JP2874861B2 - Ｉｃａｍ−１又はその機能性フラグメントに結合し得る抗体を産生するハイブリドーマ細胞の調製方法 - Google Patents

Ｉｃａｍ−１又はその機能性フラグメントに結合し得る抗体を産生するハイブリドーマ細胞の調製方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はリンパ球の群が細胞
基質を認識しそれに付着して炎症部位に浸透し炎症反応
中細胞と反応する過程で含まれるＩＣＡＭ−１のような
細胞間粘着分子又はその機能性フラグメントに結合し得
る抗体を産生するハイブリドーマ細胞の調製方法に関す
る。本発明はさらにそのような細胞間粘着分子に結合し
得るリガンド分子、これらリガンドのスクリーニングア
ッセイ、および該細胞間粘着分子、該リガンド分子およ
び該スクリーニングアッセイの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】白血球はホストをバクテリアまたはウィ
ルスのような外敵に対して適切に防御するために細胞基
質に付着し得なければならない。防御システムの優れた
見解はEisen, H. W.により“Micro-biology,第３版、ペ
ンシルバニア州フィラデルフィア、Harpe & Row 社刊、
（１９８０）、２９０−２９５および３８１−４１８”
において提示されている。白血球は内皮細胞に結合でき
て循環系から進行中の炎症部位に浸透できなければなら
ない。さらに、白血球は抗原提供細胞に付着して正常な
特異的免疫応答が起り得ねばならず、さらに、リンパ球
は、適当なターゲット細胞に付着してウィルス感染また
は腫瘍細胞の分解が起り得ねばならない。最近、そのよ
うな付着の仲介において含まれる白血球表面分子がハイ
ブリドーマ技術を用いて同定された。要するに、ヒトＴ
−細胞〔Davignon, D.等，Proc.Natl. Acad. Sci. USA
78：４５３５−４５３９（１９８１）〕とマウスひ臓
細胞〔Springer, T.等，Eur. J.Immunol. ９：３０１−
３０６（１９７９）〕に対して向けられた各モノクロー
ナル抗体は白血球表面に結合し、上述の付着関連機能を
抑制しているものと同定された〔Springer, T.等、Fed.
Proc. 44：２６６０−２６６３（１９８５）〕。これら
の抗体により同定された分子はＭａｃ−１およびリンパ
球機能会合抗原１（ＬＦＡ−１）と称される。Ｍａｃ−
１はマクロファージ、顆粒球および顆粒状リンパ球上に
見い出されたヘテロダイマーである。ＬＦＡ−１は大部
分のリンパ球に見い出されるヘテロダイマーである〔Sp
ringer, T. A. 等、Immunol.Rev. 68 ：１１１−１３５
（１９８２）〕。これらの２つの分子、および第３分子
ｐ１５０、９５（これはＭａｃ−１と同様な組織分布を
有する）は細胞粘着においてある役割を発揮する〔Keiz
er, G.等、Eur.J.Immunol.15：１１４２−１１４７（１
９８５）〕。
【０００３】上記の白血球分子は糖たん白質の関連群の
１員であることが見い出された〔Sanchez-Madrid, F.
等、J. Exper. Med. 158 : １７８５−１８０３（１９
８３）；Keizer, G.D.等、Eur.J.Immunol. 15：１１４
２−１１４７（１９８５）〕。この糖たん白質群は１つ
のアルファー鎖と１つのベータ鎖を有するヘテロダイマ
ーからなっている。抗原の各々のアルファー鎖は互いに
異なるけれども、ベータ鎖は高度に保護されていること
が判明している〔Sanchez-Madrid,F. 等、J. Exper.Me
d. 158：１７８５−１８０３（１９８３）〕。糖たん
白質群のベータ鎖（ある場合には“ＣＤ１８”と称す）
は９５KDの分子量を有することが見い出され、一方アル
ファー鎖は１５０KD−１８０KDで変化することが見い出
された〔Springer,T. 等、Fed. Proc. 44 ：２６６０
−２６６３（１９８５）〕。膜たん白質のアルファサブ
ユニットはベータサブユニットの有する広い相同性を共
有していないけれども、糖たん白質のアルファサブユニ
ットの近似分析は両者の間に実質的な類似性があること
を示している。ＬＦＡ−１関連糖たん白質のアルファー
およびベータサブユニット間の類似性の検討はSanchez-
Madrid, F.等によりなされている〔J. Exper. Med. 15
8 ：５８６−６０２（１９８３）〕；J.Exper.Med.185
：１７８５−１８０３（１９８３）〕。
【０００４】白血球表面上の上記粘着たん白質群のいず
れの１員の正常量も明らかにすることができない１群の
人々が同定されている〔Anderson, D. C. 等、Fed.Pro
c.,44：２６７１−２６７７（１９８５）；Anderson,
D. C. 等、J. Infect. Dis.,152 : ６６８−６８９（１
９８５）〕。これらの患者からのリンパ球は分子のＬＦ
Ａ−１群が抗体により中和されている健常者に類似する
インビボ欠陥を示していた。さらにまた、上記の患者
は、その細胞の細胞基質への粘着能力なしにより、正常
な免疫応答を測定することができない〔Anderson, D.
C. 等、Fed. Proc.44：２６７１−２６７７（１９８
５）；Anderson, D. C. 等、J. Infect. Dis.,152 ：６
６８−６８９（１９８５）〕。これらのデータは免疫反
応がリンパ球がＬＦＡ−１群の機能的粘着分子の欠如に
より正常な形で粘着できない場合には緩和されることを
示している。
【０００５】即ち、要約すれば、動物の健康および生命
力を維持するリンパ球の能力はリンパ球が他の細胞（内
皮細胞のような）に粘着できることを必要とする。この
粘着はリンパ球の細胞表面上に存在する特異的レセプタ
ー分子を含む細胞−細胞接触を必要とすることが判明し
ている。これらのレセプターはリンパ球が他のリンパ球
または内皮および他の非血管細胞に粘着することを可能
する。細胞表面レセプター分子は相互に高度に関連する
ことが判明している。リンパ球が上記の細胞表面レセプ
ター分子を欠損しているヒトは慢性で再発性の感染症、
および欠損抗体応答を含む他の臨床的症状を示す。リン
パ球粘着は外来組織が認識され拒絶される過程で起るの
で、この過程の理解が臓器移植、組織移植、アレルギー
および腫瘍学の分野において著しく価値がある。
【０００６】
【発明の内容】細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）お
よびその官能性誘導体に関する。さらにＩＣＡＭ−１の
機能を抑制し得る抗体および抗体フラグメント、および
ＩＣＡＭ−１機能に対する他のインヒビター、並びにそ
のようなインヒビターを同定し得るアッセイに関する。
さらに上記分子すべての診断および治療上の用途に関す
る。さらに詳細には、実質的に天然不純物を含まない細
胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体を包
含する。さらにリンパ球表面に存在する分子に結合し得
るそのような分子に関する。さらに検量可能に標識した
細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１およびその誘導体に関す
る。
【０００７】さらにＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導
体を発現し得る組換えＤＮＡ分子を包含する。また次の
各工程を含む実質的に純粋な形でＩＣＡＭ−１を回収す
る方法を包含する： (a) ＩＣＡＭ−１を発現する細胞膜からＩＣＡＭ−１を
可溶化して、可溶化ＩＣＡＭ−１調製物を調製するこ
と、(b) 上記可溶化ＩＣＡＭ−１調製物をＩＣＡＭ−１
に結合し得る抗体を含有するアフィニティマトリックス
に導入すること、(c) ＩＣＡＭ−１を上記アフィニティ
マトリックスの抗体に結合させること、(d) 上記マトリ
ックスから抗体に結合し得ないすべての化合物を除去す
ること、および(e) ＩＣＡＭ−１を上記マトリックスか
ら溶出させることによりＩＣＡＭ−１を実質的に純粋な
形で回収すること。
【０００８】さらにＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の
官能性誘導体からなる群から選ばれた分子に結合し得る
抗体を包含する。またそのような抗体を産生し得るハイ
ブリドーマ細胞を包含する。さらにモノクローナル抗体
Ｒ6 −５−Ｄ6 を産生し得るハイブリドーマ細胞を包含
する。本発明は、次の工程を含む、ＩＣＡＭ−１に結合
し得る抗体を産生する所望のハイブリドーマ細胞の産生
方法に関する： (A) 生理条件下で可溶であり、トランスメンブランドメ
インが欠落しており、ＩＣＡＭ−１細胞外ドメイン１〜
５（図８の残基１〜４５３）のアミノ酸配列を含有し、
免疫学的反応性及び天然ＩＣＡＭ−１のＩＣＡＭ−１依
存性粘着特性の仲介能力を保持しているヒトＩＣＡＭ−
１の機能性フラグメントを発現する細胞で動物を免疫す
る工程、(B) 上記動物のひ臓細胞をミエローマ細胞系と
融合させる工程、(C) 融合させたひ臓細胞及びミエロー
マ細胞により抗体分泌性ハイブリドーマ細胞を生成させ
る工程、及び(D) ハイブリドーマ細胞をＩＣＡＭ−１に
結合し得る抗体を産生し得る所望のハイブリドーマ細胞
にスクリーニングする工程。
【０００９】更に上記工程(A) において、前記動物をＩ
ＣＡＭ−１を発現するがＬＦＡ−１を発現しない細胞で
免疫し、前記スクリーニン工程(D) が次の各工程： (1) 前記ハイブリドーマ細胞のいずれかから産生した抗
体を複数の凝集し得る細胞を含有するリンパ球調製物と
インキュベートすること、(2) 上記産生した抗体を上記
リンパ球調製物の上記細胞の凝集を抑制する能力につい
て検査すること、及び(3) 前記所望のハイブリドーマ細
胞として、上記リンパ球調製物の上記細胞の凝集を抑制
し得る抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択するこ
と、を含むＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体を産生する所
望のハイブリドーマ細胞の産生方法も含有する。
【００１０】また上記方法で取得したハイブリドーマ細
胞およびそのハイブリドーマ細胞から産生させた抗体も
包含する。本発明はまた細胞間粘着の非免疫グロブリン
アンタゴニストの同定方法にも関し、その方法に次の工
程よりなる： (A) 細胞間粘着のアンタゴニストであり得る非免疫グロ
ブリン剤を凝集可能な複数の細胞を含有するリンパ球調
製物とインキュベートすること；および(B) 上記リンパ
球調製物を検査して上記非免疫グロブリン剤の存在がリ
ンパ球調製物の細胞凝集を抑制するかどうかを測定する
こと；凝集抑制が上記非免疫グロブリン剤を細胞間粘着
のアンタゴニストとして同定する。
【００１１】また哺乳動物の特異的防御システムの応答
に由来する炎症を治療する方法にも関し、その方法はそ
のような治療の必要な対象物に上記炎症を抑制するのに
十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎
症剤はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に
結合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡ
Ｍ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グ
ロブリンアンタゴニストからなる群より選ばれる。さら
にＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタゴニストがＬ
ＦＡ−１以外のＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンアンタ
ゴニストである上述の炎症治療方法を包含する。また浸
透にＬＦＡ−１群の官能性一員を必要とする造血腫瘍細
胞の転移を抑制する方法にも関し、この方法はそのよう
な治療を必要とする患者に上記の転移を抑制するのに十
分な量の抗炎症剤を与えることを含み、かつこの抗炎症
剤はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結
合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ
−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非免疫グロ
ブリンアンタゴニストからなる群より選ばれる。
【００１２】さらにＩＣＡＭ−１の非免疫グロブリンア
ンタゴニストがＬＦＡ−１以外の非免疫グロブリンアン
タゴニストである上記造血腫瘍細胞の転移を抑制する方
法も包含する。またＩＣＡＭ−１発現腫瘍細胞の成長を
抑制する方法も包含し、その方法はそのような治療を必
要とする患者に上記成長を抑制するのに十分な量の毒素
を与えることを含み、この毒素はＩＣＡＭ−１に結合し
得る毒素誘導抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体の毒
素誘導フラグメント、ＬＦＡ−１群分子の毒素誘導１
員、およびＬＦＡ−１群分子の１員の毒素誘導官能性誘
導体からなる群から選ばれる。またＬＦＡ−１発現腫瘍
細胞の成長を抑制する方法にも関し、その方法はそのよ
うな治療を必要とする患者にかかる成長を抑制するのに
十分な量の毒素を与えることを含み、この毒素は毒素誘
導ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の毒素誘導官能性誘
導体からなる群より選ばれる。
【００１３】さらに炎症を有する凝わしい哺乳動物対象
体の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位
置を診断する方法に関し、その方法は、(a) 上記の対象
体にＩＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得る検出可能
に標識した結合性リガンドを含有する組成物を投与する
こと、および(b) 上記結合性リガンドを検出すること、
を含む。さらに炎症を有する凝わしい哺乳動物対象体の
特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位置を
診断する方法に関し、その方法は、(a) 上記対象体の組
織のサンプルをＩＣＡＭ−１を発現する細胞を同定し得
る検出可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物
とインキュベートすること、および(b) 上記結合性リガ
ンドを検出すること、を含む。
【００１４】またＩＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する
凝わしい哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および
位置を診断する方法にも関し、その方法は、(a) 上記対
象体にＩＣＡＭ−１に結合し得る検出可能に標識した結
合性リガンドを含有する組成物を投与すること、このリ
ガンドは抗体およびＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラ
グメントからなる群より選ばれること、および(b) 上記
結合性リガンドを検出すること、を含む。またＩＣＡＭ
−１発現性腫瘍細胞を有する疑わしい哺乳動物対象体の
そのような細胞の存在および位置を診断する方法にも関
し、その方法は(a) 上記対象体の組織のサンプルをＩＣ
ＡＭ−１に結合し得る検出可能に標識した結合性リガン
ドを含有する組成物とインキュベートすること、このリ
ガンドが抗体およびＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラ
グメントからなる群より選ばれること、および(b) 上記
結合性リガンドを検出すること、を含む。
【００１５】またＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫
瘍細胞を有する疑わしい対象体のそのような細胞の存在
および位置を診断する方法にも関し、その方法は、(a)
上記対象体にＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る検出
可能に標識した結合性リガンドを含有する組成物を投与
すること、このリガンドはＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ
−１の官能性誘導体からなる群より選ばれること、およ
び(b) 上記結合性リガンドを検出すること、を含む。ま
たＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有する
疑わしい対象体のそのような細胞の存在および位置を診
断する方法にも関し、その方法は、(a) 上記対象体の組
織のサンプルを分子のＬＦＡ−１群の１員に結合し得る
検出可能に標識した結合性リガンドの存在下にインキュ
ベートすること、このリガンドはＩＣＡＭ−１およびＩ
ＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群より選ばれるこ
と、および(b) 上記組織サンプル中に存在する分子のＬ
ＦＡ−１群の１員に結合している上記結合性リガンドを
検出すること、を含む。
【００１６】
【発明の実施の形態】１つの局面はＬＦＡ−１に対して
の天然結合性リガンドの発見に関する。ＬＦＡ−１群分
子のような分子は、細胞間粘着の過程に含まれており、
“粘着分子”と称されている。天然結合性リガンドは
“細胞間粘着分子−１（Intercellular Adhesion Molec
ule-1)”または“ＩＣＡＭ−１”と表示される。ＩＣＡ
Ｍ−１は７６−９７kdの糖たん白質である。ＩＣＡＭ−
１はヘテロダイマーではない。本発明はＩＣＡＭ−１お
よびその“官能性誘導体”に関する。ＩＣＡＭ−１の
“官能性誘導体”はＩＣＡＭ−１の生物学的活性に実質
的に同様な生物学的活性（機能的または構造的に）を有
する化合物である。“官能性誘導体”なる用語は分子の
“フラグメント”、“変異体”、“同族体”または“化
学誘導体”を包含するものとする。ＩＣＡＭ−１のよう
な分子の“フラグメント”は分子の任意のポリペプチド
サブセットを意味する。ＩＣＡＭ−１のような分子の
“変異体”とは全分子またはそのフラグメントと構造上
または機能上実質的に同様である分子を称する。分子は
他の分子と両分子が実質的に同様な構造を有するかある
いは両分子が同様な生物学的活性を有する場合に“実質
的に同様”と称される。即ち、２つの分子が同様な活性
を有する場合、これらの分子は変異体であるとみなさ
れ、該用語は本明細書において分子の１つの構造が他の
分子中に見い出されない場合あるいはアミノ酸残基配列
が同じでない場合でも使用される。本明細書で使用する
とき、分子が通常分子の１部でない追加の化学的部分を
含む場合、その分子は他の分子の“化学的誘導体”であ
ると称する。そのような部分は分子の溶解性、吸収性、
生物学的半減期等を改善する。これらの部分はまた分子
の毒性を低減させ、分子の望ましくない副作用等を消去
または減衰させる。そのような作用を緩和させ得る部分
は“Remigton's Pharmceutical Sciences （１９８
０）”に記載されている。“毒素誘導”分子は“化学誘
導体”の特別のクラスを構成している。“毒素誘導”分
子は毒素部分を有する分子（ＩＣＡＭ−１または抗体の
ような）である。そのような分子の細胞への結合は細胞
の極く近くに毒素部分を運びそれによって細胞死を促進
する。任意の適当な毒素部分を使用できるが、例えば、
リシン毒素、ジフテリア毒素、ラジオアイソトープ毒
素、膜−チャンネル形成性毒素等の毒素を用いることが
好ましい。そのような部分を分子に結合させる方法は当
該技術において周知である。
【００１７】ＩＣＡＭ−１または分子のＬＦＡ−１群の
１員のような抗原性分子はリンパ球表面に天然に発現し
ている。即ち、そのような細胞の適当な動物への腹腔内
注射等によるような導入はＩＣＡＭ−１または分子のＬ
ＦＡ−１群の１員に結合し得る抗体の産生をもたらすで
あろう。場合によっては、そのような動物の血清を取り
出しこれら分子に結合し得るポリクローナル抗体の原料
として使用することもできる。しかしながら、好ましい
のはそのような動物からひ臓球（spleno cytes) を取り
出し、かかるひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合させ、
得られた融合細胞からＩＣＡＭ−１または分子のＬＦＡ
−１群の各一員に結合し得るモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞を確立することである。上記の
方法で得たハイブリドーマ細胞はＩＣＡＭ−１または分
子のＬＦＡ−１群のメンバーのいずれかに結合し得る抗
体を産生する所望のハイブリドーマ細胞を同定する種々
の方法によってスクリーニングできる。１つの好ましい
スクリーニングアッセイにおいては、そのような分子は
そのエプスティン−バールウィルス形質転換細胞の凝集
を抑制する能力によって同定される。そのような凝集を
抑制し得る抗体をさらにスクリーニングしてこれら抗体
がそのような凝集をＩＣＡＭ−１または分子のＬＦＡ−
１群の各一員への結合によって抑制したかどうかを決定
する。ＩＣＡＭ−１を分子のＬＦＡ−１群から区別でき
る任意の手段をそのようなスクリーニングに用いること
ができる。例えば、抗体と結合した抗原は免疫沈降およ
びポリアクリルアミドゲル電気泳動によるようにして分
析できる。結合抗原がＬＦＡ−１群の１員である場合に
は、免疫沈降した抗原がダイマーとして見い出されるで
あろうし、一方、結合抗原がＩＣＡＭ−１である場合に
は、単一分子量種が免疫沈降して来るであろう。また、
分子のＬＦＡ−１群の１員に結合する抗体をＩＣＡＭ−
１に結合する抗体からＬＦＡ−１を発現するがＩＣＡＭ
−１は発現しない顆粒球のような細胞に結合する抗体の
能力をスクリーニングすることによっても区別できる。
顆粒球に結合する抗体（細胞凝集を抑制することが知ら
れている）の能力はその抗体がＬＦＡ−１に結合し得る
ことを示す。そのような結合のない場合はＩＣＡＭ−１
を認識し得る抗体を示し得る。顆粒球のような細胞に結
合する抗体の能力は通常の熟練者により普通に用いられ
る方法によっても検出し得る。そのような方法にはイム
ノアッセイ、細胞凝集、フィルター結合試験、抗体沈降
等がある。
【００１８】本発明の抗凝集抗体はまたそのＩＣＡＭ−
１を発現する細胞（活性化内皮細胞のような）に特異的
に結合する能力およびそのＩＣＡＭ−１を発現しない細
胞に結合し得ない能力を測定することによっても同定し
得る。当業者によって容易に理解されるように、上記の
各アッセイは修正して即ち、異なる順序で行って種々の
可能性あるスクリーニングアッセイを提供でき、これら
アッセイの各々はＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体と分子
のＬＦＡ−１群の各１員との間で同定および区別化を行
い得るものである。抗炎症剤は、天然方法（例えば、動
物、植物、真菌、バクテリア等をＩＣＡＭ−１の非免疫
グロブリン アンタゴニストを産生するよう誘導するこ
とによってあるいは動物をＩＣＡＭ−１に結合し得るポ
リクローナル抗体を産生するよう誘導することによるよ
うな）により、合成方法〔例えば、ポリペプチド合成用
のメリフィールド法を用いてＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−
１の官能性誘導体またはＩＣＡＭ−１のたん白質アンタ
ゴニスト（免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのい
ずれか）を合成することによるような〕により、ハイブ
リドーマ技術（例えば、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノ
クローナル抗体を産生させるような）により、または組
換え技術〔例えば、本発明の抗炎症剤を種々の宿主（例
えば、酵母、バクテリア、真菌、培養動物細胞等）中
で、あるいは組換えベクターまたはウィルスベクターか
ら産生させるような〕により得ることができる。用いる
方法の選択は便宜さ、所望の収率等のファクターによ
る。上記の方法、手法または技術の１つのみを用いて特
定の抗炎症剤を産生させる必要はなく、上記の方法、手
法および技術は組合せて特定の抗炎症剤を得てもよい。 Ａ．ＬＦＡ−１結合用パートナー（ＩＣＡＭ−１）の同
定 １．ＬＦＡ−１依存凝集のアッセイ 多くのエプスタイン−バールウィルス形質転換細胞は凝
集を示す。この凝集はホルボールエステルの存在下で促
進できる。そのような同型（homotypic)の凝集（即ち、
１種のみの細胞種を含む凝集）は抗ＬＦＡ−１抗体によ
ってブロックされることが見い出された〔“Rothlein,
R.等、J. Exper. Mes. １６３：１１３２−１１４９
（１９８６）”、該文献は参考として本明細書に引用す
る〕。即ち、ＬＦＡ−１依存性結合の度合は自発性また
はホルボールエステル依存性凝集形成の度合を評価する
ことによって決定できる。
【００１９】ＬＦＡ−１依存性凝集を干渉する試剤は該
試剤がエプスタイン−バールウィルス形質転換細胞の自
発またはホルボールエステル依存のいずれの凝集を抑制
するかどうかを測定し得るアッセイを用いることによっ
て同定できる。殆んどのエプスタイン−バールウィルス
形質転換細胞はこれら細胞がＬＦＡ−１レセプター分子
を発現し得る限りそのようなアッセイに用い得る。その
ような細胞は“Springer, T.A.等、J.Exper.Med. １６
０：１９０１−１９１８（１９８４）”の方法によって
調製できる。該文献は参考として本明細書に引用する。
任意のそのような細胞を本発明のＬＦＡ−１依存性結合
アッセイにおいて使用できるけれども、好ましいのはＪ
Ｙ細胞系の細胞を使用することである〔Terhost, C. T.
等、Proc.Natl.Acad. Sci. USA, ７３：９１０（１９
７６）〕。これらの細胞は任意の適当な培養培地で培養
できるが、最も好ましいのは１０％ウシ胎児血清および
５０μg ／mlのゲンタマイシン（ギブコラボラトリース
社、ニューヨーク）を加えたＲＭＰ１１６４０培地中で
細胞を培養することである。これらの細胞は動物細胞増
殖に適する条件（即ち、一般に３７℃の温度で、５％Ｃ
Ｏ2 の雰囲気中で、９５％の相対温度にてなど）下で培
養すべきである。
【００２０】２．ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１の結合 リンパ球がＬＦＡ−１レセプター分子の群を欠損するヒ
ト個人は同定されている〔Anderson, D. C. 等、Fed. P
roc. ４４：２６７１−２６７７（１９８５）：Anders
on, D. C. 等、J. Infect. Dis. １５２：６６８−６８
９（１９８５）〕。そのような人は白血球粘着欠損症
（ＬＡＤ）をこうむると云われている。そのような人の
ＥＢＶ形質転換細胞は上述の凝集アッセイにおいて自発
またはホルボールエステル存在下のいずれにおいても凝
集しない。そのような細胞をＬＦＡ−１発現性細胞と混
合したときは、凝集が観察される〔Rothlein, R.等、J.
