-ter- I minale områder i NCAM (Cunningham, B.A., et al., I Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al., I EMBO J. 6:907-914 (1987)) og MAG (Lai, C., et al., 30 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84 4377-4341 (1987)), har man ikke fundet noget tegn på dette ved sekvenseringen I af endotel- eller HL-60 ICAM-l-kloner eller i de under- I søgelser af lCAM-l-proteinhovedkæden og precursoren i I en lang række celletyper (Dustin M.L., et al., J. Im- I 35 munol. 137:245-254 (1986)).
I ICAM-1 fungerer som en ligand for LFA-l i lymfo- cytinteraktioner med en række forskellige celletyper.
85 DK 175362 B1
Lymfocytter binder til ICAM-1 inkorporeret i kunstige membranbilag, og dette kræver LFA-1 på lymfocytten, hvilket direkte påviser LFA-l-interaktion med ICAM-1 (Marlin, S.D., et al., Cell 51:813-819 (1987)). LFA-1 5 er et leukocytintegrin og har ingen immunoglobulin-lignende træk. Leukocytintegriner omfatter én integrin subfamilie. De andre to underfamilier medierer celle-matrix interaktioner og genkender sekvensen RGD indenfor deres ligander, som omfatter fibronectin, vitronec-10 tin, collagen og fibrinogen (Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987); Ruoslahti, E., et al.> Science 238:491-497 (1987)). Leukocytintegrinerne eksprimeres kun på leuko-cytter, er involveret i celle-celleinteraktioner og de eneste kendte ligander er ICAM-1 og iC3b, et frag-15 ment af den komplementære komponent C3, som ikke udviser immunoglobulin-lignende træk, og som genkendes af Mac-1 (Kishimoto, T.K., et al., I: Leukocyt Typing III, McMichael, M. (ud.), Springer-verlag, New York (1987); Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 20 223-252 (1987); Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med.
28:175-194 (1987)). Baseret på sekvensanalyse er mulige peptider indenfor ICAM-1-sekvensen, genkendt af LFA-1, vist i Tabel 9.
I DK 175362 B1
I 86 I
I Tabel 9 I
I Peptider indenfor ICAM-l-sekvensen, som muligvis gen- I
kendes af LFA-1. I
I 5 -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- I -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- I -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- 10 -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- I -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- 15 ICAM-1 er det første eksempel på et medlem af H immunoglobulin-supergenfamilien, som binder til et integrin. Skønt begge disse familier spiller en vig- tig rolle ved celleadhæsion, har interaktioner mellem dem ikke tidligere været forventet. I modsætning hertil 20 er interaktioner indenfor immunoglobulingensuperfamili- en ganske almindelig. Det er meget sandsynligt, at yderligere eksempler på interaktioner mellem integrinet og immunoglobulinfamilierne vil kunne findes. LFA-1 genkender en ligand forskellig fra ICAM-1 (Springer, I 25 T.A. , et al., Ann. Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)), I og leukocytintegrinet Mac-1 genkender en ligand for- skellig fra C3bi i neutrofil-neutrofiladhæsion I (Anderson, D.C., et_al., Ann. Rev. Med. 38:175-194 I (1987)), Rensede MAG-holdige vesikler binder yderlige- I 30 re til neuritter, som er MAG, og MAG må således være i I stand til heterofil interaktion med en særskilt recep- tor (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 I (1987)).
I NCAM's rolle i neural-neural og neural-muskulære I 35 celleinteraktioner har været foreslået at skyldes de I homofile NCAM-NCAM-interaktioner (Cunningham, B.A., 87 DK 175362 B1 et_al., Science 236:799-806 (1987)). MAG’s vigtige rolle i interaktioner mellem tilstødende, omdrejende løkker af schwann-celler omsluttende axoner under myelinskededannelse kan skyldes interaktion med en 5 særskilt receptor eller homofile MAG-MAG interaktioner.
Homologien mellem NCAM og den hyppige forekomst af område-område- interaktioner indenfor immunogobulin-super-genfamilien rejser muligheden for at ICAM-1 kunne deltage i homofile interaktioner samt ICAM-l-LFA-1-10 heterofile interaktioner. Binding af B-lymfoblastceller som co-eksprimerer lignende tætheder af LFA-1 og ICAM-1 til ICAM-1 i kunstige eller cellulære monolag kan imidlertid fuldstændig inhiberes ved forbehandling af B-lymfoblasten med LFA-l-MAb, mens adhærence er upåvirket 15 af B-lymfoblast-forbehandling med iCAM-l-MAb. Forbehandling af monolaget med ICAM-1-Mab ophæver fuldstan-dig binding (Dustin, M.L., et. al., J. Immunol♦ 1^37:245-254 (1986); Marlin, S.D., et al.. Cell £1:813-819 (1987)). Disse erkendelser viser at hvis 20 ICAM-1 homofile interaktioner overhovedet forekommer, må de være meget svagere end heterofile interaktioner med LFA-1.
Muligheden for at leukocytintegrinerne genkender ligander på en fundamental anden måde stemmer overens 25 med nærværelsen af en 180 rest-sekvens i deres a-under-enheder, der kan være vigtig i ligandbinding og som ikke findes i RGD-genkendelsesintegrinerne (Corbi, A., et al. (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)). Skønt man har foreslået at Mac-1 genkender RGD sekvens, som findes i 30 iC3b 5086, er der ingen RGD-sekvens i ICAM-1 (fig. 8).
Dette er i overensstemmelse med det fibronetiske peptid GRGDSP og kontrolpeptidet GRGESP's manglende evne til at inhibere iCAM-l-LFA-l-adhæsion (Marlin, S.D., et al., Cell 51:813-819 (1987)). Beslægtede sekvenser, så-35 som PRGGS og RGEKE findes imidlertid i ICAM-1 i områder, som forudsiges at danne sløjfe mellem henholdsvis _ v
I DK 175362 B1 I
I 88 I
I β-strenge a og b i område 2 og c og d i område 2 (fig. I
I 9), og skulle således have mulighed for genkendelse. I
I Det er af interesse at det homologe MAG-molekyle inde- I
I holder en RGD-sekvens mellem område l og 2 (Poltorak, I
I 5 M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987); Salzer, . I
I J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957-965 (1987)). I
I Eksempel 19 I
I Southern og Northern Blots. I
I 10 Southern blots gennemførtes under anvendelse af I
5 )jg genomisk DNA ekstraheret fra tre cellelinier: BL2, I
I en Burkitt lymfomacellelinie (en gave fra Dr. Gilbert I
I Lenoir); JY og Er-LCL, EBV-transformerede B-lymfo- I
I blastoidcellelinier. I
I 15 DNA1erne underkastedes digestion med 5X den af I
I fabrikanten anbefalet mængde af Barn Hl og Eco Ri endo- I
I nucleaser (New England Biolabs). Efter elektroforese I
I gennem en 0,8% agarosegel, overførtes DNA'erne til en I
I nylonmembran (Zeta Probe, BioRad). Filteret præhybridi- I
I 20 seredes og hybridiseredes idet standardfremgangsmåderne I
I fulgtes under anvendelse af ICAM cDNA fra HL-60 mærket I
I med a-(32P)d XTP'er ved vilkårlig priming (Boehringer I
I Mannheim). Northern blots gennemførtes under anvendelse I
I af 20 yg total RNA eller 6 yg poly(A)+ RNA. RNA denatu- I
I 25 reredes og underkastedes elektroforese gennem en 1% I
I agarose-formaldehydgel og elektro-overførtes til Zeta I
I probe. Filtre præhybridiseredes og hybridiseredes som I
I beskrevet tidligere (Staunton, D.E., et al♦, Embo J. I
I 6:3695-3701 (1987)) under anvendelse af HL-60 cDNA- I
I 30 proben af 32P-mærkede oligonucleotidprober (beskrevet I
I ovenfor). I
I Southern blots, hvor man benytter 3 kb cDNA- I
I proben og genomisk DNA underkastet digestion med Bam I
I Hl og Eco RI viste enkelte dominerende hybridiserings- I
I 35 fragmenter på henholdsvis 20 og 8 kb, hvilket tyder på I
I et enkelt gen og på at det meste af den kodende infor- I
89 DK 175362 B1 mation findes indenfor 8 kb. i blots med tre forskellige cellelinier var der ikke tegn på restriktions-fragment-polymorfisme.
5 Eksempel 20
Ekspression af ICAM-l-qenet.
En "ekspressionsvektor" er en vektor, som (på grund af tilstedeværelsen af passende transkriptions-og/eller translationskontrolsekvenser) er i stand til 10 at eksprimere et DNA- (eller cDNA)-molekyle, som har været klonet i vektoren, og dermed at producere et po-lypeptid eller protein. Ekspression af de klonede sekvenser forekommer, når ekspressionsvektoren indføres i en passende værtscelle. Hvis en prokaryotisk eks-15 pressionsvektor benyttes vil en passende værtcelle således være enhver prokaryotisk celle, der er i stand til at eksprimere de klonede sekvenser. Hvis man på lignende måde benytter en eukaryotisk ekspressionsvektor, vil en passende værtscelle være enhver eukaryotisk 20 celle, der er i stand til at eksprimere de klonede sekvenser. Da eukaryotisk DNA kan indeholde intervenerende sekvenser, og da sådanne sekvenser ikke kan bearbejdes korrekt i prokaryotiske celler, foretrækkes det at anvende cDNA fra en celle, som er i stand til at eks-25 primere ICAM-1 til opnåelse af et prokaryotisk genomisk ekspressionsvektorbibliotek. Fremgangsmåder til fremstilling af cDNA og fremstilling af et genomisk bibliotek er angivet af Maniatis, T., et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 30 Cold Spring Harbor, NY (1982)).
Det ovennævnte ekspressionsvektors genomiske bibliotek benyttes til at frembringe en bank af værtceller (som hver indeholder ét medlem af biblioteket). Ekspressionsvektoren kan indføres i værtcellen ved et 35 vilkårligt af en række forskellige midler (dvs. transformation, transfektion, protoplastsammensmeltning,
I DK 175362 B1 I
I 90 I
elektroporering osv.)· Banken med ekspressionsvektor- I
I holdige celler formeres klonisk, og dets medlemmer prø- I
I ves individuelt (under anvendelse af en immunoprøve) I
for at bestemme om de producerer et protein, der er i I
I 5 stand til at binde til anti-ICAM-l-antistof. I
I Ekspressions vektorerne fra de celler, som pro- I
I ducerer et protein, der er i stand til at binde til I
I anti-ICAM-antistof, analyseres dernæst yderligere for I
I at bestemme om de eksprimerer (og således indeholder) I
I 10 hele ICAM-l-genet, om de kun eksprimerer (og inde- I
I holder) et fragment af ICAM-l-genet, eller om de I
I eksprimerer (og indeholder) et gen, hvis produkt ikke I
I er ICAM-l, skønt det immunologisk er beslægtet med I
I ICAM-l. Skønt en sådan analyse kan gennemføres med I
I 15 ethvert egnet middel, foretrækkes det at bestemme I
I nucleotidsekvensen af DNA- eller cDNA-fragmentet, som I
I er klonet i ekspressionsvektoren. Sådanne nucleotid- I
I sekvenser undersøges dernæst for at bestemme om de er i I
I stand til at kode for polypeptider, som har den samme I
20 aminosyresekvens som ICAM-l's tryptiske digestionfrag- I
I menter (Tabel 5). I
I En ekspressionsvektor som indeholder et DNA- el- I
I ler cDNA-molekyle, der koder for ICAM-l-genet, kan så- I
I ledes genkendes ved : (i) Evnen til direkte ekspression I
I 25 af et protein, som et i stand til at binde til anti- I
I iCAM-l-antistof; og (ii) tilstedeværelsen af en nucleo- I
I tidsekvens, der er i stand til at kode for hver af de I
I tryptiske fragmenter af ICAM-l. Det klonede DNA- I
I molekyle af en sådan ekspressionsvektor kan fjernes fra I
30 ekspressionsvektoren og isoleres på ren form. I
I Eksempel 21 I
Funktionelle aktiviteter af renset ICAM-l. I
I I celler fungerer ICAM-l normalt som et over- I
I 35 fladeprotein knyttet til cellemembranen. Funktionen af I
renset ICAM-l testedes derfor, efter at molekylet var I
------- .:-- _ -· · _:_·' r'ssexwwn— --" ’·/»--.***?r ^^^7-1¾¾ DK 175362 B1 91 rekonstitueret, i kunstige lipidmembraner (liposomer eller vesikler) ved opløsning af proteinet i detergent-solubiliserede lipider, efterfulgt af fjernelse af detergentet ved dialyse. ICAM-l renset fra JY-celler og 5 elueret i detergentet octylglucosid, som beskrevet ovenfor, rekonstitueredes i vesikler, og ICAM-l-inde-holdende vesikler fusioneredes til dækglas eller plastkul turbrønde, for at muliggøre påvisningen af cellebinding til proteinet.
10
Fremstilling af plane membraner og plast-bundne vesikler.
Vesikler fremstilledes ved fremgangsmåden ifølge Gay et al. (J. Immunol. 136:2026 (1986)). Kort fortalt 15 opløstes æggephosphatidylcholin og cholesterol i tri-chlormethan og blandedes i et molært forhold på 7:2. Lipidblandingen tørredes til en tynd film under rotering under en strøm af nitrogengas og lyofiliseredes dernæst i 1 time for at fjerne alle spor af trichlor-20 methan. Lipidfilmen opløstes dernæst i 1% octylgluco-sid/0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) til en slutkoncen-tration af phosphatidylcholin på 0,1 mM. Ca. 10 pg renset ICAM-l eller human glycophorin (Sigma Chemical Co.,
St. Louis, MO) som et kontrolmembranglycoprotein, sat-25 tes til hver ml af opløste lipider. Protein-lipid-detergentopløsningen dialyseredes dernæst ved 4°C mod 3 hold af 200 voluminer af 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH
7,2, og et hold af HBSS.
