HU218904B

HU218904B - Eljárás ICAM-1-et kódoló rekombináns DNS előállítására, ICAM-1-et kifejező sejtek vagy ezzel kapcsolatos betegségek diagnosztizálására és a specifikus védekező rendszer válaszából eredő gyulladások kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására

Info

Publication number: HU218904B
Application number: HU074/89A
Authority: HU
Inventors: Michael Loran Dustin; Steven Dean Marlin; Robert Rothlein; Timothy Alan Springer
Original assignee: Dana-Farber Cancer Institute
Priority date: 1988-09-28
Filing date: 1989-09-28
Publication date: 2000-12-28
Also published as: DK128990D0; FI981097A0; HUT56120A; FI102181B; JP2976381B2; FI902490A0; FI107451B; AU679506B2; JPH03501861A; AU4412889A; FI102181B1; KR900701846A; DK175362B1; DK128990A; WO1990003400A1; AU6319294A; HU896074D0; FI981097A

Description

A találmány olyan intercelluláris adhéziós molekulákra vonatkozik, mint amilyen az ICAM-1. Ezek a molekulák egy olyan folyamatban vesznek részt, amelyben a limfocita populációk sejtszubsztrátumokat ismernek fel és hozzájuk tapadnak. Ez úgy történik, hogy az említett limfociták a gyulladásos helyekhez vándorolnak, és a gyulladásos reakciók során a sejtszubsztrátumokkal kölcsönhatásba lépnek. Vonatkozik a találmány ezenkívül még olyan ligandummolekulákra is, amelyek képesek az ilyen adhéziós molekulákhoz kapcsolódni, továbbá e ligandumok szűrővizsgálatára és az intercelluláris adhéziós molekulák, a ligandummolekulák és a szűrővizsgálatok alkalmazására.

A leukocitáknak hozzá kell kapcsolódniuk a sejtszubsztrátumokhoz, hogy megfelelően meg tudják védeni a gazdaszervezetet az idegen behatolókkal szemben, például a baktériumokkal vagy vírusokkal szemben. A védekezőrendszerről kitűnő ismertetést ad H. W. Eisen munkája [Microbiology, 3. kiadás, Harper és Row, Philadelphia (1980), 290-295. és 381-418. oldalak], A leukocitáknak úgy kell hozzákapcsolódniuk az endoteliális sejtekhez, hogy ezek el tudjanak vándorolni a keringésből a folyamatban lévő gyulladások helyére. Ezenkívül hozzá kell kapcsolódniuk az antigén bemutatósejtekhez, hogy végbemehessen a normál specifikus immunválasz, és végül hozzá kell kapcsolódniuk a megfelelő célsejtekhez, hogy a vírussal fertőzött vagy tumorsejtek lízise megtörténhessék.

Az utóbbi időben hibridóma technológiával azonosítottak olyan leukocita felületi molekulákat, amelyek részt vesznek e kapcsolódások közvetítésében. Röviden: humán T-sejtekkel szemben [D. Davignon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78,4535 -4539 (1981)] és egérlépsejtekkel szemben [T. Springer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 9, 301-306 (1979)] termelt olyan monoklonális antitesteket azonosítottak, amelyek a leukociták felületére kötődnek, és meggátolják a fent leírt kapcsolódással összefüggő reakciókat [T. A. Springer és munkatársai, Fed. Proc., 44,2660-2663 (1985)]. Az ezekkel az antitestekkel azonosított molekulákat Mac-1-nek és Lymphocyte Function-associated Antigén- 1-nek (LFA-1; limfocitafunkcióhoz kapcsolt antigén-1) nevezték el. A Mac-1 egy olyan heterodimer molekula, amely makrofágokon, granulocitákon és nagy, granuális limfocitákon fordul elő. Az LFA-1 szintén heterodimer, amely a legtöbb limfocitán megtalálható [T. A. Springer és munkatársai, Immunoi. Rév., 68,111-135 (1982)]. Ez a két molekula, plusz egy harmadik molekula, a pl50,95 (amelynek a szöveti megoszlása hasonlít a Mac-l-éhez) játszik szerepet a celluláris adhézióban [G. Keizer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 75,1142-1147 (1985)].

A fent leírt leukocitamolekulákról megállapították, hogy egy glükoproteinekkel rokon család tagjai [F. Sanchez-Madrid és munkatársai, J. Exper. Med., 158, 1785-1803 (1983); G. D. Keizer és munkatársai, Eur. J. Immunoi., 75,1142-1147 (1985)]. E glükoprotein családot olyan heterodimerek alkotják, amelyek egy a-láncot és egy β-láncot tartalmaznak. Megállapították, hogy míg mindegyik antigén α-lánca különbözik egymástól, a β-lánc nagymértékben állandó [F. Sanchez-Madrid és munkatársai, J. Exper. Med., 158, 1785-1803 (1983)]. Megállapították, hogy a glükoprotein-család β-láncának (néha CD 18 elnevezéssel szerepel) a molekulatömege 95 kD (kilodalton), ugyanakkor az α-lánc molekulatömege 150-180 kD között változik [T. Springer, Fed. Proc., 44,2660-2663 (1985)]. Bár a membránproteinek α-alegységei közt nincs olyan nagyfokú homológia, mint a β-alegységeknél, a glükoproteinek a-alegységeinek pontos analízise kimutatta, hogy alapvető hasonlóságok vannak közöttük. Az LFA-l-gyel rokon glükoproteinek a- és β-alegységei közt meglévő hasonlóságokat foglalják össze F. Sanchez-Madrid és munkatársai a következő közleményekben: J. Exper. Med., 158, 586-602 (1983) és J. Exper. Med., 158, 1785-1803 (1983).

Több olyan egyént azonosítottak, akik ezen adhéziós proteincsalád egyetlen tagját sem képesek normál mennyiségben kifejezni leukocitasejtjeik felületén [D. C. Anderson és munkatársai, Fed. Proc., 44, 2671-2677 (1985); D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 752, 668-689 (1985)]. Ezeknek a betegeknek a limfocitái hasonló hiányosságokat mutattak in vitro, mint azok a normál limfociták, amelyeknél az LFA-1 molekulacsaládot antitestekkel gátolták. Ezenkívül ezek az egyének képtelenek voltak normál immunválaszt adni, mivel sejtjeik képtelenek voltak sejtszubsztrátumokhoz hozzátapadni [D. C. Anderson és munkatársai, Fed. Proc., 44,2671-2677 (1985); D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 752,668-689 (1985)]. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az immunreakciók enyhülnek, ha a limfociták nem tudnak normál módon megtapadni, annak következtében, hogy hiányoznak az LFA-1 családhoz tartozó fünkcionális adhéziós molekulái.

Összefoglalva tehát egy állat egészségének és életképességének a fenntartásához az szükséges, hogy limfocitái képesek legyenek más sejtekhez (például endoteliális sejtekhez) hozzátapadni. Megállapították, hogy ehhez az adherenciához sejt-sejt kontaktusok szükségesek, melyben a limfociták sejtfelületén jelen lévő specifikus receptormolekulák vesznek részt. Ezek a receptorok segítik elő, hogy egy limfocita más limfocitákhoz, endoteliális sejtekhez és más, nem vaszkuláris sejtekhez tudjon tapadni. Megállapították, hogy a sejtfelületi receptormolekulák szoros rokonságban vannak egymással. Azoknál az embereknél, akiknél ezek a sejtfelületi receptormolekulák hiányoznak a limfocitákról, krónikus és visszatérő fertőzések fordulnak elő, valamint más klinikai tüneteik is vannak, beleértve a hiányos antitestválaszokat.

Minthogy a limfocitaadhézió abban a folyamatban is részt vesz, amelyben egy idegen szövet azonosítása és kilökődése megtörténik, ennek a folyamatnak a megértése nagy jelentőségű a szervátültetés, szövetátültetés, allergia és onkológia területén.

Rothlein, R. és munkatársai leírnak egy új leukocita sejtfelületi molekulát, a természetes ICAM-l-et [Journal of Immunology, 137 (2), 1270-1274 (1986)], amely mind redukáló, mind nem redukáló körülmények között 90 000 molekulatömegűnek mutatkozik

HU 218 904 Β

SDS-PAGE meghatározásban. Kísérletekkel demonstrálják az ICÁM-1-nek számos leukocita sejtvonal és T-sejt limfoblasztok forbol-észterrel stimulált homotípiás aggregációjában játszott szerepének fontosságát. Továbbá fejtegetik, hogy az ICAM-1 fontos szerepet játszhat a gyulladások során fellépő adhéziós folyamatok szabályozásában.

Mariin, S. D. leírja a természetes ICAM-1 molekula tisztítását [Cell, 51 (5), 813-819 (1987)], és kimutatja, hogy ez a molekula egy ligandum az LFA-1-függő adhéziós rendszer részére. Kísérletekkel azt is bemutatja, hogy a teljes természetes ICAM-1 molekula egyedül is elegendő közvetlenül a limfocitaadhézió közvetítésére.

Dustin, L. M. és munkatársai további jellemzőket közölnek az ICÁM-1-ről [Journal of Immunology, 137 (1), 245-254 (1986)]. Leírják a természetes, érett ICAM-1 glükoprotein jellemzőit, intracelluláris prekurzorát és a polipeptidvázat. Szintén megemlítik, hogy az ICÁM-1 szerepet játszhat a gyulladásos folyamatokban és az immunválaszban.

A jelen találmány tárgyát az intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1 =Intercellular Adhesion Molecule-1), valamint funkcionális származékai képezik. Vonatkozik ezenkívül a találmány olyan antitestekre és antitestfragmentumokra, amelyek az ICAM-1 funkcióját gátolni képesek, valamint az ICÁM-1 funkciós más inhibitoraira, továbbá azokra a vizsgálatokra, amelyekkel ezen inhibitorokat meg lehet határozni. Foglalkozik ezenkívül a találmány minden fent leírt molekula diagnosztikai és terápiás alkalmazásával.

Részletezve: a találmány magában foglalja az ICÁM-1 intercelluláris adhéziós molekulát és funkcionális származékait, amelyek lényegében nem tartalmaznak természetes eredetű szennyeződéseket. A találmányhoz tartoznak az olyan molekulák is, amelyek ezenfelül képesek egy, a limfociták felületén jelen lévő molekulákhoz kötődni.

Foglalkozik továbbá a találmány az ICAM-1 intercelluláris adhéziós molekulával és detektálható jelzéssel ellátott származékaival.

A találmány egy olyan rekombináns DNS-molekulára is vonatkozik, amely az ICAM-1 vagy funkcionális származéka kifejezésére képes.

A találmány ezenkívül magában foglal egy eljárást az ICAM-1 lényegében tiszta formában való előállítására, amely a következő lépésekből áll:

a) szolubilizált ICAM-1 készítmény előállítása céljából az ICAM-l-et kifejező sejtek membránjából származó ICAM-l-et oldhatóvá tesszük;

b) a szolubilizált ICAM-1 készítményt affinitásmátrixra visszük fel, ez a mátrix olyan antitestet tartalmaz, amely megköti az ICAM-l-et,

c) hagyjuk, hogy az affinitásmátrixon lévő antitest megkösse az ICÁM -1 -et,

d) a mátrixról eltávolítunk minden olyan vegyületet, amely nem kötődött az antitesthez, és

e) az ICAM-l-et lényegében tiszta formában izoláljuk úgy, hogy az ICAM-l-et a mátrixról eluáljuk.

A találmány foglalkozik ezenkívül egy olyan antitesttel, amely vagy az ICAM-1 molekulához, vagy az

ICAM-1 egy funkcionális származékához kötődik. A találmány az ilyen antitestet termelő hibridómasejtre is vonatkozik.

A találmány tárgyát képezi az a hibridómasejt is, amely az R6-5-D6 monoklonális antitest termelésére képes.

A találmány magában foglal továbbá egy eljárást a kívánt hibridómasejt előállítására, amely egy olyan antitestet termel, amely az ICÁM-1-hez képes kötődni, s ez az eljárás a következő lépésekből áll:

a) ICAM-l-et kifejező sejttel állatot immunizálunk,

b) az állat lépsejtjeit egy mielomasejtvonallal fuzionáljuk,

c) a fuzionált lép- és mielomasejtekből antitestszekretáló hibridómasejtek képződnek, és

d) a hibridómasejteket a kívánt ICÁM-1-hez kötődő antitestet termelő hibridómasejtre szüljük.

A találmány a fenti eljárás szerint kapott hibridómasejtre is és a hibridómasejt által termelt antitestre is vonatkozik.

A találmány tárgyát képezi egy olyan eljárás is, amellyel az intercelluláris adhézió nem immunglobulin antagonistáját azonosíthatjuk, mely eljárás a következő lépésekből áll:

a) egy olyan nem immunglobulin hatóanyagot, amely intercelluláris adhézióellenes hatást fejt ki, limfocitakészítménnyel inkubálunk, mely limfocitakészítményben a sejtek többsége aggregálódni képes;

b) vizsgáljuk a limfocitakészítményt, hogy meghatározzuk, vajon a hatóanyag jelenléte gátolja-e a limfocitakészítmény sejtjeinek aggregálódását; ha aggregációgátlás jön létre, úgy a hatóanyag az intercelluláris adhézió antagonistájának bizonyult.

A találmány foglalkozik még olyan gyulladások kezelésének módszerével, amelyek emlősökön a specifikus védekezőrendszer válaszaként lépnek fel. E módszer szerint az ilyen kezelést igénylő egyénnek egy gyulladásgátló szer olyan mennyiségét adjuk, amely elégséges a gyulladás megszüntetéséhez; a módszer szerint a gyulladásgátló szer vagy ICAM-l-hez kötődő antitest vagy olyan antitestffagmentum, amely képes az ICAM-l-hez kötődni vagy ICAM-1, vagy az ICAM-1 funkcionális származéka, vagy az ICÁM-1 nem immunglobulin antagonistája lehet.

A találmány magában foglalja továbbá a gyulladás kezelésének fent leírt módszerét, amelyben az ICAM-1 nem immunglobulin antagonistája nem azonos az LFA-l-gyel.

A találmány további tárgyát képezi egy olyan eljárás, amellyel a hematopoetikus tumorsejt - e sejt migrációjához szükség van az LFA-1 család egy funkcionális tagjára - metasztázisa meggátolható. Az eljárás szerint egy betegnek, akinek ilyen kezelésre szüksége van, a metasztázis gátlásához elegendő mennyiséget adunk a gyulladásgátló anyagból. A gyulladásgátló anyag vagy egy olyan antitest lehet, amely kötődik az ICÁM- 1-hez vagy olyan antitestfragmentum, amely kötődik az ICAM-l-hez vagy ICAM-1, vagy az ICAM-1 egy funkcionális származéka, vagy az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistája lehet.

HU 218 904 Β

Vonatkozik a találmány a hematopoetikus tumorsejt metasztázisa gátlásának fent leírt eljárására, amelyben azonban az ICAM-1 nem immunglobulin antagonistája egy nem LFA-1 típusú ICAM-1 nem immunglobulin antagonista.

A találmány egy olyan eljárást is tartalmaz, amellyel egy ICAM-l-et kifejező tumorsejt növekedését gátoljuk meg. Az eljárás szerint egy betegnek, akinek ilyen kezelésre szüksége van, egy toxinból a növekedés gátlásához elégséges mennyiséget adunk, s ez a toxin egy toxinnal módosított ICÁM-1-hez kötődni képes antitest vagy toxinnal módosított olyan antitestfragmentum lehet, amely az ICÁM-1-hez kötődni képes vagy az LFA-1 molekulacsalád toxinnal módosított egy tagja, vagy az LFA-1 molekulacsalád egy toxinnal módosított funkcionális származéka lehet.

Foglalkozik még a találmány egy olyan eljárással is, amellyel LFA-l-et kifejező tumorsejt növekedését gátoljuk meg. Az eljárás szerint egy betegnek, aki ilyen kezelést igényel, a tumorsejt növekedésének gátlásához elegendő mennyiségű toxint adunk, s ez a toxin vagy toxinnal módosított ICAM-1, vagy az ICAM-1 egy toxinnal módosított funkcionális származéka lehet.

A találmány tárgyát képezi még egy olyan módszer, amellyel olyan emlősökben, amelyeknél gyulladás gyanúja áll fenn, egy olyan gyulladás jelenlétét és helyét diagnosztizáljuk, amely a specifikus védekezőrendszer válaszának következményeként alakult ki, s e módszer abból áll, hogy

a) a betegnek detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmazó készítményt adunk be, mely ligandum ICAM-l-et kifejező sejtet tud azonosítani, és

b) a kötődő ligandumot észleljük.

A találmány ezenfelül megad egy diagnosztikai módszert, amellyel emlősökben, akiknél gyulladás gyanúja áll fenn, egy olyan gyulladás jelenlétét és helyét diagnosztizáljuk, amely a specifikus védekezőrendszer válaszának eredménye, s e módszer a következőket tartalmazza:

a) a betegből származó szövetmintát egy olyan készítménnyel inkubáljuk, amely egy detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmaz, mely ligandum ICAM-l-et kifejező sejt azonosítására képes, és

b) a kötődő ligandumot észleljük.

A találmány egy további olyan módszert is tartalmaz, amellyel ICAM-l-et kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk emlősökben, ha ilyen sejt jelenlétének gyanúja merül fel, s a módszer a következőket tartalmazza:

a) a betegnek egy detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmazó készítményt adunk be, mely ligandum ICÁM - 1-hez képes kötődni, s ez a ligandum vagy egy antitest, vagy egy olyan antitestfragmentum lehet, amely ICÁM-1-hez képes kötődni, és

b) a kötődő ligandumot észleljük.

A találmány tartalmaz ezenkívül egy olyan módszert, amellyel ICAM-l-et kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk emlősökben, ha ilyen sejt jelenlétének gyanúja merül fel, s a módszer a következőket tartalmazza:

a) a betegből származó szövetmintát egy olyan készítménnyel inkubáljuk, amely detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmaz, mely ligandum ICAM-1hez képes kötődni, és a ligandum vagy egy antitest, vagy egy olyan antitestfragmentum lehet, amely ICÁM-1-hez képes kötődni, és

b) a kötődő ligandumot észleljük.

A találmány egy további olyan módszert tartalmaz, amellyel az LFA-1 molekulacsalád egy tagját kifejező egy tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk egy betegben, akinél ilyen sejt jelenlétét feltételezzük, s a módszer a következőket tartalmazza:

a) a betegnek egy olyan detektálható jelzéssel ellátott ligandumot tartalmazó készítményt adunk be, mely ligandum az LFA-1 molekulacsalád egy tagjához képes kötődni, és ez a ligandum vagy ICAM-1, vagy ICAM-1 egy funkcionális származéka lehet, és

b) a kötődő ligandumot észleljük.

A találmány egy további olyan módszerre is vonatkozik, amellyel az LFA-1 molekulacsalád valamely tagját kifejező tumorsejt jelenlétét és helyét diagnosztizálhatjuk egy betegben, akinél ilyen sejt jelenlétét feltételezzük, s a módszer a következőket tartalmazza:

a) a betegből származó szövetmintát egy olyan detektálható jelzéssel ellátott ligandum jelenlétében inkubáljuk, amely az LFA-1 molekulacsalád egy tagjához képes kötődni, s ez a ligandum vagy ICAM-1, vagy az ICAM-1 egy funkcionális származéka lehet, és

b) észleljük a kötődő ligandumot, amely a szövetmintában lévő LFA-1 molekulacsalád egy tagjához van kötve.

A találmány magában foglal még egy olyan gyógyszerkészítményt, amely

a) olyan gyulladásgátló hatóanyagot tartalmaz, amely vagy az ICÁM- 1-hez kötődő antitest, vagy egy antitestfragmentum lehet, mely fragmentum az ICÁM-1-hez kötődik vagy az ICAM-1 egy funkcionális származéka, vagy az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistája lehet, és amely

b) legalább egy olyan immunszuppresszív hatóanyagot tartalmaz, amely vagy dexametazon vagy azatiopirin, vagy ciklosporin A lehet.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.

Az 1. ábra egy normál és egy LFA-1 hiányos sejt közötti adhéziót ábrázol.

A 2. ábra két normál sejt közötti adhézió folyamatát ábrázolja.

A 3. ábrán a celluláris aggregáció kinetikáját mutatjuk be 50 ng/ml PMA jelenlétében (o) és távollétében (X).

A 4. ábra az LFA-1 és az LFA-1+ sejtek közötti aggregációt mutatja be. Karboxi-fluoreszcein-diacetáttal jelzett EBV-transzformált sejteket (10⁴) összekevertünk PMA jelenlétében 10⁵ nem jelzett autológ sejttel (tele oszlopok) vagy JY sejtekkel (üres oszlopok). Másfél óra után a 2. példa szerinti kvalitatív vizsgálatot használva megszámoltuk a jelzett sejteket az aggregátumban vagy a szabadon lévő jelzett sejteket. Az aggregátumban lévő jelzett sejtek számát százalékban adjuk meg. Két kísérletből az egyik reprezentatív eredményét adjuk meg.

HU 218 904 Β

Az 5. ábrán az ICAM-1 és a JY eredetű LFA-1 immunprecipitációja látható. A JY sejtek Triton X-100 lizátumait (1 és 2 nyomsáv) vagy a kontroll lizálópuffert (3 és 4 nyomsáv) az ICÁM-1-hez kötődni képes antitesttel (1 és 3 nyomsáv), vagy az LFA-l-et kötni képes antitesttel (2 és 4 nyomsáv) immunprecipitáltuk. Az A mező a redukáló körülmények között kapott eredményeket, a B mező pedig a nem redukáló körülmények között kapott eredményeket mutatja. A molekulatömeg standardokat az S nyomsávban futtattuk.

A 6. ábra az IL- 1-nek és a gamma-interferonnak humán dermális fibroblasztokon az ICÁM-1-expressziójára gyakorolt hatása kinetikáját ábrázolja. Humán dermiális fibroblasztokat szaporítottunk 8-10⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. IL-l-et (10 egység/ml, betöltött körök) vagy rekombináns gamma-interferont (10 egység/ml, üres négyzetek) adtunk a sejtekhez, és a jelzett időkben vett mintákat 4 °C-ra hűtöttük, és elvégeztük az indirekt kötési vizsgálatot. A standard deviáció nem haladta meg a 10%-ot.

A 7. ábra az IL—1 és a gamma-interferon ICÁM-1-re gyakorolt hatásának koncentrációfuggését mutatja be. Humán dermális fibroblasztokat szaporítottunk 8 · 10⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. Az IL-2-t (üres körök), a rekombináns humán IL- 1-et (üres négyzetek), a rekombináns egér-IL-l-et (betöltött négyzetek), a rekombináns humán gamma-interferont (betöltött körök) és a rekombináns β-interferont (üres háromszögek) a jelzett hígításban adagoltuk, és 4 órán át (IL—1) vagy 16 órán át (β- és gamma-interferon) inkubáltuk. A kapott eredmények négy meghatározás átlagértékei, a standard deviáció nem haladta meg a 10%-ot.

A 8. ábrán az ICAM-1 cDNS nukleotid- és aminosavszekvenciája látható. Az első ATG az 58. pozícióban van. Az ICAM-1 tripszines peptideknek megfelelő transzlatált szekvenciákat aláhúztuk. A feltételezett hidrofób szignálpeptidet, valamint a transzmembrán szekvenciákat vastagon aláhúztuk. Az N-glükozilációs helyeket bekereteztük. A 2976-os pozícióban lévő poliadenilációs AAT AAA szignált fölé húzott vonallal jelöltük meg. Az ábrázolt szekvencia a HL-60 cDNSklón szekvenciája. Az endoteliális sejt cDNS-t majdnem teljes hosszában szekvenáltuk, és ez csak csekély különbségeket mutatott.

A 9. ábra az ICAM-1 homológ doménjeit és rokonságát ábrázolja az immunglobulin szupergén családdal.

A 9A. ábra 5 homológ domént (D 1 -5) ábrázol. Két vagy több azonos csoport esetén az egybeeső részt bekereteztük. A NCAM doménekben a kétszer vagy többször előforduló állandó csoportokat, valamint a C2 és Cl készletek doménjeiben lévő állandó csoportokat összehasonlítottuk az ICAM-1 belső ismétlődő szekvenciáival. Az ICAM-1 dómén várható β-szálainak helyzetét keretekkel és az összehasonlító sorok fölött lévő kis betűkkel jeleztük, az immunglobulin C doménekben lévő β-szálak ismert helyét keretekkel és az összehasonlító sorok alatti nagybetűkkel jelöltük. Az ICAM-1 doméneken belüli feltételezett diszulfidhidak helyét S-S jelzi.

A 9B-D. ábra az ICAM-1 doménekkel homológ proteindomének összehasonlítását mutatja; a proteinek kezdeti összehasonlítása úgy történt, hogy átkutattuk az NBRF adatbázist a FASTP program segítségével. A kapott szekvenciák a következők: MAG, NCAM, T-sejtreceptor, α-alegység, V-domén, IgMp-lánc és α-1 βglükoprotein.

A 10. ábrán az ICÁM-1 és a MAG szekunder szerkezetének az összehasonlítása látható.

All. ábra az LFA-1 pozitív EBV-transzformált Blimfoblasztoid sejtek kötődését ábrázolja ICÁM-1-hez planáris membránokon.

A 12. ábra az LFA-1 pozitív T-limfoblasztok és Tlimfóma-sejtek kötődését ábrázolja ICÁM-1-hez műanyaghoz kötött vezikulumokban.

A 13. ábra az JY B-limfoblasztoid sejtek ICAM-1hez való kötődésének gátlását mutatja be műanyaghoz kötött vezikulumokban. A sejteket vagy a vezikulumokat előzőleg monoklonális antitestekkel kezeltük.

A 14. ábra a hőmérséklet hatását mutatja be a Tlimfoblasztoknak ICÁM-1-hez való kötődésére műanyaghoz kötött vezikulumokban.

A 15. ábra a T-limfoblasztok ICAM-l-hez való kötődésének divalens kationszükségletét ábrázolja műanyaghoz kötött vezikulumokban.

A 16. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a Tsejttel összefüggő OKT3 antigén felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. Az „OKT3” jel az antigén hozzáadását jelenti.

A 17. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a nem specifikus T-sejt mitogén, a Concanavalin A felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. A „CONA” jel a Concanavalin A hozzáadását jelenti.

A 18. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a kagylóhemocianin (keyhole limpet hemocyanin) antigén felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. A „KLH” jel a kagylóhemocianinnak a sejtekhez való hozzáadását jelenti.

A 19. ábra az antiadhéziós antitestek hatását mutatja be a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a tetanusztoxoid antigén felismerésére adott válaszban megnyilvánuló proliferációs képességére. Az „AGN” jel a tetanusztoxoidnak a sejtekhez való hozzáadását jelenti.

A 20. ábra az RR1/1, R6.5, LB2 és CL203 monoklonális antitestekben az ICAM-1 deléciós mutánsokhoz való kötődését ábrázolja.

A 21. ábra az ICAM-1 deléciós mutánsoknak az LFA-1-hez való kötődését ábrázolja.

A 22. ábra az RR1/1, R6.5, LB2 és CL203 antiICAM-1 mononukleáris antitestek által felismert epitópokat mutatja be.

A 23. ábra az ICAM-1 dómén-2 mutánsainak LFA-1-kötő kapacitását mutatja be.

A 24. ábra az ICAM-1 domén-3 mutánsainak LFA-l-kötő kapacitását mutatja be.

HU 218 904 Β

A 25. ábra az ICAM-1 dómén-1 mutánsainak LFA-l-kötő kapacitását mutatja be.

A 26. ábra ICÁM aminoterminális domének összehasonlítását ábrázolja.

A jelen találmány - egyik szempontja szerint - egy LFA-1-hez kötődő természetes ligandumra vonatkozik. Azokat a molekulákat - ilyenek az LFA-1 család molekulái -, amelyek a sejtek adhéziósának folyamatában részt vesznek, „adhéziós molekulák”-nak nevezzük.

A találmány szerinti természetes ligandum „Intercelluláris Adhéziós Molekula-1” vagy „ICAM-1” elnevezést kapott. Az ICAM-1 egy 76-97 kD-os glükoprotein. Az ICAM-1 nem heterodimer. A találmány az ICAM-1-re és „funkcionális származékai”-ra vonatkozik. Az ICAM-1 „funkcionális származéka” egy olyan vegyület, amelynek a biológiai aktivitása (akár funkcionálisan, akár strukturálisan) lényegében hasonló az ICAM-1 biológiai aktivitásához. A „funkcionális származékok” kifejezés magában foglalja egy molekula „fragmentumait”, „variánsait”, „analógjait” vagy „kémiai származékait”. Egy molekula, például az ICÁM -1 „fragmentuma” alatt a molekula bármely polipeptidrészét értjük. Főként azokat az ICAM-l-fragmentumokat helyezzük előnybe, amelyek ICÁM-1-aktivitást fejtenek ki és szolubilisek (nincsenek membránhoz kötve). Egy molekula, például az ICAM-1 „variánsa” alatt egy olyan molekulát értünk, amely strukturális és funkcionális szempontból lényegében vagy a teljes molekulához, vagy ennek egy fragmentumához hasonló. Egy molekuláról akkor mondjuk, hogy „lényegében hasonló” egy másik molekulához, ha mindkét molekulának lényegében hasonló a szerkezete vagy mindkét molekulának hasonló a biológiai aktivitása. Tehát feltéve, hogy két molekula hasonló aktivitású, akkor variánsoknak tekinthetők, minthogy itt ezt a kifejezést használjuk abban az esetben is, ha az egyik molekula szerkezete eltér a másikétól, vagy ha aminosavszekvenciájuk nem azonos. Egy molekula, például az ICAM-1 „analógba egy olyan molekulának felel meg, ami funkció szempontjából lényegében vagy a teljes molekulához vagy ennek a fragmentumához hasonlít. Ha egy molekuláról azt mondjuk, hogy egy másik molekula „kémiai származéka”, itt azt jelenti, hogy olyan kiegészítő kémiai csoportokat tartalmaz, amelyek normál körülmények között nem részei a molekulának. Az ilyen csoportok javíthatják a molekula oldhatóságát, abszorpcióját, biológiai féléletidejét stb. Az ilyen hatások közvetítésére alkalmas csoportokat ismertet a Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) című kiadvány. A „toxinnal módosított” molekula egy olyan molekula (mint az ICAM-1 vagy egy antitest), amely egy toxinrészt tartalmaz. Ha egy ilyen molekula egy sejthez kötődik, akkor a toxinmolekula szoros közelségbe kerül a sejttel és ezáltal elősegítheti a sejt pusztulását. Bármilyen alkalmas toxinrész alkalmazható, azonban előnyös, ha olyan toxint használunk, mint például a ricintoxin, a diftériatoxin, a radioizotóp toxinok, a membráncsatoma-képző toxinok stb. Az ilyen csoportoknak egy molekulához való kapcsolására szolgáló eljárások jól ismertek a szakterületen.

Egy antigén molekula, mint az ICAM-1 vagy az LFA-1 molekulacsalád tagjai, természetes körülmények között a limfociták felszínén fejeződnek ki. Tehát ha egy ilyen sejtet megfelelő állatba juttatunk be, például intraperitoneális injekcióban stb., olyan antitestek termelését fogja kiváltani, amelyek képesek lesznek az ICAM-l-hez vagy az LFA-1 molekulacsalád tagjaihoz kötődni. Ha kívánt, egy ilyen állat szérumát le lehet venni és fel lehet használni az ezen molekulákhoz kötődő poliklonális antitestek forrásaként. Előnyösebb azonban, ha az ilyen állatból levesszük a lépsejteket, és e lépsejteket mielomasejtvonallal fuzionáljuk, majd a fúziós sejteket olyan hibridómasejtek képzésére késztetjük, amelyek ICAM-l-et vagy az LFA-1 molekulacsalád tagjait kötő monoklonális antitestet szekretálnak.

A fentiekben leírt módon kapott hibridómasejteket különböző módszerekkel szűrhetjük abból a célból, hogy azokat a kívánt hibridómasejteket azonosítsuk, amelyek vagy az ICAM-l-hez, vagy az LFA-1 molekulacsalád tagjaihoz képesek kötődni. Egy előnyös szűrővizsgálat szerint az ilyen molekulákat az Epstein-Barr-vírussal transzformált sejtek aggregációját gátló képességük alapján azonosítjuk. Azokat az antitesteket, amelyek ezt az aggregációt gátolják, tovább szüljük, hogy meghatározzuk, vajon ez az aggregációgátlás az ICAM-l-hez való kötődésük révén jött-e létre. Bármilyen olyan módszer használható egy ilyen szűrővizsgálatban, ami az ICAM-l-et az LFA-1 molekulacsaládtól megkülönbözteti. Tehát például az antitest által megkötött antigént immunprecipitációval vagy poliakrilamidgél-elektroforézissel analizálhatjuk. Ha a megkötött antigén az LFA-1 molekulacsalád tagja, akkor az immunprecipitált antigén dimerként viselkedik, míg ha a megkötött antigén az ICAM-1, akkor egyetlen molekulatömeg-féleséget immunprecipitáltunk. Egy más módon úgy lehetséges megkülönböztetni a két antitestet, azaz hogy melyik kötődik az LFA-1 molekulacsalád tagjaihoz és melyik kötődik az ICAM-l-hez, hogy a granulocitákhoz való kötődésre szűrünk, ugyanis a granulociták LFA-l-et fejeznek ki, de ICAM-l-et nem. Az antitestnek (amelyről tudjuk, hogy meggátolja a sejt aggregációját) az a képessége, hogy kötődik a granulocitákhoz, azt jelenti, hogy az antitest megköti az LFA-l-et. A kötődés elmaradása arra utal, hogy az antitest az ICAM-1 felismerésére képes. A sejtnek azon tulajdonságát, hogy kötődik-e egy sejthez - például granulocitához - általánosan használt eszközökkel határozhatják meg az általános jártassággal rendelkező szakemberek. Az ilyen eszközök közé tartoznak az immunassayk, a sejtagglutinációk, a szűrőlemezekhez való kötés vizsgálata, antitestprecipitáció stb.