Exper.Med. １６３：１１３２−１１４９（１９８
６）〕（図１）。重要なことは、これら凝集はこれらの
細胞を抗ＬＦＡ−１抗体の存在下でインキュベートした
場合には形成されなかったことである。即ち、凝集はＬ
ＦＡ−１を必要としたが、ＬＦＡ−１欠損細胞のＬＦＡ
−１含有細胞による凝集形成能力はＬＦＡ−１結合パー
トナーはＬＦＡ−１ではなくむしろ従来未発見の細胞間
粘着分子であったことを示唆していた。第１図は細胞間
粘着のメカニズムを示す。 Ｂ．細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１） 新規な細胞間粘着分子ＩＣＡＭ−１はRothlein, R.等の
手順〔J.Immunol. １３７：１２７０−１２７４（１９
８６）、該文献は参考として本明細書に引用する〕によ
って最初同定され部分的に特徴付された。ＩＣＡＭ−１
分子を検出するために、モノクローナル抗体をＬＦＡ−
１発現が遺伝的に欠損しているヒトの細胞で免疫したマ
ウスのひ臓細胞から調製した。得られた抗体をそのＬＦ
Ａ−１発現細胞の凝集を抑制する能力についてスクリー
ニングした（図２）。詳しくは、マウスをＬＦＡ−１抗
原を発現しないＬＡＤ患者からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞
で免疫した。これら動物からのひ臓細胞を取り出し、ミ
エローマ細胞と融合させてモノクローナル抗体産生性ハ
イブリドーマ細胞になるようにした。次に、ＬＦＡ−１
を発現する正常人からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を上記ハ
イブリドーマ細胞のモノクローナル抗体の存在下でイン
キュベートしてＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のホルボールエス
テル媒介、ＬＦＡ−１依存、自発性凝集を抑制し得る任
意のモノクローナル抗体を同定した。ハイブリドーマ細
胞はＬＦＡ−１抗原を全く含まない細胞から誘導したの
で、ＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体は産生され
なかった。従って、凝集を抑制することが判った抗体は
いずれも、ＬＦＡ−１ではないけれどもＬＦＡ−１粘着
過程にかかわっていた抗原に結合し得るものでなければ
ならない。そのようなモノクローナル抗体を取得する方
法はいずれも使用できるけれども、好ましいのはＢＡＬ
Ｂ／ＣマウスをRothlein, R.等、（J.Immunol.１３７：
１２７０−１２７４（１９８６））により開示された経
路およびスケジュールを用いてＬＦＡ−１欠損者からの
エプスタイン−バールウィルス形質転換末梢血単核細胞
でもって免疫することによってＩＣＡＭ−１結合性モノ
クローナル抗体を得ることである。そのような細胞はSp
ringer, T.A.等により開示されている〔J. Exper. Med.
１６０：１９０１−１９１８（１９８４）〕。
【００２１】ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体の産生およ
び検出のための好ましい方法においては、マウスはＩＣ
ＡＭ−１およびＬＦＡ−１の両方を発現するＥＢＶ形質
転換Ｂ細胞によりあるいはより好ましくはＩＣＡＭ−１
を発現するがＬＦＡ−１を発現しないＴＮＦ活性化内皮
細胞により免疫する。抗ＩＣＡＭ−１抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞を調製する最も好ましい方法において
は、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＪＹ細胞および特異化Ｕ９３
７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３）により順次免疫
する。そのような動物からのひ臓細胞を取り出しミエロ
ーマ細胞と融合させ抗体産生性ハイブリドーマ細胞に発
展させる。得られた抗体をそのＬＦＡ−１およびＩＣＡ
Ｍ−１の両方を発現するＪＹ細胞のようなＥＢＶ形質転
換細胞系のＬＦＡ−１依存、ホルボールエステル誘起凝
集を抑制する能力についてスクリーニングする。Rothle
in, R.等〔J.Immunol. １３７：１２７０−１２７４
（１９８７）〕により開示されているように、そのよう
な凝集を抑制し得る抗体をＳＫＷ3 〔Dustin, M.等、J.
Exper. Med. １６５：６７２−６９２（１９８７）、
ホルボールエステルの存在下で自発的に凝集するその能
力はＬＦＡ−１に結合し得る抗体によっては抑制される
が抗ＩＣＡＭ−１抗体によっては抑制されない〕のよう
な細胞系のホルボールエステル誘起凝集を抑制する能力
について試験する。ＪＹ細胞のような細胞のホルボール
エステル誘起凝集を抑制し得るがＳＫＷ3 のような細胞
のホルボールエステル誘起凝集を抑制し得ない抗体は恐
らく抗ＩＣＡＭ−１抗体である。また、ＩＣＡＭ−１に
結合し得る抗体は、ＬＦＡ−１発現性細胞（ＪＹ細胞の
ような）のＬＦＡ−１依存性凝集を抑制し得るがＬＦＡ
−１を発現するがＩＣＡＭ−１を殆んどまたは全く発現
しない細胞（正常顆粒状のような）に結合し得ない抗体
あるいはＩＣＡＭ−１を発現するがＬＦＡ−１を発現し
ない細胞（ＴＮＦ活性化内皮細胞のような）に結合し得
る抗体のスクリーニングによっても同定し得る。別の方
法はＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１または両方を発現する細
胞からＪＹ細胞のような細胞のＬＦＡ−１依存性凝集を
抑制する抗体を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫沈降さ
せることであり、あるいは等価の方法により抗体により
沈降した分子のいくつかの分子特性を測定する。その特
性がＩＣＡＭ−１の特性と同じであるならば、その抗体
は抗ＩＣＡＭ−１抗体であるとみなし得る。
【００２２】上述の方法で調製したモノクローナル抗体
を用いて、ＩＣＡＭ−１細胞表面分子を精製し特性付し
た。ＩＣＡＭ−１はヒト細胞または組織からモノクロー
ナル抗体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精
製した。そのような方法においては、ＩＣＡＭ−１と反
応性のモノクローナル抗体を不活性カラムマトリックス
に結合させる。そのような結合を行う任意の方法を使用
できるが、好ましいのは“Oettgen, H. C.等、J. Biol.
Chem. ２５９：１２０３４（１９８４）”の方法を用
いることである。細胞溶解物を上記マトリックスに通し
たとき、存在するＩＣＡＭ−１分子はマトリックスに吸
着され保存される。カラムのpHまたはイオン濃度を変え
ることにより、結合したＩＣＡＭ−１分子はカラムから
溶出し得る。任意の適当なマトリックスを使用できるけ
れども、好ましいのはマトリックス材料としてセファロ
ーズ（ファルマシア）を用いることである。カラムマト
リックスの作製およびそのたん白質精製での使用は当該
技術において周知である。
【００２３】当業者によって理解された方法において、
上述のアッセイ法を用いて細胞粘着の速度または程度を
減衰しあるいは抑制し得る化合物を同定することができ
る。ＩＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、ある
種の他の上皮細胞、および繊維芽球のような非造血細胞
上並びに組織マクロファージ、マイトジェン刺激Ｔリン
パ芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、
リンパ節、およびパイエル板のような造血細胞上に発現
した細胞表面糖たん白質である。ＩＣＡＭ−１はリンパ
節および反応性増殖を示すへん桃腺内のＴ細胞領域の血
管内皮細胞状に高度に発現される。ＩＣＡＭ−１は末梢
血リンパ球上に少量発現される。ある骨ずい単球細胞系
のホルボールエステル刺激特異化はＩＣＡＭ−１発現を
大きく増大させる。即ち、ＩＣＡＭ−１は炎症部位に優
先的に発現され静止状態の細胞には一般に発現されな
い。皮ふ繊維芽球上のＩＣＡＭ−１発現は１０μ／mlの
レベルのインターロイキン１またはガンアーインターフ
ェロンによりそれぞれ４時間または１０時間以上で３倍
〜５倍増大する。その誘発はたん白質およびｍＲＮＡ合
成に依存し可逆的である。
【００２４】ＩＣＡＭ−１は繊維芽球上での９７kd、骨
ずい単球細胞系上での１１４kd、およびＢリンパ芽球細
胞ＪＹ上での９０kdの分子量を有異なる細胞種での分子
量異種抗原性を示す。ＩＣＡＭ−１生合成は約７３kdの
細胞間ブレカーサーを含むことが判っている。ツニカマ
イシン処理から得られる非−Ｎ−グリコシル化形は分子
量５５kdを有する。ホルボールエステル刺激Ｕ９３７細
胞からあるいは繊維芽球細胞から単離したＩＣＡＭ−１
は化学脱グリコシル化後同一の主要生成物を与える。Ｉ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体はフィトヘマグルチニン
芽球のＬＦＡ−１欠損細胞系への粘着を干渉する。繊維
芽球のＩＣＡＭ−１に結合したモノクローナル抗体によ
る前処理（リンパ球は行わない）リンパ球−繊維芽球粘
着を抑制する。リンパ球のＬＦＡ−１に対する抗体によ
る前処理（繊維芽球は行なわない）もリンパ球−繊維芽
球粘着を抑制することが見い出されている。
【００２５】従って、ＩＣＡＭ−１は白血球上のＣＤ１
８複合体の結合性リガンドである。ＩＣＡＭ−１はＩＬ
−１、ガンマーインターフェロンおよび腫瘍壊死因子の
ような炎症メディエーターによりインビトロで繊維芽球
および内皮細胞上にインビボでの炎症領域中へのリンパ
球の浸潤と時間枠的に一致して誘起可能である〔Dusti
n, M.L.等、J.Immunol. １３７：２４５−２５４、
（１９８６）：Prober, J.S.等、J.Immunol. １３７：
１８９３−１８９６、（１９８６）〕。さらに、ＩＣＡ
Ｍ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、他の上皮細胞お
よび繊維芽球のような非造血細胞上にまた組織マクロフ
ァージ、マイトジェン刺激Ｔリンパ芽球、へん桃腺内の
胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、リンパ節およびパイエ
ル板のような造血細胞上にも発現される〔Dustin, M.L.
等、J.Immunol. １３７：２４５−２５４、（１９８
６）〕。ＩＣＡＭ−１はアレルギー性湿疹、扁平苔癬、
発疹、じんま疹および水疱性疾患のような良性炎症のケ
ラチノサイト上にも発現される。アレルギー性である患
者の皮ふへのハプテンの適用により誘発させたアレルギ
ー性皮ふ反応もケラチノサイト上に多量のＩＣＡＭ−１
発現を生じた。これに対して、皮ふ上の有毒パッチはケ
ラチノサイト上にＩＣＡＭ−１発現を生じなかった。Ｉ
ＣＡＭ−１は種々の皮ふ学上の不整からの皮ふ傷害の生
検からのケラチノサイト上に存在し、ＩＣＡＭ−１発現
はアレルギーパッチ試験からの傷害において誘発され毒
性パッチ試験傷害からのケラチノサイトはＩＣＡＭ−１
を発現しない。 ＩＣＡＭ−１は、従って、リンパ球が
付着できる細胞基質であり、その結果、リンパ球は炎症
部位に浸透し得および／またはこの炎症に貢献する各種
のエフェクター機能を伝達し得る。そのような機能には
抗体の産生、ウィルス感染ターゲット細胞の溶解等があ
る。本明細書で使用する“炎症”なる用語は特異的防御
系の反応のみを含むことを意味する。“特異的防御系”
なる用語は特異的抗原の存在と反応する免疫系の成分を
称するものとする。炎症は、特異的防御系の反応により
生じ、媒介されあるいはそれに伴う場合には、特異的防
御系の応答に由来するものといわれている。特異的防御
系の応答に由来する炎症の例には風疹ウィルス、自己免
疫疾患、Ｔ細胞によって仲介された遅延型過敏症（例え
ば、Mantaux 試験で“陽性”となる患者におけるよう
な）等がある。 Ｃ．ＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング 任意の多くの方法を用いてＩＣＡＭ−１遺伝子をクロー
ニングできる。そのような方法の１つはＩＣＡＭ−１遺
伝子を含有する挿入物の存在についてｃＤＮＡ挿入物の
シャトルベクターライブラリー（ＩＣＡＭ発現性細胞由
来の）を分析することである。そのような分析は細胞を
上記ベクターで移入し次いでＩＣＡＭ−１発現について
アッセイすることによって実施できる。この遺伝子をク
ローニングする好ましい方法はＩＣＡＭ−１分子のアミ
ノ酸配列を決定することが必要である。これを行うに
は、ＩＣＡＭ−１たん白質を精製して自動化シークエネ
ーターにより分析できる。また、分子は臭化シアンによ
りあるいはパパイン、キモトリプシンまたはトリプシン
のようなプロテアーゼによるようにして分解できる〔Oi
ke, Y.等、J. Biol. Chem. ２５７：９７５１−９７５
８（１９８２）；Liu,C.等、Int, J. Pept. Protein Re
s. ２１：２０９−２１５（１９８３）〕。ＩＣＡＭ−
１の全アミノ酸配列を決定できるけれども、好ましいの
は分子のペプチドフラグメントの配列を決定することで
ある。ペプチドが１０ヶのアミノ酸より長い場合、その
配列情報は一般にＩＣＡＭ−１の遺伝子のような遺伝子
をクローニングするのに十分である。
【００２６】ペプチド中のアミノ酸残基の配列は、普通
用いられている３文字表示または１文字表示を用いて本
明細書においても表示する。これら３文字および１文字
表示の目録は“Biochmistey, Lehninger, A., Worth Pu
blishers刊、ニューヨーク、（１９７０）”のような教
科書において見い出される。そのような配列を縦に書く
ときには、アミノ末端基は列の頂部にあるようにし、カ
ルボキシ末端基は列の底部にあるようにする。同様に、
横方向に書くときには、アミノ末端は左にあるように
し、カルボキシ末端は右末端にあるようにする。ペプチ
ド中のアミノ酸残基はハイホンによって分離できる。そ
のようなハイホンは単に配列の存在を容易にすることを
意図しているだけである。単なる例示としては、 −Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ− と表示したアミノ酸配列はＡｌａ残基がＧｌｙのカルボ
キシ基に結合していることおよびＳｅｒ残基がＡｌａ残
基のカルボキシ基およびＰｈｅ残基のアミノ基に結合し
ていることを示している。この表示はさらにアミノ酸配
列がテトラペプチド−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ
−を含有していることも示している。この表示はアミノ
酸配列をこの１つのテトラペプチドに限定するものでは
ないが、(1)アミノまたはカルボキシに結合した１種以上
のアミノ酸残基を有するテトラペプチド、(2) アミノお
よびカルボキシ末端の両方に結合した１種以上のアミノ
酸残基を有するテトラペプチド、(3) 追加のアミノ酸残
基を有していないテトラペプチドを包含するものとす
る。
【００２７】１種以上の適当なペプチドフラグメントが
シーケンシングされると、これらをコードし得るＤＮＡ
配列を検査する。遺伝子コードは縮重するので、１種以
上のコドンを用いて特定のアミノ酸をコードできる〔Wa
tson, J. D.,Molecular Biology of the Gene,第３版、
W. A. Benjamin社、カルホルニア メンローパーク、
（１９７７）、pp３５６−３５７〕。ペプチドフラグメ
ントを分析して最低度の縮重性を有するオリゴヌクレオ
チドによってコードされ得るアミノ酸配列を同定する。
これは好ましくは単一コドンのみによってコードされて
いるアミノ酸を含有する配列を同定することによって行
う。場合によっては、そのようなアミノ酸配列は単一オ
リゴヌクレオチドのみによってコードされ得るので、多
くの場合、そのアミノ酸配列は任意の１セット（組）の
同様なオリゴヌクレオチドによってコードされ得る。重
要なのは、上記セットのすべてのメンバーがそのペプチ
ドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオチドを含
有し、かくしてそのペプチドフラグメントをコードする
遺伝子として同じヌクレオチド配列を潜在的に含むのに
対し、上記のセットの１メンバーのみはこの遺伝子のヌ
クレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含むことで
ある。このメンバーは上記のセット内に存在し、上記セ
ットの他のメンバーの存在においてさえもＤＮＡにハイ
ブリッドし得るので、単一オリゴヌクレオチドを用いて
上記ペプチドをコードする遺伝子をクローニングするの
と同じ方法で分解していないオリゴヌクレオチドセット
を用いることができる。
【００２８】上述の方法と正確に同じ方法において、ペ
プチドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオチド
配列または配列セットに相補的であるヌクレオチド配列
を有するオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチ
ドのセット）を用い得る。ＩＣＡＭ−１遺伝子のフラグ
メントをコードし得る適当なオリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドのセット（またはそのようなオリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに相補性である
もの）を同定し（上述の手順を用いて）、ＤＮＡについ
て当該技術で周知の手段を用いて、好ましくはＩＣＡＭ
−１遺伝子配列を発現し得るヒト細胞由来のｃＤＮＡ調
製物により合成しハイブリッド化する。核酸ハイブリッ
ド化技術は Maniatis, T. 等、により“Molecular Clon
ing, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY（１
９８２）”において、またHaymes, B. D. 等により“Nu
cleic acid Hybrization, a Practical Approach,IRL P
ress 社、ワシントンD. C. （１９８５）”において開
示されており、これら文献は参考として本明細書に引用
する。使用するＤＮＡまたはｃＤＮＡ源は好ましくはＩ
ＣＡＭ−１配列に富む。そのような濃厚化はＩＣＡＭ−
１合成を誘起する条件下で培養された細胞（ホルボール
エステルの存在下で増殖させたＵ９３７等のような）か
らＲＮＡを抽出することによって得たｃＤＮＡから最も
容易になし得る。
【００２９】上述した方法のようなあるいは同様な方法
はヒト アルデヒド デヒドロゲナーゼの遺伝子〔Hsu,
L. C.等、Proc, Natl, Acad, Sci, USA ８２：３７７
１−３７７５（１９８５）〕、フィブロネクチン〔Suzu
ki, S.等、Eur.Mol, Biol, Organ, J. ４：２５１９−
２５２４（１９８５）〕、ヒト エストロゲン レセプ
ス−遺伝子〔Walter, P.等、Proc, Natl, Acad, Sci, U
SA ８２：７８８９−７８９３（１９８５）〕、組織型
プラスミノーゲン アクチベーター〔Pennica,D. 等、N
ature ３０１：２１４−２２１（１９８３）〕および
ヒト胎盤アルカリ ホスファターゼ相補ＤＮＡ〔Kam,
W. 等、Proc, Natl, Acad, Sci, USA ８２：８７１５
−８７１９（１９８５）〕のクローニングを可能にして
いる。ＩＣＡＭ−１遺伝子をクローニングする別の好ま
しい方法においては、発現ベクターのライブラリーをＩ
ＣＡＭ−１を発現ベクター中に発現できる細胞からＤＮ
Ａまたは好ましくはｃＤＮＡをクローニングすることに
よって調製する。このライブラリーを次いで抗ＩＣＡＭ
−１抗体に結合しＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−１フラ
グメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードし得るヌクレオチド配列を有するたん白質を発現し
得るメンバーについてスクリーニングする。
【００３０】上記方法により得られるクローニングＩＣ
ＡＭ−１遺伝子は操作によって発現ベクターに結合させ
バクテリアまたは真核生物細胞に組み込んでＩＣＡＭ−
１たん白質を産生させる。そのような操作技術はManiat
is, T.等（前出）により開示され、当該技術において周
知である。 Ｄ．ＬＦＡ−１依存性凝集のアッセイの使用 ＬＦＡ−１依存性凝集を測定し得る前述のアッセイを用
いてＬＦＡ−１依存性凝集の度合を抑制するアンタゴニ
ストとして作用する試剤を同定できる。そのようなアン
タゴニストは凝集に関係するＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ
−１の能力を付与することによって作用し得る。即ち、
そのような試剤はＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１に結合
し得る抗体のような免疫グロブリンを包含する。さら
に、非免疫グロブリン（即ち、化学）剤も、上記アッセ
イを用いてこれらがＬＦＡ−１凝集のアンタゴニストで
あるかどうかを決定し得る。 Ｅ．ＩＣＡＭ−１レセプターたん白質に結合し得る抗体
の使用 １．抗炎症剤 ＣＤ18複合体の各１員に対するモノクローナル抗体は内
皮への結合〔Haskard,D.等、J.Immunol. １３７：２９
０１−２９０６（１９８６）〕、ホモタイプ粘着〔Roth
lein, R.等、J. Exp. Med. １６３：１１３２−１１４
９（１９８６）〕リンパ球の抗原およびマイトジェン誘
起増殖〔Davigon, D. 等、Proc, Natl,Acad,Sci,USA
７８：４５３５−４５３９（１９８１）〕、抗体形成
〔Fisher,A.等、J.Immunol. １３６：３１９８−３２
０３（１９８６）〕、および細胞毒性Ｔ細胞〔Krensky,
A. M.等、J.Immunol. １３２：２１８０−２１８２
（１９８４）〕、マクロファージ〔strassman, G. 等、
J.Immunol. １３６：４３２８−４３３３（１９８
６）〕、および抗体依存性細胞毒反応に含まれるすべて
の細胞〔Kohi, S.等、J.Immunol. １３３：２９７２−
２９７８（１９８４）〕の溶解活性のようなすべての白
血球のエフェクター機能を包含する白血球の多くの粘着
依存性機能を抑制する。これら機能のすべてにおいて、
上記抗体は白血球の適当な細胞基質への粘着能力（ここ
の能力は最終結果を抑制する）を抑制する。
【００３１】前述したように、ＩＣＡＭ−１分子のＬＦ
Ａ−１群分子の１員への結合は細胞粘着において極めて
重要である。粘着の過程において、リンパ球は外来抗原
の存在について動物を連続的にモニターし得るものであ
る。これらの過程は通常は望ましいものであるけれど
も、これらの過程はまた臓器移植拒絶、組織移植拒絶、
および多くの自己免疫疾患の原因でもある。従って、細
胞粘着を減衰または抑制できる何らかの手段が臓器移
植、組織移植または自己免疫患者の受け入れ者に大いに
望まれている。ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナ
ル抗体は哺乳動物の抗炎症剤として極めて適している。
明らかに、そのような薬剤は粘着を選択的に抑制でき通
常の薬剤で見い出し得るネフロ毒性のような他の副作用
を示さない点で一般の抗炎症剤と異なっている。従っ
て、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を用
いて哺乳動物においてそのような副作用の恐れなしに臓
器または組織の拒絶反応を防止しあるいは自己免疫応答
を修正できる。
【００３２】重要なことは、ＩＣＡＭ−１を認識し得る
モノクローナル抗体の使用はＨＬＡ不均衡を有する個々
人間においてさえも臓器移植を行うことができるという
ことである。 ２．遅延型過敏反応のサブレッサー ＩＣＡＭ−１分子は殆んど遅延型過敏反応に含まれる部
位のような炎症部位に発現するので、ＩＣＡＭ−１分子
に結合し得る抗体（特にモノクローナル抗体）はそのよ
うな反応の減衰または排除において治療的潜在力を有す
る。この潜在的治療用途は２つの方法のいずれかで活用
できる。第１は、ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル
抗体を含有する組成物を遅延型過敏反応を呈する患者に
投与できる。例えば、そのような組成物は毒キツダ、毒
オーク等の抗原と接触した人に投与できるであろう。第
２の態様においては、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノク
ローナル抗体を抗原と共に患者に投与してその後の炎症
反応を防止する。即ち、抗原とＩＣＡＭ−１結合性モノ
クローナル抗体との共投与は人をその後の上記抗原の出
現を一時的に許容し得る。
【００３３】３．慢性炎症疾患の治療 ＬＦＡ−１を欠損するＬＡＤ患者は炎症応答を示さない
ので、ＬＦＡ−１の天然リガンド、ＩＣＡＭ−１の拮抗
作用もまた炎症応答を抑制するものと信じている。ＩＣ
ＡＭ−１に対する抗体の炎症を抑制する能力は円板状エ
リスマトーデス、自己免疫甲状腺炎、実験的アレルギー
性脳脊ずい炎（ＥＡＥ）、多発性硬化症、糖尿病レイナ
ード症候群のある態様、リウマチ様関節炎等の慢性炎症
および自己免疫疾患の治療における治療用途の基本を与
える。一般に、ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナ
ル抗体はステロイド療法により現在治療可能な疾患の治
療に用い得る。 ４．診断および判定的用途 ＩＣＡＭ−１は殆んど炎症部分に発現するので、ＩＣＡ
Ｍ−１に結合し得るモノクローナル抗体は患者の感染お
よび炎症部位を画像化または可視化する手段として使用
できる。そのような用途おいては、モノクローナル抗体
はラジオアイソトープ、アフィニティラベル（ビオチ
ン、アビジン等のような）、蛍光ラベル、常磁性原子等
の使用により検出可能に標識化する。そのような標識化
を行う手順は当該技術において周知である。画像診断に
おける抗体の臨床的応用は“Grossman, H. B., Urol, C
lin, North Amer. １３：４６５−４７４（１９８
６）”、“Unger, E. C.等、Invest, Radiol, ２０：
６９３−７００（１９８５）”および“Khaw, B. A.