Plane membraner fremstilledes ved fremgangsmåden 30 angivet af Brian et al., Proc. Natl. Acad. Scl. 81:6159 (1984). Dækglas (med en diameter på 11 mm) kogtes i 15 min. i en 1:6 fortynding af 7X detergent (Linbro), vaskedes natten over i destilleret vand, gennemvædedes i 70% ethanol og lufttørredes. En 80 μΐ dråbe af en ve-35 sikelsuspension indeholdende enten ICAM-l eller glycophorin anbragtes på bunden af brøndene i en 24-brøndes
I DK 175362 B1 I
I 92 I
klyngetestplade, og de præparerede dækglas bragtes for- I
sigtigt til at flyde på toppen. Efter 20-30 min. inku- I
bering ved stuetemperatur fyldtes brøndene med HBSS, I
og dækglasset vendtes om for at bringe den plane mem- I
5 branflade opad. Brøndene vaskedes dernæst omhyggeligt I
med HBSS for at fjernes ubundne vesikler. Den plane I
membranoverflade udsattes aldrig for luft. I
Under forsøgene med plane membraner fusioneret I
til glasoverflader viste det sig, at vesikler indehol- I
10 dende ICAM-1 binder direkte til plastoverfladen af mul- I
tibrønds-vævskulturplader og bevarer funktionel aktivi- I
tet som bevist ved specifik cellebinding. Sådanne ve- I
sikler omtales herefter som "plast-bundne vesikler" I
(PBV), eftersom naturen af de til plastet bundne lipid- I
15 vesikler ikke er blvet bestemt. Plast-bundne vesikler I
I fremstilledes ved tilsætning af 30 yl vesikelsuspension I
direkte til bunden af brøndene i 96-brøndes vævskultur- I
bakker (Falcon) efterfulgt af inkubering og vaskning, I
som beskrevet for plane membraner. I
20 I
Celleadhæsionsprøver. I
Celleadhæsionsprøver under anvendelse af plane I
membraner eller plast-bundne vesikler gennemførtes beg- I
ge to på i det væsentlige samme måde, med undtagelse af I
25 at celleantallet og voluminer for PBV-prøver reducere- I
des til en femtedel af det, der benyttedes ved plane I
membranprøver. I
T-lymfocytter fra normale kontroller og en pa- I
tient med leukocytadhæsionsdeficiens (LAD), hvis I
30 celler ikke eksprimerer LFA-1 (Anderson, D.C. et al., I
J. Infect. Dis. 152:668 (1985)), fremstilledes ved I
dyrkning af mononukleære perifere blodceller med 1 I
yg/ml Concanavalin-A (Con-A) i RPMI-1640 plus 20% FCS I
I med 5 x 105 celler/ml i 3 dage. Cellerne vaskedes der- I
35 næst to gange med RPMI og en gang med 5 mM methyl-a-D- I
mannopyranosid til fjernelse af resterende lectin fra I
93 DK 175362 B1 celleoverfladen. Cellerne dyrkedes i RPMI/20% FCS indeholdende 1 ng/ml rekombinant IL-2, og benyttedes mellem 10 og 22 dage efter initieringen af kultur.
Til påvisning af cellebinding til plane membra-5 ner eller PBV, radiomærkedes Con-A blaster, T-lymfoma SKW-3 og de EBV-transformerede B-lymfoblastoidcelle-linier JY (LFA-l positive) og den LFA-l-deficiente lymfoblastoidcellelinie {BBN) (som stammer fra patient nr. 1, Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160: 10 1901-1918 (1986)) ved inkubering af 1 x 107 celler i 1 ml RPMI-r 1640/10% FCS med 100 pCi Na51Cr04 i 1 time ved 37°C efterfulgt af 4 vaskninger med RPMI-1640 til fjernelse af ikke-inkorporeret mærkninngsmiddel. I mo-noklonalt antistof-blokeringsforsøg forbehandledes cel-15 ler eller plast-bundne vesikler med 20 yg/ml renset antistof i RPMI-1640/10% FCS ved 4°C i 30 min., efterfulgt af 4 vaskninger til fjernelse af ubundet antistof. I forsøg for divalente kationers virkning på cellebinding vaskedes cellerne en gang med Ca2+-, Mg2+-20 frit HBSS plus 10% dialyseret FCS, og CaCl og MgCl tilsattes til de angivne koncentrationer. I alle forsøg præækvilibreredes celler og plane membraner eller PBV ved passende temperatur (4°C, 22°C eller 37eC) i en passende prøvepuffer.
25 Til måling af cellebinding til renset ICAM-1 centrifugeredes ®1Cr-mærkede celler (5 x 10® EBV-transformenter i plane membranprøver; 1 x 10® EBV-transformenter eller SKW-3-celler, 2 x 10® Con-A-bla-ster i PBV-prøver) i 2 min. ved 25 x g på plane mem-30 braner eller PBV, efterfulgt af inkubering ved 4°C, 22°C eller 37°c i 1 time. Efter inkubering fjernedes ubundne celler ved otte cycler med påfyldning og bortsugning af puffer præækvilibreret til den rette temperatur. Bundne celler bestemtes ved solubilisering 35 af brøndindholdet med 0,1 N NaOH/1% Triton X-100 og tælling på en γ-tæller. Procent cellebinding bestemtes I DK 175362 B1 I 94
I ved at dividere cpm fra bundne celler med input celle- I
I associeret cpm. I plane membranprøver korrigeredes in- I
put cpm for forholdet mellem dækglassets overfladeareal I
I og dyrkningsbrøndenes overfladeareal. I
I 51 disse prøver bandt EBV-transformerede B-
I lymfoblastoidceller, SKW-3 T-lymfomaceller og Con-A
I T-lymfoblaster specifikt til ICAM-1 i kunstige membra- I ner {fig. 11 og 12). Bindingen var specifik, eftersom I cellerne bandt meget svagt til kontrol plane membraner I 10 eller vesikler indeholdende ækvivalente mængder af et I andet humant celleoverfladeglycoprotein, glycophorin.
yderligere bandt LFA-l-positive EBV-transformanter og
Con-A blaster medens deres LFA-1-negative modparter ik- ke bandt i nogen signifikant udstrækning, hvilket viser I 15 at bindingen var afhængig af tilstedeværelsen af LFA-1 på cellerne.
Både specificiteten af cellebinding og afhængig- hed af cellulær LFA-1 bekræftedes i monoklonale anti- I stofblokeringsforsøg (fig. 13). Bindingen af JY-celler
20 kunne inhiberes med 97%, når ICAM-1 indeholdende PBV
I forbehandledes med anti-ICAM-1 monoklonalt antistof I RR1/1. Forbehandling af cellerne med det samme antistof H havde kun ringe virkning. Omvendt inhiberede det anti- I LFA-1-monoklonale antistof TS1/18 binding med 96%, 25 men kun når cellerne, men ikke PBV, var præbehandlet.
I Et kontrolantistof TS2/9 reaktivt med LFA-3 (et andet lymfocytoverfladeantigen) havde ingen signifikant inhi- berende virkning, hverken når celler eller PBV forbe- handledes. Dette forsøg viser, at ICAM-1 i sig selv i I 30 de kunstige membraner, og ikke en eller anden mindre I kontaminant, medierer den observerede cellulære adhæ- sion, og at adhæsionen er afhængig af LFA-l på bin- I dingscellen.
Bindingen af celler til ICAM-1 i kunstige mem- I 35 braner viser desuden to andre egenskaber hos det LFA-1- I afhængige adhæsionssystem: Temperaturafhængighed og 95 DK 175362 B1 et behov for divalente kationer. Som vist i fig. 14 bandt Con-A blaster mest effektivt til ICAM-1 i PBV ved 37°C, delvis ved 22°C og meget svagt ved 4°C. Som vist i fig. 15 var bindingen fuldstændig afhængig af til-5 stedeværelsen af divalente kationer. Ved fysiologiske koncentrationer var Mg2+ alene tilstrækkelig til maksimal cellebinding/ mens Ca2+ alene giver meget lave niveauer af binding. En tiendedel Mg2+ af den normale koncentration sammen med Ca2+ var imidlertid synergi-10 stisk og frembragte maksimal binding.
Sammenfattende viser specificiteten af cellebinding til renset ICAM-1 inkorporeret i kunstige membraner, den specifikke inhibering med monoklonale antistoffer og temperaturbehovet og det divalente kationbe-15 hov, at ICAM-1 er en specifik ligand for det LFA-l afhængige adhæsionsystem.
Eksempel 22
Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR i 20 allergiske og toxiske lappetestreaktioner♦
Hudbiopsier fra fem normale individer undersøgtes for deres ekspression af ICAM-1 og HLA-DR. Det viste sig, at medens endotelcellerne i nogle blodkar sædvanligvis eksprimerede ICAM-1, eksprimeredes der in-25 gen ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud. Ingen farvning for HLA-DR på nogen keratinocytter fra normale hudbiopsier observeredes. Kinetikken af ekspression af ICAM-1 og klasse Il-antigener undersøgtes dernæst på celler i biopsier fra allergiske og toxiske hudlæsio-30 ner. Det viste sig at halvdelen af de seks undersøgte individer havde keratinocytter, som eksprimerede ICAM-1, fire timer efter påføring af haptenet (Tabel 10). Der var en øgning i procentdelen af individer, der eksprimerer ICAM-1 på deres keratinocytter, med ti-35 den for udsættelse for haptenet, samt en øgning af intensiteten af farvning, hvilket indikerer mere ICAM-l
I DK 175362 B1 I
I 96 I
I ekspression pr. keratinocyt op til 48 timer. Faktisk I
I er der på dette tidspunkt en del keratinocytter i alle I
I biopsier farvet positivt for ICAM-1. Ved 72 timer (24 I
timer efter haptenet fjernedes) havde 7 ud af 8 indivi- I
5 der stadigvæk ICAM-1 eksprimeret på deres keratinocyt- I
I ter, mens ekspressionen af ICAM-l på ét individ dalede I
mellem 48 og 72 timer. I
DK 175362 B1 97
Tabel 10
Kinetik af indføring af ICAM-1 og HLA-DR på keratino-cytter fra allergiske lappetestbiopsier.
5 _
Tid efter Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og
lappepåføring af alene alene HLA-DR
(timer)_biopsier_
Normal hud_5_ 0_0_0_ 10 Allergisk lappetest 4 6 3a 0 0 8 9 3 0 0 24 Θ 7 0 0 15 48b 8 5 0 3 72 8 6 0 1 20 1 a Prøver betragtedes som værende positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes. b Alle lapper fjernedes på dette tidspunkt.
I DK 175362 B1 I
I 98 I
I Histologisk var farvningsmønsteret for ICAM-1 på I
I · keratinocytter fra biopsier taget fire timer efter på- I
I føring af haptenet sædvanlig i små klynger. Ved 48 ti- I
I mer eksprimeredes ICAM-1 på overfladen af størstedelen I
I 5 af keratinocytterne, idet der ikke sås nogen forskel I
I mellem skadens center og periferi. Intensiteten af I
I farvningen aftog efterhånden som keratinocytterne nær- I
I mede sig stratum corneum. Dette konstateredes hos biop- I
I sier taget fra centrum og periferien af læsionerne. På I
I 10 dette tidspunkt var lappetesten også positiv (infiltra- I
I tion, erythema og vesikler). Der observeredes ingen I
I forskel i ICAM-1 ekspression når forskellige haptener I
I påførtes følsomme individer. Foruden på keratinocytter I
I eksprimeredes ICAM-1 også på visse mononukleære celler I
I 15 og endotelceller på læsionsstedet. I
I Ekspressionen af HLA-DR på keratinocytter i de I
I allergiske hudlæsioner var mindre hyppig end ekspres- I
I sionen af ICAM-1. Ingen af de undersøgte individer hav- I
I de læsioner med keratinocytter, som farvedes positivt I
I 20 for HLA-DR op til 24 timer efter påføring af haptenet. I
I Faktisk havde kun fire biopsiprøver keratinocytter, som I
I eksprimerede HLA-DR, og ingen biosier havde keratino- I
I cytter, der var positive overfor HLA-DR og ikke ICAM-1 I
I (Tabel 10). I
I 25 I modsætning til den allergiske lappetestlæsion I
I havde den toxiske lappetestlæsion, induceret med kro- I
I tonolie eller natriumlaurylsulfat, keratinocytter, der I
I udviste en kun ringe mængde, om nogen, ICAM-1 på deres I
I overflader på alle testede tidspunkter (Tabel 11). Fak- I
I 30 tisk havde kun ét af de 14 individer, der var udsat for I
I den toxiske lappetest, keratinocytter, der eksprimerede I
I ICAM-1 i deres læsioner, 48 timer efter lappepåføring, I
I hvilket tidspunkt er det optimale tidspunkt for ICAM- I
I l-ekspression hos de allergiske lappetestindivider. I I
I 35 modsætning til de allergiske lappetestbiopsier ekspri- I
I meredes der desuden ikke HLA-DR på keratinocytter fra I
I toxiske lappetestlæsioner. I
99 DK 175362 B1
Disse data indikerer at ICAM-1 eksprimeres i immunbaseret inflammation og ikke i toxisk baseret inflammation, og ekspressionen af ICAM-1 kan således benyttes til at skelne mellem immunobaseret og toxisk 5 baseret inflammation, såsom akut nyresvigt hos nyretransplantationspatienter, hvor det er vanskeligt at bestemme hvorvidt svigtet skyldes afvisning eller nephrotoxicitet af det immunoundertrykkende terapeutiske middel. Nyrebiopsi og vurdering af opregulering af 10 ICAM-1 ekspressionen vil tillade differentiering mellem immunbaseret afvisning og ikke-immunbaseret toxicitets-reaktion.