A találmány szerinti aggregációellenes antitesteket egy másik módszer szerint is azonosíthatjuk; éspedig úgy, hogy mérjük, hogy ezen antitestek különbözőképpen képesek-e kötődni az ICAM-l-et kifejező sejtekhez (ilyenek az aktivált endoteliális sejtek) és azokhoz a sejtekhez, amelyek nem fejeznek ki ICAM-l-et, azaz ezekhez nem képesek kötődni. Az általános jártassággal rendelkező szakemberek megfelelően fogják értékelni azt a lehetőséget, hogy a fenti vizsgálat módosít6

HU 218 904 Β ható és más sorrendben is elvégezhető, miáltal számos lehetséges szűrővizsgálati módszer keletkezhet, azonban ezek mindegyike alkalmas a meghatározásra és arra, hogy megkülönböztesse az ICAM-l-et megkötő antitesteket az LFA-1 molekulacsalád tagjait kötő antitestektől.

A találmány szerinti gyulladásgátló hatóanyagok előállíthatok természetes eljárásokkal (például úgy, hogy egy állatot, növényt, gombát, baktériumot stb. arra késztetünk, hogy egy ICAM-1 nem immunglobulin antagonistát termeljen, vagy úgy, hogy egy állatot olyan poliklonális ellenanyag termelésére késztetünk, amely megköti az ICAM-l-et); szintetikus módszerekkel [például úgy, hogy Memfielt módszerével polipeptideket szintetizálunk az ICAM-1 vagy az ICAM-1 funkcionális származékai vagy az ICÁM-1 proteinantagonistái (melyek vagy immunglobulinok, vagy nem immunglobulinok lehetnek) előállításához]; hibridómatechnológiával (például úgy, hogy monoklonális antitestet termelünk, amely kötődik az ICÁM-1-hez); vagy rekombináns technológiával [például úgy, hogy a találmány szerinti gyulladásgátló hatóanyagot különböző gazdasejtekben (ilyenek az élesztő, baktériumok, gombák, tenyésztett emlős sejtek stb.) termeljük vagy rekombináns plazmidok, vagy vírusvektorok segítségével]. Hogy melyik eljárást választjuk, az bizonyos faktoroktól függ, ilyen az alkalmasság, a kívánt kitermelés stb. Nem szükséges, hogy a fent leírt módszerek, eljárások, technológiák közül csak egyet válasszunk ki az adott gyulladásgátló hatóanyag termelésére; a fent leírt eljárások, módszerek és technológiák kombinálhatok abból a célból, hogy megkapjuk az adott gyulladásgátló hatóanyagokat.

A) Az LFA- 1-hez kötődő partner (ICAM-1) azonosítása

1. Az LFA -1 -fiiggő aggregációvizsgáló módszer

Számos Epstein-Barr-vírussal transzformált sejt aggregációra hajlamos. Az aggregációt forbol-észterek jelenléte fokozza. Megállapították, hogy ezt a homotípusos aggregációt (ez olyan aggregáció, amelyben csak egyfajta sejt vesz részt) anti-LFA-1 antitestek blokkolják [R. Rothlein és munkatársai, J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986), adataik a következőkben referenciaként szerepelnek]. Az LFA-1-függő kötés mértékét úgy határozhatjuk meg, hogy megállapítjuk a spontán és a forbol-észtertől függő aggregátumképződés mértékét.

Egy LFA-l-függő aggregációt befolyásoló hatóanyagot olyan vizsgálattal lehet azonosítani, amellyel megállapítható, hogy az Epstein-Barr-vírussal transzformáit sejteknél a hatóanyag a spontán vagy a forbolésztertől függő aggregációt befolyásolja-e. A legtöbb Epstein-Barr-vírussal transzformált sejtet fel lehet használni egy ilyen vizsgálatban, amíg ezek a sejtek az LFA-1 receptormolekula kifejezésére képesek. Ezeket a sejteket T. A. Springer és munkatársai [J. Exper. Med., 160,1901-1918 (1984), ezt a munkát a következőkben referenciaként használjuk fel] módszere szerint állíthatjuk elő. Bár bármilyen ilyen sejt felhasználható a találmány szerinti LFA-l-függő kötésvizsgálatban, mégis előnyösebb a JY sejtvonal sejtjeit alkalmazni [C. T. Terhost és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 73,910 (1976)]. A sejteket bármilyen alkalmas táptalajban tenyészthetjük; azonban sokkal előnyösebb, ha a sejteket 10% fetális borjúszérummal és 50 pg/ml gentamicinnel (Gibro Laboratories) kiegészített RPMI 1640 táptalajban tenyésztjük. A sejteket olyan körülmények mellett kell tenyészteni, amelyek megfelelőek az emlős sejtek proliferációja szempontjából (azaz rendszerint 37 °C hőmérséklet mellett, 5% CO₂ és 95% relatív nedvességtartalmú atmoszférában stb.).

2. Az LFA-1 kötődik az ICÁM-1-hez

Olyan egyéneket azonosítottak, akiknek a limfocitái nem tartalmaztak LFA-1 családhoz tartozó receptormolekulákat [D. C. Anderson és munkatársai, Fed. Proc., 44, 2671-2677 (1985); D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 668-689 (1985)]. Ezek az egyének leukocitaadhézió-hiány betegségben (LAD=Leukocyte Adhesion Deficiency) szenvednek. Az ilyen betegek EBV-transzformált sejtjei nem képesek sem spontán, sem forbol-észter jelenlétében aggregálódni a fent leírt aggregációs vizsgálatban. Ha ezeket a sejteket LFA-l-kifejező sejtekkel keverjük, megfigyelhető az aggregáció [R. Rothlein és munkatársai, J. Exper. Med., 163,1132-1149 (1986)] (1. ábra). Fontos tény, hogy nem jön létre aggregáció, ha ezeket a sejteket anti-LFA-1 antitestek jelenlétében inkubáljuk. Tehát bár az aggregációhoz LFA-1 szükséges, az LFA-l-hiányos sejteknek LFA-l-tartalmú sejtekkel létrejött aggregációja azt mutatja, hogy az LFA-l-et kötő partner nem LFA-1 volt, hanem egy előzőleg még fel nem fedezett celluláris adhéziós molekula. Az

1. ábra a celluláris adhézió mechanizmusát mutatja be.

B) Intercelluláris adhéziós molekula-1 (ICAM-1)

Az új intercelluláris adhéziós molekulát, az ICAM-l-et először R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137,1270-1274 (1986), a közleményt a következőkben referenciaként használjuk fel] eljárása szerint azonosítottuk és részlegesen jellemeztük. Az ICAM-1 molekula észlelésére monoklonális antitesteket állítottunk elő LFA-1 expresszió szempontjából genetikailag deficines egyének sejtjeivel immunizált egérlépsejtekből. A kapott antitesteket az LFA-l-et kifejező sejtek aggregációját gátló tulajdonságára szűrtük (2. ábra). Részletesebben: egereket immunizáltunk LAD-betegekből származó EBV-transzformált olyan B-sejtekkel, amelyek nem fejeznek ki LFA-1 antigént. Az állatok lépsejtjeit eltávolítjuk, mielomasejtekkel fuzionáljuk, és hagyjuk, hogy kialakuljanak a monoklonális antitest-termelő hibridómasejtek. Ezután normál egyénekből származó EBV-transzformált, LFA-l-et kifejező sejteket inkubálunk a hibridómasejt monoklonális antitestjének jelenlétében abból a célból, hogy minden olyan monoklonális antitestet azonosíthassunk, amelyek az EBV-transzformált B-sejtek forbol-észter közvetítette, LFA-l-dependens, spontán aggregációját gátolni képesek. Minthogy a hibridómasejtek olyan sejtektől származtak, amelyek soha nem találkoztak LFA-1 antigénnel, így LFA-1 ellen nem termeltek monoklonális antitestet. Tehát bármelyik olyan antitest, amelyikről kiderül, hogy gátolja az aggregációt, annak kötőd7

HU 218 904 Β nie kell egy olyan antigénhez, amely bár nem LFA-1, mégis részt vesz az LFA-1 adhéziós folyamatban. Jóllehet bármilyen módszert használhatunk az ilyen monoklonális antitestek előállítására, előnyösebb, ha az ICAM-l-kötő monoklonális antitesteket Balb/c egerek immunizálásával állítjuk elő, R. Rothlein és munkatársai módszere [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)] és sémája szerint, LFA-1 deficiens betegekből származó, Epstein-Barr-vírussal transzformált, perifériás vér eredetű mononukleáris sejtek alkalmazásával. Ezeket a sejteket T. A. Springer és munkatársai írták le [J. Exper. Med., 160,1901-1918 (1984)].

Az ICÁM-1-hez kötődő antitestek előállítására és észlelésére szolgáló előnyös eljárás szerint egereket immunizálunk EBV-transzformált B-sejtekkel, melyek mind ICAM-l-et, mind LFA-l-et fejeznek ki, vagy még előnyösebb TNF-aktivált endoteliális sejtekkel, amelyek ICAM-l-et kifejeznek, de LFA-l-et nem. Az anti-ICAM-1 antitesteket termelő hibridómasejtek előállítására szolgáló egy legelőnyösebb eljárásban Balb/c egereket immunizálunk egymás után JY sejtekkel és differenciált U937 sejtekkel (ATCC CRL-1593). Az állatokból lépsejteket veszünk le, mielomasejtekkel fuzionáljuk, és hagyjuk, hogy antitesttermelő hibridómasejtekké alakuljanak. Az antitesteket arra nézve szüljük, hogy képesek-e meggátolni egy EBV-transzformált sejtvonal - ilyenek a JY sejtek, amelyek LFA-1 receptort és ICAM-l-et is kifejeznek - LFA-l-függő, forbolészterrel indukált aggregációját. R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137,1270-1274 (1987)] kimutatták ezeket az aggregációt gátló antitesteket, majd megvizsgálták, hogy meg tudják-e gátolni az SK.W3 sejtvonalnál [M. Dustin és munkatársai, J. Exper. Med., 165, 672-692 (1987)] a forbol-észterrel indukált aggregációt. Ennek a sejtvonalnak forbol-észter jelenlétében való spontán aggregációját gátolják az LFA-l-et kötni képes antitestek és nem gátolják az anti-ICAM-1 antitestek. Azok az antitestek, amelyek a JY sejtek forbolészterrel indukált aggregációját meg tudják gátolni, de nem képesek gátolni az SKW3 sejtek forbol-észterrel indukált aggregációját, azok feltehetően anti-ICAM-1 antitestek. Az ICAM-l-et kötő antitesteket más módszerrel úgy azonosítjuk, hogy olyan antitestekre szűrünk, amelyek az LFA-kifejező sejtek (ilyenek a JY sejtek) LFA-l-fuggő aggregációját gátolják, ugyanakkor nem tudnak kötődni olyan sejtekhez, amelyek LFA-l-et fejeznek ki, de ICAM-l-et nem fejeznek ki vagy csak csekély mértékben (ilyenek a normál granulociták), vagy képesek olyan sejtekhez kötődni, amelyek ICAM-l-et kifejeznek, de LFA-l-et nem (ilyenek a TNF-fel aktivált endoteliális sejtek). Még egy másik módszer szerint úgy járunk el, hogy ICAM-l-et, LFA-l-et vagy mindkettőt kifejező sejtekből immunprecipitátumot készítünk olyan antitestek használatával, amelyek gátolják a sejtek, például a JY sejtek LFA-l-fuggő aggregációját, és SDS-PAGE vagy egy ezzel egyenértékű módszerrel meghatározzuk az antitesttel precipitált molekula bizonyos molekuláris jellemzőit. Ha a jellemzők azonosak az ICÁM-1 jellemzőivel, úgy feltételezhető, hogy az antitest anti-ICAM-1 antitest.

Az ICÁM-1 sejtfelületi molekulát a fent leírtak szerint előállított monoklonális antitesteket alkalmazva tisztítottuk és jellemeztük. Az ICAM-l-et humán sejtekből vagy szövetekből tisztítottuk monoklonális antitest-affinitáskromatográfia segítségével. E módszer szerint az ICÁM- 1-gyel reagáló monoklonális antitestet inért oszlopmátrixhoz kapcsoljuk, melyhez bármilyen módszert felhasználhatunk, de előnybe helyezzük H. C. Oettgen és munkatársai [J. Bioi. Chem., 259, 12 034 (1984)] módszerét. Ha a sejtlizátumot átengedjük a mátrixon, a jelen lévő ICAM-1 molekulákat a mátrix adszorbeálja és visszatartja. Az oszlop pH-jának vagy ionkoncentrációjának a változtatásával a megkötött ICAM-1 molekulákat az oszlopról le lehet olvasni. Jóllehet bármilyen alkalmas mátrix használható, előnyös, ha a mátrix anyaga Sepharose (Pharmacia). Az oszlopmátrixok készítése és alkalmazása proteinek tisztításához jól ismert módszer e szakterületen.

Az általános jártassággal rendelkező szakemberek értelemszerűen használhatják fel a fent leírt vizsgálati módszereket olyan vegyületek azonosítására, amelyek képesek a celluláris adhézió fokát és mértékét gyengíteni vagy gátolni.

Az ICAM-1 egy olyan sejtfelületi glükoprotein, amely egyrészt nem hematopoetikus sejteken fejeződik ki, ilyenek a vaszkuláris endoteliális sejtek, timusz epiteliális sejtek, bizonyos más epiteliális sejtek és fibroblasztok, másrészt hematopoetikus sejteken fejeződik ki, ilyenek a szöveti makrofágok, mitogénnel stimulált limfocitablasztok és a germinatív centrumú B-sejtek, továbbá a dendritikus sejtek a mandulákban, nyirokcsomókban és a Peyer-plakkokban. Az ICAM-1 nagymértékben fejeződik ki vaszkuláris endoteliális sejteken a reaktív hiperpláziát mutató T-sejt területeken, nyirokcsomókban és mandulákban. Az ICAM-1 kis mennyiségben fejeződik ki a perifériás vér limfocitákon. Bizonyos mielomonocitás sejtvonalak forbol-észterrel stimulált differenciálódása nagyban növeli az ICAM-l-expresszióját. Tehát az ICAM-1 elsősorban gyulladásos helyeken fejeződik ki, és általában nem nyilvánul meg nyugvó sejteken. Bőr fibroblasztokon az ICÁM- 1-expressziót három-ötszörösére növeli az interleukin-1, illetve 10 egység/ml gamma-interferon 4, illetve 10 óra időtartamon át. Az indukció a protein- és mRNS-szintézistől függ és reverzibilis.

Az ICAM-1 molekulatömege különböző sejttípusoknál különböző, fibroblasztokon 97 kD a molekulatömeg, az U937 mielomonocita sejtvonalnál 114 kD és a JY B limfoblasztoid sejteknél 90 kD. Az ICÁM -1 bioszintézisekor egy körülbelül 73 kD-os intracelluláris prekurzort mutattunk ki. A nem N-glükozilált forma - ami a tunikamicinkezelés következménye (a tunikáiméin gátolja a glükozilációt) - molekulatömege 55 kD.

A forbol-észterrel stimulált U937 sejtekből vagy a fibroblasztsejtekből izolált ICAM-1 azonos fő terméket eredményez, melynek a molekulatömege - kémiai deglükozilálás után - 60 kD. Az ICAM-1 monoklonális antitestek befolyásolják a fitohemagglutinin-blasztok adhézióját az LFA-l-hiányos sejtvonalakhoz. Ha

HU 218 904 Β az ICAM-l-et kötő monoklonális antitestekkel előkezeljük a fibroblasztokat, de a limfocitákat nem, ezzel az előkezeléssel meggátoljuk a limfocita-fibroblaszt adhéziót. Ha a limfociták kapnak előkezelést LFA-1 elleni antitestekkel és a fibroblasztok nem, ugyancsak azt találjuk, hogy ezzel meggátoljuk a limfocita-fibroblasztadhéziót.

Tehát az ICAM-1 a leukocitákon lévő CD 18 komplex liganduma. Fibroblasztokon és endoteliális sejteken az ICAM-1 in vitro ugyanannyi időn belül indukálható gyulladáskeltő mediátorokkal - ilyenek például az IL-1, gamma-interferon és a tumomekrózis faktor (TNF) mint amennyi időt vesz igénybe in vivő a limfociták infiltrációja a gyulladásos laesiókba [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986); J. S. Prober és munkatársai, J. Immunok, 137, 1893-1896 (1986)]. Az ICAM-1 kifejeződik nem hematopoetikus sejteken, mint a vaszkuláris endoteliális sejtek, a timusz epiteliális sejtek és más epiteliális sejtek és fibroblasztok, valamint hematopoetikus sejteken, mint a szöveti makrofágok, mitogénnel stimulált T-limfocita-blasztok és a germinatív centrumú B-sejtek, továbbá dendritikus sejteken, a mandulákban, nyirokcsomókban és a Peyer-plakkokban [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. Az ICAM-1 kifejeződik keratinocitákon jóindulatú gyulladásos laesiókban, ilyenek az allergiás ekcéma, lichen planus, exanthema, urticaria és a bullózus (hólyagos) betegségek. Az allergiás bőrreakciók, amelyeket egy olyan hapténnek a bőrön való alkalmazásával idéznek elő, amelyre a beteg allergiás, a keratinocitákon szintén erős ICAM-1-expressziót eredményeznek. Másrészt a bőrön lévő toxikus plakkok nem okoznak ICAM-1expressziót a keratinocitákon. A különböző dermatológiai rendellenességekből eredő bőrlaesiók biopsziáiból származó keratinocitákon kimutatható az ICAM-1, továbbá ICAM-1-expressziót indukálnak az allergiás patch-tesztekből eredő laesiók is, míg a toxikus patchtesztekből származó laesiók nem váltanak ki ICAM-1expressziót.

Az ICAM-1 tehát egy olyan sejtszubsztrátum, amelyhez a limfociták képesek kötődni, s így a limfociták a gyulladásos helyekre tudnak vándorolni és/vagy különböző effektorfunkciókat tudnak kifejteni a gyulladás helyén. Ezek a funkciók magukban foglalják az antitesttermelést, a vírussal fertőzött célsejtek lízisét stb. A „gyulladás” („inflammation”) kifejezés itt a védekezőrendszer specifikus vagy nem specifikus reakcióit jelenti. A „specifikus védekezőrendszer” kifejezéssel az immunrendszernek azt a komponensét fejezzük ki, amely specifikus antigén jelenlétére reagál. Gyulladásnak mondjuk a specifikus védekezőrendszemek a válaszát, ha a gyulladást a specifikus védekezőrendszer reakciója okozza, közvetíti vagy vele összefügg. Specifikus védekezőrendszer válasza által okozott gyulladás például az antigénekre - ilyen például a rubeolavírus -, autoimmun-betegségekre, T-sejtek közvetítette késői típusú túlérzékenységre (ez látható például olyan egyéneknél, akiknél a Mantoux-teszt pozitív), sporiasisra stb. adott válasz.

A „nem specifikus védekezőrendszer reakciója” egy olyan válasz, amelyet az immunológiai memóriára képtelen leukociták közvetítenek. Ezek közé a sejtek közé tartoznak a granulociták és makrofágok. Amikor itt azt mondjuk, hogy a gyulladás a nem specifikus védekezőrendszer válaszának a következménye, akkor a gyulladást a nem specifikus védekezőrendszer okozza, közvetíti vagy egy reakciójával függ össze. Nem specifikus védekezőrendszer által okozott gyulladás - legalábbis részben - például az a gyulladás, amely a következő állapotokkal jár együtt: asztma, felnőttkori respirációs distress szindróma (ARDS=aduit respiratory distress syndrome), vagy szeptikémia vagy trauma okozta másodlagos többszörös szervkárosodás, a miokardiális vagy más szövetek reperfuziója által okozott károsodás, akut glomerulonephritis, reaktív arthritis, akut gyulladásos komponenseket tartalmazó dermatózisok, akut purulent meningitis vagy a központi idegrendszer más gyulladásos zavarai, hemodialízis, leukaferezis, fekélyes vastagbélgyulladás (colitis ulcerosa), Crohm-betegség, nekrotizáló enterocolitis, granulocita transzfuzióval társult tünetek és citokin-indukálta toxicitás.

A jelen találmány értelmében az ICAM-1 funkcionális származékai és főként azok a származékai, amelyek közé az ICAM-1 olyan fragmentumai vagy mutációs variánsai tartoznak, amelyek az 1-es, 2-es és 3-as domént tartalmazzák, a nem specifikus védekezőrendszer ezen reakcióinak a kezelésében vagy gyógyításában használhatók fel. Az ilyen kezelésnél vagy gyógyításban előnyösebbek az olyan ICAM-1 fragmentumok vagy mutációs variánsok, amelyek az ICAM-1 2-es doménjét tartalmazzák, de az ilyen kezelésre vagy gyógyításban a legelőnyösebbek az ICAM-1 azon fragmentumai vagy mutációs variánsai, amelyek az ICAM-1 1-es doménjét tartalmazzák.

Foglalkozik továbbá a jelen találmány az ICAM-1 és funkcionális származékai asztma kezelésére való felhasználásával is.

C) Az ICAM-1 gén klónozása

A számtalan eljárás közül bármelyiket fel lehet használni az ICAM-1 gén klónozására. Egy ilyen módszer szerint egy, az ICAM-l-kifejező sejtekből származó cDNS-inszertumokat tartalmazó ingázó vektorgyűjteményt analizálunk olyan inszertum jelenlétére, amely ICAM-1 gént tartalmaz. Egy ilyen analízist úgy végzünk, hogy a sejteket a vektorral transzficiáljuk, majd ICAM-l-expresszióra vizsgáljuk. E gén klónozásának egy előnyös módszere magában foglalja az ICAM-1 molekula aminosavszekvenciájának a meghatározását. A feladat végrehajtásához az ICAM-1 proteint tisztítjuk és automata szekvenátorral analizáljuk. Egy másik módszer szerint a molekulát ffagmentáljuk akár brómciánnal, akár proteázokkal, például papainnal, kimotripszinnel vagy tripszinnel [Y. Oike és munkatársai, J. Bioi. Chem., 257, 9751-9758 (1982); C. Liu és munkatársai, Int. J. Pept. Protein Rés., 21, 209-215 (1983)]. Jóllehet az ICAM-1 teljes aminosavszekvenciája meghatározható, mégis előnyösebb a molekula peptidfragmentumainak a meghatározása. Ha a peptidek 10 aminosavnál hosszabbak, a szekvenciákra ka9

HU 218 904 Β pott információ általában elégséges ahhoz, hogy egy gént - így az ICAM-1 gént - klónozzunk.

Egy peptid aminosavcsoportjainak a szekvenciáját vagy az általánosan használt 3-betűs jelzéssel íijuk fel vagy 1-betűs jelzéssel. A 3-betűs és 1-betűs jelölések felsorolása megtalálható szakkönyvekben, például: A. Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York, N. Y. (1970). Ha a szekvenciát függőlegesen írjuk fel, az aminoterminális csoport a sor felső részén és a peptid karboxiterminális csoportja a sor alján van. Hasonlóképpen, ha a felsorolás vízszintes, az aminoterminusz a bal oldalon, míg a karboxiterminusz a jobb oldalon van. A peptid aminocsoportjait kötőjel választhatja el. Ezek a kötőjelek kizárólag arra szolgálnak, hogy megkönnyítsék a szekvencia bemutatását. Tisztán magyarázatként, a

-Gly-Ala-Ser-Phejelölésű aminosavszekvencia azt jelenti, hogy egy Alá csoport a Gly karboxilcsoportjához kapcsolódik, a Ser csoport az Alá karboxilcsoportjához és a Phe aminocsoportjához kapcsolódik. A jelölés azt is jelenti, hogy az aminosavszekvencia a Gly-Ala-Ser-Phe tetrapeptidből áll. Ez a jelölés nem korlátozza az aminosavszekvenciát erre a tetrapeptidre, hanem azt jelenti, hogy (1) a tetrapeptidhez egy vagy több aminosavcsoport kapcsolódhat, akár aminoterminális, akár karboxiterminális végén, (2) a tetrapeptid amino- és karboxiterminális végéhez egy vagy több aminosavcsoport kapcsolódhat, (3) a tetrapeptidhez nem kapcsolódik más aminosav.

Amint egy vagy több megfelelő fragmentumot szekvenáltunk, megvizsgáljuk az ezeket kódoló DNS-szekvenciákat. Minthogy a genetikai kód degenerált, egynél több kodon használható egy adott aminosav kódolásához [J. D. Watson közlése a következő kiadványokban: Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás; W. A. Benjámin, Inc., Menlo Park, CA (1977), 356-357. oldal]. A peptidffagmentumok analízise révén meghatározzuk azokat az aminosavszekvenciákat, amelyeket a legkevésbé degenerált oligonukleotidok kódolnak. Ezt előnyösen úgy végezzük el, hogy azonosítjuk azokat a szekvenciákat, amelyek olyan aminosavakat tartalmaznak, amelyeket egyetlen kodon kódol. Ilyen aminosavszekvenciákat azonban ritkán kódolhat egyetlen oligonukleotid, az aminosavszekvenciát gyakran a hasonló oligonukleotidok tetszés szerinti készlete kódolhatja. Fontos tudni, hogy amíg a készlet minden tagja egy olyan oligonukleotid, amely tudja kódolni a peptidfragmentumot és ennélfogva potenciálisan ugyanazon nukleotidszekvenciát tartalmazza, amint az a gén, amely a peptidfragmentumot kódolja, mégis a készletnek csak egy tagja tartalmaz olyan nukleotidszekvenciát, amely a gén nukleotidszekvenciájával identikus. Minthogy ez a tag jelen van a készletben, és képes a DNS-sel hibridizálni a készlet többi tagjának a jelenlétében is, a nem ffakcionált oligonukleotidkészletet is fel lehet használni ugyanúgy, mintha egyetlen oligonukleotidot alkalmaznánk a peptidet kódoló gén klónozásához.

A fent leírtakkal pontosan analóg módon alkalmazhatunk egy olyan nukleotidot (vagy oligonukleotidkészletet), amelynek a nukleotidszekvenciája komplementer a peptidfragmentumot kódoló oligonukleotidszekvenciával vagy -szekvencia-készlettel.

Az ICAM-1 gén egy fragmentumát kódoló egy alkalmas oligonukleotidot vagy oligonukleotidkészletet, vagy amely egy ilyen oligonukleotiddal vagy nukleotidkészlettel komplementer, azonosítunk (a fent leírt eljárást használva), szintetizálunk, és - a szakterületen jól ismert módon - ICAM-1 gén szekvenciákat kifejező, humán sejtekből származó DNS-sel vagy előnyösebben egy cDNS-készítménnyel hibridizáljuk. A nukleinsavhibridizációs technikákat T. Maniatis és munkatársai [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, N. Y. (1982)], valamint B. D. Haymes és munkatársai [Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington DC (1985)] munkái tartalmazzák, melyeket itt referenciaként használunk fel. A felhasznált DNS- vagy cDNS-forrást ICAM-1 szekvenciákra feldúsítjuk. A dúsítást legkönnyebben cDNS felhasználásával érhetjük el úgy, hogy RNS-t vonunk ki olyan sejtekből, amelyeket ICAM-1 szintézist indukáló körülmények között tenyésztünk [például U937 sejteket (ATCC 1593) tenyésztünk forbol-észterek jelenlétében stb.].

A fent leírt vagy ezekhez hasonló technikákat eredményesen alkalmazták a következő gének klónozásánál : humán aldehid dehidrogenázok [L. C. Hsu és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 3771-3775 (1985)], fibronektin [S. Suzuki és munkatársai, Eur. Mól. Bioi. Organ. J., 4, 2519-2524 (1985)], humán ösztrogén receptor gén [P. Walter és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 7889-7893 (1985)], szöveti plazminogén aktivátor [D. Pennica és munkatársai, Natúré, 301, 214-221 (1983)] és humán érett placentáris alkalikus foszfatáz komplementer DNS [W. Kam és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 8715-8719 (1985)].

Az ICÁM -1 gén expressziós vektorba való klónozásának egy előnyös kiviteli változata szerint ICAM-l-et kifejező sejtből származó DNS vagy előnyösebben cDNS klónozásával expressziósvektor-gyűjteményt készítünk. A gyűjteményből ezután kiszűrjük azokat az egyedeket, amelyek anti-ICAM-1 antitesthez kötődő proteint fejeznek ki, és nukleotidszekvenciáik olyan polipeptideket kódolnak, amelyeknek az aminosavszekvenciája ugyanolyan, mint az ICÁM-1-nek vagy az ICAM-1 fragmentumainak.

A fent leírt módszerek szerint klónozott ICAM-1 gént hozzá lehet komi mesterségesen egy expressziós vektorhoz, és be lehet vezetni baktérium- vagy eukarióta sejtekbe ICÁM-1 protein termelése céljából. Ezek a manipulációs technikák megtalálhatók T. Maniatis és munkatársai munkájában (lásd fentebb), és egyébként jól ismertek a szakterületen.

D) Az LFA-l-függő aggregációs vizsgálatok felhasználási területe

Az LFA-l-függő aggregáció mérésére szolgáló fent leírt módszer olyan hatóanyagok azonosítására alkalmazható, amelyek antagonistákként az LFA-l-függő aggregáció mértékét gátolják. Ezek az antagonisták úgy hatnak, hogy csökkentik az LFA-1 vagy az ICAM-1 agg10

HU 218 904 Β regációt közvetítő képességét. Ilyen hatóanyagok közé tartoznak az immunglobulinok, például egy olyan antitest, amely vagy az LFA-1-hez, vagy az ICÁM-1-hez kötődik. A fent leírt módszer ezenkívül nem immunglobulin (vagyis kémiai) hatóanyagok vizsgálatára is alkalmas, azaz annak meghatározására, hogy ezek antagonistái-e az LFA-l-aggregációnak.

E) ICAM-1 receptor proteineket kötő antitestek felhasználási területe

1. Gyulladásgátló hatóanyagok A CD 18 komplex tagjaival szembeni monoklonális antitestek gátolják a leukociták számos adhéziótól függő funkcióját, így az endotheliumhoz való kötődést [D. Haskard és munkatársai, J. Immunoi., 137, 2901-2906 (1986)], a homo típusú adhéziókat (R. Rothlein és munkatársai, J. Exp. Med., 163,1132-1149 (1986)], a limfociták antigénnel és mitogénnel indukált proliferációját [D. Davignon és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 4535-4539 (1981)], az antitestképződést [A. Fischer és munkatársai, J. Immunoi., 136, 3198-3203 (1986)] és minden leukocitánál az effektorfünkciókat, így a citotoxikus T-sejtek [A. M. Krensky és munkatársai, J. Immunoi., 132, 2180-2182 (1984)], a makrofágok [G. Strassman és munkatársai, J. Immunoi., 136, 4328-4333 (1986)] és minden olyan sejt lítikus hatását, amelyek az antitestfüggő celluláris citotoxicitási reakciókban részt vesznek [S. Kohl és munkatársai, J. Immunoi., 133,2972-2978 (1984)]. Mindegyik fenti funkcióban az antitestek gátolják a leukocitáknak a megfelelő sejtszubsztrátumhoz való tapadását, ez pedig gátolja a végeredményt.

Mint ahogy fent tárgyaltuk, az ICAM-1 molekuláknak az LFA-1 molekulacsalád tagjaihoz való kötődése a sejtadhézióban központi fontosságú. Az adhéziós folyamat alatt a limfociták folyamatosan ellenőrizhetik, hogy egy állatban jelen vannak-e idegen antigének. Bár az ilyen folyamatok normál körülmények között kívánatosak, ezek okozzák az átültetett szerv kilökődését, az átültetett szövet kilökődését és több autoimmun-betegséget is. Tehát bármilyen olyan eszköz, amellyel gyengíteni vagy gátolni lehetne a sejtadhéziót, igen kívánatos lenne az átültetett szervek és átültetett szövetek recipiensei számára vagy az autoimmunbetegek számára.

Az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitestek mint gyulladásgátló hatóanyagok emlős betegeknél igen jól alkalmazhatók. Lényeges, hogy ezek a hatóanyagok az általános gyulladásgátló hatóanyagoktól abban különböznek, hogy szelektíven gátolják az adhéziót, és nincs olyan mellékhatásuk - ilyen például a nefrotoxicitás -, mint amilyenek a hagyományos hatóanyagoknál felléphetnek. Tehát az ICAM-l-kötő monoklonális antitesteket emlős betegekben a szerv- és szövetkilökődés megelőzésére használhatjuk vagy autoimmun- válaszok módosítására mellékhatásoktól való félelem nélkül.