等、Science ２０９：２９５−２９７（１９８０）”
により検討されている。
【００３４】炎症の存在はまたＩＣＡＭ−１を発現する
細胞のＩＣＡＭ−１遺伝子配列にまたはＩＣＡＭ−１ｍ
ＲＮＡ配列に結合するｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡ
のような結合性リガンドの使用によっても検出できる。
そのようなハイブリッド化アッセイを行う技術は Mania
tais, T.（前出）によって開示されている。そのような
検出可能に標識した抗体の病巣の検出は炎症または腫瘍
発現部位を示し得る。１つの実施態様においては、この
炎症検査は組織または血液のサンプルを取り出しそのよ
うなサンプルを上記検出可能に標識した抗体の存在下に
インキュベートすることによって行う。好ましい実施態
様においては、この方法を磁性画像診断、フルオログラ
フィ等を用いて非侵略的方法で行う。そのような診断試
験は臓器移植受け入れ者を潜在的な組織拒絶の早期発見
のためにモニターするのに用い得る。そのようなアッセ
イはまたリウマチ様関節炎または他の慢性炎症疾患に対
する個々人の対応を決定するにも実施し得る。
【００３５】５．治療または診断目的で投与する抗原物
質の導入の補佐 例えば、ウシインシュリン、インターフェロン、組織型
プラズミノーゲンアクチベーターまたはマウスモノクロ
ーナル抗体のような治療または診断剤への免疫応答はそ
のような薬剤の治療または診断価値を実質的に減少さ
せ、実際に、血清病のような疾患を生ずる。そのような
事情は抗体を用いて改善できる。この実施態様において
は、そのような抗体を治療剤または診断剤と組合せて投
与する。抗体の添加は受け入れ者を上記薬剤の認識から
防止し、従って、受け入れ者が薬剤に対する免疫応答を
開始するのを防止する。そのような免疫応答がないこと
は患者の治療剤または診断剤の追加の投与を受け入れる
能力をもたらす。 Ｆ．細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）の使用 ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の結合パートナーである。か
くして、ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体は患者の
治療においてＬＦＡ−１に結合し得る抗体と相互変化的
に使用できる。即ち、可溶化形において、そのような分
子は炎症、臓器拒絶、移植拒絶等を抑制するのに用い得
る。ＩＣＡＭ−１またはその官能性誘導体は抗ＩＣＡＭ
抗体と同じ方法で用いて治療剤または診断剤の免疫原性
を減少させ得る。
【００３６】ＩＣＡＭ−１、その官能性誘導体、および
そのアンタゴニストを用いて表面上にＩＣＡＭ−１また
はＬＦＡ−１を発現する腫瘍細胞の転移または増殖をブ
ロックし得る。種々の方法がそのような目的を達成する
のに用い得る。例えば、造血細胞の浸透はＬＦＡ−１−
ＩＣＡＭ−１結合を必要とする。従って、そのような結
合のアンタゴニストは上記の浸透を抑制し白血球由来の
腫瘍細胞の転移をブロックする。また、ＩＣＡＭ−１ま
たはＬＦＡ−１群分子の１員に結合し得る毒素誘導分子
も患者に投与し得る。そのような毒素誘導分子がＩＣＡ
Ｍ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員と結合する場合、
毒素の存在が腫瘍細胞を殺しそれによって腫瘍の増殖を
抑制する。 Ｇ．ＩＣＡＭ−１依存性粘着の非免疫グロブリンアンタ
ゴニストの使用 ＩＣＡＭ−１依存性粘着はＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−
１に結合し得る非免疫グロブリンアンタゴニストにより
抑制し得る。ＬＦＡ−１の非免疫グロブリンアンタゴニ
ストの１つの例はＬＦＡ−１である。ＬＦＡ−１に結合
する非免疫グロブリンアンタゴニストの例はＩＣＡＭ−
１である。前述のアッセイを使用することによって、追
加の非免疫グロブリンアンタゴニストを同定し精製でき
る。ＩＣＡＭ−１依存粘着の非免疫グロブリンアンタゴ
ニストはＬＦＡ−１に対する抗体またはＩＣＡＭ−１に
対する抗体と同じ目的で使用できる。 Ｈ．本発明の組成物の投与 ＩＣＡＭ−１の治療効果は患者に全ＩＣＡＭ−１または
その任意の治療上活性なペプチドフラグメントを投与す
ることによって得られる。
【００３７】ＩＣＡＭ−１およびその官能性誘導体は組
換えＤＮＡを用いて合成的にあるいはたん白質分解によ
り取得できる。ＩＣＡＭ−１の治療上の利点は追加のア
ミノ酸残基を有してキャリヤーに対する結合性を改善し
あるいはＩＣＡＭ−１の活性を改善したＩＣＡＭ−１の
官能性誘導体の使用により増強され得る。さらにある種
のアミノ酸残基を欠損しあるいは別のアミノ酸残基を含
むＩＣＡＭ−１の官能性誘導体もそのような誘導体が細
胞粘着に作用する能力を示す限り包含するものとする。
抗体およびＩＣＡＭ−１分子は、これらを含有する調製
物がこれらの生成物と共に通常天然に見出される物質を
実質的に含まない場合、“天然不純物を実質的に含まな
い”といえる。
【００３８】ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体およびその
生物学的活性を有するフラグメント（ポリクローナルま
たはモノクローナル）にも及ぶ。患者にＩＣＡＭ−１に
結合し得る抗体またはそのフラグメントを投与するに
は、あるいは、ＩＣＡＭ−１（またはそのフラグメン
ト、変異体または誘導体）を患者に投与するには、その
投与量は患者の年令、体重、身長、性別、一般的医療条
件、病歴等のファクターによる。一般には、患者に約１
Pg／kg〜１０mg／kg（患者体重）の範囲の抗体投与量で
投与することが望ましいが、それより低量または高量の
投与量も投与できる。ＩＣＡＭ−１分子またはその官能
性誘導体を患者に投与するときは、同じく約１Pg／kg〜
１０mg／kg（患者の体重基準）の範囲の投与量でそのよ
うな分子を投与することが好ましいが、それより低量ま
たは高量の投与量も使用できる。後述するように、上記
の有効投与量は抗ＩＣＡＭ−１抗体を抗ＬＡＭ−１投与
と共投与する場合は少なくすることができる。２種の抗
体（またはその官能性誘導体）はこれらがこれら両化合
物を患者血清中に検出できるような時間条件で投与され
る場合において患者に共投与できると云える。
【００３９】ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体及びＩＣＡ
Ｍ−１自体の両者は患者に静注、筋注、皮下、腸内また
は非経口的に投与できる。抗体またはＩＣＡＭ−１を注
射により投与するときは、投与は連続注入によりあるい
は１回または多数回ボーラスにより行い得る。抗炎症剤
は炎症を抑制するのに十分な量で受け入れ対象体に投与
するものである。その量は、薬剤の投与量、投与経路等
が炎症を減衰させあるいは防止するに十分である場合に
おいて炎症を“抑制”するに十分であると云える。抗炎
症剤は炎症の発症前（予想される炎症を抑制するため
に）または炎症発症後のいずれにおいても投与できる。
組成物はその投与が受け入れ患者に許容される場合に
“薬学上受け入れ可能である。”と云える。そのような
薬剤はその投与量が生理学上有意である場合に“治療上
有効な量”で投与されると云える。薬剤はその存在が受
け入れ患者の生理に検知可能な変化をもたらす場合に生
理学上有意である。抗体およびＩＣＡＭ−１分子は薬学
上有用な組成物を調製する公知の方法によって処方で
き、それによってこれらの物質またはその官能性誘導体
を薬学上許容できるキャリヤーベヒクルと混合物として
組合せ得る。適当なベヒクルおよびその調製物（例え
ば、他のヒトたん白質、例えば、ヒト血清アルブミンを
含む）は、例えば、“Remington's Pharmaceutical Sci
ences （第１６版、Dsol, A.編、マーク イーストン
（ＰＡ）、（１９８０）”に記載されている。有効な投
与に適する薬学上許容し得る組成物を調製するために
は、そのような組成物は適当量のキャリヤーベヒクルと
共に有効量の抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩＣＡＭ分子、
またはその官能性誘導体を含有する。
【００４０】追加の薬学的方法を用いて活性の持続を制
御することができる。制御放出性製剤は抗ＩＣＡＭ−１
抗体またはＩＣＡＭ−１、またはこれらの官能性誘導体
を複合体化しあるいは吸収するポリマーを使用すること
によって得ることができる。制御された伝達は適当なマ
クロ分子（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリ
ビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセル
ロース、カルボキシメチルセルロース、またはプロタミ
ン硫酸塩）および該マクロ分子の濃度並びに放出を制御
するための混入方法を選択することによって達成でき
る。制御放出製剤により活性持続を制御するもう１つの
可能性ある方法は抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩＣＡＭ−
１分子、またはこれらの官能性誘導体をポリエステル、
ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリラクトン酸またはエチ
レン−酢酸ビニルコポリマーのような高分子物質の粒子
に混入させることである。また、これら薬剤を高分子粒
子に混入させる代りに、これらの薬剤を例えばコアセル
ベーション法によりあるいは界面重合法により調製した
マイクロカプセル例えばヒドロキシメチルセルロースま
たはゼラチンマイクロカプセルおよび（メチルメタクリ
レート）マイクロカプセル中に、あるいはコロイド状薬
物伝達系例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェ
ア、マイクロエマルジョン、ナノパーティクル、ナノカ
プセルまたはマクロエマルジョン中に内包させることも
可能である。そのような方法も“Remington's Pharmace
utical Sciences （１９８０）”中に記載されている。
【００４１】
【実施例】これまで本発明を一般的に説明して来たが、
以下の実施例は本発明をより容易に理解できるであろ
う。これらの実施例は例示を目的とするものであり本発
明を限定するものではない。 実施例１ 動物細胞の培養 一般に、本発明のＥＢＶ形質転換およびハイブリドーマ
各細胞は２０ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／mlのジ
ェンタマイシン、および１０％のウシ胎児血清を加えた
ＲＭＰＩ１６４０培地中に保存した。細胞は３７℃で、
５％ＣＯZ 、９５％湿度雰囲気下で培養した。
【００４２】エプタタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）
形質転換体を確立するために、２０％ウシ胎児血清（Ｆ
ＣＳ）および５０μｇ／mlのジェンタマイシンを加えた
ＲＰＭＩ１６４０培地中の１０6 個のＴ細胞放血末梢単
核細胞／mlを１６時間Ｂ９５−８細胞のＥＢＶ含有上清
でインキュベートした〔Thorley-Lawson, D. A. 等、J.
Exper. Med. １４６：４９５（１９７７）〕。0.２ml
中細胞アリコートを１０マイクロタイターウェルに入れ
た。培地をＲＰＭＩ１６４０培地（２０％ウシ胎児血清
および５０μm ／ｌジンタマイシンを加えた）で細胞増
殖がみられるまで置換えた。細胞は殆んどウェルで増殖
し同じ培地中に拡った。フィトヘマグルチニン（ＰＨ
Ａ）芽球を１：８００希釈ＰＨＡ−Ｐ（Difco Laborato
ries社、デトロイト、ＭＩ）を含有するＲＰＭＩ１６４
０培地（２０％ウシ胎児血清）中106 細胞／mlで確立し
た。ＰＨＡ系はインターロイキン２（ＩＬ−２）調整培
地で拡がりＰＨＡにより弱く脈動した〔Cantrell,D.A.
等、J. Exper. Med. １５８：１８９５（１９８
３）〕。上記手順は“Springer, T.等、J. Exper. Med.
１６０：１９０１−１９１８（１９８４）”により開
示されており、その記載は参考として本明細書に引用す
る。上記手順で得た細胞を次いで抗ＬＦＡ−１抗体でス
クリーニングしてこれらがＬＦＡ−１抗原を発現するか
どうかを決定した。そのような抗体は“Sanchey-Madri
d, F.等、J. Exper. Med. １５８：１７８５（１９８
３）”に開示されている。
【００４３】実施例２ 細胞凝集および粘着のアッセイ 細胞粘着の度合を評価するために、凝集アッセイを用い
た。かかるアッセイに用いた細胞系は５ｍＭのHepes バ
ッファー（Sigma Chemical社、セントルイス）を含有す
るＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し２×１０6 細胞／
mlの濃度に再懸濁させた。平底９６ウェルマイクロタイ
タープレート(No.３５９６；Coastar 社、ケンブリッ
ジ、ＭＡ）に５０μl の適当なモノクローナル抗体上
清、５０μlの精製モノクローナル抗体を含むまたは含
まない完全培地、５０μl の２００ng／mlホルボールエ
ステルホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）含
有完全培地および１００μl の完全培地中２×１０6 細
胞／ml濃度の細胞を加えた。細胞を自然に沈降させ、凝
集度を各時点で計数した。度数は０〜５+ の範囲にあっ
た。ここで０は密集中に本質的に細胞がないことを示
し；１+ は１０％以下の細胞が凝集物中にあり；２+ は
５０％以下の細胞が凝集していることを示し；３+は１
００％までの細胞が小さいゆるやかな密集中にあったこ
とを示し；４+ は１００％までの細胞が大密集中に凝集
したことを示し；５+ は１００％の細胞が大きい極めて
密な凝集物中にあったことを示す。細胞粘着のより定量
的な評価を得るために、試剤および細胞を上記と同じ順
序で５mlポリスチレンチューブに加えた。チューブを３
７℃でグリラトリーシェーカー上の台中に置いた。約２
００rpm で１時間後に、１０μl の細胞懸濁液をヘモサ
イトメーター中に入れ遊離細胞の数を定量した。％凝集
を次の等式によって決定した。 ％凝集＝１００×（１−遊離細胞の数／入れた細胞の
数） 上記等式中の入れた細胞の数はインキュベートしていな
い細胞と完全培地のみを含有するコントロールチューブ
中のml当りの細胞数である。上記等式中の遊離細胞の数
は試験チューブからのml当りの非凝集細胞の数に等し
い。上記の手順は“Rothlein, R.等、J. Exper. Med.
１６３：１１３２−１１４９（１９８６）”によって開
示されている。
【００４４】実施例３ ＬＦＡ−１依存性凝集 実施例２で記載した定量的凝集アッセイをエプスタイン
−バールウィルス形質転換細胞系ＪＹを用いて行った。
マイクロタイター中の培地にＰＭＡを加えて、細胞凝集
を観察した。時間経過ビデオ記録計はマイクロタイター
ウェル底部のＪＹ細胞が動いており活性な膜波動および
仮足運動を示していた。隣接細胞の仮足間の接触はしば
しば細胞−細胞粘着をもたらした。粘着が持続した場
合、細胞接触領域は尾脚（uropod) に移動した。接触は
激しい細胞運動および双対方向への細胞の引っ張り合い
にも依らず維持できた。ＰＭＡ処理および未処理細胞間
の主な違いは１度形成された上記接触の安定性において
現われていた。ＰＭＡにおいては、細胞密集が出現し、
その周りに粘着した追加の細胞として粒度の成長があっ
た。
【００４５】粘着を測定する第２の手段としては、実施
例２で記載した定量的アッセイを用いた。細胞懸濁液を
２時間、２００rpm で振り、ヘモサイトメーターに移
し、凝集物中に含まれない細胞を計数した。ＰＭＡの不
存在では、４２％（ＳＤ＝２０％、Ｎ＝６）のＪＹ細胞
が２時間後、凝集物中にあったが、５０μg ／mlのＰＨ
Ａと共に同じ条件下でインキュベートしたＪＹ細胞は凝
集物中に８７％（ＳＤ＝８％、Ｎ＝６）の細胞を有して
いた。凝集の動力学的検討はＰＭＡがすべての試験時間
で凝集速度および強度を促進していることを示した（図
３）。 実施例４ 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体を用いての細胞の凝集
抑制 ＰＭＡ誘起細胞凝集への抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗
体の効果を試験するために、そのような抗体を実施例２
の定量凝集アッセイに従ってインキュベートした細胞に
加えた。このモノクローナル抗体はＰＭＡの存在または
不存在下のいずれにおいても細胞凝集の形成を抑制して
いることが判った。ＬＦＡ−１のアルファー鎖に対する
モノクローナル抗体のF(ab')2 および Fab' フラグメン
トの２つは細胞凝集を抑制できた。一方、本質的に１０
０％の細胞が抗ＬＦＡ−１抗体の不存在下では凝集を形
成し、抗体を加えたときは２０％以下の細胞が凝集物中
に見い出された。この実験の結果は Rothlein, R等によ
り開示された〔J. Exper.Med. １６３：１１３２−１
１４９（１９８６）〕。
【００４６】実施例５ 細胞凝集はＬＦＡ−１レセプターを必要とするＥＢＶ形
質転換リンパ芽球細胞を実施例１で記載した方法により
患者から調製した。この細胞をＬＦＡ−１を認識し得る
モノクローナル抗体に対してスクリーニングし、細胞が
ＬＦＡ−１欠損であることを見い出した。実施例２で記
載した定量凝集アッセイを上記ＬＦＡ−１欠損細胞を用
いて行った。この細胞はＰＭＡの存在においても自発的
に凝集しなかった。 実施例６ ＩＣＡＭ−１の発見 実施例５のＬＦＡ−１欠損細胞をカルボキシフルオレス
セインジアセテートで標識した〔Patarroyo, M. 等、Ce
ll. Immunol. ６３：２３７−２４８（１９８１）〕。
標識細胞を同原またはＪＹ細胞と１：１０の比で混合し
凝集物中のフルオレスセイン標識細胞の割合を“Rothle
in, R.等、J. Exper. Med. １６３：１１３２−１１４
９（１９８６）”の方法に従って測定した。ＬＦＡ−１
欠損細胞はＬＦＡ−１発現性細胞と共凝集し得ることを
見い出した（第４図）。
【００４７】ＬＦＡ−１が凝集形成またはその維持にの
みに重要であるかどうかを決定するために、ＬＦＡ−１
に結合し得る抗体を上記の前以って形成させた凝集に加
えた。抗体の添加は上記の前以って形成させた凝集を強
く分裂させることが判った。時間経過ビデオ記録計は前
以って形成させた凝集へのモノクローナル抗体の添加が
２時間以内で分裂を生じ始めることを示した（表１）。
ＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体の添加後、凝集
中の個々の細胞の促足運動および形状変化は変らないま
ま続いた。個々の細胞は凝集物の周囲から次第に解離
し、８時間までに細胞は殆んど分散した。ビデオ時間経
過によれば、ＬＦＡ−１モノクローナル抗体による前以
って形成させた凝集の分裂は時間を逆のぼって行ったＬ
ＦＡ−１モノクローナル抗体の不存在下での凝集過程と
等価であった。
【００４８】
【表１】 表 １ 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体の前以って形成 させたＰＭＡ誘起ＪＹ細胞凝集物の分裂能力 凝 集 点 数 １８ｈ 実験 ２ｈa ─────────────── −ｍＡｂ ＋ｍＡｂ １ ４+ ４+ １+b ２ ３+ ４+ １+c ３ ５+ ５+ １+d ───────────────────────────────── 定量マイクロタイタープレート中の凝集を観察的に計数した。アッセイ時間全 体を通じて存在した抗ＬＦＡ−１においては、凝集は１+ 以下であった。a モノクローナル抗体添加２時間直前の凝集量b ＴＳ１／１８＋ＴＳ１／２２c ＴＳ１／１８d ＴＳ１／２２ 実施例７ ＬＦＡ−１依存性凝集における２価イオンの必要性 細胞毒性Ｔ細胞とターゲット間のＬＦＡ−１依存性粘着
はマグネシウムの存在を必要とする〔Martz, E., J. Ce
ll. Biol. ８４：５８４、５９８（１９８０）〕。Ｐ
ＭＡ誘起ＪＹ細胞凝集を２価カチオン依存性について試
験した。ＪＹ細胞はカルシウムまたはマグネシウムイオ
ンを含まない培地中では凝集しなかった（実施例２のア
ッセイを用いて）。２価マグネシウムの添加は0.３ｍＭ
程の低い濃度で凝集を行った。カルシウムイオン単独の
添加は殆んど効果がなかった。しかしながら、カルシウ
ムイオンはマグネシウムイオンのＰＭＡ誘起凝集を補佐
する能力を増強することが判った。1.２５ｍＭのカルシ
ウムイオンを培地に加えたときは、0.０２ｍＭ程の低い
マグネシウムイオン濃度で凝集を補佐することが判っ
た。これらのデータは細胞のＬＦＡ−１依存性凝集がマ
グネシウムイオンを必要とすること、およびカルシウム
イオンがそれ自体は不十分であるけれどもマグネシウム
イオンと共に凝集を増大させることを示している。
【００４９】実施例８ 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体を発現し得るハイブ
リドーマ細胞の単離 ＩＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を“Roth
lein, R.等、J.Immunol. １３７：１２７０−１２７４
（１９８６）”の方法に従って単離した。該文献は参考
として本明細書に引用する。即ち、３匹のＢＡＬＢ／Ｃ
マウスをＬＦＡ−１欠損患者からのＥＢＶ形質転換末梢
血単核細胞で腹腔内免疫した（〔Springer, T.A.等、J.
Exper. Med.１６０：１９０１（１９８４））。１mlRP
ML１６４０培地中約１０7 個の細胞を各免疫に用いた。
免疫はひ臓細胞をマウスから取り出す前の４５日、２９
日および４日で行い所望のハイブリドーマ細胞系を産生
させた。ひ臓細胞の取り出し前３日に、マウスに追加の
0.１５ml培地中１０7 細胞を投与した（静注）。
【００５０】上記の動物からの単離ひ臓細胞をＰ３×７
３Ａｇ8.６５３ミエローマ細胞と４：１の比率で“Galf
re, G.等、Nature ２６６：５５０（１９７７）”のプ
ロトコールに従って融合させた。得られたハイブリドー
マ細胞の各アリコートを９６ウェルマイクロタイタープ
レートに入れた。各ハイブリドーマ上清を凝集について
スクリーニングし、１つの抑制ハイブリドーマ（１００
以上のウェル試験のうちから）をクローニングし限定稀
釈によりサブクローニングした。このサブクローンはＲ
Ｐ１／1.1.1.と表示した（以後“ＲＰ１／１”と表示す
る）。モノクローナル抗体ＲＰ１／１はＬＦＡ−１発現
性細胞系ＪＹのＰＭＡ刺激凝集を一貫して抑制すること
を見い出した。ＲＲ１／１モノクローナル抗体はいくつ
かのＬＦＡ−１αまたはβサブユニットに対するモノク
ローナル抗体よりも等価かわずかに小さく凝集を抑制し
た。これに対し、コントロールのＨＬＡに対するモノク
ローナル抗体（これはＪＹ細胞上に多量に発現する）は
凝集を抑制しなかった。モノクローナル抗体ＲＰ１／１
と結合した抗原は細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）
と定義する。
【００５１】実施例９ ＩＣＡＭ−１を特性化するための抗ＩＣＡＭ−１モノク
ローナル抗体の使用 ＩＣＡＭ−１の性質を限定するために、特にＩＣＡＭ−
１がＬＦＡ−１と異なるかどうかを決定するために、細
胞たん白質をモノクローナル抗体ＲＰ１／１を用いて免
疫沈降させた。免疫沈降は“Rothlein, R.等の方法に従
って行った〔J.Immunol. １３７：１２７０−１２７４
（１９８６）〕。ＪＹ細胞を新たに１ｍＭフェニルメチ
ルスルホニルフルオライド、0.２単位／mlのトリプシン
インヒビターアプロチニンを加えた１％トリトンＸ−１
００、0.１４ｍのNaCl、１０ｍＭのトリス、pH8.０（溶
解バッファー）中で５×１０7 細胞／mlで２０分間、４
℃で溶解させた。溶解物を１0,０００xgで１０分間遠心
しＣＮＢｒ活性化グリシン抑制セファローズＣ１−４Ｂ
の５０％懸濁液５０mlで１時間、４℃で前処理した。１
mlの溶解物をセファローズＣｌ−４Ｂに結合させたモノ
クローナル抗体（１mg／ml）の５０％懸濁液の２０μl
で４℃で一夜免疫沈降させた〔〔Springer,T.A.等、J.
Exper. Med.１６０：１９０１（１９８４）〕。セファ
ローズ結合モノクローナル抗体は“March, S. 等、の方
法に従って炭酸塩バッファー中のセファローズＣｌ−４
ＢのＣＮＢｒ活性化法を用いて調製した〔Anal. Bioche
m. ６０：１４９（１９７４）〕。洗浄した免疫沈降物
をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色に“Morrissey, J. H.
Anal. Biochem. １１７：３０７（１９８１）”の手順
に従って供した。
【００５２】ＳＤＳサンプルバッファー〔ＨＤ，M. K.