Tabel 11
Kinetik af indføring af ICAM-1 og HLA-DR på kerati-15 nocytter fra toxlske lappetestbiopsier.
Tid efter Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og
lappepåføring af alene alene HLA-DR
20 (timer)_biopsier_ 4 4 0 0 0 8 3 la 0 0 24 3 1 0 0 48b 14 10 0 25 72 3 1 0 0 a Prøver betragtedes som værende positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes.
30 b Alle lapper fjernedes på dette tidspunkt._
I DK 175362 B1 I
I 100 I
I Eksempel 23 I
I Eksprlmerlnq af ICAM-1 og HLA-DR i godartede kutane I
I sygdomme. , I
I Celler fra hudbiopsier med læsioner fra patien- I
I 5 ter med forskellige typer af inflammatoriske hudsygdom- I
I me undersøgtes for deres ekspression af ICAM-1 og HLA- I
I DR. En del keratinocytter i biopsier med allergisk kon- I
I takteksem, pemphigoid/pemphigus og lichen planus eks- I
I primerede ICAM. Lichen planus-biopsier viste den mest I
10 intense farvning med et mønster svarende til eller end- I
I og stærkere end den, der konstateredes hos de 48 timer I
I allergiske laptestbiopsier (Tabel 12). I overensstem- I
I melse med resultaterne, der sås ved den allergiske lap- I
petest, konstateredes den mest intensive iCAM-l-farv- I
I 15 ning på steder med kraftig mononukleær celleinfiltra- I
tion. 8 ud af de 11 testede lichen planus-biopsier var I
I yderligere positive for HLA-DR ekspression på keratino- I
I cytter. I
I Ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytter fra I
I 20 hudbiopsier fra patienter med exanthema og urticaria I
I var mindre udtalt. Kun fire ud af de syv testede pa- I
I tienter med disse sygdomme havde keratinocytter, der I
eksprimerede ICAM-1 på læsionsstedet. HLA-DR ekspres- I
I sion viste sig kun på én patient, og dette var i for- I
25 bindelse med ICAM-1. I
I Endotelceller og en del af de mononukleære cel- I
I leinfiltrater fra alle de testede godartede inflammato- I
I riske hudsygdomme eksprimerede ICAM-1 i forskellig ud- I
strækning. I
DK 175362 B1 101
Tabel 12
Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR på keratinocytter fra godartede kutane sygdomme.
5 Diagnose Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og _af tilfælde alene alene HLA-DR_
Allergisk kontakteksem 5 3a 0 2
Lichen Planus 11 30 8 10 Pemhigoid/
Pemhigus 2 200
Exanthema 3 200
Urticaria 4 10 1 15 aPrøver betragtedes som værende positive, hvis mindst 20 små klynger af keratinocytter farvedes.
I DK 175362 B1
I 102 I
H Eksempel 24 I
I Ekspression af ICAM-1 pS keratlnocytter I
H fra psoriatiske hudlæsioner. I
H Ekspressionen af ICAM-1 i hudsbiopsier fra 5 pa- I
fl 5 tienter med psoriasis undersøgtes før initieringen og I
I periodisk under et forløb med PUVA-behandling. Biopsier I
opnåedes fra fem patienter med klassisk psoriasis be- I
kræftet ved histologi. Biopsier blev udtaget i række- I
I følge før og under indikeret tid for PUVA-behandling. I
I 10 PUVA tilførtes 3-4 gange om ugen. Biopsier blev taget I
fra periferien af de psoriatiske plaques hos fem pati- I
I enter og yderligere biopsier blev taget fra klinisk I normal hud fra fire af patienterne.
I Friske hudbiopsistykker blev frosset og opbevaret H 15 i flydende nitrogen. Seks ym cryostatsektioner luft- I tørredes natten over ved stuetemperatur, fikseredes i I acetone i 10 min. og farvedes enten straks eller ind- I pakkedes i aluminiumfolie og opbevaredes ved -80°C ind- I til farvning.
20 Farvning gennemførtes på den efterfølgende måde.
Sektioner inkuberedes med monoklonale antistoffer og H farvedes ved en 3-trins immunoperoxidasemetode (Stein, I H., et al., Adv. Cancer Res 42:67-147, (1984)), under fl anvendelse af diaminobenzidin H202-substrat. Tonsiler H 25 og lymfeknuder benyttedes som en positiv kontrol på H anti-ICAM-1- og HLA-DR-farvning. Væv farvet i frafl vær af et primært antistof var negative kontroller.
I De monoklonale antistoffer mod HLA-DR erhveredes I fra Becton Dickinson (Mountainview, California). Det fl 30 monoklonale anti-lCAM-l-antistof var R6-5-D6. Peroxida- I se-konjugeret kanin-anti-muse-Ig og peroxidase-konju- fl geret svine-anti-kanin-Ig erhvervedes fra DAKOPATTS, I København, Danmark. Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid fl opnåedes fra Sigma (St. Louis, Mo.).
I 35 Resultaterne af undersøgelsen viste, at endotel- I cellerne i nogle blodkar eksprimerer ICAM-1 i både syg 103 DK 175362 B1 og normal hud, men intensiteten af farvning og antallet af blodkar, der eksprimerer ICAM-1 øgedes i de psoria-tiske hudlaesioner. Mønsteret af ekspression af ICAM-1 varierede desuden i keratinocytter fra ubehandlede 5 psoriatiske-hudlæsioner fra de fem patienter, fra at kun små klynger af celler var farvet til at mange keratinocytter var farvet. Under forløbet med PUVA-behandling viste ICAM-l-ekspressionen på to af patienterne (patient nr. 2 og 3) udbredt reduktion, som gik forud 10 for eller var samtidig med klinisk remission (Tabel 13). Patienterne nr. 1, 4 og 5 havde formindskelse og øgning af ICAM-l-ekspression under PUVA-behandlingen, hvilket korrelerer med henholdsvis kliniske remissioner og tilbagefald. Der var ingen ICAM-l-ekspression på 15 keratinocytter fra normal hud før eller efter PUVA-behandling. Dette indikerer, at PUVA ikke inducerer ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud.
Observationen af at densiteten af det mononukle-ære celleinfiltrat korrelerede med mængden af ICAM-1-20 ekspression på keratinocytter var af betydning. Dette vedrører både et aftagende antal mononukleære celler i læsioner under PUVA-behandling, når ICAM-l-ekspression også aftog, og et øget antal af mononukleære celler under PUVA-behandling, når ICAM-l-ekspression på kera-25 tinocytter var mere fremtrædende. Endotelceller og dermale mononukleære celler er også ICAM-l-positive.
I klinisk normal hud var ICAM-l-ekspressionen begrænset til endotelceller uden mærkning af keratinocytter.
30 Ekspressionen af HLA-DR på keratinocytter var variabel. Der var ingen HLA-DR-positiv biopsi, der ikke også var ICAM-l-positiv.
Sammenfattende viser disse resultater, at før behandling er ICAM-1-ekspression udtalt på keratinocyt-35 terne og korrelerer med et tæt mononukleær celleinfiltrat. Under PUVA-behandling ses en udtalt mindskelse af
I DK 175362 B1 I
I 104 I
I ICAM-l-farvning parallelt med den kliniske forbedring. I
I Histologisk mindskedes det dermale infiltrat også. Når I
I et klinisk tilbagefald var tydelig under behandlingen, I
I øgedes ekspressionen af ICAM-l på keratinocytterne og I
I 5 tætheden af dermal infiltrat. Når en klinisk remission I
konstateredes under behandlingen, var der en samtidig I
aftagelse i ICAM-l-farvning på keratinocytterne og I
I en mindskelse i det dermale infiltrat. Ekspressionen af I
ICAM-l på keratinocytter svarede således til tætheden I
I 10 af mononukleær celleinfiltrat på dermis. Disse data vi- I
I ser at klinisk reaktion overfor PUVA-behandling resul- I
I terer i en udtalt mindskelse af ICAM-l-ekspression på I
I keratinocytter parallelt med en mere moderat aftagelse I
I af de mononukleære celler. Dette indikerer, at ICAM-l- I
15 ekspression på keratinocytter er ansvarlig for inite- I
I ring og opretholdelse af det dermale inf iltrat, og at I
I PUVA-behandling nedregulerer ICAM-l, som på sin side I
I mindsker det dermale infiltrat og den inflammatoriske I
reaktion. Dataene indikerer desuden at der var en va- I
I 20 riabel HLA-DR-ekspression på keratinocytter under PUVA- I
I behandling. I
I Ekspressionen af ICAM-l på keratinocytter i I
I psoriatiske læsioner korrelerer med den kliniske alvor- I
I lighed af læsionen samt størrelsen af det dermale in- I 25 filtrat. ICAM-l spiller således en central rolle ved I psoriasis og inhibering af dets ekspression og/eller I inhibering af dets interaktion med CD 18 komplekset på mononucleære celler vil være en virkningsfuld behand- ling af sygdommen. Registrering af ICAM-l-ekspression I 30 på keratinocytter vil yderligere være et effektivt I -værktøj til diagnostisering og prognose, samt evalue- I ring af terapiforløbet for psoriasis.
'•'-Hi. I ιιπ 1.1 ·ι ιΊ-ιιτ — ni— -πττ - .... ---f. ‘SK* .^IMIWI,·» I ^Μ4·Μ. T"· ;__'' ' *· , Igh.i.iiirlli T. S M'M
DK 175362 B1 105
Tabel 13
Sekventiel ICAM-l-ekspression af keratinocytter i pso-riatiske hudlæsioner (PS) og klinisk normal hud (N) før og under PUVA-behandling.
5 _________ patient nr.
Tid før og i 2 3 4 5 under
PUVA-behandling ps PS N PS N PS N PS N
10 0 + + >++-++'-+++- 1 dag + 1 uge + + - - ++ - + 0 2 uger ++ + -+-+- 3 uger ++ * 0 15 4 uger ++ + - ++ * * 5-6 uger - - o 7 uger (+♦) (+) +++ .
* * 10 ugér (+) - 20 +++ Mange positive keratinocytter.
++ En del positive keratinocytter.
+ Fokale positive keratinocytter.
25 (+) Meget få, spredte positive keratinocytter.
Ingen positiv farvning.
* Klinisk remission, o Klinisk tilbagefald.
I DK 175362 B1 106
I Eksempel 25 I
I Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR i I
H maligne kutane sygdomme. I
Modsat læsioner fra godartede kutane tilstande 5 var ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytter fra ma- H ligne hudlæsioner meget mere variable (Tabel 14). Af de 23 undersøgte kutane T-cellelymfomaer identificeredes ICAM-l-positive keratinocytter kun i 14 tilfælde. Der var en tendens til at keratinocytter fra biopsier med 10 mycosis fungoide læsioner mister deres ICAM-l-ekspres- sion ved udvikling af sygdommen til mere fremskredne stadier. ICAM-1-ekspression observeredes imidlertid på I en varierede del af det mononucleære celleinfiltrat fra de fleste af de kutane T-cellelymfomalæsioner. Blandt 15 de resterende undersøgte lymfomaer havde fire ud af ot- te keratinocytter, der eksprimerede ICAM-1. Af de 29 patienter med maligne kutane sygdomme, som undersøgtes, havde 5 keratinocytter, som eksprimerede HLA-DR uden at eksprimere ICAM-1 (Tabel 14).
DK 175362 B1 107
Tabel 14
Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR på keratinocytter fra maligne kutane sygdomme.
5
Diagnose Antal ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og
_tilfælde alene alene HLA-DR
CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 10 CTCL, SS 3102 CTCL, Stor celle 2020 CBCL 2 0 0 1
Leukemia Cutis 3111
Histiocytosis XI 00 0 15 _ aPrøver betragtedes som positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes.
I DK 175362 B1 108 H Eksempel 26 B Virkning af antl-ICAM-l-antistoffer på proliferationen B af humane perifere mononukleære blodceller.
Humane perifere mononukleære blodceller induce- 5 res til at proliferere ved tilstedeværelsen og gen- kendelsen af antigener eller mitogener. Visse moleky- B ler, såsom mitogenet concanavalin A, eller det T-celle- bindende antistof OKT3, forårsager en ikke-specifik proliferation af perifere mononukleære blodceller.
10 Humane perifere mononukleære blodceller er heterogene, idet de består af subpopulationer af celler, som er i stand til at genkende specifikke anti- gener. Når en perifer mononukleær blodcelle, som er i stand til at genkende et bestemt specifikt antigen, 15 møder dette antigen induceres proliferationen af denne subpopulation af mononukleær celle. Tetanus-toxoid og "keyhole limpet"-hæmocyanin er eksempler på antigener, som genkendes af subpopulationer af perifere mono- I nukleære blodceller, men som ikke genkendes af alle pe- B 20 rifere mononukleære celler hos sensibiliserede indivi- der.
B Anti-ICAM-l-monoklonalt antistof R6-5-D6's evne B til at inhibere proliferaktive reaktioner fra humane B perifere mononukleære blodceller i systemer, der vides B 25 at kræve celle-celleadhæsioner, testedes.