Fontos szempont, hogy az ICAM-l-et felismerő monoklonális antitestek használata mellett, még a HLA szempontból eltérő egyéneknél is, végrehajthatók szervátültetések.

2. A kései típusú túlérzékenységi reakciók szuppresszorai

Minthogy az ICÁM-1 molekulák főként a gyulladások helyén, például a kései típusú túlérzékenységi reakciók (delayed type hypersensitivity reaction) helyén fejeződnek ki, az ICAM-1 molekulákhoz kötődő antitestek (különösen a monoklonális antitestek) terápiás potenciálját felhasználhatjuk az ilyen reakciók gyengítésére vagy kiküszöbölésére. A terápiás felhasználás lehetőségét kétféleképpen lehet kiaknázni. Először: ICAM-1 elleni monoklonális antitestet tartalmazó készítményt adhatunk be olyan betegnek, akinél kései típusú túlérzékenységi reakció lépett fel. Ilyen készítményeket adhatunk például olyan egyéneknek, akik olyan antigénekkel, mint például a mérges szömörce (poison ivy, poison oak) stb. érintkeztek. Egy másik alkalmazási lehetőség szerint a betegnek az ICÁM - 1-hez kötődő monoklonális antitestet egy antigénnel együtt adjuk be, hogy megelőzzük az ezt követő gyulladásos reakciót. Tehát ha ICAM-l-kötő monoklonális antitest mellett kiegészítésül egy antigént adagolunk, ez átmenetileg toleránssá teheti az egyént ugyanezen antigénnek egy következő megjelenésével szemben.

3. A krónikus gyulladással járó betegségek terápiája

Minthogy az LFA-1-hiányban szenvedő LAD betegeknél nem lép fel gyulladásos válasz, azt gondoljuk, hogy az LFA-1 természetes ligandumának, az ICÁM-1-nek az antagonistája szintén gátolja majd a gyulladásos választ. Az ICAM-1-ellenes antitestek gyulladásgátló képessége képezi az alapját terápiás felhasználásuknak krónikus gyulladásos betegségek és autoimmun-betegségek - ilyen a lupus erythematosus, az autoimmun thyroiditis, az experimentális allergiás encephalomyelitis (EAE), sclerosis multiplex, a diabeteses Reynaud-szindróma bizonyos formái, rehumatoid arthritis stb. - kezelésében. Ezek az antitestek a psoriasis terápiás kezelésében is felhasználhatók. Általánosságban az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitesteket azoknak a betegségeknek a kezelésében lehet alkalmazni, amelyek folyamatosan kezelhetők szteroidterápiával.

4. Diagnosztikai és prognosztikai alkalmazások

Minthogy az ICAM-1 főként a gyulladásos helyeken fejeződik ki, az ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitesteket eszközként lehet felhasználni arra, hogy egy betegben képet alkothassunk a fertőzés és gyulladás helyéről, és hogy azt láthatóvá tegyük. Ilyen célú használat esetén a monoklonális antitesteket detektálható jelzéssel látjuk el, például radioizotópokkal való jelzéssel, affinitásjelzéssel (ilyen a biotin, avidin stb.), flureszcens jelzéssel, paramágneses atomokkal való jelzéssel stb. A jelölések kivitelére szolgáló eljárások jól ismertek e szakterületen.

Az antitesteknek a diagnosztikai gyakorlatban való klinikai felhasználásával a következő összefoglaló közlemények foglalkoznak: Η. B. Grossman, Urol. Clin. Norh. Amer., 13, 465-474 (1986); E. C. Unger és munkatársai, Invest. Rádiói., 20, 693-700 (1985) és B. A. Khaw és munkatársai, Science, 209, 295-297 (1980).

HU 218 904 Β

A gyulladások fennállását ligandumok segítségével is észlelhetjük, azaz olyan mRNS, cDNS vagy DNS révén, amelyek az ICAM-1 kifejező sejtek ICAM-1 gén szekvenciáihoz vagy ICAM-1 mRNS-szekvenciáihoz kötődnek. Ezeknek a hibridizációs vizsgálatoknak a technikáját T. Maniatis írta le (lásd fentebb).

A detektálhatóan jelzett antitestek helyzetének az észlelése alapján egy gyulladásnak vagy egy tumor fejlődésének a helyére lehet következtemi. A gyulladás vizsgálatának egyik módja szerint úgy járunk el, hogy szövet- vagy vérmintákat veszünk, és a mintákat a detektálható jelzéssel ellátott antitestek jelenlétében inkubáljuk. Egy előnyös megvalósítási változatban a technikát nem invazív módon alkalmazzuk, azaz mágneses leképezést, fluorográfiát stb. használunk. Ezt a diagnosztikai tesztet arra lehet használni, hogy a szervátültetett betegnél a potenciális szövetkilökődés korai jeleit megfigyeljük. Az ilyen vizsgálatok lefolytatásánál megkísérelhetjük meghatározni egy betegnél a rehumatoid arthritisre vagy más gyulladásos megbetegedésekre való hajlamot.

5. Néhány kiegészítés a terápiás és diagnosztikai célokra alkalmazott antigén természetű anyagok beadásával kapcsolatban

A terápiás vagy diagnosztikai hatóanyagokra - így például a bovin inzulinra, interferonra, szöveti plazminogén aktivátorra vagy az egér monoklonális antitestekre - adott immunválaszok lényegében csökkentik ezen hatóanyagok terápiás vagy diagnosztikai értékét, és valójában betegségeket is okozhatnak, például szérumbetegséget. Az ilyen esetek a találmány szerinti antitestek használatával orvosolhatók. Ebben az eljárásban az antitesteket a terápiás vagy diagnosztikus hatóanyaggal kombinálva alkalmazhatjuk. Az antitest hozzáadása megakadályozza, hogy a recipiens felismerje a hatóanyagot, és ennélfogva megvédi a beteget attól, hogy ez ellen immunválasz induljon meg. Az immunválasz elmaradása a beteg számára azt eredményezi, hogy a terápiás vagy diagnosztikus hatóanyagokból további adagokat lehet a betegnek beadni.

F) Az Intercelluláris Adhéziós Molekula-1 (ICAM—1) felhasználási területe

Az ICAM-1 az LFA-1 kötőpartnere. Tehát betegségek kezelésében az ICAM-l-et vagy funkcionális származékait az LFA-1-hez kötődő antitestekkel felváltva lehet alkalmazni, azaz ezeket a molekulákat - szolubilizált formában - fel lehet használni gyulladás, szervkilökődés, graftrejekció stb. gátlására. Az ICAM-l-et vagy funkcionális származékait ugyanúgy lehet használni, mint az anti-ICAM-1 antitesteket a terápiás és diagnosztikai hatóanyagok immunogenitásának a csökkentésére.

Az ICAM-l-et, funkcionális származékait és antagonistáit fel lehet használni olyan tumorsejtek metasztázisának és proliferációjának a blokkolására, amelyek felületükön vagy ICAM-l-et vagy LFA-l-et fejeznek ki. Különböző módszereket használhatunk e cél elérésére. Például: a hematopoetikus sejtek migrációjához szükség van LFA-l-ICAM-1 kötődésre. Tehát e kötődés antagonistái akadályozzák e migrációt, és blokkolják a leukocitavonal tumorsejtjeinek a metasztázisát. Vagy másként: vagy az ICAM-l-et vagy az LFA-1 molekulacsalád egy tagját megkötni képes, toxinnal módosított molekulákat adhatunk be betegeknek. Ha az ilyen toxinnal módosított molekulák hozzákötődnek olyan tumorsejtekhez, amelyek az ICAM-l-et vagy az LFA-1 molekulacsalád egy tagját kifejezik, a toxin jelenléte elöli a tumorsejtet, és ezáltal megakadályozza a tumor proliferációját.

G) Az ICAM-l-függő adhézió nem immunglobulin antagonistáinak felhasználási területe

Az ICAM-l-függő adhézió meggátolható olyan nem immunglobulin antagonistákkal, amelyek vagy az ICÁM-1-hez vagy az LFA-1-hez kötődnek. Az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistája például az LFA-1. Egy nem immunglobulin antagonista, amely kötődik az LFA-1-hez, például az ICAM-1. A fent leírt vizsgálatok révén további nem immunglobulin antagonisták azonosíthatók és tisztíthatók. Az ICAM-l-függő adhézió nem immunglobulin antagonistái ugyanarra a célra használhatók, mint az LFA-1 elleni antitestek vagy az ICAM-1 elleni antitestek.

H) A találmány szerinti készítmények alkalmazása

Az ICAM-1-gyei terápiás hatást úgy érhetünk el, ha a betegnek a teljes ICAM-1 molekulát adjuk be vagy ennek bármilyen terápiásán hatásos peptidfragmentumát.

Az ICAM-l-et és funkcionális származékait vagy szintetikus úton vagy rekombináns DNS-technológiával, vagy proteolízis révén kaphatjuk meg. Az ICAM-1 terápiás előnyeit azzal növelhetjük meg, ha további aminosavcsoportokat kapcsolunk a molekulához, amelyek erősítik a vivőanyaghoz való kapcsolódást vagy erősítik az ICÁM-1 aktivitását. A jelen találmány oltalmi köréhez tartoznak az ICAM-1 azon további funkcionális származékai is, amelyekből hiányoznak bizonyos aminosavcsoportok vagy amelyek más aminosavcsoportokat tartalmaznak, feltéve, ha ezek a származékok a sejtes adhéziót befolyásoló tulajdonságokkal rendelkeznek.

A találmány szerinti antitestekről és az ICÁM-1 molekuláról azt állítjuk, hogy „lényegében nem tartalmaznak természetes szennyezéseket”, ha ezek a készítmények lényegében mentesek azoktól az anyagoktól, amelyek ezekben a termékekben rendszerint a természetben együtt vannak.

A jelen találmány azokra az antitestekre és biológiailag aktív fragmentumaira (akárpoliklonális, akár monoklonális) is kiterjed, amelyek képesek az ICAM-1hez kötődni. Ezek az antitestek állatban vagy szövettenyészetben, vagy rekombináns DNS-technológiával állíthatók elő.

Ha egy betegnek ICAM-l-et kötő antitesteket adunk be vagy ennek fragmentumait, vagy ha egy recipiens betegnek ICAM-l-et (vagy egy fragmentumát, variánsát vagy származékát) adunk, az alkalmazott hatóanyag adagolása olyan faktorok függvényében változik, mint a beteg kora, súlya, magassága, neme, általános állapota orvosi szempontból, kortörténete stb. Általában célszerű a beteget 1 pg/kg-tól 10 mg/kg-ig (kg a

HU 218 904 Β beteg testtömege) terjedő antitestadaggal kezelni, de kisebb vagy nagyobb adagok is alkalmazhatók. Ha a betegnek ICAM-1 molekulákat vagy funkcionális származékait adjuk be, előnyös, ha ezekből a molekulákból szintén 1 pg/kg-tól 10 mg/kg-ig (kg a beteg testtömege) terjedő adagokat adunk, bár kisebb vagy nagyobb adagok is alkalmazhatók. Mint alább tárgyaljuk, a terápiásán hatásos dózist csökkenthetjük, ha az antiICAM-1 antitestet anti-LFA-1 antitesttel együtt alkalmazzuk. Egy komponensnek egy második komponenssel való együttes alkalmazása itt azt jelenti, hogy a két komponenst olyan időközökben adagoljuk, hogy mindkét komponens ugyanazon időben legyen észlelhető a beteg szérumában.

Mind az ICÁM-1-et kötő antitest, mind maga az ICÁM-1 beadható a betegnek intravénásán, intramuszkulárisan, szubkután, enterálisan vagy parenterálisan. Ha az antitestet vagy az ICÁM-1-et injekcióban adjuk, az adagolás történhet folyamatos infúzióval, vagy egyszeri vagy többszöri implantációs kapszula adásával.

A találmány szerinti gyulladásellenes hatóanyagokat olyan mennyiségben adjuk a recipiens betegnek, hogy az elégséges legyen a gyulladás leküzdéséhez. Egy mennyiségre akkor mondjuk, hogy elégséges a leküzdéshez, ha a hatóanyag dózisa, adagolásának módja stb. elégséges a gyulladás gyengítéséhez vagy megelőzéséhez.

Az anti-ICAM-1 antitestet vagy ennek egy fragmentumát vagy egyedül, vagy egy vagy több kiegészítő immunszuppresszív hatóanyaggal kombinálva adagolhatjuk (főként olyan betegnek, akinél szerv- vagy szövetátültetés történt). Az ilyen vegyület(ek) alkalmazása vagy „profilaktikus” vagy terápiás célt szolgál. Ha profilaktikus célból adjuk, akkor az immunszuppresszív vegyületet (vegyületeket) bármilyen gyulladásos válasz vagy szimptóma előtt alkalmazzuk (például a szerv- vagy szövettranszplantáció ideje előtt, vagy ezzel egy időben, vagy röviddel ez után, de a szervkilökődés bármilyen szimptómája előtt). A vegyületek) profilaktikus adása arra szolgál, hogy megelőzzön vagy gyengítsen bármilyen bekövetkező gyulladásos választ (például egy átültetett szerv- vagy szövet kilökődését). Ha az immunszuppresszív vegyületek) terápiás célt szolgálnak, úgy ezt (ezeket) az aktuális gyulladás tüneteinek a kezdetekor (vagy röviddel ez után) kell beadni. A vegyület(ek) terápiás alkalmazása bármilyen aktuális gyulladás (ilyen például egy átültetett szerv vagy szövet kilökődése) gyengítésére szolgál.

A jelen találmány szerinti gyulladásgátló hatóanyagokat tehát vagy a gyulladás megindulása előtt (egy előre látott gyulladás elfojtására) alkalmazzuk, vagy a gyulladás megindulása után.

Egy készítményről akkor mondjuk, hogy „farmakológiailag megfelelő”, ha beadását a recipiens beteg tűri. Egy ilyen hatóanyagnál akkor mondjuk, hogy adagolása „terápiásán hatásos mennyiségben” történik, ha a beadott mennyiség hatása fiziológiai szempontból szignifikáns. Egy hatóanyagról akkor mondjuk, hogy fiziológiailag szignifikáns hatású, ha beadása a recipiens betegben kimutatható fiziológiai változást okoz.

A találmány szerinti antitestet és ICÁM-1 molekulákat ismert eljárások szerint formulázhatjuk gyógyszerészeti szempontból használható készítményekké, azaz ezeket az anyagokat vagy funkcionális származékaikat gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozó vivőanyagokkal kombinálva elegyítjük. Az alkalmas vivőanyagok és formulázásuk - ideértendők más humán proteinek, mint például a humán szérumalbumin - leírása megtalálható például a Remington’s Pharmaceutical Sciences [16. kiadás, A. Osol (szerkesztő), Mack, Easton PA, USA (1980)] című kiadványban. Annak érdekében, hogy megfelelő hatékonysággal alkalmazható, gyógyszerészeti szempontból megfelelő készítményt állítsunk elő, ezeknek a készítményeknek az antiICAM-1 antitestből vagy az ICAM-1 molekulából, vagy fúnkcionális származékaikból hatásos mennyiséget kell tartalmazniuk a hordozó vivőanyag alkalmas mennyiségével együtt.

A hatás időtartamának a szabályozására ezenkívül farmakológiai módszereket is alkalmazhatunk. Szabályozottan felszabaduló készítményeket az anti-ICAM-1 antitesttel vagy az ICAM-1-gyei, vagy ezek funkcionális származékaival komplexet képező vagy ezeket adszorbeáló polimerek segítségével állítunk elő. A szabályozott felszabaduláshoz megfelelő makromolekulákat [például poliészterek, poliaminosavak, poli(vinil-pirrolidon), etilén-vinil-acetát, metil-cellulóz, karboxi-metilcellulóz vagy protamin-szulfát] választunk ki, továbbá megállapítjuk a makromolekulák koncentrációját és az inkorporáció módszereit a szabályozott felszabadulás érdekében. Egy másik lehetséges módszer szerint a szabályozottan felszabaduló készítményekkel úgy szabályozzuk a hatás időtartamát, hogy az anti-ICAM-1 antitestet vagy az ICÁM—1 molekulákat vagy fúnkcionális származékaikat beépítjük egy polimer anyag - mint amilyenek a poliészterek, poliaminosavak, hidrogélek, politejsav vagy az etilén-vinil-acetát kopolimerek - partikuláiba. Vagy pedig a hatóanyagoknak polimer partikulákba való beépítése helyett ezeket az anyagokat például koacervációs technikával vagy interfaciális polimerizációval készített mikrokapszulákba vihetjük be, például hidroxi-metil-cellulóz vagy zselatin mikrokapszulákba, vagy például kollidális gyógyszer-felszabadító rendszereket - ilyenek például a liposzómák, albumin mikrogömbök, mikroemulziók, nanopartikulák és nanokapszulák - vagy makroemulziókat alkalmazhatunk. Ezek a technikák megtalálhatók a Remington’s Pharmaceutical Sciences (1980) című kiadványban.

A találmány általános leírása után a találmány könnyebben megérthető a következő példákon keresztül, amelyeket magyarázatképpen ismertetünk, anélkül azonban, hogy e példákkal a találmány oltalmi körét korlátoznánk.

1. példa

Emlőssejtek tenyésztése

A találmány szerinti EBV-transzformált és hibridómasejteket általában 20 mM L-glutaminnal, 50 pg/ml

HU 218 904 Β gentamicinnel és 10% fetális bovin- (vagy fetális borjú-) szérummal kiegészített RPMI1640 táptalajban tartjuk fenn. A sejteket 37 °C-on 50% CO₂- és 95% nedvességtartalmú levegőatmoszférában tenyésztjük.

Epstein-Barr-vírussal (EBV) transzformált sejtekhez úgy jutunk, hogy ml-enként 10⁶ T-sejtre kimerített perifériás vér mononukleáris sejtet tartalmazó, 20% fetális borjúszérummal (FCS 2 fetal calf serum) és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI 1640 táptalajt 16 órán át inkubálunk B95-8 sejtek (ATCC CRL 1612) [D. A. Thorley-Lawson és munkatársai, J. Exper. Med., 146, 495 (1977)] EBV-tartalmú felülúszójával. A sejtekből 0,2 ml részleteket mértünk be 10 mikrotitráló lemeztartályba. Amíg a sejtnövekedés észlelhető, a táptalajt RPMI 1640 táptalajjal (kiegészítve 20% FCS-sel és 50 pg/ml gentamicinnel) cseréltük. A legtöbb tartályban növekedést észleltünk, és ezeket a sejteket ugyanezen táptalajban szaporítottuk el. Fitohemagglutinin (PHA) blasztokat készítettünk 10⁶ sejt/ml sűrűséggel, RPMI 1640 táptalajban (kiegészítve 20% FCSsel), mely 1:800 hígításban tartalmazott PHA-P-t (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI., USA). A PHA sejtvonalakat interleukin-2-vel (IL-2-vel) kondicionált táptalajban szaporítottuk, és hetenként PHA-val kezeltük [D. A. Cantrell és munkatársai, J. Exper. Med., 158, 1895 (1983)]. A fenti eljárást T. Springer és munkatársai [J. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1984)] közölték, adatait itt referenciaként használjuk fel. A fenti eljárás folyamán kapott sejteket ezután anti-LFA-1 antitestekkel szűrtük, hogy meghatározzuk, vajon kifejeznek-e LFA-1 antigént. Ezeket az antitesteket F. Sanchez-Madrid és munkatársai ismertették [J. Exper. Med., 158, 1785 (1983)]

2. példa

A sejtes aggregáciö és adhézió vizsgáló módszerei

Annak érdekében, hogy meghatározzuk a celluláris adhézió mértékét, aggregációs vizsgálatokat végeztünk. Az ilyen vizsgálatokban használt sejtvonalakat kétszer mossuk 5 mM HEPES-puffert (Sigma Chemical Co., St.Louis) tartalmazó RPMI 1640 táptalajjal, és a sejteket 2 10⁶ sejt/ml koncentrációban reszuszpendáljuk. Lapos fenekű, 96 tartályos mikrotitráló lemezek (No. 3596; Costar, Cambridge, MA, USA) tartályaiba bemérünk 50 pl megfelelő monoklonális antitest felülúszót vagy 50 pg teljes táptalajt tisztított monoklonális antitesttel vagy nélküle, 50 pl teljes táptalajt, mely 200 ng/ml forbol-észtert, azaz forbol-mirisztát-acetátot (PMA) tartalmaz és 100 pl teljes táptalajt, mely a sejteket 2 10⁶ sejt/ml koncentrációban tartalmazza. A végső koncentráció tehát 50 ng/ml PMA és 2 · 10⁵ sejt tartályonként. Hagyjuk, hogy a sejtek spontán leülepedjenek, és az aggregáciö mértékét különböző időpontokban feljegyezzük. A titerérték O-tól 5+-ig változhat, ahol a 0 azt jelenti, hogy a sejtek lényegében nincsenek összecsapódva; 1 + azt jelenti, hogy a sejtek kevesebb mint 10%-a aggregálódott; a 2+ azt jelenti, hogy a sejtek kevesebb mint 50%-a aggregálódott; a 3+ azt jelenti, hogy a sejtek 100%-a kis, laza csomókat képez; a 4+ azt jelenti, hogy a sejtek 100%-a aggregálódott nagy csomókban; az 5+ azt jelenti, hogy a sejtek 100%-a nagy kompakt aggregátumokban van. Annak érdekében, hogy a sejtes adhézióról ennél kvantitatívabb értékelést kapjunk, a reagenseket és a sejteket 5 ml-es polisztirolcsövekbe mérjük be ugyanolyan sorrendben, mint fent. A csöveket 37 °C-on egy forgó rázógép rácsos állványába helyezzük. A csöveket körülbelül 200 fordulat/perc mellett 1 órán át rázzuk, és ez után a sejtszuszpenzióból 10 pl-t hemocitométerbe helyezünk, és a szabad sejtek számát megmérjük. Az aggregáciö százalékát az alábbi egyenlettel határozzuk meg:

szabad sejtek száma aggregáció%=100x(l --) bevitt sejtek száma

A fenti képletben a bevitt sejtek száma egyenlő a kontrollcsőben lévő sejtek ml-enkénti számával. A kontrolicső csak sejteket és teljes táptalajt tartalmaz, és nincs inkubálva. Az egyenletben a szabad sejtek száma egyenlő a kísérleti csőben lévő nem aggregált sejtek ml-enkénti számával. A fenti eljárást R. Rothlein és munkatársai írták le [J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986)].

3. példa

LFA -1-függő sejtes aggregáciö

A 2. példában leírt kvalitatív vizsgálatot EpsteinBarr-vírussal transzformált JY sejtvonallal végeztük. Megfigyeltük, hogy a mikrotitráló lemezeken lévő táptalajhoz adott PMA hatására a sejtek aggregálódnak. Gyorsított videofelvételek (timelapse videó recordings) azt mutatták, hogy a mikrotitráló lemez tartályai fenekén a JY sejtek mozgékonyak, és aktív membrángyűrődéseket és állábas (pseudopodiás) mozgásokat mutattak. A szomszédos sejtek állábai közti érintkezés gyakran sejt-sejt adherenciát eredményezett. Ha az adherencia fennmarad, a sejt kontaktusterülete az uropodia felé mozdul el. Az érintkezés az élénk sejtmozgás és a sejtek ellenkező irányba való elhúzódása ellenére is fennmarad. Úgy tűnik, hogy a PMA-val kezelt és a nem kezelt sejtek közti primer különbség a már kialakult kontaktusok stabilitásában van. PMA-val a kialakult sejtcsomók mérete növekszik, ahogyan további sejtek tapadnak a csomók felszínére.

Az adhézió mérésének másik módszere a 2. példában leírt kvantitatív vizsgálat. A sejtszuszpenziót 200 fordulat/perc mellett 2 órán át rázzuk, majd átvisszük hemocitométerbe, és megszámoljuk az aggregátumon kívül lévő sejteket. PMA távollétében 2 óra múlva a JY sejtek 42%-a (SD=20%, N=6) volt aggregátumokban, míg ha a sejteket azonos körülmények között 50 pg/ml PMA-val inkubáltuk, a sejtek 87%-a (SD=8%, N=6) volt az aggregátumokban. Az aggregáció kinetikus vizsgálata azt mutatta, hogy a PMA minden vizsgált időpontban (3. ábra) erősítette az aggregáció sebességét és mértékét.

4. példa

A sejtek aggregációjánakgátlása anti-LFA-1 monoklonális antitestekkel

HU 218 904 Β

Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk az antiLFA-1 monoklonális antitestek hatását a PMA-val indukált sejtes aggregációra, a 2. példában leírt kvalitatív aggregációs vizsgálat szerint inkubált sejtekhez az említett monoklonális antitesteket adtuk hozzá. Azt tapasztaltuk, hogy e monoklonális antitestek gátolták a sejtaggregátumok kialakulását akár jelen volt PMA, akár nem. Az LFA-1 α-láncával szembeni monoklonális antitesteknek mind az F(ab’)₂, mind az Fab’ fragmentumai képesek voltak a sejtes aggregációt meggátolni. Míg lényegében a sejtek 100%-a képezett aggregátumokat anti-LFA-1 antitest távollétében, addig ha antitestet adtunk hozzájuk, a sejtek kevesebb mint 20%-a volt az aggregátumokban. Ennek a kísérletnek az eredményeit R. Rothlein és munkatársai írták le [J. Exper. Med., 163,1132-1149 (1986)].

5. példa

A sejtes aggregáció LFA—1 receptorigénye

Betegekből származó EBV-transzformált limfoblasztoid sejteket készítettünk az 1. példában leírt módon. A sejteket LFA-l-et felismerő monoklonális antitestekkel szűrtük, és azt találtuk, hogy a sejtek LFA-l-deficiensek.

A 2. példában leírt kvalitatív aggregációs vizsgálatot végeztük el a fent leírt LFA-1 deficiens sejteket használva. Ezek a sejtek spontán nem aggregálódtak még PMA jelenlétében sem.

6. példa

AzlCAM-1 felfedezése

Az 5. példa szerinti LFA-1 deficiens sejteket karboxi-fluoreszcein-diacetáttal jeleztük [M. Patarroyo és munkatársai, Cell. Immunoi., 63, 237-248 (1981)]. A jelzett sejteket 1:10 arányban autológ vagy JY sejtekkel kevertük, és meghatároztuk az aggregátumban a fluoreszceinnel jelzett sejtek százalékát R. Rothlein és munkatársai eljárása szerint [J. Exper. Med., 163, 1132-1149 (1986)]. Megállapítottuk, hogy az LFA-1 deficiens sejtek az LFA-1 kifejező sejtekkel koaggregálódni képesek (4. ábra).

Hogy meghatározzuk, vajon kizárólag az LFA-1 volt-e lényeges az aggregátumok képződése vagy fennmaradása szempontjából, LFA-l-et kötő antitesteket adtunk a fent leírt kész aggregátumokhoz. Azt tapasztaltuk, hogy az antitest hozzáadása erőteljesen széttördelte a kialakult aggregátumokat. Gyorsított videofelvétellel megerősítettük, hogy a kialakult aggregátumokhoz hozzáadott monoklonális antitestek 2 órán belül megkezdték az aggregátumok széttördelését (I. táblázat). LFA-1-gyei szembeni monoklonális antitestek hozzáadása után az aggregátumokon belül lévő egyes sejteknél az állábas mozgások és alakváltozások változatlanok maradtak. Az egyes sejtek fokozatosan leváltak az aggregátum felületéről; 8 óra múlva a sejtek nagy része diszpergálódott. Gyorsított videóval azt láttuk, hogy a kialakult aggregátumok szétesése LFA-1 monoklonális antitestek hatására időben visszafelé futtatva azonos az LFA-1 monoklonális antitestek távollétében történő aggregációs folyamattal.

I. táblázat

Az anti-LFA-1 monoklonális antitestek hatása a PMA-val indukált JY sejtaggregátumok szétesésére

Kísérlet	2 óra³	Aggregációleolvasás 18 óra
-MAt	+MAt
1.	4+	4+	l+^b
2.	3 +	4+	l+^c
3.	5 +	5 +	l+<*

Mikrotitráló lemezen végzett kvalitatív vizsgálatban az aggregáció leolvasása vizuálisan történt. Ha anti-LFA-1 volt jelen a vizsgálat időtartama alatt, az aggregáció kisebb volt 1 +-nál.

^a Az aggregáció mértéke közvetlenül a monoklonális antitest (MAt) hozzáadása előtt a 2. órában. ^b TS1/18+TS1/22 ^c TS1/18 ^dTSl/22

7. példa

Az LFA-l-fiiggő aggregáció divalens ion igénye

A citotoxikus T-sejtek és a célsejtek közötti LFA-1függő adhézióhoz magnéziumionok jelenléte szükséges [E. Martz, J. Cell. Bioi., 84, 584-598 (1980)]. A PMAval indukált JY sejtek aggregációját divalens kationoktól való függőségre teszteltük. A JY sejtek nem aggregálódnak kalcium- és magnéziumionokat nem tartalmazó táptalajban (a 2. példa szerinti vizsgálatban). A divalens magnéziumion hozzáadása elősegítette az aggregációt 0,3 mmólos alacsony koncentráció mellett. Ha egyedül kalciumionokat adagoltunk, annak csekély hatása volt. Azonban azt tapasztaltuk, hogy a kalciumionok megnövelik a magnéziumionoknak azt a képességét, amellyel elősegítik a PMA-val indukált aggregációt. Ha 1,25 mM kalciumiont adtunk a táptalajhoz, 0,02 mM magnéziumion-koncentráció elősegítette az aggregációt. Ezek az adatok azt mutatták, hogy a sejtek LFA-l-függő aggregációjához magnéziumionok szükségesek, és hogy a kalciumionok, bár önmagukban elégtelenek, szinergistái a magnéziumionoknak az aggregációt illetően.

8. példa

Anti-ICAM-1 monoklonális antitesteket kifejező hibridómasejtek izolálása

Az ICAM-l-kötő monoklonális antitesteket R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137,1270-1724 (1986)] módszere szerint izoláltuk. E közleményt itt referenciaként használjuk fel. Azaz 3 Balb/c egeret intraperitoneálisan oltva immunizáltunk egy LFA-1 deficiens egyén perifériás véréből származó EBV-transzformált mononukleáris sejtjeivel [T. A. Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901 (1984)]. Minden immunizáló oltáshoz körülbelül 10⁷ sejtet tartalmazó 1 ml RPMI 1640 táptalajt használtunk. Az oltásokat az egérlépsejtek eltávolítása előtt 45,29 és 4 nappal végeztük a kívánt hibridómasejtek termelése végett. A lépsejtek eltávolítása előtt 3 nappal az egereknek további 10⁷ sejtet adtunk intravénásán, 0,15 ml táptalajban.

HU 218 904 Β

A fent említett állatokból izolált lépsejteket P3X73Ag8.653 mielomasejtekkel (ATCC CRL 1580) fuzionáltuk 4:1 arányban G. Galfre és munkatársai [Natúré, 266, 550 (1977)] előirata szerint. A kapott hibridómasejtek részleteit 96 tartályos mikrotitráló lemezekre mértük be. A hibridóma felülúszókat aggregációgátlásra szűrtük, és egy táló hibridómát (600 vizsgált tartályból) határhígításos módszenei klónoztunk és szubklónoztunk. Ezt a szubklónt RR1/1.1.1 jelzéssel láttuk el (a továbbiakban az „RR1/1” jelzést használjuk).

Megállapítottuk, hogy az RR1/1 monoklonális antitest következetesen gátolja az LFA-l-et kifejező JY sejtvonal PMA-val stimulált aggregációját. Az RR1/1 monoklonális antitest által gátolt aggregáció azonos vagy valamivel kisebb, mint az LFA-1 a- vagy β-alegységével szembeni egyes monoklonális antitestek gátlása. Ezzel szemben a kontroll HLA-ellenes monoklonális antitestek - HLA antitesteket bőségesen fejezik ki a JY sejtek nem gátolják az aggregációt. Azt az antigént, amelyet az RR1/1 monoklonális antitest megköt, intercelluláris adhéziós molekula-1-nek (ICÁM-1-nek) neveztük el.

9. példa

Anti-ICAM-1 monoklonális antitestek felhasználása az ICAM—1 molekula jellemzésére

Annak érdekében, hogy meghatározzuk az ICÁM -1 természetét, és főként hogy meghatározzuk, vajon az ICAM-1 különbözik-e az LFA-1-től, sejtproteineket immunprecipitáltunk az RR1/1 monoklonális antitesttel. Az immunprecipitációt R. Rothlein és munkatársai szerint végeztük [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)]. A JY sejteket, 5 · 10⁷ sejt/ml mellett, 1% Triton X-100, 0,14 M NaCl, 10 mM trisz (pH=8,0), frissen hozzáadott 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid és 0,2 egység/ml tripszin inhibitor aprotonin tartalmú oldatban (lizálópuffer) lizáltuk 20 percig 4 °C-on. A lizátumokat lecentrifugáltuk (10 000 g; 10 perc) és cián-bromiddal aktivált, glicinnel kezelt Sepharose CL-4B (Pharmacia) 50%-os szuszpenziójának 50 μΐ-ével előderítettük 1 órán át 4 °C-on. A lizátum 1 ml-ét a Sepharose CL-4B-hez kötött (1 mg/ml) RR1/1 monoklonális antitest 50%-os szuszpenziójának 20 μΐ-ével immunprecipitáltuk egy éjszakán át 4 °C-on [T. A. Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901 (1984)]. A Sepharose-monoklonális antitest kötést úgy végeztük, hogy a Sepharose CL-4B-t bróm-ciánnal aktiváltuk karbonátpufferben S. March és munkatársai módszere szerint [Anal. Biochem., 60, 149 (1974)]. A mosott immunprecipitátumokat SDS-PAGE módszerrel és ezüstfestéssel vizsgáltuk J. H. Morrissey eljárása szerint [Anal. Biochem., 117, 307(1981)].