等、J. Biol.Chem. ２５８：６３６（１９８３）〕に
よる１００℃でのたん白質溶出後、各サンプルを半分に
分けて還元（図５Ａ）または非還元（図５Ｂ）の各条件
下で電気泳動（ＳＤＳ−８％ＰＡＧＥ）に供した。分子
量５０kdおよび２５kdを有するバンドはモノクローナル
抗体セファローズからの免疫グロブリンの長鎖および短
鎖に相当した（図５Ａ、レーン３）。２５〜５０kd分子
量範囲の可変量の他のバンドも観察したが、ヘアリー白
血病細胞からの沈降中では見られず、この白血病細胞は
９０kd分子量バンドのみを与えた。ＬＦＡ−１の１７７
kdαサブユニットおよび９５kdβサブユニットは還元
（図５Ａ、レーン２）および非還元（図５Ｂ、レーン
２）の両条件下でＩＣＡＭ−１とは異なって浸透した。
【００５３】ＰＨＡ−リンパ芽球凝集に対してのモノク
ローナル抗体ＲＰ１／１の効果を測定するために、実施
例２で記載した定量凝集アッセイを用いた。即ち、Ｔ細
胞芽球細胞をＰＨＡで４日間刺激し、十分に洗浄し、次
いでＩＬ−２状態調節培地の存在下に６日間培養した。
ＰＨＡはこの６日間培養で取り込まれ凝集アッセイに寄
与しなかった。異なるＴ細胞芽球調製物による３種のア
ッセイにおいて、ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体は一
貫して凝集を抑制した（表２）。
【００５４】
【表２】 表 ２ ＲＰ１／１モノクローナル抗体a によるＰＭＡ刺激ＰＨＡリンパ芽球 凝集の抑制 ────────────────────────────────── ％ ％ 実験 ＰＭＡ ＭＡｂ 凝集 抑制b ──────────────────────────────────── １c − 対照 ９ −− ＋ 〃 ５１ ０ ＋ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ ５８ −１４d ＋ ＬＦＡ−１アルファ ３１ ３９ ＋ ＩＣＡＭ−１ ３１ ３９ ２e − 対照 １０ −− ＋ 〃 ７８ ０ ＋ ＬＦＡ−１ベータ １７ ７８ ＋ ＩＣＡＭ−１ ５０ ３６ ３f − ----------- ７ ＋ 対照 ７０ ＋ ＨＬＡ−Ａ，Ｂ ８０ −１４ ＋ ＬＦＡ−３ ８３ −１９ ＋ ＬＦＡ−１アルファ ２ ９７ ＋ ＬＦＡ−１ベータ ３ ９６ ＋ ＩＣＡＭ−１ ３４ ５１ ──────────────────────────────────── a ５０ng／mlのＰＨＡで刺激したＰＨＡ誘起リンパ球の凝集は実施例２に記載 したようにして非凝集細胞の数を顕微鏡により計数することによって間接的に 定量した。b ＰＭＡおよびＸ６３モノクローナル抗体で処理した細胞に対する％抑制c 凝集はモノクローナル抗体およびＰＭＡの刺激的添加後１時間で測定した。 d 負の数は凝集の％促進を示す。e 凝集はモノクローナル抗体およびＰＭＡの刺激的添加後１時間で測定した。
【００５５】細胞は２００ＸＧで１分間でペレット化
し、３７℃で１５分間インキュベートし、ゆるやかに再
懸濁し、１００rpm で４５分間振とうした。f 細胞はＰＨＡで３７℃、４時間前処理した。モノク
ローナル抗体添加後、各チューブを３７℃で２０分間静
置インキュベートし、７５rpm で１００分間振とうさせ
た。ＬＦＡ−１モノクローナル抗体はＩＣＡＭ−１モノ
クローナル抗体よりも一貫して抑制的であり、一方ＨＬ
Ａ−Ａ、ＢおよびＬＦＡ−３モノクローナル抗体は効果
なしであった。これらの結果は試験したモノクローナル
抗体のうち、ＬＦＡ−１またはＩＣＡＭ−１に結合し得
るモノクローナル抗体のみが細胞粘着を抑制し得ること
を示している。
【００５６】実施例１０ ＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の調製免疫 Balb／ｃマウスをＲＰＭ１培地中の２×１０7 ＪＹ細胞
0.５mlで融合前の１０３日および２４日で腹腔内（i.
p.) 免疫した。融合前４日および３日に、マウスを0.５
mlのＲＰＭ１培地中のＰＭＡ分化Ｕ９３７細胞でi.p.免
疫した。Ｕ９３７細胞の分化 Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３）を１０％
のウシ胎児血清、１％グルタミンおよび５０mlの２ng／
mlホルボール−１２−ミリステートアセテート（ＰＭ
Ａ）含有ジエタマイシン（完全培地）を含むＲＰＭＩ中
５×１０5 ／mlで滅菌ポリプロピレン容器中でインキュ
ベートすることによって分化した。このインキュベーシ
ョンの第３日で、1/2 容量の培地を除去し新しいＰＭＨ
含有完全培地で置き換えた。４日目で、細胞を取り出
し、清浄して免疫用に調製した。
【００５７】融合 免疫マウスからのひ臓細胞をGalfre等に従ってＰ３×６
３Ag 8.６５３ミエローマ細胞と４：１の比で融合させ
た〔Nature ２６６：５５０（１９７７）〕。融合後、
細胞を９６ウェル平底マイクロタイタープレートに１０
5 ひ臓細胞／ウェルで入れた。抗ＩＣＡＭ−１陽性細胞の選択 １週間後、５０μl の上清を凝集用細胞系としてＪＹお
よびＳＫＷ−３の両方を用いて実施例２の定量凝集アッ
セイでスクリーニングした。ＪＹ細胞凝集を抑制するが
ＳＫＷ−３凝集は抑制しない上清からの細胞を選択し限
定稀釈を用いて２回クローニングした。
【００５８】この実験により、抗ＩＣＡＭ−１モノクロ
ーナル抗体を産生する３種のハイブリドーマ系の同定お
よびクローニングができた。これらのハイブリドーマ系
により産生した抗体は、それぞれ、IgG2a 、IgG2b およ
びIgM であった。IgG2a 抗ＩＣＡＭ−１抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞系は表示Ｒ６′５′Ｄ６′Ｅ９′Ｂ
２とした。この好ましいハイブリドーマ細胞系により産
生した抗体はＲ６′５′Ｄ６′Ｅ９′Ｂ２と表示した
（以下、“Ｒ６−５−Ｄ６”と称する）。ハイブリドー
マ細胞系Ｒ６′５′Ｄ６′Ｅ９′Ｂ２はアメリカンタイ
プカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に１９８７年１
０月３０日寄託し、番号ＡＴＣＣ ＨＢ９５８０を得
た。 実施例１１ ＩＣＡＭ−１の発現と規格化 ＩＣＡＭ−１発現を測定するために、ラジオイムノアッ
セイを行った。このアッセイにおいては、精製ＲＰ１／
１をイオドゲンを用いて１０μCi／μg の特定の活性に
ヨー素化した。内皮細胞を９６ウェルプレート中で増殖
させ各実験で述べたようにして処理した。各プレートを
直接氷上ではなく冷室に0.５〜１時間置くことによって
４℃に冷却した。各単一層を冷完全培地で３回洗浄し次
いで４℃で３０分間125I ＲＰ１／１でインキュベート
した。125I ＲＰ１／１の特異活性を未標識ＲＰ１／１
を用いて調整して本試験において用いる抗原密度範囲に
亘って直線状シグナルを得た。非特異結合を1,０００倍
過剰の未標識ＲＰ１／１の存在下で測定し総結合から差
引き特異性結合を得た。
【００５９】上述のラジオイムノアッセイを用いて測定
したＩＣＡＭ−１発現はヒトヘソ帯静脈内皮細胞（ＨＵ
ＶＥＣ）およびヒト伏状静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）上
でＩＬ−１、ＴＮＦ、ＬＰＳおよびＩＦＮガンマーによ
り増大する（表３）。伏状静脈内皮細胞は本試験におい
ては成人組織由来の培養大静脈内皮細胞中のヘソ帯静脈
内皮細胞からの結果を確認するために用いた。ＩＣＡＭ
−１の基礎的発現はヘソ帯静脈内皮細胞よりも伏状静脈
内皮細胞上で２倍高い。ヘソ帯静脈内皮細胞の組換えＩ
Ｌ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦへの露
出はＩＣＡＭ発現を１０〜２０倍増大させる。ＩＬ−１
アルファ、ＴＮＦおよびＬＰＳは最大効力インデューサ
ーであり、ＩＬ−１は重量基準および応答の飽和濃度で
は効力はそれより小さい。１００ng／mlでのＩＬ−１ベ
ータはＩＣＡＭ−１発現をＨＵＶＥＣ上で９倍、ＨＳＶ
ＥＣ上で7.３倍増大させ、半−最高増加は１５ng／mlで
起った。５０ng／mlのｒＴＮＦはＩＣＡＭ−１発現をＨ
ＵＶＥＣ上で１６倍、ＨＳＶＥＣ上で１１倍増大させ、
半−最高効果は0.５ng／mlであった。インターフェロン
ガンマーはＩＣＡＭ−１発現において１0,０００Ｕ／ml
でＨＵＶＥＣ上で5.２倍またはＨＳＶＥＣ上で3.５倍の
有意の増大を示した。１０μg ／mlでのＬＰＳの効果は
ｒＴＮＦの効果と強さにおいて同じようであった。これ
ら媒介物の対の組合せはＩＣＡＭ−１発現において追加
の効果または追加の効果よりもわずかに小さい効果をも
たらした（表３）。ｒＴＮＦとｒＩＬ−１ベータまたは
ｒＩＦＮガンマーとの交差滴定は次善または最善の濃度
での効果において共働作用を示さなかった。
【００６０】ＬＰＳは培地中でときどき見い出される基
準で内皮細胞上でのＩＣＡＭ−１発現を増大させたの
で、基礎的ＩＣＡＭ−１発現がＬＰＳに基づき得る可能
性を試験した。いくつかの血清バッチを試験したとき、
低エンドトキシン血清が２５％までの低ＩＣＡＭ−１基
礎発現を与えることを見い出した。ここで示した結果は
すべて低エンドトキシン血清中で増殖させた内皮細胞の
ものであった。しかしながら、ＬＰＳ中和性抗生物質ポ
リミキシンＢの１０μg ／mlでの添加はＩＣＡＭ−１発
現をわずかに追加の２５％に減少させた。ＩＬ−１また
はＴＮＦによる処理時のＩＣＡＭ−１発現の増大は１０
μg ／mlポリミキシンＢの存在によっては効果はなかっ
た。上記ポリミキシン濃度はこれらの調製物中で低エン
ドトキシン濃度として一貫させている。
【００６１】
【表３】 表 ３ 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体 条件（１６hr) 125Ｉ特異性結合（ＣＰＭ） ＨＵＶＥＣ ＨＳＶＥＣ 対 照 603±11 − 1132±31 − 100 ng/ml ｒＩＬ−１ベータ 5680±633 9X 8320±766 7.3x 50 ng/ml ｒＩＬ−１アルファ 9910±538 16X − − 50 ng/ml ｒＴＮＦアルファ 9650±1500 16X 12690±657 11.2x 10 μg/ml ＬＰＳ 9530±512 16X 10459±388 9.2x 10 ng/ml ｒＩＦＮガンマー 3120±308 5.2x 4002±664 3.5x ｒＩＬ−１ベータ＋ｒＴＮＦ 1469±1410 24x 16269±660 14x ｒＩＬ−１ベータ＋ＬＰＳ 13986±761 23X 10870±805 10x ｒＩＬ−１ベータ＋ｒＩＮＦガンマー 7849±601 13X 8401±390 7.4x ｒＴＮＦ＋ＬＰＳ 15364±1241 24X 16141±1272 14x ｒＴＮＦ＋ｒＩＦＮガンマー 13480±1189 22X 13238±761 12x ＬＰＳ＋ＩＦＮガンマー 10206±320 17x 10987±668 10x ポリミキシンＢ（10μg/ml) 480±23 − − − ポリミキシンＢ＋ｒＩＬ−１ 5390±97 11X − − ポリミキシンＢ＋ｒＴＮＦ 9785±389 20X − − １μg ／mlＬＰＳ 7598±432 13X − − ポリミキシンＢ＋ＬＰＳ 510±44 1.1X ＨＶＥＣおよびＨＳＶＥＣ−ＨＵＶＥＣまたはＨＳＶＥ
Ｃ上のＩＣＡＭ−１発現の上方規格化 (upregulation)
は９６ウェルプレートに１：３で融合性単一層から種付
し融合状に増殖させた。次いで細胞を各物質または培地
で１６時間処理しＲＩＡを方法的に行った。すべての数
値は４回繰返しで行った。
【００６２】実施例１２ ＩＣＡＭ−１のインターロイキン１およびガンマーイン
ターフェロン誘起の動力学 皮ふ繊維芽細胞上でのＩＣＡＭ−１発現へのインターロ
イキンー１およびガンマーインターフェロン効果の動力
学を Dustin, M.L. 等の 125Ｉヤギ抗マウスIgＧ結合ア
ッセイを用いて測定した〔J. Immunol. １３７：２４５
−２５４（１９８６）；該文献は参考として本明細書に
引用する。〕この結合アッセイを行うために、ヒト皮ふ
繊維芽球を９６ウェルマイクロタイタープレート中で２
〜８×１０4 細胞／ウェル（0.３２cm2 ）に増殖させ
た。細胞を実施例１で記載したようにして補充したＲＰ
ＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。細胞をさらにハンク
ス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、１０ mＭのＨＥＰＥＳ、0.
０５％ NaN3 および１０％の熱不活化ウシ胎児血清で１
回洗浄した。この結合用バッファーでの洗浄は４℃で行
った。各ウェルに上記の結合用バッファー５０μl およ
びＸ６３およびＷ６／３２による適当なハイブリドーマ
上清５０ｍl を、それぞれ陰性および陽性コントロール
として加えた。３０分間、４℃でのインキュベーション
後、ウェルを２回結合用バッファーで洗浄し、第２の抗
体 125Ｉ−ヤギ抗マウスIgＧを１００μl 中５０ nＣi
で加えた。 125Ｉ−ヤギ抗マウス抗体はイオドゲン (Pi
erce社)を用いて Fraker, P.J. 等の方法に従って調製
した〔Biochem. Biophys. Res. Commun.８０：８４９
（１９７８）〕。４℃で３０分間、ウェルを２回２００
μlの結合用バッファーで洗浄し、細胞層を１００μl
の0.１Ｎ NaOH を加えることによって可溶化した。この
処理および１００μl 洗浄はベックマン５５００ガンマ
ーカウンター中で計数した。分当り結合の特異的カウン
トを〔モノクローナル抗体によるcpm 〕−〔Ｘ６３によ
るcpm 〕として計算した。特異的試剤による誘起を含む
すべての工程は４回繰返しで行った。
【００６３】ＩＣＡＭ−１誘起の半減期２時間のインタ
ーロイキン１の効果は半減期3.７５時間のガンマーイン
ターフェロンの効果よりも急速であった。ＩＣＡＭの静
止レベルに戻る時間は細胞サイクルまたは細胞増殖によ
っているようであった。静止状態細胞においては、イン
ターロイキン１およびガンマーインターフェロン効果は
２〜３日安定であり、一方対数期培養においては、ＩＣ
ＡＭ−１発現はこれらの誘起剤の除去後２日で基本線に
近い。組換えマウスおよびヒトインターロイキン１によ
るＩＣＡＭ−１誘起および組換えガンマーインターフェ
ロンによるＩＣＡＭ−１誘起のドーズレスポンス曲線を
図７に示す。ガンマーインターフェロンおよびインター
ロイキン１は１ｎg ／ｍl で殆んど同一の効果を有する
同じような濃度依存性を有することが判った。ヒトおよ
びマウス組換えインターロイキン１も同様な曲線を有す
るが、ＩＣＡＭ−１発現の誘起においてヒトインターロ
イキン１製剤よりもかなり低い効果を示している。
【００６４】シクロヘキサミド（たん白質合成のインヒ
ビター）およびアクチノマイシンＤ（ mＲＮＡ合成のイ
ンヒビター）は繊維芽球上でのＩＣＡＭ−１発現におけ
るインターロイキン１およびガンマーインターフェロン
の効果を壊滅させる（第４表）。さらにまた、ツニカマ
イシン（Ｎ結合グリコシル化のインヒビター）のみはイ
ンターロイキン１効果を４３％まで抑制した。これらの
結果はたん白質およびmＲＮＡ合成がＩＣＡＭ−１発現
におけるインターロイキン１およびガンマーインターフ
ェロン誘起増大を必要とするがＮ−結合グリコシル化の
方はそれを必要としないことを示している。
【００６５】
【表４】 表 ４ ヒト皮ふ繊維芽球上のＩＬ１およびガンマーＩＦＮによるＩＣＡＭ−１ 誘起におけるシクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、およびツニカマ イシンの効果a 125Ｉヤギ抗マウスIgＧ特異性結合（cpm) 処 理 抗ICAM-1 抗HLA-A,B,C 対照 (4 hr) 1524±140 11928±600 ＋シクロヘキシイミド 1513±210 10678±471 ＋アクチノマイシンＤ 1590± 46 12276±608 ＋ツニカマイシン 1461±176 12340±940 ＩＬ−１（１０U/ml) (4 hr) 4264±249 12155±510 ＋シクロヘキシイミド 1619±381 12676±446 ＋アクチノマイシンＤ 1613± 88 12294±123 ＋ツニカマイシン 3084±113 13434±661 ＩＦＮ−ｒ（１０U/ml) (18 hr) 4659±109 23675±500 ＋シクロヘキシミン 1461± 59 10675±800 ＋アクチノマイシンＤ 1326±186 12089±550 ────────────────────────────────── a ヒト繊維芽球を８×１０4 細胞／0.３２cm2 ウェルの密度に増殖させた。
【００６６】処理は各試剤を含有する５０μl 最終濃度
で行った。シクロヘキシイミド、アクチノマイシンＤお
よびツニカマイシンは、それぞれ、サイトカインと同じ
時間で２０μｇ／ｍl 、１０ mＭおよび２μｇ／ｍl で
加えた。すべての数値は４回重複ウェルの平均±ＳＤで
ある。 実施例１３ ＩＣＡＭ−１の組織分布 組織化学試験をヒト器官の凍結組織上で行い胸腺、リン
パ節、腸、皮ふ、じん臓および肝臓中のＩＣＡＭ−１の
分布を測定した。そのような分析を行うために、正常ヒ
ト組織の凍結組織切片（４μｍ厚さ）をアセトン中で１
０分間固定しモノクローナル抗体、ＲＲ１／１で Cerf-
Bensussan, N. 等により開示されたアビジン−ビオチン
コンプレックス法 (Vector Laboratories 社、バーリン
ゲーム、ＣＡ）を用いたイムノパーオキシダーゼ法によ
り染色した〔J. Immunol. １３０：２６１５（１９８
３）〕。抗体とのインキュベーション後、切片をビオチ
ン化ウマ抗マウスIgＧおよびアビチン−ビオチン化パー
オキシダーゼ複合体で順次インキュベートした。各切片
は最終的には３−アミノ−９−エチル−カルバゾール
（アルドリッチケミカル社、ミルウォーキー、ＷＩ）を
含有する溶液に浸して呈色反応を行った。次いで、各切
片を４％ホルムアルデヒド中で５分間固定させてヘマト
キシリンで対向染色 (counterstain）させた。コントロ
ール（対照）はＲＲ１／１抗体の代りに無関係のモノク
ローナル抗体でインキュベートした切片を含んでいた。
【００６７】ＩＣＡＭ−１は主要組織親和性コンプレッ
クス（ＭＨＣ）クラス II 抗原の分布を殆んど同じ分布
を有していることが判った。すべての組織中の血管（大
および小共に）の殆んどはＩＣＡＭ−１抗体による内皮
細胞染色を示した。管内皮染色はじん臓、肝臓および正
常皮ふ中の血管に較べてリンパ節、へん桃腺およびパイ
ヤー班中の小胞間（パラコーチカル）領域でより強い。
肝臓においては、染色は殆ど洞様毛細血管ライニング細
胞に限定され、門静脈および動脈の殆んどをライニング
しているヘパトサイトおよび内皮細胞は染色されなかっ
た。胸腺ずい質においては、大細胞の拡散染色および樹
木染色模様がみられた。皮質においては、染色像は巣状
であり主として樹木状であった。胸腺細胞は染色されて
なかった。末梢リンパ球組織においては、２次リンパ濾
胞の胚中心細胞は強く染色していた。あるリンパ濾胞に
おいては、染色像は殆んど樹木状であり、リンパ球の認
識し得る染色はなかった。
【００６８】マントル領域の細胞のかすかな染色も観察
された。さらに、細胞質拡大（指間小網細胞）を有する
樹木状細胞および小胞内またはパラコーチカル領域のリ
ンパ球の小数はＩＣＡＭ−１結合性モノクローナル抗体
で染色していた。細胞様マクロファージはリンパ節およ
び小腸の薄膜プロプリア内で染色されていた。試験した
器官の殆んどのストローマ内に拡散している繊維芽球様
細胞（スピンドル形細胞）はＩＣＡＭ−１結合性抗体に
より染色していた。外皮中のランゲルハンス／不定細胞
中では染色は認められなかった。平滑筋組織中でも染色
は観察されなかった。外皮細胞の染色はへん桃腺の粘膜
中で一貫して見られた。肝細胞、肝管外皮、腸外皮細
胞、およびじん臓中の管状外皮細胞は殆どの情況におい
て染色されなかったが、じん細胞がん腫を有するじん摘
出片からの正常じん臓組織の切片はＩＣＡＭ−１の多く
の隣接管状細胞の染色を示した。これらの管状外皮細胞
はまた抗ＨＬＡ−ＤＲ結合性抗体によっても染色してい
た。
【００６９】要するに、ＩＣＡＭ−１は管状外皮細胞の
ような非造血細胞、および組織マクロファージおよびマ
イトジエン刺激Ｔリンパ芽球のような造血細胞上に発現
する。ＩＣＡＭ−１は末梢血リンパ球に少量発現するこ
とが判った。 実施例１４ モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーに
よるＩＣＡＭ−１の精製一般的精製手順 ＩＣＡＭ−１をヒト細胞または組織からモノクローナル
抗体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し
た。ＩＣＡＭ−１と反応性のモノクローナル抗体ＲＲ１
／１を最初に精製して不活性カラムマトリックスに結合
させた。この抗体は“Rothlein, R.等、J. Immunol. １
３７：１２７０−１２７４（１９８６）”および“Dust
in, M. L. 等、J. Immunol. １３７：２４５（１９８
６）”に記載されている。ＩＣＡＭ−１を細胞膜から細
胞を非イオン性清浄剤トリトンＸ−１００中で近中性 p
Ｈで溶解することによって可溶化した。可溶化ＩＣＡＭ
−１を含有する細胞溶解物をカラムマトリックス材料に
非特異的に結合する物質を除去するように設計されたプ
レカラムに通し、次いでモノクローナル抗体カラムマト
リックスに通してＩＣＡＭ−１を抗体に結合させた。抗
体カラムを pＨを pＨ１1.０まで上昇させた一連の洗浄
剤洗浄バッファーで洗浄した。こられの洗浄中、ＩＣＡ
Ｍ−１は抗体マトリックスに結合したままであり、結合
してないまた弱く結合している不純物は除去された。次
いで、結合ＩＣＡＭ−１を pＨ１2.５の洗浄剤バッファ
ーを適用することによってカラムから特異的に溶出させ
た。
【００７０】モノクローナル抗体ＲＲ１／１の精製およ
びセファローズＣＬ／４Ｂへの共有結合 抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１はハイブ
リドーマ含有マウスの腹水またはハイブリドーマ培養上
清から標準の硫酸アンモニウム沈降法およびプロテイン
Ａアフィニティークロマトグラフィーにより精製した
〔Ｅy 等、Immunochem. １５：４２９（１９７８）〕。
精製IgＧまたはラットIgＧ（シグマケミカル社、セント
ルイス、ＭＯ）をセファローズＣＬ−４Ｂ（ファルマシ
ア社、スウェーデン）に March等の方法〔Anal. Bioche
m.６０：１４９（１９７４）〕の修正法を用いて共有結
合させた。要するに、セファローズＣＬ−４Ｂを蒸留水
中で洗浄し、５Ｍの K2HPO4 （ pＨ約１２）中の４０ｍ
ｇ／ｍl ＣＮＢｒで５分間活性化し、次いで0.１ mＭ
ＨＣl で４℃にて長く洗浄した。濾過し活性化したセフ
ァローズを等量の精製抗体（0.１Ｍ NaHCO3 、0.１Ｍ
NaCl中２〜１０ｍｇ／ｍl ）で再懸濁させた。懸濁液
を４℃で１８時間ゆるやかな端から端までの回転により
インキュベートした。次いで、上清を未結合抗体につい
て２８０ｎm の吸収によりモニターし、活性化セファロ
ーズの残りの反応部位をグリシンを0.０５Ｍに加えるこ
とによって飽和させた。結合効率は通常９０％以上であ
る。
【００７１】ヒトひ臓から調製した膜の洗浄剤可溶化 すべての手順を４℃で行った。毛状細胞白血病の患者か
らの凍結ヒトひ臓（２００ｇラフグメント）を氷上で１
mＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳ
Ｆ）、0.２Ｕ／ｍl のアプロチニンおよび５ mＭのイオ
ドアセタミドを含有する２００ｍl トリス−塩水（５０
mＭのTris、0.１４Ｍの NaCl 、４℃でpＨ7.４）中に
溶解させた。組織を小片に切断し４℃でテクマー強力ホ
モジナイザーで均質化した。容量をトリス−塩水で３０
０ｍl とし、トリス−塩水中１０％トウィーン４０（ポ
リオキシエチレンソルビタンモノパルミテート）１００
ｍl を加え最終濃度2.５％トウィーン４０を得た。膜を
調製するため、均質化物を３ストロークのドンス (Doun
ce) またはより好ましくはテフロンポッターエルブジャ
ムホモジナイザーを用いて抽出し、次いで１０００ｘｇ
で１５分間遠心した。上清を残し、ペレットをトリス−
塩水中の2.５％トウィーン４０の２５０ｍl で再抽出し
た。１０００ｘｇで１５分間の遠心後、両抽出物からの
上清を一緒にし１５0,０００ｘｇで１時間遠心して膜を
ペレット化した。膜を２００ｍl のトリス−塩水中に再
懸濁させることによって洗浄し、１５0,０００ｘｇで１
時間遠心した。膜ペレットを２００ｍl のトリス−塩水
中に再懸濁させ、モーター駆動ホモジナイザーおよびテ
フロンペストルで懸濁液が濃密になるまで均質化した。
容量を次いでトリス−塩水で９００ｍl までにし、Ｎ−
ラウロイルサルコシンを最終濃度１％になるよう加え
た。４℃で３０分の攪拌後、洗浄剤溶解物中の不溶性物
質を１５0,０００ｘｇ、１時間での遠心により除去し
た。トリトンＸ−１００を上清に最終濃度２％に加え、
溶解物を４℃で１時間攪拌した。
【００７２】ＪＹＢ−リンパ芽球細胞の洗浄剤可溶化 ＥＢＹ形質転換Ｂ−リンパ芽球細胞系ＪＹを１０％ウシ
胎児血清（ＦＣＳ）および１００ mＭ ＨＥＰＥＳを含
有するＲＰＭＩ１６４０中で0.８〜1.０×１０6 細胞／
ｍl の密度に増殖させた。ＩＣＡＭ−１の細胞表面発現
を増大させるため、ホルボール１２−ミリステート１３
−アセテート（ＰＭＡ）を細胞を収穫する前に２５ｎg
／ｍl で８〜１２時間で加えた。バナジン酸ナトリウム
（５０μＭ）もこの時間中に培養物に加えた。細胞を５
００ｘg で１０分間遠心することによってペレット化し
ハンス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で再懸濁および遠心す
ることによって２回洗浄した。細胞（５リットルの培養
物当り約５ｇ）を５０ｍlの溶解バッファー（0.１４Ｍ
NaCl 、５０ mＭ Tris、 pＨ8.０、１％トリトンＸ−
１００、0.２μ／ｍl アプロチニン、１ mＭのＰＭＳ
Ｆ、５０μＭバナジン酸ナトリウム）中に４℃で３０分
間攪拌することによって溶解させた。未溶解核および不
溶性片を１0,０００ｘg で１５分間の遠心、次いで１５
0,０００ｘg での１時間の上清の遠心および上清のフッ
トマン３mmフィルター紙により濾過により除去した。
【００７３】構造検討のためのアフィニティークロマト
グラフィー 構造検討に使用するＩＣＡＭ−１の大規模精製として、
１０ｍl のＲＲ１／１−セファローズＣＬ−４Ｂのカラ
ム（2.５ｍｇの抗体／ゲルのｍl で結合）、およびＣＮ
Ｂｒ−活性化、グリシン安定化セファローズＣＬ−４Ｂ
およびラットIgＧ結合セファローズＣＬ−４Ｂ（２ｍg/
ｍl ）の２種のプレカラムを用いた。各カラムに直列に
つなぎ、１０カラム容量の溶解バッファー、１０カラム
容量の pＨ１2.５バッファー（５０ mＭトリエチルアミ
ン、0.１％トリトンＸ−１００、４℃で pＨ１2.５）で
予備洗浄し次いで１０カラム容量の溶解バッファーで平
衡させた。１リットルのヒトひ臓の洗浄剤溶解物を0.５
〜1.０ｍl ／分の流速で負荷させた。２つのプレカラム
はＲＲ１／１−セファローズカラムに通す前に溶解物か
ら非特異結合物質を除去するのに用いた。
【００７４】負荷後、ＲＲ１／１−セファローズのカラ
ムおよび結合ＩＣＡＭ−１を（１）溶解バッファー、
（２）２０ mＭ Tris pＨ8.０／0.１４Ｍ NaCl/0.１％
トリトン Ｘ−１００、（３）２０ mＭグリシン pＨ１
0.０／0.１％トリトンＸ−１００、および５０ mＭトリ
エチルアミン pＨ１1.０／0.１％トリトンＸ−１００の
各々最低５カラム容量で１ｍl ／分の流速で順次洗浄し
た。すべての洗浄バッファーは１ mＭのＰＭＳＦと0.２
μ／ｍl のアフロチニンを含んでいた。洗浄後、残留結
合ＩＣＡＭ−１を５カラム容量の溶出バッファー（５０
mＭトリエチルアミン／0.１％トリトンＸ−１００／４
℃で pＨ１2.５）により１ｍl ／３分の流速で溶出させ
た。溶出ＩＣＡＭ−１を１ｍl フラクションに集め直ち
に0.１ｍl の１Ｍトリス、 pＨ6.７を加えて中和させ
た。ＩＣＡＭ−１を含有するフラクションを１０μｌの
アリコートのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Sp
ringer等、J. Exp. Med. １６０：１９０１（１９８
４）〕により次いで銀染色〔Morrissey, J. H., Anal.