B Perifere mononukleære blodceller rensedes på
Ficoll-Paque (Pharmacia) gradienter ifølge fabrikantens I instruktioner. Efter opsamling af grænsefladen vaskedes I cellerne tre gange med RPMI 1640 medium og dyrkedes i I 30 fladbundede, 96-brøndes mikrotiterplader i en koncen- I tration på 106 celler/ml i RPMI 1640 medium suppleret I med 10% fetal bovin serum, 2 mM glutamin og gentamicin (50 pg/ml).
I Antigen, enten τ-cellemitogenet, concanavalin A
I 35 (0,25 yg/ml), det T-celle-bindende antistof, 0KT3 I (0,001 Mg/ml), "keyhole limpet"-hæmocyanin (10 g/ml)
-------------- 'wi.-r- . ..Ml·«.!«*i·,ιλurr--f -^K.-m.;HMM.>»M
DK 175362 B1 109 eller tetanus-toxoid (1:100 fortynding fra kilde) sattes til celler, som dyrkedes som beskrevet ovenfor enten i nærværelse eller fravær af anti-ICAM-antistof (R6-5-D6; slutkoncentration på 5 g/ml). Cellerne dyrke-5 des i 3,5 dage (concanavalin A forsøg), 2,5 dage (OKT3-forsøg) eller 5,5 dage ("keyhole limpet"-hæmocyanin og tetanus-toxoid-forsøg) før prøverne afsluttedes.
18 timer før afslutningen af prøven sattes 2,5 yCi 3H-thymidin til kulturerne. Cellulær prolifera-10 tion prøvedes ved at måle inkorporeringen af thymidin i DNA ved de perifere mononukleære blodceller. Inkorporeret thymidin opsamledes og taltes i en væskescin-tillationstæller (Merluzzi et al., J. Immunol.
139:166-168 (1978)). Resultaterne af disse forsøg er 15 vist i fig. 16 (concanavalin A-forsøg), fig. 17 (OKT3-forsøg), fig. 18 ("keyhole limpet"-hæmocyanin-forsøg) og fig. 19 (tetanus-toxoid-forsøg).
Det viste sig, at anti-ICAM-l-antistof inhiberer proliferative reaktioner overfor det ikke-specifikke T-20 cellemitogen, ConA; det ikke-specifikke T-celleassocie-rede antigen, OKT-3; og de specifikke antigener, "keyhole limpet"-hæmocyanin og tetanus-toxoid, i mononukleære celler. Inhiberingen af anti-ICAM-lantistof var sammenlignelig med inhiberingen af anti-LFA-l-anti-25 stof, hvilket tyder på, at ICAM-1 er en funktionel ligand af LFA-1, og at antagonisme af ICAM-1 vil inhibere specifikke forsvarssystemreaktioner.
Eksempel 27 30 Virkning af anti-ICAM-l-antistof på den blandede lymfocytreaktion.
Som omtalt ovenfor er ICAM-1 nødvendig for effektive cellulære interaktioner under en immunreaktion medieret gennem LFA-1-afhængig celleadhæsion. Induk-35 tionen af ICAM-1 under immunreaktioner eller inflammatorisk sygdom tillader interaktionen af leukocytter med hinanden og med entodelceller.
I DK 175362 B1 I lio B Når lymfocytter fra to ikke-relaterede individer B dyrkes i hinandens nærværelse observeres blasttransfor- mation og celleproliferation af lymfocytterne. Denne reaktion af én population af lymfocytter overfor nærvæ- I 5 reisen af en anden population af lymfocytter er kendt B som en blandet lymfocytreaktion (MLR), og den er analog med reaktionen af lymfocytter overfor tilsætningen af mitogener (Immunology The Science of Self-Nonself Dis- B crimination, Klein. J., John Wiley & Sons, NY (1982), 10 S. 453-458).
Der gennemførtes forsøg til bestemmelse af virk- B ningen af anti-lCAM-l-monoklonale antistoffer på human MLR. Disse forsøg gennemførtes som følger. Perifert B blod opsamledes fra normale raske donorer ved vene- 15 punktur. Blodet opsamledes i hepariniserede rør og for- B tyndes 1:1 ved stuetemperatur med Puck's G (GIBCO)
B balancerede saltopløsning (BSS). Blodblandingen (20 ml) I
B anbragtes som et lag ovenpå 15 ml af en Ficoll/Hypaque I
B densitetsgradient (Pharmacia, tæthed = 1,078, stuetem- I
B 20 peratur) og centrifugeredes ved 1000 x g i 20 min.
B Grænsefladen opsamledes og vaskedes 3X i Puck's G. Cel-
B lerne taltes på et hæmacytometer og genopslæmmedes i I
B RPMI-1640 dyrkningsmedium (GIBCO) indeholdende 0,5% I
B gentamicin, 1 mM L-glutamin (GIBCO) og 5% varmeinakti-
B 25 veret (56°C, 30 min.) human AB sera (Flow Laboratories) I
B (herefter omtalt som RPMI-dyrkningsmedium).
B Muse-anti-ICAM-l (R6-5-D6) benyttedes i disse B forsøg. Alle monoklonale antistoffer (fremstillet fra B ascites af Jackson immunoResearch Laboratories, Boston, B 30 MA) benyttedes som rensede IgG-præparater.
Perifere mononucleæré blodceller (PBMC) dyrke- I des i medium med 6,25 x 105 celler/ml i Linbro rund- I bundede mikrotiterplader (# 76-013-05). Stimulator- I celler fra en adskilt doner bestråledes ved 1000 R og I 35 dyrkedes med respondercellerne ved den samme koncentra- I tion. Det totale volumen per kultur var 0,2 ml. Kon- 111 DK 175362 B1 troller omfattede responderceller alene og stimulatorceller alene. Dyrkningspladerne inkuberedes ved 37°C i en 5% C02-fugtet luftatmosfære i 5 dage. Brøndene pulseredes med 0,5 pCi tritieret thymidin (3HT) (New Eng-5 land Nuclear) under de sidste 18 timers dyrkning. I nogle tilfælde gennemførtes en 2-vejs MLR. Protokollen var den samme med undtagelse af at den anden donors celler ikke inaktiveredes ved bestråling.
Cellerne høstedes på glasfiberfiltre under an-10 vendelse af et automatiseret multiprøvehøstapparat (Skatron, Norge), idet der skylledes med vand og methanol. Filtrene ovntørredes og taltes i Aquasol i en Beckman (LS-3801) væske-scintillationstæller. Resultaterne er angivet som middelværdien af CPM + middelfejl for 15 6 individuelle kulturer.
Tab. 15 viser at rensede anti-lCAM-1 monoklonale antistoffer inhiberer MLR på en dosisafhængig måde med signifikant undertrykkelse synlig ved 20 ng/ml. Renset muse-IgG havde kun ringe eller ingen undertrykkende 20 virkning. Undertrykkelse af MLR med det anti-ICAM-1 monoklonale antistof forekommer når antistoffet tilsættes indenfor de første 24 timers dyrkning (Tabel 16).
I DK 175362 B1
I 112 I
I Tabel 15 I
I Virkning af anti-ICAM-l-antistof på én-vejs lymfocyt- I
reaktionen. I
I ** a C 3 -I
Responder celler Stimulator- Antistof HT-Inkorporation (CPM) I
I _celler___ I
I 445d 1 143 I
+ 148 4 17 4 698 ± 72 10_____ I 4 4- 42-626 ± 1.579 I 4 4 mlgG (10,0 ug) 36.882 1 1.823 (14%) 4 4 mlgG ( 0,4 μς) 35.500 1 1.383 (17%) 15 4 4 mlgG ( 0,02 ug) 42.815 l 1.246 ( 0%) I 44 R6-5-D6 (10,0 Mg) 8.250 i 520 (81%) 4 4 R6-5-D6 ( 0,4 Mg) 16.142 1 858 (62%) 4 4 R6-5-D6 ( 0,03 /ig) 28.844 t 1.780 (32%)
I 20 a. Responderceller (6,25 X l05/ml) I
I b. Stimulatorceller (6,25 X 105/ml, bestrålet ved I 10000R).
I c. Renset monoklonalt antistof mod ICAM-1 (R6-5-D6) eller renset muse IgG (mlgG) ved slutkoncentra- 25 tioner (yg/ml).
I d. Middelværdi + middelfejl af 5-6 kulturer, tal i parenteser angiver procent inhibering I _af MLR._ DK 175362 B1 113
Tabel 16
Tilsætningstidspunkt for anti-ICAM-1.
^ Ra ^HT Inkorporering (CPM)
Tilsætningstidspunkt for medium eller antistof Dag 0 Dag 1 Dag 2 10 medium 205^ ± 14 476 ± 132 247 i 75 + medium 189 ± 16 nde nd + > medium 1.860 ± 615 nd nd 15 + + medium 41.063 t 2.940 45,955 ± 2.947 50.943 i 3.072 + + R6-5-D6 17.781 ± 1.293 38.409 ± 1.681 47.308 i 2,089 (57%)f (16%) (7%) a. Responderceller (6,25 x l05/ml).
20 b. Stimulatorceller (6,25 x 105/ml, bestrålet ved 1000 R).
c. Dyrkningsmedium eller renset monoklonalt antistof mod ICAM-l (R6-5-D6) ved 10 yg/ml tilsattes på dag 0 med 24 timers intervaller.
25 d. Middelværdi + middelfe^l af 4-6 kulturer.
e. nd » ikke udført.
f. Procent inhibering
I DK 175362 B1 I
I 114 I
Sammenfattende kan det anføres, at evnen hos an- I
tistof mod ICAM-1 til at inhibere MLR viser, at ICAM-1 I
monoklonale antistoffer har terapeutisk anvendelighed I
ved akut transplantationsafvisning. ICAM-l monoklonale I
5 antistoffer har desuden terapeutisk virkning ved be- I
I slægtede immunmedierede sygdomme, der afhænger af I
LFA-1/ICAM-1 regulerede celle-til-celle-interaktioner. I
I De her beskrevne forsøg viser at tilsætningen af I
I monoklonale antistoffer til ICAM-1 inhiberer den bian- I
10 dede lymfocytreaktion (MLR), når de tilsættes under de I
I første 24 timer af reaktionen. ICAM-1 bliver yderligere I
opreguleret på humane perifere blodmonocytter under I
I in vitro dyrkning. I
Det har yderligere vist sig, at ICAM-1 ikke I
15 eksprimeres på hvilende humane perifere blodlymfocytter I
eller -monocytter. ICAM-1 opreguleres på monocytterne I
af dyrkede celler alene eller celler, der er codyrket I
med ikke-relaterede donorceller i en blandet lymfo- I
cytreaktion under anvendelse af almindelige flowcyto- I
I 20 metriske analyser. Denne opregulering af ICAM-1 på mo- I nocytter kan anvendes som en indikator for inflamma- I tion, især hvis ICAM-1 eksprimeres på friske monocytter I fra individer med akut eller kronisk inflammation.
I ICAM-l's specificitet for aktiverede monocytter
I 25 og evnen hos antistof mod ICAM-1 til at inhibere en MLR
tyder på, at lCAM-1-monoklonale antistoffer kan have en mulig diagnostisk og terapeutisk anvendelighed ved akut transplantationsafvisning og relaterede immunmedierede sygdomme, der kræver celle-til-celle-interaktioner.
30
Eksempel 28 I Synergistiske virkninger af den kombinerede administre- ring af antl-ICAM-1- og anti-LFA-1-antlstoffer.
Som vist i eksempel 27 inhiberes MLR af anti- 35 ICAM-1-antistof. MLR kan desuden inhiberes af anti- LFA-l-antistoffet. For at bestemme hvorvidt den kombi- 115 DK 175362 B1 nerede administration af anti-ICAM-l- og anti-LFA-l-antistoffer ville have en forbedret eller synergistisk virkning gennemførtes en MLR-prøve {gennemført som beskrevet i eksempel 27) i nærværelse af forskellige 5 koncentrationer af de to antistoffer.
Denne MLR-prøve viste, at kombinationen af anti-ICAM-l plus anti-LFA-1, i koncentrationer, hvor intet af de to antistoffer alene dramatisk inhiberer MLR, er signifikant mere potente mht. inhibering af MLR-reak-10 tionen (Tabel 17). Dette resultat indikerer at terapier som involverer coadministreringen af anti-ICAM-l-anti-stof (eller fragmenter deraf) og anti-LFA-l-antistof (eller fragmenter deraf) har evnen til at bibringe en forbedret anti-inflammatorisk terapi. En sådan forbed-15 ret terapi muliggør administrering af lavere doser af antistof, end der ellers ville være terapeutisk effektive, og dette er af vigtighed, hvor høje koncentrationer af individuelle antistoffer inducerer en antiidio-typisk reaktion.