A proteineket SDS mintapufferrel [Μ. K. Ho és munkatársai, J. Bioi. Chem., 258, 636 (1983)] oldottuk ki 100 °C-on, a mintákat kettéosztottuk, és redukáló (5A. ábra) és nem redukáló (5B. ábra) körülmények között elektroforetizáltuk (SDS-8% PAGE). Az 50 kD és 25 kD molekulatömegű sávok a Sepharose-monoklonális antitestből származó immunglobulinok nehéz és könnyű láncának felelnek meg (5A. ábra, 3. nyomsáv). Különböző mennyiségű más sávot is megfigyeltünk a 25-50 kD molekulatömegű tartományban, ezeket azonban nem észleltük a hajas leukémiasejteken, amelyek csak egy 90 kD molekulatömegű sávot adtak. Az LFA-1 177 kD-os α-alegysége és 95 kD-os βalegysége az ICAM-l-től eltérően vándorolt, mind redukáló (5A. ábra, 2. nyomsáv), mind nem redukáló (5B. ábra, 2. nyomsáv) körülmények között.

Az RR1/1 monoklonális antitest hatását a PHA-limfoblaszt aggregációjára a 2. példában leírt kvantitatív aggregációs vizsgálat alkalmazásával határoztuk meg. Ezért a T-sejt eredetű blasztsejteket stimuláltuk 4 napon át PHA-val, majd gondosan mostuk, és ezután 6 napon át IL-2-vel kondicionált táptalajban tenyésztettük. A 6 napos tenyésztés alatt a PHA intemalizálódott, és nem befolyásolta az aggregációs vizsgálatot. Különböző T-blasztsejtekkel végzett három különböző vizsgálatban az ICAM-1 monoklonális antitestek következetesen gátolták az aggregációt (II. táblázat).

11. táblázat

PMA-val stimulált PHA-limfoblasztok aggregációjának gátlása RR1/1 monoklonális antitesttel³

Kísérlet	PMA	MAt	Aggregáció %-a	Gátlás^b %-a
l^c	-	Kontroll	9	-
	+	Kontroll	51	0
	+	HLA-A, B	58	-14<*
		LFA-1a	31	39
	+	ICAM-1	31	39
2<=	-	Kontroll	10	-
	+	Kontroll	78	0
	+	LFA-1β	17	78
	+	ICAM-1	50	36
3^f	-	-	7
	+	Kontroll	70
	+	HLA-A, B	80	-14
	+	LFA-3	83	-19
	+	LFA-1a	2	97
	+	LFA-1β	3	96
	+	ICAM-1	34	51

^a Az 50 ng/ml PMA-val stimulált PHA-val indukált limfoblasztok aggregációját a 2. példában leírtak szerint indirekt módon határoztuk meg úgy, hogy a nem aggregálódott sejteket mikroszkóp segítségével számoltuk meg.

^b A gátlás százaléka a PMA-val és X63 monoklonális antitesttel kezelt sejtekhez viszonyítva.

^c Az aggregációt a monoklonális antitest és PMA együttes hozzáadása után 1 óra múlva mértük.

⁴ A negatív szám az aggregáció százalékos erősödését jelzi. ^c Az aggregációt a monoklonális antitest és PMA együttes hozzáadása után 1 óra múlva mértük. A sejteket 200 g mellett 1 percig ülepítettük,

HU 218 904 Β °C-on 15 percig inkubáltuk, óvatosan rcszuszpendáltuk, és 45 percig 100 fordulat/pcrc mellett ráztuk.

^f A sejteket 4 órán át 37 °C-on PMA-val előkezeltük. Miután hozzáadtuk a monoklonális antitestet, a csöveket 37 °C-on inkubáltuk 20 percig nyugalmi helyzetben és 100 percig 75 fordulat/perc mellett.

Az LFA-1 monoklonális antitestek következetesen erősebben gátoltak mint az ICAM-1 monoklonális antitestek, míg a HLA-1 és LFA-3 monoklonális antitestek hatástalanok voltak. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy a vizsgált monoklonális antitestek közül csak azok kötődtek LFA-1-hez vagy ICÁM-1-hez, amelyek képesek voltak a sejtes adhéziót meggátolni.

10. példa

ICAM-1 elleni monoklonális antitest előállítása Immunizálás

Balb/c egereket intraperitoneálisan (i.p.) oltunk 2 χ 0,5 ml-ben (RPMI táptalajban) 2 · 10⁷ JY sejttel a fúzió előtt 103 és 24 nappal. A fúzió előtti 4. és 3. napon az egereket i.p. oltjuk 0,5 ml RPMI táptalajban 10⁷PMA-val differenciált U937 sejttel.

U937 sejtek differenciálása

U937 sejteket (ATCC CRL-1593) differenciálunk úgy, hogy 5 · 10⁵/ml sejtet 10% fetális bovinszérummal, 1% glutaminnal és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI táptalajban (teljes táptalaj), mely 2 ng/ml forbol12-mirisztát-acetátot (PMA) tartalmaz, inkubálunk steril polipropilén tartályban. Az inkubálás harmadik napján a táptalaj felét levesszük, és friss PMA-tartalmú teljes táptalajjal pótoljuk. A 4. napon a sejteket eltávolítjuk, mossuk és előkészítjük immunizáláshoz.

Fúzió

Az immunizált egerekből származó lépsejteket P3X63Ag8.653 mielomasejtekkel -4:1 arányban - fuzionáljuk Galfre és munkatársai [Natúré, 266, 550 (1977)] szerint. A fúzió után a sejteket 96 tartályos, lapos fenekű mikrotitráló lemezekre visszük, tartályonként 10⁵ lépsejttel.

Anti-ICAM-1 pozitív sejtek szelekciója

Egy hét után 50 pl felülúszót szűrünk a 2. példa szerinti kvalitatív aggregációs vizsgálattal, JY (ATCC CCL 84) és SKW-3 (DSM ACC 53) sejteket mint aggregálódó sejtvonalakat használva. Azokból a felülúszókból, amelyek a JY sejtek aggregációját gátolják, de nem gátolják az SKW-3 sejtekét, a sejteket szelektáljuk, és kétszer klónozzuk határhígításos módszert alkalmazva.

A kísérlet három külön olyan hibridómavonal azonosítását és klónozását eredményezte, amelyek antiICAM-1 monoklonális antitestet termeltek. A hibridómasejtvonalak által termelt antitestek IgG_2a, IgG_2b, illetve IgM típusúak voltak. Az IgG_2a anti-ICAM-1 antitestet termelő hibridómasejtvonal R6’5’D6’E9’B2 jelzést kapott. Az előnyös hibridómasejtvonal jele: R6’5’D6’E9’B2 (a továbbiakban „R6-5-D6”).

11. példa

Az ICAM-1-expressziója és szabályozása

Az ICAM-l-expressziójának mérésére egy radioimmunassay-t fejlesztettünk ki. A vizsgálatban tisztított

RRl/l-et jóddal jelzünk egy jódvegyülettel úgy, hogy specifikus aktivitása 10 pCi/pg legyen. Endoteliális sejteket tenyésztünk 96 tartályos lemezeken, és ezeket a kísérleteknél leírt módon kezeljük. A lemezeket 4 °C-ra hűtjük oly módon, hogy fél-egy órára hideg szobába helyezzük a lemezeket és nem azonnal jégre. Az egysejt rétegeket háromszor mossuk hideg teljes táptalajjal, majd 30 percig 4 °C-on inkubáljuk ¹²⁵J-RRl/l-gyel. A megkötött ¹²⁵J-ot 0,1 mólos NaOH-val szabadítjuk fel és számlálunk. A ¹²⁵J-RR1/1 specifikus aktivitását jelzetlen RR1/1 használatával állítjuk be, hogy a vizsgálat során lineáris szignált kapjunk az antigén sűrűségértékére. A nem specifikus kötést a jelzetlen RR1/1 ezerszeres túlsúlyának jelenlétében határoztuk meg, ezt levontuk a teljes kötésből, és ez eredményezte a specifikus kötést.

A fent leírt radioimmunassay-vel mért ICAM-1expresszió megnövekszik humán köldökvéna endoteliális sejteken (HUVEC; humán umbilical vein endothelial cells) és humán véna spahena endoteliális sejteken (HSVEC; humán saphenous vein endothelial cells) IL-1, TNF, BPS és IFN-gamma hatására (III. táblázat). Ebben a vizsgálatban véna sephena endoteliális sejteket használtunk, hogy megerősítsük azokat az eredményeket, amelyeket köldökvéna endoteliális sejtekből és felnőttek szövetéből származó nagy vénás endoteliális sejtek tenyészetéből kaptunk. Az ICAM-1 alapexpressziója kétszer nagyobb véna saphena endoteliális sejteken, mint köldökvéna endoteliális sejteken. Ha köldökvéna endoteliális sejteket rekombináns IL— 1 a, IL—1 β és TNF-gamma hatásának teszünk ki, tíz-hússzorosára nő az ICÁM- 1-expresszió. Az IL-1 a, TNF és LPS voltak a leghatásosabb indukálószerek, és az IL-1 sem tömeg szerint, sem telítési koncentrációkban nem volt elég hatásos a válasz szempontjából (III. táblázat). Az IL-1 β 100 ng/ml koncentrációban 9-szeresére növelte az ICAM-1-expressziót HUVEC-en és 7,3-szorosra HSVEC-en, és 15 ng/ml-nél a növekedés a maximum felét érte el. Az rTNF 50 ng/ml-nél 16-szorosra növelte az ICAM-l-expresszióját HUVEC-en és 11-szeresre HSVEC-en, és 0,5 ng/ml-nél a maximális hatás felével. Az interferon-gamma jelentősen növelte az ICAM-1expressziót, azaz 10 000 egység/ml-nél 5,2-szeres volt HUVEC-en és 3,5-szörös HSVEC-en. Az LPS hatása 10 pg/ml mellett hasonló nagyságú volt, mint az rTNF hatása. Ezen mediátorok páronkénti kombinációja vagy additív vagy az additívnél valamivel kisebb hatást gyakorolt az ICAM-l-expressziójára (III. táblázat). Az rTNF kereszttitrálása rIL-1 β-val és rINF gammával nem mutatott szinergizmust közöttük sem szuboptimális, sem optimális koncentrációkban.

Minthogy az LPS növeli az ICAM-l-expresszióját az endoteliális sejteken olyan mennyiségekben is, mint amennyi néha a táptalajokban előfordul, megvizsgáltuk azt a lehetőséget, hogy vajon az alap ICAM-l-expresszió az LPS-nek tulajdonítható-e. Több szérumsarzs vizsgálatánál azt tapasztaltuk, hogy az alacsony endotoxintartalmú szérum 25%-kal alacsonyabb ICAM-1 alapexpressziót eredményezett. Az itt ismertetett összes eredmény olyan endoteliális sejtekre vonatkozik, amelyeket

HU 218 904 Β alacsony endotoxintartalmú szérummal tenyésztettünk. Azonban 10 pg/ml LPS neutralizáló polimixin B antibiotikum bevitele csak egy további 25%-kal csökkentette az ICAM-l-expressziót (III. táblázat). Az IL-1 vagy

TNF kezelés hatására megnövekedett ICÁM-1-expressziót nem befolyásolta 10 pg/ml polimixin B jelenléte, ami egybevág ezen készítmény alacsony endotoxinszintjével (III. táblázat).

111. táblázat

Anti-ICAM-1 monoklonális antitestek

Kondicionálás (16 óra)	Specifikusan kötött ¹²⁵J (cpm)
HUVEC		HSVEC
kontroll	603±ll	-	1132±31
100 ng/ml rIL-1 β	5 680±633	9x	8 320±766	7,3x
50 ng/ml rIL-1 a	9 910±538	16x	-	-
50 ng/ml rTNF a	9 650±1500	16x	12 690±657	11,2x
10 pg/ml LPS	9 530±512	16x	10 459±388	9,2x
10 ng/ml rlFN gamma	3120±308	5,2x	4 002±664	3,5x
rIL-1 a + rTNF	1 469±1410	24x	16 269±660	14x
rIL-1 β + LPS	13 986±761	23x	10 870±805	10x
rIL-Ι β + rlFN gamma	7 849±601	13x	8401±390	7,4x
rTNF + LPS	15 364±124	24x	16 141±1272	14x
rTNF + rlFN gamma	13 480±1189	22x	13 238±761	12x
LPS + IFN gamma	10 206±320	17x	10 987±668	lOx
polimixin B (10 pg/ml)	480±23	-	-	-
polimixin B + rIL-1	5 390±97	llx	-	-
polimixin B + rTNF	9 785±389	20x	-	-
1 pg/ml LPS	7 598±432	13x	-	-
polimixin B + LPS	510±44	Llx

Az ICAM-l-expressziójának HUVEC-en és HSVEC-HUVEC-en vagy HSVEC-en való szabályozásához e sejteket 96 tartályos lemezekre oltottuk összefolyt egysejtrétegről 1:3 arányban, majd hagytuk növekedni összefolyásig. A sejteket ezután a felsorolt anyagokkal vagy közegekkel kezeltük 16 órán át, és a RIA-t a leírt műszerekkel végeztük el. Minden vizsgálatot négy párhuzamossal végeztünk.

12. példa

Az interleukin-1 és a gamma-interferon indukciójának kinetikája ICÁM-1-re vonatkozólag

Az interleukin-1 és a gamma-interferon hatásának kinetikáját ICAM-l-nek bőr fibroblasztokon való kifejeződésénél M. L. Dustin és munkatársai [J. Immunoi., 137, 245-254 (1986), mely közleményt referenciaként használjuk fel] szerint határoztuk meg, ¹²⁵J-dal jelzett kecske-anti-egér IgG-kötési vizsgálat alkalmazásával. A kötési vizsgálat elvégzése érdekében humán bőr fibroblasztokat tenyésztettünk 96 tartályos mikrotitráló lemezeken 2-8 Ί0⁴ sejt/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. A sejteket kétszer mostuk az 1. példa szerint kiegészített RPMI 1640 tápoldattal. A sejteket még egyszer mostuk 10 mM HEPES, 0,05% NaN₃ és 10% hőinaktivált fetális bovinszérumot tartalmazó Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (Hanks’ Balanced Salt Solution=HBSS). A kötőpufferrel való mosást 4 °C-on végeztük. Minden tartályhoz hozzáadtunk 50 pl-t a fenti kötőpufferből és 50 pl-t a megfelelő X63 (ATCC TIBI7) és W6/32 hibridóma (ATCC HB95) felülúszóból negatív, illetve pozitív kontrollként. Az inkubálást 30 percig 4 °C-on gyenge rázogatás mellett végeztük, a tartályokat kétszer mostuk a kötőpufferrel, majd hozzáadtuk 100 pl-ben a második antitestet, a ¹²⁵J kecskeanti-egér antitestet 50 nCi értékben. A ¹²⁵J kecske-anti-egér antitestet Iodogén (Pierce) felhasználásával készítettük, P. J. Fraker és munkatársai módszere szerint [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 80, 849 (1978)]. Harminc perc (4 °C) múlva a tartályokat kétszer mostuk 200 pl kötőpufferrel, és a sejtréteget 100 pl 0,1 M NaOH hozzáadásával oldottuk fel. Ezt és egy 100 pl-nyi mosófolyadékot Beckman 5500 gamma-számlálóban vizsgáltuk. A specifikus kötés beütési számát a következőképpen számítottuk ki: (cpm a monoklonális antitesttel)-(cpm X63-mal). Minden lépést, a specifikus reagensekkel való indukciót beleértve, négy párhuzamos vizsgálatban végeztünk.

Az interleukin-1-nek az ICAM-1 indukciójára gyakorolt hatásának a félélet-ideje 2 óra, s ez gyorsabb mint a gamma-interferoné, melynél 3,75 óra volt a félélet-idő (6. ábra). Az ICAM-1 nyugalmi szintre való visszatérésének időtartalma úgy látszik, hogy a sejtcik18

HU 218 904 Β lustól vagy a sejtnövekedés sebességétől függ. Nyugalmi állapotban lévő sejtekben az interleukin-1 és a gamma-interferon hatása 2-3 napon át stabil, míg lóg fázisban lévő tenyészetekhez az ICAM-l-expressziója 2 nappal az indukálóanyagok eltávolítása után közel van az alapszinthez.

Az ICAM-1 indukcióját illetően a rekombináns egér és humán interleukin-1 és a rekombináns gammainterferon dózis válaszgörbéi a 7. ábrán láthatók. A gamma-interferonnál és az interleukin- 1-nél hasonlók a koncentrációfüggések és közel azonos hatásúak 1 pg/ml mellett. A humán és az egér rekombináns interleukin-1 görbéi szintén hasonlóak, de sokkal kisebb hatással vannak az ICÁM-1-expressziójára, mint a humán interleukin-1 készítmények.

A ciklohexamid, amely a proteinszintézis inhibitora és az aktinomicin D, amely az mRNS-szintézis inhibitora, megszünteti mind az interleukin-1, mind a gammainterferon hatását az ICÁM-1-expressziójára fibroblasztokon (IV. táblázat). Ezenfelül a tunikamicin, amely az N-glükozilációt gátolja, csak 43%-ban gátolja az interleukin-1 hatását. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az ICÁM- 1-expresszió interleukin-1-gyei és gamma-interferonnal stimulált növekedéséhez proteinés mRNS-szintézisre van szükség, de N-glükozilációra nincs szükség.

IV. táblázat

Cikloheximid, aktinomicid D és tunikamicin hatása az IL-l-gyel és gamma-interferonnal indukált ICÁM-1-expresszióra humán bőr fibroblasztokon³

Kezelés	Specifikusan kötött ¹²⁵J kecske-anti-egér IgG (cpm)
anti-ICAM-1	Anti-HLA Λ, B, C
kontroll (4 óra)	1525±140	11 928±600
+cikloheximid	1513±210	10 678±471
+actinomicin D	1590±46	12 276±608
+tunikamicin	1461±176	12 340±940
1L 1 (10 E/ml) (4 óra)	4264±249	12 155±510
+cikloheximid	1619±381	12 676±446
+aktinomicin D	1613±88	12 294±123
+tunikamicin	3048±113	13 434±661
IFN-gamma (10 E/ml) (18 óra)	4569±109	23 675±500
+cikloheximid	1461±59	10 675 ±800
+aktinomicin D	1326±186	12 089±550

^a Humán fibroblasztokat tenyésztünk 8 -10⁴ sej t/tartály (0,32 cm²) sűrűségig. A kezeléseket a felsorolt reagensekkel 50 μΐ-es végtérfogatban végeztük. A cikloheximidből, aktinomicin D-ből és tunikamicinből 20 pg/ml, illetve 10 μΜ, illetve 2 μg/ml mennyiséget adagoltunk a citokinnel azonos időben. Minden adat négy párhuzamos vizsgálat eredményei SD.

13. példa

Az ICAM-1 szöveti megoszlása

Humán szervek fagyasztott szöveteit hisztokémiai vizsgálatnak vetettük alá, hogy meghatározzuk az ICAM-1 megoszlását a timuszban, nyirokcsomókban, bélben, bőrben, vesében és májban. A vizsgálatot úgy végeztük el, hogy normál humán szövetek fagyasztott metszeteit (4 pm vastag) acetonban fixáltuk 10 percig és RR1/1 monoklonális antitesttel, immunperoxidáz technikával festettük, az avidin-biotin komplex módszert használva (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) N. Cerf-Bensussan és munkatársai [J. Immunoi., 130, 2615 (1983)] leírása szerint. Az antitesttel való inkubálás után a metszeteket egymás után biotinilezett ló-anti-egér IgG-vel és avidin-biotinilezett peroxidáz komplexszel inkubáltuk. A metszeteket végül 3-amino-9-etil-karbazol (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) tartalmú oldatba mártottuk a színreakció kifejlesztésére. A metszeteket ezután 4%-os formaldehidben 5 percig fixáltuk, majd hematoxilinnel átfestettük. A kontrollmetszeteket nem rokon monoklonális antitesttel inkubáltuk RR1/1 antitest helyett.

Azt találtuk, hogy az ICÁM-1 megoszlása igen hasonló a fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) II. osztályú antigénjeinek a megoszlásához. Minden szövetben a legtöbb érpályában (kis és nagy érben) az endoteliális sejteknek ICÁM-1 antitesttel való festődését ki lehetett mutatni. A vaszkuláris endoteliális festődés intenzívebb volt a nyirokcsomókban, mandulákban és Peyer-plakkokban lévő interfolikkuláris (parakortikális) területeken, összehasonlítva a vesében, májban és normál bőrben lévő véredényekkel. A májban a festődés leginkább a szinuszoid béléssejtekre korlátozódott; a hepatociták és a legtöbb gyűjtő- és ütőér endoteliális béléssejtje nem festődött.

A timusz velőállományában nagy sejtek diffúz festődése és egy dendritikus festődési kép volt megfigyelhető. A kéregállományban a festődési kép gócos volt és túlnyomóan dendritikus. A timociták nem festődtek. A perifériás nyirokszövetekben a másodlagos limfoid follikuluszok germinatív centrumú sejtjei intenzíven festődtek. Bizonyos limfoid follikulusokban a festődési kép főként dendritikus volt, a limfocitákra jellemző festődés nélkül. A külső zónában enyhén festődé sejteket figyeltünk meg. Ezenkívül a kiterjedt citoplazmával rendelkező dendritikus sejtek (interdigitating reticulum cells; interdigitáló retikulumsejtek) és egy kisszámú limfocita az interfollikuláris vagy parakortikális területeken festődött ICÁM-1-hez kötődő antitestekkel.

A nyirokcsomókban és a vékonybél kötőszöveti rétegében (lamina propria) a makrofágokhoz hasonló sejtek megfestődtek. A fibroblasztszerű sejtek (orsú alakú sejtek) és a dendritikus sejtek, amelyek a legtöbb vizsgált sejt sztrómájában szétszórtan helyezkedtek el, megfestődtek ICÁM-1-hez kötődő antitesttel. Nem észleltünk festődést az epidermiszben a Langerhans/indetermináns sejtekben. Nem volt festődés a simaizom-szövetben.

HU 218 904 Β

A mandulák nyálkahártyájában következetesen látható volt az epitheliális sejtek festődése. Jóllehet a hepatociták, az epevezeték epitheliuma, a bél epitheliális sejtjei és a vesetubulusok epitheliális sejtjei a legtöbb esetben nem festődtek, egy vesesejt-karcinóma esetében nefrektomiával kapott normál veseszövetmetszetekben számos proximális tubuláris sejt mutatott festődést ICAM-l-re nézve. Ezek a tubuláris epiteliális sejtek anti-HLA-DR-kötő antitesttel is festődtek.

Összefoglalva az ICAM-1 kifejeződik olyan nem hematopoetikus sejtekben, mint a vaszkuláris endoteliális sejtek, és olyan hematopoetikus sejteken, mint a szöveti makrofágok és a mitogénnel stimulált T-limfocitablasztok. Azt találtuk, hogy kis mennyiségben ICAM-1 fejeződik ki perifériás vérlimfocitákon.

14. példa

ICAM-1 tisztítása monoklonális antitest-affinitáskromatográfiával

Általános tisztítási séma

Az ICÁM-1 -et humán sejtekből vagy szövetekből tisztítottuk monoklonális antitest-affmitáskromatográíiával. Először az ICAM-l-gyel reagáló RR1/1 monoklonális antitestet tisztítottuk, majd inért oszlopmátrixhoz kötöttük. Az antitestet R. Rothlein és munkatársai [J. Immunoi., 137, 1270-1274 (1986)] és M. L. Dustin és munkatársai [J. Immunoi., 137, 245 (1986)] ismertették. Az ICAM-l-et sejtmembránokból oldottuk ki úgy, hogy a sejteket nemionos detergenssel, Triton Χ-100-zal lizáltuk közel neutrális pH-η. A szolubilizált ICAM-l-et tartalmazó sejtlizátumot ezután előtétoszlopokon vittük át, hogy eltávolítsuk azokat az anyagokat, amelyek nem specifikusan kötődnek az oszlopmátrix anyagához, majd a monoklonális antitest-oszlopmátrixon visszük át, s hagyjuk, hogy az ICAM-l-et megkösse az antitest. Az antitestoszlopot ezután egy sorozat növekvő pH-jú detergens mosópufferrel - pH = 11,0-ig - mossuk. A mosások alatt az ICAM-1 kötve marad az antitestmátrixhoz, míg a nem kötött és gyengén kötött szennyezések leoldódnak. A megkötött ICAM-l-et ezután specifikusan oldjuk le az oszlopról egy pH = 12,5 detergenspufferrel.

Az RR1/1 monoklonális antitest tisztítása és kovalens kötése Sepharose CL-4B-hez

Az RR1/1 anti-ICAM-1 monoklonális antitestet hibridóma hordozó egerek ascites folyadékából vagy hibridómatenyészet-felülúszókból tisztítottuk standard technikákkal, ammónium-szulfátos kicsapással és protein A affinitáskromatográfiával [Ey és munkatársai, Immunochem., 15, 429 (1978)]. A tisztított IgG-t vagy patkány-IgG-t (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) kovalens kötéssel kapcsoltuk Sepharose CL-4B-hez (Pharmacia, Uppsala, Svédország) March és munkatársai [Anal. Biochem., 60, 149 (1974)] módszerének egy módosított változatát alkalmazva. Röviden: A Sepharose CL-4B-t desztillált vízben mostuk, 40 mg/ml CNBr-mal - 5 M K₂HPO₄-ben (pH=körülbelül 12) - aktiváltuk, majd alaposan mostuk, 0,1 M HCl-dal 4 °C-on. A szűrt, aktivált Sepharose-t azonos térfogatú tisztított antitesttel (2-10 mg/ml; 0,1 M NaHCO₃ és 0,1 M NaCl-tartalmú oldatban) reszuszpendáltuk. A szuszpenziót 18 órán át 4 °C-on óvatos le-fel forgatással inkubáltuk. A felülúszót ezután 280 nm-en mért abszorpciójával ellenőriztük, hogy tartalmaz-e kötetlen antitestet, majd az aktivált Sepharose maradék reaktív helyeit 0,05 mólos glicin hozzáadásával telítettük. A kötés hatékonysága rendszerint 90%-osnál nagyobb volt.

Humán lépből készített membránok szolubilizálása detergenssel

Az egész eljárást 4 °C-on végeztük. Hajas sejtes leukémiás betegtől származó fagyasztott humán lépet (200 g; darabos) jégen megolvasztottunk 200 ml 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF), 0,2 egység/ml aprotonint és 5 mM jód-acetamidot tartalmazó triszkonyhasó- (50 mM trisz, 0,14 M NaCl, pH = 7,4; 4 °C) oldatban. A szövetet kis darabkákra vágtuk, és 4 °C-on Tekmar-porhomogenizátorban homogenizáltuk. A mennyiséget 300 ml-re töltöttük fel trisz-konyhasó-oldattal, és 100 ml 10% Tween 40-et (poli-oxi-etilén-szorbitán-monopalmitátot) tartalmazó trisz-konyhasó-oldatot adtunk hozzá, hogy a Tween 40 végső koncentrációja 2,5% legyen. Membránkészítés céljából a homogenizátumot egy Dounce vagy előnyösebben egy Teflon Potter Elvejhem homogenizátorban három ütemben extraháltuk, ezután 1000 g mellett centrifugáltuk 15 percig. A felülúszót megőriztük, és az üledéket újra extraháltuk 200 ml 2,5%-os Tween 40-et tartalmazó trisz-konyhasó-oldatban. Centrifugálás után (1000 g; 15 perc) a két extrahálás felülúszóit egyesítettük és 150 000 g mellett 1 órán át centrifugáltuk, hogy a membránokat leülepítsük. A membránokat 200 ml trisz-konyhasó-oldatban reszuszpendáltuk, és egy motorizált homogenizátorral - teflon mozsártörővei - homogenizáltuk addig, amíg a szuszpenzió egyenletesen zavaros nem lett. A mennyiségét ekkor 900 ml-re egészítettük ki trisz-konyhasó-oldattal, 1% végkoncentrációig N-lauril-szarkozint adtunk hozzá, majd 4 °C-on 30 percig kevertük. A detergenslizátumban lévő oldhatatlan anyagokat centrifugálással (150 000 g; 1 óra) távolítottuk el. Ezután Triton Χ-100-at adtunk a felülúszóhoz 2% végkoncentrációig, és a lizátumot 4 °C-on 1 órán át kevertük.

A JY B-limfoblasztoid sejtek szolubilizálása detergenssel

A JY EBV-transzformált B-limfoblasztoid sejtvonalat 10% fetális borjúszérumot (FCS) és 10 mM HEPES-t tartalmazó RPMI1640 táptalajban tenyésztettük. A tenyésztést közelítőleg 0,8-1,0 -10⁶ sejt/ml sűrűségig folytattuk. Az ICAM-1 sejtfelszíni expressziójának a növelésére 25 ng/ml forbol-12-mirisztát-13-acetátot (PMA) adtunk a tenyészethez a sejtek aratása előtt 8-12 órával. Ez alatt az idő alatt 50 μΜ nátrium-vanadátot adtunk a tenyészethez. A sejteket 500 g mellett 10 percig tartó centrifugálással ülepítettük, és kétszer mostuk Hanks-féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS) való felszuszpendálással és centrifugálással. A sejteket (körülbelül 5 g/5 liter tenyészet) 50 ml lizálópufferben (0,14 NaCl, 50 mM trisz, pH=8,0, 1% Triton X-100,

HU 218 904 Β

0,2 E/ml aprotonin, 1 mM PMSF, 50 μΜ nátriumvanadát) lizáltuk 4 °C-on 30 percig keverés közben. A lizálatlan sejtmagokat és oldhatatlan törmelékeket 10 000 g mellett 1 órán át centrifugálva távolítottuk el, majd a felülúszót Whatman 3 mm szűrőpapíron szűrtük meg.

Az ICAM-1 affinitáskromatográfiája szerkezetvizsgálatokhoz

A strukturális vizsgálatokhoz szánt ICAM-1 nagybani tisztításához egy 10 ml-es RRl/l-Sepharose CL-4B oszlopot (Pharmacia) (2,5 mg kötött antitest/ml gél) és két 10 ml-es CNBr-mal aktivált, glicinnel blokkolt Sepharose CL-4B előtétoszlopot és patkány-IgG-vel konjugált Sepharose CL-4B (2 mg/ml) oszlopot használtunk. Az oszlopokat sorba kötöttük és előmostuk tíz oszloptérfogat-lizáló pufferrel, 10 oszloptérfogat 12,5 pH-jú pufferrel (50 mM trietil-amin, 0,1% Triton X-100, pH = 12,5; 4 °C), majd 10 oszloptérfogat-lizáló pufferrel hoztuk egyensúlyba az oszlopokat. A humán lép detergenslizátumának 1 literét vittük fel az oszlopra 0,5-1,0 ml/perc átfolyási sebességgel. A két előtétoszlopot arra használtuk, hogy a nem specifikusan kötődő anyagokat eltávolítsuk a lizátumból, mielőtt az RR1/1-Sepharose oszlopra kerülne.

A felvitel után az RR1/1-Sepharose oszlopot és a megkötött ICAM-l-et 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett minimum 5 oszloptérfogattal mostuk egymás után a következő oldatokkal: 1) lizálópuffer; 2) 20 mM trisz (pH=8,0)/0,14 M NaCl/0,1% Triton X-100; 3) 20 mM glicin (pH=10,0)/0,1% Triton X-100 és 4) 50 mM trietil-amin (pH=11,0)/0,1% Triton X-100. Mindegyik mosópuffer 1 mM PMSF-et és 0,2 E/ml aprotonint tartalmazott. Mosás után a kötve maradt ICAM-l-et 5 oszloptérfogat-kioldó pufferrel (50 mM trietil-amin/0,1% Triton X-100/pH=12,5; 4 °C) eluáltuk 1 ml/3 perc átfolyási sebesség mellett. A leoldódó ICAM-1-bői 1 ml-es frakciókat szedtünk, és azonnal semlegesítettük 0,1 ml 1 M trisz (pH=6,7) hozzáadásával. Az ICAM-l-et tartalmazó frakciókat 10 μΐ aliquot mennyiségekből végzett SDS-PAGE módszerrel [Springer és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901 (1984)] azonosítottuk, majd ezüstfestést végeztünk [J. H. Horrissey, Anal. Biochem., 117, 307 (1981)]. Ilyen körülmények mellett az ICAM-1 fő tömege körülbelül 1 oszloptérfogatban oldódott le, és tisztasága nagyobb volt 90%-osnál, amint azt az ezüsttel festett elektroferogramból meg lehetett állapítani (egy kis mennyiségű IgG volt a fő szennyeződés, ami az affinitásmátrixról származott). Az ICAM-1-tartalmú frakciókat egyesítettük és körülbelül 20-szorosra bekoncentráltuk Centricon-30 mikrokoncentrátorokkal (Amicon, Danvers, MA, USA). A tisztított ICAM-1 pool etanollal kicsapott aliquot mennyiségéből Lowry módszerével meghatároztuk a proteintartalmat: körülbelül 500 pg tiszta ICAM-l-et állítottunk elő 200 g humán lépből.