Biochem. １１７：３０７（１９８１）〕によって同定
した。これらの条件下で、ＩＣＡＭ−１のバルクが約１
カラム容量に溶出し、銀染色電気泳動から判断して９０
％以上の純度であった（アフィニティーマトリックスか
ら漏出した少量のIgＧは主要不純物であった）。ＩＣＡ
Ｍ−１を含有するフラクションをプールしセントリコン
−３０マイクロコンセントレーター（アミコン社、デン
バース、ＭＡ）を用いて約２０倍に濃縮した。精製ＩＣ
ＡＭ−１をプールのエタノール沈降アリコートの Lowry
たん白質アッセイにより定量した。約５００μｇの純Ｉ
ＣＡＭ−１を２００ｇのヒトひ臓から調製できた。
【００７５】約２００μｇの精製ＩＣＡＭ−１を分離用
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により第２段
階の精製に供した。ＩＣＡＭ−１を示すバンドはゲルを
１ＭKCl 中にソーキングすることによって可視化させ
た。ＩＣＡＭ−１を含むゲル領域を検査して“Hunkapil
ler 等、Meth. Enzymol.９１：２２７−２３６（１９８
３）”の方法によって電気溶出させた。精製たん白質は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で判断したとき９８％以
上の純度であった。官能試験のためのＩＣＡＭ−１のアフィニティー精製 官能性試験用のＩＣＡＭ−１を前述したようなＪＹ細胞
からの洗浄剤溶解物から精製したが、小スケール（１ｍ
l のＲＲ１／１−セファローズカラム）で次の修正を加
えて行った。すべての溶液は５０μＭバナジン酸ナトリ
ウムを含んでいた。カラムを0.１％トリトンＸ−１００
含有 pＨ１1.０バッファーで洗浄後、カラムを0.１％ト
リトンＸ−１００に代えて１％のｎ−オクチル−ベータ
ー−Ｄ−グルコピラノサイド（オクチルグルコシド）含
有の同じバッファー５カラム容量で再洗浄した。オクチ
ルグルコシドはＩＣＡＭ−１に結合したトリトンＸ−１
００を除去し、トリトンＸ−１００と異なりその後透析
により除去できる。次いで、ＩＣＡＭ−１を0.１％トリ
トンＸ−１００の代わりに１％のオクチルグルコシドを
含む pＨ１2.５バッファーで溶出させ、分析し、上述の
ようにして濃縮した。
【００７６】実施例１５精製ＩＣＡＭ−１の特性化 ヒトひ臓から精製したＩＣＡＭ−１はＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル中でＭｒ７2,０００〜９1,０００の広い
バンドとして浸透する。ＪＹ細胞から精製したＩＣＡＭ
−１もＭｒ７6,５００〜９7,０００の広いバンドとして
浸透する。これらＭｒは種々の細胞源から免疫沈降させ
たＩＣＡＭ−１の報告された範囲にある：ＪＹ細胞のＭ
ｒ＝９0,０００、骨ずい単球細胞系Ｕ９３７上の１１4,
０００、および繊維芽球上の９7,０００〔Dustin等、J.
Immunol. １３７：２４５（１９８６）〕。Ｍｒのこの
広い範囲は広汎であるが変化し得る度合のグリコシル化
に貢献する。非グリコシル化プレカーサーはＭｒ５5,０
００を有する（Dustin等）。ＪＹ細胞またはヒトひ臓か
ら精製したたん白質は、その元のアフィニティカラムへ
の再結合能力によりまたＲＲ１／１−セファローズによ
る免疫沈降およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
により明らかなように、その抗原活性を保持している。
【００７７】ＩＣＡＭ−１のペプチドフラグメントを調
製するためには、約２００μｇを２mＭジチオスレイト
ール／２％ＳＤＳで還元し、次いで５ mＭの沃化酢酸で
アルキル化した。たん白質をエタノールで沈降させ、0.
１Ｍ NH4CO3／0.１ mＭ CaCl2／0.１％双性イオン剤
（２wittergent) ３−１４（カルビオケミ社）中に再溶
解させ、１％ｗ／ｗトリプシンで３７℃、４時間消化
し、次いで１％トリプシンで３７℃、１２時間の追加の
消化を行った。トリプシンペプチドを逆相ＨＰＬＣによ
り0.４×１５cm Ｃ４カラム（Vydac 社) を用いて精製
した。ペプチドは0.１％トリフルオロ酢酸中で０％〜６
０％アセトニトリルの直線勾配によって溶出した。選択
したペプチドをガス相マイクロシーケネーター（アプラ
イドバイオシステムズ社）での配列分析に供した。この
試験から得られた配列情報を第５表に示す。
【００７８】
【表５】 表 ５ ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチドのアミノ酸配列 ペ プ チ ド アミノ酸残基 50a 50b 46a 46b X 45 K AA J U 0 M1 １ [T/V] A (V/A) E V S L E A L V L ２ F S Q P E F N L G L T L/E ３ L I T A L P P D S G L P/(G) ４ T S F A A T L V I P ５ V L P P P V R L E G/Y ６ Y G L L N T P V T N/L ７ P W P P V Y Q T P (N) ８ T P I I T/I G G C P/V (Q) ９ S F G (G) L - L S K (E) 10 E E (Q) - D E T (D) 11 A S D/P K S L S 12 G/S V V P F F C 13 A T D Q S E D 14 G V W V/L A - Q 15 I K T P 16 S K 17 A 18 P 19 X 20 Q 21 L （ ） ＝低信頼配列 〔 〕 ＝極めて低信頼配列 ／ ＝配列中の不明確さを示す、最も可能性あるアミノ酸を最初に 挙げている。
【００７９】ａ ＝主要ペプチド ｂ ＝非重要ペプチド 実施例１６ ＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング ＩＣＡＭ−１の遺伝子は任意の種々の手順を用いてクロ
ーニングできる。例えば、ＩＣＡＭ−１のトリプシンフ
ラグメントのシーケンシング（第５表）から得られたア
ミノ酸配列情報を用いてＩＣＡＭ−１遺伝子に相当する
オリゴヌクレオチド配列を同定し得る。また、ＩＣＡＭ
−１遺伝子は抗ＩＣＡＭ−１抗体を用いてＩＣＡＭ−１
を産生するクローンを検出することによってもクローニ
ングできる。
【００８０】オリゴヌクレオチドプローブを用いること
によるＩＣＡＭ−１遺伝子のクローニング 遺伝子コード〔Watson, J.D., Molecular Biology of t
he Gene,第３版、W.A.ベンジャミン社、メロノパーク、
ＣＡ（１９７７）〕を用いて、１種以上の異なるオリゴ
ヌクレオチドを同定でき、その各々はＩＣＡＭ−１トリ
プシンペプチドをコードし得るものである。特定のオリ
ゴヌクレオチドが実際に現実のＩＣＡＭ−１コード配列
を構成する可能性は異常な塩基対関係および特定のコド
ンを現実に真核細胞に用いて（特定のアミノ酸をコード
する）頻度を考慮することによって評価できる。そのよ
うな“コドン利用法則”は“Lathe, R. 等、Ｊ．Melec.
Biol.１８３：１〜１２（１９８５）”により開示され
ている。Lathe の“コドン利用法則”を用いて、理論的
に“最も可能性のある“ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチ
ド配列をコードし得るヌクレオチド配列（即ち、最低の
不要物を有するヌクレオチド配列）を含有する単一オリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを同
定する。
【００８１】ＩＣＡＭ−１フラグメントをコードし得る
理論的に“最も可能性のある”配列を含むオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチドのセットを用いて“最
も可能性ある”配列または配列のセットにハイブリッド
化し得る相補オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チドのセットの配列を同定する。そのような相補配列を
含むオリゴヌクレオチドはＩＣＡＭ−１遺伝子を同定し
単離するプローブとして使用できる〔Maniatis, T.等、
Molecular Cloning A Laboratory Manual, コールド
スプリング ハーバー プレス社、コールド スプリン
グ、ＮＹ（１９８２）〕。上記のセクションＣに記載さ
れているように、ＩＣＡＭ−１遺伝子を含有する可能性
ある真核ＤＮＡ調製物からＩＣＡＭ−１遺伝子をクロー
ニングすることは可能である。ＩＣＡＭ−１たん白質を
コードする遺伝子を同定しクローニングするためには、
ＤＮＡライブラリーをその上記のオリゴヌクレオチドプ
ローブとハイブリッド化する能力についてスクリーニン
グする。正常な二倍体細胞中にはＩＣＡＭ−１の遺伝子
のほんの２つのコピーしか存在しないようであるので、
またＩＣＡＭ−１遺伝子はクローニングが望まれない大
きな非転写介在配列（イントロン）を有し得る可能性が
あるので、好ましいのはゲノムＤＮＡよりはむしろＩＣ
ＡＭ−１産生細胞の mＲＮＡから調製したｃＤＮＡライ
ブラリーからＩＣＡＭ−１コード配列を単離することで
ある。適当なＤＮＡまたはｃＤＮＡ調製物は酵素的に開
裂させ、ランダムにせん断し、連結反応させて組換えベ
クターとする。これら組換えベクターの上述のオリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリッド化する能力を測定す
る。ハイブリッド化の手順は、例えば、“Maniatis,
T., Molecular Cloning A Laboratory Manual, コール
ド スプリング ハーバー プレス社、コールド スプ
リング ハーバー、ＮＹ（１９８２）”または“Hayme
s, B.T.等、Nucleic Acid Hybridization a Practical
Approach, IRLプレス社、オックスフォード、英国（１
９８５）”において開示されている。そのようなハイブ
リッド化ができることが判っているベクターを分析して
ベクターが含有するＩＣＡＭ−１配列の程度および性質
を分析する。純粋に仮説的な考察によれば、ＩＣＡＭ−
１分子をコードするような遺伝子はほんの１８ケのヌク
レオチドを有するオリゴヌクレオチドを用いて明確に同
定できるであろう（ハイブリッド化スクリーニングによ
り）。
【００８２】即ち、要約すれば、ＩＣＡＭ−１ペプチド
配列の現実の同定により、そのようなペプチドをコード
し得る理論的に“最も可能性ある”ＤＮＡ配列またはそ
のような配列のセットの同定ができる。この理論的配列
に相補性のオリゴヌクレオチドを構築することにより
（あるいは“最も可能性ある”オリゴヌクレオチドのセ
ットに相補的なオリゴヌクレオチドのセットを構築する
ことにより）、ＩＣＡＭ−１遺伝子を同定し単離するプ
ローブとして機能し得るＤＮＡ分子（またはＤＮＡ分子
のセット）が得られる。第５表のＩＣＡＭ−１ペプチド
配列を用いて、ＡＡおよびＪペプチドをコードし得るオ
リゴヌクレオチドの“最も可能性ある”配列の配列を決
定した（それぞれ、第６表および第７表）。これら配列
に相補性のオリゴヌクレオチドを合成し精製してＩＣＡ
Ｍ−１遺伝子配列を単離するプローブとした。適当なサ
イズ選定ｃＤＮＡライブラリーをＰＭＡ誘起ＨＬ−６０
細胞からおよびｐｓ刺激へそ帯静脈内皮細胞からのポリ
（Ａ）+ ＲＮＡから調製した。サイズ選定ｃＤＮＡライ
ブラリーは“Gubler, U.等〔Gene ２５：２６３−２６
９（１９８３）〕およびCorbi, A. 等、〔ＥＮＢＯ
Ｊ．６：４０２３−４０２８（１９８７）〕の方法に従
ってＰＭＡ誘起ＨＬ−６０細胞からのポリ（Ａ）+ ＲＮ
Ａを用いて調製した。これらの文献は参考として本明細
書に引用する。
【００８３】サイズ選定ｃＤＮＡライブラリーはｐｓ５
μｇ／ｍl で４時間刺激したヘソ帯静脈上皮細胞からの
ポリ（Ａ）+ を用いて調製した。ＲＮＡは上記細胞を４
Ｍグアニジニウムイソシアネート中で均質化し上清をCs
Cl勾配により超遠心に供することによって抽出した〔Ch
irgwin, J. M. 等、Biochem. １８：５２９４−５２９
９（１９７９）〕。ポリ（Ａ）+ ＲＮＡは全ＲＮＡスペ
イシスの混合物からオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマ
トグラフィー（タイプ３、コラボラティブ リサーチ
社）を用いて単離した〔Aviv, H.等、Proc. Natl. Aca
d. Sci. (USA) 6９：１４０８−１４１２（１９７
２）〕。
【００８４】
【表６】 表 ６ ＩＣＡＭ−１ ＡＡペプチドをコードし得る最も可能性ある ヌクレオチド配列に相補性のオリゴヌクレオチド ─────────────────────────────────── ＩＣＡＭ−１の ＩＣＡＭ−１ ＡＡペプチドをコード アミノ酸残基 ＡＡペプチド する最も可能性ある配列 相補配列 ───────────────────────────────── ５′ ３′ １６２ Ｇｌｕ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ １６３ Ｌｅｕ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ １６４ Ａｓｐ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ １６５ Ｌｅｕ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ １６６ Ａｒｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ １６７ Ｐｒｏ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ １６８ Ｇｌｎ Ｃ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ １６９ Ｇｌｙ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ １７０ Ｌｅｕ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ １７１ Ｇｌｕ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ １７２ Ｌｅｕ Ｃ Ｇ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ １７３ Ｐｈｅ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ａ １７４ Ｇｌｕ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ ３′ ５′ Ａ Ｔ １７５ Ａｓｎ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ｔ １７６ Ｔｈｒ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｕ Ａ １７７ Ｓｅｒ Ｃ Ｇ Ａ ３′ ５′ ────────────────────────────────────
【００８５】
【表７】 表 ７ ＩＣＡＭ−１ Ｊペプチドをコードし得る最も可能性ある ヌクレオチド配列に相補性のオリゴヌクレオチド ─────────────────────────────────── ＩＣＡＭ−１の ＩＣＡＭ−１ ＡＡペプチドをコード アミノ酸残基 ＡＡペプチド する最も可能性ある配列 相補配列 ─────────────────────────────────── ５′ ３′ １９ Ｖａｌ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ ２０ Ｔｈｒ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ ２１ Ｃｙｓ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ Ｃ Ｇ ２２ Ｓｅｒ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ ２３ Ｔｈｒ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ ２４ Ｓｅｒ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ ２５ Ｃｙｓ Ｔ Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ ２６ Ａｓｐ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ ２７ Ｇｌｎ Ｃ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ ２８ Ｐｒｏ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ ２９ Ｌｙｓ Ａ Ｔ Ａ Ｔ ３′ ５′ ──────────────────────────────────── 第１のストランドｃＤＮＡをポリ（Ａ）+ ＲＮＡ、トリ
骨ずい芽球症ウィルス逆転写酵素（ライフサイエンス
社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーと用いて合成し
た。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはラナーゼＨ（ＢＲＬ
社）で消化、第２ストランドはＤＮＡポリメラーゼＩ
（ニューイングランド バイオラブス社）を用いて合成
した。生成物をＥcoＲ１メチラーゼ（ニューイングラン
ド バイオラブス社）でメチル化し、ＥcoＲ１リンカー
（ニューイングランド バイオラブス社）にブラントエ
ンド連結反応させ、ＥcoＲ１で消化し低融点アガロース
ゲル上でサイズ選定した。５００ｂp より大きいｃＤＮ
Ａを前以てＥcoＲ１消化させ脱リン酸化させているλｇ
ｔ１０に連結反応させた（ストラタジーン）。連結反応
生成物を次いでパッケージンクした（ストラタジーンゴ
ールド）。
【００８６】次に、ヘソ帯静脈内皮細胞およびＨＬ−６
０ｃＤＮＡライブラリーを２0,０００ＰＦμ／１５０mm
プレートで塗布した。組換えＤＮＡを複製中でニトロセ
ルロースフィルターに移し、0.５Ｍ NaOH ／1.５ NaCl
中で変性し１Ｍトリス、ＰＨ7.5/1.５Ｍ NaCl 中で中和
し、８０℃で２時間ベーキングした（Benton, W.D.等、
Science １９６：１８０−１８２（１９７７）〕。フィ
ルターをプレハイブリッド化し、５× Denhardt 溶液、
５０ mＭ NaPO4 および１μｇ／ｍl のサケ精子ＤＮＡ
を含む５×ＳＳＣ中でハイブリッド化した。プレハイブ
リッド化は４５℃で１時間行った。ハイブリッド化は３
２ｂp （ '５−ＴＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧ
ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡＣ）または４７ｂp （ '５
−ＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧ
ＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣ）抗
感覚オリゴヌクレオチドを上述の方法で、それぞれＩＣ
ＡＭ−１トリプシンペプチドＪおよびＡＡ（第６表およ
び第７表）上で用いて行った〔Lathe, R. J.Melec. Bio
l. １８３：１−１２（１９８５）〕。オリゴヌクレオ
チドはｒ−（ 32Ｐ）ＡＴＰでＴ4 ポリヌクレオチドキナ
ーゼおよび製造者（ニューイングランド バイオラブス
社）に推奨される条件を用いて末端標識した。オーバー
ナイトハイブリッド化に続いて、フィルターを２×ＳＳ
Ｃ／0.１％ＳＤＳで３０分間、４５℃で２回洗浄した。
ファージをハイブリッド化を示すプラーグから単離し、
連続再塗布および再スクリーニングにより精製した。
【００８７】抗ＩＣＡＭ−１抗体の使用によるＩＣＡＭ
−１の遺伝子のクローニング ＩＣＡＭ−１の遺伝子を別法として抗ＩＣＡＭ−１抗体
の使用によりクローニングできる。ＤＮＡまたはより好
ましくはｃＤＮＡをＩＣＡＭ−１を発現し得る細胞から
抽出し精製する。精製ｃＤＮＡをフラグメント化し（せ
ん断化、エンドヌクレアーゼ消化等により）ＤＮＡまた
はｃＤＮＡフラグメントのプールを調製する。このプー
ルからのＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを発現ベク
ターにクローニングして各々のメンバーが特異的クロー
ン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを含有する発現
ベクターの遺伝子ライブラリーを調製する。 実施例１７ ｃＤＮＡクローンの分析 陽性クローンからのファージＤＮＡをＥcoＲ１で消化
し、１つのクローンからのｃＤＮＡをプローブとして用
いてサウサーン分析により試験した。交差ハイブリッド
化した最大サイズｃＤＮＡ挿入物をプラスミドベクター
ｐＧＥＭ４Ｚ（プロメガ社）のＥcoＲ１サイトにサブク
ローニングした。両配向にｃＤＮＡを含むＨＬ−６０サ
ブクローンをエンドヌクレアーゼ III消化（Henikoff,
S., Gene 28：３５１−３５９（１９８４）〕により製
造者の推奨（エラス−アーベース、ブロメガ社）に従っ
て欠落させた。漸次的に欠落させたｃＤＮＡを次いでク
ローニングしてジデオキシヌクレオチド鎖終端シーケン
シングに製造者の推奨（シーケナーゼ、Ｕ．Ｓ．バイオ
ケミカル社）に従って供した（Sanger, F.等、Proc. Na
tl. Acad. Sci. (USA) ７４：５４６３−５４６７（１
９７７）〕。ＨＬ−６０ｃＤＮＡ５′およびコード用領
域を両ストランド上で完全にシーケンシングし、３′領
域を両ストランド上で約７０％シーケンシングした。代
表的な内皮ｃＤＮＡをその長さの殆どに亘って４ｂp 認
識制限酵素フラグメントのショットガンクローニングに
よりシーケンシングした。
【００８８】１種のＨＬ−６０および１種の内皮細胞ｃ
ＤＮＡのｃＤＮＡ配列を確立した（図８〜図１０）。３
０２３ｂp 配列は短い５′未ほん訳領域と位置２９６６
に共通ポリアデヒル化シグナルを有する1.３ｋb ３′未
ほん訳領域を含む。最長開放読み枠は位置５８の第１Ａ
ＴＧで始まり位置１６５３のＴＧＡ終端トリプレットで
終る。ほん訳アミノ酸配列と合計９１個のアミノ酸の８
個の異なるトリプシンペプチドから決定した配列（図８
〜図１０中でアンダーラインを施している）との間の同
一性は信頼できるＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡが単離されたこ
とを確認した。配列分析に基づき、ＬＦＡ−１により認
識されたＩＣＡＭ−１内の可能性あるペプチドを第８表
に示す。
【００８９】
【表８】 表 ８ ＩＣＡＭ−１トリプシンペプチドのアミノ酸配列 ─────────────────────────────────── ペプチド 残基 配 列 ────────────────────────────────── Ｊ 14−29 ＸＧＳＶＬＶＴＣＳＴＳＣＤＱＰＫ Ｕ 30−39 ＬＬＧＩＥＴＰＬ（Ｐ）（Ｋ） 50 78−85 （Ｔ）ＦＬＴＶＹＸＴ Ｘ 89−95 ＶＥＬＡＰＬＰ AA 161−182 ＸＥＬＤＬＲＰＱＧＬＥ−− ＬＦＥＸＴＳＡＰＸＱＬ Ｋ 232−246 ＬＮＰＴＶＴＹＧＸＤＳＦＳＡＫ 45 282−295 ＳＦＰＡＰＮＶ（Ｔ／Ｉ）ＬＸＫＰＱ（Ｖ／Ｌ） ─────────────────────────────────── −− 配列が次の行に続くことを示す。アンダーラインを施した配列は オリゴヌクレオチドプローブを調製するのに用いた。 疎水性分析 (Kyte, J.等、J. Melec. Biol. １５７：１
０５−１３２（１９８２）〕は２７残基シグナル配列の
存在を示唆している。＋１グルタミンの役目は３種のＩ
ＣＡＭ−１たん白質調製物上にＮ−末端配列を本発明で
得ることができないことと一致しており；グルタミンは
フイログルタミン酸に環状化しブロックしたＮ−末端を
もたらす。１〜４５３のほん訳配列は主として親水性で
あり２４残基の疎水性の推定トランスメンブランドメイ
ンが続く。トランスメンブランドメインはその後すぐに
２７残基の推定細胞質ドメイン内に含まれた数個の荷電
残基が続く。
【００９０】成熟ポリペプチド鎖の予示サイズは５5,２
１９ダルトンであり、脱グリコシル化ＩＣＡＭ−１の観
察されたサイズ５5,０００と良好に一致している〔Dust
in,M.L.等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１
９８６）〕。８個のＮ−結合グリコシル化部位が予示さ
れる。これらの部位の２のトリプシンペプチド配列中の
アスパラギンの不存在はそれらのグリコシル化とそれら
の細胞外配向を確認している。高マンノースＮ−結合カ