I DK 175362 B1
I 116 I
I Tabel 17 I
I Virkning af forskellige doser af anti-lCAM-i og I
I (R3.1) anti-LFA-1 på blandet lymfocytreaktion. I
I 5 % Inhibering I
Koncentration (μg/ml) I
Anti-ICAM-l (R6-5-D6) . I
Anti-LFA-1 0 0,004 0,02 0,1 0,5 2,5 I
I 10 0,0 0 7 31 54 69 70 I
I 0,0008 1 7 28 48 62 71 I
I 0,004 0 13 30 50 64 72 I
I 0,02 29 38 64 75 84 86 I
I 0,1 92,5 90 91 92 92 92
15 0,5 93 90 90 92 93 91 I
Eksempel 29 I
20 Additive virkninger af kombineret administrering af I
sub-optimale doser af anti-ICAM-1 og andre immunosup- I
pressive midler i MLR. I
Som vist i eksempel 28 inhiberes MLR af kombina- I 25 tioner af anti-ICAM-1- og anti-LFA-l-antistoffer. Til I bestemmelse af, hvorvidt den kombinerede administration af anti-ICAM-1 og andre immunosuppressive midler (såsom I dexamethason, azathioprin, cyclosporin A eller steroi- I der, som f.eks. prednison osv.) også ville have forøge- I 30 de virkninger, udførtes der MLR-prøver under anvendelse I af sub-optimale koncentrationer (dvs. koncentrationer, I som vil være lavere end den optimale koncentration, ved I hvilken midlet alene vil blive administreret til et in- divid) af R6-5-D6 sammen med andre immunosuppressive I 35 midler ifølge protokollen i eksempel 27. Dataene angi- I ver, at de inhiberende virkninger af R6-5-D6 er i det 117 DK 175362 B1 mindste additive med de inhiberende virkninger af sub-optimale doser af dexamethason (Tabel 18), azathioprin (Tabel 19) og cyclosporin A (Tabel 20). Dette indebærer, at anti-lCAM-l-antistoffer kan være effektive med 5 hensyn til at sænke de nødvendige doser af kendte immunosuppressive midler og således nedsætte deres toksiske bivirkninger. Ved anvendelse af et anti-ICAM-l-antistof (eller et fragment heraf) til opnåelse af en sådan immunosuppression er det muligt at kombinere administre-10 ringen åf antistoffet (eller fragmentet heraf) med enten et enkelt yderligere immunosuppressivt middel, eller med en kombination af mere end et yderligere immunosuppressivt middel.
15 Tabel 18
Virkning af anti-ICAM-1 og dexamethason på human MLR
Inhibitor 3HT
20 Gruppe (ng/ml) Inkorporering % _(CPM)_inhiberinq
Medier - 156
Stimulatorer (S) - 101
Respondere (R) - 4.461 25 R X S_=_34.199 =_ R X S_R6-S-D6 (8) 26.224_23_ R x S_Dex (50) 14.158_59_ R X S R6-5-D6 (8) _+ Dex (50) 7.759_77_ 30 Dex: Dexamethason I DK 175362 B1
I 118 I
I Tabel 19 I
I Virkning af anti-lCAM-l og azathioprin på human MLR I
I 5 3HT
I Gruppe Inhibitor Inkorporering % I
I _(ng/ml)_(CPM)_Inhibering I
I Medier 78 I Stimulatorer (S) - 174 I 10 Respondere (R) - 3.419 I R x S_=_49.570_:_ R X S_R6-5-D6 (8) 44.374_11_ I R x S_Azathioprin (1) 42.710_14_ I R X S R6-5-D6 (8) I 15 _+ Azathioprin (1) 34.246_31 I Tabel 20
I Virkning af anti-ICAM-1 og cyclosporin A på human MLR
I 20 _ I
Inhibitor 3HT
Gruppe (ng/ml) Inkorporering % I ______(CPM)_Inhibering I Medier - 87 I 25 Stimulatorer (S) - 206 I Respondere (R) - 987 I R x S_=_31.640 =_ R x S_R6-5-D6 (8) 26.282_17____ I R x S_CyA (10) 23.617_25 I 30 R x S R6-5-D6 (8) I ___+ CyA (10) 19.204_39_
I CyA: Cyclosporin A
DK 175362 B1 119
Eksempel 30
Virkning af anti-ICAM-l-antistof mht. undertrykkelse af afvisningen af transplanterede alloqene organer.
Por at vise virkningen af anti-ICAM-l-antistof 5 mht. undertrykkelse af afvisningen af et allogenisk transplanteret organ, transplanteredes Cynomolgus aber med allogene nyrer i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af Cosimi et al. (Transplant. Proc. 13: 499-503 (1981)) med den ændring, at valium og ketamin 10 benyttedes som anæsthetika.
Nyretransplantationen gennemførtes således i det væsentlige som følger. Heterotropiske nyreallotrans-plantationer gennemførtes hos 3-5 kg Cynomolgus aber, i det væsentlige som beskrevet af Marquet (Marguet et 15 al., Medical Primatology, Part II, Basel, Karger, s.
125 (1972)) efter induktion af anæsthesi med valium og ketamin. Ende-til-side anastomoser af donor-nyrekar på et stykke af aorta eller vena cava konstrueredes under anvendelse af 7-0 Prolene sutur. Donorureteren 20 spatuleredes og implanteredes ind i blæren ved hjælp af den ekstravesiale metode (Taguchi, Y., et al♦, i Daus-set et al. (eds), i: Advances in Transplantation, Baltimore, Williams & Wilkins, s. 393 (1968)). Nyrefunktionen evalueredes ved ugentlige eller to gange ugent-25 lige serumcreatinin-bestemmelser. Yderligere skaffedes hyppige allotransplantationsbiopsier til histopatologiske undersøgelser, og fuldstændige autopsier gennemførtes på alle ikke-overlevende modtagere. Hos de fleste modtagere gennemførtes bilateral nephrectomi på trans-30 plantationstidspunktet, og efterfølgende uræmisk død betragtedes som slutpunktet for allotransplantations-overlevelse. Hos nogle modtagere gennemførtes unilateral nativ nephrectomi og kontralateral ureteral ligation på transplantationstidspunktet. Når allotrans-35 plantationsafvisning forekom, fjernedes ligaturen på den autologe ureter, hvilket resulterede i restituering
I DK 175362 B1 I
I 120 I
I af normal nyrefunktion og muligheden for at fortsætte I
I immunologisk overvågning af det modtagende dyr. I
I Monoklonalt antistof R6-5-D6 administreredes I
dagligt i 12 dage, startende to dage før transplanta- I
I 5 tion, i en dosis på 1-2 mg/kg/dag. Serumkoncentrationer I
I af creatinin testedes periodisk for at overvåger af- I
I visning, virkningen af anti-lCAM-l-antistof på immun- I
I systemets afvisning af de allogeniske nyrer er vist I
I i Tabel 21. I
-——<——»•«rajcr-'ggc.-i-g^cs——— - __ι^ο^|ΠΜΜ|ΒΒΒΗΜΐαΒΜΒΙί1]ΠΜΐ1ΙΓ!3ΐί]Ε^ΖΓΕ1ΐ1^_^ DK 175362 B1 121
Tabel 21 R6-5-D6-aktivitet mht. til forlængelse af nyreallo-transplantationsoverlevelse ved profylaktiske protokoller hos Cynomulgus aben1 5 _
Dage af overle-
Abe Dosis af R6-5-D6 (mg/kg) velse/efterbe- _handling_ 10 Kontrol 1 8
Kontrol 2 - 11
Kontrol 3 - li
Kontrol 4 - 10
Kontrol 5 - 9 15 Kontrol 6 10
Ml5 1,0 20 M19 1,0 7b M17 1,0 30 M25 1,5 29
20 M23 1,0 11C
M27 2,0 34 M7 0,5 22
Mil 0,5 26 MIO 0,5 22 25 M8_ 0,5_, _26^_
Aber fik indgivet R6-5-D6 i 12 på hinanden følgen-* de dage begyndende to dage før transplantationen.
b Dødsårsag er ukendt. Der var tegn på latent mala-30 ria.
c Død af nyre-infarkt.
^ Stadig i live den 15. august 1988.
Resultaterne viser, at R6-5-D6 var effektivt med 35 hensyn til at forlænge livet hos aber, der havde fået foretaget allogeniske nyretransplantationer.
I DK 175362 B1 I
I 122 I
I Eksempel 31 I
I Virkning af anti-ICAM-l-antistof med hensyn til under- I
I trykkelse af akut afstødning af transplanterede orga- I
I 5 ner. I
I For at vise at anti-ICAM-l-antistof er effektivt I
I i en akut model af transplantatafstødning, testedes I
R6-5-D6 også i en terapeutisk eller akut nyreadstød- I
I 10 ningsmodel. I denne model transplanteredes abenyrer I
I (under anvendelse af. den i eksempel 30 beskrevne pro- I
I tokol), og der blev perioperativt indgivet 15 mg/kg I
I cyclosporin A (CyA) i.m., indtil der var opnået stabil I
I nyrefunktion. Dosen af CyA formindskedes derefter to I
I 15 gange om ugen i spring på 2,5 mg/kg, indtil der ind- I
trådte afstødning som angivet ved en stigning i blod- I
I kreatininkoncentrationerne. På dette tidspunkt admini- I
streredes R6-5-D6 i 10 dage, og overlevelseslængde re- I
H gistreredes. Det er vigtigt at bemærke, at ved denne I
20 protokol forbliver dosen af CyA suboptimal, da den ikke ændrer sig, når først den akutte afstødningsepisode H indtræder. I denne model overlever historiske kontrol- dyr (N=5) uden nogen antistof-redning i 5 til 14 dage I fra startén af afstødningsepisoden. Til dato testedes I 25 seks dyr under anvendelse af R6-5-D6 i denne protokol I (Tabel 22). To af disse dyr er stadig overlevende (M12, I 31 dage og M5, 47 dage efter administreringen af R6-5-D6). To dyr levede 38 og 55 dage efter påbegyndel- sen af R6-5-D6-terapi, og to dyr døde af andre årsager 30 end akut afstødning (et dyr døde af CyA-toksicitet}, og I det andet døde, medens det fik indgivet R6-5-D6 under I anæsthesi. Denne model ligger tættere på den kliniske I situation, i hvilken R6-5-D6 først ville blive anvendt.
DK 175362 B1 123
Tabel 22 R6-5-D6-aktivitet mht. forlængelse af nyreallotrans-plantationsoverlevelse i terapeutiske protokoller hos 5 Cynomulgus abena
Dag for afstødnings- Dage af over-
Abe episode*3 levelse/efter- _behandling_ 10 Kontroldyrc 14-98 5-14 M24 41 38 M21 34 4d M3 41 55 M9 12 lle 15 Ml2 37 >31f M5_ 26_>46f_ a Aber fik indgivet 1-2 mg/kg af R6-5-D6 i 10 på hinanden følgende dage efter starten af afstødning.
20 ^ Dag, på hvilken kreatininkoncentrationerne steg som følge af nedsættelse af CyA-doseringen, og R6-5-D6-terapien startede.
c Fem dyr testedes under anvendelse af den ovenfor beskrevne terapeutiske protokol, bortset fra at 25 der ikke var nogen redningsterapi. Dage af over- levelse/efterbehandling repræsenterer overlevel-v sesdage, når først kreatininkoncentrationerne ' begyndte at stige.
d Døde under anæsthesi. Kreatininkoncentrationerne 30 var lave.
e Død af CyA-toksicitet. Kreatininkoncentrationerne var lave.
f Stadig i live den 15. august 1988.
I DK 175362 B1
I 124 I
I Eksempel 32 I
I Genetisk konstruktion og ekspression af afkortede deri- I
vater af ICAM-1 I
I I
I I dets naturlige tilstand er ICAM-1 et celle- I
I membran-bundet protein, der indeholder en ekstracellu- I
I lær region med 5 inununoglobulinlignende domæner, et I
I transmembrandomæne og et cytoplasmisk domæne. Det var I
I 10 ønskeligt at konstruere funktionelle derivater af I
I ICAM-1, der mangler transmembrandomænet og/eller det I
I cytoplasmiske domæne, idet der kunne frembringes en op- I
løselig, secerneret form af ICAM-1. Disse funktionelle I
I derivater konstrueredes ved oligonucleotid-dirigeret I
I 15 mutagenese af ICAM-l-genet, efterfulgt af ekspression i I
I abeceller efter transfektion med mutantgenet. I
I Mutationer i ICAM-l-genet resulterende i amino- I
I syresubstitutioner og/eller afkortede derivater frem- I
bragtes ved hjælp af den metode, der er angivet af I
I 20 Kunkel, T., (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 488- I
I 492 (1985)). ICAM-1 cDNA fremstillet som beskrevet I
I ovenfor underkastedes digestion med restriktionsendo- I
I nucleaser Sal 1 og Kpn 1, og det opnåede 1,8 kb DNA- I
I fragment subklonedes ind i plasmidvektoren CDM8 (Seed, I
I 25 B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 3365- I
I 3369 (1987)). En dut~, ung" stamme af E^ coli I
I (BW313/P3) transformeredes derefter med denne konstruk- I
>!< Ί
tion betegnet pCD1.8C. Et enkeltstrengs uracilholdigt ·. I
templat udfriedes fra transformanterne ved infektion I
I 30 med hjælper-fagen R408 (Stratagene). Mutant-ICAM-1- I
cDNA'er frembragtes derefter ved priming af en anden- I
I strengs-syntese med et oligonucleotid med umage baser I
I og efterfølgende transformation af en ung* vært I
I (MC1061/P3) med det opnåede heteroduplex. Mutanter I
35 isoleredes ved screening for nyskabte endonuclease- I
I restriktionssteder indført af mutant-oligonucleotidet. I
βπμγ.......-ir^s^aasgaaassaaBar^- - ..· j ., _ -Γ· DK 175362 B1 125
Mutant-ICAM-l-protelnet eksprimeredes ved transfek-tion af Cos-7 celler med mutant-DNA'et i den eukaryoti-ske ekspressionsvektor CDM8 under anvendelse af sædvanlige DEAE-dextran-metoder (Selden, R.F. et al., I: 5 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds. (side 9.2.1-9.2.5 (1987)).
Et afkortet funktionelt derivat af ICAM-1, der mangler transmembrandomænet og det cytoplasmiske domæne, men indeholder den ekstracellulære region med alle 10 5 immunoglobulinlignende domæner, fremstilledes. Et 30 bp mutant-oligonucleotid (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) anvendtes til transformering af kodonerne for aminosyrerne tyrosin (Y) og glutaminsyre (E) i henholdsvis stillingerne 452 og 45 3 til en phenylalanin 15 (F) og et translations-stopkodon (TAG). Mutanten isole- redes ved hjælp af dens unikke Xba 1 restriktionssted og betegnedes Y4S2E/F,TAG.