A tisztított ICAM-1 körülbelül 200 pg-ját egy második tisztítási lépésben preparatív SDS-poliakrilamid-gélben elektroforetizáltuk. Az ICAM-l-et reprezentáló sávot úgy tettük láthatóvá, hogy a gélt 1 M KCl-ben áztattuk, majd az ICAM-l-et tartalmazó géldarabot kimetszettük és elektroeluáltuk Hunkapiller és munkatársai [Meth. Enzymol., 91, 227-236 (1983)] módszere szerint. A tisztított protein tisztasága nagyobb volt 98%-nál, amint ezt SDS-PAGE ezüstfestéssel megítéltük.

Az ICAM-1 affinitástisztítása funkcionális vizsgálatokhoz

Funkcionális vizsgálatok céljára az ICAM-l-et JY sejtek detergenslizátumából tisztítottuk, mint fent leírtuk, de kisebb léptékben (1 ml-es RR1/1-Sepharose oszlop) és a következő módosításokkal. Minden oldat 50 μΜ nátrium-vanadátot tartalmazott. Miután az oszlopot 0,1% Triton Χ-100-tartalmú pufferrel (pH=11,0) mostuk, újból mostuk az oszlopot 5 oszloptérfogat-azonos pufferrel, mely 1% n-oktil-P-D-glükopiranozidot (oktil-glükozid) tartalmazott 0,1% Triton X-100 helyett. Az oktil-glükozid-detergens kiszorította az ICAM-l-hez kötődött Triton Χ-100-at, és ellentétben a Triton Χ-100-zal, ezután dialízissel eltávolítható. Az ICAM-l-et ezután 0,1% oktil-glükozidot tartalmazó, pH = 12,5 pufferrel eluáltuk, majd mint fent leírtuk, analizáltuk és koncentráltuk.

15. példa

A tisztított ICÁM-1 jellemzői

A humán lépből tisztított ICAM-1 SDS-poliakrilamidgélben széles sávként vándorol, M_F=72 000-91 000. A JY sejtekből tisztított ICAM-1 szintén széles sáv gyanánt vándorol, M_r=76 500-97 000. Ezek az M_r-értékek a különböző sejtforrásokból immunprecipitált ICAM-1re ismert tartományban vannak: M_r=90 000 JY sejteknél, 114 000 az U937 mielomonocita sejtvonalnál és 97 000 fibroblasztoknál [Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137,245 (1986)]. Az M_r ezen széles tartományát a kiteqedt és változatos glükozilációs foknak tulajdonítjuk. A nem glükozilált prekurzomál M_r=55 000 (Dustin és munkatársai). A protein, akár JY sejtekből, akár humán lépből tisztítjuk, megtartja antigén tulajdonságát, amit az bizonyít, hogy újból kötődni képes az eredeti affinitásoszlophoz. További bizonyítékot jelent az immunprecipitáció RRl/l-Sepharose-zal és az SDS-PAGE.

Az ICÁM-1 peptid fragmentumainak az előállításához körülbelül 200 pg proteint redukáltunk 2 mM ditiotreitol/2% SDS eleggyel, majd alkileztük 5 mM jódecetsavval. A proteint etanollal kicsaptuk, visszaoldottuk 0,1 M NH₄CO₃/0,l mM CaCl₂/0,l% Zwittergent 3-14 (Calbiochem) oldatban, ezután emésztés következett 1% (tömeg/tömeg) tripszinnel 37 °C-on 4 órán át, majd tovább emésztettük 1% tripszinnel 12 órán át 37 °C-on. A tripszines peptideket reverz fázisú HPLCvel tisztítottuk, 0,4 χ 15 cm-es C4 oszlop (Vydac) használatával. A peptideket 0-60% acetonitril (0,1%-os trifluor-ecetsavban) lineáris gradiensével eluáltuk. Szekvenciaanalízist végeztünk szelektált peptideken gázfázisú mikroszekvenátorral (Applied Biosystems). Ennek a vizsgálatnak a szekvenciaadatait az V. táblázatban foglaljuk össze.

HU 218 904 Β

V. táblázat

ICÁM-1 tripszines peptidek aminosavszekvenciája

Aminosav- csoport

50a

50b

46a

46b

X

45

K

AA

J

u

0

Ml

1.

[T/V]

A

(V/A)

E

V

S

L

E

A

L

V

L

2.

F

S

Q

P

E

F

N

L

G

L

T

L/E

3.

L

I

T

A

L

P

D

S

G

L

P/(G)

4.

T

s

F

A

T

L

V

I

P

5.

V

L

P

V

R

L

E

G/Y

6.

Y

G

L

N

T

P

V

T

N/L

7.

P

W

P

V

Y

Q

T

P

(N)

8.

T

P

I

T/I

G

C

P/V

(Q)

9.

s

F

G

(G)

L

-

L

s

K

(E)

10.

E

(Q)

-

D

E

T

(D)

11.

A

S

D/P

K

S

L

s

12.

G/S

V

P

F

c

13.

A

T

D

Q

S

E

D

14.

G

V

W

V/L

A

-

Q

15.

I

K

T

P

16.

s

K

17.

A

18.

P

19.

X

20.

Q

21.

L

() - Kevéssé megbízható szekvencia.

[] =Nagyon kevéssé megbízható szekvencia.

/ = Kétértelműséget jelez a szekvenciában; a legvalószínűbb aminosavat az első betű jelenti, a =Nagy peptid. b = Kis peptid.

16. példa

Az ICAM-1 gén klónozása

Az ICAM-1 gén klónozására a különböző eljárások bármelyike felhasználható. Például az ICAM-1 tripszines fragmentumainak szekvenálása révén az aminosavszekvenciáról kapott információkat (V. táblázat) fel lehet használni egy olyan oligonukleotidszekvencia azonosítására, amely megfelelhet az ICAM-1 génnek. Vagy úgy is klónozhatjuk az ICÁM-1 gént, hogy antiICAM-1 antitestet használunk az ICAM-1 termelő kiónok detektálására.

ICAM-1 gén klónozása oligonukleotidszondák segítségével

A genetikai kódot használva [J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. kiadás; W. A. Benjámin, Inc., Menlo Park, CA (1977)] egy vagy több különböző olyan oligonukleotidot azonosíthatunk, amelyek az ICAM-1 peptideket kódolják. Annak valószínűségét, hogy egy bizonyos oligonukleotid a valóságban meg tudja alkotni az adott ICAM-1 kódoló szekvenciát, úgy lehet megítélni, ha figyelembe vesszük a szabálytalan bázispárosodási kapcsolatokat és azt, hogy az egyedi kodonok aktuális használatának milyen a gyakorisága egy bizonyos aminosav kódolásánál eukarióta sejtekben. Ilyen „kodonhasználati szabályok”-at ismertet R. Lathe és munkatársai [J. Molec. Bioi., 183, 1-12 (1985)]. A Lathe-féle „kodonhasználati szabályok” alkalmazásával egyetlen oligonukleotidot vagy oligonukleotidkészletet választunk, amely egy olyan „leginkább valószínű” nukleotidszekvenciát (azaz a legkevesebb felesleget tartalmazó nukleotidszekvencia) tartalmaz, amely képes az ICAM-1 tripszines peptidszekvenciákat kódolni.

Az ICAM-1 fragmentumokat kódoló, elméletileg „leginkább valószínű” szekvenciát tartalmazó oligonukleotid vagy oligonukleotidkészlet használatával egy olyan komplementer oligonukleotidnak vagy oligonukleotidkészletnek a szekvenciáját állapítjuk meg, amely a „legvalószínűbb” szekvenciával vagy szekvenciakészlettel képes hibridizálni. Egy ilyen komplementer szekvenciát tartalmazó oligonukleotid alkalmazható szondaként az ICAM-1 gén azonosítására és izolálására

HU 218 904 Β [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)].

Mint fentebb, a C fejezetben leírtuk, ICAM-1 gént olyan eukarióta DNS-készítményekből klónozhatunk, amelyekről feltételezzük, hogy ezt a gént tartalmazzák. Az ICAM-1 proteint kódoló gén azonosítása és klónozása céljából egy DNS-gyűjteményt szűrünk arra vonatkozóan, hogy képes-e a fent leírt oligonukleotidszondákkal hibridizálni. Minthogy egy normál diploid sejtben az ICÁM-1 génnek valószínűleg csak két másolata van, és minthogy lehetséges, hogy az ICÁM-1 génnek hosszú, nem átírt közbeeső szekvenciái (intronok) vannak, amelyeknek a klónozása nemkívánatos, előnyösebb az ICAM-1 kódoló szekvenciákat egy ICAM-1termelő sejt mRNS-éből készített cDNS-gyűjteményből izolálni, mint genomiális DNS-ből. Az alkalmas DNSvagy cDNS-készítményeket enzimatikusan hasítjuk vagy találomra feldaraboljuk, és rekombináns vektorokba ligáljuk. Ezután e rekombináns vektoroknak a fent leírt oligonukleotidszondákkal való hibridizációs képességét mérjük. A hibridizációs eljárásokat például

T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)] című munkája vagy Β. T. Haymes és munkatársai, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach [IRL Press, Oxford (1985)] című munkája tartalmazza. A hibridizáló vektorokat ezután analizáljuk, hogy meghatározzuk a bennük lévő ICAM-1 szekvenciák nagyságát és természetét. Tisztán statisztikai megfontolásokra alapozva egy olyan gén, mint amely az ICAM-1 molekulát kódolja, egyértelműen azonosítható (hibridizációs szűrés révén) egy csupán 18 nukleotidot tartalmazó oligonukleotidszonda alkalmazásával.

Összefoglalva tehát az ICAM-1 peptidszekvenciák aktuális azonosításával lehetővé válik egy ilyen pepiidet kódoló, elméletileg „legvalószínűbb” DNS-szekvencia vagy -szekvenciakészlet azonosítása. Az elméleti szekvenciával komplementer oligonukleotid megszerkesztése révén (vagy a „legvalószínűbb” oligonukleotidokból álló készlettel komplementer oligonukleotidkészlet szerkesztése révén) egy olyan DNS-molekulát (vagy DNSmolekulakészletet) kapunk, amely mint szonda képes funkcionálni az ICAM-1 gén azonosításánál és izolálásánál.

Az V. táblázatbeli ICAM-1 peptidszekvenciák felhasználásával meghatároztuk egy olyan oligonukleotid „legvalószínűbb” szekvenciáját, amely az AA és J pepiidet kódolja (VI., illetve VII. táblázat). Oligonukleotidokat szintetizáltunk, amelyek ezekkel a szekvenciákkal komplementerek. A kapott szekvenciákat tisztítottuk az ICAM-1 génszekvenciák izolálásánál használandó szondák céljára. Alkalmas, nagyság szerint szelektált cDNS-gyűjteményeket hoztunk létre PMA-val indukált HL-60 (ATCC CCL 240) sejtekből és PS-sel (foszfáttal puffereit NaCl-oldat) stimulált köldökvéna endoteliális sejtekből származó poli(A)⁺ RNS-ből. A PMAval indukált HL-60 sejt eredetű poli(A)⁺ RNS használatával készített, nagyság szerint szelektált cDNS-gyűjtemény előállítására U. Gubler és munkatársai [Gene,

25, 263-269 (1983)] és A. Corbi és munkatársai [EMBO J., 6, 4023-4028 (1987)] módszerét használtuk. Ezeket a közleményeket referenciaként alkalmazzuk.

Egy nagyság szerint szelektált cDNS-gyűjteményt készítettünk köldökvéna endoteliális sejtekből származó poli(A)+ RNS felhasználásával, amelyet 4 órán át 5 pg/ml PS-sel stimuláltunk. Az RNS extrakcióját úgy végeztük, hogy a sejteket 4 mólos guanidinium-izotiocianátban homogenizáltuk, majd a felülúszót CsCl-gradiensben ultracentrifugáltuk [J. M. Chirgwin és munkatársai, Biochem. J., 18, 5294-5299 (1979)]. A poli(A)+ RNS-t az összes RNS-fajta keverékéből izoláltuk oligo(dT)-cellulóz kromatográfiával (Type 3, Collaborative Research) [H. Aviv és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 69,1408-1412(1972)].

VI. táblázat

Az ICÁM-1 AA pepiidet kódoló legvalószínűbb nukleotidszekvenciával komplementer oligonukleotid

Az ICAM-1 aminosavcsoportja	ICAM-1 AA peptid	Az AA peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia	Komple- menter szekvencia
		5’	3’
162	Glu	G	C
		A	T
		G	c
163	Leu	C	G
		T	A
		G	C
164	Asp	G	C
		A	T
		C	G
165	Leu	C	G
		T	A
		G	C
166	Arg	C	G
		G	C
		G	C
167	Pro	C	G
		C	G
		C	G
168	Gin	C	G
		A	T
		G	c
169	Gly	G	c
		G	c
		C	G
170	Leu	C	G
		T	A

HU 218 904 Β

VI. táblázat (folytatás)

Az ICAM-1 aminosavcsoportja	ICAM-1 AA peptid	Az AA peptidet kódoló legvalószínűb b szekvencia	Komple- menter szekvencia
		G	c
171	Glu	G	c
		A	T
		G	c
172	Leu	C	G
		T	A
		G	C
173	Phe	T	A
		T	A
		T	A
174	Glu	G	C
		A	T
		G	c
		3’	5’
175	Asn	A	T
		A	T
		C	G
176	Thr	A	T
		C	G
		C	G
177	Ser	U	A
		C	G
		A
		3’	5’

VII. táblázat

Az ICÁM-1 J peptidet kódoló legvalószínűbb nukleotidszekvenciával komplementer oligonukleotid

Az ICAM-1 aminosavcsoportja	ICAM-1 J peptid	A J peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia	Komple- menter szekvencia
		3’	5’
19	Val	G	C
		T	A
		G	C
20	Thr	A	T
		C	G
		C	G
21	Cys	T	A
		G	C
		C	G
22	Ser	T	A

Az ICAM-1 aminosav- csoportja	ICAM-1 J peptid	A J peptidet kódoló legvalószínűbb szekvencia	Komple- menter szekvencia
		C	G
		c	G
23	Thr	A	T
		C	G
		C	G
24	Ser	T	A
		C	G
		C	G
25	Cys	T	A
		G	C
		T	A
26	Asp	G	C
		A	T
		C	G
27	Gin	C	G
		A	T
		G	C
28	Pro	C	G
		C	G
		C	G
29	Lys	A	T
		A	T
		3’	5’

A cDNS első szálának szintetizálásához 8 pg poli(A)⁺ RNS-t, avian mieloblastosis vírus reverz transzkriptázt (Life Science) és egy oligo(dT) prímért használtunk. A DNS-RNS hibridet RN-áz H-val (BRL) emésztettük, és a második szálat DNS-polimeráz I (New England Biolabs) segítségével szintetizáltuk. A terméket EcoRI metilázzal (New England Biolabs) metileztük, a tompa végeket EcoRI linkerekhez (New England Biolabs) ligáltuk, EcoRI-gyel emésztettük, és egy alacsony olvadáspontú agarózban végeztük a nagyság szerinti szelekciót. Az 500 bp-nál nagyobb cDNS-eket előzőleg EcoRI-gyel emésztett és defoszforilált XgtlO-be (Stratagene) ligáltuk. A ligálás termékét ezután pakoltuk (Stratagene gold).

A köldökvéna endoteliális sejteket és a HL-60 cDNS-gyűjteményt ezután lemezre vittük (20 000 pfu/150 mm-es lemez). A rekombináns DNS-t nitrocellulóz szűrőkre vittük át - duplikátumban -, amelyeket 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl-oldatban denaturáltunk, 1 M írisz (pH = 7,5)/1,5 M NaCl-oldatban neutralizáltunk és 80 °C-on hevítettünk 2 órán át [W. D. Benton és munkatársai, Science, 196, 180-182 (1977)]. A szűrőket előhibridizáltuk és 5xDenhardtoldatot, 50 mM NaPO₄-et és 1 pg/ml lazacspermát tartalmazó 5 χ SSC pufferben hibridizáltuk. Az előhibridizálás 45 °C-on 1 órán át tartott. A hibridizálást 32 bp

HU 218 904 Β (5 ’ - TTGGGCTGGTC AC AGG AGGTGG AGC AGGT GAC) vagy a 47 bp (5’-GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTCA) antiszensz oligonukleotidokkal végeztük, amelyek a fent tárgyaltak szerint a J, illetve AA ICÁM-1 tripszines peptidekre (VI. és VII. táblázat) voltak alapozva [R. Lathe, J. Molec. Bioi., 183, 1-12 (1985)]. Az oligonukleotidokat gamma-³²-(P)ATP-vei végjeleztük T4 polinukleotidkinázt használva, a gyártó (New England Biolabs) által ajánlott körülmények mellett. Az egy éjszakán át tartó hibridizálást követően a szűrőket kétszer mostuk 2xSSC/0,l% SDS-oldattal 30 percig 45 °C-on. A hibridizációt mutató plakkokból izoláltuk a fágokat, melyeket ismételt lemezre öntéssel és újbóli szűréssel tisztítottunk.

Az ICAM-1 gén klónozása anti-ICAM-1 antitest alkalmazásával

Az ICAM-1 gént - másképpen - anti-ICAM-1 antitest alkalmazásával is klónozhatjuk. Egy sejtből, amely ICAM-1 kifejezésére képes, DNS-t vagy előnyösebben cDNS-t vonunk ki és tisztítjuk. A tisztított cDNS-t fragmentáljuk (hasítással, endonukleázzal való emésztéssel stb.), hogy DNS vagy cDNS poolt kapjunk. A poolból a DNS- vagy cDNS-fragmentumokat ezután beklónozzuk egy expressziós vektorba, hogy így olyan expressziós vektorokból álló genomiális gyűjteményt kapjunk, amelynek minden tagja egyetlen klónozott DNS-t vagy cDNS-fragmentumot tartalmaz.

17. példa

A cDNS-klónok analízise

A pozitív kiónokból származó fág DNS-t EcoRIgyel emésztettük és Southem-analízissel vizsgáltuk úgy, hogy az egyik klón cDNS-ét szondaként használtuk. Azokat a legnagyobb méretű cDNS-inszertumokat, amelyek kereszthibridizáltak, szubklónoztuk a pGEM 4Z (Promega) plazmidvektor EcoRI helyére. A HL-60 szubklónokat, amelyek mindkét orientációban tartalmazták a cDNS-t, exonukleáz ΙΠ-mal való emésztéssel deletáltuk [S. Heinkoff, Gene, 28,351-359 (1984)] a gyártó ajánlásai szerint (Erase-a-Base, Promega). A progresszíven deletált cDNS-eket ezután klónoztuk és didezoxilánc-terminációs módszerrel [F. Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] szekvenáltuk az előállítók ajánlásai szerint (Sequenase,

U. S. Biochemical). A HL-60 cDNS 5’ és kódolószakaszainak mindkét szálát végigszekvenáltuk, és a 3'-szakasz mindkét szálát körülbelül 70%-ban szekvenáltuk. Egy reprezentatív endoteliális cDNS-t majdnem teljes hosszában szekvenáltunk a 4 bp-felismerő restrikciós enzimes fragmentumok shotgun klónozásával.

Egy HL-60 és egy endoteliális sejt cDNS-ének megállapítottuk a cDNS-szekvenciáját (8. ábra). A 3023 bp szekvencia egy rövid 5’ nem transzlatált szakaszt és egy 1,3 kb 3’ nem transzlatált szakaszt tartalmaz és egy általánosan elfogadott poliadenilációs szignált a 2966. pozícióban. A leghosszabb nyitott leolvasási keret az első ATG-vel kezdődik az 58. pozícióban és egy TGA terminátor triplettel végződik az 1653. pozícióban. A transzlatált aminosavszekvencia és a 8 különböző tripszines pepiidből meghatározott összesen 91 aminosav (a VIII. táblázatban aláhúzva) között fennálló azonosság megerősítette, hogy autentikus ICAM-1 cDNS-klónokat izoláltunk. Az ICAM-1 tripszines peptidek aminosavszekvenciáit a VIII. táblázat mutatja be.

Vili. táblázat

Az ICÁM-1 tripszines peptidek aminosavszekvenciája

Peptid	Csoportok	Szekvencia
J	14-29	XGSVLVTCSTSCDQPK
U	30-39	L L GIE T P L (PK) (K)
50	78-85	(T)FLTVYXT
X	89 95	VÉLAPLP
AA	161-182	XELDLRPQGLE- - LFEXTSAPXQL
K	232-246	LNPTVTYGXDSFSAK
45	282-295	S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L)

— Azt jelenti, hogy a szekvencia a következő sorban folytatódik. Az aláhúzott szekvenciákat használtuk az oligonuklcotidszondák előállításához.

A hidrofobicitás analízise [J. Kyte és munkatársai, J. Molec. Bioi., 157, 105-132 (1982)] alapján egy 27 csoportból álló szignálszekvencia jelenlétére lehet következtetni. A +1 glutamin jelzése egybevág azzal, hogy képtelenek voltunk 3 különböző ICÁM-1 proteinkészítménynél N-terminális szekvenciát kapni; a glutamin piroglutaminsavvá ciklizálódhat, s ez blokkolt Nterminálist eredményezhet. A transzlatált szekvencia 1től 453-ig túlnyomóan hidrofil, ezt követi egy 24 csoportból álló hidrofób, feltehetően transzmembrán dómén. A transzmembrán domént közvetlenül követi számos töltéssel ellátott csoport, amelyek egy 27 csoportból álló, feltehetően citoplazmatikus doménen belül helyezkednek el.

Az érett polipeptidlánc várható mérete 55 219 D, s ez kitűnően egyezik a megfigyelt mérettel, ami a deglükozilált ICÁM- 1-re nézve 55 000 [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. Nyolc Nglükozilációs hely várható. A tripszines szekvenciákban ezek közül két helyen hiányzik az aszparagin, ami bizonyítja ezek glükoziláltságát és extracelluláris orientációjukat. Feltételezve 2500 D-t egy magas mannóztartalmú N-szénhidrátra számítva, 75 000 D várható az ICAM-1 prekurzorra, összehasonlítva a megfigyelt hat 73 000 D-ossal [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. A magas mannóztartalomnak komplex szénhidráttá való konverziója után az érett ICAM-1 glükoprotein 76-114 kD között van, a sejttípustól függően [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)]. Tehát az ICAM-1 egy erősen glükozilált, egyébként pedig egy tipikus membránintegrált protein.

HU 218 904 Β

18. példa

Az ICÁM-1 az immunglobulin szupergén család egy integrinkötő tagja

Elvégeztük az ICAM-1 belső ismétlődő szekvenciáinak az összehasonlító vizsgálatát a Microgenie protein összehasonlító program [C. Queen és munkatársai, Nucl. Acid. Rés., 12,581-599 (1984)] alkalmazásával, majd ennek kiértékelése következett. Az ICAM-l-et a következő proteinekhez hasonlítottuk: IgM, N-CAM és MAG. (N-CAM = idegsejt adhéziós molekula; MAG=mieIín asszociált glükoprotein.) A vizsgálat kiviteléhez a Microgenie és ALIGN programot használtuk [M. 0. Dayhoff és munkatársai, Meth. Enzymol., 91, 524-545 (1983)]. Négy proteinszekvencia adatbázist - ezeket a National Biomedical Research Foundation (NBRF) tartja fenn - vizsgáltunk át hasonló proteinszekvenciák után kutatva a Williams és Pearsonféle FASTP program segítségével [D. J. Lipman és munkatársai, Science, 227,1435-1439 (1985)].

Minthogy az ICAM-1 egy integrál ligandum, nem vártuk, hogy az immunglobulin szupergén család egy tagja lenne. Azonban az ICAM-1-szekvencia kiértékelése azt mutatta, hogy az kielégít minden olyan kritériumot, amelyeket az immunglobulin szupergén család tagsága megkövetel. Ezeket a kritériumokat az alábbiakban tárgyaljuk meg.

Az ICAM-1 teljes extracelluláris doménje 5 homológ immunglobulinszerű doménből van felépítve, amelyeket a 9A. ábra aláhúzva mutat be. Az 1 —4. domének 88, 97, 99, illetve 99 csoport hosszúságúak, és ezek típusosán lg dómén méretek; az 5. dómén 68 csoportra csonkul. Az NBRF adatbázis átvizsgálása során - a FASTP programot használva - szignifikáns homológiákat találtunk az immunglobulin szupergén család tagjaival, így a következőkkel: IgM, IgG C dómén, T-sejt receptor α-alegység variábilis dómén és a-1 β-glükoprotein (9B-D. ábra).

Felhasználva a fenti információt, összehasonlítottuk az ICAM-1 aminosavszekvenciáját az immunglobulin szupergén család más tagjainak az aminosavszekvenciájával.

Három típusú lg szupercsalád domént különböztetünk meg, úgymint V, Cl és C2. Mind a V, mind a C domének 2 β-lemezből vannak felépítve, amelyek intradomén diszulfid hidakkal kapcsolódnak egymáshoz; a V domének 9, míg a C domének 7 antiparalel β-szálat tartalmaznak. A konstans domének két készletre, a Cl és C2 készletre vannak felosztva a 9A. ábrán bemutatott jellemző csoportok alapján. A Cl készlethez olyan proteinek tartoznak, amelyek részt vesznek az antigén felismerésében. A C2 készlethez számos Fc receptor és protein tartozik - ezek vesznek részt az adhézióban (call adhesion) -, valamint a CD2, LFA-3, MAG és N-CAM. Azt találtuk, hogy az ICAM-1 domének a C2 készlet doménjeivel mutatják a legerősebb homológiát, s így az ICAM-1 ehhez a készlethez tartozik, amit az a tény is tükröz, hogy a C2-ben lévő állandó csoportokhoz nagyobb a hasonlósága, mint a Cl-ben lévőkhöz, mint ahogy ez a 9. ábrán a B-F β-szálak esetében látható. Továbbá az ICAM-1 domének sokkal jobban igazodnak a C2 domének A és G β-szálaihoz, mint a V és Cl domének ezen szálaihoz, s így sokkal inkább sorolható a teljes C2 dómén állománya mellé. Az N-CAM, MAG és α-Ι-β-glükoprotein C2 doménjével való összehasonlítást a 9B. és 9C. ábra mutatja; az azonosság 28-33%-os. Egy T-sejt receptorral való összehasonlítása Va 27%-os identitását és az IgM C dómén-3 34%-os identitást mutat (9B. és 9D. ábra).

Az immunglobulin domének legfontosabb jellemzői közé tartoznak a diszulfidkötésű ciszteinek, amelyek hidat képeznek a B és F szálak között, s ezek stabilizálják a β-lemez szendvicset; az ICÁM-1-ben a ciszteinek minden esetben állandóak, kivéve a domén-4 f szálában, ahol egy leucin található, amely befordulhat a szendvicsbe, és stabilizálhatja a kontaktust, mint ahogy ez néhány dómén V és C2 készleténél tapasztalható. A ciszteinek közti távolság (43, 50, 52 és 37 csoport) olyan, mint ami a C2 készletre jellemző.

Az ICÁM-1-ben a láncok közti diszulfidkötések jelenlétének tesztelése érdekében ICAM-1 endoteliális sejteken SDS-PAGE vizsgálatot végeztünk redukáló és nem redukáló körülmények mellett. Azért használtunk endoteliális sejt eredetű ICAM-l-et, mivel ez kisebb glükozilációs heterogenitást mutat, mint a JY vagy a lép hajas sejt eredetű ICAM-1, és így nagyobb érzékenységgel kaphatjuk meg az M_r-ben való eltolódásokat. Ebből a célból 16 órán át LPS-sel (5 pg/ml) stimulált köldökvéna endoteliális sejttenyészetből tisztítottunk ICAM-l-et immunaffinitás kromatográfiával, mint fent leírtuk. Az acetonnal kicsapott ICAM-l-et 0,25% 2 merkapto-etanolt vagy 25 mM jód-acetamidot tartalmazó mintapufferben [U. K. Laemmli, Natúré, 227, 680-685 (1970)] reszuszpendáltuk és 5 percig 100 °C-on tartottuk. A mintáknál SDS-PAGE-t és ezüstfestést alkalmaztunk. Az endoteliális sejt ICAM-1 molekulatömege (M_r) 100 kD redukáló körülmények között és 96 kD nem redukáló körülmények között, ami igen meggyőzően bizonyítja a láncközi diszulfidkötések jelenlétét a natív ICÁM-1-ben.

A primer szekvencia használata a másodlagos szerkezet előrejelzésére [P. Y. Chou és munkatársai, Biochem., J., 13, 211-245 (1974)] 7 várható β-szálat

- a-g-vel jelölve a 9A. ábrán felül - jelzett minden ICÁM-1 doménben, ami pontosan beváltja egy immunglobulin doménnel szembeni várakozást, és megfelel az immunglobulinokban lévő A-H-szálak helyzetének (9A. ábra, alul). A dómén 5-ben nincs A- és C-szál, de minthogy ezek képezik a lemezek peremét, a lemezek még mindig kialakulhatnak - talán a D-szállal, amely elfoglalja a C-szál helyét -, mint ahogy ez bizonyos más C2 doméneknél előfordul; és a jellemző diszulfidkötés a B- és F-szál között bántatlan marad. Tehát az a körülmény, hogy az ICAM-1 dómén méretre, szekvenciahomológiára, az állandó ciszteincsoportokra

- amelyek a feltételezett intradomén diszulfidkötéseket alkotják -, diszulfidkötések jelenlétére és az előrelátható β-lemez szerkezetre vonatkozó kritériumoknak megfelel, alátámasztja, hogy az ICAM-1 az immunglobulin szupergén családhoz tartozik.

HU 218 904 Β

Megállapítottuk, hogy az ICAM-1 a C2 készlet N-CAM és MAG glükoproteinjeivel mutatja a legerősebb homológiát. Ez különlegesen azért lényeges, mivel mind az N-CAM, mind a MAG sejt-sejt adhéziót közvetít. Az N-CAM-nak a neuron-neuron és neuromuszkuláris kölcsönhatásoknál van fontossága [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987)], míg a MAG-nak a neuron-oligodendrocita és oligodendrocita-oligodendrocita kölcsönhatásokban van fontossága a mielinhüvely kialakulása folyamán [M. Poltorak és munkatársai, J. Cell. Bioi., 105, 1893-1899 (1987)]. Az N-CAM és MAG kifejeződése a sejt felületén a fejlődéssel kapcsolatos szabályozás alatt áll az idegrendszer kialakulása, illetve a mielinhüvely kialakulása folyamán ugyanúgy, mint az ICAM-1 szabályozott indukciója gyulladás esetén [T. A. Springer és munkatársai, Ann. Rév. Immunok, 5, 223-252 (1987)]. Az ICAM-1, az N-CAM [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987)] és MAG [J. L. Salzer és munkatársai, J. Cell. Biok, 104, 957-965 (1987)] teljes szerkezetükben hasonlóak és homológok, minthogy mindegyik membránhoz tartozó glükoprotein, amelyek 5 olyan C2 doménből vannak felépítve, amelyek az N-terminális extracelluláris szakaszt alkotják, bár az NCAM további nem Ig-szerű szekvenciát is tartalmaz az utolsó C2 dómén és a transzmembrán dómén között. Az ICAM-1 teljes hosszában - a transzmembrán és citoplazmatikus doménekkel együtt a MAG mellé illeszthető 21%-os identitással; ugyanezt a százalékos identitást találjuk, ha az ICAM-1 és NCAM-1 5 doménjét összehasonlítjuk. Az ICAM-1 és MAG szekunder szerkezetének diagramos összehasonlítását a 10. ábra mutatja be. A domén-domén összehasonlítások szerint az ICÁM-1 és az NCAM molekulákon belüli domének közti homológia szintje (x±s.d. 21=1=2,8%, illetve 18,6±3,8%) ugyanolyan, mint az ICÁM-1 doméneknek az NCAM és MAG doménekkel való összehasonlításából látható homológiaszint (20,4±3,7, illetve 21,9±2,7). Jóllehet bizonyíték van az NCAM C-terminális szakaszaiban alternatív splicing jelenlétére [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987); D. Barthels és munkatársai, EMBO J., 6, 907-914 (1987)], ugyanígy a MAG-ban [C. Lai és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 4377-4341 (1987)] is, ugyanakkor erre nézve nem találtunk bizonyítékot az endoteliális vagy HL-60 eredetű ICAM-1 kiónok szekvenálásakor, sem a különböző sejttípusok ICAM-1 proteingerincének és prekurzorainak tanulmányozása folyamán [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137, 245-254 (1986)].