ルボハイドレート当り2,５００ダルトンを想定すると、
７5,０００ダルトンのサイズがＩＣＡＭ−１プレカーサ
ーについて予示され、観察されたサイズ７3,０００ダル
トン〔Dustin, M.L.等、J. Immunol. １３７：２４５−
２５４（１９８６）〕に匹敵する。高マンノースのコン
プレックスカルボハイドレートへの転換後、成熟ＩＣＡ
Ｍ−１糖たん白質は細胞の種類により７６〜１１４ｋd
である〔Dustin, M.L.等、J. Immunol. １３７：２４５
−２５４（１９８６）〕。即ち、ＩＣＡＭ−１は高度に
グリコシル化されているのが典型的な完全膜たん白質で
ある。
【００９１】実施例１８ ＩＣＡＭ−１は免疫グロブリン超遺伝子群のインテグリ
ン結合性１員であるＩＣＡＭ−１内部繰返し配列をミク
ロジーニ (Microgenie) たん白質配列プログラム〔Quee
n, C. 等、Nucl. Acids Res.１２：５８１−５９９（１
９８４）〕を用い次いで検査することによって行った。
ＩＣＡＭ−１のIgＭ、Ｎ−ＣＡＭおよびＭＡＧへの配列
をミクロジーニおよびＡＬＩＧＮプログラム〔Daypoff,
M.O. 等、 Meth. Enzmol. ９１：５２４−５４５（１
９８３）〕を用いて行った。ナショナル バイオメデカ
ル リサーチ ファンデーション (National Biomedica
l Research Foundation)に保管されている４種のたん白
質配列データベースをWilliams と PearsonのＦＡＳＴ
Ｐプログラムを用いてたん白質配列の類似性について調
査した〔Lipman, D. J. 等、Science ２２７：１４３５
−１４３９（１９８５）〕。
【００９２】ＩＣＡＭ−１はインテグリンのリガンドで
あるので、免疫グロブリン超遺伝子群の１員であること
は予期されなかった。しかしながら、ＩＣＡＭ−１配列
の調査はその配列が免疫グロブリン超遺伝子群中の身内
関係に提唱されたすべての規準を満たすことを示してい
る。これらの基準を以下に説明する。ＩＣＡＭ−１の全
細胞外ドメインを図１１（Ａ）に配列して示した５つの
相同性免疫グロブリン様ドメインから構築する。ドメイ
ン１−４はそれぞれ８８、９７、９９および９９の残基
長であり、かくして典型的なＩg ドメインサイズを有し
ており；ドメイン５は６８個の残基中で切り取られてい
る。ＦＡＳＴＰプログラムを用いてのＮＢＲＦデータベ
ースの調査はIgＭとIgＧ Ｃドメインを包含する免疫グ
ロブリン超遺伝子群の１員、Ｔ細胞レセプターαサブユ
ニット可変ドメイン、およびアルファ１ベータ糖たん白
質と有意の相同性を示していた（図１１（Ｂ）−
（Ｄ））。
【００９３】上記の情報を用いて、ＩＣＡＭ−１のアミ
ノ酸配列を免疫グロブリン超遺伝子群の他の１員のアミ
ノ酸配列と比較した。Ｉg 超遺伝子群ドメインの３つの
タイプ、Ｖ、Ｃ１およびＣ２は分化されている。ＶとＣ
の両ドメインは内部ドメインスルフィド結合により一緒
に結合している２β−シートから構築されており；Ｖド
メインは９つの抗平行β−ストランドを有しＣドメイン
は７つ有している。一定のドメインを図１１（Ａ）に示
した特徴的残基に基づいてＣ1 およびＣ2 −セットに分
割した。Ｃ1 −セットは抗原認識中に含まれるたん白質
を含んでいる。Ｃ2 −セットは数個のＦc レセプターと
ＣＤ２，ＬＦＡ−３，ＭＡＧおよびＮＣＡＭを包含する
細胞粘着中に含まれるたん白質とを含んでいる。ＩＣＡ
Ｍ−１ドメインはこのセット中でＩＣＡＭ−１と置き変
っているＣ2 −セットのドメインと最も強い相同性を有
することが判った；このことは図１１のβ−ストランド
Ｂ−Ｆについて示されているようにＣ1 ドメインよりも
Ｃ2 中の保持残基により強く類似している点にも反映さ
れている。また、ＩＣＡＭ−１ドメインはＶおよびＣ1
ドメイン中の上記ストランドとよりもＣ2 ドメインのβ
ストランドＡおよびＧとより一層良好に列んでおり、全
Ｃ2ドメイン強度を横切って良好な配列を可能としてい
る。ＭＣＡＭ，ＭＡＧおよびアルファ１−β糖たん白質
からのＣ2 ドメインとの配列は図１１（Ｂ）および図１
１（Ｃ）に示されており；同一性は２８〜３３％の範囲
であった。Ｔ細胞レセプターＶα２７％同一性およびＩ
ｇＭ Ｃドメイン３ ３４％同一性との配列も示されて
いる（図１１（Ｂ）、図１１（Ｄ））。
【００９４】免疫グロブリンドメインの最も重要な特徴
付の１つはβシートサンドイッチを安定化するＢおよび
Ｆβストランドを架橋するジスルフィド結合システイン
であり；ＩＣＡＭ−１においてはシステインはすべての
場合に保持されているが、ロイシンが見出されるドメイ
ン４のストランドｆにおいて上記サンドイッチに面しい
くつかの他のＶ−およびＣ2 −セットドメインに提案さ
れたような接触を安定化している。システイン（４３，
５０，５２および３７残基）間の距離はＣ2 セットにつ
いて述べたとおりである。ＩＣＡＭ−１中の鎖間ジスル
フィド結合の存在について試験するために、内皮細胞Ｉ
ＣＡＭ−１を還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅに供した。内皮細胞ＩＣＡＭ−１はこれがＪＹまたは
毛状ひ臓細胞ＩＣＡＭ−１よりも小さいグリコシル化異
種原性を示しＭｒ中のシフトにより大きな感応性を示す
ことから使用した。従って、ＩＣＡＭ−１を１６時間Ｌ
ＰＳ（５μｇ／ｍl ）刺激ヘソ帯静脈内皮細胞培養物か
ら前述したようなイムノアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した。アセトン沈降ＩＣＡＭ−１を0.２
５％２−メルカプトエヌノールまたは２５ mＭイオドア
セタミド含有のサンプルバッファー〔Laemmli, U. K.,
Nature ２２７：６８０−６８５（１９７０）〕中に再
懸濁させ１００℃に５分間もたらした。サンプルをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ４６７０および銀染色４６１３に供した。
内皮細胞ＩＣＡＭ−１は還元条件下で１００ｋd の見掛
けのＭｒを非還元条件下で９６ｋd を示し天然ＩＣＡＭ
−１中の鎖間ジスルフィドの存在を強く示唆していた。
【００９５】二次構造を予想するための一次配列の使用
〔Chon, P. Y. 等、Biochem.１３：２１１−２４５（１
９７４）〕は、図１１（Ａ）上方にａ−ｇと表示され、
免疫グロブリンドメインについての予想を正確に満たし
また免疫グロブリン中のストランドＡ−Ｈの各位置（図
１１（Ａ）下方）に相応する各ＩＣＡＭ−１ドメイン中
の７つの予期されたβ−ストランドを示していた。ドメ
イン５はＡおよびＣストランドを欠損しているが、これ
らはシートの端部を形成しているので、各シートは依然
として恐らくはストランドＤと形成しておりいくつかの
他のＣ2 ドメインで提案されたようにストランドＣの代
理をしており；またＢおよびＦストランド間の特徴的ジ
スルフィド結合は影響を受けないであろう。即ち、ドメ
インサイズ、配列相同性、推定ドメイン間ジスルフィド
結合を形成する保持システイン、ジスルフィド結合の存
在、および予想βシート構造の基準はすべて免疫グロブ
リン超遺伝子群中へのＩＣＡＭ−１の内在を満たしてい
る。
【００９６】ＩＣＡＭ−１はＣ2 セットのＮＣＡＭおよ
びＭＡＧ糖たん白質と最も強く相同性であることが判明
した。このことはＮＣＡＭとＭＡＧが共に細胞−細胞粘
着を媒介するので特に重要である。ＮＣＡＭはニューロ
ン−ニューロンおよび神経−筋相互作用において重要で
あり〔Cunningham, B.A.等、Science ２３６：７９９−
８０６（１９８７）〕、またＭＡＧはミエリン化 (myel
ination)中のニューロン−オリゴデントロサイトおよび
オリゴデントロサイト−オリゴデントロサイト相互作用
において重要である〔Poltorak, M.等、J. Cell. Biol.
１０５：１８９３−１８９９（１９８７）〕。ＮＣＡＭ
とＭＡＧの細胞表面発現は神経系形成およびミリエン化
中に、それぞれ、炎症におけるＩＣＡＭ−１の調整され
た誘起と類似して発展的に調整されている〔Springer,
T.A.等、Ann. Rev. Immunol. 5：２２３−２５２（１
９８７）〕。ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ〔Cunningham, B.
A.等、Science ２３６：７９９−８０６（１９８
７）〕、およびＭＡＧ〔Salzer,J. L. 等、J. Cell. Bi
ol.１０４：９５７−９６５（１９８７）〕は全体構造
並びに相同性において類似している。何故ならば、各々
はＮ末端細胞外領域を形成する５つのＣ2 ドメインから
構成された完全膜糖たん白質であるからである。ただ
し、ＮＣＡＭにおいては、ある追加の非Ｉｇ様配列が最
後のＣ2 ドメインとトランスメンブランドメイン間に存
在する。ＩＣＡＭ−１はトランスメンブランと細胞質ド
メインを含むその全体長に亘ってＮＡＧと２１％の同一
性を有して列んでおり；同じ％同一性がＩＣＡＭ−１と
ＮＣＡＭ−１の５つのドメインを比較したとき見出され
る。ＩＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の図式的比較は図
１２に示している。ドメイン対ドメインの比較はＩＣＡ
Ｍ−１とＮＣＡＭ内のドメイン間の相同性のレベル（そ
れぞれ、×±ｓ．ｄ．２１±2.８％および１8.６±3.８
％）はＩＣＡＭ−１ドメインをＮＣＡＭおよびＭＡＧド
メインと比較したときの相同性のレベル（それぞれ、２
0.４±3.７および２1.９±2.７）と同じであることを示
している。ＮＣＡＭ〔Cunningham, B.A.等、Science ２
３６：７９９−８０６（１９８７）；Barthels, D.等、
ＥＭＢＯ Ｊ．６：９０７−９１４（１９８７）〕およ
びＭＡＧ（Lai, C. 等、Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
８４：４３７７−４３４１（１９８７）〕のＣ−末端
領域における別の総合の証拠は存在するけれども、これ
が内皮またはＨＬ−６０ＩＣＡＭ−１クローンのシーケ
ンシングにおいてあるいは種々のタイプのＩＣＡＭ−１
たん白質バックボーンおよびプレカーサーの研究〔Dust
in, M. L. 等、J. Immunol. １３７：２４５−２５４
（１９８６）〕において見出されたという証拠はない。
【００９７】ＩＣＡＭ−１は多くの種々の細胞種とのリ
ンパ球相互作用におけるＬＦＡ−１用のリガンドとして
機能する。リンパ球は人工膜２重層に含まれたＩＣＡＭ
−１と結合し、これはリンパ球上にＬＦＡ−１を必要と
しＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の相互作用を直接示唆して
いる〔Marlin, S.D.等、Cell ５１：８１３−８１９
（１９８７）〕。ＬＦＡ−１は白血球インテグリンであ
り免疫グロブリン様特徴を有しない。白血球インテグリ
ンは１種のインテグリン亜族を含む。他の２つの亜族は
細胞マトリックス相互作用を媒介し、フイブロネクチ
ン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびフィフリノーゲ
ンを包含するそのリガンド内の配列ＲＧＤを認識する
〔Hynes, R.O., Cell ４８：５４９−５５４（１９８
７）；Ruoslahti,E. 等、Science ２３８：４９１−４
９７（１９８７）〕。白血球インテグリンは白血球上の
みに発現し、細胞−細胞相互作用に含まれ、わずかに公
知のリガンドはＩＣＡＭ−１とｉＣ3 ｂ（即ち免疫グロ
ブリン様特徴を示さない補体成分Ｃ3 のフラグメント）
であり、Ｍａｃ−１によって認識される〔Kishimoto,
T.K.等、Leukocyte Typing III, ＭｃＭｉ Chael, M.
編、スプリンガー ベルラーグ、ニューヨーク、（１９
８７）； Springer T.A. 等、Ann. Rev. Immunol.５：
２２３−２５２（１９８７）；Anderson, D.C.等、Ann.
Rev. Med. ３８：１７５−１９４（１９８７）〕。配
列分析により、ＬＦＡ−１により認識されるＩＣＡＭ−
１配列内の潜在的ペプチドは表９に示す。
【００９８】
【表９】表 ９ ＬＦＡ−１に認識され得るＩＣＡＭ−１内のポリペプチ
ド -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- ＩＣＡＭ−１はインテグリンに結合する免疫グロブリン
超遺伝子群の１員の最初の例である。これらの群の双方
は細胞粘着において重要な役割を発揮するけれども、両
者間の相互作用は以前には予期されてなかった。これに
対し、免疫グロブリン超遺伝子群内の相互作用は全く一
般的である。インテグリンと免疫グロブリン群との間の
相互作用のさらなる例が発見されるであろうことは全く
可能である。ＬＦＡ−１はＩＣＡＭ−１とは異なるリガ
ンドを認識し〔Springer T.A. 等、Ann. Rev. Immunol.
５：２２３−２５２（１９８７）〕、白血球インテグリ
ンＭａｃ−１は好中球−好中球粘着のＣ3 biと異なるリ
ガンドを認識する〔Anderson, D.C.等、Ann. Rev. Med.
３８：１７５−１９４（１９８７）〕。さらにまた、
精製したＭＡＧ含有ベシクルはＭＡＧであるニューリッ
ト (neurites) に結合し、かくしてＭＡＧは異種レセプ
ターと異好性相互作用可能でなければならない〔Poltor
ak, M.等、J. Cell. Biol.１０５：１８９３−１８９９
（１９８７）〕。
【００９９】神経−神経および神経−筋肉相互作用にお
けるＮＣＡＭの役割は同種親和性ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相
互作用に基づくことは示唆されている。〔Cunningham,
B.A.等、Science ２３６：７９９−８０６（１９８
７）〕。ミエリン鞘形成中に軸索を取り囲むシュヴアン
細胞の隣近回転ループ間の相互作用におけるＭＡＧの重
要な役割は異種レセプターとの相互作用または同種親和
性ＭＡＧ−ＭＡＧ相互作用に基づき得る。ＮＣＡＭとの
相同性および免疫グロブリン超遺伝子群内でのドメイン
−ドメイン相互作用の頻繁な出現はＩＣＡＭ−１が同種
親和性相互作用並びにＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１異好性
相互作用に係わり得る可能性を引き起こす。しかしなが
ら、同様な密度のＬＦＡ−１とＩＣＡＭ−１を共発現す
るＢリンパ芽球細胞の人工または細胞単一層中のＩＣＡ
Ｍ−１への結合はＢ−リンパ芽球のＬＦＡ−１ ＭＡｂ
による前処理によって完全に抑制され得るが、粘着はＩ
ＣＡＭ−１ ＭＡｂによるＢ−リンパ芽球前処理による
影響はない。ＩＣＡＭ−１ Ｍａｂによる単一層の前処
理は結合を完全に壊滅させている〔Dustin, M. L. 等、
J. Immunol. １３７：２４５−２５４（１９８６）；Ma
rlin, S. D. 等、Cell、５１：８１３−８１９（１９８
７）〕。これらの知見はＩＣＡＭ−１同種親和性相互作
用が全く起した場合、その作用はＬＦＡ−１との異好性
相互作用よりもかなり弱くなければならないことを示し
ている。
【０１００】白血球インテグリンが基本的に異なる方法
でリガンドを認識する可能性はリガンド結合において重
要でありＲＧＤ認識性インテグリン中には存在しないそ
れらのαサブユニット中の１８０残基配列の存在と一致
する〔Corbi, A. 等、ＥＭＢＯ Ｊ．６：４０２３−４
０２８（１９８７）〕。Ｍａｃ−１はｉＣ3 b ５０８６
中に存在するＲＧＤ配列を認識することが提示されてい
るけれども、ＩＣＡＭ−１中にはＲＧＤ配列はない（図
８〜図１０）。これはフイブロネクチンペプチドＧＲＧ
ＤＳＰとコントロールペプチドＧＲＧＥＳＰがＩＣＡＭ
−１−ＬＦＡ−１粘着を抑制できないことと一致してい
る〔Marlin, S. D. 等、Cell、５１：８１３−８１９
（１９８７）〕。しかしながら、ＰＲＧＧＳおよびＲＧ
ＥＫＥのような関連配列はＩＣＡＭ−１中に、それぞ
れ、ドメイン２のβ−ストランドａとｂおよびドメイン
２のｃとｄ間のループに予示される領域において存在し
ており（図１１）、従って、認識について受け入れられ
得る。興味あることは相同性ＭＡＧ分子がドメイン１と
２の間にＲＧＤ配列を含むことである〔Poltorak, M.
等、J. Cell. Biol.１０５：１８９３−１８９９（１９
８７）； Salzer, J. L.等、J. Cell. Biol. １０４；
９５７−９６５（１９８７）〕。
【０１０１】実施例１９ サウサーンおよびノウサーンブロット サウサーンブロットを３種の細胞系から抽出した５μｇ
の遺伝子ＤＮＡを用いて行なった。ＢＬ２、パーキット
リンパ腫細胞系（Dr. Gilbert Lenoirから供与) ；ＪＹ
およびＥｒ−ＬＣＬ，ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ腫様細
胞系。各ＤＮＡを５×製造者が推奨する量のＢamＨＩと
ＥcoＲＩエンドヌクレアーゼ（ニューイングランド バ
イオラブス社）で消化した。0.８％アガロースゲルによ
る電気泳動に続いて、ＤＮＡをナイロン膜（ゼータプロ
ーブ、バイオラド社）に移した。フィルターを予備ハイ
ブリッド化およびα−（32Ｐ）d ＸＴＰ′ｓで標識した
ＨＬ−６０からのＩＣＡＭ ｃＤＮＡを用いての標準手
法に従ってランダムプライミングによりハイブリッド化
した。ノウサーンブロット２０μｇの全ＤＮＡまたは６
μｇのポリ（Ａ）+ ＲＮＡを用いて行なった。ＲＮＡは
変性し１％アガローズ−ホルムアルデヒドゲルにより電
気泳動し、ゼータプローブに電気移動させた。各フィル
ターを予備ハイブリッド化し32Ｐ標識オリゴヌクレオチ
ドプローブ（前述の）のＨＬ−６０ｃＤＮＡプローブを
用いて前述したようにしてハイブリッド化した〔Stauto
n, D. B.等、Embo J. ６；３６９５−３７０１（１９８
７）〕。
【０１０２】３ｋb ｃＤＮＡプローブおよびＢamＨＩと
ＥcoＲＩで消化した遺伝子ＤＮＡを用いたサウサーンブ
ロットはそれぞれが単一遺伝子を示しまたコード化情報
の殆どが８ｋb 内に存在することを示す２０および８ｋ
b の単一主要ハイブリッド化性フラグメントを示した。
３種の細胞系のブロットにおいては、制限フラグメント
多形性の証拠はなかった。 実施例２０ ＩＣＡＭ−１遺伝子の発現 “発現ベクター”は、（適当な転写性および／またはほ
ん訳性コントロール配列の存在に基づき）ベクターにク
ローニングされるＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）を発現し
得、それによってポリペプチドまたはたん白質を産生し
得るベクターである。クローニングした配列の発現は発
現ベクターを適当なホスト細胞に組み込んだときに起
る。原核細胞発現ベクターを用いる場合は、適当なホス
ト細胞はクローニングした配列を発現し得る任意の原核
細胞であろう。同様に、真核発現ベクターを用いる場
合、適当なホスト細胞はクローニングした配列を発現し
得る任意の真核細胞である。重要なことは真核ＤＮＡは
介在配列を含み得るので、またそのような配列は原核細
胞中では正確に加工できないので、原核ゲノム発現ベク
ターライブラリーを産生するためには、ＩＣＡＭ−１を
発現し得る細胞からのｃＤＮＡを用いることが好まし
い。ｃＤＮＡを調製する方法およびゲノムライブラリー
を産生する方法は Maniatis, J. 等により開示されてい
る〔Molecular Cloning : A Laboratory Manual,コール
ド スプリング ハーバー プレス社、コールド スプ
リング ハーバー、ＮＹ（１９８２）〕。
【０１０３】上述の発現ベクターゲノムライブラリーを
用いてホスト細胞のバンクを創生する（その各々はライ
ブラリーの１員を含む）。発現ベクターはホスト細胞に
任意の種々の手段によって組み込みし得る（即ち、形質
転換、トランスフェクション、原形質体融合、エレクト
ロポーレーション等）。発現ベクター含有細胞のバンク
はクローン的に増殖させ、その各員は個々にアッセイし
て（イムノアッセイを用いて）これらが抗ＩＣＡＭ−１
抗体に結合し得るかどうかを測定する。抗ＩＣＡＭ−１
抗体に結合し得るたん白質を産生する細胞の発現ベクタ
ーはさらに分析してこれらのベクターが全ＩＣＡＭ−１
遺伝子を発現（または含有）するかどうか、ＩＣＡＭ−
１遺伝子のフラグメントのみを発現（または含有）する
かどうかあるいは生成物が免疫学的にＩＣＡＭ−１に関
係したとしてもＩＣＡＭ−１ではない遺伝子を発現（ま
たは含有）するかどうかを決定する。そのような分析は
任意の都合の良い方法で行なってよいけれども、好まし
いのは発現ベクターにクローニングされるＤＮＡまたは
ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することである。そ
のようなヌクレオチド配列を検査してＩＣＡＭ−１のト
リプシン消化フラグメント（表５）と同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードし得るかどうかを決定す
る。
【０１０４】ＩＣＡＭ−１遺伝子をコードするＤＮＡま
たはｃＤＮＡ分子を含む発現ベクターは、かくして、
（ｉ）抗ＩＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質の発現
を行なう能力；および（ii) ＩＣＡＭ−１のトリプシン
フラグメントの各々をコードし得るヌクレオチド配列の
存在によって認識し得る。そのような発現ベクターのク
ローニングＤＮＡ分子は発現ベクターから取り出して純
粋な形で単離できる。 実施例２１ 精製ＩＣＡＭ−１の機能活性 細胞中では、ＩＣＡＭ−１は細胞膜と会合した表面たん
白質として通常は機能する。従って、精製ＩＣＡＭ−１
の機能は分子を人工脂質膜（リポソームまたはベシク
ル）中にたん白質を洗浄剤可溶化脂質中に溶解し次いで
洗浄剤を透析により除去することによって再構成させた
のち試験した。ＪＹ細胞から精製し洗浄剤オクチルグリ
コシド中に上述のようにして溶出したＩＣＡＭ−１をベ
シクル中に再構成し、ＩＣＡＭ−１含有ベシクルをガラ
スカバースリップまたはプラスチック培養ウェルに融合
させたん白質に結合する細胞の検出をできるようにし
た。
【０１０５】平坦膜およびプラスチック結合ベシクルの
調製 ベシクルはＧay等の方法により調製した〔J. Immunol.
１３６；２０２６（１９８６）〕。即ち、タマゴホスフ
ァチジルクロリンとコレステロールをクロロホルム中に
溶解し７：２のモル比で混合した。脂質混合物をチッ素
ガス流下に回転させながら薄膜に乾燥させ、次いで１時
間で凍結乾燥させてすべての痕跡量のクロロホルムを除
去した。脂質膜を１％オクチルグリコシド／0.１４Ｍ N
aCl ／２０ mＭトリス（ pＨ7.２）中にホスファチジル
クロリン最終濃度0.１ mＭに溶解した。約１０μｇの精
製ＩＣＡＭ−１またはコントロール膜糖たん白質として
のヒトグリコホリン（シグマケミカル社、セントルイ
ス、ＭＯ）を溶解脂質の各ｍl に加えた。たん白質−脂
質−洗浄剤溶液を２００容量の２０ mＭトリス／0.１４
Ｍ NaCl 、 pＨ7.２の３回交換およびＨＢＳＳの１回交
換に対して４℃で透析した。
【０１０６】平坦膜は Brian等の方法により調製した
〔Proc. Natl. Acad. Sci., ８１：６１５９（１９８
４）〕。ガラスカバースリップ（直径１１mm）を１７×
洗浄剤（Linbro）の１：６希釈液中で１５分間煮沸し、
一夜蒸留水中で洗浄し、７０％エタノール中に浸し、風
乾させた。ＩＣＡＭ−１またはクリコホリンのいずれを
含有するベシクル懸濁液の８０μl 小滴を２４ウェルク
ルスタープレートのウェル底部に入れ、上記で調製した
ガラスカバースリップを静かに頂部に浮かした。室温で
の２０〜３０分のインキュベーション後、ウェルをＨＢ
ＳＳで満たし、カバースリップをひっくり返して平坦面
を上向きにした。次いでウェルをＨＢＳＳで十分洗浄し
て未結合ベシクルを除去した。平坦膜表面は全く空気に
さらさなかった。
【０１０７】ガラス表面に融合させた平坦膜による実験
途中で、ＩＣＡＭ−１を含むベシクルはマルチウェル組
織培養プレートのプラスチック表面に直接結合し、特異
的細胞結合により明らかなような機能活性を保持してい
ることが判明した。そのようなベシクルは以後“プラス
チック結合ベシクル（ＰＢＶ）と称する。というのは、
プラスチックに結合した脂質ベシクルの性質を測定する
のではないからである。プラスチック結合ベシクルは３
０μl のベシクル懸濁液を直接９６ウェル組織培養トレ
イ（ファルコン）中のウェル底部に加え次いで平坦膜に
ついて述べたようにしてインキュベーションおよび洗浄
を行うことによって調製した。細胞粘着アッセイ 平坦膜またはプラスチック結合ベシクルを用いた細胞粘
着アッセイの両方を本質的に同じ方法で行ったが、ＰＢ
Ｖアッセイの細胞数および容量は平坦膜アッセイに用い
たのの１／５に減じた。
【０１０８】正常コントロールおよびＬＦＡ−１を発現
できない白血球粘着欠損（ＬＡＤ）患者〔Anderson, D.