Til ekspression af mutant-proteinet transficere-des COS-celler med tre mutant-subkloner (nr. 2, nr. 7 20 og nr. 8). Tre dage efter transfektion med de tre mutant-subkloner analyseredes kultursupernatanter og cellelysater ved immunopræcipitation med anti-ICAM-1 monoklonalt antistof RR1/1 og SDS-PAGE. ICAM-1 præci-piteredes fra kultursupernatanterne fra celler trans-25 ficeret med mutant-subkloner nr. 2 og nr. 8, men ikke fra detergent-lysater af disse celler. Molekylvægten af i kultursupernatanten fundet ICAM-1 var formindsket ca.
6 kd i forhold til membranformen af ICAM-1, hvilket stemmer med den ud fra mutant-DNA'et forudsagte stør-30 relse. Dette funktionelle derivat af ICAM-1 ekskreteres således som et opløseligt protein. I modsætning hertil immunopræcipiteredes ICAM-1 ikke fra kontrolkultursu-pernatanter fra celler transficeret med nativt ICAM-1, hvilket viser, at membranformen af ICAM-1 ikke udgydes 35 fra Cos-celler. Endvidere immunopræcipiteredes der ikke noget ICAM-1 fra hverken kultursupernatanter eller cel- I DK 175362 B1
I 126 I
I lelysater fra negativ kontrol skin-transficerede cel- I I ler. I I Det fra transficerede celler secernerede afkor- I I tede ICAM-1 rensedes ved immunoaffinitetschromatografi I I 5 med et ICAM-1 specifikt antistof (R6-5-D6) og testedes % I I for funktionel aktivitet ved en cellebindingsprøve. I I Efter rensning i nærværelse af detergentet octylgluco- I
sid fortyndedes præparater indeholdende nativt ICAM-1 I I eller den afkortede, secernerede form til en slutkon- I I 10 centration på 0,25% octylglucosid {en koncentration un- I I der den kritiske micellekoncentration af detergentet). I I Man lod disse præparater af ICAM-1 binde til overfla- I I derne af 96-brønds plastplader (Nunc) til frembringelse I I af ICAM-1 bundet til en fast fase. Efter udvaskning af I I 15 ubundet materiale bandt ca. 75-80% og 83-88% af SKW-3- I
celler, som bar LFA-1 på deres overflade, specifikt til I I henholdsvis den native og den afkortede form af ICAM-1. I I Disse data viser, at det secernerede, afkortede opløse- I I lige funktionelle derivat af ICAM-1 bevarede både den I I 20 immunologiske reaktivitet og den evne til at mediere I I ICAM-1-afhængig adhæsion, som er karakteristisk for na- I I tivt ICAM-1.
Et funktionelt derivat af ICAM-1, der kun mang-I ler det cytoplasmiske domæne, fremstilledes ved lignen-I 25 de metoder. Et 25 bp oligonucleotid (TC AGC ACG TAC CTC I TAG AAC CGC CA) anvendtes til at ændre kodonet for ami- nosyre 476 (Y) til et TAG-translationsstopkodon. Mutan-I ten betegnedes Y476/TAG. ved immunopræcipitationsanaly-I se og SDS-PAGE af Cos-celler transficeret med mutanten I 30 påvistes en membranbundet form af ICAM-1 med en mole- kyl vægt på ca. 3 kd mindre end for nativt ICAM-1. In-I direkte immunofluorescens af de mutant-transficerede I Cos-celler viste et lignende punkteret farvningsmønster I som for nativt ICAM-1 eksprimeret på LPS-stimulerede I 35 humane endothelceller. Endelig bandt celler transfice-I ret med 'mutant-DNA'et specifikt til renset LFA-1 på 127 DK 175362 B1 plastoverflader på lignende måde som Cos-celler trans-ficeret med nativt ICAM-1 DNA (Tabel 23).
Tabel 23 5
Evne hos celler, der eksprimerer ICAM-l eller et funktionelt derivat af ICAM-1 til at binde LFA-1 % Celler, der eksprime- 10 rer ICAM-1, som binder LFA-1 i nærværelse af: Transfektion Intet antistof RR1/1 15 Skin 0 0
Nativt ICAM-1 20 0 Y4 7 6/TAG_20_0
Eksempel 33 20
Kortlægning af funktionelle domæner i ICAM-1
Undersøgelser af ICAM-1 har vist, at molekylet har 7 domæner. Fem af disse domæner er ekstracellulære 25 (idet domæne 5 ligger nærmest celleoverfladen og domæne 1 ligger fjernest fra celleoverfladen), ét domæne er et transmembrandomæne, og ét domæne er cytoplasmisk (dvs. ligger inde i cellen). Til bestemmelse af hvilke domæner, der bidrager til ICAM-1's evne til at binde LFA-1, 30 kan der anvendes epitopkortlægningsundersøgelser. Til udførelse af sådanne undersøgelser fremstiller man forskellige deletionsmutanter og karakteriserer dem med hensyn til deres evne til at binde til LFA-1. Alternativt kan undersøgelserne gennemføres under anvendelse 35 af anti-ICAM-antistof, som vides at gribe ind i ICAM-1's evne til at binde LFA-1. Eksempler på sådant
I DK 175362 B1 I
I 128 I
I egnet antistof indbefatter RRl/1 (Rothlein, R. et. al., I
I Immunol. 137: 1270-1274 (1986)), R6.5 (Springer, I
I T.A. et al., US patentansøgning nr. 07/250.446), LB-2 I
I (Clark, E.A. et al., I: Leukocyt Typing I (A. Bernard, I
I 5 et al., Eds♦), Springer-verlag side 339-346 (1984)) el- k I
I ler CL203 (Staunton, D.E. et al., Cell 56: 849-853 I
I (1989)). I
Deletionsmutanter af ICAM-1 kan frembringes ved I
I hjælp af et vilkårligt af flere forskellige midler. Det I
I 10 foretrækkes imidlertid at frembringe sådanne mutanter I
via sted-dirigeret mutagenese, eller ved hjælp af en I
anden rekombinant-metode (såsom ved konstruktion af I
ICAM-l-eksprimerende gensekvenser, hvori sekvenser, der I
I koder for bestemte proteinregioner, er blevet delete- I
I 15 ret. ProcedurerΓ der kan tilpasses til at frembringe I
I sådanne mutanter, er velkendte i teknikken. Under an- I
vendelse af sådanne procedurer fremstilledes der tre I
I ICAM-1-deletionsmutanter. Den første mutant mangler I
aminosyreresterne F185 til og med P284 (dvs. deletion I
20 af domæne 3). Den anden mutant mangler aminosyrerester- I
I ne P284 til og med R451 (dvs. deletion af domænerne 4 I
og 5). Den tredj e mutant mangler aminosyreresterne ef- I
ter Y476 (dvs. deletion af det cytoplasmiske domæne). I
Resultaterne af sådanne undersøgelser viser, at I
25 domænerne 1, 2 og 3 er overvejende involveret i ICAM-1- I
I interaktioner med anti-ICAM-l-antistof og LFA-1. I
I Eksempel 34 I
I 30 Virkning af mutationer i ICAM-1 på LFA-l-binding I
I ICAM-1's evne til at reagere med og binde til I
I LFA-1 medieres af ICAM-l-aminosyrerester, der er til I
I stede i domæne l i iCAM-l-molekylet (fig. 8, 9 og 10). I
I 35 Sådanne interaktioner understøttes imidlertid ved bi- I drag fra aminosyrer, der er til stede i domænerne 2 og ...... " ——· -·_;_· _ r ' .* ......:r«"y ·.:-ιr“*t";!jM.r ,-.Γ1* ~ΙΜ1 DK 175362 Β1 129 3 i ICAM-1. Blandt de foretrukne funktionelle derivater ifølge den foreliggende opfindelse er således opløselige fragmenter af ICAM-1-molekylet, som indeholder domænerne l, 2 og 3 fra ICAM-1. Mere foretrukket er opløse-5 lige fragmenter af ICAM-1-molekylet, som indeholder domænerne l og 2 fra ICAM-1. Mest foretrukket er opløselige fragmenter af ICAM-1-molekylet, som indeholder domæne 1 fra ICAM-1. Flere aminosyrerester indenfor det første ICAM-l-domæne er involveret i interaktionen mel-10 lem ICAM-1 og LFA-l. Substitutioner af disse aminosyrer med andre aminosyrer ændrer ICAM-l's evne til at binde LFA-l. Disse aminosyrerester og substitutionerne er vist i fig. 25. Fig. 25 viser virkningerne af sådanne mutationer på det opnåede mutant-ICAM-1-molekyle's evne 15 til at binde til LFA-l. I fig. 23-25 er der beskrevet rester under angivelse af étbogstavskoden for aminosyrer, efterfulgt af restens position i ICAM-l-molekylet.
Således refererer f.eks. "E90" til glutaminsyreresten i position 90 i ICAM-1. Tilsvarende refererer "E90V" til 20 det dipeptid, der er sammensat af glutaminsyreresten i position 90 og valinresten i position 91. Substitutionssekvensen er angivet til højre for skråstregen ("/"). Resterne V4, R13, Q27, Q58 og D60S61 i ICAM-1 er involveret i LFA-l-binding.
25 Erstatning af disse aminosyrer ændrede ICAM-l's evne til at binde til LFA-l. F.eks. resulterer erstatning af V4 med G i dannelsen af et mutant-ICAM-l-mole-kyle, der har mindre evne til at binde til LFA-l (fig.
25). Erstatning af Rl3-resten i ICAM-1 med E fører til 30 dannelsen af et mutant-molekyle med væsentlig mindre evne til at binde LFA-l (fig. 25). Erstatning af Q58-resten i ICAM-1 med H fører til dannelsen af et mutantmolekyle med i det væsentlige normal evne til at binde LFA-l (fig. 25). Erstatning af D60S-resterne i ICAM-1 35 med KL fører til dannelsen af et mutant-molekyle med væsentlig mindre evne til at binde LFA-l (fig. 25).
I DK 175362 B1
I 130 I
B Glycosyleringssteder i det andet domæne er også I
B involveret i LFA-l-binding (fig. 23). Erstatning af I
B NI03 med K, eller A155N med SV, resulterer i dannelsen I
af et mutant-ICAM-l-molekyle, der er i det væsentlige I
5 uden evne til at binde LFA-l. I modsætning hertil syn- I
tes erstatning af glycosy lerings stedet Ni 75 med A ikke I
i væsentlig grad at påvirke mutant-ICAM-1's evne til at I
I binde LFA-l.
B Mutationer i det tredje ICAM-l-domæne ændrer ik- I
B 10 ke i nævneværdig grad ICAM-l-LFA-l-bindingen (fig. 24).
Eksempel 35
Multimere former af ICAM-l med forøget biologisk hal- 15 veringstidaffinitet og dearance-evne
Der konstrueres kimæriske molekyler, hvori domæ- B nerne 1 og 2 fra ICAM-l er. knyttet til hængselsregionen i immunoglobulins tunge kæde. Foretrukne konstruktioner 20 har knyttet c-terminalen i ICAM-i-domæne 2 til et ség- B ment i genet for immunoglobulins tunge kæde lige N- B terminalt til hængselsregionen, hvilket muliggør den B segmentale fleksibilitet, der bibringes af hængsels- B regionen. ICAM-l-domænerne 1 og 2 vil således erstatte B 25 Fab-fragmentet i et antistof. Tilknytning til tunge kæ- B der af IgG-klassen og produktion af dyreceller vil re- B sultere i produktion af et kimærisk molekyle. Produk- tion af molekyler, der indeholder tunge kæder hidrøren- I de fra IgA eller IgM vil resultere i produktion af mo- I 30 lekyler med højere multimericitet indeholdende fra 2 I til 12 ICAM-i-molekyler. Co-ekspression af J-kæde-gen i I de dyreceller, der producerer de kimæriske ICAM-1- tung-kæde-molekyler vil muliggøre korrekt samling af I IgA- og IgM-multimere resulterende hovedsageligt i IgA- I 35 molekyler indeholdende 4 til 6 ICAM-l-molekyler og i tilfælde af IgM indeholdende ca. 10 ICAM-i-molekyler.
--.ΊΓιί " ill in· i"'f »*ι«π>ιιηι^Μ»ιι/^Μΐ^ΜΙΊι· li. ιτίι·ι·μι··ιιιιγιιιπ>··Τ Τ- · ',ιΓ—iL -- - —3Κ*-!" ' ~", ' ' '^Pvr'T’f ' ’·' ' ' ' · · ·*|Τ·" :'--ι DK 175362 B1 131
Disse kimæriske molekyler kan have flere fordele. For det første er Ig-molekyler konstrueret til at have lang levetid i kredsløbet, og dette kan forbedre den biologiske halveringstid.
5 Endvidere vil den multimere natur af disse mani pulerede molekyler gøre det muligt for dem at reagere med større iver med rhinovirus såvel som med celleover-flade-LFA-1, afhængig af den terapeutiske sammenhæng, og således i høj grad formindske mængde af rekombinant-10 protein, som man behøver administrere for at få en effektiv dosis. IgA og IgM er i høj grad glycosylerede molekyler, der normalt er til stede i sekreter på steder med slimhinder såsom i næsen. Deres i høj grad hydrofile natur hjælper til med at holde bakterier og vi-15 rus, hvortil de binder, ude i slimhinden, hvorved de forhindrer vedhæftning til celler og forhindrer passage gennem epithelcellemembranbarrieren. De kan således have forøget terapeutisk effektivitet. IgM og især IgA er stabile i slimhindeområder, og de kan forøge stabilite-20 ten af ICAM-1-konstruktionerne. Hvis et sådant funktionelt derivat af ICAM-l administreres i blodstrømmen, kan det også forøge den biologiske halveringstid. IgA binder ikke komplement og vil således være ideelt til anvendelser, hvor dette ville være skadeligt. Hvis der 25 ønskes igG-H-kæde-kimærer, ville det være muligt at mutere regioner involveret i vedhæftning til komplement såvel som i interaktioner med Fc-receptorer.