A limfociták és számos különböző sejttípus kölcsönhatásaiban az ICAM-1 mint az LFA-1 liganduma működik. Szintetikus membrán kettős rétegeken a limfociták a beépült ICÁM-1-hez kötődnek, s a limfocitán ehhez LFA-l-re van szükség, s ez közvetlenül demonstrálja az LFA-1 kölcsönhatását az ICAM-l-gyel [S. D. Mariin és munkatársai, Cell, 51, 813-819 (1987)]. Az LFA-1 egy leukocita integrin és nincsenek immunglobulinszerű jellemvonásai. A leukocita integrinek egy alcsaládot alkotnak. A másik két alcsalád sejtmátrix kölcsönhatásokat közvetít, és felismeri az RGD-szekvenciát ligandumain belül, amelyekhez a fibronektin, vitronektin, kollagén és a fibrinogén tartozik [R. O. Hynes, Cell, 48, 549-554 (1987); E. Ruoslahti és munkatársai, Science, 238, 491-497 (1987)]. A leukocita integrinek csak leukocitákon fejeződnek ki, sejt-sejt kölcsönhatásokban vesznek részt, és egyedül a következő ligandumaik ismertek: ICAM-1 és a C3 komplement komponenst egy fragmentuma, az iC3b, amely nem mutat immunglobulinszerű jellemvonásokat, és a Mac-1 ismeri fel [T. K. Kishimoto és munkatársai, Leukocyte Typing III, M. McMichael (szerkesztő), Springer Verlag, New York (1987); T. A. Springer és munkatársai, Ann. Rév. Immunok, 5, 223-252 (1987); D. C. Anderson és munkatársai, Ann. Rév. Med., 38, 175-194 (1987)]. A IX. táblázat mutatja be az ICAM-1 szekvencián belüli azon peptideket - szekvenciaanalízisre alapozva -, amelyeket az LFA-1 felismer.

IX. táblázat

Az ICAM-1 szekvencián belüli peptidek, amelyeket az LFA-1 valószínűleg felismer

Az ICAM-1 az immunglobulin szupergén család első olyan tagja, amely egy integrinhez kötődik. Bár mindkét család fontos szerepet játszik a sejtadhézióban, a köztük lévő kölcsönhatást eddig nem tartották valószínűnek. Ezzel szemben az immunglobulin gén szupercsaládon belüli kölcsönhatások általánosan ismertek. Lehetséges, hogy az integrin és az immunglobulin család között további kölcsönhatásokat fognak felfedezni. Az LFA-1 felismer egy olyan ligandumot, mely eltér az ICÁM-1-től [T. A. Springer és munkatársai, Ann. Rév. Immunok, 5, 223-252 (1987)] és a leukocita integrin Mac-1 felismer egy C3bi-től különböző ligandumot a neutrofil-neutrofil adhézió során [D. C. Anderson és munkatársai, Ann. Rév. Med., 38, 175-194 (1987)]. Ezenkívül a tisztított MAG-ot tartalmazó vezikulumok kötődnek a nemitekhez, amelyek MAG-ok, így a MAG képes kell legyen egy eltérő receptorral való heterofil kölcsönhatásra [M. Poltorak és munkatársai, J. Cell. Biok, 105, 1893-1899 (1987)].

Az NCAM-nak a neurális-neurális és neurálismuszkuláris sejtkölcsönhatásokban játszott szerepéről feltételezhető, hogy ez a homofil NCAM-NCAM köl27

HU 218 904 Β csönhatásának tudható be [B. A. Cunningham és munkatársai, Science, 236, 799-806 (1987)]. A MAG-nak fontos szerepe van az axonokat körülvevő Schwannsejtek szomszédos hurkainak a kölcsönhatásaiban a mielinhüvely kialakulásakor, ami vagy egy külön receptorral való kölcsönhatásnak, vagy a homofil MAGMAG kölcsönhatásnak tulajdonítható. A NCAM-mal való homológia és a gyakori domén-domén kölcsönhatások fellépése az immunglobulin szupergén családon belül felveti annak lehetőségét, hogy az ICAM-1 részt vehet a homofil kölcsönhatásokban, valamint az ICAM-l-LFA-1 heterofil kölcsönhatásokban. Azonban a B-limfoblasztoid sejteknek - ezek egyszerre hasonló sűrűségben fejezik ki mind az LFA-l-et, mind az ICAM-l-et - a kötődése mesterséges vagy sejtes monorétegekben lévő ICÁM-1-hez teljesen gátolható, ha a B-limfoblasztokat LFA-1 monoklonális antitesttel (MAt) előkezeljük, míg nem befolyásolja az adherenciát, ha a B-limfoblasztokat ICAM-1 MAt-tel előkezeljük. Ha az egysejtréteget ICAM-1 MAt-tel előkezeljük, a kötődés teljesen megszűnik [M. L. Dustin és munkatársai, J. Immunoi., 137,245-254 (1986); S. D. Mariin és munkatársai, Cell, 51, 813-819 (1987)]. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy ha egyáltalán fellépnek homofil kölcsönhatások, ezeknek sokkal gyengébbeknek kell lenniük, mint az LFA-1-gyel való heterofil kölcsönhatás.

Az a lehetőség, hogy a leukocita integrinek a ligandumokat alapvetően eltérő módon ismerik fel, megfelel egy 180 csoportból álló szekvencia jelenlétének az aalegységekben, amelyek fontosak lehetnek a ligandumkötődésben, és ezek nincsenek meg az RGD felismerőintegrinekben [A. Corbi és munkatársai, EMBO J., 6, 4023-4028 (1987)]. Bár a Mac-l-ről úgy tudjuk, hogy felismeri az iC3b-ben az RGD-szekvenciát, az ICÁM-1-ben azonban nincs RGD-szekvencia (8. ábra). Ez összhangban van azzal, hogy a GRGDSP fibronektinpeptid és a kontroll-GRGESP-peptid nem képes az ICÁM- 1-LFA-1 adhéziót gátolni [S. D. Mariin és munkatársai, Cell, 51, 813-819 (1987)]. Habár rokon szekvenciák, mint a PRGGS és az RGEKE, jelen vannak az ICAM-1 azon szakaszaiban, amelyekről feltételezhető, hogy hurkot alkotnak a dómén 2 a és b, illetve a dómén

2. c és d β-szálai között (9. ábra), és ez teszi lehetővé felismerésüket. Lényeges, hogy a homológ MAG-molekula egy RGD-szekvenciát tartalmaz a dómén 1 és 2 között [M. Poltorak és munkatársai, J. Cell. Bioi., 105, 1893-1899 (1987); J. L. Salzer és munkatársai, J. Cell. Bioi., 104, 957-965 (1987)].

19. példa

Southern- és Northern-blotok

A Southem-blot-technikát 5 pg genomiális DNS felhasználásával végeztük. A DNS-eket három sejtvonalból vontuk ki: BL2, egy Burkitt-lymphoma sejtvonal (dr. Gilbert Lenoir adománya), JY és Er-LCL [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85, 227-231 (1988)], egy EBVtranszformált B-limfoblasztoid sejtvonal.

A DNS-eket BamHI és EcoRI endonukleázokkal emésztettük az előállítók által javasolt mennyiség ötszörösével (New England Biolabs), majd 0,8%-os agarózgélben végzett elektroforézis után a DNS-eket nejlonmembránra (Zeta Probe, BioRad) vittük át. A szűrőt standard eljárásokkal prehibridizáltuk és hibridizáltuk, a-(³²P)dXTP-kkel (Boehringer Mannheim) véletlenszerűen jelzett (random priming) HL-60 eredetű ICÁM cDNS-t használva. A Northem-blot-technikához 20 pg össz-RNS-t vagy 6 pg poli(A)⁺ RNS-t használtunk. Az RNS-t denaturáltuk és 1%-os agaróz-formaldehid-gélben elektroforetizáltuk, majd átvittük Zeta Probe lemezekre. A szűrőlemezeket az előbb leírt módon prehibridizáltuk és hibridizáltuk [D. E. Staunton és munkatársai, EMBO J„ 6, 3695-3701 (1987)] a 32p. vei jelzett oligonukleotidpróbák (lásd fentebb) HL-60 eredetű cDNS-szondáját használva.

A 3 kb cDNS-szondával és a BamHI-gyel és EcoRIgyel emésztett genomiális DNS-sel kapott Southemblotok 20, illetve 8 kb nagyságú fő fragmentumokat mutattak, ami egyetlen génre utal, és hogy a legtöbb kódoló információt a 8 kb tartalmazza. A három különböző sejtvonal blotjában nem volt bizonyíték a restrikciós fragmentumok polimorfizmusára.

20. példa

Az ICAM-1 gén kifejeződése

Az „expressziós vektor” egy olyan vektor, amely (megfelelő transzkripciós és/vagy transzlációs szabályozószekvenciák jelenlétének a következtében) egy vektorba beklónozott DNS- (vagy cDNS) molekulát képes kifejezni, és ezáltal egy polipeptid vagy protein termelésére képes. A klónozott szekvenciák akkor fejeződnek ki, ha az expressziós vektort egy megfelelő gazdasejtbe vezettük be. Ha prokarióta expressziós vektort használunk, a megfelelő gazdasejt bármilyen olyan prokarióta sejt lehet, amely képes kifejezni a klónozott szekvenciát. Hasonlóképpen, ha eukarióta expressziós vektort használunk, a megfelelő gazdasejt bármilyen eukarióta sejt lehet, amely képes a klónozott szekvencia kifejezésére. Fontos megemlíteni, hogy mivel az eukarióta DNS köztes szekvenciákat tartalmazhat, és mivel az ilyen szekvenciákat a prokarióta sejtek nem tudják korrekt módon feldolgozni, előnyösebb, ha ICAM-l-et kifejező sejtből származó cDNS-t használunk egy prokarióta genomiális expressziós vektorgyűjtemény előállítása céljából. A cDNS-izolálás módszereit és egy genomiális gyűjtemény előállítási eljárásait T. Maniatis és munkatársai írták le [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1982)].

A fent leírt expressziós vektor genomiális gyűjteményt gazdasejtbank létesítésére használjuk fel (minden gazdasejt a gyűjtemény egy tagját tartalmazza). Az expressziós vektort a gazdasejtbe bármilyen ismert módon bevihetjük, például transzformációval, transzfekcióval, protoplasztfiizióval, elektroporációval stb. Az expressziós vektorokat tartalmazó sejtbankot klónozás révén szaporítjuk, és tagjait egyenként vizsgáljuk (immunassay-ket használva) annak meghatározására, hogy képesek-e olyan proteint termelni, amely kötődik az anti-ICAM-1 antitesthez.

HU 218 904 Β

Az anti-ICAM-1 antitesthez kötődő proteineket termelő sejtek expressziós vektorait továbbá vizsgáljuk annak megállapítására, hogy a teljes ICAM-1 gént fejezik-e ki (azaz tartalmazzák-e), vagy csak az ICAM-1 gén egy fragmentumát fejezik ki (tehát ezt tartalmazzák), vagy egy olyan gént fejeznek ki (azaz tartalmaznak), amelynek a terméke, bár immunológiailag rokon az ICAM-1-gyei, de mégsem maga az ICAM-1. Bár ezt a vizsgálatot bármilyen alkalmas módszerrel el lehet végezni, előnyös meghatározni az expressziós vektorba klónozott DNS- vagy cDNS-fragmentum nukleotidszekvenciáját. Ezeket a nukleotidszekvenciákat azután megvizsgáljuk annak megállapítására, hogy tudnak-e kódolni olyan polipeptideket, amelyeknek az aminosavszekvenciája az ICÁM-1 tripszines emésztésével nyert fragmentumai aminosavszekvenciájával azonosak (V. táblázat).

Egy expressziós vektort, amely egy ICAM-1 gént meghatározó DNS- vagy cDNS-molekulát tartalmaz, a következők alapján lehet felismerni: (1) tudja-e irányítani egy olyan protein kifejeződését, amely az antiICAM-1 antitesthez képes kötődni; és (2) jelen van-e egy olyan nukleotidszekvencia, amely az ICAM-1 bármelyik tripszines fragmentumának a kódolására képes. Egy ilyen expressziós vektorba klónozott DNS-molekula eltávolítható az expressziós vektorból, és tiszta formában előállítható.

21. példa

A tisztított ICÁM-1 funkcionális aktivitása

A sejtekben az ICAM-1 normálisan a sejtmembránhoz kötött felületi proteinként funkcionál. Tehát megvizsgáltuk a tisztított ICAM-1 hatását mesterséges lipidmembránokba (liposzómákba vagy vezikulumokba) való beépítésük után oly módon, hogy a proteint detergenssel szolubilizált lipidekben feloldottuk, majd a detergenst dialízissel eltávolítottuk. JY sejtekből tisztított és oktil-glükozid detergensben a fent leírt módon oldott ICAM-l-et vezikulumokba vittük be, és az ICAM-l-et tartalmazó vezikulumokat üveg fedőlemezekhez vagy műanyag tenyésztőtartályokhoz fuzionáltuk abból a célból, hogy lehetővé váljék a sejtek proteinhez való kötődésének a detektálása.

Planáris membránok és műanyaghoz kötött vezikulumok előállítása

A vezikulumokat Gay és munkatársai [J. Immunoi., 136, 2026 (1986)] módszerével állítottuk elő. Röviden: tojás foszfatidil-kolint és koleszterint oldottunk kloroformban, és ezeket 7:2 mól arányban kevertük össze. Ezután a lipidkeveréket nitrogéngázban, forgatás közben, vékony filmréteggé szárítottuk, majd a kloroform nyomainak az eltávolítása érdekében 1 órán át liofilizáltuk. Ezután a lipidfilmet 1%-os oktil-glükozid/0,14 M NaCl/20 mM trisz (pH=7,2) oldatban oldottuk fel úgy, hogy a foszfatidil-kolin végkoncentrációja 0,1 mM legyen. A tisztított ICÁM-1-ből vagy a humán glükoforinból (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mint kontroll-membránglükoproteinből mintegy 10 pg-ot adtunk az oldott lipid minden ml-éhez. A protein-lipiddetergens-oldatot ezután 4 °C-on dializáltuk 200 térfogatnyi 20 mM trisz/0,14 M NaCl (pH = 7,2) oldat háromszori váltásával és HBSS-oldat egyszeri váltásával.

A planáris membránokat Brian és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6159 (1984)] módszerével állítottuk elő. Üveg fedőlemezeket (átmérő 11 mm) 15 percig forraltunk a 7X detergens (Linbro) 1:6 hígítású oldatában, egy éjszakán át mostuk desztillált vízzel, 70%-os etanolban áztattuk, és levegőn szárítottuk. Az ICAM-l-et vagy a glükoforint tartalmazó vezikulumszuszpenzió 80 pl-es csöppjeit a tartályok aljára cseppentettük egy 24 tartályos lemezen, majd az előkészített tárgylemezeket finoman ráúsztattuk. A lemezeket 20-30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd a tartályokat HBSS-oldattal töltöttük fel, és a fedőlemezeket megfordítottuk, hogy a planáris membránokat szembefordítsuk. Ezután a tartályokat intenzíven mostuk HBSS-sel, hogy a kötetlen vezikulumokat eltávolítsuk. A planáris membránfelület soha nem volt levegőnek kitéve.

Az üveg felületéhez fuzionált planáris membránokkal végzett kísérletek során az ICAM-l-et tartalmazó vezikulumokról megállapítottuk, hogy azok a soktartályos szövettenyésztő lemezeken közvetlenül a műanyag felülethez kötődnek, és megtartják funkcionális aktivitásukat, amelyet a sejtekhez való specifikus kötődés bizonyít. A továbbiakban ezeket a vezikulumokat „műanyaghoz kötött vezikulumok”-nak („plasticbound vesicles”, PBV) nevezzük, minthogy a műanyaghoz kötött lipidvezikulumok természetét vizsgáltuk. A műanyaghoz kötött vezikulumokat úgy állítottuk elő, hogy 30 pl vezikulumszuszpenziót mértünk be a 96 tartályos szövettenyésztő tálca (Falcon) tartályainak az aljába, és a tálcákat a planáris membránoknál leírt módon inkubáltuk és mostuk.

Sejtadhéziós vizsgálatok

A sejtadhéziós vizsgálatokat mind a planáris membránokkal, mind a műanyaghoz kötött vezikulumokkal lényegében azonos módon végeztük, kivéve, hogy a planáris membránoknál használt sejtszámot és térfogatot a PBV esetében egyötödére csökkentettük.

Normál kontroliegyénekből és LAD (Leukocyte Adhesion Defíciency) betegekből, akiknek a sejtjei LFA-l-et nem tudnak kifejezni [D. C. Anderson és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 668 (1985)] származó T-limfocitákat készítettünk elő oly módon, hogy a perifériás vér mononukleáris sejtjeit 1 pg/ml Concanavalin A (ConA)-val tenyésztettük 3 napon át 20% fetális borjúszérumot tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban, 5 · 10⁵ sejt/ml mellett. A sejteket ezután kétszer mostuk RPMI-vel és egyszer 5 mmólos metil-a-D-mannopiranoziddal, hogy eltávolítsuk a visszamaradó lektint a sejtek felszínéről. A sejteket RPMI/20% FCS tápoldatban tenyésztettük, amely 1 ng/ml rekombináns IL-2-t tartalmazott, és a sejteket a tenyésztés megkezdése után a 10-22. nap között használtuk fel.

Abból a célból, hogy a ConA-blasztoknak, a T-lymphoma SK.W-3 sejteknek és a JY (LFA-1 pozitív) EBV-transzformált B-limfoblasztoid sejtvonalnak, valamint az LFA-l-defíciens limfoblasztoid sejtvonalnak (BBN) [az 1-es betegből származik; T. A. Springer

HU 218 904 Β és munkatársai, J. Exper. Med., 160, 1901-1918 (1986)] a planáris membránokhoz vagy a PBV-hez való kötődését észlelhessük, az említett sejteket radioaktív izotóppal jeleztük úgy, hogy 1 · 10⁷ sejtet 1 ml RPMI 1640/10% FCS tápoldatban 100 pCi Na⁵iCrO4gyel indukáltunk 1 órán át 37 °C-on, majd négyszer mostuk RPMI 1640-nel a be nem épült jelzés eltávolítása céljából. Monoklonális antitestblokkoló vizsgálatokban a sejteket vagy a műanyaghoz kötött vezikulumokat RPMI 1640/10% FCS-ben oldott 20 pg/ml tisztított antitesttel előkezeltük, 4 °C-on 30 percig inkubáltuk, majd négyszer mostuk a kötetlen antitestek eltávolítása céljából. A kétértékű kationoknak a sejtek kötődésére kifejtett hatásvizsgálata során a sejteket egyszer mostuk Ca²⁺-, Mg²⁺-mentes, 10% dializált FCS-tartalmú HBSS-oldattal, majd az oldathoz CaCl2-t és MgCl₂-t adtunk a megadott koncentrációkban. Minden kísérletben a sejteket és a planáris membránokat vagy PBV-t előzőleg kiegyensúlyoztuk a megfelelő hőmérsékleten (4 °C, 22 °C vagy 37 °C) a megfelelő vizsgálati pufferben.

Hogy megmérjük a sejtek kötődését a tisztított ICÁM-1-hez, az ⁵¹Cr-jelzett sejteket (5 10⁵ EBVtranszformált sejt a planáris membrán vizsgálatokban; 1 -10⁵ EBV-transzformált sejt vagy SKW-3 sejt; 2· 10⁵ ConA blaszt sejt a PBV vizsgálatokban) a planáris membránokra vagy PBV-re centrifugáltuk 2 percig 25 mg mellett, majd inkubálás után a nem kötődött sejteket úgy távolítottuk el, hogy a tartályokat nyolc ciklusban a megfelelő hőmérsékletű pufferrel feltöltöttük és leszívattuk. A megkötött sejtek mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a tartályok tartalmát 0,1 M NaOH/1% Triton X-100 oldattal szolubilizáltuk és gamma-számlálóval mértük. A sejtkötődés százalékát úgy állapítottuk meg, hogy a kötött sejtek cpm-értékét elosztottuk a bevitt sejtek cpm-értékével. A planáris membrán vizsgálatokban a bevitt cpm-et a tenyésztőtartályok területének és a fedőlemez területének az összehasonlításából adódó arány szerint korrigáltuk.

Ezekben a vizsgálatokban az EBV-transzformált Blimfoblasztoid sejtek, az SKW-3 T-lymphoma sejtek és a ConA T-limfoblasztok specifikusan kötődtek az ICÁM-1-hez mesterséges membránokban (11. és 12. ábra). A kötés specifikus volt, minthogy a sejtek nagyon gyengén kötődtek azokhoz a kontroll planáris membránokhoz vagy vezikulumokhoz, amelyek ekvivalens mennyiségű más humán sejtfelszíni glükoproteint - glükoforint - tartalmaztak. Továbbá az LFA-1 pozitív EBV-transzformált sejtek és a ConA blasztok kötődtek, míg ezek LFA-1 negatív párjai nem kötődtek szignifikáns mértékben, s ez azt mutatja, hogy a kötés attól függött, hogy volt-e a sejtekben LFA-1.

A sejt kötődésének mind a specifitását, mind a celluláris LFA-1-től való függését monoklonális antitestblokkoló kísérletekben bizonyítottuk (13. ábra). A JY sejtek kötődése 97%-ban gátolható, ha az ICAM-1tartalmú PBV-t RR1/1 anti-ICAM-1 monoklonális antitesttel előkezeljük. Ha a sejteket előkezeltük ugyanezen antitesttel, annak csekély hatása volt. Ezzel szemben a TS1/18 anti-LFA-1 monoklonális antitest a kötést 96%-ban gátolta, de csak akkor, ha a sejteket és nem a PBV-t kezeltük előzetesen. A kontroll TS2/9 antitest, amely az LFA-3-mal (mely egy más limfocita felületi antigén) reagál, nem fejtett ki szignifikáns gátló hatást, akár a sejteket, akár a PBV-t előkezeltük vele. Ez a kísérlet megmutatta, hogy maga az ICAM-1 és nem a csekély jelen lévő szennyezés - közvetít a mesterséges membránokon megfigyelt celluláris adhéziót, és hogy az adhézió a kötődő sejten lévő LFA-1-től függ·

A sejteknek a mesterséges membránokon lévő ICÁM-1-hez való kötődése az LFA-l-függő adhéziós rendszer másik két jellegzetességét is bemutatja: a hőmérsékletfüggést és a kétértékű kationigényt. Amint az a 14. ábrán látható, a ConA blasztok a PBV-n legjobban 37 °C-on kötődnek az ICÁM-1-hez - kisebb mértékben 22 °C-on és igen gyengén 4 °C-on. A 15. ábrán az látható, hogy a kötés teljes mértékben a kétértékű kationok jelenlététől függ. Fiziológiás koncentráció esetében a Mg²⁺ egyedül elegendő a maximális sejtkötődéshez, míg a Ca²⁺ egyedül csak kismértékű kötődést tesz lehetővé. Azonban ha a Mg²⁺-ot normál koncentrációja egytizedének megfelelő koncentrációban Ca²⁺-al kombináljuk, a hatás szinergetikus, és maximális kötése jön létre.

Összefoglalva, a mesterséges membránokba beépített tisztított ICÁM-1-hez történő sejtkötődés specificitása, a monoklonális antitestekkel való specifikus gátlás, a hőmérséklet és a kétértékű kationok iránti igény azt mutatja, hogy az ICAM-1 az LFA-l-függő adhéziós rendszer egy specifikus liganduma.

22. példa

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója allergiás és toxikus patch-teszt-reakciókban

Öt normál egyén bőrbiopsziás mintáját tanulmányoztuk annak megállapítására, hogy azok kifejeznek-e ICÁM- 1-et és HLA-DR-t. Azt tapasztaltuk, hogy míg néhány véredény endoteliális sejtjei rendszerint kifejeznek ICAM-l-et, a normál bőr keratinocitáiban nem volt kimutatható ICAM-1-expresszió. Normál bőrbiopsziás minták keratinocitáiban nem volt megfigyelhető a HLA-DR festődése. Az ICAM-1 és a II. osztályú antigének expressziójának a kinetikáját allergiás és toxikus bőrlaesiókból származó biopsziás sejteken tanulmányoztuk, s azt találtuk, hogy a hat vizsgált beteg felénél olyan keratinociták vannak jelen, amelyek ICAM-l-et fejeznek ki 4 órával a haptén alkalmazása után (X. táblázat). Növelve a hapténnel való kezelés időtartamát, növekszik azoknak a betegeknek a százalékos aránya, akiknél a keratinociták ICAM-l-et fejeznek ki, és ugyancsak növekszik a festődés intenzitása, jelezvén, hogy 48 óra múlva keratinocitánként több ICAM-1 fejeződik ki. Tény, hogy ebben az időpontban minden biopsziában a keratinociták pozitívan festődtek ICÁM-1-re. A 72. órában (24 órával a haptén eltávolítása után) a nyolc betegből hétnél még mindig volt ICAM-l-kifejeződés a keratinocitákon, míg egy betegnél csökkent az ICAM-l-expressziója a 48. és 72. óra között.

HU 218 904 Β

X. táblázat

Az ICAM-1 és a HLA-DR indukció kinetikája allergiás patch-teszt biopsziás keratinocitákon

A patch alkalmazása után eltelt idő (óra)	A biopsziák száma	Csak ICAM-1	Csak HLA-DR	ICAM-1 és HLA-DR
Normál bőr	5	0	0	0
Allergiás patch-teszt
4	6	3^a	0	0
8	9	3	0	0
24	8	7	0	0
48^b	8	5	0	3
72	8	6	0	1

^a A mintákat pozitívnak tekintjük, ha a kcratinocitáknak legalább egy kis csoportja megfestődik.

^b Ebben az időpontban minden patchot eltávolítottunk.

A szövettani vizsgálatok szerint a haptén alkalmazása után 4 órával vett biopsziás mintában a keratinociták ICAM-l-festődése kis csomókban jelent meg. A 48. órában a keratinociták nagy részénél az ICAM-1 kifejeződött a sejt felületén, és nem volt látható különbség a laesió középpontja és széle között. A festődés erőssége csökkent, ahogy a keratinociták a stratum comeumhoz közeledtek. Ez volt tapasztalható mind a középpontból, mind a laesió széléről vett biopsziás mintákban. Ugyanebben az időpontban a patch-teszt pozitív volt (infiltráció, erythema és vezikulumok). Nem volt észlelhető különbség az ICAM-l-expressziójában abban az esetben, ha érzékeny egyéneknél különböző hapténeket alkalmaztunk. A laesió helyén a keratinocitákon kívül néhány mononukleáris sejten és endoteliális sejten is kifejeződött az ICAM-1.

Allergiás bőrlaesiókban a keratinocitákon a HLA-DR kifejeződése kevésbé gyakori, mint az ICAM-l-expressziója. A vizsgálat egyének egyikénél sem volt pozitív a HLA-DR-festődés a keratinocitákon 24 órával a haptén alkalmazása után. Tény, hogy csak négy biopsziás mintában volt olyan keratinocita, amely HLA-DR-t fejezett ki, és egyetlen biopsziás mintában sem volt olyan keratinocita, amely HLA-DR-re pozitív lett volna, amikor ICÁM-1-re nem (X. táblázat).

Ellentétben az allergiás patch-teszt-laesióval, a krotonolajjal vagy nátrium-lauril-szulfáttal indukált toxikus patch-teszt-laesio olyan keratinocitákat tartalmaz, amelyeknek a felületén kevés ICAM-1 mutatható ki ha egyáltalában valami kimutatható - minden vizsgált időpontban (XI. táblázat). Tény, hogy 48 órával a patch alkalmazása után - ugyanis allergiás patch-teszt esetében ez volt az optimális időpontja az ICAM-l-expressziónak - 14 patch-tesztes egyén közül csak egynél fejeztek ki a keratinociták ICÁM-1-et a laesió helyén. Az allergiás patch-teszt-biopsziával ellentétben a toxikus patch-teszt-biopsziás mintában lévő keratinocitákon nem volt HLA-DR-kifejeződés.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ICAM-1 az immunológiai eredetű gyulladások helyén fejeződik ki, és nem a toxikus eredetű gyulladásokban, így az ICAM-1-expressziót fel lehet használni az immunológiai eredetű és a toxikus eredetű gyulladások megkülönböztetésére, így például a veseátültetés után a betegnél fellépő akut veseelégtelenségben, ahol nehéz meghatározni, hogy az elégtelenség a kilökődésnek vagy az immunszuppresszív terápiás hatóanyagnak tudható-e be. A vesebiopszia és az ICAM-1-expresszió fokozódásának a kimutatása lehetővé teszi az immunológiai eredetű kilökődés és a nem immunológiai eredetű toxikus reakció megkülönböztetésére.

XI. táblázat

Az ICAM-1 és a HLA-DR indukció kinetikája toxikus patch-teszt-biopsziás mintákból származó keratinocitákon

A patch alkalmazása után eltelt idő (óra)	A biopsziák száma	Csak ICAM-1	Csak HLA-DR	ICAM-1 és HLA DR
4	4	0	0	0
8	3	l^a	0	0
24	3	1	0	0
48^b	14	1	0	0
72	3	1	0	0

^a A mintát pozitívnak tekintjük, ha a keratinociták legalább egy kis csoportja megfestődik.

^b Ebben az időpontban minden patchot eltávolítottunk.

23. példa

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója jóindulatú bőrbetegségekben

Különböző típusú gyulladásos bőrbetegségben szenvedő betegek bőrbiopsziás sejtjeinek az ICAM-1- és HLA-DR-expresszióját tanulmányoztuk. Az allergiás kontakt ekcéma, a pemphigoid/pemphigus és a lichen planus biopsziás minták keratinocitáinak egy része fejezett ki ICÁM-1-et. A lichen planus biopsziás minták mutatták a legerősebb festődést, amelynek a képe hasonló, sőt erősebb volt, mint amilyen az allergiás patchteszt-biopsziás mintákban volt látható 48 óra múlva (XII. táblázat). Az allergiás patch-tesztnél látott eredményekhez hasonlóan a legerősebb ICAM-1-festődés a súlyos mononukleáris sejtinfiltráció helyén volt látható. Továbbá a keratinociták HLA-DR vizsgálataiban a vizsgált 11 lichen planus biopsziás mintákból 8 pozitív volt.

Az exanthemás és urticariás betegek bőrbiopsziás mintáiban lévő keratinociták ICAM-l-expressziója kevésbé kifejezett. Az ebben a betegségben szenvedő hét beteg közül csak négynek a keratinocitái fejeztek ki ICÁM-1-et a laesió helyén. Csak egy betegnél tapasztaltuk a HLA-DR expresszióját, és ez összefüggésben volt az ICAM-l-gyel.

HU 218 904 Β

Minden vizsgált jóindulatú gyulladásos bőrbetegség esetében az endoteliális sejtek és az infiltrált mononukleáris sejtek egy része különböző mértékben fejezték ki az ICAM-l-et.

XII. táblázat

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója jóindulatú bőrbetegségek keratinocitáin

Diagnózis	Az esetek száma	Csak ICAM-1	Csak HLA-DR	ICAM-1 és HLA-DR
Allergiás kontakt ekcéma	5	3^a	0	2
Lichen planus	11	3	0	8
Pemphigoid/ pemphigus	2	2	0	0
Exanthema	3	2	0	0
Urticaria	4	1	0	1

^a Pozitívnak tekintettük azokat a mintákat, amelyekben a keratinocitáknak legalább egy kis csoportja mcgfcstődött.

24. példa

Az ICAM-1-expressziója pszoriázisos bőrlaesiók keratinocitáin

Öt pszoriázisban szenvedő beteg bőrbiopsziás mintájában tanulmányoztuk az ICAM-1-expressziót a PUVA-kezelés megkezdése előtt és a kezelés alatt periodikusan. (PUVA: a pszoriázis kombinált kezelése ultraibolya sugárzással és egy antrocénszármazékkal.) Szövettanilag bizonyított klasszikus pszoriázisban szenvedő öt betegből vettünk biopsziás mintát. A biopsziás mintákat egymást követően vettük a PUVA-kezelés előtt és a kezelés ideje alatt a megjelölt időpontokban. Az öt beteg esetében a biopsziás mintákat a pszoriázisos plakkok széléről vettük, és négy beteg esetén a klinikailag normális bőrből szintén vettünk biopsziás mintát.

A friss biopsziás mintákat lefagyasztottuk, és folyékony nitrogénben tároltuk. Hatmikronos kriosztátmetszeteket készítettünk, ezeket egy éjszakán át szobahőmérsékleten, levegőn szárítottuk, acetonnal 10 percig fixáltuk és vagy azonnal festettük, vagy alumíniumfóliába csomagolva -80 °C-on tartottuk a festésig.

A festést a következő módon végeztük: a metszeteket monoklonális antitestekkel inkubáltuk, és háromlépéses immunperoxidázos módszerrel festettük meg [H. Stein és munkatársai, Adv. Cancer Rés., 42, 67-147 (1984)], diamino-benzidin H₂O₂-szubsztrátumot alkalmazva. Az anti-ICAM-1 és a HLA-DR-festődés pozitív kontrolljaként tonzillát vagy nyirokcsomót használtunk. Negatív kontrollként a primer antitest távollétében megfestett szövetek szolgáltak.

A HLA-DR elleni monoklonális antitestet a Becton-Dickinson cégtől (Mountainview, CA, USA) szereztük be. A monoklonális anti-ICAM-1 antitest az R6-5-D6 volt. A peroxidázzal konjugált nyúl-antiegér lg és a peroxidázzal konjugált disznó-anti-nyúl lg beszerzése a DAKAPATTS cégnél (Koppenhága, Dánia) történt. A diamino-benzidin-tetrahidrokloridot a Sigma cégtől (St. Louis, MO, USA) vásároltuk.