C. 等、J. Infect. Dis. １５２：６６８（１９８
５）〕からのＴリンパ球を、１μｇ／ｍl のコンカナバ
リン−Ａ（Con-A)を含む末梢血単核細胞をＲＰＭＩ−１
６４０＋２０％ＦＣＳ中で５×１０5 細胞／ｍl で３日
間培養することによって調製した。次いで、細胞をＲＰ
ＭＩで２回；５ mＭメチル−アルファーｂ−マノフィラ
ノシドで１回洗浄して残留レクチンを細胞表面から除去
した。細胞を１ｎｇ／ｍl の組換えＩＬ−２を含むＲＰ
ＭＩ／２０％ＦＣＳ中で増殖させ、培養開始後１０およ
び２２日の間で使用した。平坦膜またはＰＢＶに結合す
る細胞を検出するため、Con-Ａ芽球、Ｔ−リンパ腫ＳＫ
Ｗ−３、ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ腫様細胞系ＪＹ（Ｌ
ＦＡ−１陽性）およびＬＦＡ−１欠損リンパ腫様細胞系
（ＢＢＮ）（患者１由来、Springer, T.A.等、J. Expe
r. Med. １６０：１９０１−１９１８（１９８６）〕
を１ｍl のＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣＳ中の１×
１０7 細胞を１００μＣｉのＮa51 CrO4で３７℃、１時
間インキュベートし、次いでＲＰＭＩ−１６４０で４回
洗浄し未結合標識を除去することによって放射性標識さ
せた。モノクローナルブロッキング試験においては、細
胞またはプラスチック結合ベシクルはＲＰＭＩ−１６４
０／１０％ＦＣＳ中の２０μｇ／ｍl の精製抗体で４℃
にて３０分間前処理し、次いで４回洗浄して未結合抗体
を除去した。細胞結合に関しての２価イオンの効果の実
験においては、細胞をＣａ2+、Ｍｇ2+を含まないＨＢＳ
Ｓ＋１０％透析ＦＣＳで１回洗浄し、CaClと MgCl を決
められた濃度に加えた。すべての実験において、細胞お
よび平坦膜またはＰＢＶは適当な温度（４℃、２２℃ま
たは３７℃）で適当なアッセイバッファー中で予備平衡
させた。
【０１０９】精製ＩＣＡＭ−１に結合する細胞を測定す
るために、51Ｃr 標識細胞（平坦膜アッセイでの５×１
０5 ＥＢＶ形質転換体；ＰＢＶアッセイでの１×１０5
ＥＢＶ形質転換体またはＳＫＷ−３細胞、２×１０5 Co
n-Ａ芽球）を平坦膜またはＰＢＶ上で２５ Xg で２分間
遠心し、次いで４℃、２２℃または３７℃で１時間イン
キュベーションした。インキュベーション後、未結合細
胞を適当な温度での予備平衡させたバッファーによる充
填、吸引の８回のサイクルによって除去した。結合細胞
はウェル内容物の0.１Ｎ NaOH ／１％トリトンＸ−１０
０による可溶化およびガンマーカウンターでの計数によ
って定量した。％細胞結合は結合細胞からのcpm を入力
と細胞のcpm で割ることによって決定した。平坦膜アッ
セイにおいては、入力cpm はカバースリップの表面積を
培養ウェルの表面積と比較した比に対して集めた。
【０１１０】これらのアッセイにおいて、ＥＢＶ形質転
換Ｂリンパ腫細胞、ＳＫＷ−３Ｔ−リンパ腫細胞、およ
びCon-Ａ Ｔリンパ芽球は人工膜中のＩＣＡＭ−１に特
異的に結合した（図１３および図１４）。結合は、細胞
が等価の量の他のヒト細胞表面糖たん白質グリコホリン
を含んだコントロールの平坦膜またはベシクルに極めて
貧弱にしか結合しなかったことから特異的であった。さ
らにまた、ＬＦＡ−１陽性ＥＢＶ形質転換体およびCon-
Ａ芽球も結合したが、それらのＬＦＡ−１陰性等価物は
何ら有意の程度に結合せず、結合が細胞上のＬＦＡ−１
の存在に依存していることを示した。細胞結合の特異性
および細胞ＬＦＡ−１への依存性の両方はモノクローナ
ル抗体のブロッキング試験において確認した（図１
５）。ＪＹ細胞の結合はＩＣＡＭ−１含有ＰＢＶを抗Ｉ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体ＲＲ１／１前処理したと
き９７％まで抑制できた。同じ抗体による細胞の前処理
は殆ど効果がなかった。逆に、抗ＬＦＡ−モノクローナ
ル抗体ＴＳ 1／１８は９６％まで結合を抑制したがＰＢ
Ｖでなく細胞を前処理したときはわずかであった。ＬＦ
Ａ−３と反応性のコントロール抗体ＴＳ ２／９（異な
るリンパ球表面抗原）は前処理またはＰＢＶのいずれを
前処理したときも有意の抑制効果はなかった。この実験
は人工膜の若干量の不純物のないＩＣＡＭ−１自体が観
察された細胞粘着を媒介していることおよび粘着は結合
性細胞上のＬＦＡ−１に依存していることを示してい
る。
【０１１１】人工膜中のＩＣＡＭ−１への細胞の結合も
ＬＦＡ−１依存性粘着系の２つの他の特性：温度依存性
と２価カチオンの必要性を示した。図１６に示すよう
に、Con-Ａ芽球はＰＢＶ中のＩＣＡＭ−１に３７℃で最
も効果的に、２２℃で部分的に、４℃で極めて貧弱に結
合した。図１７に示すように、結合は完全に２価カチオ
ンの存在に依存している。生理学上の濃度においては、
Ｍｇ2+は単独で最高の細胞結合を示したが、Ｃａ2+の単
独は極めて低レベルの結合を示した。しかしながら、Ｃ
2+と組合せた通常濃度の１／１０のＭｇ2+は共働効果を
有し最高の結合を示した。要約すれば、人工膜中に混入
させた精製ＩＣＡＭ−１に対する細胞結合の特性性、モ
ノクローナル抗体による特異的抑制、および温度および
２価カチオンの必要性はＩＣＡＭ−１がＬＦＡ−１依存
性の粘着系の特異的リガンドであることを示している。
【０１１２】実施例２２ アレルギーおよび毒性パッチ試験反応におけるＩＣＡＭ
−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 ５人の正常人の皮ふ生検をそのＩＣＡＭ−１およびＨＬ
Ａ−ＤＲについて行った。ある血管中の内皮細胞は通常
ＩＣＡＭ−１を発現するけれども、正常皮ふからのケラ
チン細胞にはＩＣＡＭ−１は発現しないことが判った。
正常皮ふ生検からの任意ケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲ
の染色は観察されなかった。ＩＣＡＭ−１とクラス II
抗原の発現動力学をアレルギー性および毒性皮ふ傷害の
生検の細胞において検討した。検討した６人の対象者の
半分がハプテンの適用後４時間でＩＣＡＭ−１を発現し
たケラチン細胞を有していることが判った（表１０）。
ハプテンへの露出時間によりケラチン細胞上にＩＣＡＭ
−１を発現する人の割合が増大し、また４８時間までに
ケラチン細胞当りより多くのＩＣＡＭ−１発現を示す染
色強度も増大した。事実、この時点で、すべての生検の
ケラチン細胞の部分がＩＣＡＭ−１に対して陽性に染色
した。７２時間（ハプテン除去後２４時間）で、８人の
対象者の７人のケラチン細胞にＩＣＡＭ−１を発現して
おり、１人の対象者のＩＣＡＭ−１発現は４８〜７２時
間の間に弱くなった。
【０１１３】
【表１０】 表 １０ アレルギーパッチ試験生検からのケラチン細胞上の ＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲの誘起の動力学 ─────────────────────────────── パッチ適用 生検の数 ICAM-1 HLA-DR ICAM-1と 後の時間 のみ のみ HLA-DR ─────────────────────────────── 正常皮ふ ５ ０ ０ ０ ─────────────────────────────── アレルギー パッチ試験 ４ ６ ３a ０ ０ ８ ９ ３ ０ ０ ２４ ８ ７ ０ ０ ４８b ８ ５ ０ ３ ７２ ８ ６ ０ １ ───────────────────────────────a サンプルは少なくとも小群のケラチン細胞が染色し
た場合に陽性とみなした。
【０１１４】b すべてのパッチはこの時点で除去し
た。 組織学上、ハプテンの適用後４時間で採取した生検から
のケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の染色像は通常小群生
状であった。４８時間後、ＩＣＡＭ−１はケラチン細胞
の大部分の表面上に発現し、傷害の中心および周辺間に
差異はなかった。染色強度はケラチン細胞が爪角質層に
近づいたとき減少した。これは傷害の中心および周辺か
ら採られた生検において見い出された。また、この時間
でも、パッチ試験は陽性であった（浸潤、紅斑、小
胞）。異なるハプテンを感受性個人に適用してもＩＣＡ
Ｍ−１発現における差異は見られなかった。ケラチン細
胞以外にも、ＩＣＡＭ−１は傷害部位のいくつかの単核
細胞および内皮細胞上にも発現した。
【０１１５】アレルギー皮ふ傷害のケラチン細胞上での
ＨＬＡ−ＤＲの発現はＩＣＡＭ−１の発現よりも頻度は
小さかった。検討した対象者のうち、ハプテン適用後２
４時間までにＨＬＡ−ＤＲに陽性に染色したケラチン細
胞による傷害を有するものはなかった。事実、わずかに
４人の生検サンプルがＨＬＡ−ＤＲを発現したケラチン
細胞を有するに過ぎず、ＨＬＡ−ＤＲに陽性でＩＣＡＭ
−１に陽性でないケラチン細胞を有する生検はなかっ
た。アレルギーパッチ試験傷害と対照的に、はず油また
はラウリル硫酸ナトリウムで誘発させた毒性パッチ試験
傷害は試験のすべての時点でその表面にＩＣＡＭ−１を
殆ど示さないケラチン細胞を有していた。実際に、パッ
チ適用後４８時間で、これはアレルギー性パッチ試験対
象者における最適の時点であるが、１４人の毒性パッチ
試験対象者のうちの１人が傷害中にＩＣＡＭ−１を発現
するケラチン細胞を有していた。また、アレルギー性パ
ッチ試験生検と対照的に、毒性パッチ試験傷害のケラチ
ン細胞上にＨＬＡ−ＤＲは発現しなかった。
【０１１６】これらのデータはＩＣＡＭ−１が免疫系炎
症中で発現し毒性系炎症では発現しないことを示してお
り、かくして、ＩＣＡＭ−１の発現は、疾患が免疫抑制
治療剤の拒絶または尿毒性によるのかどうかの判断が難
しい場合の急性腎疾患のような免疫系および毒性系炎症
を区別するのに使用できる。腎生検およびＩＣＡＭ−１
発現の向上の評価が免疫系拒絶と非免疫系毒性反応の区
別を可能にするであろう。
【０１１７】
【表１１】 表 １１ 毒性パッチ試験生検からのケラチン細胞上の ＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲの誘起動力学 ─────────────────────────────── パッチ適用 生検の数 ICAM-1 HLA-DR ICAM-1と 後の時間(hr) のみ のみ HLA-DR ─────────────────────────────── ４ ４ ０ ０ ０ ８ ３ １a ０ ０ ２４ ３ １ ０ ０ ４８b １４ １ ０ ０ ７２ ３ １ ０ ０ ───────────────────────────────a サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色さ
れた場合陽性とみなした。
【０１１８】b すべてのパッチはこの時点で除去し
た。 実施例２３ 良性皮ふ病中のＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 種々のタイプの炎症性皮ふ病を有する患者からの傷害の
皮ふ生検からの細胞をそのＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲ
の発現について検討した。アレルギー性接触湿疹、天疱
瘡、および扁平苔癬の生検中のケラチン細胞の一部はＩ
ＣＡＭ−１を発現した。扁平苔癬は４８時間アレルギー
性パッチ試験生検で見られた結果と同等か幾分強い像に
よる最も強く染色を示した（図１４）。アレルギー性パ
ッチ試験の結果と同様に、最も強いＩＣＡＭ−１染色は
高単核細胞浸潤部位で見られた。さらにまた、試験した
１１の扁平苔癬生検のうちの８つはケラチン細胞上でＨ
ＬＡ−ＤＲ発現について陽性であった。
【０１１９】発振とじんま疹を有する患者の皮ふ生検か
らのケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現は少なかっ
た。これらの疾患を有する試験した７人の患者のうち４
人のみが傷害部位でＩＣＡＭ−１を発現したケラチン細
胞を有していた。ＨＬＡ−ＤＲ発現は１人の患者におい
てのみであり、これはＩＣＡＭ−１と関連していた。試
験した良性炎症皮ふ病のすべてからの内皮細胞および単
核細胞浸潤の部分は変化度合でＩＣＡＭ−１を発現して
いた。
【０１２０】
【表１２】 表 １２ 良性皮ふ病からのケラチン細胞上の ＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 ──────────────────────────────────── 診 断 生検数 ICAM-1のみ HLA-DRのみ ICAM-1とHLA-DE ──────────────────────────────────── アレルギー性 ５ ３a ０ ２ 接触湿疹 扁平苔癬 １１ ３ ０ ８ 天疱瘡 ２ ２ ０ ０ 発 疹 ３ ２ ０ ０ じんま疹 ４ １ ０ １ ────────────────────────────────────a サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色され
た場合陽性とみなした。 実施例２４ 悪性皮ふ病中のＩＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 良性皮ふ状態からの傷害とは異なり、悪性皮ふ傷害から
のケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現は変化に富んで
いた（表１３）。試験した皮ふＴ−細胞リンパ腫２３例
のうち、ＩＣＡＭ−１陽性ケラチン細胞は１４例のみに
おいて同定された。菌状息肉腫傷害の生検からのケラチ
ン細胞では、病気の進行がより前の段階に進むにつれて
そのＩＣＡＭ−１発現を消失する傾向にあった。しかし
ながら、ＩＣＡＭ−１発現は皮ふＴ細胞リンパ腫傷害の
殆どからの変化割合の単核細胞浸潤上に見られた。試験
した残りのリンパ腫のうちでは、８つのうち４つがＩＣ
ＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有していた。試験し
た悪性皮ふ病を有する２９人の患者のうちう、５例はＩ
ＣＡＭ−１を発現することなしにＨＬＡ−ＤＲを発現し
たケラチン細胞を有していた。
【０１２１】
【表１３】 表 １３ 悪性皮ふ病からのケラチン細胞上の ＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲの発現 ───────────────────────────────── 診 断 生検数 ICAM-1のみ HLA-DRのみ ICAM-1とHLA-DE ───────────────────────────────── CTCL,MFI ８ １a ０ ４ CTCL,MFII-III １０ １ ２ ５ CTCL,SS ３ １ ０ ２ CTCL,ラージ細胞 ２ ０ ２ ０ CBCL ２ ０ ０ １ 皮ふ白血病 ３ １ １ １ ヒスチオサイトシス X １ ０ ０ ０ ──────────────────────────────────a サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色され
た場合陽性とみなした。 実施例２５ ヒト末梢血単核細胞の増殖上の抗ＩＣＡＭ−１抗体の効
果 ヒト末梢血単核細胞を抗原またはマイトジェンの存在お
よび認識より誘起させ増殖させる。マイトジェン、コン
カナバリンＡまたはＴ細胞結合性抗体のＯＫＴ3 のよう
なある種の分子は末梢血単核細胞の非特異的増殖を引き
起こす。
【０１２２】ヒト末梢血単核細胞はこれらが特異的抗原
を認識し得る細胞の細個体群 (subpopulation) からな
る点で不均質である。特定の特異抗原を認識し得る末梢
血単核細胞がその抗原に出会った場合、単核細胞の上記
細個体群の増殖は誘起される。破傷風トキソイドおよび
キーホールリンペットヘモシアニンは末梢単核細胞の細
個体群により認識される抗原の例であるが感応化した個
体中のすべて末梢単核細胞によって認識されるものでは
ない。細胞−細胞粘着を必要とすることが知られている
系中でのヒト末梢血単核細胞の増殖的応答を抑制する抗
ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６の能力
を試験した。末梢血単核細胞をフィコールペーグ (Fico
ll-Paque，ファルマシア社）で製造者が推奨するような
勾配で精製した。界面を集めた後、細胞をＲＰＭＩ１６
４０培地で３回洗浄し平底９６ウェルマイクロタイター
プレート中で１０％ウシ胎児血清、２ mＭグルタミンお
よびジェンタマイシン（５０μｇ／ｍl ）を含むＲＰＭ
Ｉ１６４０培地中で１０6 細胞／ｍl の濃度で培養し
た。
【０１２３】抗原、Ｔ−細胞マイトジェン、コンカナバ
リンＡのいずれか（0.２５μｇ／ｍl ）；Ｔ−細胞結合
性抗体ＯＫＴ3 （0.００１μｇ／ｍl ）；キーホールリ
ンペットヘモシアニン（１０ｇ／ｍl ）または破傷風ト
キソイド（供給源からの希釈１：１００）を上記のよう
にして培養した細胞中に抗ＩＣＡＭ−１抗体（Ｒ６−５
−Ｄ６；最終濃度５ｇ／ｍl ）の存在または不存在下に
加えた。細胞はアッセイが終了する前の3.５日（コンカ
ナバリンＡ試験）、2.５日（ＯＫＴ3 試験）、または5.
５日（キーホールリンペットヘモシアニンおよび破傷風
トキソイド試験）で培養した。アッセイ終了前１８時間
で、2.５μＣi の 3Ｈ−チミジンを培養物に加えた。細
胞増殖を末梢血単核細胞によりＤＮＡへのチミジンの取
り込みを測定することによってアッセイした。取り込ま
れたチミジンを集め液体シンチレーションカウンター中
で計数した〔Merluzzi等、J. Immunol. １３９：１６６
−１６８（１９８７）〕。これらの実験の結果は図１８
（コンカナバリンＡ試験）、図１９（ＯＫＴ3 試験）、
図２０（キーホールリンペットヘモシアニン試験）、お
よび図２１（破傷風トキソイド試験）に示す。
【０１２４】抗ＩＣＡＭ−１抗体は単核細胞中の非特異
Ｔ−細胞マイトジェン、Con Ａ；非特異的Ｔ−細胞会合
抗原、ＯＫＴ−３；および特異抗原、キーホールリンペ
ットヘモシアニンおよび破傷風トキソイドに対する増殖
的応答を抑制することが判明した。抗ＩＣＡＭ−１抗体
による抑制は抗ＬＦＡ−１抗体の抑制効果と匹敵し、Ｉ
ＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の官能性リガンドであることお
よびＩＣＡＭ−１のアンタゴニストは特異的防御系応答
を抑制するであろうことを示唆している。 実施例２６ 乾癬皮ふ傷害のケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１発現 乾癬を有する５例の患者からの皮ふ生検中のＩＣＡＭ−
１発現を開始前およびＰＵＶＡ治療の途中で周期的に検
討した。生検は組織学によって確認した古典的乾癬を有
する５例の患者から得た。生検は実質的にＰＵＶＡ治療
の前および指示された時間中に採取した。ＰＵＶＡは週
に３〜４回投与された。生検は５例の患者の乾癬斑の周
囲から採取し、生検以外に、これら患者の４人の臨床的
に正常な皮ふからも採取した。
【０１２５】新しい皮ふ生検試料を凍結した液体チッ素
中に保存した。６ミクロンの保存切片を一夜室温で風乾
し、アセトン中で１０分間固定し、直ちに染色しまたは
アルミニウムホイルで包み染色するまで−８０℃で保存
した。染色は次の方法で作った。切片をモノクローナル
抗体でインキュベートし、ジアミノベンジジン H2O2 、
基質を用いて３段階イムノパーオキシダーゼ法により染
色した〔Stein, H. 等、Adv. Cancer Res. ４２；６７
−１４７、（１９８４）〕。へん桃腺およびリンパ節を
抗ＩＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲ染色用の陽性コント
ロールとして用いた。一次抗体の不存在下で染色した組
織は陰性コントロールであった。ＨＬＡ−ＤＲに対する
モノクローナル抗体を Becton Dickinson 社( カリホル
ニア州マウンテンビュー) から購入した。抗ＩＣＡＭ−
１モノクローナル抗体はＲ６−５−Ｄ６であった。パー
オキシダーゼ−コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇおよ
びパーオキシダーゼ−コンジュゲートブタ抗ウサギＩｇ
はスウェーデン、コペンハーゲンの DAKAPATTSより購入
した。ジアミノベンジジン−テトラヒドロクロリドはシ
グマ社（セントルイス) より得た。
【０１２６】試験の結果は数種の血管の内皮細胞が疾患
および正常皮ふの両方でＩＣＡＭ−１を発現しているこ
とを示したが、染色強度およびＩＣＡＭ−１を発現する
血管の数は乾癬皮ふ傷害内で増大した。さらに、５例の
患者からの未治療乾癬皮ふ傷害のケラチン細胞中のＩＣ
ＡＭ−１の発現像はわずかに小量の細胞染色から多数の
ケラチン細胞が染色されているまでに変化した。ＰＵＶ
Ａ治療の途中では、患者の２人（患者２と３）のＩＣＡ
Ｍ−１発現は臨床的軽快さに先行しあるいは一致した著
しい低減を示した。患者１、４および５は、それぞれ、
臨床的軽快あるいは悪化に関連してＰＵＶＡ治療中ＩＣ
ＡＭ−１発現を減少あるいは増大させた。ＰＵＶＡ治療
前後の正常皮ふからのケラチン細胞上にＩＣＡＭ−１発
現はなかった。このことはＰＵＶＡは正常皮ふからのケ
ラチン細胞上にＩＣＡＭ−１を誘起しないことを示して
いる。
【０１２７】注目すべきことは単核細胞浸潤密度はケラ
チン細胞上のＩＣＡＭ−１発現量と関連していることで
あった。このことはＩＣＡＭ−１発現も弱まったときＰ
ＵＶＡ治療中の傷害中の単核細胞の数も減少することお
よびケラセン細胞上のＩＣＡＭ−１発現がより顕著にな
ったときＰＵＶＡ治療中単核細胞の数が増大することの
両方に関係している。内皮細胞および皮ふ単核細胞はま
たＩＣＡＭ−１陽性である。臨床的に正常な皮ふにおい
ては、ＩＣＡＭ−１発現はケラチンの標識化なしで内皮
細胞に確認された。ケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲの発
現は可変的であった。ＩＣＡＭ−１陽性でないＨＬＡ−
ＤＲ陽性生検は存在しなかった。要約すれば、これらの
結果は、治療前では、ＩＣＡＭ−１発現はケラチン細胞
上で高く、単核細胞浸潤密度と相関していることを示し
ている。ＰＵＶＡ治療中は、ＩＣＡＭ−１染色の著しい
減少が臨床的改善と平行して見られる。組織学上でも、
皮ふ浸潤は消失した。臨床的悪化が治療中に見られる場
合には、ケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現並びに皮
ふ浸潤密度も増大した。臨床的軽快が治療中に見られた
ときは、ケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１染色における一
致した減少並びに皮ふ湿潤の減少があった。即ち、ケラ
チン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現は皮ふの単核細胞浸潤
密度に相応する。これらのデータはＰＵＶＡ治療に対す
る臨床的応答は単核細胞のよりおだやかな下降と平行し
てケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１発現のはっきりした減
少をもたらすことを示している。このことはケラチン細
胞上のＩＣＡＭ−１発現が皮ふ浸潤の開始および持続に
応答性であること、および行なわれたＰＵＶＡ治療はＩ
ＣＡＭ−１を調整し皮ふ浸潤および炎症応答を緩和して
いることを示している。データはまたＰＵＶＡ治療中の
ケラチン細胞上に可変性のＨＬＡ−ＤＲがあったことも
示している。
【０１２８】乾癬傷害のケラセン細胞上のＩＣＡＭ−１
発現は傷害臨床上の厳格さおよび皮ふ浸潤の大きさと相
関している。即ち、ＩＣＡＭ−１は乾癬において中心的
役割を発揮し、その発現の抑制および／またはその単核
細胞上でのＣＤ１８コンプレックスとの相互作用の抑制
は本病変の有効な治療となるであろう。さらにまた、ケ
ラチン細胞上のＩＣＡＭ−１発現をモニターすることは
乾癬の診断、予防、および治療経過を評価するため有効
な手段となるであろう。
【０１２９】
【表１４】 表 １４ ＰＵＶＡ治療中および治療前の乾癬皮傷害および臨床的に 正常な皮ふのケラチン細胞によるＩＣＡＭ−１発現 ───────────────────────────────── 患 者 No. PUVA治療前お 1 2 3 4 5 よび中の時間 PS PS N PS N PS N PS N ───────────────────────────────── ０ + + - ++ - ++ - +++ - １日 + １週 + + - - - ++ - + - 0 ２週 ++ + - + - + - ３週 ++ * 0 ４週 ++ + - - - ++ - * * ５〜６週 - - - - 0 ７週 * (++) (+) +++ - * 1０週 (+) - - ────────────────────────────────── +++ 多くの陽性ケラチン細胞 ++ 部分的陽性ケラチン細胞 + わずかな陽性ケラチン細胞 (+) 極めてわずかな拡散した陽性ケラチン細胞 - 陽性染色なし * 臨床的軽快 0 〃 悪化 実施例２７ 混合リンパ球反応についての抗ＩＣＡＭ−１の効果 前述したように、ＩＣＡＭ−１はＬＦＡ−１依存性細胞
粘着より媒介された免疫応答中の有効な細胞相互作用の
ために必要である。免疫応答または炎症疾患中のＩＣＡ
Ｍ−１の誘起は白血球の相互または内皮細胞との相互作
用を可能にする。
【０１３０】２人の無関係の個人からのリンパ球を各互
いの存在下で培養したときは、芽球形質転換およびリン
パ球の細胞増殖が観察される。１つの集団の白血球を第
２集団の白血球の存在へのこの応答は混合リンパ球反応
（ＭＬＲ）として公知であり、リンパ球のマイトジェン
の添加に対する応答と類似である〔Immunology The Sci
ence of Self-Nonself Discrimination, Klein, J. Joh
n Willey & Sons 社、ＮＹ（１９８２），ｐp ４５３−
４５８〕。抗ＩＣＡＭモノクローナル抗体のヒトＭＬＲ
上の効果について試験した。これらの実験は次のように
して行った。末梢血を正常な健康ドナーから静脈穿刺に
より採取した。血液をヘパリン化チューブに集め、室温
で Punk's G (GIBCO社) 平衡塩溶液（ＢＳＳ）で１：１
に希釈した。血液混合物（２０ｍl ）を１５ｍl のFico
ll/Hypaque密度勾配( ファルマシア社、密度1.０７８、
室温) 上に層化し、１０００ Xg で２０分間遠心した。
次いで界面を集め、 Punk's G 中で３回洗浄した。細胞
をヘマシトメーター上で計数し、0.５％のジェンタマイ
シン、１ mＭＬ−グルタミン(GIBCO社) および５％加熱
不活化（５６℃、３０分）ヒトＡＢ血清（フローラボラ
トリーズ社）とを含むＲＰＭＩ−１６４０培地(GIBCO
社) （以下、ＲＰＭＩ培地と呼ぶ）中に再懸濁させた。
【０１３１】マウス抗−ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５−Ｄ
６）をこの実験で用いた。すべてのモノクローナル抗体
（ジャックソンイムノリサーチラボラトリーズ、ボスト
ン、ＭＡにより腹水から調製された）を精製Ｉg G 調製
物として用いた。別々のドナーからのスチミュレーター
細胞を１０００Ｒで照射し、レスポンダー細胞と同じ濃
度で培養した。培養当りの総容量は0.２ｍl であった。
コントロールはレスポンダー細胞単独およびシチミュレ
ーター細胞単独を含んでいた。培養プレートを３７℃で
５％ＣＯ2 −湿潤空気雰囲気中で５日間インキュベート
した。各ウェルを0.５μＣi のトリチウム化チミジン（
3ＨＴ）（ニューイングランドニュクレア社）で培養の
最後の１８時間脈動させた。ある場合には、２通りのＭ
ＬＲを行った。プロトコールは第２ドナー細胞を照射に
より不活化されてない以外は同じであった。
【０１３２】細胞をガラス繊維フィルター上に自動化マ
ルチプルサンプルハーベスタ (Skatron 社、ノルウェ
ー) を用いて採取し、水およびメタノールですすいだ。
フィルターをオーブン乾燥させ、アクアゾル中でベッグ
マン（ＬＳ−３８０１）液体シンチレーションカウンタ
ーで計数した。結果は６ケの個々の培養物について平均
ＣＰＭ±標準誤差として示している。表１５は精製抗Ｉ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体が２０ｎg ／ｍl で明ら
かな有意の抑制でもって投与量依存の形でＭＬＲを抑制
していた。精製マウスＩg Gは殆どあるいは全く抑制効
果を示さなかった。抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体
によるＭＬＲの抑制は抗体を培養の最初の２４時間以内
で加えたとき生じる（表１６）
【０１３３】
【表１５】 表 １５ ワンウェイリンパ球反応についての 抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果 ─────────────────────────────────── レスホ゜ンタ゛ー スチミュレーター 抗 体c 3HT取り込み(CPM) 細胞a 細胞b ─────────────────────────────────── − − − 445d ± 143 − ＋ − 148 ± 17 ＋ − − 698 ± 72 ────────────────────────────────── ＋ ＋ − 42,626 ± 1,579 ────────────────────────────────── ＋ ＋ mIgG (10.0 μg) 36,882 ± 1,823(14%) ＋ ＋ mIgG ( 0.4 μg) 35,500 ± 1,383(17%) ＋ ＋ mIgG (0.02 μg) 42,815 ± 1,246( 0%) ────────────────────────────────── ＋ ＋ R6-5-D6 (10.0 μg) 8,250 ± 520 (81%) ＋ ＋ R6-5-D6 ( 0.4 μg) 16,142 ± 858 (62%) ＋ ＋ R6-5-D6 (0.03 μg) 28,844 ± 1,780(32%) ──────────────────────────────────a レスポンダー細胞（6.２５×１０5 ／ｍl ）b スチミュレーター細胞（6.２５×１０5 ／ｍl 、１
０００Ｒでの照射）c 最終濃度（μｇ／ｍl ）でのＩＣＡＭ−１に対する
精製モノクローナル抗体（Ｒ６−５−Ｄ６）または精製
マウスＩg G （ｍＩｇＧ）d ５〜６培養物の平均±標準誤差、（ ）内の数はＭ
ＬＲの％抑制を示す
【０１３４】
【表１６】 表 １６ 抗ＩＣＡＭ−１の添加時間 Ｒa Ｓb 添加c 3ＨＴ 取り込み(CPM) 抗体または培地の添加時間 日0 日1 日2 − − 培地 205d ±14 476±132 247±75 − ＋ 培地 189 ±16 nde nd ＋ − 培地 1,860 ±615 nd nd ＋ ＋ 培地 41,063 ±2,940 45,955±2,947 50,943±3,072 ＋ ＋ R6-5-D6 17,781 ±1,293 38,409±1,681 47,308±2,089 (57%)f (16%) (7%) a レスポンダー細胞（6.２５×１０5 ／ｍl ）b スチミュレーター細胞（6.２５×１０5 ／ｍl ）c 培養培地またはＩＣＡＭ−１に対する精製モノクロー
ナル抗体（Ｒ６−５−Ｄ６），１０μｇ／ｍl で日０で
２４時間間隔で加えた。
【０１３５】d ４〜６培養物の平均値±標準誤差e ｎｄ＝測定せずf ％抑制 要約すれば、ＩＣＡＭ−１に対する抗体のＭＬＲを抑制
する能力はＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体が急性移植
拒絶に治療的利用性を有していることを示している。Ｉ
ＣＡＭ−１モノクローナル抗体はまたＬＦＡ−１／ＩＣ
ＡＭ−１調整細胞−細胞相互作用に依存する関連免疫媒
介不整における治療的利用性を有している。本実験はＩ
ＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の添加が反応に
最初２４時間中に加えたときに混合リンパ球反応（ＭＬ
Ｒ）を抑制することを示している。さらにまた、ＩＣＡ
Ｍ−１はインビトロ培養中のヒト末梢血単核細胞につつ
いて状態向上なる。
【０１３６】さらにまた、ＩＣＡＭ−１は静止ヒト末梢
血リンパ球または単核細胞上には発現しないことが見い
出された。ＩＣＡＭ−１は単独培養細胞または混合リン
パ球反応中の未調整ドナー細胞との共培養細胞の単核細
胞上で、通常のフローサイトメトリック分析を用いるこ
とにより状態向上される。単核細胞上でのこのＩＣＡＭ
−１の状態向上は炎症の指示剤として、特にＩＣＡＭ−
１が急性または慢性炎症を有するヒトの新鮮単核細胞上
で発現する場合に使用できる。活性化単核細胞に対する
ＩＣＡＭ−１の特異性およびＩＣＡＭ−１に対する抗体
のＭＬＲを抑制する能力とはＩＣＡＭ−１モノクローナ
ル抗体が急性移植拒絶および細胞−細胞相互作用を必要
とする関連免疫媒介不整における診断上および治療上の
潜在力を有し得ることを示している。
【０１３７】実施例２８ 抗ＩＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ−１抗体の混合投与の相
乗効果 実施例２７で示したように、ＭＬＲは抗ＩＣＡＭ−１抗
体によって抑制される。ＭＬＲはまた抗ＬＦＡ−１抗体
によっても抑制できる。抗ＩＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ
−１抗体の組合せ投与が促進されたあるいは相乗的効果
を有するかどうかを決定するために、ＭＬＲアッセイ
（実施例２７に記載したようにして行った）を２つの抗
体の種々の濃度の存在下で行った。このＭＬＲアッセイ
は抗ＩＣＡＭ−１＋抗ＬＦＡ−１の組合せが、抗体単独
では劇的にＭＬＲを抑制しない濃度において、ＭＬＲ応
答を抑制するのに著しい効力があることを示した（表１
７）。この結果は抗ＩＣＡＭ−１抗体（またはそのフラ
グメント）と抗ＬＦＡ−１抗体（またはそのフラグメン
ト）の共投与を包含する治療が改善された抗炎症治療を
与える能力を有することを示している。そのような改善
された治療は治療上有効である他の場合よりもより低い
抗体投与量の投与を可能にし、また高濃度の個々の抗体
が抗イデオタイプ応答を誘起するような場合に重要性を
示す。
【０１３８】
【表１７】 表 １７ 混合リンパ球反応についての各種投与量での抗 ＩＣＡＭ−１と（Ｒ3.１）抗ＬＦＡ−１の効果 ──────────────────────────────── ％抑制 濃度（μｇ／ｍl ） 抗−ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５−Ｄ６） 抗-LFA-1 0 .004 .02 .1 .5 2.5 0.０ 0 7 31 54 69 70 0.0008 1 7 28 48 62 71 0.004 0 13 30 50 64 72 0.02 29 38 64 75 84 86 0.1 92.5 90 91 92 92 92 0.5 93 90 90 92 93 91 ───────────────────────────────── 実施例２９ 移植した同種異系臓器の拒絶を抑制するのに抗ＩＣＡＭ
−１抗体の効果 同種異系移植臓器の拒絶を抑制における抗ＩＣＡＭ−１
抗体の効果を示すために、カニクイザルに Cosimi 等の
方法 (Transplant. Proc. １３；４９９−５０３（１９
８１）〕に従って同種異系の腎臓を移植した、ただし、
麻酔薬としてバリウム (valium) とケタミンを用いる修
正を加えた。
【０１３９】即ち、腎臓移植を本質的に次のようにして
行った。異型腎アログラストを３〜５ｋg のカニクイザ
ルに、バリウムとケタミンによる麻酔の誘起後、本質的
に Marquetにより記載されたようにして行った〔Marque
t 等、Medical Primatology, Part II, Basel, Karger,
p. １２５）１９７２）〕。大動脈または大静脈のパッ
チ上のドナー腎臓の末端−側面アナストモーシス (anas
tomoses)を７−０プロレン縫合線を用いて構築した。ド
ナー尿管をスパチュラ処理し外のう的方法によってプラ
ッダー中に埋め込んだ〔Taguchi, Y. 等、Dausset 等
編、Advances in Transplantation,バルチモア、ウィリ
アムス アンド ウィルキンス、p ３９３（１９６
８）〕。腎機能を１週毎にまたは２週間毎の血清クリア
チニン測定によって評価した。さらに、頻ぱんなアログ
ラフト生検を組織病理学検査用に採取し、完全解剖をす
べての死んだ受容体で行った。殆どの受容体において、
両側性腎摘出を移植時に行い、その後の尿毒症死をアロ
グラフト生存の終点で考慮した。ある受容体において
は、片側の生腎摘出と対側尿管ライゲーションを移植時
点で行った。アログラフト拒絶が生じたときは、同原尿
管上のライゲーチュアを除去し、正常腎機能の再生と受
容動物の免疫学的モニターを続ける機会を得た。
【０１４０】モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６を１２
日間毎日投与したが、移出前２日から１〜２ｍｇ／ｋg
／日の投与量で開始した。クレアチニンの血清量を周期
的試験して拒絶をモニターした。同種異系腎の免疫系拒
絶に対する抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果は図１９に示す。
【０１４１】
【表１８】 表 １８ 同種異系腎受容体の生存時間 ──────────────────────────── 対照サル 生存時間 R6-5-D6 処理サル 生存時間 (days) (days)a ───────────────────────────── １ ８ １ ２０ ２ １１ ２ ８ ３ １１ ３ ３０ ４ １０ ４ ３１ ５ ９ ５ １１ ６ １０ ６ ２３b ──────────────────────────────a 動物は移植前２日から１２日間毎日１−２ｍｇ／ｋg
／日で投与した。
【０１４２】b １９８８年４月８日でまだ生存してい
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】正常細胞とＬＦＡ−１欠損細胞間の粘着を図式
的に示す。
【図２】正常細胞／正常細胞粘着過程を図式的に示す。
【図３】５０ｎg ／ｍl のＰＭＡの不存在（×）または
存在（○）下の細胞凝集の動力学を示す。
【図４】ＬＦＡ−１- 細胞とＬＦＡ−１+ 細胞間の凝集
を示す。図中に示すようにカルボキシフルオレスセイン
ジアセテート標識ＥＢＶ−形質転換細胞（１０4 ）を１
０5 未標識同元細胞（黒枠）またはＪＹ（白枠）とＰＭ
Ａの存在下に混合した。1.５時間後、凝集物中または遊
離の標識細胞を実施例２の定量アッセイを用いて計数し
た。凝集物中の標識細胞の％を示す。２つの内の１つの
代表的な試験を示している。
【図５】ＪＹ細胞からのＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の免
疫沈降を示す。ＪＹ細胞のトリトンＸ−１００溶解物
（レーン１および２）または対照溶解バッファー（レー
ン３および４）をＩＣＡＭ−１に結合し得られる抗体
（レーン１および３）またはＬＦＡ−１に結合し得る抗
体（レーン２および４）で免疫沈降させた。パネルＡは
還元条件下での結果を示し、パネルＢは非還元条件下で
得られた結果を示す。分子量標準物はレーンＳに示し
た。
【図６】ヒト皮ふ繊維芽細胞上のＩＣＡＭ−１発現に対
してのＩＬ−１とガンマーインターフェロンの効果の動
力学を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８×１０4 細胞／0.
３２cm2 のウェルの密度に増殖させた。ＩＬ−１（１０
μ／ｍl 、黒丸）または組換えガンマーインターフェロ
ン（１０μ／ｍl 、白四角）を加え、示した時間で、４
℃に冷却し間接結合アッセイを実施した。標準偏差は１
０％を越えなかった。
【図７】ＩＣＡＭ−１へのＩＬ−１とガンマーインター
フェロン効果の濃度依存性を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞
は８×１０4 細胞／0.３２cm2 ／ウェルの密度に増殖さ
せた。ＩＬ−２（白丸）、組換えヒトＩＬ−１（白四
角）、組換マウスＩＬ−１（黒四角）および組換えベー
タインターフェロン（白三角）を示した希釈率で４時間
（ＩＬ−１）または１６時間（ベータおよびガンマーイ
ンターフェロン）インキュベートした。示した結果は４
回測定の平均を示し、標準偏差は１０％を越えなかっ
た。
【図８】ＩＣＡＭ−１ cＤＮＡのヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列を示す。第１ＡＴＧは位置５８にある。ＩＣ
ＡＭ−１トリプシンペプチドに相当する翻訳配列はアン
ダーラインを施してある。疎水性推定シグナルペプチド
およびトランスメンブラン配列は肉太アンダーラインを
施している。Ｎ−結合グリコシル化部位は囲っている。
位置２９７６のポリアデニリル化シグナルＡＡＴＡＡは
オーバーラインを施している。図示した配列はＨＬ−６
０ｃＤＮＡクローン用である。内皮細胞ｃＤＮＡはその
長さの大部分に亘って配列されており小さな差異のみを
示した。
【図９】ＩＣＡＭ−１ cＤＮＡのヌクレオチドおよびア
ミノ酸配列を示す。第１ＡＴＧは位置５８にある。ＩＣ
ＡＭ−１トリプシンペプチドに相当する翻訳配列はアン
ダーラインを施してある。疎水性推定シグナルペプチド
およびトランスメンブラン配列は肉太アンダーラインを
施している。Ｎ−結合グリコシル化部位は囲っている。
位置２９７６のポリアデニリル化シグナルＡＡＴＡＡは
オーバーラインを施している。図示した配列はＨＬ−６
０ｃＤＮＡクローン用である。内皮細胞ｃＤＮＡはその
長さの大部分に亘って配列されており小さな差異のみを
示した。
【図１０】ＩＣＡＭ−１ cＤＮＡのヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を示す。第１ＡＴＧは位置５８にある。Ｉ
ＣＡＭ−１トリプシンペプチドに相当する翻訳配列はア
ンダーラインを施してある。疎水性推定シグナルペプチ
ドおよびトランスメンブラン配列は肉太アンダーライン
を施している。Ｎ−結合グリコシル化部位は囲ってい
る。位置２９７６のポリアデニリル化シグナルＡＡＴＡ
Ａはオーバーラインを施している。図示した配列はＨＬ
−６０ｃＤＮＡクローン用である。内皮細胞ｃＤＮＡは
その長さの大部分に亘って配列されており小さな差異の
みを示した。
【図１１】ＩＣＡＭ−１相同ドメインおよび免疫グロブ
リン超遺伝子群への相関を示す。（Ａ）５つの相同ドメ
インの配列（Ｄ1-5 ）：列んだ２以上の同じ残基は囲っ
ている。ＮＣＡＭドメインに２回以上含まれる残基、お
よびセットＣ2 およびＣ1 のドメイン中に含まれる残基
はＩＣＡＭ−１内部繰返しによって配列している。ＩＣ
ＡＭ−１のドメイン中の予想βストランドの位置は棒線
および配列上の小文字でマークしており、また免疫グロ
ブリンｃドメイン中のβ−ストランドの公知の位置は棒
線および配列下の大文字でマークしている。ＩＣＡＭ−
１ドメイン内の推定ジスルフィド架橋の位置はＳ−Ｓに
よって示している。ＩＣＡＭ−１に相同性のたん白質ド
メインの（Ｂ−Ｄ）配列：各たん白質はＦＡＳＴＰプロ
グラムを用いてＮＢＲＦデータベースを調査することに
よって先ず配列する。各たん白質配列はＭＡＧ、ＮＣＡ
Ｎ、Ｔ細胞レセプターαサブユニットＶドメイン、Ｉg
Ｍμ鎖およびα−１−Ｂ−糖たん白質である。
【図１２】ＩＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の比較図で
ある。
【図１３】平坦膜中でＩＣＡＭ−１に結合しているＬＦ
Ａ−１陽性ＥＢＶ−形質転換Ｂ−リンパ芽球種(lymphob
lastoid)細胞を示す。
【図１４】プラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１
に結合しているＬＦＡ−１陽性Ｔ−リンパ芽球およびＴ
−リンパ球を示す。
【図１５】プラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１
に結合しているＪＹ Ｂ−リンパ芽球腫の細胞またはベ
シクルのモノクローナル抗体による前処理による結合抑
制を示す。
【図１６】プラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１
へのＴ−リンパ芽球の結合に対しての温度の効果を示
す。
【図１７】プラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１
へのＴ−リンパ芽球の結合における二価のカチオンの必
要性を示す。
【図１８】末梢血液単核細胞がＴ−細胞会合抗原ＯＫＴ
３の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗接着性抗体
の効果を示す。“ＯＫＴ３”は抗原の添加を示す。
【図１９】末梢血液単核細胞が、非特異的Ｔ−細胞分裂
促進物質である、コンカナバリンＡの認識に応答して増
殖する能力に及ぼす抗接着性抗体の効果を示す。“ＣＯ
ＮＡ”はコンカナバリンＡの添加を示す。
【図２０】末梢血液単核細胞が、鍵穴カサガイヘモシア
ニン (keyhole limpet hemocyanin)抗原の認識に応答し
て増殖する能力に及ぼす抗接着性抗体の効果を示す。
“ＫＬＨ”は、鍵穴カサガイヘモシアニンの、細胞への
添加を示している。
【図２１】末梢血液単核細胞が、破傷風菌トキソイド抗
原の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗接着性抗体
の効果を示す。“ＡＧＮ”は破傷風菌トキソイド抗原
の、細胞への添加を示す。
【図２２】ヒト末梢単核細胞におけるＩＣＡＭ−１の発
現を示している。（Ａ）応答細胞は培養されない；
（Ｂ）応答Ｘ刺激細胞は培養されない；（Ｃ）応答細胞
は２４時間培養される；（Ｄ）応答Ｘ刺激細胞は２４時
間培養される。（-----モノクローナル抗体なし；・・
・・マウスイムノグロブリン；──── マウス抗−Ｉ
ＣＡＭ−１）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＥ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡＢ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ 33/577 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 スティーヴン ディーン マーリン アメリカ合衆国 コネチカット州 06811 ダンバリー テラ ホート ロ ード 18 (72)発明者 マイケル ローラン ダスティン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02215 ボストン 23 パーク ドライ ヴ 231 (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．15, ｐ．1142−1147（1985) Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．44，ｐ．2660− 2663（1985) Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．68，ｐ. 111−135（1982) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/02 ZNA C12P 21/08 C07K 14/78 C07K 16/44 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （Ａ）生理条件下で可溶であり、トラン
    スメンブランドメインが欠落しており、ＩＣＡＭ−１細
    胞外ドメイン１（配列番号１のアミノ酸残基１〜８
    ８）、ドメイン２（残基８９〜１８５）、ドメイン３
    （残基１８６〜２８４）、ドメイン４（残基２８５〜３
    ８５）又はドメイン５（残基３８６〜４５３）のいずれ
    かのアミノ酸配列を含有し、免疫学的反応性及び天然Ｉ
    ＣＡＭ−１のＩＣＡＭ−１依存性粘着特性の仲介能力を
    保持しているヒトＩＣＡＭ−１の機能性フラグメントを
    発現する細胞でヒト以外の動物を免疫する工程、 （Ｂ）上記動物のひ臓細胞をミエローマ細胞系と融合さ
    せる工程、 （Ｃ）融合させたひ臓細胞及びミエローマ細胞により抗
    体分泌性ハイブリドーマ細胞を生成させる工程、及び （Ｄ）ハイブリドーマ細胞をＩＣＡＭ−１に結合し得る
    抗体を産生し得る所望のハイブリドーマ細胞にスクリー
    ニングする工程を含むことを特徴とするＩＣＡＭ−１又
    はその機能性フラグメントに結合し得る抗体を産生する
    所望のハイブリドーマ細胞の調製方法。
  2. 【請求項２】 ヒトＩＣＡＭ−１の機能性フラグメント
    が、ＩＣＡＭ−１のドメイン１、２及び３を含むか、Ｉ
    ＣＡＭ−１のドメイン１及び２を含むか又はＩＣＡＭ−
    １のドメイン１を含むものである請求項１記載の調製方
    法。
  3. 【請求項３】 ヒトＩＣＡＭ−１の機能性フラグメント
    が、以下の（ａ）〜（ｑ）からなる群から選ばれる少な
    くとも１種のポリペプチドを含む請求項１又は請求項２
    記載の調製方法。 （ａ）−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｓ−Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ−
    Ｋ； （ｂ）−Ｘ−Ｇ−Ｓ−Ｖ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｔ−Ｓ
    −Ｃ−Ｄ−Ｑ−Ｐ−Ｋ； （ｃ）−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ｉ−Ｅ−Ｔ−Ｐ−Ｌ； （ｄ）−Ｆ−Ｌ−Ｔ−Ｖ−Ｙ−Ｘ−Ｔ； （ｅ）−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ； （ｆ）−Ｅ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｌ
    −Ｆ−Ｅ； （ｇ）−Ｌ−Ｎ−Ｐ−Ｔ−Ｖ−Ｔ−Ｙ−Ｇ−Ｘ−Ｄ−Ｓ
    −Ｆ−Ｓ−Ａ−Ｋ； （ｈ）−Ｓ−Ｆ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｎ−Ｖ； （ｉ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ； （ｊ）−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｐ； （ｋ）−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−Ｋ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｒ−Ｅ−Ｐ
    −Ａ−Ｖ−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｅ； （ｌ）−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｓ； （ｍ）−Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｋ； （ｎ）−Ｑ−Ｅ−Ｄ−Ｓ−Ｑ−Ｐ−Ｈ； （ｏ）−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ
    −Ｓ； （ｐ）−Ｒ−Ｒ−Ｄ−Ｈ−Ｈ−Ｇ−Ａ−Ｎ−Ｆ−Ｓ；及
    び （ｑ）−Ｄ−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ
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