I DK 175362 B1 I
I 132 I
I Eksempel 36 I
I Frembringelse af ICAM-l-mutanter I
I 5 Oliqonucleotid-dirlgeret mutaqenese I
I Koderegionen i et ICAM-l cDNA i et 1,8 kb Sall- I
I Kpnl-fragment subklonedes ind i ekspressionsvektoren I
CDMB (Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) I
I 10 84: 3365-3369 (1987)). Baseret på metoder angivet af I
I Kunkel, T., (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 488- I
I 492 (1985)) og modifikationer angivet af Staunton D. I
et al^ (Staunton, D.E. et al., Cel! 52: 925-933 (1988)) I
I anvendtes denne konstruktion (pCD1.8) til frembringelse I
I 15 af et enkeltstrengs uracilholdigt templat, der skal an- I
I vendes ved oligonucleotid-dirigeret mutagenese. I
I Kort beskrevet transformeredes E^ coli stamme I
I XS127 med pCDl.8. Enkeltkolonier dyrkedes i 1 ml af I
I Luria Broth (LB) medium (Difco) med 13 yg/ml ampicillin I
I 20 og 8 yg/ml tetracyclin indtil nær mætning. 100 μΐ af I
I kulturen inficeredes med R408 hjælper-fag (Strategene) I
I ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10, og der til- I
I sattes 10 ml LB medium med ampicillin og tetracyclin I
I til en 16 timers kultur ved 37°C. Efter centrifugering I
25 ved 10.000 o/min i 1 minut og 0,22 ym filtrering af su- I
pernatanten anvendtes fag-suspensionen til at inficere I
I E^ coli BW313/P3, som derefter udpladedes på LB agar I
I (Difco) plader suppleret med ampicillin og tetracyclin. I
I Kolonier udplukkedes, dyrkedes i 1 ml LB medium med I
I 30 ampicillin og tetracyclin til nær mætning og inficere- des med hjælper-fag ved en MOI på 10. Dyrkningsvolume- I net forøgedes derefter til 250 ml, og cellerne dyrkedes I natten over. Enkeltstrengs DNA isoleredes ved sædvanlig I fag-ekstraktion.
I 35 Mutant-oligonucleotider phosphoryleredes og an- I vendtes med pCD1.8-templatet i en andenstrengs-syntese- 133 DK 175362 B1 reaktion (Staunton, D.E. et al., Cell 52; 925-933 (1988)).
Transfektlon 5 COS-celler podedes i 10 cm vævskulturplader, således at de ville være 50% sammenflydende efter 16-24 timer. COS-cellerne vaskedes derefter en gang med TBS og inkuberedes i 4 timer med 4 ml RPMI indeholdnde 10% 10 Nu-sera (Collaborative), 5 yg/ml chloroquin, 3 yg mu-tant-plasmid og 200 yg/ml DEAE-dextran-sulfat. Cellerne vaskedes derefter med 10% DMSO-PBS efterfulgt af PBS og dyrkedes i 16 timer i kulturmedium. Kulturmediet erstattedes med frisk medium, og 48 timer efter transfek-15 tion suspenderedes COS-cellerne ved trypsin/EDTA (Gibco) behandling og deltes i to, 10 cm plader samt 24 brønds vævskulturplader til HRV-binding. Ved 72 timer høstedes cellerne fra 10 cm pladerne med 5 mM EDTA/ HBSS og behandledes til adhæsion til LFA-l-overtrukket 20 plast og immunofluorescens.
LFA-i- og HRV-binding LFA-1 oprensedes fra SKW-3 lysater ved immuno- 25 affinitetschromatografi på TS2/4 LFA-1 mAb Sepharose og elueredes ved pH 11,5 i nærværelse af 2 mM MgCl2 og 1% octylglucosid. LFA-1 (10 yg pr. 200 yl pr. 6-cm plade) bandtes til bakteriologiske Petri skåle ved fortynding af octylglucosid til 0,1% i PBS (phosphat-pufret salt- 30 opløsning) med 2 mM MgCl2 og inkubation natten over ved 0 4 C. Pladerne blokeredes med 1% BSA (bovin serumalbumin) og opbevaredes i PBS indeholdende 2 mM MgCl2, 0,2% BSA, 0,025% azid og 50 yg/ml gentamycin.
51Cr-mærkede COS-celler i PBS indeholdende 5% 35 FCS (fetal kalveserum), 2 mM MgCl2, 0,025% azid (puffer) inkuberedes med eller uden 5 yg/ml RRI/1 og I DK 175362 B1 I 134 I R6.5 i LFA-l-overtrukne mikrotiterplader ved 25 C i Η 1 time. Ikke-vedhæftende celler fjernedes véd tre vask- I ninger med puffer. Vedhæftende celler elueredes ved H tilsætning af EDTA til 10 mM og taltes i en γ-tæller.
I 5
Resultater
Antl-lCAM-l-antistoffer, såsom RRl/l, R6.5, LB-2 eller CL203 er blevet identificeret. Hvis disse anti- 10 stoffer er i stand til at inhibere ICAM-l-funktion, må de være i stand til at binde til et bestemt sted i ICAM-1-molekylet, som også er vigtigt for iCAM-l-funk- tionen. Ved at fremstille de ovenfor beskrevne dele- tionsmutanter af ICAM-1 og bestemmte det omfang, hvori 15 anti-ICAM-l-antistofferne kan binde til deletionen, er det muligt at bestemme, hvorvidt de deleterede domæner er af betydning for funktionen.
ICAM-1 er et integrerende membranprotein, hvor- af det ekstracellulære domæne forudsiges at være sam- I 20 mensat af 5 Ig-lignende C-domæner. Til identificering af domæner involveret i binding af LFA-l deleteredes domæne 3 og domænerne 4 og 5 (carboxyl-terminal) ved oligonucleotid-dirigeret mutagenese og testedes funk- tionelt efter ekspression i COS-celler. Desuden dele- 25 teredes hele det cytoplasmiske domæne for at fastslå dets eventuelle indvirkning på ICAM-1-interaktioner.
I Som forventet viste deletionen af det cytoplasmiske do- I mæne Y476/* intet tab af RRl/l-, R6.5-, LB-2- og CL203- reaktivitet, medens deletion af domæne 3, F185-R451, I 30 resulterede i henholdsvis et fald i og tab af CL203- I reaktivitet (fig. 20). CL203-epitopet synes således at være placeret i domæne 4, medens RRl/l, R6.5 og LB-2 I synes at være placeret i de to amino-terminale domæner.
I Alle tre deletionsmutanter viser vild-type-ni- I 35 veauer med hensyn til adhærence til LFA-l (fig. 21).
I Aminosyresubstitutioner i forudsagte β-snoninger i do- 135 DK 175362 B1 mænerne 1, 2 og 3 blev også frembragt og testet funktionelt efter ekspression i COS-celler. R6.5-epitopet lokaliseredes således til sekvensen EliiGGA i domæne 2 og kan også involvere E39 i domæne 1, medens RR1/1 og 5 LB-2 begge er afhængige af RI3 i domæne 1 (fig. 22). Desuden nedsættes RRl/l-binding ved mutationer i sekvensen D71GQS. Mutationer, der eliminerer N-tilknyttede glycosyleringssteder ved NI03 og NI65, resulterer i nedsat RR1/1, R6.5 og LB-2, LFA-l-HRV-binding. Disse 10 mutationer synes at bevirke bearbejdning, således at der frembringes ICAM-l-dimere.
Andre mutationer i domæne 2 eller 3 resulterede ikke i ændret LFA-l-adhæsion (fig. 23 og 24). Aminosy-rerne RI3 og D60 i domæne 1 er begge involveret i bin-15 ding af LFA-l (fig. 25).
LFA-1- og HRV-binding synes således at være en funktion af det amino-terminale Ig-lignende domæne i ICAM-l. Fig. 26 viser en opstilling af amino-terminale domæner i I CAM.
20 Medens opfindelsen er beskrevet i forbindelse med specifikke udførelsesformer derfor, er det klart, at yderligere modifikationer er mulige, og den foreliggende beskrivelse tilsigter at dække alle variationer, anvendelser eller tilpasninger af opfindelsen, idet man 25 generelt følger principperne ifølge opfindelsen og herunder sådanne afvigelser fra den foreliggende beskrivelse som falder indenfor kendt eller sædvanlig praksis indenfor det område, hvortil opfindelsen hører, og som kan anvendes på de ovenfor anførte væsentlige træk in-30 denfor omfanget af de efterfølgende krav.
Hvad angår fremgangsmåden, der er anført på side 6, linie 1-18, kan der benyttes forskellige udførelsesformer som anført i nedenstående punkter 1 til 15.
1. En fremgangsmåde, hvori det funktionelle de-35 rivat af ICAM-l er et fragment af ICAM-l.
2. En fremgangsmåde som under punkt 1, hvori fragmentet indeholder domænerne 1, 2 og 3 fra ICAM-l,
I DK 175362 B1 I
I 136 I
B eller indeholder domænerne 1 og 2 fra ICAM-1, eller I
indeholder domæne 1 fra ICAM-1. I
B 3. En fremgangsmåde, hvori det nævnte ICAM-1 el- I
ler det nævnte funktionelle derivat af ICAM-1 er et op- I
I 5 løseligt protein, hvorhos det opløselige protein kan I
mangle transmembran-domænet i ICAM-1 eller det cyto- I
B plasmiske domæne i ICAM-1. I
B 4. En fremgangsmåde, hvori det anti-inflammato- I
B riske middel er et antistof, der er i stand til at bin- I
I 10 de til ICAM-1, hvilket antistof kan være et monoklonalt I
I antistof, og hvilket monoklonale antistof kan være I
R6-5-D6.
I 5. En fremgangsmåde, hvori det anti-inflammato- I
I riske middel er et fragment af et antistof, hvilket I
15 fragment er i stand til at binde til ICAM-1, og hvilket I
fragment kan være et fragment af antistoffet R6-5-D6. I
B 6. En fremgangsmåde, hvor nævnte inflammation er I
en reaktion fra det specifikke forsvarssystem. I
7. En fremgangsmåde, hvor nævnte inflammation er B 20 en forsinket-type-hypersensibilitetsreaktion.
8. En fremgangsmåde, hvor nævnte inflammation er B et symptom på psoriasis.
B 9. En fremgangsmåde, hvor nævnte inflammation er B et symptom på en autoimmun sygdom, hvilken autoimmune B 25 sygdom kan være Reynaud's syndrom, autoimmun thyroi- B ditis, B EAE, multipel sclerosis, rheumatoid arthritis og lupus B erythematosus.
I 10. En fremgangsmåde, hvor nævnte inflammation I 30 er en reaktion på organtransplantatafstødning, hvor or- I gantransplantatet kan være et nyretransplantat.
11. En fremgangsmåde, hvor nævnte inflammation I er en reaktion på vævstransplantatafstødning.
I 12. En fremgangsmåde, der yderligere omfatter I 35 administrering af et middel valgt blandt et antistof, I der er i stand til at binde til LFA-l; et funktionelt 137 DK 175362 B1 derivat af et antistof, hvilket funktionelle derivat er i stand til at binde til LFA-1; og en ikke-immunoglobulin antagonist af LFA-1.
13. En fremgangsmåde, der yderligere omfatter 5 administreringen af et immunosuppressivt medikament, hvilket immunosuppressive medikament kan administreres til individet i en sub-optimal dosis og endvidere kan være valgt blandt dexamethason, azathioprin og cyclosporin A.
10 14. En fremgangsmåde, hvor det anti-inflammato riske middel administreres profylaktisk til individet.
15. En fremgangsmåde, hvor det anti-inflammatoriske middel administreres terapeutisk til individet·
Hvad angår den fremgangsmåde, der er angivet på 15 side 6, linie 19 til .linie .36,.. . . kan der benyttes de i nedenstående punkter 16 til 17 anførte udførelsesformer.
16. En fremgangsmåde, hvor det anti-inflammatoriske middel er et antistof, der er i stand til at bin- 20 de til ICAM-1, hvilket antistof kan være et monoklonalt antistof, og hvilket monoklonalt antistof kan være R6-5-D6.
17. En fremgangsmåde, hvori det anti-inflammatoriske middel er et fragment af et antistof, hvilket 25 fragment er i stand til at binde til ICAM-1, og hvilket fragment kan være et fragment af antistoffet R6-5-D6.
Endelig kan der på basis af opfindelsen anvendes en fremgangsmåde til behandling af inflammation hidrørende fra en reaktion fra det ikke-specifikke forsvars-30 system hos et mammalia-individ, hvilken fremgangsmåde omfatter administrering af en mængde af et anti-inflam-matorisk middel, som er tilstrækkelig til at undertrykke nævnte inflammation, til et individ, der har behov for en sådan behandling, og ved hvilken fremgangsmåde 35 det anti-inflammatoriske middel vælges blandt: et fragment af ICAM-1, der indeholder domænerne l, 2 og 3 fra
I DK 175362 B1 I
I '136 I
I ICAM-1; et fragment af ICAM-1, der indeholder domænerne I
I 1 og 2 fra ICAM-1; og et fragment af ICAM-1, der inde- I
I holder domæne 1 fra ICAM-1. I
Claims (15)
1. Opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1.
2. Funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge krav l, kendetegnet ved, at det er et fragment af 5ICAM-1 eller en variant, en analog eller et kemisk derivat af et sådant fragment:.