A vizsgálatok eredménye azt mutatta, hogy a beteg és a normál bőr néhány véredényének endoteliális sejtjei kifejeznek ICAM-l-et, de az ICAM-l-et kifejező véredények száma és a festődés intenzitása növekszik a pszoriázisos bőrléziókban. Ezenkívül öt nem kezelt beteg keratinocitáin az ICAM-1-expresszió képe a festődő sejtek kis csoportjától a sok megfestődött keratinocitáig változott. A PUVA-kezelés ideje alatt két beteg esetében (2-es és 3-as beteg) az ICÁM-1-expresszió jelentős csökkenést mutatott, amely megelőzte vagy egybeesett a klinikai átmeneti javulással (remisszió) (XIII. táblázat). Az 1-es, 4-es és 5-ös betegnél csökkent, illetve a növekedett az ICAM-1 kifejeződése a PUVAkezelés alatt, összhangban a klinikai átmeneti javulással, illetve visszaeséssel. A PUVA-kezelés előtt vagy a kezelés után a normál bőr keratinocitáin nem volt ICAM-l-kifejeződés. Mindezek azt mutatják, hogy a PUVA nem indukált ICAM-1-expressziót a normál bőr keratinocitáinál.

Figyelemreméltó az a megfigyelés, hogy a mononukleáris sejtinfiltráció erőssége összefüggésben van a keratinocitákon megnyilvánuló ICAM-1 mennyiségével. Ez egybevág azzal a megfigyeléssel, hogy a PUVAkezelés alatt a laesiókban csökken a mononukleáris sejtek száma, ha az ICAM-l-expressziója megszűnik, és megnövekszik a mononukleáris sejtek száma a PUVAkezelés alatt, ha a keratinocitákon az ICÁM-1-expresszió emelkedettebb. Az endoteliális sejtek és a dermális mononukleáris sejtek szintén ICAM-1-pozitívak. A klinikailag normál bőrben az ICAM-l-kifejeződés az endoteliális sejtekre korlátozódik, és nincs kifejeződés a keratinocitákon.

A HLA-DR expressziója a keratinocitákon különböző volt. Nem volt olyan HLA-DR pozitív biopsziás minta, mely ne lett volna ICAM-1-pozitív.

Összefoglalva ezek az eredmények azt mutatják, hogy a kezelés előtt az ICÁM-1-expresszió a keratinocitákon nyilvánul meg, és összefügg a mononukleáris sejtbeszűrődés erősségével. A PUVA-kezelés alatt, a klinikai javulással párhuzamosan az ICAM-1-festődés jelentős csökkenése észlelhető. A szövettani vizsgálatok szerint a dermális infiltrációk is csökkennek. Ha a kezelés alatt nyilvánvaló klinikai visszaesés tapasztalható, a keratinocitákon megnövekszik az ICAM-l-expressziója, valamint a bőrinfiltráció erőssége is. Ha a kezelés alatt klinikai remisszió volt észlelhető, ezzel egyidejűleg csökkent a keratinocitákon az ICAM-l-festődés, és ugyancsak csökkent a bőr beszűródése. Tehát az ICÁM- 1-nek a keratinocitákon való kifejeződése megfelel a bőr mononukleáris sejtbeszűrődés erősségének. Ezek az adatok a PUVA-kezelésre adott klinikai választ mutatják be, amely a keratinocitákon történő ICÁM-1-expresszió csökkenésében és párhuzamosan a mononukleáris sejtek mérsékeltebb csökkenésében nyilvánul meg. Mindezek azt mutatják, hogy a keratinocitákon megnyilvánuló ICÁM-1-expresszió felelős a bőrbeszűrődés beindulásáért és annak fenntartásáért,

HU 218 904 Β és hogy a PUVA-kezelés csökkenti az ICAM-l-expressziót, s ez pedig csökkenti a dermális infiltrációt és a gyulladásos reakciót.

A pszoriázisos laesiók keratinocitáin megnyilvánuló ICAM-1-expresszió összefüggésben van a laesio klinikai súlyosságával, valamint a bőrbeszűrődés nagyságával. Tehát az ICAM-1 központi szerepet játszik a pszoriázisban, és kifejeződésének a gátlása és/vagy a CD 18 komplexszel való kölcsönhatásának a gátlása mononukleáris sejteken hatásos kezelési módja lesz ennek a betegségnek. Ezenkívül a keratinocitákon megnyilvá5 nuló ICAM-l-expresszió ellenőrzése hatásos eszköze lesz a diagnózisnak és a prognózisnak, és eszköz lesz a pszoriázisterápia menetének a kiértékelésében.

ΧΠΙ. táblázat

A keratinociták folyamatos ICAM-l-expressziója pszoriázisos bőrlaesiókban (PS) és klinikailag normál bőrben (N) PUVA-kezelés előtt és alatt

A PUVA-kezelés időtartama	A beteg száma
1.	2.	3.	4.	5.
PS	PS	N	PS	N	PS	N	PS	N
0	+	+	-	+ +	-	+ +	-	+ + +	-
1 nap	+
1 hét	+	+	-	-	-	+ +	-	+	-
	0
2 hét	+ +			+	-	+	-	+	-
3 hét	+ +			♦		0
4 hét	+ +	+	-	-	-	+ +	-	*
5-6 hét		-	*	-				♦	-
7 hét	*					+ +	+	+ + +	-
10 hét	(+)					-	-	*

+ + + Sok pozitív keratinocita.

+ + Pozitív keratinociták.

+ Gócos pozitív keratinociták.

(+) Igen kevés, elszórtan pozitív keratinocita. - Nincs pozitív festődés.

* Klinikai javulás (rcmisszió).

Klinikai visszaesés.

25. példa

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója rosszindulatú bőrbetegségekben 45

Eltérően a jóindulatú bőrbetegségektől, a rosszindulatú laesiók keratinocitáin az ICAM-l-expressziója sokkal inkább változó (XIV. táblázat). A vizsgált 23 bőr Tsejt lymphoma (CTCL=cutaneous T-cell lymphoma) közül 14 esetben azonosítottunk ICÁM-1-pozitív kerati- 50 nocitát. A myeosis fúngoides (MF) laesiókból vett biopsziás minták keratinocitáin az ICAM-l-expresszió elvesztésének a tendenciája tapasztalható, ahogy a betegség az előrehaladottabb fázis felé halad. Azonban a legtöbb bőr T-sejt lymphomában a mononukleáris sejtinfiltrációval különböző mértékben arányos az ICAM-1 kifejeződése. A fennmaradó lymphomákat vizsgálva, nyolcból négyben találtunk olyan keratinocitákat, amelyek ICAM-l-et fejeznek ki. A vizsgált 29 rosszindulatú bőrbetegségben szenvedő beteg közül ötnek volt

HLA-DR kifejező keratinocitája, de ezek nem fejeztek ki ICAM-l-et (XIV. táblázat).

XIV. táblázat

Az ICAM-1 és a HLA-DR expressziója rosszindulatú bőrbetegségek keratinocitáin

Diagnózis	Az esetek száma	Csak ICAM-1	Csak HLA-DR	ICAM-1 és HLA DR
CTCL, MFI	8	l^a	0	4
CTCL, MFII III	10	1	2	4
CTCL, SS	3	1	0	2
CTCL, nagy sejt	2	0	2	0

HU 218 904 Β

XIV. táblázat (folytatás)

Diagnózis	Az esetek száma	Csak ICAM-1	Csak HLA-DR	ICAM-1 cs HLA-DR
CBCL	2	0	0	1
Leukémia cutis	3	1	1	1
Histiocytosis X	1	0	0	0

^a Azokat a mintákat tekintettük pozitívnak, amelyekben legalább a keratinociták egy kis csoportja megfestődött.

26. példa

Az anti-ICAM-1 antitestek hatása a humán perifériás vér mononukleáris sejtekproliferáciöjára

A humán perifériás vér mononukleáris sejtjeinek a proliferációját antigének vagy mitogének jelenléte és azok felismerése indikálja. Bizonyos molekulák, így a mitogén Concanavalin-A vagy a T-sejt-kötő OKT3 antitest a perifériás vér mononukleáris sejtjeinek nem specifikus proliferációját okozzák.

A humán perifériás vér mononukleáris sejtjei heterogének abból a szempontból, hogy olyan sejtek szubpopulációiból állnak, amelyek specifikus antigének felismerésére képesek. Ha egy perifériás mononukleáris sejt, amely képes egy sajátságos specifikus antigén felismerésére, találkozik az antigénnel, indukálódik a mononukleáris sejtek szubpopulációinak proliferációja. Ilyen antigénekre példa a tetanusztoxoid és a kagylóhemocianin (keyhole limpet hemocyanin), ezeket a perifériás vér mononukleáris sejtek szubpopulációi felismerik, de szenzitizált egyénekben ezt nem minden perifériás mononukleáris sejt ismeri fel.

Vizsgáltuk az R6-5-D6 anti-ICAM-1 monoklonális antitestet, hogy gátolja-e a humán perifériás vér mononukleáris sejtek proliferációs válaszát olyan rendszerekben, amelyekről tudjuk, hogy sejt-sejt adhéziót igényelnek.

A perifériás vér mononukleáris sejteket Ficoll-Paque (Pharmacia) gradiensben tisztítottuk az előállító cég előírásai szerint. A határfelület összegyűjtése után a sejteket háromszor mostuk RPMI 1640 oldattal, majd lapos fenekű 96 tartályos mikrotitráló lemezeken tenyésztettük 10⁶ sejt/ml sűrűségig 10% fetális bovinszérummal, 2 mM glutaminnal és 50 pg/ml gentamicinnel kiegészített RPMI 1640 tápoldattal.

A fent leírt módon tenyésztett sejtekhez a következő antigéneket adtuk hozzá: T-sejt mitogén Concanavalin A (0,25 pg/ml), T-sejt-kötő OKT3 antitest (0,001 pg/ml), csigahemocianin (10 pg/ml), tetanusztoxoid (a kiindulási anyag 1:100 hígítása) R6-5-D6 anti-ICAM-1 antitest jelenlétében (5 pg/ml végső koncentrációig) vagy enélkül. A sejteket 3,5 napig (ConA kísérlet), 2,5 napig (OK.T3 kísérlet) vagy 5,5 napig (kagylóhemocianin és tetanusztoxoid kísérlet) tenyésztettük a kísérletek befejezése előtt.

A vizsgálat befejezése előtt 18 órával 2,5 pCi ³Htimidint adtunk a tenyészetekhez. A sejtek proliferációját a timidinnek a perifériás vér mononukleáris sejtek DNS-ébe való beépülése mérésével határoztuk meg. A beépült timidint folyadékszcintillációs számlálóval mértük [Merluzzi és munkatársai, J. Immunoi., 139, 166-168 (1987)]. A kísérletek eredményeit a 16. ábra (ConA kísérlet), a 17. ábra (OKT3 kísérlet), a 18. ábra (kagylóhemocianin kísérlet) és a 19. ábra (tetanusztoxoid kísérlet) mutatja be.

Azt találtuk, hogy mononukleáris sejtek esetében az anti-ICAM-1 antitest gátolja a ConA nem specifikus T-sejt mitogénre, az OKT3 nem specifikus T-sejttel kapcsolatos antigénre és a specifikus antigénekre, így a csigahemocianinra és a tetanusztoxoidra adott proliferatív választ. Az anti-ICAM-1 antitest által kifejtett gátlás hasonlítható az anti-LFA-1 antitest által kifejtett gátlással, melynek alapján feltételezhető, hogy az ICAM-1 funkcionális liganduma az LFA-1-nek és az ICÁM-1-nek ezen antagonista tulajdonsága gátolja a védekezőrendszer válaszait.

27. példa

Az anti-ICAM-1 antitest hatása a kevert limfocita reakcióra

Amint azt a fentiekben tárgyaltuk, az ICAM-1 az LFA-l-függő sejtadhéziók által közvetített immunválasz során a sejtek közötti hatékony kölcsönhatáshoz szükséges. Az immunválaszok vagy a gyulladásos betegségek során az ICAM-1 indukciója lehetővé teszi a leukocitáknak egymással és az endoteliális sejtekkel való kölcsönhatását.

Ha nem rokon egyének limfocitáit egymás jelenlétében tenyésztjük, blaszttranszformációt és a limfociták proliferációját figyelhetjük meg. Ez a válasz, vagyis egy limfocitapopuláció válasza egy másik populáció jelenlétére, kevert limfocita reakció (mixed lymphocyte reaction=MLR) néven ismert jelenség és hasonló a limfocitáknak a mitogén hozzáadására fellépő reakciójához [Immunology, The Science of Self-Nonself Discrimination, J. Klein, John Wiley and Sons, N. Y. (1982), 453-458. oldal].

Kísérleteket végeztünk, hogy meghatározzuk az anti-ICAM-1 monoklonális antitestek hatását a humán MLR-ra. A kísérleteket a következők szerint hajtottuk végre: normál, egészséges donoroktól vénapunkcióval perifériás vért vettünk le. A vért heparinos csövekbe vettük, és szobahőmérsékleten 1:1 arányban hígítottuk Puck’s G (GIBCO) kiegyensúlyozott sóoldattal (BSS=balanced salt solution). A vérkeveréket (20 ml) 15 ml Ficoll/Hypaque sűrűséggradiensre (Pharmacia; sűrűség 1,078 szobahőmérsékleten) rétegeztük és 1000 g mellett 20 percig centrifügáltuk. A fázisok határfelületi részét összegyűjtöttük, és háromszor mostuk Puck’s Goldatban. A sejteket hemocitométerben számláltuk meg, és ismét felszuszpendáltuk RPMI 1640 tápoldatban, amely 0,5% gentamicint, 1 mmol L-glutamint (GIBCO) és 5% hővel inaktivált (56 °C, 30 perc) humán AB szérumot (Flow Laboratories) tartalmazott. (Ezt az összetételt a következőkben RPMI táptalajnak nevezzük.)

HU 218 904 Β

Ezekben a kísérletekben egér anti-ICAM-l-et (R6-5-D6) használtunk. Minden monoklonális antitestet (ascites folyadékból állították elő a Jackson Immuno Research Laboratories cégnél, Boston, MA, USA) tisztított IgG készítmény formájában használtunk.

A perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMC=peripheral blood mononuclear cell) Linbro-féle gömbölyű fenekű mikrotitráló lemezeken (76-013-05) tenyésztettük, 6,25 1 0⁵ sejt/ml sűrűségig. Egy másik donorból vett stimulátorsejteket 1000 R-nal sugároztunk be, és a válaszreakciót adó (responder) sejtekkel együtt tenyésztettük azonos sűrűségig. Az össztérfogat tenyészetenként 0,2 ml volt. A kontrollok csak respondersejteket, valamint csak stimulátorsejteket tartalmaznak. A tenyésztőlemezeket 37 °C-on 5% CO₂-tartalmú nedves le- 15 vegő atmoszférában 5 napon át inkubáltuk. A tartályokat 0,5 pCi triciumos timidinnel (³HT) (New England Nuclear) kezeltük a tenyésztés utolsó 18 órájában. Néhány esetben kétutas MLR-t végeztünk. Az eljárás azonos volt, kivéve, hogy a második donor sejtjeit nem inaktiváltuk besugárzással.

A sejteket üvegszál szűrőkre gyűjtöttük egy többszörös automata mintagyűjtőt alkalmazva (Skatron, Norvégia), amelyet vízzel és metanollal öblítettünk. A szűrőket szárítószekrényben szárítottuk és Aquasolban, egy Beckman (LS-3801) folyadékszcintillációs számlálóban mértük. Az eredményeket a 6 egyedi tenyészet átlaga cpm értékében (± standard hiba) adjuk meg.

A XV. táblázatból kitűnik, hogy a tisztított antiICAM-1 monoklonális antitestek gátolják az MLR-t 30 dózistól függően, 20 ng/ml mellett már szignifikáns szuppressziót okozva. Tisztított egér IgG-nek csekély az immunszuppresszív hatása, vagy nincs ilyen hatás.

Az MLR szuppressziója anti-ICAM-1 monoklonális antitesttel akkor következik be, ha az antitestet a tényé- 35 szethez az első 24 órában adjuk (XVI. táblázat).

XV. táblázat

Az anti-ICAM-1 antitest hatása az egyutas limfocita reakcióra

Válaszoló sejtek³	Stimulátor- sejtek^b	Antitest	³HT-beépülés
-	-	-	445^d±143
-	+	-	148±17
+	-	-	698±72
+	+	-	42,626±1,579
+	+	mlgG (10,0 pg)	36,882±1,823 (14%)
+	+	mlgG (0,4 pg)	35,500± 1,383 (17%)
+	+	mlgG (0,02 pg)	42,815 ±1,246 (0%)
+	+	R6-5-D6 (10,0 pg)	8,250±520 (81%)
+	+	R6-5-D6 (0,4 pg)	16,142±858 (62%)
+	+	R6-5-D6 (0,03 pg)	28,844± 1,780 (32%)

^a Válaszoló sejtek (6,25 · 10⁵/ml).

^b Stimulátorscjtck (6,25 · 10⁵/ml, 1000 R-nal besugározva). ^c ICÁM -1 elleni tisztított monoklonális antitest (R6- 5 -D6) vagy tisztított egér IgG (mlgG=mouse IgG) végkoncentrációja (μ g/ml) mellett. ^d 5-6 tenyésztés átlagértékei standard hiba, a zárójelben lévő számok az MLR gátlásának %-át jelentik.

XVI. táblázat

Az anti-ICAM-1 adás ideje

R^a	S^b	Adagolás	³HT-bcépülés (cpm)
			0. nap	1. nap	2. nap
-	-	táptalaj	205^d±14	476±132	247±75
-	+	táptalaj	189±16	na^e	na
+	-	táptalaj	l,860±615	na	na
+	-1-	táptalaj	41,063±2,940	45,955±2,947	50,943±3,072
+	+	R6-5-D6	17,781 ±1,293 (57%)«	38,409±l,681 (16%)	47,308±2,089 (7%)

^a Válaszoló sejtek (6,25 · 10⁵/ml).

^b Stimulátorsejtek (6,25· 10⁵/ml, 1000 R-nal besugározva).

^c Táptalaj vagy ICAM-1 -gyei szembeni monoklonális antitest (R6- 5-D6) 10 pg/ml, melyet a 0. napon és ezután 24 órás időközönként adagoltunk. ^d 4-6 tenyészet átlagai standard hiba. ^e na=nincs adagolás.

«gátlás százaléka.

HU 218 904 Β

Összefoglalva az ICAM-1-gyei szembeni antitesteknek az MLR-re kifejtett gátló hatása azt mutatja, hogy az ICAM-1 monoklonális antitesteknek terápiás felhasználási lehetősége van az akut graft kilökődés megakadályozásában. Az ICAM-1 monoklonális anti- 5 testeknek egy másik terápiás felhasználása olyan immunológiai mediátorokkal összefüggő rendellenességekben van, amelyek az LFA-1/ICAM-1 által szabályozott sejt-sejt kölcsönhatásoktól függnek.

Az itt leírt kísérletek azt mutatják, hogy az ICAM-1- 10 gyei szembeni monoklonális antitestek hozzáadása, ha a reakció első 24 órájában adagoljuk, gátolja a kevert limfocita reakciót (az MLR-t). Továbbá az ICAM-1 a humán perifériás vér monocitáin az in vitro tenyésztés során nagyobb mennyiségben képződik.

Ezenkívül megállapítottuk, hogy az ICAM-1 nem fejeződik ki nyugvó humán perifériás vér limfocitákon vagy monocitákon. Az ICÁM-1 csak tenyésztett sejtek monocitáin vagy nem rokon donorsejtekkel együtt tenyésztett sejteken, egy kevert limfocita reakcióban kép- 20 ződik fokozott mértékben, amelyet hagyományos folyadékcitometriás analízissel állapítottunk meg. Az ICAM-1 ezen fokozott megjelenését a monocitákon fel lehet használni gyulladások indikátoraként, főként ha az ICÁM -1 az akut vagy krónikus gyulladásos bete- 25 gek friss monocitáin fejeződik ki.

Az ICAM-1 specifitása az aktivált monocitákkal szemben és az ICAM-l-gyel szembeni antitesteknek azon képessége, hogy az MLR-t gátolják, azt mutatja, hogy az ICÁM -1 monoklonális antitesteknek diagnosz- 30 tikus és terápiás felhasználási lehetősége van a graft kilökődésben és olyan immunológiai mediátorokkal összefüggő zavarokban, amelyekben sejt-sejt kölcsönhatás lenne szükséges.

28. példa

Az anti-ICAM-1 és anti-LFA-1 antitestek kombinált alkalmazásának szinergetikus hatása

A 27. példában bemutattuk, hogy az anti-ICAM-1 antitest gátolja az MLR-t. Az MLR-t az anti-LFA-1 antitestek is képesek gátolni. Annak eldöntésére, hogy vajon az anti-ICAM-1 és anti-LFA-1 antitestek kombinált alkalmazása fokozott vagy szinergetikus hatást fejtenek-e ki, egy MLR assayt végeztünk (a 27. példában leírt módon) a két antitest különböző koncentrációinak 15 a jelenlétében.

Ezek az MLR vizsgálatok azt mutatták, hogy az anti-ICAM-1 és anti-LFA-1 antitestek kombinációja olyan koncentrációkban, amelyekben egyik antitest sem gátolja jelentősen az MLRT-t, szignifikánsan hatásosabb az MLR-válasz gátlásában (XVII. táblázat). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy azok a terápiás eljárások, amelyekben kiegészítésül az anti-ICAM-1 antitest

- vagy egy fragmentuma - és az anti-LFA-1 antitest

- vagy egy fragmentuma - együttes alkalmazása szerepel, olyan hatásúak, hogy előnyösebb gyulladás elleni terápiát tesznek lehetővé. Egy ilyen tökéletesített terápiában az antitesteket kisebb adagokban alkalmazhatjuk, mint amilyenek egyébként terápiásán hatásosak lennének, és olyan körülmények közt van ennek jelentősége, amikor az egyes antitestek magas koncentrációi antiidiotípusos választ indukálnának.

XVII. táblázat

Az anti-ICAM-1 és az (R3.1) anti-LFA-1 különböző adagjainak a hatása a kevert limfocita reakcióra

Koncentráció (Ug/ml)	Gátlás (%)
anti-ICAM-1 (R6-5-D6)
Anti-LFA-1	0	0,004	0,02	0,1	0,5	2,5
0,0	0	7	31	54	69	70
0,0008	1	7	28	48	62	71
0,004	0	13	30	50	64	72
0,02	29	38	64	75	84	86
0,1	92,5	90	91	92	92	92
0,5	93	90	90	92	93	91

29. példa

Az anti-ICAM-1 szuboptimális dózisainak más immunszuppresszív szerekkel kombinált alkalmazásával járó additív hatások MLR-ben

A 28. példában bemutattuk, hogy az MLR-t az antiICAM-1 és anti-LFA-1 antitestek kombinációja gátolja. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, vajon az anti-ICAM-1 alkalmazása más immunszuppresszív hatóanyagokkal (ilyen a dexametazon, azatioprin, ciklo- 60 sporin A vagy a szteroidok, mint például a prednizon stb.) kombinálva ugyancsak hatásfokozódással jár-e. Ezért MLR-vizsgálatokat végeztünk az R6-5-D6-nak 55 szuboptimális koncentrációival (azaz olyan koncentrációkkal, amelyek annál az optimális koncentrációnál alacsonyabbak, mint amivel a beteg kizárólag a hatóanyagot kapná meg) és más immunszuppresszív szereknek együttes alkalmazásával a 27. példa szerinti adatok alapján.

HU 218 904 Β

Az adatok azt mutatják, hogy az R6-5-D6 gátló hatása legalábbis additív a dexametazon (XVIII. táblázat), az azatioprin (XIX. táblázat) és ciklosporin A (XX. táblázat) szuboptimális dózisainak gátló hatásához. Ebből következik, hogy az anti-ICAM-1 antitestek hatékonyan csökkenthetik az ismert immunszuppresszív szerek szükséges dózisait, és így ezek toxikus mellékhatásait csökkenthetik. Egy anti-ICAM-1 antitest (vagy fragmentuma) használatakor ahhoz, hogy elérjünk ilyen immunszuppressziót, lehetőség nyílik az antitestet (vagy fragmentumát) akár egyetlen további immunszuppresszív szerrel, akár egynél több további immunszuppresszív szer kombinációjával együttesen alkalmazni.

XVIII. táblázat

Az anti-ICAM-1 és a dexametazon hatása humán MLR-ben

Csoport	Inhibitor (pg/ml)	³HT-beépülés (cpm)	Gátlás (%)
Közeg	-	156	-
Stimulátorok (S)	-	101	-
Responderek (R)	-	4,461	-
RxS	-	34,199	-
RxS	R6-5-D6 (8)	26,224	23
RxS	Dex (50)	14,158	59
RxS	R6-5-D6 (8) + Dex (50)	7,759	77

Dex: dexametazon.

XIX. táblázat

Az anti-ICAM-1 és az azatioprin hatása humán MLR-ben

Csoport	Inhibitor (pg/ml)	³HT-beépülés (cpm)	Gátlás (%)
Közeg	-	87	-
Stimulátor (S)	-	206	-
Responder (R)	-	987	-
RxS	-	31,640	-
RxS	R6 5 D6 (8)	26,282	17
RxS	CyA (10)	23,617	25
RxS	R6-5-D6 (8) + CyA (10)	19,204	39

CyA: ciklosporin A.

30. példa

Az anti-ICAM-1 antitest hatása a transzplantált allogén szervek kilökődésének szuppresszálásában

Annak érdekében, hogy bemutassuk az antiICAM- 1 antitest hatását egy allogén átültetett szerv kilökődésének a szuppresszálásában, Cynomolgus majmokba allogén veséket ültettünk át a Cosimi és munkatársai [Transplant. Proc., 13,499-503 (1981)] módszere szerint azzal a módosítással, hogy az anesztéziához váliumot és ketamint használtunk.

Vagyis a veseátültetést lényegében a következőképpen végeztük. Heterotróp veseallográftokat ültettünk be 3-5 kg-os Cynomolgus majmokba, lényegében Marquet és munkatársai [Medical Primatology, II. rész, Karger, Basel, 125. oldal (1972)] leírása alapján az anesztéziát váliummal és ketaminnal végezve. A donorveseereket vég az oldalhoz anasztomózissal az aorta vagy véna cava oldalába szájaztattuk 7-0 Prolene varrattal. A donor urétert elvágtuk és a hólyagba extravizikális megoldással implantáltuk [Y. Taguchi és munkatársai, Advances in Transplantation, szerkesztők: Dausset és munkatársai, Williams & Wilkins, Baltimore, 393. oldal (1968)]. A vesefunkciót hetenként vagy kéthetenként értékeltük szérumkreatinin meghatározásokkal. Ezenkívül rendszeresen vettünk allograft biopsziás mintákat hisztopatológiás vizsgálatok céljára, és minden nem túlélő egyed esetében teljes autopsiát végeztünk. A legtöbb recipiensben kétoldali nelfektómiát végeztünk a transzplantáció időpontjában, és az ezt követő urémiás halált tekintettük az allograft túlélése végpontjának. Néhány recipiens esetében unilaterális natív nefrektómiát és ellenkező oldali uréteres összeköttetést létesítettünk a transzplantációval egy időben. Ha az allograft-kilökődés bekövetkezett, az autológ uréterkötést eltávolítottuk, ezzel a normál vesefunkciót helyreállítottuk, és megteremtettük annak lehetőségét, hogy a recipiens állat immunológiai megfigyelését folytathassuk.

Az R6-5-D6 monoklonális antitestet naponta adtuk 12 napon át a transzplantáció előtt két nappal elkezdvén 1-2 mg/kg/nap adagokban. A szérumkreatininszintet időszakonként mértük a kilökődés ellenőrzése céljából. Az anti-ICAM-1 antitestnek az allogén vese immunrendszer okozta kilökődésére gyakorolt hatását a XXI. táblázat mutatja be.

XXI. táblázat

Az R6-5-D6 hatása a vese allograft túlélés meghosszabbítására Cynomolgus majmokon végzett profilaktikus eljárásban³

Majom	R6-5-D6 dózis (mg/kg)	T úlélési/utókezelési napok
Kontroll 1	-	8
Kontroll 2	-	11
Kontroll 3	-	11
Kontroll 4	-	10
Kontroll 5	-	9
Kontroll 6	-	10
M15	1,0	20

HU 218 904 Β

XXI. táblázat (folytatás)

Majom	R6-5-D6 dózis (mg/kg)	Túlélési/utókezelési napok
M19	1,0	7^b
M17	1,0	30
M25	1,5	29
M23	1,0	11'
M27	2,0	34
M7	0,5	22
MII	0,5	26
M10	0,5	22
M8	0,5	26^d

'Amajmoknak 12 egymást követő napon R6 5 D6-ot adtunk. Adozírozást a transzplantáció előtti 2. napon kezdtük meg. ^b A halál oka ismeretlen. Latens maláriára utaló leletet kaptunk.

' A halál oka veseinfarktus.

^d 1988. augusztus 15-én még él.

Az eredmények szerint az R6-5-D6 hatékonyan meghosszabbította azoknak a majmoknak az életben maradását, amelyek allogén transzplantált vesét kaptak.

31. példa

Az anti-ICAM-1 antitest hatása a transzplantált szervek akut kilökődésének szuppresszálásában

Annak bemutatása érdekében, hogy az anti-ICAM-1 antitest egy transzplantátumkilökődés akut modelljében mennyire hatékony, vizsgáltuk az R6-5-D6 hatását egy terápiás vagy egy akut kilökődési modellben. Ebben a modellkísérletben majomveséket transzplantáltunk (a 30. példában leírt eljárást alkalmazva), és az operáció körül 15 mg/kg ciklosporin A-t (CyA) adagoltunk imm., amíg helyre nem állt a stabil veseműködés. A CyA dózisát ezután kéthetenként 2,5 mg/kg adaggal csökkentettük, amíg meg nem történt a kilökődés, amelyet a vér kreatininszintjének a növekedése jelzett. Ettől az időponttól R6-5-D6-ot adagoltunk 10 napon át, és a túlélés időtartamát figyeltük. Fontos megjegyezni, hogy ebben az eljárásban a CyA dózisa szuboptimális maradt, mivel nem változtattuk meg, amikor az akut kilökődés eredménye megtörtént. Ebben a modellben az antitest segítsége nélküli kontrollok (n=5) 5-14 nappal élték túl a kilökődés beindulását. Az eljárásban a mai napig hat állatot teszteltünk R6-5-D6 használatával (XXII. táblázat). Az állatok közül kettő még él (az R6-5-D6 alkalmazását követően az M12 állat 31 napja és az M5 állat 47 napja él). Két állat 38, illetve 55 napig élt az R6-5-D6 terápia elkezdése után, és két állat pusztulását nem az akut kilökődés okozta, hanem más (az egyik halálát a CyA toxicitása okozta, a második halála azért következett be, mivel az R6-5-D6-ot az anesztézia alatt kapta). Ez a modell inkább közelíti azt a klinikai szituációt, amelyben az R6-5-D6 használatát el lehetne kezdeni.

XXII. táblázat

Az R6-5-D6 hatása a vese allográf túlélés meghosszabbítására Cynomolgus majmokon végzett terápiás kísérletekben³

Majom	A kilökődési esemény napja^b	Túlélési/utókezelési napok
Kontrollok'	14-98	5-14
M24	41	38
M21	34	4^d
M3	41	55
M9	12	11'
M12	37	>31^f
M5	26	>47^r

^a A majmok 1-2 mg/kg R6- 5 - D6-ot kaptak a kilökődés megindulását követően 10 napon át.

^b Az a nap, amikor a kreatininszintek megnőttek a CyA adagok csökkentése következtében, és amikor az R6-5-D6 terápia elkezdődött. ^c Öt állatot teszteltünk a fent leírt terápiás eljárást használva, kivéve, hogy nem kaptak segítő terápiát. A túlélési/utókezelési napok a kreatininszint emelkedésének kezdete utáni túlélési napokat jelentik. ^d Anesztézia alatt pusztult el. A kreatininszint alacsony volt. ^e CyA toxicitása miatt pusztult cl. A kreatininszint alacsony volt. ^f 1988. augusztus 15-én még mindig élt.

32. példa

Az ICAM—1 csonkított származékainak genetikai szerkezete és kifejeződése

Természetes állapotában az ICAM-1 egy membránhoz kötött protein, amely egy 5 immunglobulinszerű doménből álló extracelluláris szakaszt, egy transzmembrán domént és egy citoplazmatikus domént tartalmaz. Kívánatos volt olyan ICAM-1 funkcionális származékokat szerkeszteni, amelyekben nincs transzmembrán dómén és/vagy citoplazmatikus dómén, hogy az ICÁM-1-ből egy szolubilis, szekretált forma képződhessen. Ezeket a funkcionális származékokat az ICAM-1 gén oligonukleotidra irányuló mutagenezisével szerkesztettük meg, majd ezt követte a mutáns génekkel transzficiált majomsejtekben való kifejeződés.

Az ICÁM -1 génben aminosavszubsztitúciókat eredményező mutációkat és/vagy csonkított származékokat T. Kunkel [Proc. Natl. Acad. Sci., 82,488-492 (1985)] módszerével hoztunk létre. A fentiekben leírt módon előállított ICAM-1 cDNS-t Sáli és KpnI restrikciós endonukleázokkal emésztettük, és a kapott 1,8 kb DNSffagmentumot a CDM8 plazmidvektorba [B. Seed és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3365-3369 (1987)] szubklónoztuk. Az E. coli (BW313/P3) egy dut , ung’ törzsét [T. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] ezzel a szerkezettel transzformáltuk, melyet pCD1.8C elnevezéssel láttunk el. Az R408 (Stratagene^R) helper fággal való fertőzés segítségével egy egyszálú, uraciltartalmú templátot szabadítottunk fel a transzformált sejtekből. Az ICAM-1 cDNSmutánsokat ezután úgy állítottuk elő, hogy egy második szál szintézisét indítottuk be egy hibásan illeszkedő bá38

HU 218 904 Β zisokat tartalmazó oligonukleotiddal, majd ezután egy ung+ gazdasejtet (MC 1061/P3) [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)] a kapott hetero duplexszel transzformáltunk. A mutánsokat úgy izoláltuk, hogy a mutáns oligonukleotid révén bevitt újonnan keletkezett endonukleáz restrikciós helyekre nézve végeztünk szűrővizsgálatot. A CDM8 eukarióta expressziós vektorban (Invitrogen V308-20) lévő mutáns DNS-sel transzficiált COS-7 (ATCC CRL 1651) sejtek - standard DEAE-dextrán eljárást alkalmaztuk - fejezték ki a mutáns ICAM-1 proteint [R. F. Selden és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, szerkesztők: F. M. Ausubel és munkatársai, 9.2.1-9.2.6. oldal (1987)].

Előállítottuk az ICÁM -1 egy olyan csonkított funkcionális származékát, amely nem tartalmazta a transzmembrán és citoplazmatikus doméneket, de tartalmazta az 5 immunglobulinszerű domént magában foglaló extracelluláris szakaszt. Egy 30 bp mutáns oligonukleotidot (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) használtunk arra, hogy a 452., illetve 453. pozícióban lévő tirozin (Y) és glutaminsav (E) kodonokat egy fenil-alanin (F) kodonná és egy transzlációs stopkodonná (TAG) transzformáljuk. A mutáns, amelyet egyetlen Xbal restrikciós helye révén izoláltunk, Y⁴⁵²E/F,TAG elnevezést kapott.

A mutáns protein kifejezése céljából COS-sejteket transzficizáltunk 3 mutáns szubklónnal (#2, #7 és #8). A három mutáns szubklónnal való transzfekció után 3 nappal a tenyészet felülúszókat és a sejtlizátumokat RR1/1 anti-ICAM-1 monoklonális antitesttel való immunprecipitációval és SDS-PAGE módszerrel analizáltuk. Az ICAM-l-et a #2 és #8 mutáns szubklónnal transzficiált sejtek tenyészeteinek felülúszójából precipitáltuk, de nem e sejtek detergenslizátumából. A tenyészet felülúszóban talált ICAM-1 molekulatömege körülbelül 6 kD-ra csökkent az ICÁM -1 membrán formájához viszonyítva, amely egybevág a mutáns DNS előrelátott méretével, azaz az ICAM-1 ezen funkcionális származéka szolubilis proteinként szekretálódik. Ezzel szemben a natív ICAM-1-gyei transzficiált sejttenyészetek felülúszójából ICAM-1 nem volt immunprecipitálható, ami azt jelenti, hogy a COS-sejtek nem bocsátják ki az ICAM-1 membrán formáját. Ezenfelül sem a negatív kontroll áltranszficiált sejtek tenyészetének felülúszóiból, sem a sejt lizátumaiból nem volt immunprecipitálható az ICAM-1.

A transzformált sejtek által szekretált csonka ICAM-l-et immunaffinitás-kromatográfiával - egy specifikus antitestet (R6-5-D6) használva - tisztítottuk, és funkcionális aktivitását egy sejtkötő assay-ben teszteltük. Oktil-glükozid-detergens jelenlétében való tisztítás után a natív vagy a csonka, szekretált formájú ICAM-l-et tartalmazó készítményeket úgy hígítottuk, hogy az oktil-glükozid végső koncentrációja 0,25% legyen (ez a koncentráció a detergens kritikus micellakoncentrációja alatt van). Hagytuk, hogy ezen ICAM-1készítmények a 96 tartályos műanyag lemez (Nunc) felszínére kötődjenek, s így szilárd fázishoz kötött ICAM-1 keletkezett. A kötetlen anyag kimosása után az SKW-3 sejteknek - felületükön LFA-l-et hordoznak - 75-80%-a kötődött az ICAM-1 natív, illetve 83-88%-a kötődött az ICAM-1 csonkított formájához specifikusan. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a szekretált, csonkított szolubilis ICAM-1 funkcionális származék megtartotta mind immunológiai reaktivitását, mind azon képességét, hogy közvetítse az ICAM-1fuggő adhéziót, amely a natív ICAM-1 jellemzője.

Hasonló módon állítottuk elő az ICAM-1 egy olyan funkcionális származékát, amelyből csak a citoplazmatikus dómén hiányzott. Egy 25 bp oligonukleotidot (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) használtunk arra, hogy a 476-os aminosav (Y) kodonját egy TAG transzlációs stopkodonná változtassuk. A mutáns Y⁴⁷⁶/TAG elnevezést kapott. A mutánssal transzficiált COS-sejtek immunprecipitációs és SDS-PAGE vizsgálatával az ICAM-1 egy olyan membránhoz kötött formáját mutattuk ki, amelynek a molekulatömege 3 kD-nal kevesebb, mint a natív ICAM-1 molekulatömege. A mutáns transzficiált COS-sejtek indirekt immunfluoreszcenciás vizsgálata pettyezett festődési képet adott, hasonlót, mint amikor a natív ICAM-1 LPSsel stimulált endoteliális sejteken fejeződik ki. Végül a mutáns DNS-sel transzficiált sejtek hasonló módon specifikusan kötődnek a műanyag felületen lévő tisztított LFA-l-hez, mint a natív ICAM-1 DNS-sel transzficiált COS-sejtek (XXIII. táblázat).

XXI11. táblázat

ICAM-l-et vagy az ICAM-1 egy funkcionális származékát kifejező sejtek LFA- 1-kötő képessége

Transzfekció	ICAM-l-et kifejező LFA-1-et kötő sejtek százaléka
antitest nélkül	RR1/1 jelenlétében
Altranszfekció	0	0
Natív ICAM-1	20	0
Y⁴⁷⁶/TAG	20	0

33. példa

Az ICAM-1 funkcionális doménjeinek térképezése Az ICÁM -1 vizsgálatai kimutatták, hogy a molekula 7 domént tartalmaz. Ezek közül 5 dómén extracelluláris (a dómén 5 van legközelebb a sejt felületéhez, és a dómén 1 van legtávolabb a sejt felületétől), egy dómén a transzmembrán dómén, és van egy citoplazmatikus dómén (azaz a citoplazmán belül helyezkedik el). Annak meghatározására, hogy mely domének járulnak hozzá az ICAM-1 LFA-l-kötő képességéhez, epitóp térképezési vizsgálatok végezhetők. A vizsgálatok elvégzéséhez különböző deléciós mutánsokat állítottunk elő, és megvizsgáltuk, hogy képesek-e kötődni az LFA-l-hez. A vizsgálatokat más módon is el lehet végezni, így olyan anti-ICAM-1 antitest használatával is, amelyről tudjuk, hogy befolyásolja az ICAM-1 LFA-l-kötő képességét. Erre a célra alkalmas antitest például az RR1/1 [R. Rothlein és munkatársai, J. Immu39

HU 218 904 Β nol., 137, Υ2.10-Ώ.Ί4 (1986)], az R6.5 [T. A. Springer és munkatársai, 5,284,931 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás], az LB-2 [E. A. Clark és munkatársai, Leukocyte Typing I; szerkesztők: A. Bemard és munkatársai, Springer Verlag, 339-346. oldal (1984)] vagy a CL203 [D. E. Staunton és munkatársai, Cell., 56, 849-853 (1989)].

ICAM-1 deléciós mutánsokat a különböző eljárások bármelyikével előállíthatunk. Azonban mégis előnyösebb, ha ezeket a mutánsokat helyre irányuló mutagenezissel állítjuk elő vagy más rekombináns technikával (például úgy, hogy ICAM-l-kifejező olyan génszekvenciákat szerkesztünk, amelyekből az egyes proteinszakaszokat kódoló szekvenciák hiányoznak). Az ilyen mutánsok előállításához adaptálható eljárások jól ismertek ezen a szakterületen. Ilyen eljárásokat használva három ICAM-1 deléciós mutánst készítettünk. Az első mutánsból hiányoznak az FI85-től P284-ig terjedő aminosavcsoportok (azaz a dómén 3 kiesett). A második mutánsból hiányoznak a P284-től az R451-ig terjedő aminosavcsoportok (azaz a dómén 4 és 5 kiesett). A harmadik mutánsból hiányoznak az Y476 utáni aminosavcsoportok (azaz a citoplazmatikus dómén kiesett). Ezeknek a vizsgálatoknak az eredménye arra utal, hogy a dómén 1, 2, 3 kiemelkedő szerepet játszik az ICÁM-1-nek az anti-ICAM-1 antitesttel és az LFA-l-gyel való kölcsönhatásában.

34. példa

Az ICAM-1-ben létrejött mutációk hatása az LFA-1kötődésre

Az ICÁM-1-nek azon képességét, hogy kölcsönhatásba lép az LFA-l-gyel és hozzákötődik, olyan ICAM-1 aminosavcsoportok közvetítik, amelyek az ICAM-1 molekulában, a dómén 1-ben vannak jelen (8., 9. és 10. ábra). Ezeket a kölcsönhatásokat azonban az ICÁM-1-ben lévő dómén 2-ben és 3-ban jelen lévő aminosavak hatása is segíti. Tehát a jelen találmány szerinti előnyös funkcionális származékok közé tartoznak az ICAM-1 molekula szolubilis fragmentumai, s ezek tartalmazzák az ICAM-1 dómén 1-et, 2-t és 3-at. Előnyösebbek az ICÁM-1 molekula azon fragmentumai, amelyek az IC-1 dómén 1-et és 2-t tartalmazzák. A legelőnyösebbek az ICAM-1 molekulának azok a szolubilis fragmentumai, amelyek az ICAM-1 dómén 1-et tartalmazzák. Az első ICAM-1 doménben számos aminosavcsoport szerepel az ICAM-l-LFA-1 kölcsönhatásban. Ezeknek az aminosavaknak más aminosavakkal való szubsztitúciója megváltoztatja az ICÁM-1-nek azt a képességét, hogy kötődni tudjon az LFA-1-hez. Ezeket az aminosavcsoportokat és a szubsztitúciókat mutatja be a 25. ábra. A 25. ábra bemutatja az ilyen mutációk hatását a kapott mutáns ICAM-1 molekula LFA-l-kötő képességére. A 23-25. ábrákban a csoportokat az aminosavak egybetűs kódjával írtuk fel, és ezt követi az ICAM-1 molekulában lévő csoport pozíciójának a jelzése. Tehát például az „E90” egy glutaminsavcsoportnak felel meg az ICAM-1 90-es pozíciójában. Hasonlóan az „E90V” egy dipeptidet jelent, amely a 90-es pozíciójú glutaminsavcsoportból és a 91-es pozíciójú valincsoportból áll. A szubsztituált szekvenciát a törtvonaltól („/”) jobbra jelöljük. Az ICAM-1 V4, R13, Q28, Q58 és a D60S61 csoportjai vesznek részt az LFA-1-kötésben.

Ezeknek az aminosavaknak a helyettesítése megváltoztatja az ICÁM-1-nek LFA-1-hez kötődő képességét. Például a V4 helyettesítése G-vel egy olyan mutáns ICAM-1 molekula képződését eredményezi, amely kevésbé képes az LFA-1-hez kötődni (25. ábra). Az ICAM-1 R13 csoportjának E-vel való helyettesítése egy olyan mutáns molekula képződéséhez vezet, amely lényegesen kisebb kapacitással köti az LFA-1-et (25. ábra). Az ICAM-1 Q58 csoportjának helyettesítése H-val egy olyan mutáns molekula képződéséhez vezet, amely lényegében normál kapacitással köti az LFA-l-et (25. ábra). Az ICAM-1 D60S csoportjainak a helyettesítése KL-lel egy olyan mutáns molekulát eredményez, amely lényegesen kisebb kapacitással köti az LFA-l-et (25. ábra).

A második dómén glükozilációs helyei szintén részt vesznek az LFA-1-kötésben (23. ábra). Az N103 helyettesítése K-val vagy az A166N helyettesítése SV-vel egy olyan mutáns ICAM-1 molekula képződését eredményezi, amely lényegében képtelen az LFA-1-hez kötődni. Ezzel szemben az N175-ÖS glükozilációs helynek A-val való helyettesítése úgy tűnik, hogy lényegében nem befolyásolja a mutáns ICÁM-1-nek LFA-lkötő tulajdonságát.

A harmadik ICÁM -1 doménben keletkező mutációk nem változtatják meg jelentősen az ICAM-l-LFA-1 kötődést (24. ábra).

35. példa

Megnövekedett biológiai félélet-idővel és kiürülési képességgel rendelkező ICÁM-1 multimer formák

Kiméra molekulákat állítottunk elő, amelyekben az ICÁM -1 dómén 1-et és 2-t hozzákapcsoltuk az immunglobulin nehéz lánc csuklószakaszához. Az előnyös szerkezetekben az ICAM-1 dómén 2 C terminusza az immunglobulin nehéz lánc gén egy szegmentumában lévő csuklószakasz N-terminuszához kapcsolódik, s ez lehetővé teszi a szegmentumok flexibilitását a csuklószakasznak köszönhetően. Az ICAM-1 dómén 1 és 2 ilyen módon egy antitest Fab fragmentumát helyettesíti. Az IgG osztályok nehéz láncaihoz való kapcsolás és állati sejtekben való termelés kiméra molekula termelését fogja eredményezni. IgA vagy IgM eredetű nehéz láncokat tartalmazó molekulák előállítása nagyobb mértékben multimer molekulák termelésében fog jelentkezni, s ez 2-12 ICAM-1 molekulát jelent. Az ICAM-1-nehéz lánc kiméra molekulákat termelő állati sejtekben a J-lánc gén koexpressziója megfelelően összeszerelt IgA és IgM multimereket eredményez, amelyek főként 4-6 ICAM-1 molekulát tartalmazó IgA molekulát és IgM esetében körülbelül 10 ICAM-1 molekulatartalmat jelentenek. Ezek a kiméra molekulák számos előnnyel rendelkeznek. Először: az lg molekulák - tulajdonságuk szerint hosszú ideig fennmaradnak a keringésben, és ez javítja a biológiai félélet-időt.

HU 218 904 Β

Ezenkívül a manipulált molekulák multimer tulajdonsága azt eredményezi, hogy nagy aktivitással lépnek reakcióba mind a rhinovírussal, mint a sejtfelületi LFA-l-gyel - a terápia irányával összefüggésben és ez nagyban csökkenti a rekombináns proteinnek azt a mennyiségét, amelyet a hatásos dózis elérése érdekében lenne szükséges alkalmazni.

A mukózus helyek, például az orr szekrétumaiban normálisan jelen lévő IgA és IgM erősen glükozilezett molekulák. Ezek erősen hidrofil jellege meggátolja a baktériumokat és a vírusokat - amelyekhez kötődnek - abban, hogy a sejtekhez kapcsolódjanak, és hogy átjussanak az epiteliális sejtmembránkorláton. Tehát így nagyobb a terápiás hatékonyságuk. Az IgM és főként az IgA nyálkakömyezetben stabilak, és így növelhetik az ICAM-1 szerkezetek stabilitását is. Ha egy ilyen ICAM-1 funkcionális származékot a véráramba juttatunk, ez is növelheti a biológiai félélet-időt. Az IgA nem komplementkötő, s ez ideális az alkalmazás szempontjából, mivel ellenkező esetben káros hatása lenne. Abban az esetben, ha IgG H-lánc kimérára lenne igény, lehetőség volna azokat a szakaszokat mutálni, amelyek a komplement kötésben, valamint az Fc receptorral való kölcsönhatásban részt vesznek.

36. példa

ICAM-1 mutánsok képzése

Oligonukleotidra irányuló mutagenezis

Egy ICAM-1 cDNS-kódoló szakaszát egy 1,8 kb méretű Sall-KpnI fragmentum formájában beklónoztuk a CDM8 expressziós vektorba (Invitrogen V308-20) [B. Seed és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 3365-3369 (1987)]. T. Kunkel módszere alapján [Proc. Natl. Acad. Sci., 82, 488-492 (1985)], amelyet D. Staunton és munkatársai módosítottak [Cell., 52, 925-933 (1988)], ezt a szerkezetet (pDC1.8) használtuk egy egyszálú, uraciltartalmú templát előállítására, az oligonukleotidra irányuló mutagenezisben való felhasználás céljára.

Röviden: az XS127 E. coli törzset pCD1.8-cal transzformáltuk. Egyedi telepeket tenyésztettünk 13 pg/ml ampicillint és 8 pg/ml tetraciklint tartalmazó 1 ml Luria táplevesben (LB=Luria Broth; Difco) közel telítésig. A tenyészet 100 pl-ét R408 helper fággal (Stratagene) fertőztük 10-szeres fertőző adaggal (MOI=multiplicty of infection) és 10 ml ampicillin- és tetraciklintartalmú LB tápoldatot adtunk hozzá további 16 órás tenyésztéshez 37 °C-on. A tenyészetet 10 000 fordulat/perc mellett 1 percig centrifugáltuk, és a felülúszót 0,22 pm-es szűrőn megszűrtük, ezután a fágszuszpenziót használtuk a BW313/P3 E. coli sejtek fertőzésére. A sejteket ampicillinnel és tetraciklinnel kiegészített LB agar (Difco) lemezekre öntöttük. Kiszúrtunk néhány telepet, ezeket ampicillin- és tetraciklintartalmú 1 ml LB tápoldatban közel telítésig elszaporítottuk és 10 MOI helper fággal fertőztük. Ekkor a tenyészet térfogatát megnöveltük 250 mire, és a sejteket egy éjszakán át tenyésztettük. Egyszálú DNS-t izoláltunk standard fág extrakciós módszerrel.

A mutáns oligonukleotidokat foszforiláltuk, és ezt használtuk a pCD1.8 templáthoz, a második szál szintéziséhez [D. E. Staunton és munkatársai, Cell., 52, 925-933 (1988)].

Transzfekció

COS-sejteket (ATCC CRL 1651) oltottunk 10 cmes szövettenyésztő lemezekre úgy, hogy 16-24 óra múlva 50%-a összefolyt legyen. A COS-sejteket ezután egyszer mostuk TBS-oldattal, majd 4 órán át inkubáltuk 10% Nu-szérumot (Collaborative), 5 pg/ml klorokvint (chloroquine), 3 pg mutáns plazmidot és 200 pg/ml DEAE-dextrán-szulfátot tartalmazó RPMI 1640 tápoldatban. A sejteket ezután 10%-os DMSO/PBS-ben, majd PBS-ben mostuk, majd 16 órán át tenyésztettük a tápoldatban. A tápoldatot ekkor friss táptalajjal cseréltük ki, és a transzfekció utáni 48. órában a COS-sejteket tripszin/EDTA (GIBCO) kezeléssel szuszpendáltuk, majd elosztottuk két 10 cm-es lemezre, valamint 24 tartályos szövettenyésztő lemezekre a HRV-kötéshez. A 72 órás sejteket a 10 cm-es lemezekről 5 mmólos EDTA/HBSS-oldattal arattuk le, és előkészítettük a műanyagra adszorbeált LFA-1-hez való adhéziós és immunfluoreszcenciához.

LFA -1- és HR V-kötés

LFA-l-et tisztítottunk SKW-3 lizátumokból immunaffinitás-kromatográfiával TS2/4 LFA-1 MAt Sepharose-on és pH = 11,5 mellett, 2 mM MgCl₂ és 1% oktil-glükozid jelenlétében eluáltuk. Az LFA-l-et (10 pg/200 pl/6 cm-es lemez) bakteriológiai Petri-csészékhez kötöttük oly módon, hogy az oktil-glükozidot 2 mM MgCl₂-t tartalmazó PBS-ben (foszfáttal pufferolt konyhasóoldat=phosphate buffered saline) 0,1%-ra hígítottuk és egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. A csészéket 1%-os BSA-val (bovin szérumalbumin) blokkoltuk és 2 mM MgCl₂, 0,2% BSA, 0,025% azid- és 50 pg/ml gentamicintartalmú PBS-ben tároltuk.

Az ⁵¹Cr-mal jelzett COS-sejteket 5% FCS (fetal calf serum), 2 mM MgCl₂, 0,025% azidtartalmú PBSpufferben inkubáltuk 5 pg/ml RRl/l-gyel és R6.5-tel - vagy ezek nélkül - LFA-l-gyel fedett mikrotitráló lemezeken, 25 °C-on, 1 órán át. A nem adherens sejteket 10 mmólos EDTA hozzáadásával oldottuk le, majd gamma-számlálás következett.

Eredmények

A következő anti-ICAM-1 antitesteket vizsgáltuk: RR1/1, R6.5, LB-2 és CL203. Ha ezek az antitestek képesek meggátolni az ICAM-1 funkcióját, akkor az ICÁM-1 molekulának egy olyan különleges helyéhez kell kötődniük, ami az ICAM-1 funkciója szempontjából is fontos. Tehát az ICAM-1 fent leírt deléciós mutánsainak az előállításával és annak megállapításával, hogy az anti-ICAM-1 antitest milyen mértékben tud a deletált mutánshoz kötődni, lehetségessé válik annak meghatározása, hogy a deletált domének fontosak-e a funkció szempontjából.

Az ICAM-1 egy membránhoz kötött protein, amelynek az extracelluláris doménje valószínűleg öt Ig-szerű C-doménből áll. Annak meghatározására, hogy mely domének vesznek részt az LFA-1 megkötésében, a dómén 3-at és a dómén 4-et és 5-öt (karboxiterminális szakasz) oligonukleotidra irányuló mutagenezis segítségével deletáltuk és COS-sejtekben való ki41

HU 218 904 Β fejeződésük után funkciószempontból teszteltük. Ezenkívül a teljes citoplazmatikus domént kiejtettük, hogy meggyőződjünk az ICAM-1 kölcsönhatásokra gyakorolt potenciális befolyásáról. Mint vártuk, a citoplazmatikus dómén deléciója - Y476/* - azt mutatta, hogy nem volt veszteség az RR1/1, R6.5, LB-2 és CL203 reaktivitásban, ugyanakkor a dómén 3 deléciója - FI85 - R451 - csökkentette a CL203 reaktivitását, illetve ennek elvesztését okozta (20. ábra). Tehát úgy látszik, hogy a CL203 epitóp a dómén 4-ben helyezkedik el, míg az RR1/1, R6.5 és az LB-2 az aminoterminális doménben van.

Mind a három deléciós mutáns tehát az LFA- 1-hez való adherencia vad típusú szintjét mutatta (21. ábra). Aminosan szubsztitúciókat is végeztünk a dómén 1, 2 és 3-ban feltehetően jelen lévő β-hurkokban, és COSsejtekben való kifejeződés után ezeket funkciójuk szempontjából teszteltük. Az R6.5 epitóp eszerint a dómén 2 EE111GGA szekvenciában lokalizálódik, és feltehetően a dómén 1 E39-ben is, míg az RR1/1 és az LB-2 a dómén 1 R13 csoportjától függnek (22. ábra). Ezenkívül az RRl/l-kötődés csökken, ha a D71GQS szekvenciában mutáció fordul elő. Azoknál a mutációknál, amelyekben N103-nál és N165-nél az N-glükozilációs helyek megszűnnek, csökken az RR1/1, R6.5 és az LB-2 LFA-1 HRV-kötése. Úgy látszik, hogy ezek a mutációk úgy hatnak a folyamatra, hogy ICAM-1 dimerek keletkeznek.

Más mutációk a dómén 2-ben vagy 3-ban nem változtatják meg az LFA-1 adhéziót (23. és 24. ábra). A dómén 1-ben az R13 és D60 aminosavak részt vesznek az LFA-1-kötésben (25. ábra).

Tehát valószínűnek látszik, hogy az LFA-1- és HRV-kötés az ICAM-1 aminoterminális Ig-szerű doménjének a fúnkciója. A 26. ábra az ICÁM-1 aminoterminális doménjének az összehasonlítását mutatja be.

Bár a találmányt a speciális megvalósításokkal kapcsolatosan írtuk le, magától értetődik azonban, hogy a találmány tovább módosítható, azaz ez a bejelentés a találmány bármilyen olyan változtatását, használatát vagy adaptációját oltalmi körébe vonja, amely általánosságban a találmány alapelveit követi, ideértendők a jelen tartalomtól való olyan eltérések is, amelyek a találmánnyal kapcsolatos szakterületen a gyakorlati ismeretekből és a felhasználók gyakorlatából adódnak, továbbá amelyek az előbbiekben előadott és a csatolt igénypontokban megfogalmazott lényeges elveknek megfelelően alkalmazhatók.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás a 8. ábrán megadott aminosavszekvenciájú ICAM-l-et kódoló rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy egy ICAM-l-et vagy megfelelő fragmentumát termelő sejtből DNS-t vagy mRNS-t izolálunk, az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és a DNS-t vagy cDNS-t megfelelő preparálás után alkalmas oligonukleotidpróbákkal hibridizáljuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás a

a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K-,

b) -X-G-S-V-L-V-T-C-S-T-S- C-D-Q-P-K-,

c) -L-L-G-I-E-T-P-L-,

d) -F-L-T-V-Y-X-T-,

e) -V-E-L-A-P-L-P-,

f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E-,

g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K-,

h) -S-F-P-A-P-N-V-,

i) -L-R-G-E-K-E-L-,

j) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-,

k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E-,

l) -P-R-G-G-S-,

m) -P-G-N-N-R-K-,

n) -Q-E-D-S-Q-P-M-,

o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S-,

p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S-,

q) -D-L-R-P-Q-G-L-Epolipeptidek csoportjából legalább egyet tartalmazó ICAM-l-et kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy az izolált DNS-t (egy) a fenti polipeptidfragmentumo(ka)t kódoló „legvalószínűbb” nukleotidszekvenciá(ka)t tartalmazó próbával/próbákkal hibridizáljuk.
3. Eljárás az ICAM-1 1., 2., 3., 4. és 5. doménjét kódoló rekombináns DNS-molekula előállítására, azzal jellemezve, hogy egy ICAM-l-et vagy megfelelő fragmentumát termelő sejtből DSN-t vagy mRNS-t izolálunk, az mRNS-ről cDNS-t szintetizálunk, és a DNS-t vagy cDNS-t megfelelő preparálás után alkalmas oligonukleotidpróbákkal hibridizáljuk.
4. Eljárás az R6-5-D6 antitest előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett antitestet az ATCC-nél ATCC HB 9580 számon letétbe helyezett hibridómából nyert sejttenyészet felülúszójából izoláljuk.
5. Eljárás a specifikus védekezőrendszer válaszából eredő gyulladás meglétének és helyének diagnosztizálására gyaníthatóan ilyen gyulladástól szenvedő emlős alanyban, azzal jellemezve, hogy

i) az illető alany szövetmintáját egy ICAM-l-et kifejező sejt azonosítására képes, detektálhatóan jelzett kötődő ligandumot tartalmazó készítménnyel inkubáljuk; és ii) detektáljuk az említett kötődő ligandumot.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy antitestet vagy egy fragmentumát használjuk kötődő ligandumként.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett antitest vagy fragmentum egy monoklonális antitest vagy annak fragmentuma.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest az R6-5-D6.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitestfragmentum az R6-5-D6 monoklonális antitest egy fragmentuma.
10. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICAM-l-et kódoló DNS-szekvenciához vagy egy megfelelő mRNS-szekvenciához kötődő nukleinsavmolekulát használjunk kötődő ligandumként.

HU 218 904 Β
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a

a) -V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K-,

b) -X-G-S-V-L-V-T-C-S-T-S-C-D-Q-P-K-,

c) -L-L-G-I-E-T-P-L-,

d) -F-L-T-V-Y-X-T-,

e) -V-E-L-A-P-L-P-,

f) -E-L-D-L-R-P-Q-G-L-E-L-F-E-,

g) -L-N-P-T-V-T-Y-G-X-D-S-F-S-A-K-,

h) -S-F-P-A-P-N-V-,

i) -L-R-G-E-K-E-L-,

j) -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-,

k) -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E-,

l) -P-R-G-G-S-,

m) -P-G-N-N-R-K-,

n) -Q-E-D-S-Q-P-M-,

o) -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S-,

p) -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S-,

q) -D-L-R-P-Q-G-L-Epolipeptidek csoportjából legalább egyet kódoló nukleinsavmolekulát használunk kötődő ligandumként.
12. Eljárás ICÁM-1-et kifejező tumorsejt jelenlétének és helyzetének diagnosztizálására gyaníthatóan ilyen sejtet hordozó emlős alanyban, azzal jellemezve, hogy

i) az illető alany szövetmintáját egy, az ICAM-1hez kötődő antitestek vagy ezek fragmentumai által alkotott csoportból választott, detektálhatóan jelzett ligandumot tartalmazó készítménnyel inkubáljuk; és ii) detektáljuk az említett kötődő ligandumot.
13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy ICÁM-1-hez kötődő monoklonális antitestet vagy ennek egy ICÁM - 1-hez kötődő fragmentumát használjuk kötődő ligandumként.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitest az R6-5-D6.
15. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett monoklonális antitestfragmentum az R6-5-D6 monoklonális antitest egy fragmentuma.
16. Eljárás az LFA-1 molekulacsalád egy tagját kifejező tumorsejt jelenlétének és helyzetének diagnosztizálására gyaníthatóan ilyen sejtet hordozó alanyban, azzal jellemezve, hogy

i) az illető alany szövetmintáját egy, az LFA-1 molekulacsalád egy tagjához kötődő, detektálhatóan jelzett, a 8. ábrában megadott aminosavszekvenciájú ICAM-1 vagy az ICAM-1 egy olyan oldható fragmentuma közül választott ligandum jelenlétében inkubáljuk, amely az ICÁM-1-től a transzmembrán dómén hiányában eltérő; és ii) detektáljuk az említett kötődő ligandumot.
17. Eljárás emlős alanyban a specifikus vagy nem specifikus védekezőrendszer válaszából eredő gyulladás kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy (a) egy ICÁM-1-hez kötődő antitest, egy ICÁM-1-hez kötődő antitestfragmentum, a 8. ábrán megadott aminosavszekvenciájú ICAM-1 vagy az ICAM-1 egy oldható fragmentuma, amelyből hiányzik a citoplazmatikus vagy a citoplazmatikus és a transzmembrán dómén közül választott gyulladásgátló ágenst, és (b) az ICAM-1 egy nem immunglobulin antagonistáját önmagukban vagy egy vagy több más hatóanyagként a dexametazon, azatioprin és ciklosporin A közül választott legalább egy immunszuppresszív ágenssel együtt, adott esetben hordozókkal, hígítókkal és/vagy egyéb gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokkal kombinálunk, és a kombinációt gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICAM-1 nem immunglobulin antagonistájaként egy LFA-1-től eltérő nem immunglobulin antagonistát használunk.
19. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICAM-1 oldható fragmentumaként egy, az ICAM-1 1. doménjét, az ICAM-1 1. és 2. doménjeit, az ICAM-1 1., 2. és 3. doménjét, az ICAM-1 1., 2., 3. és 4. doménjét és az ICAM-1 1., 2., 3., 4. és 5. doménjét tartalmazó fragmentumok által alkotott csoportból választott fragmentumot használunk.
20. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ICAM-1 oldható fragmentumaként egy olyan fragmentumot használunk, amelyből hiányzik az ICAM-1 citoplazmatikus doménje.
21. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antitestként egy monoklonális antitestet használunk.
22. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy monoklonális antitestként az R6-5-D6-ot használjuk.
23. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy ICÁM-1-hez kötődő antitestfragmentumként az R6-5-D6 monoklonális antitest egy fragmentumát használjuk.
24. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy késleltetett típusú hiperérzékenységi reakció kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
25. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pszoriázis tüneteinek kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
26. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy autoimmun-betegség tünetének kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a Reynaud-szindróma, autoimmun-pajzsmirigygyulladás, EAE (enteroantigén enteritis), szklerózis multiplex, reumatoid artritisz és lupus erythematosus által alkotott csoportba tartozó betegség kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
28. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szervátültetés kilökődési válaszreakciójának kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
29. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy veseátültetés kilökődési válaszreakciójának kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
30. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szövetátültetés kilökődési válaszreakciójának kezelésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.

HU 218 904 Β
31. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gyulladások megelőzésére szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
32. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gyulladások terápiás kezelésére 5 szolgáló gyógyszerkészítményt állítunk elő.
33. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy migrációhoz az LFA-1 család egy funkcionális tagját igénylő hematopoetikus tumorsejt metasztá zisának elnyomására szolgáló gyógyszerkészítményt ál lítunk elő.
34. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez ve, hogy ICAM-l-et kifejező tumorsejt növekedésé nek visszaszorítására szolgáló gyógyszerkészítményt ál lítunk elő.