3. Funktionelt derivat af ICAM-l ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det manger det cytoplas-miske domæne af ICAM-1.
4. Funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge krav 2 10 eller 3, kendetegnet ved, at det mangler transmembran-domænet af ICAM-1.
5. Rekombinant DNA-molekyle, kendetegnet ved, at det er i stand til at eksprimere et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vil- 15 kårligt af kravene 1-4.
6. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter a) et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, og b) en bærer eller et excipiens.
7. Opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, til anvendelse ved fremstilling af et farmaceutisk præparat til behandling af inflammation hidrørende fra en reaktion fra det specifikke eller ikke-specifikke forsvarssystem.
8. Opløseligt funktionelt derivat af ICAM-l 25 ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, til anvendelse ved fremstilling af et farmaceutisk præparat til undertrykkelse af metastasis af en hæmatopoietisk tumorcelle, hvilken celle kræver et funktionelt medlem af LFA-1 familien til migrering.
9. Toxin-derivatiseret, opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, til anvendelse ved undertrykkelse af væksten af en LFA-1 eksprimerende tumorcelle. I DK 175362 B1 I I 140 I
10. Anti-inflammatorisk middel til anvendelse I I ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat, der I I skal anvendes sammen med et immunosuppressivt medika- I I ment, som fortrinsvis er valgt blandt dexamethason, I I azathioprin og cyclosporin A, til behandling af inflam- I I 5 mation hidrørende fra en reaktion fra det specifikke I forsvarssystem, kendetegnet ved, at det er I I valgt blandt et antistof, der er i stand til at binde I I til ICAM-1; et fragment af et antistof, hvilket frag- I I ment er i stand til at binde til ICAM-1; ICAM-1; et I I 10 funktionelt derivat af ICAM-1; og en ikke-immunoglobu- I I lin antagonist af ICAM-1. I
11. Anti-inflammatorisk middel ifølge krav 10, I I kendetegnet ved, at det er et opløseligt I I funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af I I ie kravene 1-4. I
15 I
12. Anti-inflammatorisk middel til anvendelse I ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat til be- I I handling af inflammation hidrørende fra en reaktion fra I det specifikke forsvarssystem, og som skal anvendes I I sammen med et andet middel valgt blandt et antistof, I 20 der er i stand til at binde til LFA-l; et funktionelt I I derivat af et antistof, hvilket funktionelle derivat er I I i stand til at binde til LFA-l; og en ikke-immunoglo- I I bulin antagonist af LFA-l; kendetegnet ved, I I at det anti-inflammatoriske middel er valgt blandt et I I 25 antistof, der er i stand til at binde til ICAM-1; et I I fragment af et antistof, hvilke fragment er i stand til I I at binde til ICAM-1; ICAM-1; et funktionelt derivat af I I ICAM-1; og en ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1. I
13. Anti-inflammatorisk middel ifølge krav 12, I kendetegnet ved, at det er en opløseligt 30 funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1-4.
14. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter a) et anti-inflammatorisk middel 141 DK 175362 B1 valgt blandt et antistof, der er i stand til at binde til ICAM-1; et fragment af et antistof, hvilket fragment er i stand til at binde til ICAM-1; ICAM-1; et funktionelt derivat af ICAM-1; og en ikke-immunoglo-bulin antagonist af ICAM-l, og b) mindst ét immunosup-pressivt middel valgt blandt dexamethason, azathioprin og cyclosporin A.
15. Fremgangsmåde til fremstilling af et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-1, kendetegnet ved, at man dyrker en værtsmikroorganisme, der 10 er blevet transformeret med en rekombinant vektor, som koder for et opløseligt funktionelt derivat af ICAM-l ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, under betingelser, hvor nævnte derivat eksprimeres og secerneres i kulturmediet, hvorefter man isolerer derivatet. 15 20 1 30
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US25044688A | 1988-09-28 | 1988-09-28 | |
US25044688 | 1988-09-28 | ||
US37388289A | 1989-06-30 | 1989-06-30 | |
US37388289 | 1989-06-30 | ||
PCT/US1989/004242 WO1990003400A1 (en) | 1988-09-28 | 1989-09-28 | Intercellular adhesion molecules, and their binding ligands |
US8904242 | 1989-09-28 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK128990D0 DK128990D0 (da) | 1990-05-25 |
DK128990A DK128990A (da) | 1990-07-26 |
DK175362B1 true DK175362B1 (da) | 2004-09-13 |
Family
ID=26940882
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK199001289A DK175362B1 (da) | 1988-09-28 | 1990-05-25 | Oplöseligt funktionelt derivat af ICAM-1, rekombinant DNA-molekyle og fremgangsmåde til fremstilling af nævnte derivat, farmaceutisk præparat indeholdende et sådant derivat og derivatets anvendelse til fremstilling af et sådant præparat, samt.... |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2976381B2 (da) |
KR (1) | KR900701846A (da) |
AU (2) | AU4412889A (da) |
DK (1) | DK175362B1 (da) |
FI (2) | FI102181B (da) |
HU (1) | HU218904B (da) |
WO (1) | WO1990003400A1 (da) |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6143298A (en) * | 1988-09-01 | 2000-11-07 | Bayer Corporation | Soluble truncated forms of ICAM-1 |
ZA896668B (en) * | 1988-09-01 | 1990-06-27 | Molecular Therapeutics Inc | A human rhinovirus receptor protein that inhibits virus infectivity |
ATE146968T1 (de) * | 1989-03-16 | 1997-01-15 | Blood Res Center | Verwendung von funkionellen derivaten des interzellulär-adhäsions-moleküls icam-1 in einer antivirus-therapie |
WO1991018010A1 (en) * | 1990-05-15 | 1991-11-28 | Swinburne Limited | Inhibition of viral infection using intercellular adhesion molecule-1-like peptides and/or analogues thereof |
WO1991018011A1 (en) * | 1990-05-15 | 1991-11-28 | Swinburne Limited | Inhibition of cell adhesion using intercellular adhesion molecule-1-like peptides and/or analogues thereof |
DK162890D0 (da) * | 1990-07-06 | 1990-07-06 | Novo Nordisk As | Polypeptid |
US5686582A (en) * | 1990-07-20 | 1997-11-11 | Bayer Corporation | Multimeric forms of human rhinovirus receptor protein |
US5686581A (en) * | 1990-07-20 | 1997-11-11 | Bayer Corporation | Multimeric form of human rhinovirus receptor protein |
US6107461A (en) * | 1990-07-20 | 2000-08-22 | Bayer Corporation | Multimeric forms of human rhinovirus receptor and fragments thereof, and method of use |
US5283058A (en) | 1990-08-30 | 1994-02-01 | The General Hospital Corporation | Methods for inhibiting rejection of transplanted tissue |
CA2056143A1 (en) * | 1990-11-28 | 1992-05-29 | Michael S. Diamond | The mac-1 binding site of icam-1 |
US5932214A (en) | 1994-08-11 | 1999-08-03 | Biogen, Inc. | Treatment for inflammatory bowel disease with VLA-4 blockers |
ES2165366T3 (es) * | 1992-06-11 | 2002-03-16 | Scripps Research Inst | Procedimientos y composiciones para inhibir la inflamacion mediada por celulas endoteliales y fibrinogeno. |
US5599790A (en) | 1992-06-11 | 1997-02-04 | The Scripps Research Institute | Fibrinogen γ chain polypeptide and compositions thereof |
CA2144738A1 (en) * | 1992-10-09 | 1994-04-28 | Michael Diamond | A subpopulation of mac-1 (cd11b/cd18) molecules which mediate neutrophil adhesion to icam-1 and fibrinogen |
DE4335273A1 (de) * | 1993-10-15 | 1995-04-20 | Univ Ludwigs Albert | Peptide zur Tumortherapie |
EP0762886A4 (en) * | 1994-04-19 | 1999-03-31 | Univ Kansas | ICAM-1 / LFA-1 SHORT CHAIN PEPTIDES AND METHODS FOR USE THEREOF |
AU6390696A (en) * | 1995-06-20 | 1997-01-22 | Trustees Of Boston University | Hypoxia-responsive adhesion molecules, specific antibodies, nd their uses |
CA2383773A1 (en) * | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating autoimmune disease |
ES2383525T3 (es) | 2003-11-05 | 2012-06-21 | Sarcode Bioscience Inc. | Moduladores de la adhesión celular |
CA2609053C (en) | 2005-05-17 | 2017-04-25 | Sarcode Corporation | Compositions and methods for treatment of eye disorders |
EP3797775A1 (en) | 2007-10-19 | 2021-03-31 | Novartis AG | Compositions and methods for treatment of diabetic retinopathy |
AR069333A1 (es) * | 2007-11-15 | 2010-01-13 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticuerpos monoclonales que se unen al receptor tirosin quinasa anexelekto (axl), hibridomas que los producen y sus usos |
WO2009139817A2 (en) | 2008-04-15 | 2009-11-19 | Sarcode Corporation | Crystalline pharmaceutical and methods of preparation and use thereof |
US8378105B2 (en) | 2009-10-21 | 2013-02-19 | Sarcode Bioscience Inc. | Crystalline pharmaceutical and methods of preparation and use thereof |
MX2015001098A (es) | 2012-07-25 | 2015-09-25 | Sarcode Bioscience Inc | Inhibidor del antigeno-1 asociado a la funcion del linfocito (lfa-1) y polimorfo del mismo. |
EP3717632B1 (en) | 2017-11-30 | 2022-10-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | B-cell cultivation method |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0289949B1 (en) * | 1987-05-04 | 1995-10-04 | Dana Farber Cancer Institute | Intercellular adhesion molecules, and their binding ligands |
ATE114972T1 (de) * | 1987-11-02 | 1994-12-15 | Baylor College Medicine | Verwendung von icam-1 oder ihre funktionelle derivate zur behandlung unspezifischer entzündungen. |
-
1989
- 1989-09-28 JP JP1510885A patent/JP2976381B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-09-28 AU AU44128/89A patent/AU4412889A/en not_active Abandoned
- 1989-09-28 HU HU074/89A patent/HU218904B/hu unknown
- 1989-09-28 KR KR1019900701105A patent/KR900701846A/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-09-28 WO PCT/US1989/004242 patent/WO1990003400A1/en active IP Right Grant
-
1990
- 1990-05-21 FI FI902490A patent/FI102181B/fi active IP Right Grant
- 1990-05-25 DK DK199001289A patent/DK175362B1/da not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-05-19 AU AU63192/94A patent/AU679506B2/en not_active Expired
-
1998
- 1998-05-18 FI FI981097A patent/FI107451B/fi active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1990003400A1 (en) | 1990-04-05 |
FI102181B1 (fi) | 1998-10-30 |
FI102181B (fi) | 1998-10-30 |
FI902490A0 (fi) | 1990-05-21 |
HU896074D0 (en) | 1990-11-28 |
FI981097A0 (fi) | 1989-09-28 |
AU4412889A (en) | 1990-04-18 |
AU679506B2 (en) | 1997-07-03 |
HU218904B (hu) | 2000-12-28 |
DK128990D0 (da) | 1990-05-25 |
FI981097A (fi) | 1998-05-18 |
DK128990A (da) | 1990-07-26 |
FI107451B (fi) | 2001-08-15 |
JP2976381B2 (ja) | 1999-11-10 |
HUT56120A (en) | 1991-07-29 |
AU6319294A (en) | 1994-08-25 |
KR900701846A (ko) | 1990-12-04 |
JPH03501861A (ja) | 1991-04-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK175362B1 (da) | Oplöseligt funktionelt derivat af ICAM-1, rekombinant DNA-molekyle og fremgangsmåde til fremstilling af nævnte derivat, farmaceutisk præparat indeholdende et sådant derivat og derivatets anvendelse til fremstilling af et sådant præparat, samt.... | |
DK174629B1 (da) | ICAM-1 eller et ICAM-1 derivat med samme funktionelle egenskaber, fremgangsmåde til udvinding af ICAM, samt anvendelse af ICAM-1 eller et ICAM-1 derivat med samme funktionelle egenskaber | |
US5612216A (en) | Nucleotide sequence encoding intercellular adhesion molecule-1 and fragments thereof | |
EP0606518B1 (en) | Intercellular adhesion molecules and their binding ligands | |
US5831036A (en) | Soluble fragments of human intercellular adhesion molecule-1 | |
DK175577B1 (da) | Intercellulære adhæsionsmolekyler og deres bindingsligander | |
AU629189B2 (en) | Intercellular adhesion molecules and their binding ligands | |
US20090035321A1 (en) | Intercellular adhesion molecules and their binding ligands | |
DK176020B1 (da) | Monoklonale antistoffer og fragmenter deraf, hybridomaceller til fremstilling af monoklonale antistoffer, fremgangsmåder til diagnosticering af tumorceller, anvendelse af antistoffer samt farmaceutiske præparater indeholdende samme | |
IE83840B1 (en) | Intercellular adhesion molecules, and their binding ligands | |
IE19960275A1 (en) | Intercellular adhesion molecules, and their binding ligands | |
NZ244853A (en) | Antibodies and fragments to icam-1, pharmaceutical composition | |
NO320241B1 (no) | Fragment av ICAM-1 og anvendelse derav i diagnose in vitro |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |