NO320241B1

NO320241B1 - Fragment av ICAM-1 og anvendelse derav i diagnose in vitro

Info

Publication number: NO320241B1
Application number: NO19952799A
Authority: NO
Inventors: Michael Loran Dustin; Robert Rothlein; Steven Dean Marlin; Timothy Alan Springer
Original assignee: Dana Farber Cancer Inst Inc
Priority date: 1989-03-16
Filing date: 1995-07-14
Publication date: 2005-11-14
Also published as: NO952799L; NO952799D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår et fragment av intracellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) og anvendelse derav i diagnose in vi tro.

Leukocytter må kunne festes til cellesubstrater for i tilstrekkelig grad å kunne forsvare verten mot fremmede inn-trengere så som bakterier eller virus. En utmerket oversikt over forsvarssystemet er tilveiebragt av H. W. Eisen, (I: Microbiology, 3. utgave. Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), s. 290-295 og 381-418). De må kunne festes til endotelceller slik at de kan vandre fra sirkulasjonen til inflammasjonssteder. Videre må de festes til antigenpresenterende celler, slik at en normal spesifikk immunrespons kan skje, og endelig må de festes til passende målceller slik at det kan skje lyse av virusinfiserte celler eller tumorceller.

Leukocyttoverflatemolekyler som inngår ved bevirkning av slike tilheftinger, er nylig blitt identifisert ved anvendelse av hybridomteknologi. Kort angitt ble det identifisert monoklonale antistoffer rettet mot humane T-celler (D. Davignon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:4535-4539 (1981), og muse-miltceller (T. Springer et al., Eur. J. Immunol., 9:301-3 06 (1979)) som ble bundet til leukocyttoverflater og inhiberte de tilheftingsbeslektede funksjoner beskrevet ovenfor (T. Springer et al., Fed. Proe, 44:2660-2663 (1985)). Molekylene som ble identifisert ved disse antistoffer, ble kalt Mac-1 og lymfocyttfunksjonstilknyttet antigen 1 (LFA-1). Mac-1 er en heterodimer som finnes på makrofager, granulocytter og store granulære lymfocytter. LFA-1 er en heterodimer som finnes på

de fleste lymfocytter (T.A. Springer et al., Immunol. Rev., 68:111-135 (1982)). Disse to molekyler, pluss et tredje molekyl, pl50,95 (som har en vevsfordeling lik Mac-1) spiller en rolle ved cellulær tilhefting (G. Keizer et al., Eur. J. Immunol., 15:1142-1147 (1985)).

De ovenfor beskrevne leukocyttmolekyler ble funnet å være medlemmer av en beslektet familie av glykoproteiner (F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med., 158:1785-1803 (1983);

G.D. Keizer et al., Eur. J. Immunol., 15:1142-1147 (1985)).

Denne glykoproteinfamilie består av heterodimerer med én alfakjede og én betakjede. Skjønt alfakjeden i hver av anti-genene var forskjellige fra hverandre, ble betakjeden funnet å være høyest konservert (F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med., 158:1785-1803 (1983)). Betakjeden hos glykoprotein-familien (noen ganger omtalt som "CD18") ble funnet å ha en molekylvekt på 95 kd, mens alfakjedene ble funnet å variere fra 150 kd til 180 kd (T. Springer, Fed. Proe, 44:2660-2663

(1985)). Skjønt alfa-underenhetene i membranproteinene ikke har den utstrakte homologi som beta-underenhetene, har nøyaktig analyse av alfa-underenhetene i glykoproteinene vist at det er vesentlige likheter mellom dem. Oversikter over likhetene mellom alfa- og beta-underenhetene i de LFA-1-beslektede glykoproteiner er tilveiebragt av F. Sanchez-Madrid et al., (J. Exper. Med., 158:586-602 (1983); J. Exper. Med., 158:1785-1803

(1983)).

Det er blitt identifisert en gruppe individer som ikke kan uttrykke normale mengder av noen medlemmer av denne adhesjons-proteinfamilie på sin leukocyttcelleoverflate (D.C. Anderson et al., Fed. Proe, 44:2671-2677 (1985); D.C. Anderson et al., J. Infect. Dis., 152:668-689 (1985)). Lymfocytter fra disse pasienter viste defekter in vi tro i likhet med tilsvarende normale individer hvis LFA-1-molekylfamilie var blitt motvirket av antistoffer. Videre kunne disse individer ikke frembringe en normal immunrespons p.g.a. at cellene deres ikke var i stand til å henge fast til cellesubstrater (D.C. Anderson et al., Fed. Proe, 44:2671-2677 (185); D.C. Anderson et al., J. Infect. Dis., 152:668-689 (1985)). Disse data viser at immunreaksjoner avdempes når lymfocytter ikke kan tilhefte på normal måte p.g.a. mangel på funksjonelle adhesjonsmolekyler i LFA-1-familien.

Oppsummert fordrer således lymfocytters evne til å opp-rettholde et dyrs helse og levedyktighet at de kan hefte til andre celler (så som endotelceller). Denne tilhefting er blitt funnet å fordre celle-celle-kontakter som innbefatter at spesifikke reseptormolekyler er tilstede på lymfocyttenes celleoverflate. Disse reseptorer gjør en lymfocytt i stand til å hefte til andre lymfocytter eller til endotelceller og andre ikke-vaskulære celler. Celleoverflate-reseptormolekylene er blitt funnet å være sterkt beslektet med hverandre. Mennesker hvis lymfocytter mangler disse celleoverflatereseptormolekyler, viser kroniske og tilbakevendende infeksjoner, så vel som andre kliniske symptomer innbefattende mangelfulle antistoff-responser.

Siden lymfocyttadhesjon inngår ved prosessen ved hvilken fremmed vev identifiseres og forkastes, er en forståelse av denne prosess av betydelig verdi på områdene organtransplant-asjon, vevstransplantasjon, allergi og onkologi.

Den foreliggende oppfinnelse angår et diagnostisk, anvendelig, vannløselig, funksjonelt derivat av ICAM-1 som er et fragment av ICAM-1, kjennetegnet ved at det mangler cytoplasmafeltet og transmembranfeltet i ICAM-1, og det inneholder felt 1 eller feltene 1 og 2, eller feltene 1, 2 og 3.

Oppfinnelsen innbefatter også anvendelse av derivatet ifølge oppfinnelsen for in vitro-diagnostisering av tilstedeværelse og lokasjon av en tumorcelle som uttrykker et medlem av LFA-l-molekylfamilien i et individ som man har mistanke om har en slik celle, ved a) inkubering av en vevsprøve fra individet i nærvær av en blanding som inneholder et påvisbart, merket, vannløselig,

funksjonelt derivat ifølge krav 1, og

b) påvisning av nevnte bindingsligand som er bundet til et medlem av LFA-l-molekylfamilien som er tilstede i vevs-prøven .

Det beskrives en fremgangsmåte for in vitro-diagnostisering av tilstedeværelse og lokasjon av en tumorcelle som uttrykker et medlem av LFA-l-molekylfamilien hos et pattedyr som man har mistanke om har en slik celle, som omfatter:

Ca) en vevsprøve fra individet inkuberes i nærvær av en påvistbart merket bindingsligand som kan bindes til et medlem av LFA-l-molekylfamilien, hvilken ligand er valgt fra gruppen som består av ICAM-1 og et funksjonelt derivat av ICAM-1, og (b) bindingsliganden som er bundet til et medlem av LFA-l-molekylf amilien som er tilstede i vevsprøven, påvises.

Det henvises nå til tegningene:

Figur 1 viser i skjematisk form adhesjonen mellom en normal celle og en celle som mangler LFA-1. Figur 2 viser i skjematisk form prosessen ved en normal/- normal-celleadhesj on. Figur 3 viser kinetikken ved cellulær aggregering i fravær (X) eller nærvær av 50 ng/ml PMA (O). Figur 4 viser koaggregering mellom LFA-1" og LFA-1<+->celler. Karboksyfluoresceindiacetat-merkede EBV-transformerte celler (IO<4>) som vist på figuren ble blandet med 10<5> umerkede autologe celler (massive søyler) eller JY-celler (åpne søyler) i nærvær av PMA. Etter 1,5 timer ble de merkede celler, i aggregater eller frie, opptalt under anvendelse av den kvalitative analyse ifølge eksempel 2. Prosentandelen av merkede celler i aggregater er vist. Ett representativt forsøk av to er vist. Figur 5 viser immunutfelling av ICAM-1 og LFA-1 fra JY-celler. Triton X-100-lysater av JY-celler (felt 1 og 2) eller kontroll-lysebuffer (felt 3 og 4) ble immunutfelt med antistoff som kunne bindes til ICAM-1 (felt 1 og 3) eller antistoffer som kunne bindes til LFA-1 (felt 2 og 4). Del A viser resultater under reduserende betingelser; del B viser resultater oppnådd under ikke-reduserende betingelser. Molekylvektstandarder ble kjørt i felt S. Figur 6 viser kinetikken hos IL-1 og gamma-interferoneffekter på ICAM-l-ekspresjon på humane hud-fibroblaster. Humane hud-fibroblaster ble dyrket til en densitet på 8 x IO<4 >celler/0,32 cm<2> brønn. IL-1 (10 U/ml, lukkede sirkler) eller rekombinant gamma-interferon (10 U/ml, åpne firkanter) ble tilsatt, og på det angitte tidspunkt ble analysen avkjølt til 4°C, og en indirekte bindingsanalyse ble utført. Standard-avviket oversteg ikke 10%. Figur 7 viser konsentrasjonsavhengigheten av IL-1 og gamma-interferoneffekter på ICAM-1. Humane hud-fibroblaster ble dyrket til en densitet på 8 x IO<4> celler/0,32 cm<2>/brønn. IL-2 (åpen sirkel), rekombinant humant IL-1 (åpen firkant), rekombinant muse-IL-1 (massiv firkant), rekombinant humant gamma-interf eron (massive sirkler) og rekombinant beta-interferon (åpen trekant) ble tilsatt i den angitte fortynning og ble inkubert i 4 timer (IL-1) eller 16 timer (beta- og gamma-interferon). De angitte resultater er middelverdiene fra firedobbelte bestemmelser; standardavvik oversteg ikke 10%. Figur 8 viser nukleotid- og aminosyresekvensen for ICAM-1-cDNA. Den første ATG er i stilling 58. Translaterte sekvenser som svarer til tryptiske ICAM-l-peptider, er understreket. Det hydrofobe antatte signalpeptid og transmembransekvenser har en sterk understrekning. N-bundne glykosyleringsseter er innrammet. Det er trukket en linje over polyadenylerings-signalet AATAAA i stilling 2976. Den viste sekvens er for HL-60-cDNA-klonen. Endotelcelle-cDNA ble sekvensert over størstedelen av sin lengde og viste bare mindre forskjeller. Figur 9 viser de ICAM-1-homologe områder og slektskapet med immunglobulin-supergenfamilien. (A) oppstilling av 5 homologe områder (Dl-5). To eller flere identiske rester som samsvarte, er innrammet. Rester konservert to eller flere ganger i NCAM-områder, så vel som rester konservert i områder i settene C2 og Cl ble innrettet med de indre repeterende ICAM-1-enheter. Lokasjonen av de forutsette fi-kjeder i ICAM-1-området er markert med søyler og små bokstaver over innrettingene, og den kjente lokasjon for 6-kjeder i immunglobulin C-områder er markert med søyler og store bokstaver under innrettingen. Stillingen for den antatte disulfidbro i ICAM-1-områder er angitt med S-S. (B-D) innretting av proteinområder homologe til ICAM-1-områder; proteinene ble i begynnelsen innrettet ved undersøkelse av NBRF-databaser under anvendelse av FASTP-programmet. Proteinsekvensene er MAG, NCAM, T-cellereseptor-a-underenhet-V-område, IgM^-kjede og a-l-B-glykoprotein. Figur 10 viser en skjematisk sammenligning av de sekundære strukturer av ICAM-1 og MAG. Figur 11 viser LFA-1-positive EBV-transformerte B-lymfoblastoidceller som bindes til ICAM-1 i plane membraner. Figur 12 viser LFA-l-positive T-lymfoblaster og T-lymfom-celler som bindes til ICAM-1 i plastbundne vesikler. Figur 13 viser inhiberingen av binding av JY-B-lymfoblastoidceller som bindes til ICAM-1 i plastbundne vesikler ved forbehandling av celler eller vesikler med monoklonale antistoffer. Figur 14 viser effekten av temperatur på binding av T-lymfoblaster til ICAM-1 i plastbundne vesikler. Figur 15 viser fordringer angående divalente kationer for binding av T-lymfoblaster til ICAM-1 i plastbundne vesikler. Figur 16 viser effekten av anti-adhesjonsantistoffer på evnen hos mononukleære celler i perifert blod til å formere seg som svar på oppfattelse av det T-celletilknyttede antigen 0KT3. "0KT3" angir tilsetting av antigen. Figur 17 viser effekten av anti-adhesjonsantistoffer på evnen hos mononukleære celler i perifert blod til å formeres som svar på oppfattelse av det ikke-spesifikke T-cellemitogen, concanavalin A. "CONA" angir tilsetting av concanavalin A. Figur 18 viser effekten av anti-adhesjonsantistoffer på evnen hos mononukleære celler i perifert blod til å formeres som svar på oppfattelse av "keyhole limpet"-hemocyaninanti-genet. Tilsettingen av "keyhole limpet"-hemocyanin til cellene er angitt med "KLH". Figur 19 viser effekten av anti-adhesjonsantistoffer på evnen hos mononukleære celler i perifert blod til å formere seg som svar på oppfattelse av tetanustoksoid-antigenet. Tilsettingen av tetanustoksoid-antigen til cellene er angitt med

"AGN".

Figur 20 viser bindingen av monoklonale antistoffer RR1/1, R6.5, LB2 og CL203 til ICAM-1-utelukkelsesmutanter. Figur 21 viser bindingen av ICAM-l-utelukkelsesmutanter til LFA-1. Figur 22 viser epitopene som oppfattes av monoklonale anti-ICAM-l-antistoffer RRl/1, R6.5, LB2 og CL203. Figur 23 viser bindingskapasitet hos ICAM-1-området 2-mutanter til LFA-1. Figur 24 viser bindingskapasiteten hos ICAM-1-området 3-mutanter til LFA-1. Figur 25 viser bindingskapasiteten hos ICAM-1-området 1-mutanter til LFA-1. Figur 26 viser innrettingen av amino-terminale ICAM-områder.

Ett aspekt ved den foreliggende oppfinnelse angår opp-dagelsen av en naturlig bindingsligand til LFA-1. Molekyler så som de som er i LFA-l-familien, som inngår ved prosessen angående celleadhesjon, er omtalt som "adhesjonsmolekyler".

Den naturlige bindingsligand er betegnet "intercellulært adhesjonsmolekyl" eller "ICAM-1". ICAM-1 er et 76-97 kd glykoprotein. ICAM-1 er ikke en heterodimer. Den foreliggende oppfinnelse er rettet mot ICAM-1 og dens "funksjonelle derivater". Et "funksjonelt derivat" av ICAM-1 er en forbindelse som har en biologisk aktivitet (enten funksjonell eller strukturell) som er hovedsakelig lik en biologisk aktivitet av ICAM-1. Betegnelsen "funksjonelle derivater" er ment å innbefatte "fragmentene", "variantene", "analogene" eller "kjemiske derivater" av et molekyl. Et "fragment" av et molekyl så som ICAM-1 er ment å angi hvilket som helst polypeptidundersett av molekylet. Fragmenter av ICAM-1 som har ICAM-1-aktivitet og som er løselige (dvs. ikke membranbundne), er særlig foretrukket. En "variant" av et molekyl så som ICAM-1 er ment å angi et molekyl med hovedsakelig lik struktur og funksjon som enten hele molekylet eller et fragment av dette. Et molekyl sies å være "hovedsakelig likt" et annet molekyl hvis begge molekyler har hovedsakelig like strukturer, eller hvis begge molekyler har lik biologisk aktivitet. Under forutsetning av at to molekyler har lik aktivitet, anses de således som varianter slik som denne betegnelse er anvendt i det foreliggende, selv om strukturen av ett av molekylene ikke finnes i det annet, eller om sekvensen av aminosyrerester ikke er identisk. En "analog" til et molekyl så som ICAM-1 er ment å angi et molekyl som har hovedsakelig lik funksjon som enten hele molekylet eller et fragment av dette. Som anvendt i det foreliggende sies et molekyl å være et "kjemisk derivat" av et annet molekyl når det inneholder ytterligere kjemiske deler som normalt ikke er en del av molekylet. Slike deler kan forbedre molekylets løselighet, absorpsjon, biologiske halveringstid, etc. Delene kan alternativt minske molekylets toksisitet, eliminere eller dempe eventuelle uønskelige bivirkninger av molekylet, etc. Deler som kan gi slike effekter, er beskrevet i Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). "Toksin-derivatiserte" molekyler utgjør en spesiell klasse av "kjemiske derivater". Et "toksinderivatisert" molekyl er et molekyl (så som ICAM-1 eller et antistoff) som inneholder en toksindel. Bindingen av et slikt molekyl til en celle bringer toksindelen i umiddelbar nærhet til cellen og fremskynder derved celledød. Enhver egnet toksindel kan anvendes; det er imidlertid foretrukket å anvende toksinene så som f.eks. ricinus-toksinet, difteri toksinet, radioisotopiske toksiner, membrankanal-dannende toksiner, etc. Fremgangsmåter for kopling av slike deler til et molekyl er velkjent på området.

Et antigent molekyl så som ICAM-1, eller medlemmer av LFA-l-molekylf amilien, er naturlig uttrykt på overflaten av lymfocytter. Således vil innføring av slike celler i et passende dyr, som ved intraperitoneal injeksjon, etc, resultere i dannelse av antistoffer som kan bindes til ICAM-1 eller medlemmer av LFA-1-molekylfamilien. Hvis ønskelig, kan serumet fra et slikt dyr fjernes og anvendes som en kilde til polyklonale antistoffer som kan binde disse molekyler. Det er imidlertid foretrukket å fjerne splenocytter fra slike dyr, å sammensmelte slike miltceller med en myelomcellelinje og gi mulighet for slike fusjonsceller til å danne en hybridomcelle som utsondrer monoklonale antistoffer som kan binde ICAM-1 eller medlemmer av LFA-1-molekylfamilien.

Hybridomcellene som oppnås på den måte som er beskrevet heri, kan undersøkes ved mange forskjellige metoder for identifisering av ønskede hybridomceller som utsondrer antistoff som kan bindes enten til ICAM-1 eller til medlemmer av LFA-l-molekylfamilien. Ved en foretrukket undersøkelsesanalyse identifiseres slike molekyler ved sin evne til å inhibere aggregeringen av Epstein-Barr-virustransformerte celler. Antistoffer som kan inhibere slik aggregering, undersøkes så videre for bestemmelse av om hvorvidt de inhiberer slik aggregering ved binding til ICAM-1, eller til et medlem av LFA-l-molekylf amilien. Hvilket som helst hjelpemiddel som kan skjelne ICAM-1 fra LFA-molekylfamilien, kan anvendes ved en slik undersøkelse. Således kan f.eks. antigenet som bindes av antistoffet, analyseres så som ved immunutfeining og polyakryl-amidgel-elektroforese. Hvis det bundne antigen er et medlem av LFA-l-molekylfamilien, vil det immunutfelte antigen bli funnet å være en dimer, mens hvis det bundne antigen er ICAM-1, vil en forbindelse med en enkelt molekylvekt være blitt immunutfelt. Alternativt er det mulig å skjelne mellom slike antistoffer som bindes til medlemmer av LFA-l-molekylfamilien, fra slike som binder ICAM-1 ved undersøkelse med hensyn til antistoffets evne til å bindes til celler så som granulocytter, som uttrykker LFA-1, men ikke ICAM-1. Evnen hos et antistoff (som er kjent for å inhibere celleaggregering) til å bindes til granulocytter, angir at antistoffet kan binde LFA-1. Fravær av slik binding angir et antistoff som kan oppfatte ICAM-1. Et antistoffs evne til å bindes til en celle så som en granulocytt kan påvises ved hjelpemidler som vanligvis anvendes av vanlige fagfolk. Slike hjelpemidler innbefatter immunanalyser, celle-agglutinering, filterbindingsundersøkelser, antistoffutfelning, etc.

Antiaggregerings-antistoffene kan alternativt identifiseres ved at man måler deres evne til å bindes differensielt til celler som uttrykker ICAM-1 (så som aktiverte endotelceller), og deres udugelighet til å bindes til celler som ikke uttrykker ICAM-1. Som det lett vil forstås av vanlige fagfolk, kan ovennevnte analyser modifiseres eller utføres i en annen sekvensiell rekkefølge for tilveiebringelse av forskjellige potensielle undersøkelsesanalyser, som hver kan identifisere og skjelne mellom antistoffer som kan bindes til ICAM-1, og medlemmer av LFA-molekylfamilien.

A. Identifikasjon av LFA- l- bindingspartneren ( ICAM- 1)

1. Analyser av LFA-1-avhengig aggregering

Mange Epstein-Barr-virus-transformerte celler viser aggregering. Denne aggregering kan forøkes ved tilstedeværelse av forbolestere. Slik homotypisk aggregering (dvs. aggregering som innbefatter bare én celletype) ble funnet å blokkeres av anti-LFA-1-antistoffer (R. Rothlein et al., J. Exper. Med., 163:1132-1149 (1986)), hvilken referanse er medtatt i det foreliggende som referanse. Således kan omfanget av LFA-1-avhengig binding bestemmes ved vurdering av omfanget av spontan eller forbolester-avhengig aggregatdannelse.

Et middel som vekselvirker med LFA-1-avhengig aggregering, kan identifiseres ved anvendelse av en analyse som kan bestemme om hvorvidt middelet vekselvirker med enten den spontane aggregering eller den forbolester-avhengige aggregering av Epstein-Barr-virus-transformerte celler. De fleste Epstein-Barr-virustransformerte celler kan anvendes i en slik analyse så lenge cellene kan uttrykke LFA-1-reseptormolekylet. Slike celler kan fremstilles i henhold til teknikken ifølge T.A. Springer et al., J. Exper Med., 160:1901-1918 (1984), hvilken referanse er medtatt i det følgende som referanse. Skjønt hvilken som helst slik celle kan anvendes i den LFA-1-avhengige bindingsanalyse ifølge den foreliggende oppfinnelse, er det foretrukket å anvende celler fra JY-cellelinjen (C.T. Terhost et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 73:910 (1976)). Cellene kan dyrkes i hvilket som helst egnet dyrkningsmedium; det er imidlertid mest foretrukket å dyrke cellene i RMPI 1640-dyrkningsmedium supplert med 10% føtalt kalveserum og 50 fig/ ml gentamycin (Gibco Laboratories, NY). Cellene bør dyrkes under betingelser som er egnet for pattedyrcelleformering (dvs. ved en temperatur på vanligvis 37°C, i en atmosfære av 5% C02, ved en relativ fuktighet på 95%, etc).

2. LFA-1 bindes til ICAM-1

Det er blitt identifisert individer blant mennesker hvis lymfocytter mangler LFA-l-reseptormolekylfamilien (D.C. Anderson et al., Fed. Proe, 44:2671-2677 (1985); D.C. Anderson et al., J. Infect. Dis., 152:668-689 (1985)). Slike individer sies å lide av leukocyttadhesjons-mangel (LAD). EBV-transformerte celler fra slike individer aggregeres ikke hverken spontant eller i nærvær av forbolestere i den ovenfor beskrevne aggregeringsanalyse. Når slike celler ble blandet med LFA-1-uttrykkende celler, ble aggregering observert (R. Rothlein et al., J. Exper. Med., 163:1132-1149 (1986)) (figur 1). Det er betydningsfullt at disse a<*>ggregater ikke ble dannet hvis disse celler ble inkubert i nærvær av anti-LFA-1-antistoffer. Skjønt aggregeringen fordret LFA-1, viste således evnen hos celler som manglet LFA-1, til å danne aggregater med LFA-l-holdige celler at LFA-1-bindingspartneren ikke var LFA-1, men heller et tidligere uoppdaget celleadhesjonsmolekyl. Figur 1 viser mekanismen for celleadhesjon. ;B. Intercellulært adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1) ;Det nye intercellulære adhesjonsmolekyl ICAM-1 ble først identifisert og delvis karakterisert i henhold til fremgangsmåten ifølge R. Rothlein et al., (J. Immunol., 137:1270-1274 ;(1986)), hvilken referanse er medtatt i det foreliggende som referanse. For påvisning av ICAM-l-molekylet, ble det fremstilt monoklonale antistoffer fra miltceller hos mus immunisert med celler fra individer som genetisk manglet LFA-1-ekspresjon. Resulterende antistoffer ble undersøkt med hensyn til sin evne til inhibering av aggregeringen av LFA-1-uttrykkende celler (figur 2). Mer detaljer ble mus immunisert med EBV-transformerte B-celler fra LAD-pasienter som ikke uttrykker LFA-1-antigenet. Miltcellene fra disse dyr ble deretter fjernet, sammensmeltet med myelomceller, og fikk bli hybridomceller som dannet monoklonale antistoffer. EBV-transformerte B-celler fra normale individer som uttrykker LFA-1, ble så inkubert i nærvær av det monoklonale antistoff fra hybridom-cellen for identifikasjon av et eventuelt monoklonalt antistoff som kunne inhibere den forbolester-bevirkede, LFA-1-avhengige, spontane aggregering av de EBV-transformerte B-celler. Siden hybridomcellene stammet fra celler som aldri hadde støtt på LFA-1-antigenet, ble det ikke dannet noe monoklonalt antistoff mot LFA-1. Følgelig må ethvert antistoff som finnes å inhibere aggregering, kunne bindes til et antigen som, skjønt det ikke er LFA-1, delta i LFA-l-adhesjonsprosessen. Skjønt hvilken som helst metode for oppnåelse av slike monoklonale antistoffer kan anvendes, er det foretrukket å oppnå ICAM-1-bindende monoklonale antistoffer ved immunisering av Balb/C-mus under anvendelse av fremgangsmåtene og programmene som er beskrevet av R. Rothlein et al., (J. Immunol., 137:1270-1274 (1986)) med Epstein-Barr-virus-transformerte mononukleære celler fra perifert blod fra individer som mangler LFA-1. Slike celler er beskrevet av T.A. Springer et al., (J. Exper Med., 160:1901-1918 (1984)). ;Ved en foretrukket fremgangsmåte for dannelse og påvisnig av antistoffer som kan bindes til ICAM-1, immuniseres mus med enten EBV-transformerte B-celler som uttrykker både ICAM-1 og LFA-1, eller mer foretrukket med TNF-aktiverte endotelceller som uttrykker ICAM-1, men ikke LFA-1. Ved en mest foretrukket fremgangsmåte for dannelse av hybridomceller som danner anti-ICAM-l-antistoffer, ble en Balb/C-mus sekvensielt immunisert med JY-celler og med differensierte U937-celler (ATCC CRL-1593) . Miltcellene fra slike dyr fjernes, sammensmeltes med myelomceller og får utvikles til antistoffdannende hybridomceller. Antistoffene undersøkes med hensyn til sin evne til inhibering av den LFA-1-avhengige, forbolester-bevirkede aggregering av en EBV-transformert cellelinje, så som JY-celler, som uttrykker både LFA-1-reseptoren og ICAM-1. Som vist av R. Rothlein et al., (J. Immunol., 137:1270-1274 (1987)), undersøkes deretter antistoffer som kan. inhibere slik agge-gering, med hensyn til sin evne til inhibering av den forbolesterbevirkede aggregering av en cellelinje, så som SKW3 ;(M. Dustin et al., J. Exper Med., 165:672-692 (1987)), hvis evne til spontan aggregering i nærvær av en forbolester inhiberes av antistoff som kan binde LFA-1, men inhiberes ikke av anti-ICAM-l-antistoffer. Antistoffer som kan inhibere den forbolester-bevirkede aggregering av celler så som JY-celler, men som ikke kan inhibere den forbolesterbevirkede aggregering av celler så som SKW3-celler, er sannsynligvis anti-ICAM-1-antistoffer. Alternativt kan antistoffer som kan bindes til ICAM-1, identifiseres ved undersøkelse med hensyn til antistoffer som kan inhibere den LFA-1-avhengige aggregering av LFA-ekspresjonsceller (så som JY-celler), men som ikke kan bindes til celler som uttrykker LFA-1, men lite eller intet ICAM-1 (så som normale granulocytter), eller som kan bindes til celler som uttrykker ICAM-1, men ikke LFA-1 (så som TNF-aktiverte endotelceller). Et annet alternativ er å immunutf elle fra celler som uttrykker ICAM-1, LFA-1, eller begge, under anvendelse av antistoffer som inhiberer den LFA-1-avhengige aggregering av celler, så som JY-celler, og ved SDS-PAGE eller en ekvivalent metode bestemme en eller annen molekyl-karakteregenskap hos molekylet som er utfelt med antistoffet. Hvis karakteregenskapen er den samme som hos ICAM-1, kan antistoffet antas å være et anti-ICAM-l-antistoff. ;Ved anvendelse av monoklonale antistoffer fremstilt på den måte som er beskrevet ovenfor, ble ICAM-l-celleoverflate-molekylet renset og karakterisert. ICAM-1 ble renset fra humane celler eller vev ved anvendelse av affinitetskromatografi for monoklonalt antistoff. Ved en slik fremgangsmåte koples et monoklonalt antistoff som kan reagere med ICAM-1, til en inert kolonnematriks. Hvilken som helst metode for utførelse av slik kopling kan anvendes; det er imidlertid foretrukket å anvende fremgangsmåten ifølge H.C. Oettgen et al., J. Biol. Chem., 259:12034 (1984)). Når et cellelysat ledes gjennom matriksen, adsorberes de tilstedeværende ICAM-1-molekyler og holdes tilbake av matriksen. Ved forandring av pH eller ionekonsentrasjonen i kolonnen, kan de bundne ICAM-1-molekyler elueres fra kolonnen. Skjønt hvilken som helst egnet matriks kan anvendes, er det foretrukket å anvende Sepharose (Pharmacia) som matriksmateriale. Dannelsen av kolonne-matrikser og anvendelse av dem ved proteinrensing er velkjent på området. ;På en måte som forstås av vanlige fagfolk, kan de ovenfor beskrevne analyser anvendes til identifikasjon av forbindelser som kan svekke eller inhibere graden eller omfanget av celle-adhesjon. ;ICAM-1 er et celleoverflateglykoprotein som uttrykkes på ikke-hematopoietiske celler så som vaskulære endotelceller, tymusepitelceller, visse andre epitelceller og fibroblaster, og på hematopoietiske celler så som vevsmakrofager, mitogenstimulerte T-lymfocyttblaster og kjernesentrerte B-celler og dendrittceller i tonsiller, lymfeknuter og de peyerske flekker. ICAM-1 er sterkt uttrykt på vaskulære endotelceller i T-celleområder i lymfeknuter og tonsiller som viser reaktiv hyperplasi. ICAM-1 uttrykkes i små mengder på lymfocytter i perifert blod. Forbolesterstimulert differensiering av en del myelomonocyttiske cellelinjer øker ICAM-1-ekspresjonen i stor grad. Således uttrykkes ICAM-1 fortrinnsvis på inflammasjonssteder og uttrykkes ikke vanligvis av hvilende celler. ICAM-1-ekspresjon på hud-fibroblaster økes fra tre til fire ganger ved enten interleukin 1 eller gamma-interferon ved nivåer på 10 U/ml i løpet av et tidsrom på henholdsvis 4 eller 10 timer. Induksjonen er avhengig av protein- og mRNA-syntesen og er reversibel. ;ICAM-1 viser molekylvektheterogenitet i forskjellige celletyper med en molekylvekt på 97 kd på fibroblaster, 114 kd på den myelomonocyttiske cellelinje U937, og 90 kd på den lymfoblastoide B-celle JY. ICAM-l-biosyntesen er blitt funnet å innbefatte en intracellulær forløper på ca. 73 kd. Den ikke-N-glykosylerte form som er et resultat av tunikamycinbehandling (som inhiberer glykosylering) har en molekylvekt på 55 kd. ;ICAM-1 isolert fra forbolesterstimulerte U937-celler eller fra fibroblastceller gir et identisk hovedprodukt med en molekylvekt på 60 kd etter kjemisk deglykocylering. Monoklonale ICAM-l-antistoffer vekselvirker med adhesjonen av fytohemaglutininblaster til cellelinjer som mangler LFA-1. Forbehandling av fibroblaster, men ikke lymfocytter, med monoklonale antistoffer som kan binde ICAM-1, inhiberer lymfocyttfibroblastadhesjon. Forbehandling av lymfocytter, men ikke fibroblaster, med antistoffer mot LFA-1 er også blitt funnet å inhibere lymfocyttfibroblastadhesjon. ;ICAM-1 er således bindingsliganden til CD-18-komplekset på leukocytter. Det kan påføres på fibroblaster og endotelceller in vitro ved inflammatoriske mediatorer så som IL-1, gamma-interferon og tumornekrosefaktor innenfor en tidsramme som er i overensstemmelse med infiltrasjonen av lymfocytter i inflammatoriske lesjoner in vivo (M.L. Dustin et al., J. Immunol, 137:245-254 (1986); J.S. Prober et al., J. Immunol, 137:1893-1896. Videre uttrykkes ICAM-1 på ikke-hematopoietiske celler så som vaskulære endotelceller, tymusepitelceller, andre epitelceller og fibroblaster, og på hematopoietiske celler så som vevsmakrofager, mitogenstimulerte T-lymfocyttblaster og kjernesenter-B-celler og dendrittceller i tonsiller, lymfeknuter og peyerske flekker (M.L. Dustin et al., J. Immunol, 137:245-254 (1986)). ICAM-1 uttrykkes på keratinocytter i benigne inflammatoriske lesjoner så som allgergisk eksem, lichen planus, eksantem, uriticaria og blæredannelses-sykdommer. Allergiske hudreaksjoner frembragt ved påføring av et hapten på huden som pasienten er allergisk for, viste også en sterk ICAM-1-ekspresjon på keratinocyttene. På den annen side viste ikke toksiske flekker på huden ICAM-l-ekspresjon på keratinocyttene. ICAM-1 er tilstede på keratinocytter fra biopsier av hudlesjoner fra forskjellige dermatologiske forstyrrelser, og ICAM-l-ekspresjon fremkalles på lesjoner fra allgergiske flekkundersøkelser, mens keratinocytter fra toksiske flekkundersøkelseslesjoner ikke uttrykte ICAM-1. ;ICAM-1 er derfor et cellesubstrat som lymfocytter kan festes til, slik at lymfocyttene kan vandre til inflammasjonssteder og/eller utføre forskjellige effektorfunksjoner som bidrar til denne inflammasjon. Slike funksjoner innbefatter dannelsen av antistoff, lyse av viralt infiserte målceller osv. Betegnelsen "inflammasjon" som anvendt i det foreliggende er ment å innbefatte reaksjoner i det spesifikke eller ikke-spesifikke forsvarssystem. Som anvendt i det foreliggende, er betegnelsen "spesifikt forsvarssystem" ment å angi den bestanddel i immunsystemet som reagerer overfor tilstedeværelse av spesifikke antigener. Inflammasjon sies å være et resultat av en respons fra det spesifikke forsvarssystem hvis inflammasjonen er forårsaket av, formidlet ved eller forbundet med en reaksjon fra det spesifikke forsvarssystem. Eksempler på inflammasjon som er et resultat av en respons fra det spesifikke forsvarssystem, innbefatter responsen overfor antigener så som rubellavirus, autoimmune sykdommer, hyper-sensitivitetsrespons av forsinket type, formidlet ved T-celler (som f.eks. vil kunne sees hos individer som gir "positiv" test i Mantaux-testen), psoriasis osv. ;En "ikke-spesifikk forsvarssystemreaksjon" er en respons som er formidlet ved leukocytter som ikke har immunologisk hukommelse. Slike celler innbefatter granulocytter og makrofager. Som anvendt i det foreliggende, sies en inflammasjon å være et resultat av en respons fra det ikke-spesifikke forsvarssystem hvis inflammasjonen er forårsaket av, formidlet ved, eller forbundet med en reaksjon fra det ikke-spesifikke forsvarssystem. Eksempler på inflammasjon som, i hvertfall delvis, er et resultat av en reaksjon fra det ikke-spesifikke forsvarssystem, innbefatter inflammasjon som er forbundet med tilstander så som: astma; respiratorisk lidelsessyndrom hos voksne (ARDS) eller multiple organskadesyndromer som er sekundære til sepsis eller trauma; reperfusjonsskade på myokard-eller andre vev; akutt glomerulonefritt; reaktiv artritt; dermatoser med akutt inflammatoriske komponenter; akutt purulent meningitt eller andre inflammatoriske forstyrrelser i sentralnervesystemet; termisk skade; hemodialyse,- leukaferese; ulcerøs kolitt; Chron's sykdom; nekrotiserende enterokolitt; granulocytt-transfusjonstilknyttede syndromer; og cytokin-bevirket toksisitet. ;I henhold til den foreliggende oppfinnelse kan funksjonelle ICAM-l-derivater, og særlig slike derivater som omfatter fragmenter eller mutant-varianter av ICAM-1 som har områdene 1, 2 og 3, anvendes ved in vitro-diagnostisering av slike reaksjoner i det ikke-spesifikke forsvarssystem. Mer foretrukket for slik diagnostisering er ICAM-1-fragmenter som inneholder området 2 på ICAM-1. ;C. Kloning av ICAM- l- genet ;Hvilken som helst av mange forskjellige fremgangsmåter kan anvendes for å klone ICAM-l-genet. Én slik metode omfatter analysering av et skyttelvektor-bibliotek av cDNA-innskudd (som stammer fra en ICAM-1-uttrykkende celle) med hensyn til tilstedeværelse av et innskudd som inneholder ICAM-l-genet. En slik analyse kan utføres ved at celler transfekteres med vektoren, og deretter analyseres med hensyn til ICAM-l-ekspresjon. Den foretrukkede metode for kloning av dette gen omfatter bestemmelse av aminosyresekvensen hos ICAM-1-molekylet. For utførelse av denne oppgave, kan ICAM-1-protein renses og analyseres ved automatiserte sekvensanalysatorer. Alternativt kan molekylet fragmenteres så som med cyanogen-bromid eller med proteaser så som papain, chymotrypsin eller trypsin (Y. Oike et al., J. Biol. Chem., 257:9751-9758 (1982); C. Liu et al., Int. J. Pept. Protein Res., 21:209-215 (1983)). Skjønt det er mulig å bestemme hele aminosyresekvensen hos ICAM-1, er det foretrukket å bestemme sekvensen hos peptidfragmenter i molekylet. Hvis peptidene har en lengde på mer enn 10 aminosyrer, er sekvensinformasjonen vanligvis tilstrekkelig til at man kan klone et gen så som genet for ICAM-1. ;Sekvensen av aminosyrerester i et peptid betegnes i det foreliggende enten ved anvendelsen av deres vanlig anvendte 3-bokstav-betegnelser eller ved deres enkeltbokstav-betegnelser. En oppregning av disse 3-bokstav- og 1-bokstav-betegnelser kan finnes i lærebøker så som Biochemistry, A. Lehninger, Worth Publishers, New York, NY (1970). Når en slik sekvens er oppført vertikalt, er den aminoterminale rest ment å være på toppen av listen, og den karboksytermiale rest i peptidet er ment å være i bunnen av listen. Ved horisontal oppføring er på lignende måte den aminoterminale rest ment å være i den venstre ende, mens den karboksyterminale rest er ment å være i den høyre ende. Restene av aminosyrer i et peptid kan separeres ved bindestreker. Slike bindestreker er kun ment å gjøre presentasjonen av en sekvens lettere. Som et rent illustrerende eksempel, angir aminosyresekvensen betegnet: ;-Gly-Ala-Ser-Phe- ;at en Ala-rest er bundet til karboksygruppen på Gly, og at en Ser-rest er bundet til karboksygruppen på Ala-resten og til aminogruppen på en Phe-rest. Betegnelsen angir videre at aminosyresekvensen inneholder tetrapeptidet Gly-Ala-Ser-Phe. Betegnelsen er ikke ment å begrense aminosyresekvensen til dette ene tetrapeptid, men er ment å innbefatte (1) tetrapeptidet med én eller flere aminosyrerester bundet til enten sin amino- eller karboksyende, (2) tetrapeptidet med én eller flere aminosyrerester bundet til både sin amino- og sin karboksyende, (3) tetrapeptidet uten noen ytterligere aminosyrerester. ;Når ett eller flere egnede peptidfragmenter er blitt sekvensbestemt, undersøkes DNA-sekvensene som kan kode dem. På grunn av at den genetiske kode er degenerert, kan mer enn ett kodon anvendes til å kode en spesiell aminosyre {J.D. Watson, I: Molecular Biology of the Gene, 3. utgave, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Ca (1977), s. 356-357). Peptidfragmentene analyseres for identifikasjon av sekvenser av aminsyrer som kan kodes ved oligonukleotider med den laveste degenereringsgrad. Dette utføres fortrinnsvis ved identifikasjon av sekvenser som inneholder aminosyrer som kodes for ved bare et enkelt kodon. Skjønt slike aminsyresekvenser leilighetsvis kan kodes for ved bare et enkelt oligonukleotid, kan ofte aminsyresekvensen kodes for ved hvilket som helst av et sett av lignende oligonukleotider. Det er betydningsfullt at skjønt alle elementene i settet inneholder oligonukleotider som kan kode for peptidfragmentet, og således potensielt inneholder den samme nukleotidsekvens som genet som koder for peptidfragmentet, inneholder bare ett element i settet en nukleotidsekvens,som er identisk med nukleotidsekvensen i dette gen. På grunn av at dette element finnes inne i settet og kan hybridiseres til DNA selv i nærvær av de andre elementene i settet, er det mulig å anvende det ikke-fraksjonerte sett av oligonukleotider på samme måte som man ville anvende et enkelt oligonukleotid til å klone genet som koder for peptidet. ;På en måte som er nøyaktig analogt til den som er beskrevet ovenfor, kan man anvende et oligonukleotid (eller sett av oligonukleotider) som har en nukleotidsekvens som er komplementær til oligonukleotidsekvensen eller settet av sekvenser som kan kode for peptidfragmentet. ;Et egnet oligonukleotid, eller sett av oligonukleotider, som kan kode for et fragment av ICAM-l-genet (eller som er komplementært til et slikt oligonukleotid, eller sett av oligonukleotider) identifiseres (under anvendelse av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte), syntetiseres og hybridiseres ved hjelpemidler som er velkjente på fagområdet, overfor et DNA-, eller mer foretrukket, et cDNA-preparat som stammer fra humane celler som kan uttrykke ICAM-1-gensekvenser. Teknikker for nukleinsyrehybridisering er beskrevet av R. Maniatis et al., I: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982), og av B.D. Haymes et al., I. Nucleic Acid Hybrization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC ;(1985), hvilke referanser er medtatt i det foreliggende som referanser. Kilden til den anvendte DNA eller cDNA vil fortrinnsvis være blitt anriket med hensyn til ICAM-1-sekvenser. Slik anriking kan lettest fås ved cDNA oppnådd ved ekstraksjon av RNA fra celler dyrket under betingelser som bevirker ICAM-1-syntese (så som U937 dyrket i nærvær av forbolestere osv.). ;Teknikker så som, eller lik, dem som er beskrevet ovenfor, har med hell gjort mulig kloning av gener for humane aldehyd-dehydrogenaser (L.C. Hsu et al., proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:3771-3775 (1985), fibronektin (S. Suzuki et al., Eur. Mol. Biol. Organ. J., 4:2519-2524 (1985)), det humane østrogen-reseptorgen (P. Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:7889-7893 (1985)), vevstypeplasminogenaktivator (D. Pennica et al., Nature, 301:214-221 (1983)) og human placenta-alkal-inske fosfatase-komplementær DNA (W. Kam et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:8715-8719 (1985)). ;På en foretrukket alternativ måte til kloning av ICAM-l-genet, fremstilles et bibliotek av ekspresjonsvektorer ved kloning av DNA, eller mer foretrukket cDNA, fra en celle som kan uttrykke ICAM-1, i en ekspresjonsvektor. Biblioteket undersøkes så med hensyn til elementer som kan uttrykke et protein som bindes til anti-ICAM-l-antistoff, og som har en nukleotidsekvens som kan kode for polypeptider som har den samme aminosyresekvens som ICAM-1 eller fragmenter av ICAM-1. ;Det klonede ICAM-l-gen, oppnådd ved de metoder som er beskrevet ovenfor, kan bindes operabelt til en ekspresjonsvektor og innføres i bakterie- eller eukaryote celler under dannelse av ICAM-1-protein. Teknikker for slike manipulasjoner er beskrevet av T. Maniatis et al., som ovenfor, og er velkjente på området. ;D. Anvendelser av analyser av LFA- 1- avhengig aggregering ;Den ovenfor beskrevne analyse, som kan måle LFA-1-avhengig aggregering, kan anvendes for identifikasjon av agenser som virker som antagonister til inhibering av omfanget av LFA-1-avhengig aggregering. Slike antagonister kan virke ved at de svekker evnen hos LFA-1 eller ICAM-1 til formidling av aggregering. Således innbefatter slike agenser immunglobuliner så som et antistoff som kan bindes til enten LFA-1 eller ICAM-1. Dessuten kan ikke-immunglobulin-agenser (dvs. kjemiske) undersøkes under anvendelse av den ovenfor beskrevne analyse for bestemmelse av om hvorvidt de er antagonister til LFA-1-aggregering. ;E. Anvendelser av antistoffer som kan bindes til ICAM-1-reseptorproteiner ;1. Anti-inflammatoriske midler ;Monoklonale antistoffer overfor elementer i CD-18-komplekset inhiberer mange adhesjonsavhengige funksjoner hos leukocytter innbefattende binding til endotel (D. Haskard et al., J. Immunol., 137:2901-2906 {1986)), homotypiske adhesjoner CR. Rothlein et al., J. Exp. Med., 163:1132-1149 (1986)), antigen- og mitogen-bevirket formering av lymfocytter (D. Davignon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78:4535-4539 ;(1981)), antistoffdannelse (A. Fischer et al., J. Immunol., 136:3198-3203 (1986)), og effektorfunksjoner hos alle leukocytter så som lytisk aktivitet av cytotoksiske T-celler (A.M. Krensky et al., J. Immuno., 132:2180-2182 (1984)), makrofater (G. Strassman et al., J. Immunol., 136:4328-4333 (1986)), .og alle celler som inngår i antistoffavhengige cellecytotoksi-sitetsreaksjoner (S. Kohl et al., J. Immunol., 133:2972-2978 ;(1984)). Ved alle de ovennevnte funksjoner inhiberer antistoffene leukocyttens evne til å festes til det passende cellesubstrat, som i sin tur inhiberer det endelige utfall. ;Som omtalt ovenfor, er bindingen av ICAM-1-molekyler til medlemmene av LFA-l-molekylfamilien av sentral betydning ved cellulær adhesjon. Ved adhesjonsprosesen kan lymfocytter stadig kontrollere et dyr med hensyn til nærvær av fremmede antigener. Skjønt disse prosesser normalt er ønskelig, er de også årsaken til organtransplantasjonsforkastelse, vevstrans-plantasjonsforkastelse og mange autoimmunsykdommer. Følgelig ville hvilket som helst hjelpemiddel som kunne svekke eller inhibere cellulær adhesjon, være meget ønskelig for mottagere av organtransplantater, vevstransplantater eller for autoimmun-pasienter. ;Monoklonale antistoffer som kan bindes til ICAM-1, er meget godt egnet som anti-inflammatoriske midler i et pattedyr. Det er betydningsfullt at slike midler er forskjellige fra vanlige anti-inflammatoriske midler ved at de selektivt kan inhibere adhesjon og ikke gir andre bivirkninger så som nyretoksisitet som finnes når det gjelder vanlige midler. Monoklonale antistoffer som kan bindes til ICAM-1, kan derfor anvendes for forhindring av organ- eller vevsforkastelse, eller til modifisering av autoimmunresponser uten frykt for slike bivirkninger i pattedyret. ;Det er betydningsfullt at anvendelsen av monoklonale antistoffer som kan oppfatte ICAM-1, kan gjøre det mulig at man kan utføre organtransplantasjoner selv mellom individer som har HLA-uoverensstemmelse. ;2. Undertrykkere av hypersensitivitetsreaksjon av forsinket type ;Siden ICAM-1-molekyler for det meste uttrykkes på inflammasjonssteder, så som slike steder som inngår ved hypersensitivitetsreaksjon av forsinket type, har antistoffer (særlig monoklonale antistoffer) som kan bindes til ICAM-1-molekyler, terapeutisk potensiale ved svekking eller elimine-ring av slike reaksjoner. Denne potensielle terapeutiske anvendelse kan utnyttes på én av to måter. For det første kan en blanding som inneholder et monoklonalt antistoff mot ICAM-1, administreres til en pasient som får en hypersensitivitetsreaksjon av forsinket type. F.eks. kan slike blandinger gis til et individ som har vært i kontakt med antigener så som giftig eføy, giftig eik, osv. Ved den annen utførelsesform administreres det monoklonale antistoff som kan bindes til ICAM-1, til en pasient i forbindelse med et antigen for forhindring av en etterfølgende inflammatorisk reaksjon. Således kan tilleggsadministrasjonen av et antigen med et ICAM-1-bindende monoklonalt antistoff gjøre at et individ midlertidig kan tolerere etterfølgende presentasjon av dette antigen. ;3. Terapi for kronisk inflammatorisk sykdom ;Siden LAD-pasienter som mangler LFA-1, ikke frembringer en inflammatorisk respons, antas det at antagonisme til LFA-1's naturlige ligand, ICAM-1, også vil inhibere en inflammatorisk respons. Evnen hos antistoffer mot ICAM-1 til inhibering av inflammasjon gir grunnlaget for deres terapeutiske anvendelse ved behandling av kroniske inflammatoriske sykdommer og autoimmune sykdommer så som lupus erytematosus, autoimmun tyroiditt, eksperimentell allgerisk encefalomyelitt (EAE), multippel sklerose, noen former av diabetes Reynaud's syndrom, reumatoid artritt osv. Slike antistoffer kan også anvendes som terapi ved behandling av psoriasis. Vanligvis kan de monoklonale antistoffer som kan bindes til ICAM-1, anvendes ved behandling av slike sykdommer som vanligvis kan behandles ved steroid-terapi. ;4. Diagnostiske og prognostiske anvendelser ;Siden ICAM-1 for det meste uttrykkes på inflammasjonssteder, kan monoklonale antistoffer som kan bindes til ICAM-1, anvendes som et middel til avbilding eller visualisering av infeksjons- og inflammasjonsstedene hos en pasient. Ved slik anvendelse merkes de monoklonale antistoffer påvisbart ved anvendelse av radioisotoper, affinitetsmarkører (så som biotin, avidin osv), fluorescerende markører, paramagnetiske atomer osv. Fremgangsmåter for utførelse av slik merking er velkjente på området. Det er gitt en oversikt over klinisk anvendelse av antistoffer ved diagnostisk avbilding av H.B. Grosman, Uroi. Clin. North Amerk., 13:465-474 (1986), E.C. Unger et al., Invest- Radiol., 20:693:700 (1985) og B.A. Khaw et al., Science, 209:295-297 (1980). ;Tilstedeværelse av inflammasjon kan også påvises ved anvendelse av bindingsligander så som mRNA, cDNA eller DNA, som bindes til ICAM-1-gensekvenser eller til ICAM-1-mRNA-sekvenser, i celler som uttrykker ICAM-1. Teknikker for utførelse av slike hybridiseringsanalyser er beskrevet av T. Maniatis (som ovenfor). ;Påvisning av sentrer for slike påvistbart merkede antistoffer angir et inflammasjonssted eller tumorutvikling. Ved én utførelsesform utføres denne undersøkelse angående inflammasjon ved fjerning av vevsprøver eller blod og inkubering av slike prøver i nærvær av påvisbart merkede antistoffer. Ved en foretrukket utførelsesform utføres denne teknikk på en ikke-invasiv måte ved anvendelse av magnetisk avbilding, fluorografi osv. En slik diagnostisk test kan anvendes til kontrollering av organtransplantat-mottagere når det gjelder tidlige tegn på potensiell vevsforkastelse. Slike analyser kan også utføres ved bestrebelser på bestemmelse av et individs tilbøyelighet til reumatoid artritt eller andre kroniske inflammatoriske sykdommer. ;Mens oppfinnelsen nå er blitt generelt beskrevet, vil den lettere kunne forstås ved henvisning til følgende eksempler som er gitt som illustrasjon. ;EKSEMPEL 1 ;Dyrkning av pattedyrsceller ;Vanligvis ble EBV-transformerte celler og hybridomcellene oppbevart i RMPI 1640- dyrkningsmedium, supplert med 20 mM L-glutamin, 50 fig/ ml gentamycin og 10% føtalt bovint {eller føtalt kalve-) serum. Cellene ble dyrket ved 3 7°C i en fuktig atmosfære av 5% C02 og 95% luft. ;For frembringelse av Epstein-Barr-virus (EBV)-transformanter ble T-celle-uttømte mononukleære celler fra perifert blod i et antall av l0<6>/ml i RPMI 164 0-medium supplert med 20% føtalt kalveserum (FCS) , og 50 /xg/ml gentamycin inkubert i 16 timer med EBV-holdig supernatant fra B95-8-celler (D.A. Thorley-Lawson et al., J. Exper. Med., 146:495 {1977)). Celler i porsjoner på 0,2 ml ble anbragt i 10 ;mikrotiterbrønner. Mediet ble erstattet med RPMI 1640-medium ;(supplert med 20% føtalt kalveserum og 50 /ig/ml gentamycin) ;inntil cellevekst ble observert. Cellene vokste i de fleste brønner og ble ekspandert i det samme medium. ;Fytohemaglutinin-(PHA)-blåster ble opprettet med IO<6> celler/ml i RPMI 1640-medium (supplert med 20% føtalt kalveserum) som inneholdt en 1:800-fortynning av PHA-P (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI). PHA-linjer ble ekspandert med interleukin 2-(IL-2)-kondisjonert medium og pulsert ukentlig med PHA (D.A. Cantrell et al., J. Exper. Med., 158:1895 (1983)). Ovennevnte fremgangsmåte ble beskrevet av T. Springer et al., J. Exper. Med., 160:1901-1918 (1984), hvilken referanse er medtatt i det foreliggende som referanse. Celler oppnådd ved ovennevnte fremgangsmåte undersøkes så med anti-LFA-l-antistoffer for bestemmelse av om hvorvidt de uttrykker LFA-1-antigenet. Slike antistoffer er beskrevet av F. Sanchez-Madrid et al., J. Exper. Med., 158:1785 (1983). ;EKSEMPEL 2 ;Analyser angående cellulær aggregering og adhesjon ;For vurdering av omfanget av cellulær adhesjon ble det anvendt aggregeringsanalyser. Cellelinjer som ble anvendt i, slike analyser, ble vasket to ganger med RPMI 1640-medium som inneholdt 5 mM hepesbuffer (Sigma Chemical Co., St. Louis) og suspendert på nytt til en konsentrasjon på 2 x IO<6> celler/ml. I flatbunnede 96-brønns-mikrotiterplater (nr. 3596; Costar Cambridge, MA) ble det tilsatt 50 fil passende monoklonalt-antistoff-supernatant eller 50 fil komplett medium med eller uten rensede monoklonale antistoffer, 50 ( il komplett medium som inneholdt 200 ng/ml av forbolester-forbolmyristatacetatet (PMA) og 100 ul celler med en konsentrasjon på 2 x IO<6> celler/ml i komplett medium. Dette ga en endelig konsentrasjon på 50 ng/ml PMA og 2 x IO<5> celler/brønn. Cellene fikk bunnfelles spontant, og aggregeringsgraden ble notert på forskjellige tidspunkter. Poengtallene var i området fra 0 til 5+, hvor 0 anga at i det vesentlige ingen celler var i klynger; 1+ anga at mindre enn 10% av cellene var i aggregater; 2+ anga at mindre enn 50% av cellene var aggregert; 3+ anga at opptil 100% av cellene var i små, løse klynger; 4+ anga at opp til 100% av cellene var aggregert i større klynger; og 5+ anga at 100% av cellene var i store, meget kompakte aggregater. For oppnåelse av en mer kvantitativ vurdering av celleadhesjonen, ble reagenser og celler tilsatt i 5 ml polystyrenrør i samme rekkefølge som ovenfor. Rørene ble anbragt i et stativ på et roterende rysteappart ved 37°C. Etter 1 time ved ca. 2 00 rpm ;(omdreininger pr. minutt), ble 10 /il av cellesuspensjonen anbragt i et hemocytometer, og antallet frie celler ble kvantifisert. Prosentvis aggregering ble bestemt ved følgende ligning: ;Antallet innførte celler i ovenstående formel er antallet celler pr. ml i et kontrollrør som bare inneholdt celler og komplett medium som ikke var blitt inkubert. Antallet frie celler i ovenstående ligning er lik antallet ikke-aggregerte celler pr. ml fra forsøksrør. Ovenstående fremgangsmåter er beskrevet av R. Rothlein et al., J. Exper. Med., 163:1132-1149 ;(1986) . ;EKSEMPEL 3 ;LFA-1-avhengig celleaggregering ;Den kvalitative aggregeringsanalyse som er beskrevet i eksempel 2, ble utført under anvendelse av den Epstein-Barr-transformerte cellelinje JY. Ved tilsetning av PMA til dyrkningsmediet i mikrotiterplatene ble aggregering av celler observert. Videoregistreringer av tidsforløp viste at JY-cellene i bunnen av mikrotiterbrønnene var bevegelige og viste aktiv membranrynking og pseudopodiebevegelse. Kontakt mellom pseudopodiene i naboceller resulterte ofte i celle-celle-adhesjon. Hvis adhesjonen var langvaring, beveget området for cellekontakt seg til uropod. Kontakt kunne opprettholdes til tross for sterke cellebevegelser og rykking av cellene i motsatte retninger. Hovedforskjellen mellom PMA-behandlede og ubehandlede celler så ut til å være i stabiliteten av disse kontakter straks de var dannet. Med PMA utviklet det seg celleklynger som vokste i størrelse ettersom ytterligere celler ble tilheftet i periferien av dem. ;Som et andre hjelpemiddel til måling av adhesjon ble den kvantitative analyse som er beskrevet i eksempel 2, anvendt. Cellesuspensjonene ble rystet ved 200 rpm i 2 timer, overført til et hemocytorneter, og celler som ikke var i aggregater, ble opptellet. I fravær av PMA var 42% (SD = 20%, N = 6) i JY-celler i aggregater etter 2 timer, mens JY-celler inkubert under identiske betingelser med 50 ng/ml PMA hadde 87% (SD = 8%, N = 6) av cellene i aggregater. Kinetiske undersøkelser av aggregeringen viste at PMA forøkte mengden og størrelsen av agggeringen på alle de undersøkte tidspunkter (figur 3). ;EKSEMPEL 4 ;Inhibering av aggregering av celler under anvendelse ;av monoklonale anti-LFA-l-antistoffer ;For undersøkelse av virkningene av monoklonale anti-LFA-l-antistof f er på PMA-bevirket celleaggregering, ble slike antistoffer tilsatt til celler inkubert i henhold til den kvalitative aggregeringsanalyse ifølge eksempel 2. De monoklonale antistoffer ble funnet å inhibere dannelsen av aggregater av celler enten i nærvær eller fravær av PMA. Både F(ab')2- og Fab<1->fragmentene av monoklonale antistoffer mot alfakjeden i LFA-1 kunne inhibere celleaggregering. Skjønt omtrent 100% av cellene dannet aggregater i fravær av anti-LFA-l-antistof f, ble mindre enn 20% av cellene funnet å være i aggregater når antistoff ble tilsatt. Resultatene av dette forsøk er beskrevet av R. Rothlein et al., (J. Exper. Med., 163:1132-1149 (1986)) . ;EKSEMPEL 5 ;Celleaggregering fordrer LFA-1-reseptoren EBV-transformerte lymfoblastoidceller ble fremstilt fra pasienter på den måte som er beskrevet i eksempel 1. Slike celler ble undersøkt overfor monoklonale antistoffer som kunne oppfatte LFA-1, og cellene ble funnet å ha mangel på LFA-1. ;Den kvalitative aggregeringsanalyse som er beskrevet i eksempel 2, ble anvendt under anvendelse av de LFA-1-manglende celler som er beskrevet ovenfor. Slike celler aggregerte ikke spontant, selv i nærvær av PMA. ;EKSEMPEL 6 ;Oppdagelse av ICAM-1 ;De LFA-1-manglende celler ifølge eksempel 5 ble merket med karboksyfluorescein-diacetat (M. Patarroyo et al., Cell. Immunol., 63:237-248 (1981)}. De merkede celler ble blandet i et forhold på 1:10 med autologe eller JY-celler, og prosentandelen av fluoresceinmerkede celler i aggregater ble bestemt i henhold til fremgangsmåten ifølge R. Rothlein et al., J. Exper. Med., 163:1132-149 (1986). De LFA-1-manglende celler ble funnet å kunne ko-aggregere med LFA-1-eksprimerende celler (figur 4). ;For bestemmelse av om hvorvidt LFA-1 bare hadde betydning ved dannelse av aggregater, eller ved opprettholdelse av dem, ble antistoffer som kunne bindes til LFA-1, tilsatt til de fordannede aggregater beskrevet ovenfor. Tilsettingen av antistoff ble funnet å splitte den fordannede aggregering i sterk grad. Videoregistrering av tidsforløp bekreftet at tilsetting av de monoklonale antistoffer til fordannede aggregater begynte å forårsake oppriving innen 2 timer (tabell 1). Etter tilsetting av monoklonale antistoffer mot LFA-1, fortsatte pseudopodie-bevegelser og forandringer i form av individuelle celler i aggregater uforandret. Individuelle celler ble gradvis løsrevet fra aggregatets periferi; etter 8 timer var størstedelen av cellene dispergert. Ifølge videoregistrering av tidsforløp, fremtrådte opprivingen av fordannede aggregater ved monoklonale LFA-l-antistoffer som ekvivalent med aggregeringsprosessen i fravær av monoklonalt LFA-l-antistoff når man gikk tilbake i tid. ;EKSEMPEL 7 ;Krav om divalente ioner for LFA-1-avhengig aggregering LFA-1-avhengige adhesjoner mellom cytotoksiske T-celler og målsubstanser fordrer tilstedeværelse av magnesium (E. Martz, J. Cell. Biol., 84:584-598 (1980)). PMA-bevirket JY-celleaggregering ble undersøkt med hensyn til avhengighet av divalente kationer. JY-celler aggregerte ikke (under anvendelse av analysen ifølge eksempel 2) i medium som var fritt for kalsium- eller magnesiumioner. Tilsetning av divalent magnesium understøttet aggegeringen ved konsentrasjoner så lave som 0,3 mM. Tilsetning av kalsiumioner alene hadde liten effekt. Kalsiumioner ble imidlertid funnet å forsterke magnesiumioners evne til understøttelse av PMA-bevirket aggregering. Når 1,25 mM kalsiumioner ble tilsatt til mediet, ble magnesiumionekonsentrasjoner så lave som 0,02 millimolar funnet å understøtte aggregeringen. Disse data viser at den LFA-1-avhengige aggregering av celler fordrer magnesiumioner, og at kalsiumioner, skjønt de i seg selv er utilstrekkelige, kan virke synergisk med magnesiumioner slik at aggregering gjøres mulig. ;EKSEMPEL 8 ;Isolering av hybridomceller som kan uttrykke monoklonale anti-ICAM-l-antistoffer ;Monoklonale antistoffer som kunne bindes til ICAM-1, ble isolert i henhold til fremgangsmåten ifølge R. Rothlein et al., J. Immunol., 137:1270-1274 (1986), hvilken referanse er blitt medtatt i det foreliggende som referanse. Således ble 3 BALB/C-mus immunisert intraperitonealt med EBV-transformerte mononukleære celler fra perifert blod, fra et LFA-1-manglende individ (T.A. Springer et al., J. Exper. Med., 160:1901 ;(1984)). Ca. IO<7> celler i 1 ml RPMI 1640-medium ble anvendt for hver immunisering. Immuniseringsdosene ble administrert 45, 29 og 4 dager før miltceller ble fjernet fra musen for dannelse av de ønskede hybridomcellelinjer. På dag 3 før fjerning av miltcellene fikk musene ytterligere IO<7> celler i 0,15 ml medium (intravenøst). ;Isolerte miltceller fra de ovenfor beskrevne dyr ble sammensmeltet med P3X73Ag8.653-myelomceller i et forhold på 4:1 i henhold til protokollen ifølge G. Galfre et al., Nature, 266:550 (1977). Porsjoner av de resulterende hybridomceller ble innført i 96-brønns-mikrotiterplater. Hybridomsupernatant-ene ble undersøkt med hensyn til inhibering av aggregering, og ett inhiberende hybridom (blant over 600 undersøkte brønner) ble klonet og subklonet ved begrensningsfortynning. Denne subklon ble betegnet RRl/1.1.1 (i det følgende betegnet "RR1/1"). ;Monoklonalt antistoff RR1/1 ble overensstemmende funnet å inhibere PMA-stimulert aggregering av den LFA-1-uttrykkende cellelinje JY. Det monoklonale RRl/1-antistoff inhiberte aggregering tilsvarende, eller litt mindre enn, en del monoklonale antistoffer mot LFA-l-alfa- eller -beta-underenhetene. I motsetning til dette ble aggregering ikke inhibert av monoklonalt kontrollantistoff mot HLA, som er rikelig uttrykt på JY-celler. Antigenet som ble bundet av monoklonalt antistoff RRl/1, er definert som det intercellulære adhesjonsmolekyl 1 (ICAM-1). ;EKSEMPEL 9 ;Anvendelse av monoklonale anti-ICAM-l-antistoffer ;for karakterisering av ICAM-1-molekylet ;For bestemmelse av beskaffenheten av ICAM-1, og spesielt for bestemmelse av om hvorvidt ICAM-1 var forskjellig fra LFA-1, ble celleproteiner immunutfelt under anvendelse av monoklonalt antistoff RRl/1. Immunutfellingen ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge R. Rothlein et al., (J Immunol., 137:1270-1274 (1986)). JY-cller ble lysert med 5 x IO<7> celler/ml i 1% Triton X-100, 0,14 mM NaCl, 10 mM tris, pH 8,0, med nylig tilsatt 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 0,2 enheter pr. ml trypsininhibitor aprotinin (lysebuffer) i 20 minutter ved 4°C. Lysatene ble sentrifugert ved 10.000 x g i 10 minutter og forklaret med 50 ^1 av en 50% suspensjon av CNBr-aktivert, glysin-stoppet Sepharose CL-4B i 1 time ved 4°C. 1 ml lysat ble immunutf elt med 20 pl av en 50% suspensjon av monoklonalt antistoff RRl/1 koplet til Sepharose CL-4B (1 mg/ml) over natten ved 4°C (T.A. Springer et al., J. Exper. Med., 160:1901 ;(1984)). Sepharose-bundet monoklonalt antistoff ble fremstilt under anvendelse av DNBr-aktivering av Sepharose CL-4B i karbonatbuffer i henhold til fremgangsmåten ifølge S. March et al., (Anal. Biochem., 60:149 (1974)). Vaskede immunutfellinger ble underkastet SDS-PAGE og sølvfarging i henhold til fremgangsmåten ifølge J.H. Morrissey, Anal. Biochem., 117:307 ;(1981) . ;Etter eluering av proteiner med SDS-prøvebuffer (M.K. Ho et al., J. Biol. Chem., 258:636 (1983)) ved 100°C, ble prøvene delt i to halvdeler og underkastet elektroforese (SDS-8% PAGE) under reduserende (figur 5A) eller ikke-reduserende betingelser (figur 5B). Bånd med molekylvekt på 50 kd og 25 kd svarte til de tunge og lette kjeder av immunglobuliner fra Sepharosen med det monoklonale antistoff (figur 5A, felt 3). Variable mengder ' av andre bånd i vektområdet 25-50 kd ble også observert, men ble ikke sett i utfeininger fra hårete leukemiceller, som bare ga et bånd ved molekylvekt 90 kd. Alfa-underenheten på 177 kd og beta-underenheten på 95 kd av LFA-1 ble funnet å vandre anderledes enn ICAM-1 både under reduserende (figur 5A, felt 2) og ikke-reduserende (figur 5B, felt 2) betingelser. ;For bestemmelse av effekten av monoklonalt antistoff RRl/1 på PHA-lymfoblastaggregering, ble den kvantitative aggregeringsanalyse beskrevet i eksempel 2 anvendt. Således ble T-celle-blastceller stimulert i 4 dager med PHA, vasket grundig og så dyrket i 6 dager i nærvær av IL-2-kondisjonert medium. PHA ble funnet å bli internalisert under denne 6 dagers kultur og bidro ikke ved aggregeringsanalysen. I tre forskjellige analyser med forskjellige T-celleblast-preparater, inhiberte monoklonale ICAM-l-antistoffer aggregeringen overensstemmende (tabell 2). ;Monoklonale LFA-l-antistoffer var overensstemmende mer inhiberende enn monoklonale ICAM-1-antistoffer, mens monoklonale HLA-A, B- og LFA-3-antistoffer var uten effekt. Disse resultater viser at blant de undersøkte monoklonale antistoffer, kunne bare de som kunne bindes til LFA-1 eller ICAM-1, inhibere celleadhesjon. ;EKSEMPEL 10 ;Fremstilling av monoklonalt antistoff mot ICAM-1 ;Immunisering ;En Balb/C-mus ble immunisert intraperitonealt (i.p.) med 0,5 ml 2 x 10<7> JY-celler i RPMI-medium 103 dager og 24 dager før fusjon. På dag 4 og 3 før fusjon ble mus immunisert i.p. med IO<7> celler av PMA-differensierte U937-celler i 0,5 ml RPMI-medium. ;Differensiering av U937- celler ;U937-celler (ATCC CRL-1593) ble differensiert ved inkubering med 5 x 10<5>/ml i RPMI med 10% føtalt bovint serum, 1% glutamin og 50 tig/ ml gentamycin (komplett medium) som inneholdt 2 ng/ml forbol-12-myristatacetat (PMA) i en steril polypropylenbeholder. På den tredje dag av denne inkubering ble halvdelen av medievolumet fjernet og erstattet med friskt komplett medium som inneholdt PMA- På dag 4 ble cellene fjernet, vasket og preparert for immunisering. ;Fusjon ;Miltceller fra de immuniserte mus ble sammensmeltet med P3x63 Ag8-653-myelomceller i et forhold på 4:1 ifølge Galfre et al., (Nature, 266:550 (1977)). Etter fusjonen ble cellene utplatet i flatbunnede mikrotiterplater med 96 brønner med IO<5 >miltceller/brønn. ;Seleksjon med hensyn til anti- ICAM- l- positive celler ;Etter en uke ble 50 /il supernatant undersøkt ved den kvalitative aggregeringsanalyse ifølge eksempel 2 under anvendelse både av JY og SKW-3 som aggregerende cellelinjer. Celler fra supernatanter som inhiberte JY-celleaggregering, men ikke SKW-3, ble utvalgt og klonet 2 ganger under anvendelse av begrensende fortynning. ;Dette forsøk resulterte i identifikasjon og kloning av tre adskilte hybridom-linjer som dannet monoklonale anti-ICAM-l-antistof f er. Antistoffene dannet ved disse hybridomlinjer, var henholdsvis IgG2a, IgG2b og IgM. Hybridomcellelinjen som dannet IgG2a-anti-ICAM-l-antistoffet, ble gitt betegnelsen R6'5'D6'E9<1>B2. Antistoffet som ble dannet av den foretrukkede hybridomcellelinje, ble betegnet R6<1>5<1>D6<1>E9'B2 (i det følgende omtalt som "R6-5-D6". ;EKSEMPEL 11 ;Ekspresjon og regulering av ICAM-1 ;For måling av ICAM-l-ekspresjon ble det utviklet en radioimmunanalyse. I denne analyse ble renset RRl/1 jodert under anvendelse av jodogen til en spesifikk aktivitet på 10 nCi/ ng. Endotelceller ble dyrket i plater med 96 brønner og behandlet som beskrevet for hvert forsøk. Platene ble avkjølt ved 4°C ved anbringelse i et kaldt rom i 0,5-1 time, ikke umiddelbart på is. Monolagene ble vasket 3 ganger med kaldt komplett medium og deretter inkubert i 30 minutter ved 4°C med <125>I-RRl/1. Monolagene ble så vakset 3 ganger med komplett medium. Det bundne <125>I ble frigjort ved anvendelse av 0,1 N NaOH og tellet. Den spesifikke aktivitet for <125>I-RR1/1 ble justert under anvendelse av umerket RRl/1 for oppnåelse av et lineært signal over antigendensitetsområdet som fantes ved denne undersøkelse. Ikke-spesifikk binding ble bestemt i nærvær av et tusendobbelt overskudd av umerket RRl/1 og ble subtrahert fra den totale binding for oppnåelse av spesifikk binding. ;ICAM-l-ekspresjon, målt under anvendelse av den ovenfor beskrevne radioimmunanalyse, økes på humane navlevene-endotelceller (HUVEC) og humane safena-vene-endotelceller (HSVEC) ved IL-1, TNF, LPS og IFN-gamma (tabell 3). Safena-vene-endotelceller ble anvendt ved denne undersøkelse for å bekrefte resultatene fra navlevene-endotelceller i dyrkede endotelceller fra store vener fra vev hos voksne. Basalekspresjonen av ICAM-1 er to ganger høyere på safena-vene-endotelceller enn på navle-vene-endotelceller. Utsettelse av navle-vene-endotelceller for rekombinant IL-l-alfa, IL-l-beta og TNF-gamma øker ICAM-1-ekspresjonen 10-20 ganger. IL-l-alfa, TNF og LPS var de mest potent-innførere, og IL-1 var mindre potent på vektbasis og også ved metningskonsentrasjoner for responsen (tabell 3). IL-l-beta ved 100 ng/ml øket ICAM-1-ekspresjonen 9 ganger på HUVEC og 7,3 ganger på HSVEC, idet halvmaksimal økning fremkom ved 15 ng/ml. rTNF med 50 ng/ml øket ICAM-1-ekspresjonen 16 ganger på HUVEC og 11 ganger på HSVEC med halvmaksimale effekter ved 0,5 ng/ml. Interferon-gamma ga en betydelig økning i ICAM-l-ekspresjon på 5,2 ganger på HUVEC eller 3,5 ganger på HSVEC ved 10.000 U/ml. Effekten av LPS ved 10 fxg/ml var i samme størrelsesorden som effekten av rTNF. Parvise kombinasjoner av disse mediatorer resulterte i additive eller litt mindre enn additive effekter på ICAM-1-ekspresjonen (tabell 3). Krysstitrering av rTNF med rIL-l-beta eller rlFN-gamma viste ingen synergisme mellom disse ved suboptimale eller optimale konsentrasjoner. ;Siden LPS øket ICAM-1-ekspresjonen på endotelceller ved ;nivåer som noen ganger finnes i dyrkningsmedier, ble muligheten for at den basale ICAM-ekspresjon kunne skyldes LPS, undersøkt. Når flere serumporsjoner ble undersøkt, ble det funnet at serum med lavt endotoksininnhold ga lavere ICAM-l-basalekspresjon med 25%. Alle resultater som er gjengitt her, var for endotelceller dyrket i serum med lavt endotoksininnhold. Imidlertid minsket innarbeidelse av det LPS-nøytraliserende antibiotikum polymyksin B med 10 n<g>/ ml ICAM-1-ekspresjonen bare med ytterligere 25% (tabell 3). Økningen i ICAM-l-ekspresjonen ved behandling med IL-1 eller TNF ble ikke påvirket ved tilstedeværelse av 10 //g/ml polymyksin B, hvilket er overensstemmende med de lave endotoksin-nivåer i disse preparter (tabell 3). ;;Oppregulering av ICAM-1-ekspresjonen på HUVEC og HSVEC. HUVEC eller HSVEC ble utsådd i 96 brønns-plater med 1:3 fra et sammenløpende monolag og fikk vokse til sammenløping. Cellene ble så behandlet med de angitte materialer eller medier i 16 timer, og RIA ble utført ifølge beskrevet fremgangsmåte. Alle punkter ble utført med fire paralleller. ;EKSEMPEL 12 ;Kinetikk for interleukin-1 og gamma-interferon-induksjon av ICAM-1 ;Kinetikken for interleukin-1 og gammainterferoneffekter på ICAM-l-ekspresjon på hud-fibroblaster ble bestemt under anvendelse av 125I-geite-antimus-IgG-bindingsanalyse ifølge M.L. Dustin et al., (J. Immunol., 137:24 5-254 (1986); hvilken referanse er medtatt i det foreliggende som referanse). For utførelse av denne bindingsanalyse ble humane hudfibroblaster dyrket i en 96-brønns mikrotiterplate til en densitet på 2-8 x IO4 celler/brønn (0,32 cm<2>). Cellene ble vasket to ganger med RPMI 1640-medium supplert som beskrevet i eksempel 1. Cellene ble dessuten vasket en gang med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), 10 mM HEPES, 0,05% NaN3 og 10% varme-inaktivert føtalt bovint serum. Vasking med denne bindingsbuffer ble utført ved 4°C. I hver brønn ble det tilsatt 50 fil av den ovenfor beskrevene bindingsbuf f er og 50 fil av den hensiktsmessige hybridom-supernatant med X63 og W6/32 som henholdsvis negativ og positiv kontroll. Etter inkubering i 30 minutter ved 4°C med forsiktig agitering, ble brønnene vasket to ganger med bindingsbuffer, og det andre antistoff 125I-geite-antimus-IgG, ble tilsatt med 50 nCi i 100 ni. 125I-geite-antimus-antistoffet ble fremstilt ved anvendelse av jodogen (Pierce) i henhold til fremgangsmåten ifølge P.J. Fraker et al., {Biochem. Biophys. Res. Commun., 80:849 (1978)). Etter 30 minutter ved 4°C ble brønnene vasket to ganger med 200 /il bindingsbuf f er, og cellelaget ble solubilisert ved tilsetting av 100 /il 0,1 N NaOH. Dette og en 100 /il vasking ble tellet i en gammateller av typen Beckman 5500. De spesifikke tellinger pr. minutt ble beregnet som [cpm med monoklonalt antistoff]-[cpm med X63]. Alle trinn, innbefattende induksjon med spesifikke reagenser ble utført i fire paralleller. ;Effekten av interleukin 1 med en halveringstid for ICAM-1-induksjon på 2 timer var hurtigere enn effekten av gammainter-feron med en halveringstid på 3,75 timer (figur 6). Tidsfor-løpet for tilbakevending til hvilenivåer for ICAM-1 viste seg å avhenge av cellesyklusen eller hastigheten av celleveksten. Hos hvilende celler er interleukin 1- og gamma-interferoneffekter stabile i 2-3 dager, mens ICAM-1-ekspresjonen i log-fasekulturer er nær basislinjen 2 dager etter fjerning av disse induksj onsmidler. ;Doseresponskurvene for induksjon av ICAM-1 ved rekombinant muse- og humant interleukin 1, og for rekombinant humant gamma-interf eron, er vist på figur 7. Gamma-interferon og interleukin 1 ble funnet å ha samme konsentrasjonsavhengigheter med nesten identiske effekter ved 1 ng/ml. Det rekombinante humane og muse-interleukin 1 har også lignende kurver, men er mye mindre effektive enn preparater av humant interleukin 1 ved induksjon av ICAM-l-ekspresjon. ;Cykloheksimid, en inhibitor for proteinsyntese, og aktinomycin D, en inhibitor for mRNA-syntese, opphever effektene både av interleukin 1 og gamma-interferon på ICAM-l-ekspresjon på fibroblaster (tabell 4). Videre inhiberte tunikamycin, en inhibitor for N-bundet glykosylering, bare interleukin 1-effekten med 43%. Disse resultater viser at protein- og mRNA-syntese, men ikke N-bundet glykosylering, fordres for interleukin 1- og gamma-interferon-stimulerte økninger i ICAM-l-ekspresjon. ;EKSEMPEL 13 ;Vevsfordeling av ICAM-1 ;Histokjetniske undersøkelser ble utført på frosset vev fra humane organer for bestemmelse av fordelingen av ICAM-1 i thymus, lymfeknuter, tarmer, hud, nyrer og lever. For utfø-relse av en slik analyse ble frosne vevssnitt (4 /im tykke) av normale humane vev fiksert i aceton i 10 minutter og farget med det monoklonale antistoff RRl/1 ved en immunperoksydaseteknikk hvor det ble anvendt avidin-biotin-kompleksmetoden (Vector Laboratories, Burlingame, CA) beskrevet av N. Cerf-Bensussan et al., (J. Immunol., 130:2615 (1983)). Etter inkubering med antistoffet, ble snittene sekvensielt inkubert med biotinylert heste-anti-mus-IgG og avidin-biotinylerte peroksydase-komplekser. Snittene ble tilslutt dyppet i en oppløsning som inneholdt 3-amino-9-etyl-karbazol (Aldrich Chemical Co., Inc. Milwaukee WI) for frembringelse av en fargereaksjon. Snittene ble så fiksert i 4% formaldehyd i 5 minutter og ble motfarget med hematoksylin. Kontroller innbefattet snitt inkubert med ikke-beslektede monoklonale antistoffer istedenfor RRl/1-antistoffet. ;ICAM-1-ble funnet å ha en fordeling som var mest lik fordelingen hos hoved-histokompatibilitetskompleks-(MHC)-antigener klasse II. De fleste av blodkarene (både små og store) i alle vev viste farging av endotelceller med ICAM-1-antistoff. Vaskulær-endotelfargingen var mer intens i interfollikulære (parakortikale) områder i lymfeknuter, tonsiller og peyerske flekker, sammenlignet med kar i nyre, lever og normal hud. I leveren var fargingen for det meste begrenset til sinusoidal-dekkende celler; hepatocyttene og endotelcellene som dekker mestedelen av portvenene og -arteriene, var ikke farget. ;I thymusmargen ble det observert diffus farging av store celler og et dendrittisk fargemønster. I barken var farge-mønsteret fokalt og hovedsakelig dendrittisk Thymocytter ble ikke farget. I det perifere lymfoide vev ble kimsentercellene i de sekundære lymfoide follikler intenst farget. I noen lymfoide follikler var fargemønsteret for det meste dendrittisk, uten noen gjenkjennelig farging av lymfocyttene. Svak farging av celler i dekkesonen ble også observert. Dessuten ble dendrittiske celler med cytoplasma-forlengelser ("mellomfinger"-retikulumceller) og et lite antall lymfocytter i de interfollikulære eller parakortikale områder farget med det ICAM-1-bindende antistoff. ;Celler som lignet makrofager, ble farget i lymfeknutene og lamina propria i tynntarmen. Fibroblastlignende celler (spindelformede celler) og dendrittiske celler som var spredt i stroma i de fleste undersøkte organer, ble farget med det ICAM-1-bindende antistoff. Ingen farging kunne sees i de langer-hanske/ubestemmelige celler i epidermis. Ingen farging ble observet i glatt muskelvev. ;Fargingen av epitelceller ble likeledes sett i tonsillenes slimhinner. Skjønt hepatocytter, gallegangsepitel, tarmepitel-celler og tubulus-epitelceller i nyren ikke ble farget under de fleste omstendigheter, viste snitt fra normalt nyrevev fra en prøve av fjernet nyre med nyrecelle-karsinom farging av mange celler fra proksimale tubuli med hensyn til ICAM-1. Disse tubulus-epitelceller ble også farget med et anti-HLA-DR-bindende antistoff. ;Oppsummert uttrykkes ICAM-1 på ikke-hematopoietiske celler så som vaskulære endotelceller, og på hematopoietiske celler så som vevsmakrofager og mitogenstimulerte T-lymfocyttblaster. ICAM-1 ble funnet å uttrykkes i små mengder på lymfocytter fra perifert blod. ;EKSEMPEL 14 ;Rensing av ICAM-1 ved monoklonalt-antistoffaffinitetskromatografi ;Generell rensingsplan ;ICAM-1 ble renset fra humane celler eller vev ved anvendelse av monoklonalt-antistoff-affinitetskromatografi. Monoklonalt antistoff RRl/1, som var reaktivt med ICAM-1, ble først renset og koplet til en inert kolonnématriks. Dette antistoff er beskrevet av R. Rothlein et al., J. Immunol., 137:1270-1274 ;(1986), og M.L. Dustin et al., J. Immunol., 137:245 (1986). ICAM-1 ble solubilisert fra cellemembraner ved lysering av cellene i en ikke-ionisk detergent, Triton X-100, ved en nesten nøytral pH. Cellelysatet som inneholdt solubilisert ICAM-1, ble så ledet gjennom forkolonner utformet for å fjerne materialer som bindes ikke-spesifikt til kolonnematriks-materialet, og deretter gjennom kolonnematriksen med det monoklonale antistoff, idet ICAM-1 fikk bindes til antistoffet. Antistoffkolonnen ble så vasket med en serie detergent-vaskebuffere med økende pH opptil pH 11,0. Under disse vaskinger forble ICAM-1 bundet til antistoffmatriksen, mens ikke-bindende og svakt bindende forurensninger ble fjernet. Det bundne ICAM-1 ble så spesifikt eluert fra kolonnen ved anvendelse av en detergent-buffer med pH 12,5. ;Rensing av monoklonalt antistoff RRl/ 1 og kovalent kopling til Sepharose CL- 4B ;Det monoklonale anti-ICAM-l-antistoff RRl/1 ble renset fra ascites-væsken fra hybridombærende mus, eller fra hybridom-dyrkningssupernatanter ved standardteknikker med ammonium-sulfatutfelling og protein A-affinitetskromatografi (Ey et al., Immunochem., 15:429 (1978)). Det rensede IgG, eller rotte-IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ble kovalent koplet til Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Sverige) under anvendelse av en modifikasjon av fremgangsmåten ifølge March et al., (Anal. Biochem., 60:149 (1974)). Kort angitt ble Sepharose CL-4B vasket i destillert vann, aktivert med 40 mg/ml CNBr i 5 M K2HP04 {pH ca. 12) i 5 minutter, og deretter vasket grundig med 0,1 mM HC1 ved 4°C. Den filtrerte, aktiverte Sepharose ble suspendert på nytt med et likt volum av renset antistoff (2-10 mg/ml i 0,1 M NaHC03, 0,1 M NaCl) . Suspensjonen ble inkubert i 18 timer ved 4°C med forsiktig ende-til-ende-rotasjon. Supernatanten ble så kontrollert med hensyn til ubundet antistoff ved absorbans ved 280 nm, og gjenværende reaktive seter på den aktiverte Sepharose ble mettet ved tilsetting av glycin til 0,05 M. Koplingseffektiviteten var vanligvis større enn 90%. ;Detergent- solubilisering av membraner fremstilt fra human milt ;Alle fremgangsmåter ble utført ved 4°C. Frosset human milt (200 g fragmenter) fra pasienter med håret-celle-leukemi ble tint på is i 200 ml Tris-saltoppløsning (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4 vd 4°C) som inneholdt 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 0,2 E/ml aprotinin og 5 mM jodacetamid. Vevet ble kuttet i små stykker og homogenisert ved 4°C med en Tekmar-maskinhomogenisator. Volumet ble så bragt til 3 00 ml med Tris-saltoppløsning, og 100 ml 10% Tween 40 (polyoksyetylensorbitan-monopalmitat) i Tris-saltoppløsning ble tilsatt under oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 2,5% Tween 40. ;For fremstilling av membraner ble homogenatet ekstrahert under anvendelse av tre slag av en Dounce- eller mer foretrukket Potter-Elvehjem-homogenisator av teflon, og deretter sentrifugert ved 1000 x g i 15 minutter. Supernatanten ble holdt tilbake, og bunnfallet ble ekstrahert på nytt med 200 ml 2,5% Tween 40 i Tris-saltoppløsning. Etter sentrifugering ved 1000 x g i 15 minutter, ble supernatantene fra begge ekstrak-sjoner blandet og sentrifugert ved 150.000 x g i 1 time for bunnfalldannelse av membranene. Membranene ble vasket ved suspendering på nytt i 2 00 ml Tris-saltoppløsning, sentrifugert ved 150.000 x g i 1 time. Membranbunnfallet ble suspendert på nytt i 200 ml Tris-saltoppløsning og ble homogenisert med en motorisert homogenisator og teflon-pistil inntil suspensjonen var jevnt uklar. Volumet ble så bragt opp til 900 ml med Tris-saltoppløsning, og N-lauroylsarkosin ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1%. Etter omrøring ved 4°C i 30 minutter, ble uløselig materiale i detergent-lysatet fjernet ved sentrifugering ved 150.000 x g i 1 time. Triton X-100 ble så tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 2%, og lysatet ble omrørt ved 4°C i 1 time. ;Vaskemiddel- solubilisering av JY- B- lymfoblastoide celler ;Den EBV-transformerte B-lymfoblastoid-cellelinje JY ble dyrket i RPMI-1640 som inneholdt 10% føtalt kalveserum (FCS) og 10 mM HEPES til en omtrentelig densitet på 0,8-1,0 x IO<6 >celler/ml. For økning av celleoverflateekspresjonen av ICAM-1, ble forbol-l2-myristat-13-acetat {PMA) tilsatt med 25 ng/ml i 8-12 timer før høsting av cellene. Natriumvanadat (50 /iM) ble også tilsatt til kulturene i løpet av dette tidsrom. Cellene ble dannet til bunnfall ved sentrifugering ved 500 x g i 10 minutter og vakset to ganger i Hank's Blanced Salt Solution (HBSS) ved suspendering på nytt og sentrifugering. Cellene (ca. 5 g pr. 5 liter kultur) ble lysert i 50 ml lysebuffer (0,14 M NaCl, 50 mM Tris pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,2 E/ml aprotinin, 1 mM PMSF, 50 ( xM natriumvanadat) ved omrøring ved 4°C i 30 minutter. Ikke-lyserte kjerner og uløselige celle-rester ble fjernet ved sentrifugering ved 10.000 x g i 15 minutter, fulgt av sentrifugering av supernatanten ved 150.000 x g i 1 time, og filtrering av supernatanten gjennom filtrer-papir av typen Whatman 3 mm. ;Affinitetskromatografi av ICAM- 1 for strukturundersøkelser ;For rensing i stor målestokk av ICAM-1 for anvendelse ved strukturundersøkelser, ble det anvendt en kolonne av 10 ml RRl/1-Sepharose CL-4B (koplet med 2,5 mg antistoff/ml gel), og to 10 ml forkolonner av CNBr-aktivert glycinstoppet Sepharose CL-4B og rotte-IgG koplet til Sepharose CL-4B (2 mg/ml). Kolonnene ble koplet i serie og forvasket med 10 kolonnevolumer lysebuffer, 10 kolonnevolumer buffer med pH 12,5 (50 mM trietylamin, 0,1% Triton X-100, pH 12,5 ved 4°C) , fulgt av ekvilibrering med 10 kolonnevolumer lysebuffer. En liter av detergent-lysatet av human milt ble påsatt ved en strømings-hastighet på 0,5-1,0 ml/minutter. De to forkolonner ble anvendt for fjerning av ikke-spesifikt bindende materiale fra lysatet før passasje gjennom RRl/l-Sepharose-kolonnen. ;Etter påsetting, ble kolonnen av RRl/1-Sepharose og bundet ICAM-1 vasket sekvensielt ved en strømingshastighet på 1 ml/minutt med minimalt 5 kolonnevolumer av hver av følgende: 1) lysebuffer, 2) 20 mM Tris, pH 8,0/0,14 M NaCl/0,1% Triton X-100, 3) 20 mM glycin pH 10,0/0,1% Triton X-100 og 4) 50 mM trietylamin, pH 11,0/0,1% Triton X-100. Alle vaskebuffere inneholdt 1 mM PMSF og 0,2 E/ml aprotinin. Etter vasking ble det gjenværende bundne ICAM-1 eluert med 5 kolonnevolumer elueringsbuffer (50 mM trietylamin/0,1% Triton X-100/pH 12,5 ved 4°C) med en strømingshastighet på 1 ml/3 minutter. Det eluerte ICAM-1 ble oppsamlet i 1 ml fraksjoner og straks nøytralisert ved tilsetting av 0,1 ml 1 M Tris, pH 6,7. Fraksjoner som inneholdt ICAM-1, ble identifisert ved SDS-polyakrylamidelektroforese av 10 [ il porsjoner (J. Springer et al., Exp. Med., 160:1901 (1984)), fulgt av sølvfarging (J.H. Morrissey, Anal Biochem., 117:307 (1981)). Under disse betingelser ble hovedmengden av ICAM-1 eluert i ca. 1 kolonnevolum og hadde en renhet på mer enn 90%, ifølge bedømmelse med sølvfargede elektroferogrammer (en liten mengde IgG, utvasket fra affinitetsmatriksen, var hovdforurensningen). Fraksjonene som inneholdt ICAM-1, ble blandet og konsentrert ca. 20 ganger under anvendelse av mikrokonsentreringsanordninger av typen Centricon 30 (Amicon, Danvers, MA). Det rensede ICAM-1 ble kvantifisert ved Lowry-proteinanalyse av en etanolutfelt porsjon av blandingen: ca. 500 ug rent ICAM-1 ble fremstilt av de 200 g av human milt. ;Ca. 200 fig renset ICAM-1 ble underkastet en annentrinnsrensing ved preparativ SDS-polyakrylamidgel-elektroforese. Båndet som representerte ICAM-1, ble visualisert ved at gelen ble lagt i 1 M KCl. Gelområdet som inneholdt ICAM-1, ble så utskåret og elektroeluert i henhold til fremgangsmåten ifølge Hunkapiller et al., Meth. Enzymol., 91:227:236 (1983). Det rensede protein hadde en renhet større enn 98%, bedømt ved SDS-PAGE og sølvfaring. ;Affinitetsrensing av ICAM- 1 for funksjonelle undersøkelser ;ICAM-1 for anvendelse ved funksjonelle undersøkelser ble renset fra vaskemiddel-lysater av JY-celler som beskrevet ovenfor, men i mindre målestokk (en 1 ml kolonne av RRl/1-Sepharose), og med følgende mofifikasjoner. Alle oppløsninger inneholdt 50 nM natriumvanadat. Etter vasking av kolonnen med buffer med pH 11,0 som inneholdt 0,1% Triton X-100, ble kolonnen vasket igjen med fem kolonnevolumer av den samme buffer inneholdende 1% n-oktyl-beta-D-glukopyranosid (oktylglukosid) i stedet for 0,1% Triton X-100. Oktylglukosid-detergenten erstatter Triton X-100 bundet til ICAM-1, og kan i motsetning til Triton X-100 fjernes etterpå ved dialyse. ICAM-1 ble så eluert med buffer med pH 12,5 som inneholdt 1% oktylglukosid i stedet for 0,1% Triton X-100, og ble analysert og konsentrert som beskrevet ovenfor. ;EKSEMPEL 15 ;Karakteregenskaper hos renset ICAM-1 ;ICAM-1 renset fra human milt vandrer i SDS-polyakryl-amidgeler som et bredt bånd med Mr 72.000-91.000. ICAM-1 renset fra JY-celler vandrer også som et bredt bånd med Mr 76.500-97.000. Disse Mr er innenfor det rapporterte området for ICAM-1 immunutfelt fra forskjellige cellekilder: Mr=90.000 for JY-celler, 114.000 for den myelomonocytiske cellelinje U937, og 97.000 for fibroblaster (Dustin et al., J. Immunol., 137:245 ;(1986)). Dette vide området for Mr er blitt tilskrevet en utstrakt, men variabel glykosyleringsgrad. Den ikke-glyko-sylerte forløper har en Mr på 55.000 (Dustin et al.). Proteinet som er renset enten fra JY-celler eller human milt, beholder sin antigene aktivitet, bevist ved dets evne til å gjen-bindes til den opprinnelige affinitetskolonne, og ved immunutfelling med RRl/1-Sepharose og SDS-polyakrylamidelektroforese. ;For fremstilling av peptidfragmenter av ICAM-1 ble ca. 200 fig redusert med 2 mM ditiotreitol/2% SDS, fulgt av alkylering med 5 mM jodeddiksyre. Proteinet ble utfelt med etanol, og oppløst på nytt i 0,1 M NH4CO3/0,l mM CaCl2/0,l% zwittergent 3-14 (Calbiochem), og digerert med 1 vekt-% trypsin ved 37°C i 4 timer, fulgt av en ytterligere digerering med 1% trypsin i 12 timer ved 37°C. De tryptiske peptider ble renset ved revers-fase-HPLC under anvendelse av en 0,4 x 15 cm C4 kolonne (Vydac). Peptidene ble eluert med en lineær gradient på fra 0 til 60% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre. Utvalgte peptider ble underkastet sekvensanalyse på gassfase-mikros-ekvenator (Applied Biosystems). Sekvensinformasjonen som ble oppnådd ved denne undersøkelse, er vist i tabell 5. ;EKSEMPEL 16 ;Kloning av ICAM-l-genet ;Genet for ICAM-1 kan klones under anvendelse av forskjellige fremgangsmåter. F.eks. kan aminosyresekvensinformasjonen oppnådd ved sekvensering av de tryptiske fragmenter av ICAM-1 (tabell 5) anvendes for identifikasjon av en oligonukleotid-sekvens som ville svare til ICAM-l-genet. Alternativt kan ICAM-l-genet klones under anvendelse av anti-ICAM-l-antistoff for påvisning-av kloner som danner ICAM-1. ;Kloning av genet for ICAM- 1 ved anvendelse av oligonukleotidprober ;Ved anvendelse av den genetiske kode (J.D. Watson, I: Molecular Biology of the Gene, 3. utg., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), kan ett eller flere forskjellige oligonukleotider identifiseres, som hver ville kunne kode de tryptiske ICAM-1-peptider. Sannsynligheten for at et spesielt oligonukleotid faktisk vil utgjøre den virkelige ICAM-1-kodende sekvens, kan vurderes ved betraktning av unormale baseparings-forhold og den frekvens ved hvilken et spesielt kodon virkelig er anvendt (for koding av en spesiell aminosyre) i eukaryote celler. Slike "kodonanvendelsesregler" er beskrevet av R. Latne et al., J. Molec. Biol., 183:12 (1985). Ved anvendelse av "kodonanvendelsesreglene" ifølge Lathe identifiseres et enkelt oligonukleotid, eller et sett av oligonukleotider, som inneholder en teoretisk "mest sannsynlig" nukleotidskvens (dvs. nukleotidsekvensen som det er minst rikelig av) som kan kode for de tryptiske ICAM-1-peptidsekvenser. ;Oligonukleotidet, eller settet av oligonukleotider, som inneholder den teoretisk "mest sannsynlige" sekvens som kan kode for ICAM-l-fragmentene, anvendes for identifisering av sekvensen av et komplementært oligonukleotid eller sett av oligonukleotider som kan hybridiseres til den "mest sannsynlige" sekvens, eller sett av sekvenser. Et oligonukleotid som inneholder en slik komplementær sekvens, kan anvendes som probe for identifisering og isolering av ICAM-l-genet (T. Maniatis et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Habo Press, Cold Spring Harbor, NY(1982). ;Som beskrevet under del C ovenfor, er det mulig å klone ICAM-l-genet fra eukaryote DNA-preparater som man antar inneholder dette gen. For identifisering og kloning av genet som koder for ICAM-1-proteinet, undersøkes et DNA-bibliotek med hensyn til sin evne til å hybridisere med oligonukleotidprobene som er beskrevet ovenfor. P.g.a. at det er sannsynlig at det bare vil være to kopier av genet for ICAM-1 i en normal diploid celle, og p.g.a. at det er mulig at ICAM-l-genet kan ha store ikke-transkriberte inngripende sekvenser (introner) hvis kloning ikke er ønskelig, er det foretrukket å isolere ICAM-1-kodende sekvenser fra et cDNA-bibliotek fremstilt utfra mRNA hos en ICAM-1-dannende celle, snarere enn fra genom-DNA. Egnede DNA- eller cDNA-preparater spaltes enzymatisk, eller kuttes tilfeldig og ligeres i rekombinante vektorer. Evnen hos disse rekombinante vektorer til å hybridiseres til de ovenfor beskrevne oligonukleotidprober måles deretter. Fremgangsmåter for hybridisering er f.eks. beskrevet i T. Maniatis Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) eller i B.T. Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization a Practical Approach, IRL Press, Oxford, England (1985). Vektorer som er funnet å være i stand til slik hybridisering, analyseres så for bestemmelse av omfanget og beskaffenheten av ICAM-1-sekvensene som de inneholder. Basert på rene statistiske betraktninger, kunne et gen så som det som koder for ICAM-1-molekylet, identifiseres utvetydig (via hybridiseringsundersøkelse) under anvendelse av en oligonukleo-tidprobe med bare 18 nukleotider. ;Kortfattet gjør således den virkelige identifikasjon av ICAM-l-peptidsekvenser mulig identifikasjon av en teoretisk "mest sannsynlig" DNA-sekvens, eller et sett av slike sekvenser, som kan kode for et slikt peptid. Ved konstruksjon av et oligonukleotid som er komplementært til denne teoretiske sekvens (eller ved konstruksjon av et sett oligonukleotider som er komplementært til settet av "mest sannsynlige" oligonukleotider) får man et DNA-molekyl (eller et sett av DNA-molekyler) som kan funksjonere som probe for identifikasjon og isolering av ICAM-l-genet. ;Ved anvendelse av ICAM-l-peptidsekvensene i tabell 5, ble sekvensen av den "mest sannsynlige" sekvens av et oligonukleotid som kunne kode for AA- og J-peptidene bestemt (henholdsvis tabell 6 og 7). Oligonukleotider som var komplementære til disse sekvenser, ble syntetisert og renset for anvendelse som prober for isolering av ICAM-l-gensekvenser. Egnede størrelses-selekterte cDNA-biblioteker ble dannet fra poly(A)<+->RNA for både PMA-induserte HL-60-celler og fra PS-stimulerte navleveneendotelceller. Et størrelses-selektert cDNA-bibliotek ble fremstilt under anvendelse av poly(A)<+->RNA fra PMA-induserte HL-60-celler i henhold til fremgangsmåten ifølge U. Gubler et al., (Gene, 25:263-269 (1983)) og A. Corbi et al., (EMBO J., 6:4023-4028 (1987)), hvilke referanser er medtatt i det foreliggende som referanse. ;Et størrelses-selektert cDNA-bibliotek ble fremstilt under anvendelse av poly(A)<+->RNA fra navleveneendotelceller som var blitt stimulert i 4 timer med PS 5 Mg/ml■ RNA ble ekstrahert ved at cellene ble homogenisert i 4 M guanidin-isotiocyanat og supernatanten ble underkastet ultrasentrifugering gjennom en CsCl-gradient (J.M. Chirgwin et al., Biochem., 18:5294-5299 ;(1979)). Poly(A)<+->RNA ble isolert fra blandingen av den totale mengde av RNA-typer ved anvendelse av oligo-(dT)-cellulose-kromatografi (type 3, Collaborative Research) (H. Aviv et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 69:1408-1412 (1972)). ;Første kjede-cDNA ble syntetisert under anvendelse av 8 /ig poly(A)<+->RNA, reversert fuglemyeloblastosevirus-transkriptase (Life Sciences) og en oligo(dT)-primer. DNA-RNA-hybridet ble digerert med RNase H (BRL), og den annen kjede ble syntetisert under anvendelse av DNA-polymerase I (New England Biolabs). Produktet ble metylert med Eco Rl-metylase (New England Biolabs), stumpendeligert til Eco Ri-sammenbindere (New England Biolabs), digerert med Eco Ri og størrelsesselektert på en agarosegel med lavt smeltepunkt. cDNA som var større enn 500 bp, ble ligert til XgtlO som tidligere var blitt Eco Rl-digerert og defosforylert (Stratagen). produktet av ligeringen ble så pakket (Stratågene gull). ;Navleveneendotelcelle- og HL-60-cDNA-biblioteker ble så utplatet med 20.000 PFU/150 mm plate. Rekombinant DNA ble overført i to paralleller til nitrocellulosefiltere, denaturert i 0,5 M NaOH/1,5 M NaCl, nøytralisert i 1 M Tris, pH 7,5/1,5 M NaCl og brent ved 80°C i 2 timer (W.D. Benton et al., Science, 196:180-182 (1977)). Filterne ble forhybridisert og hybridisert i 5X SSC som inneholdt 5X Denhardfs oppløsning, 50 mM NaP04 og 1 Mg/ml laksespermie-DNA. Forhybridisering ble utført ved 45°C i 1 time. ;Hybridisering ble utført under anvendelse av 32 bp (5'-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) eller 47 bp (5'-GAGGTGTTCTC-AAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC) antisanseoligonukleotider basert, på den måte som er omtalt ovenfor, på henholdsvis de tryptiske ICAM-1-peptider J og AA (tabell 6 og 7) (R. Lathe, J. Molec. Biol., 183:1-12 (1985)). Oligonukleotidene ble ende-merket med r-(<32>P(ATP) under anvendelse av T4-polynukleotid-kinase og betingelser anbefalt av fabrikanten (New England Biolabs). Etter hybridisering over natten, ble filterne vasket to ganger med 2X SSC/0,1% SDS i 30 minutter ved 45^. Fag ble isolert fra de plakk som viste hybridisering, og ble renset ved suksessiv gjenutplating og undersøkelse på nytt. ;Kloning av genet for ICAM- 1 ved anvendelse av anti- ICAM- l- anti-stof f ;Genet for ICAM-1 kan alternativt klones ved anvendelse av anti-ICAM-l-antistoff. DNA, eller mer foretrukket cDNA, ekstraheres og renses fra en celle som kan uttrykke ICAM-1. Den rensede cDNA fragmentiseres (ved kutting, endonuklease-digerering, osv.) under dannelse av en blanding av DNA- eller cDNA-fragmenter. DNA- eller cDNA-fragmenter fra denne blanding blir så klonet i en ekspresjonsvektor for dannelse av et genombibliotek av ekspresjonsvektorer hvis elementer hvert inneholder et unikt klonet DNA- eller cDNA-fragment. ;EKSEMPEL 17 ;Analyse av cDNA-klonene ;Fag-DNA fra positive kloner ble spaltet med Eco Ri og undersøkt ved Southern-analyse ved anvendelse av en cDNA fra én klon som probe. cDNA-innskudd med maksimal størrelse som krysshybridiserte, ble subklonet i Eco Ri-setet i plasmidvektor pGEM 4Z (Promega). HL-60-subkloner som inneholdt cDNA i begge orienteringene, ble eliminert ved eksonuklease III-digerering (S. Henikoff, Gene, 28:351-359 (1984)) i henhold til fabrikantens anbefalinger (Erase-a-Base, Promega). Progressivt eliminerte cDNA-molekyler ble så klonet og underkastet dideoksynukleotidkjedeterminierigssekvensering (F. Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei (USA), 74:5463-5467 (1977)) i henhold til fabrikantens anbefalinger (Sequenase, U.S. Biochemical). HL-60-CDNA-51 - og kodingsområdene ble sekvensert fullstendig på begge kjeder, og 3<1->området ble sekvensert ca. 70% på begge kjeder. En representativ endotel-cDNA ble sekvensert over størstedelen av sin lengde ved hurtigkloning av 4 bp-oppfattelses-restriksjonsenzymfragmenter. ;cDNA-sekvensen fra én HL-60- og én endotelcelle-cDNA ble opprettet (figur 8). 3023 bp-sekvensen inneholder et kort 5'-ikke-translatert område og et 1,3 kb 3<1->ikke-translatert område med et konsensus-polyadenyleringssignal i stilling 2966. Den lengste åpne leseramme begynner med den første ATG i stilling 58 og slutter med en TGA-terminerigstriplett i stilling 1653. Identitiet mellom den translaterte aminosyresekvens og sekvenser bestemt fra 8 forskjellige tryptiske peptider med totalt 91 aminosyrer (understreket på figur 8) bekreftet at autentiske ICAM-l-cDNA-kloner var blitt isolert. Aminosyresekvensene i tryptiske ICAM-1-peptider er vist i tabell 8. ;;Hydrofobisitetsanalyse (J. Kyte et al., J. Molec. Biol., 157:105-132 {1982)) antyder tilstedeværelse av en 27-resters signalsekvens. Fastsettelsen av +l-glutaminet er i overensstemmelse med vår manglende evne til å oppnå N-terminalsekvens for tre forskjellige ICAM-l-proteinpreparater; glutamin kan syklisere til pyroglutaminsyre, hvilket resulterer i en blokkert N-terminalende. Den translaterte sekvens fra 1 til 453 er hovedsakelig hydrofil, fulgt av et 24-resters hydrofobt antatt transmembranfelt. Transmembranfeltet følges umiddelbart av flere ladede rester som finnes i et 2 7-resters antatt cytoplasmisk felt. ;Den forutsette størrelse for den fullt utviklede polyeptidkjede er 55.219 dalton, i utmerket overensstemmelse ;med den observerte størrelse på 55.000 for deglykosylert ICAM-1 (M.L. Dustin et al., J. Immunol., 137:245-254 (1986)). Åtte N-bundne glykosyleringsseter er forutsett. Fravær av asparagin i de tryptiske peptidsekvenser i to av disse seter bekrefter ;deres glykosylering og deres ekstracellulære orientering. Ved antagelse av 2500 dalton pr. N-bundet karbohydrat med høyt ;innholdt av mannose, forutses en størrelse på 75.000 dalton for ICAM-1-forløperen, sammenlignet med de observerte seks på 73.000 dalton (M.L. Dustin et al., J. Immunol., 137:245-254 ;(1986)). Etter omdannelse av høy-mannose til komplekst karbohydrat, er det fullt utviklede ICAM-l-glykoprotein 76-114 kd, avhengig av celletype (M.L. Dustin et al., J. Immunol., 137:245-254 (1986)). Således er ICAM-1 et sterkt glykosylert, men ellers typisk, integralt membranprotein. ;EKSEMPEL 18 ;ICAM-1 er et integrin-bindende medlem av immunglobulin-supergen familien ;Innretting av interne ICAM-1-repeteringer ble utført under anvendelse av Microgenie-proteininnrettingsprogrammet (C. Queen et al., Nucl. Acid Res., 12:581-599 (1984)) fulgt av inspeksjon. Innretting av ICAM-1 med IgM, N-CAM og MAG ble utført under anvendelse av Microgenie- og ALIGN-programmet (M.O. Dayhoff et al., Meth. Enzymol., 91:525-545 (1983)). Fire proteinsekvensdatabaser, oppbevart av National Biomedical Research Foundation, ble undersøkt med hensyn til protein-sekvenslikheter under anvendelse av FASTP-programmet ifølge Williams og Pearson (D.J. Lipman et al., Science, 227:1435-1439 ;(1985)) . ;Siden ICAM-1 er en ligand i et integrin, var det uventet at det ville være et medlem av immunglobulinsupergenfamilien. Imidlertid viser inspeksjon av ICAM-1-sekvensen at den oppfyller alle kriterier foreslått for medlemskap i immunglobulinsupergenfamilien. Disse kriterier er omtalt nedenfor. ;Hele det ekstracellulære felt i ICAM-1 er konstruert av 5 homologe immunglobulinlignende områder som er vist på linje på figur 9A. Feltene 1-4 er henholdsvis 88, 97, 99 og 99 rester lange og har således typisk Ig-felt-størrelse; felt 5 er avkortet innenfor 68 rester. Undersøkelser av NBRF-databasen under anvendelse av FASTP-programmet viste betydningsfulle homologier med medlemmer av immunglobulinsupergenfamilien innbefattende IgM- og IgG C-felter, variabelt T-cellereseptor-of-underenhetfelt og alfa-l-beta-glykoprotein (figur 9B-D) . ;Ved anvendelse av ovenstående informasjoner ble aminosyresekvensen for ICAM-1 sammenlignet med aminosyresekvensene for andre medlemmer i immunglobulinsupergenfamilien. ;Tre typer Ig-superfamiliefelter, V, Cl og C2 er blitt differensiert. Både V- og C-felter er konstruert av 2 S-lag bundet sammen ved intrafelt-disulfidbindingen; V-felter inneholder 9 antiparallelle fi-kjeder, mens C-felter har 7. Konstante felter ble delt i Cl- og C2-sett basert på karakteristiske rester vist på figur 9A. Cl-settet innbefatter proteiner som inngår ved antigenoppfattelse. C2-settet innbefatter flere Fc-reseptorer og proteiner som inngår ved celleadhesjon innbefattende CD2, LFA-3, MAG og NCAM. ICAM-1-felter ble funnet å være sterkest homogene med felter i C2-settet ved anbringelse av ICAM-1 i dette sett; dette reflekteres ved sterkere likhet med konserverte rester i C2-enn Cl-felter som vist for fi-kjedene B-F på figur 9. Dessuten samsvarte ICAM-1-felter mye bedre med S-kjedene A og G i C2-felter enn med disse kjeder i V- og Cl-felter, hvilket gjorde mulig gode innordninger over hele C2-området. Innordninger med C2-felter fra NCAM, MAG og alfa-l-S-glykoprotein er vist på figurene 9B og 9C,- identiteten var i området fra 28 til 33%. Innordninger med en T-cellereseptor Va 27%-identitet og IgM C-felt 3-34%-identitet er også vist (figurene 9B, 9D). ;Én av de viktigste karakteregenskaper hos immunglobulin-felter er de disulfidbundne cysteiner som binder sammen B- og F-fi-kjedene som stabiliserer 6-lagdannelsen; i ICAM-1 er cysteinene konservert i alle tilfeller bortsett fra i kjede f i felt 4, hvor en leucin-aminosyre finnes som kan vende inn mot lagdannelsen og stabilisere kontakten som foreslått for noen andre V- og C2-sett-felter. Avstanden mellom cystein-aminosyrene (43, 50, 52 og 37 rester) er som beskrevet for C2-settet. ;For å undersøke tilstedeværelsen av intrakjede-disulfidbindinger i ICAM-1, ble endotelcelle-ICAM-1 underkastet SDS- ;PAGE under reduserende og ikke-reduserende betingelser. Endotelcelle-ICAM-1 ble anvendt fordi det viser mindre glyko-syleringsheterogenisitet enn JY eller håret-cellemilt-ICAM-1 og gjør mulig større følsomhet overfor skift i Mr. ICAM-1 ble derfor renset fra kulturer av navlevene-endoelceller stimulert i 16 timer med LPS (5 /ig/ml) , ved immunaf f initetskromatograf i som beskrevet ovenfor. Acetonutfelt ICAM-1 ble suspendert på nytt i prøvebuffer (U.K. Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970)) med 0,25% 2-merkaptoetanol eller 25 mM jodacetamid og bragt til 100°C i 5 minutter. Prøvene ble underkastet SDS-PAGE 4670 og sølvfarging 4613. Endotelcelle-ICAM-1 hadde en tilsynelatende Mr på 100 kd under reduserende betingelser og 96 kd under ikke-reduserende betingelser, hvilket i stor grad antyder tilstedeværelse av intrakjededisulfider i naturlig ICAM-1. ;Anvendelse av primærsekvensen for forutsigelse av sekundærstruktur (P.Y. Chou et al., Biochem., 13:211-245 ;(1974)) viste de 7 ventede fi-kjeder i hvert ICAM-l-felt, merket a-g på figur 9A øverst, hvilket nøyaktig oppfylte forutsigelsen om et immunglobulinfelt, og svarte til stillingene for kjedene A-H i immunglobuliner (figur 9A, nedre). Felt 5 mangler A- og C-kjedene, men siden disse danner kanter på lagene, kunne lagene fremdeles dannes, muligens slik at kjede D kom i stedet for kjede C, som foreslått for noen andre C2-felter; og den karakteristiske disulfidbinding mellom B- og F-kjedene ville være upåvirket. Således oppfylles alle kriteriene for felt-størrelse, sekvenshomologi, konserverte cysteinaminosyrer som danner den antatte intrafelt-disulfidbinding, tilstedeværelse av disulfidbindinger og forutsette 6-lagstruktur, for inkorpo-rering av ICAM-1 i immunglobulinsuperenfamilien. ;ICAMl ble funnet å være sterkest homologt med NCAM- og MAG-glykoproteiner i C2-settet. Dette er av spesiell interesse siden både NCAM og MAG formidler celle-celle-adhesjon. NCAM er viktig ved nevron-nevron og nevromuskulære vekselvirkninger (B.A. Cunningham et al., Science, 236:799-806 (1987)), mens MAG er viktig ved nevronoligodendrocytt- og oligodendrocytt-oligodendrocyttvekselvirkninger under myelinering (M. Poltorak et al., J. Cell Biol., 105:1893-1899 (1987)). Celleoverflateekspresjonen av NCAM og MAG er utviklingsmessig regulert under henholdsvis nervesystemdannelse og myelinering, i analogi med den regulerte induksjon av ICAM-1 ved inflammasjon (T.A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol., 5:223-252 (1987)). ICAM-1, NACM (B.A. Cunningham et al., Science, 236:799-806(1987)) og MAG (J.L. Salzer et al., J. Cell. Biol., 104:957-965 (1987)) er like i den totale struktur så vel som homologe, siden hver er et integralt membran-glykoprotein konstruert av 5 C2-felter som danner det N-terminale ekstracellulære området, skjønt en ytterligere ikke-lg-lignende sekvens er tilstede i NCAM mellom det siste C2-felt og transmembran-feltet. ICAM-1 samsvarer over sin hele lengde innbefattende transmembran- og cytoplasma-feltene, med MAG med 21% identitet,- den samme prosentvise identitet finnes ved sammenligning av de 5 felter av ICAM-1 og NCAM-1. En skjematisk sammenligning av sekundærstrukturene hos ICAM-1 og MAG er vist på figur 10. Sammenligninger felt for felt viser at nivået for homologi mellom felter i ICAM-1- og NCAM-molekyler (henholdsvis x + s.d. 21 + 2,8% og 18,6 + 3,8%) er det samme som nivået for homologi ved sammenlignig av ICAM-1-felter og NCAM- og MAG-felter (henholdsvis 20,4 + 3,7 og 21,9 + 2,7). Skjønt det er beviser for alternativ spleising i de C-terminale områder av NCAM (B.A. Cunningham et al., Science, 236:799-806 (1987); D. Barthels et al., EMBO J., 6:907-914 ;(1987)) og MAG (C. Lai et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 84:4377-4341 (1987)), er det ikke blitt funnet noe bevis for dette ved sekvenseringen av endotel- eller HL-60-ICAM-1-kloner eller ved undersøkelser av ICAM-1-proteinskjelettet og -forløper i mange forskjellige celletyper (M.L. Dustin et al., J. Immunol., 137:245-254 (1986)). ;ICAM-1 virker som ligand for LFA-1 i lymfocyttvekselvirk-ninger med en rekke forskjellige celletyper. Lymfocytter ;bindes til ICAM-1 inkorporert i kunstige membrandobbeltlag, og dette fordrer LFA-1 på lymfocytten, hvilket viser direkte LFA-1-vekselvirkning med ICAM-1 (S.D. Marlin et al., Cell, 51:813-819 (1987)). LFA-1 er et leukocyttintegrin og har ingen immun- ;globulinlignende trekk. Leukocyttintegriner omfatter én integrinunderfamilie. De andre to underfamilier formidler cellematriks-vekselvirkninger og oppfatter sekvensen RGD i sine ligander som innbefatter fibronektin, vitronektin, kollagen og fibrinogen (R.O. Hynes, Cell, 48:549-554 (1987); E. Ruoslathi et al., Science, 238:491-497 (1987)). Leukocyttintegrinene uttrykkes bare på leukocytter, inngår ved celle-celle-vekselvirkninger, og de eneste kjente ligander er ICAM-1 og iC3b, et fragment av komplement-komponenten C3 som ikke viser noen immunglobulin-lignende trekk og oppfattes av Mac-1 (T.K. Kishimoto et al., I; Leukocyte Typing III, M. McMichael (red.), Springer-Verlag, New York (1987); T.A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol., 5:223-252 (1987); D.C. Anderson et al., Ann. Rev. Med., 38:175-194 (1987)). Basert på sekvensanalyse, er eventuelle peptider i ICAM-1-sekvensen som oppfattes av LFA-1, vist i tabell 9. ;ICAM-1 er det første eksempel på et medlem av immunglobulinsupergenfamilien som bindes til et integrin. Skjønt begge disse familier spiller en viktig rolle ved celleadhesjon, var vekselvirkning mellom dem ikke ventet tidligere. I motsetning til dette, er vekselvirkninger innenfor immunglobulingen-super-familien helt vanlig. Det er meget mulig at ytterligere eksempler på vekselvirkninger mellom integrin- og immunglobulin-familiene vil bli funnet. LFA-1 oppfatter en ligand forskjellig fra ICAM-1 (T.A. Springer et al., Ann. Rev. Immunol., 5:223-252 {1987)), og leukocyttintegrinet Mac-1 oppfatter en ligand forskjellig fra C3bi ved nøytrofil-nøytrofil-adhesjon {D.C. Anderson et al., Ann. Rev. Med., 38:175-194 (1987)). Videre bindes rensede MAG-holdige vesikler til nevritter som er MAG, og således må MAG kunne vekselvirke heterofilt med en spesiell reseptor (M. Poltorak et al., J. Cell Biol., 105:1893-1899 (1987)). ;NCAM's rolle ved nøytral-nøytral- og nøytral-muskelcelle-vekselvirkninger er blitt antydet å skyldes homofile NCAM-NCAM-vekselvirkninger (B.A. Cunningham et al., Science, 236:799-806 ;(1987)). Den viktige rolle hos MAG ved vekselvirkninger mellom nabo-dreiningssløyfer hos Schwann-celler som omslutter aksoner under myelinskjededannelse, kan skyldes vekselvirkning med en spesiell reseptor, eller homofile MAG-MAG-vekselvirkning. Homologien med NCAM og den hyppige forekomst av felt-felt-vekselvirkninger innenfor immunglobulinsupergenfamilien frem-setter den mulighet at ICAM-1 kunne ta del i homofile vekselvirkninger så vel som heterofile ICAM-1-LFA-1-vekselvirkninger. Imidlertid kan binding av B-lymfoblastceller som ko-uttrykker lignende densiteter av LFA-1 og ICAM-1 overfor ICAM-1 i kunstige eller cellulære monolag, fullstendig inhiberes ved forbehandling av B-lymfoblasten med LFA-l-MAb, mens adhesjonen er upåvirket av B-lymfoblast-forbehandling med lCAM-1-MAb. Forbehandling av monolaget med ICAM-l-MAb opphever binding fullstendig M.L. Dustin et al., J. Immunol., 137:245-254 ;(1986); S.D. Marlin et al., Cell, 51:813-819 (1987)). Disse funn viser at hvis homofile ICAM-l-vekselvirkninger i det hele tatt finner sted, må de være svakere enn heterofil vekselvirkning med LFA-1. ;Muligheten for at leukocyttintegrinene oppfater ligander på en fundamentalt forskjellig måte er i overensstemmelse med tilstedeværelsen av en 180-resters sekvens i deres a-under-enheter som kan være viktig ved ligandbinding og som ikke er tilstede i de RGD-oppfattende integriner (A. Corbi et al., (EMBO J., 6:4023-4028 (1987)). Skjønt Mac-1 er blitt antydet å oppfatte RGD-sekvens som er tilstede i iC3b 5086, er det ingen RGD-sekvens i ICAM-1 (figur 8). Dette er i overensstemmelse med det faktum at fibronektinpeptidet GRGDSP og kontroll-peptidet GRGESP ikke inhiberer ICAM-l-LFA-l-adhesjon (S.D. Marlin et al., Cell, 51:813-819 (1987)). Imidlertid er beslektede sekvenser så som PRGGS og RGEKE tilstede i ICAM-1 i områder som er forutsett å danne sløyfe mellom henholdsvis 6-kjeder a og b i felt 2, og c og d i felt 2 (figur 9), og kan således være tilgjengelige for oppfattelse. Det er av interesse at det homologe MAG-molekyl inneholder en RGD-sekvens mellom felt 1 og 2 (M. Poltorak et al., J. Cell Biol., 105:1893-1899 (1987); J.L. Salzer et al., J. Cell. Biol., 104:957-965 (1987)). ;EKSEMPEL 19 ;"Southern" og "Northern Blots" ;"Southern blots" ble utført under anvendelse av 5 fig genom-DNA ekstrahert fra tre cellelinjer: BL2, en Burkitt-lymfom-cellelinje (en gave fra Dr. Gilbert Lenoir); JY og Er-LCL, EBV-transformerte B-lymfoblastoidcellelinjer. ;DNA-molekylene ble digerert med 5 ganger fabrikantens anbefalte mengde av BAM Hl- og Eco Rl-endonukleaser (New England Biolabs). Etter elektroforese gjennom en 0,8% agarosegel, ble DNA-molekylene overført til en nylonmembran (Zeta Probe, BioRad). Filteret ble forhybridisert og hybridisert etter standardfremgangsmåter under anvendelse av ICAM-l-cDNA fra HL-60 merket med a- (32P)d-XTP-molekyler ved tilfeldig merking (Boehringer Mannheim). "Northern blots" ble utført under anvendelse av 20 fig total-RNA eller 6 ug poly(A)<+->RNA. RNA ble denaturert og kjørt i elektroforese gjennom en 1% agarose-formaldehydgel og elektro-overført til Zeta-Probe. Filtrene ble forhybridisert og hybridisert som beskrevet tidligere (D.E. Staunton et al., Embo J., 6:3695-3701 (1987)) under anvendelse av HL-60-cDNA-proben av <32->P-merkede oligonukleotidprober (beskrevet ovenfor). ;"Southern blots" med anvendelse av 3 kb cDNA-proben og genom-DNA digerert med BAM Hl og Eco Ri, viste enkelt-dominerende hybridiseringsfragmenter på henholdsvis 20 og 8 kb, hvilket antydet et enkelt gen og antydet at størstedelen av kodingsinformasjonen er tilstede innenfor 8 kb. I "blots" av tre forskjellige cellelinjer er det ikke noe tegn til restriksjonsfragment-polymorfisme. ;EKSEMPEL 20 ;Ekspresjon av ICAM-l-genet ;En "ekspresjonsvektor" er en vektor som (på grunn av tilstedeværelse av hensiktsmessige transkripsjonene og/eller translasjonene kontroll sekvenser) kan uttrykke et DNA- (eller cDNA) molekyl som er blitt klonet i vektoren, og derved danne et polypeptid eller protein. Ekspresjon av de klonede sekvenser skjer når ekspresjonsvektoren innføres i en passende vertscelle. Hvis det anvendes en prokaryot ekspresjonsvektor, vil den passende vertscelle være hvilken som helst prokaryot celle som kan uttrykke de klonede sekvenser. Hvis det på lignende måte anvendes en eukaryot ekspresjonsvektor, vil den passende vertscelle være hvilken som helst eukaryot celle som kan uttrykke de klonede sekvenser. Det er betydningsfullt at siden eukaryot DNA kan inneholde inngripende sekvenser, og siden slike sekvenser ikke korrekt kan bearbeides i prokaryote celler, er det foretrukket å anvende cDNA fra en celle som kan uttrykke ICAM-1 for frembringelse av et prokriot genom-ekspre-sjonsvektorbibliotek. Fremgangsmåter for fremstilling av cDNA og for frembringelse av et genom-bibliotek er beskrevet av T. Maniatis et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)). ;Det ovenfor beskrevne ekspresjonsvektor-genombiblioteket anvendes for dannelse av en bank av vertsceller (som hver inneholder et element i biblioteket). Ekspresjonsvektoren kan innføres i vertscellen på hvilken som helst av mange forskjellige måter (dvs. tranformasjon, transfeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, osv.). Banken med ekspresjonsvektorholdige celler spres klonalt, og dens elementer analyseres individuelt (under anvendelse av en immun-analyse) for bestemmelse av om hvorvidt de danner et protein som kan bindes til anti-ICAM-l-antistoff. ;Ekspresjonsvektorene for de celler som danner et protein som kan bindes til anti-ICAM-l-antistoff, analyseres så videre for bestemmelse av om hvorvidt de uttrykker (og således inneholder) hele ICAM-l-genet, hvorvidt de uttrykker (og inneholder) bare et fragment av ICAM-l-genet, eller hvorvidt de uttrykker (og inneholder) et gen hvis produkt, skjønt det er immunologisk beslektet med ICAM-1, ikke er ICAM-1. Skjønt en slik analyse kan utføres på hvilken som helst hensiktsmessig måte, er det foretrukket å bestemme nukleotidsekvensen for DNA-eller cDNA-fragmentet som var blitt klonet i ekspresjonsvektoren. Slike nukleotidsekvenser undersøkes så for bestemmelse av om hvorvidt de kan kode for polypeptider med samme aminosyresekvens som de tryptiske digereringsfragmenter av ICAM-1 (tabell 5). ;En ekspresjonsvektor som inneholder et DNA- eller cDNA-molekyl som koder for ICAM-l-genet, kan således oppfattes ved: (i) evnen til å styre ekspresjonen av et protein som kan bindes til anti-ICAM-l-antistoff; og (ii) tilstedeværelse av en nukleotidsekvens som kan kode for hvert av de tryptiske fragmenter av ICAM-1. Det klonede DNA-molekyl i en slik ekspresjonsvektor kan fjernes fra ekspresjonsvektoren og isoleres i ren form. ;EKSEMPEL 21 ;Funksjonelle aktiviteter av renset ICAM-1 ;I celler funksjonerer ICAM-1 normalt som et overflate-protein forbundet med cellemembranen. Funksjonen av renset ICAM-1 ble derfor undersøkt etter at molekylet var gjenopprettet i kunstige lipidmembraner (liposomer eller vesikler) ved oppløsing av proteinet i vaskemiddel-solubiliserte lipider, fulgt av fjerning av detergenten ved dialyse. ICAM-1, renset fra JY-celler og eluert i vaskemiddel-oktylglukosidet som beskrevet ovenfor, ble gjenopprettet i vesikler, og de ICAM-1-holdige vesikler ble sammensmeltet med dekkglass eller plast-dyrkningsbrønner for å gjøre mulig påvisning av celler som ble bundet til proteinet. ;Fremstilling av plane membraner og plastbundne vesikler ;Vesikler ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Gay et al., (J. Immunol., 136:2026 (1986)). Kort angitt ble egg-fosfatidylkolin og -kolesterol oppløst i kloroform og blandet i et molart forhold på 7:2. Lipidblandingen ble tørket til en tynn film mens man roterte under en strøm av nitrogengass, og ble så lyofilisert i 1 time under fjerning av alle spor av kloroform. Lipidfilmen ble så oppløst i 1% oktylglukosid/- 0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) til en sluttkonsentrasjon av fosfatidylkolin på 0,1 mM. Ca. 10 /ig renset ICAM-1, eller humant glykoforin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) som kontroll-membranglykoprotein, ble tilsatt til hver ml oppløste lipider. Protein-lipid-detergentoppløsningen ble så dialysert ved 4°C mot 3 skift på 200 volumdeler av 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH 7,2, og et skift av HBSS. ;Plane membraner ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Brian et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 81:6159 (1984). Dekkglass (med diameter 11 mm) ble kokt i 15 minutter i en 1:6-fortynning av 7X detergent (Linbro), vasket over natten i destillert vann, nedsenket i 70% etanol og lufttørket. En 80 ( xl dråpe av vesikkelsuspensjon som innehold enten ICAM-1 eller glukoforin, ble anbragt i bunnen av brønner i en 24-brønns "duster"-plate, og de preparerte dekkglass ble forsiktig lagt til å flyte på toppen. Etter 20-30 minutters inkubering ved romtemperatur, ble brønnene fylt med HBSS, og dekkglassene ble snudd for at den plane membran skulle vende opp. Brønnene ble så vasket grundig med HBSS under fjerning av ubundne vesikler. Den plane membranoverflate ble aldri utsatt for luft. ;I løpet av forsøkene med plan membran sammensmeltet med glassoverflater, ble vesikler som inneholdt ICAM-1, funnet å bindes direkte til plastoverflaten av mulitbrønns-vevskulturplater, og bevare funksjonell aktivitet bevist ved spesifikk cellebinding. Slike vesikler er i det følgende omtalt som "plastbundne vesikler" (PBV), siden beskaffenheten av lipid-vesiklene bundet til plasten ikke er blitt bestemt. ;Plastbundne vesikler ble fremstilt ved tilsetting av 30 /il vesikkelsuspensjon direkte i bunnen av brønner i 96-brønns vevskulturplater (Falcon), fulgt av inkubering og vasking som beskrevet for plane membraner. ;Celleadhesjonsanalyser ;Celleadhesjonsanalyser under anvendelse av plane membraner eller plastbundne vesikler ble begge utført på hovedsakelig samme måte, bortsett fra at celleantallene og volumdelene for PBV-analyser ble redusert til 1/5 av det som ble anvendt ved plan-membrananalyser. ;T-lymfocytter fra normale kontroller og en pasient med leukocyttadhesjonsmangel (LAD) hvis celler ikke uttrykker LFA-1 (D.C. Anderson et al., J. Infect. Dis., 152:668 (1985)) ble fremstilt ved dyrkning av mononukleære celler fra perifert blod med 1 fig/ ral Concanavalin-A (Con-A) i RPMI-1640 pluss 20% FCS med 5 x IO<5> celler/ml i 3 dager. Cellene ble så vasket to ganger med RPMI og en gang med 5 mM metyl-alfa-D-mannopyranosid for fjerning av rest-lecitin fra celleoverflaten. Cellene ble dyrket i RPMI/2 0% FCS som innehold 1 ng/ml rekombinant IL-2, og ble anvendt mellom 10 og 22 dager etter starting av dyrkningen. ;For påvisning av cellebinding til plane membraner eller PBV, ble Con-A blåster, T-lymfomet SKW-3 og de EBV-transformerte B-lymfoblastoid-cellelinjer JY (LFA-l-positive) - og LFA-1-manglende lymfoblastoid-cellelinje (BBN) (fra pasient 1, T.A. Springer et al., J. Exper Med., 160:1901-1918 (1986)) merket ved inkubering av 1 x 10<7> celler i 1 ml RPMI-1640/10% FCS med 100 /iCi Na<51>Cr04 i 1 time ved 37°C, fulgt av fire vaskinger med RPMI-1640 for fjerning av ikke-inkorporert merking. I monoklonalt-antistoff-blokkerende forsøk ble celler eller plastbundne vesikler forbehandlet med 20 /ig/ml renset antistoff i RPMI-1640/10% FCS ved 4°C i 30 minutter, fulgt av fire vaskinger for fjerning av ubundet antistoff. I forsøk med hensyn til effektene av divalente kationer på cellebinding, ble cellene vasket en gang med Ca<2+->, Mg<2+->fri HBSS pluss 10% dialysert FCS, og CaCl og MgCl ble tilsatt til de angitte konsentrasjoner. I alle forsøk ble celler og plane membraner eller PBV forekvilibrert ved den hensiktsmessige temperatur (4°C, 22°C eller 37°C) i den hensiktsmessige analysebuffer. ;For måling av cellebindig til renset ICAM-1, ble <51>Cr-merkede celler (5 x IO<5> EBV-transformanter i plan-membran-analyser; 1 x 10s EBV-trans formant er eller SKW-3-celler, 2 x IO<5> Con-A-blaser i PBV-analyse) sentrifugert i 2 minutter ved 25 x g på plane membraner eller PBV, fulgt av inkubering ved 4°C, 22°C eller 37°C i 1 time. Etter inkuberingen ble ubundne celler fjernet ved åtte sykluser med fylling og aspirering med buffer forekvilibrert til den hensiktsmessige temperatur. Bundne celler ble kvantifisert ved solubilisering av brønninnholdet med 0,1 N NaOH/1% Triton X-100 og telling i en gammateller. Prosentvis cellebinding ble bestemt ved dividering av cpm fra bundne celler med innført celletilknyttet cpm. I planmembran-analyser, ble innført cpm korrigert med hensyn til forholdet mellom overflatearealet for dekkglass, sammenlignet med overflatearealet for dyrkningsbrønnene. ;Ved disse analyser ble EBV-transformerte B-lymfoblastoidceller, SKW-3-T-lymfomceller og Con-A-T-lymfoblaster bundet spesifikt til ICAM-1 i kunstige membraner (figur 11 og 12). Bindingen var spesifikk siden cellene ble meget svakt bundet til plane kontrollmembraner eller vesikler som inneholdt ekvivalente mengder av et annet humant celleoverflateglykoprotein, glykoforin. Videre ble LFA-1-positive EBV-transformanter og Con-A-blaster bundet, mens deres LFA-1-negative motstykker ikke ble bundet i noen betydelig utstrekning, hvilket viste at bindingen av avhengig av tilstedeværelsen av LFA-1 på cellene. ;Både spesifisiteten av cellebindingen og avhengigheten av cellulært LFA-1 ble bekreftet ved monoklonalt-antistoff-blokkeringsforsøk (figur 13). Bindingen av JY-celler kunne inhiberes med 97% når de ICAM-l-holdige PBV ble forbehandlet med et monoklonalt-anti-ICAM-l-antistoff RRl/1. Forbehandling av cellene med det samme antistoff hadde liten effekt. Motsatt inhiberte det monoklonale anti-LFA-l-antistoff TS1/18 binding med 96%, men bare når cellene, men ikke PBV, var forbehandlet. Et kontrollantistoff TS2/9 som reagerte med LFA-3 (et annet lymfocyttoverflateantigen) hadde ingen betydelig inhiberende effekt når både celler eller PBV var forbehandlet. Dette forsøk viser at ICAM-1 i seg selv i de kunstige membraner, og ikke en mindre forurensning, gir den observerte celleadhesjon, og at adhesjonen er avhengig av LFA-1 på den bindende celle. ;Bindingen av celler til ICAM-1 i kunstige membraner viste også to andre karakteregenskaper ved det LFA-1-avhengige adhesjonssystem: temperaturavhengighet og et krav om divalente kationer. Som vist på figur 14, ble Con-A-blaster bundet til ICAM-1 i PBV mest effektivt ved 3 7°C, delvis ved 22°C og meget dårlig ved 4°C. Som vist på figur 15, var bindingen fullstendig avhengig av tilstedeværelsen av divalente kationer. Ved fysiologiske konsentrasjoner var Mg<2+> alene tilstrekkelig for maksimal cellebinding, mens Ca<2+> alene ga meget lave bindingsnivåer. Imidlertid var Mg<2+> ved 1/10 av den normale konsentrasjon, kombinert med Ca<2+>, synergistisk og ga maksimal binding. ;Kort angitt viser spesifisiteten ved cellebinding til renset ICAM-1 inkorporert i kunstige membraner, den spesifikke inhibring med monoklonale antistoffer og temperaturkravene og kravene om divalent kation at ICAM-1 er en spesifikk ligand for det LFA-1-avhengige adhesjonssystem. ;EKSEMPEL 22 ;Ekspresjon av ICAM-1 og HLA-DR ved ;allergiske og toksiske lapptestreaksjoner Hudbiopsier fra fem normale individer ble undersøkt med hensyn til ekspresjon av ICAM-1 og HLA-DR. Det ble funnet at skjønt endotelcellene i noen blodkar vanligvis uttrykte ICAM-1, var det ikke noen ICAM-l-ekspresjon på keratinocytter fra normal hud. Ingen farging med hensyn til HLA-DR på noen keratinocytt fra normale hudbiopsier ble observert. Ekspresjonskinetikken for ICAM-1 og antigener i klasse II ble så undersøkt for celler i biopsier fra allergiske og toksiske hudlesjoner. Det ble funnet at halvparten av de seks undersøkte individer hadde keratinocytter som uttrykte ICAM-1, 4 timer etter påføring av haptenet (tabell 10). Det var en økning i prosentandelen av individer som uttrykte ICAM-1 på sine keratinocytter med eksponeringstiden for haptenet, så vel som en økning i fargeintensiteten, hvilket viste mer ICAM-l-ekspresjon pr. keratinocytt opp til 48 timer. På dette tidspunkt ble faktisk en viss andel av kerationocytter i alle biopsier farget positivt med hensyn til ICAM-1. Etter 72 timer (24 timer etter at haptenet var fjernet), hadde syv av de åtte individer fremdeles ICAM-1 uttrykt på sine keratinocytter, mens ekspresjonen av ICAM-1 for et individ avtok mellom 48 og 72 timer. ;;Histologisk var fargemønsteret for ICAM-1 på keratinocytter fra biopsier tatt 4 timer etter påføring av haptenet, vanligvis i små klynger. Etter 48 timer var ICAM-1 uttrykt på overflaten av størstedelen av keratinocyttene, idet man ikke kunne se noen forskjell mellom sentrum og periferien av lesjonen. Fargeintensiteten minsket ettersom keratinocyttene nærmet seg hornlaget. Dette ble funnet for biopsier tatt både fra sentrum og periferien av lesjonene. Også på dette tidspunkt var lapptesten positiv (infiltrasjon, erytem og vesikler). Ingen forskjell i ICAM-1-ekspresjonen ble observert når forskjellige haptener ble påført på følsomme individer. I tillegg til keratinocytter, ble ICAM-1 også uttrykt på en del mononukleære celler og endotelceller på lesjonsstedet. ;Ekspresjonen av HLA-DR på keratinocytter i de allergiske hudlesjoner var mindre hyppig enn ekspresjonen av ICAM-1. Ingen av de undersøkte individer hadde lesjoner med keratinocytter som ble farget positivt med hensyn til HLA-DR opp til 24 timer etter påføring av haptenet. Faktisk hadde bare fire biopsiprøver keratinocytter som uttrykte HLA-DR, og ingen biopsi hadde keratinocytter som var positive med hensyn til HLA-DR og ikke ICAM-1 (tabell 10). ;I motsetning til den allergiske lapptestlesjon, hadde den toksiske lapptestlesjon bevirket med krotonolje eller natrium-laurylsulfat, keratinocytter som viste ingen, hvis noen, ICAM-1 på sin overflate ved alle de undersøkte tidspunkter (tabell 11). 48 timer etter lapp-påføringen, som var det optimale tidspunkt for ICAM-l-ekspresjon hos individene med den allergiske lapptest, hadde faktisk bare én av de 14 individer med toksisk lapptest, keratinocytter som uttrykte ICAM-1 i sine lesjoner. Også i motsetning til de allergiske lapptest-biopsier, var det ikke noen HLA-DR uttrykt på keratinocytter ved toksiske lapptest-lesjoner. ;Disse data viser at ICAM-1 uttrykkes ved immunbasert inflammasjon, og ikke ved toksisk-basert inflammasjon, og således kan ekspresjonen av ICAM-1 anvendes til å skille mellom immun-basert og toksisk-basert inflammasjon, så som akutt nyresvikt hos nyretransplantasjonspasienter, hvor det er vanskelig å bestemme hvorvidt svikten skyldes forkastelse eller nyretoksisitet av det immunundertrykkende terapeutiske middel. Nyrebiopsi og vurdering av oppregulering av ICAM-l-ekspresjon vil gjøre mulig differensierig av immunbasert forkastelse og ikke-immunbasert toksisitetsreaksjon. ;EKSEMPEL 23 ;Ekspresjon av ICAM-1 og HLA-DR i ;benigne hudsykdommer ;Celler fra hudbiopsier av lesjoner fra pasienter med forskjellige typer inflammatoriske hudsykdommer ble undersøkt med hensyn til sin ekspresjon av ICAM-1 og HLA-DR. En viss andel keratinocytter i biopsier fra allergisk kontakteksem, pemfigoid/pemfigus og lichen planus uttrykte ICAM-1. Lichen planus-biopsier viste den mest intense farging med et mønster likt, eller til og med sterkere enn, det som sees i 48-timers allergiske lapptest-biopsier (tabell 12). I overensstemmelse med resultater som sees ved den allergiske lapptest, ble den mest intense ICAM-l-farging sett på steder med sterk infiltrering av mononukleære celler. Videre var 8 av de 11 undersøkte lichen planus-biopsier positive med hensyn til HLA-DR-ekspresjon på keratinocytter. ;Ekspresjonen av ICAM-1 på keratinocytter fra hudbiopsier fra pasienter med eksantem og urtikaria var mindre uttalt. Bare fire av de syv undersøkte pasienter med disse sykdommer hadde keratinocytter som uttrykte ICAM-1 på lesjonsstedet. HLA-DR-ekspresjon ble bare funnet hos én pasient, og dette var i forbindelse med ICAM-1. ;Endotelceller og en viss andel av infiltratet av de mononukleære celler fra alle de undersøkte benigne inflammatoriske hudsykdommer uttrykte ICAM-1 i varierende utstrekning. ;EKSEMPEL 24 ;Ekspresjon av ICAM-1 på keratinocytter i psoriatiske hudlesjoner ;Ekspresjonen av ICAM-1 i hudbiopsier fra 5 pasienter med psoriasis ble undersøkt før startingen av, og periodisk under, et PUVA-behandlingsforløp. Biopsier ble tatt fra 5 pasienter med klassisk psoriasis bekreftet ved histologi. Biopsier ble tatt sekvensielt før og under angitt tid for PUVA-behandling. PUVA ble gitt 3-4 ganger ukentlig. Biopsier ble tatt fra periferien av psoriasis-plakkene hos 5 pasienter, og dessuten ble biopsier tatt fra klinisk normal hud hos 4 av pasientene. ;Friske hudbiopsiprøver ble frosset og lagret i flytende nitrogen. Kryostatsnitt på 6 j«n ble lufttørket over natten ved romtemperatur, fiksert i aceton i 10 minutter og enten farget straks eller innpakket i aluminiumfolie og lagret ved -80°C til farging. ;Fargingen ble utført på følgende måte. Snitt ble inkubert med monoklonale antistoffer og farget ved en 3-trinns-immunper-oksydasemetode (H. Stein et., Adv. Cancer Res., 42:67-147 ;(1984)), under anvendelse av et diaminobenzidin-H202-substrat. Tonsiller og lymfeknuter ble anvendt som positiv kontroll for anti-ICAMl- og HLA-DR-farging. Vev som ble farget i fravær av primært antistoff, var negative kontroller. ;De monoklonale antistoffer mot HLA-DR ble levert fra Becton Dickinson (Mountainview, California). Det monoklonale anti-ICAM-l-antistoff var R6-5-D6. Peroksydase-konjugert kanin-anti-muse-Ig og peroksydase-konjugert svine-anti-kanin-lg ble levert fra DAKAPATTS, København, Danmark. Diaminobenzidin-tetrahydroklorid ble levert fra Sigma (St. Louis, Mo.). ;Resultatene av undersøkelsen viser at endotelcellene i noen blodkar uttrykker ICAM-1 både hos syk og normal hud, men fargeintensiteten og antallet blodkar som uttrykte ICAM-1, var øket i de psoriatiske hudlesjoner. Videre varierte ekspresjonsmønsteret for ICAM-1 i keratinocytter i ubehandlede psoriatiske hudlesjoner fra de 5 pasienter fra farging av bare små celleklynger til farging av mange keratinocytter. I løpet av PUVA-behandling viste ICAM-1-ekspresjonen for to av pasientene (pasient 2 og 3) markert reduksjon som gikk forut for, eller var samtidig med, klinisk remisjon (tabell 13). Pasient 1, 4 og 5 hadde minskninger og økninger av ICAM-l-ekspresjon under PUVA-behandlingen som samsvarte med henholdsvis kliniske remisssjoner og tilbakefall. Det var ingen ICAM-l-ekspresjon på keratinocytter fra normal hud før eller etter PUVA-behandling. Dette viser at PUVA ikke induserer ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud. ;Observasjonen at densiteten av infiltratet av mononukleære celler samsvarte med mengden av ICAM-l-ekspresjon på keratinocytter, var bemerkelsesverdig. Dette gjaldt både et minsket antall av mononukleære celler i lesjoner under PUVA-behandling når ICAM-l-ekspresjonen også avtok, og et øket antall mononukleære celler under PUVA-behandling når ICAM-l-ekspresjon på keratinocytter var mer fremherskende. Endotelceller og mononukleære hudceller er også ICAM-1-positive. Hos klinisk normal hud var ICAM-l-ekspresjonen begrenset til endotelceller uten noen merking av keratinocytter. ;Ekspresjonen av HLA-DR på keratinocytter var variabel. Det var ingen HLA-DR-positiv biopsi som ikke også var ICAM-1-positiv. ;Kort angitt, viser disse resultater at før behandling er ICAM-l-ekspresjonen uttalt på keratinocyttene og samsvarer med et tett infiltrat av mononukleære celler. Under PUVA-behandling sees en uttalt minskning av ICAM-1-fargingen å være parallell med den kliniske forbedring. Histologisk ble hudinfiltratet også mindre. Når et klinisk tilbakefall var tydelig under behandlingen, øket ekspresjonen av ICAM-1 på keratinocyttene, så vel som densiteten av hudinfiltratet. Når man så en klinisk remisjon under behandlingen, var det en tilsvarende minskning i ICAM-1-farging på keratinocyttene så vel som minskning i hudinfiltratet. Således svarte ekspresjonen av ICAM-1 på keratinocytter til densiteten av infiltratet av mononukleære celler i dermis. Disse data viser at klinisk respons overfor PUVA-behandling resulterte i en uttalt minskning av ICAM-l-ekspresjon på keratinocytter parallelt med en mer moderat nedgang i de mononukleære celler. Dette viser at ICAM-l-ekspresjon på keratinocytter er ansvarlig for starting og opprettholdelse av hudinfiltratet, og at PUA-behandling regulerer ned ICAM-1, som i sin tur forminsker hudinfiltratet og den inflammatoriske respons. Dataene viser også at det var variabel HLA-DR-ekspresjon på keratinocytter under PUVA-behandling. ;Ekspresjonen av ICAM-1 på keratinocytter i psoriatiske lesjoner samsvarer med den kliniske styrkegrad for lesjonen så vel som med størrelsen av hudinfiltratet. Således spiller ICAM-1 en sentral rolle ved psoriasis, og inhibering av dets ekspresjon og/eller inhibering av dets vekselvirkning med CD 18-komplekset på mononukleære celler vil være en effektiv behandling av sykdommen. Videre vil styring av ICAM-l-ekspresjonen på keratinocytter være et effektivt redskap for diagnostisering og prognostisering, så vel som vurdering av forløpet av behandlingen av psoriasis. ;EKSEMPEL 25 ;Ekspresjon av ICAM og HLA-DR ved ;maligne hudsykdommer ;I motsetning til lesjoner fra benigne hudtilstander, var ekspresjonen av ICAM-1 på keratinocytter fra maligne hudlesjoner mye mer variabel (tabell 14). Blant de 23 hud-T-celle-lymfomundersøkelser, ble ICAM-l-positive keratinocytter identifisert i bare 14 tilfeller. Det var en tendens til at keratinocytter fra biopsier av mykosis fungoides-lesjoner mistet sin ICAM-l-ekspresjon med progresjonen av sykdommen til mer fremskredne stadier. Imidlertid ble ICAM-l-ekspresjon observert på en varierende andel av infiltratet av mononukleære celler fra de fleste av hud-T-celle-lymfomlesjonene. Blant de gjenværende undersøkte lymfomer, hadde 4 av 8 keratinocytter som uttrykte ICAM-1. Blant de 29 undersøkte pasienter med maligne hudsykdommer, hadde 5 keratinocytter som uttrykte HLA-DR uten å uttrykke ICAM-1 (tabell 14). ;EKSEMPEL 26 ;Effekt av anti-ICAM-l-antistoffer på ;formeringen av humane mononukleære celler fra perifert blod Humane mononukleære celler fra perifert blod bevirkes å formeres ved tilstedeværelse og oppfattelse av antigener eller mitogener. Visse molekyler, så Som mitogenet, concanavalin A eller det T-celle-bindende antistoff 0KT3, bevirker en ikke-spesifikk formering av mononukleære celler fra perifert blod. ;Humane mononukleære celler fra perifert blod er heterogene på den måten at de består av underpopulasjoner av celler som kan oppfatte spesifikke antigener. Når en mononukleær celle fra perifert blod som kan oppfatte et spesielt spesifikt antigen, støter på antigenet, bevirkes formering av denne underpopulasjon av mononukleære celler. Tetanus-toksoid og "keyhole limpet"-hemocyanin er eksempler på antigener som oppfattes av underpopulasjoner av perifere mononukleære celler, men ikke oppfattes av alle perifere mononukleære celler hos sensibiliserte individer. ;Evnen hos monoklonalt anti-ICAM-l-antistoff er R6-5-D6 til å inhibere proliferative responser hos humane mononukleære celler fra perifert blod i systemer som er kjent for å fordre celle-celle-adhesjoner, ble utprøvd. ;Mononukleære celler fra perifert blod ble renset på Ficoll-Paque (Pharmacia)-gradienter ifølge frabrikantens instruksjoner. Etter oppsamling av grenseflate-laget, ble cellene vasket tre ganger med RPMI 1640-medium og dyrket i flatbunnede 96-brønns-mikrotiterplater ved en konsentrasjon på IO6 celler/ml i RPMI 164 0-medium supplert med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin og gentamycin (50 ng/ ml) . ;Antigen, enten T-celle-mitogenet, concanavalin A (0,25 Aig/ml) ; det T-celle-bindende antistoff, OKT3 (0,001 ng/ ml) ; "keyhole limpet"-hemocyanin (10 g/ml) eller tetanus toksoid ;(1:100 fortynning fra kilden) ble tilsatt til celler som ble dyrket som beskrevet ovenfor enten i nærvær eller fravær av anti-ICAM-antistoff (R6-5-D6; sluttkonsentrasjon 5 g/ml). Cellene ble dyrket i 3,5 dager (concanavalin A-forsøk), 2,5 dager (0KT3-forsøk), eller 5,5 dager ("keyhole limpet"-hemocyanin- og tetanustoksoid-forsøk) før analysene ble avsluttet. 18 timer før avslutning av analysen ble 2,5 fiCi <3>H-tymidin tilsatt til kulturene. Celleformering ble analysert ved måling av inkorporeringen av tymidin i DNA ved de mononukleære celler fra perifert blod. Inkorporert tymidin ble oppsamlet og tellet i en væskescintillasjonsteller (Merluzzi et al., J. Immunol., 139:166-168 (1987)). Resultatene av disse forsøk er vist på figur 16 (concanavalin A-forsøk), figur 17 (0KT3-forsøk), figur 18 ("keyhole limpet-hemocyaninforsøk) og figur 19 (tetanustoksoid-forsøk). ;Det ble funnet at anti-ICAM-l-antistoff inhiberer proliferative responser overfor det ikke-spesifikke T-cellemitogen, ConA; det ikke-spesifikke T-celle-tilknyttede antigen, OKT-3; og de spesifikke antigener, "keyhole limpet"-hemocyanin og tetanustoksoid, i mononukleære celler. Inhiberingen ved anti-ICAM-l-antistoff var sammenlingbar med inhiberingen av anti-LFA-l-antistoff, hvilket antyder at ICAM-1 er en funksjonell ligand til LFA-1 og at antagonisme av ICAM-1 vil inhibere spesifikke forsvarssystemresponser. ;EKSEMPEL 27 ;Effekt av anti-ICAM-l-antistoff på ;blandet-lymfocytt-reaksj onen ;Som omtalt ovenfor, er ICAM-1 nødvendig for effektive celle-vekselvirkninger under en immunrespons bevirket ved LFA-1-avhengig celleadhesjon. Induksjonen av ICAM-1 under immun-responser eller inflammatorisk sykdom gjør mulig vekselvirkning hos leukocytter seg i mellom og med endotelceller. ;Når lymfocytter fra to ubeslektede individer dyrkes i nærvær av hverandre, observeres blast-transformasjon og celleformering av lymfocyttene. Denne respons, av én populasjon av lymfocytter overfor tilstedeværelsen av en annen populasjon av lymfocytter, er kjent som blandet-lymfocytt-reaksjon (MLR), og er analog til responsen hos lymfocytter overfor tilsetning av mitogener (Immunology The Science of Self-Nonself Discrimination, (J. Klein, John Wiley & Sons, NY (1982), s. 453-458). ;Forsøk ble utført for bestemmelse av effekten av monoklonale anti-ICAM-antistoffer på den humane MLR. Disse forsøk ble utført som følger. Perifert blod ble tatt fra normale, friske donorer ved venepunksjon. Blodet ble samlet i hepariniserte rør fortynnet 1:1 ved romtemperatur med Puck's G (GIBCO) balanserte saltoppløsning (BSS). Blodblandingen (20 ml) ble lagt som et lag opp på 15 ml av en Ficoll/hypaque-densitetsgradient (Pharmacia, densitet = 1,078, romtemperatur) og sentrifugert ved 1000 x g i 20 minutter. Grenseflatelaget ble så oppsamlet og vasket 3 ganger i Puck's G. Cellene ble tellet på et hemacytometer og suspendert på nytt i RPMI 1640-dyrkningsmedium (GIBCO) som inneholdt 0,5% gentamycin, 1 mM L-glutamin (GIBCO) og 5% varmeinaktivert (56°C, 30 minutter) humant AB-serum (Flow Laboratories) (i det følgende omtalt som RPMI-dyrkningsmedium). ;Muse-anti-ICAM-1 (R6-5-D6) ble anvendt ved disse forsøk. Alle monoklonale antistoffer (fremstilt utfra ascites av Jackson ImmunoResearch Laboratories, Boston, MA) ble anvendt som rensede IgG-preparater. ;Mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) ble dyrket i medium med 6,25 x IO<5> celler/ml i rundbunnede mikrotiterplater av typen Linbro (nr. 76-013-05). Stimulatorceller fra en separat donor ble bestrålt ved 1000 R og dyrket med responder-cellene ved samme konsentrasjon. Det totale volum pr. kultur var 0,2 ml. Kontrollene innbefattet responderceller alene så vel som stimulatorceller alene. Dyrkningsplatene ble inkubert ved 37°C i en 5% C02-atmosfære med fuktet luft i 5 dager. Brønnene ble pulsert md 0,5 jtCi tritiert tymidin (3HT) (New England Nuclear) i de siste 18 timer av dyrkningen. I noen tilfeller ble det utført en toveis-MLR. Protokollen var den samme, bortsett fra at den annen donors celler ikke ble inaktivert ved bestråling. ;Cellene ble høstet på glassfiberfiltere under anvendelse av en automatisk multippelprøvehøsteanordning (Skatron, Norge), og skylling med vann og metanol. Filtrene ble ovnstørket og tellet i Aquasol i en Beckman (LS-3801)-væskescintillasjonsteller. Resultatene er angitt som middel-CPM + standardfeil for 6 individuelle kulturer. ;Tabell 15 viser at rensede monoklonale anti-lCAM-1-antistoffer inhiberte MLR på en doseavhengig måte med signifikant undertrykkelse som var synlig ved 20 ng/ml. Renset muse-IgG hadde liten eller ingen undertrykkende effekt. Undertrykkelse av MLR ved det monoklonale anti-ICAM-l-antistoff skjer når antistoffet tilsettes innen de første 24 dyrknings-timer (tabell 16). ;Kort angitt, viser evnen hos antistoff mot ICAM-1 til inhibering av MLR at monoklonale ICAM-l-antistoffer er terapeutisk nyttige ved akutt transplantatforkastelse. Monoklonale ICAM-l-antistoffer er også terapeutisk nyttige ved beslektede immunbevirkede forstyrrelser avhengig av LFA-l/ICAM-l-regulerte celle-celle-vekselvirkninger. ;Forsøkene som er beskrevet her, viser at tilsetning av monoklonale antistoffer mot ICAM-1 inhiberer blandet-lymfocytt-reaksjonen (MLR) ved tilsetting under de første 24 timer av reaksjonen. Videre blir ICAM-1 oppregulert på humane monocytter fra perifert blod under in vi tro-dyrkning. ;Videre ble det funnet at ICAM-1 ikke uttrykkes på hvilende humane lymfocytter eller monocytter fra perifert blod. ICAM-1 oppreguleres på monocyttene i dyrkede celler alene eller celler som er dyrket sammen med ubeslektede donorceller ved en blandet lymfocyttreaksjon under anvendelse av vanlige strømnings-cytometriske analyser. Denne oppregulering av ICAM-1 på monocytter kan anvendes som indikator på inflammasjon, spesielt hvis ICAM-1 uttrykkes på friske monocytter hos individer med akutt eller kronisk inflammasjon. ;ICAM-1's spesifisitet overfor aktiverte monocytter, og evnen hos antistoff mot ICAM-1 til inhibering av MLR, antyder at monoklonale ICAM-l-antistoffer kan ha diagnostisk og terapeutisk potensial ved akutt transplantatforkastelse og beslektede immunbevirkede forstyrrelser som fordrer celle-celle-vekselvirkninger. ;EKSEMPEL 28 ;Genetisk konstruksjon og ekspresjon av avkuttede derivater av ICAM-1 ;I sin naturlige tilstand er ICAM-1 et cellemembran-bundet protein som inneholder et ekstracellulært område med 5 immunglobulin-lignende felter, et transmembranfelt, og et cytoplasmafelt. Det var ønskelig å konstruere funksjonelle derivater av ICAM-1 som manglet transmembranfeltet og/eller cytoplasmafeltet ved at en løselig, utsondret form av ICAM-1 kunne dannes. Disse funksjonelle derivater ble konstruert ved oligonukleotidrettet mutagenese av ICAM-l-genet, fulgt av ekspresjon i apeceller etter transfeksjon med det mutante gen. ;Mutasjoner i ICAM-l-genet som resulterte i aminosyre-substitusjoner og/eller avkuttede derivater, ble dannet ved fremgangsmåten ifølge T. Kunkel, (Proe. Nati. Acad. Sei. ;(U.S.A), 82:488-492 (1985)). ICAM-l-cDNA fremstilt som beskrevet ovenfor, ble digerert med restriksjonsendonukleaser Sal 1 og Kpn 1, og det resulterende 1,8 kb DNA-fragment ble subklonet i plasmidvektoren CDM8 (B. Seed et al., Proe. Nati. Acad, Sei. (U.S.A.), 84:3365-3369 (1987)). En dut", ung"-stamme av E. coli (BW313/P3) ble så transformert med denne konstruksjon, betegnet pCD1.8C. Et enkeltkjedet uracil-holdig templat ble uttatt fra transformantene ved infeksjon med hjelperfagen R408 (StratageneR) . Mutante ICAM-1-cDNA-molekyler ble så dannet ved priming av en annen kjede-syntese med et oligonukleotid som hadde umake baser, og etterfølgende transformering av en ung<+->vert (MC1061/P3) med det resulterende heterodupleks. Mutanter ble isolert ved undersøkelse med ;hensyn til nylig dannede endonuklease-restriksjonsseter innført ved det mutante oligonukleotid. Det mutante ICAM-1-protein ble uttrykt ved transfeksjon ved Cos-7-celler med den mutante DNA i den eukaryote ekspresjonsvektor CDM8 under anvendelse av ;standard-DEAE-dekstran-fremgangsmåter (R.F. Seiden et al., I: Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., red.) sider 9.2.1-9.2.6 (1987)). ;Et avkuttet funksjonelt derivat av ICAM-1 som manglet transmembran- og cytoplasma-feltene, men som inneholdt det ekstracellulære området som hadde alle de 5 immunglobulin-lignende felter, ble fremstilt. Et 30 bp mutant oligonukleotid (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) ble anvendt for transformering av kodonene for aminosyrene tyrosin (Y) og glutaminsyre (E) i henholdsvis stillinger 452 og 453, til et fenylalanin (F) og et .translasjonelt stoppkodon (TAG). Mutanten ble isolert ved sitt unike Xba 1-restriksjonssete, og ble betegnet Y<4S2>E/F, TAG. ;For ekspresjon av det mutante protein, ble COS-celler transfektert med tre mutante subkloner (nr. 2, nr. 7 og nr. 8). Tre dager etter transfeksjon med de tre mutante subkloner, ble dyrkningssupernatanter og cellelysat analysert ved immunutfelling med monoklonalt anti-ICAM-l-antistoff RRl/1 og SDS-PAGE. ICAM-1 ble utfelt fra dyrkningssupernatantene for celler transfektert med mutante subkloner nr. 2 og nr. 8, men ikke fra detergent-lysater av disse celler. Molekylvekten for ICAM-1 funnet i dyrkningssupernatanten var redusert med ca. 6 kd i forhold til membranformen av ICAM-1, som er i overensstemmelse med størrelsen som er forutsett for den mutante DNA. Således utsondres dette funksjonelle derivat av ICAM-1 som et løselig protein. I motsetning til dette ble ICAM-1 ikke immunutfelt fra kontroildyrkningssupernatanter fra celler transfektert med naturlig ICAM-1, hvilket viser at membranformen av ICAM-1 ikke er utspredt fra Cos-celler. Videre ble ikke noe ICAM-1 immunutfelt fra noen dyrkningssupernataner eller cellelysater fra "narre"-transfekterte negativ-kontrollceller. ;Det avkuttede ICAM-1 som var utsondret fra transfekterte celler, ble renset ved immunaffinitetskromatografi med et spesifikt ICAM-l-antistoff (R6-5-D6) og undersøkt med hensyn til funksjonell aktivitet i en cellebindingsanalyse. Etter rensing i nærvær av vaskemiddelet oktylglukosid, ble preparater som inneholdt naturlig ICAM-1, eller den avkuttede, utsondrede form, fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 0,25% oktylglukosid {en konsentrasjon under den avgjørende micelle-konsentrasjon for vaskemiddelet). Disse preparater av ICAM-1 fikk bindes til overflatene på 96-brønns plastplater (Nunc), under dannelse av ICAM-1 bundet til en fastfase. Etter utvasking av ubundet materiale, ble ca. 75-80% og 83-88% SKW-3-celler som hadde LFA-1 på sin overflate, bundet spesifikt til henholdsvis de naturlige og de avkuttede former av ICAM-1. Disse data viser at det utsondrede, avkuttede, løselige funksjonelle ICAM-1-derivat beholdt både den immunologiske reaktivitet og evnen til å formidle ICAM-1-avhengig addhesjon som er karakteristisk for naturlig ICAM-1. ;Et funksjonelt derivat av ICAM-1 som bare manglet det cytoplasmiske felt, ble fremstilt ved lignende fremgangsmåter. Et 25 bp oligonukleotid (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) ble anvendt til å forandre kondonet for aminosyre 476 (Y) til et translasjonelt TAG-stoppkodon. Mutanten ble betegnet Y<476>/TAG. Immunutfellingsanalyse og SDS-PAGE av Cos-celler transfektert med mutanten, påviste en membranbundet form av ICAM-1 med en molekylvekt på ca. 3 kd mindre enn naturlig ICAM-1. Indirekte immunfluorescens av de mutant-transfekterte Cos-celler viste et punktformet fargemønster likt naturlig ICAM-1 uttrykt på LPS-stimulerte humane endotelceller. Endelig ble celler transfektert med den mutante DNA spesifikt bundet til renset LFA-1 på plastoverflater på en måte lik Cos-celler transfektert med naturlig ICAM-1-DNA (tabell 17). ;EKSEMPEL 29 ;Kartlegging av funksjonelle ICAM-1-felter Undersøkelser av ICAM-1 har vist at molekylet har syv felter. Fem av disse felter er ekstracellulære (felt 5 er nærmest celleoverflaten, felt 1 er lengst fra celleoverflaten), ett felt er et transmembranfelt, og ett felt er cytoplasmisk (dvs. ligger inne i cellen). For bestemmelse av hvilke felter som bidrar til ICAM-1's evne til å binde LFA-1, kan det anvendes epitop-kartleggingsundersøkelser. For utførelse av slike undersøkelser, fremstilles forskjellige utslettelsesmutanter, og disse karakteriseres med hensyn til sin kapasitet til å bindes til LFA-1. Alternativt kan undersøkelsene utføres ved anvendelse av anti-ICAM-antistoff kjent for å innvirke på kapasiteten av ICAM-1 til å binde LFA-1. Eksempler på slikt egnet antistoff innbefatter RRl/1 (R. Rothlein et al., J. Immunol., 137:1270-1274 (1986)), R6.5 (T.A. Springer et al., U.S. patentsøknad serie nr. 07/250.446), LB-2 (E.A. Clark et al., Leukocyte Typing I, A. Bernard et al., red.), Springer-Verlag s. 339-346 (1984)), eller CL203 D.E. Staunton et al., Cell, 56:849-853 (1989)). ;Utslettelsesmutanter av ICAM-1 kan dannes på hvilken som helst av mange forskjellige måter. Det er imidlertid foretrukket å fremstille slike mutanter via seterettet mutagenese, eller på andre rekombinante måter (så som ved konstruksjon av ICAM-1-uttrykkende gensekvenser hvor sekvenser som koder for spesielle proteinområder, er blitt utslettet). Fremgangsmåter som kan anvendes for fremstilling av slike mutanter, er velkjente på området. Ved anvendelse av slike fremgangsmåter, ble det fremstilt tre ICAM-l-utslettelsesmutanter. Den første mutant mangler aminosyrerestene F185-P284 (dvs. utslettelse av felt 3). Den annen mutant mangler aminosyrerestene P284-R451 (dvs. utslettelse av felt 4 og 5). Den tredje mutant mangler aminosyrerestene etter Y4 76 (dvs. utslettelse av cytoplasmafelt). Resultatene av slike undersøkelser viser at felt 1, 2 og 3 hovedsakelig inngår ved vekselvirkninger mellom ICAM-1 og anti-ICAM-l-antistoff og LFA-1. ;EKSEMPEL 30 ;Effekt av mutasjoner i ICAM-1 på LFA-binding ;Evnen hos ICAM-1 til å vekselvirke med, og bindes til, LFA-1 formidles ved ICAM-1-aminosyrerester som er tilstede i felt 1 i ICAM-l-molekylet (figurene 8, 9 og 10). Slike vekselvirkninger understøttes imidlertid ved bidrag fra aminosyrer som er tilstede i felt 2 og 3 i ICAM-1. Blant de foretrukkede funksjonelle derivater ifølge den foreliggende oppfinnelse, er således løselige fragmenter av ICAM-l-molekylet som inneholder felt 1, 2 og 3 i ICAM-1. Mer foretrukket er løselige fragmenter av ICAM-l-molekylet som inneholder feltene 1 og 2 av ICAM-1. Mest foretrukket er løselige fragmenter av ICAM-l-molekylet som inneholder felt 1 av ICAM-1. Flere aminosyrerester i det første ICAM-l-felt inngår ved veksel-virkningen mellom ICAM-1 og LFA-1. Substitusjoner av disse aminosyrer med andre aminosyrer forandrer evnen hos ICAM-1 til å binde LFA-1. Disse aminosyrerester og substitusjonene er vist på figur 25. Figur 25 viser virkningene av slike mutasjoner på evnen hos det resulterende mutante ICAM-l-molekylet til å bindes til LFA-1. På figurene 23-25 er det beskrevet rester med henvisning til énbokstav-koden for aminosyrer, fulgt av posisjonen for resten i ICAM-l-molekylet. Således angir f.eks. "E90" glutaminsyreresten i stilling 90 i ICAM-1. Likeledes angir "E90V" dipeptidet som består av glutaminsyreresten i stilling 90 og valinresten i stilling 91. Substitusjonssekvensen er angitt til høyre for skråstreken (<ii>/<ii>), V4-, R13-, Q27-, Q58- og D60S61-restene i ICAM-1 inngår ved LFA-1-binding. ;Utskiftning av disse aminosyrer forandret kapasiteten hos ICAM-1 til å bindes til LFA-1. F.eks. resulterer utskifting av V4 med G i dannelse av et mutant ICAM-1-molekyl som er mindre i stand til å bindes til LFA-1 (figur 25). Utskifting av R13-resten i ICAM-1 med E fører til dannelse av et mutant molekyl med hovedsakelig mindre kapasitet til å binde LFA-1 (figur 25). Utskifting av Q58-resten i ICAM-1 med H fører til dannelse av et mutant molekyl med en hovedsakelig normal kapasitet til å binde LFA-1 (figur 25). Utskifting av D60S-restene i ICAM-1 med KL fører til dannelse av et mutant molekyl med hovedsakelig mindre kapasitet til å binde LFA-1 (figur 25). ;Glykosyleringsseter i det annet felt inngår også ved LFA-1-binding (figur 23). Utskifting av N103 med K, eller A155N med SV, resulterer i dannelse av et mutant ICAM-1-molekyl som hovedsakelig ikke kan binde LFA-1. I motsetning til dette, så det ikke ut til at utskifting av glykosyleringssetet N175 med A i vesentlig grad frembragte kapasiteten hos det mutante ICAM-1 til å binde LFA-1. ;Mutasjoner i det tredje ICAM-1 felt forandret ikke ICAM-1-LFA-1-bindingen i noen betydelig grad {figur 24). ;EKSEMPEL 31 ;Multimere former av ICAM-1 med øket ;biologisk halveringstid, affinitet og klaringsevne Kimære molekyler konstrueres hvor felt 1 og 2 festet til hengselområdet på den tunge immunglobulinkjede. Foretrukkede konstruksjoner fester den C-terminale ende av ICAM-l-felt 2 til et segment av genet for den tunge immunglobulinkjede like N-terminalt til hengselområdet, hvilket gjør mulig den segment-fleksibilitet som fås ved hengselområdet. ICAM-l-felt 1 og 2 vil således erstatte Fab-fragmentet i et antistoff. Tilhefting til tunge kjeder i IgG-klassen og dannelse av dyreceller vil resultere i dannelsen av et kimært molekyl. Dannelse av molekyler som inneholder tunge kjeder som stammer fra IgA eller IgM, vil resultere i dannelse av molekyler med høyere multi-merisitet som inneholder fra 2 til 12 ICAM-1-molekyler. Samtidig ekspresjon av J-kjedegen i dyrecellene som danner de kimære ICAM-1-tungkjede-molekyler, vil gjøre mulig riktig sammensetning av IgA- og IgM-multimerer, som hovedsakelig resulterer i IgA-molekyler som inneholder 4-6 ICAM-1-molekyler, og når det gjelder IgM, som inneholder ca. 10 ICAM-1-molekyler. Disse kimære molekyler kan ha flere fordeler. For det første er Ig-molekyler utformet slik at de varer lenge i sirkulasjonen, og dette kan forbedre den biologiske halveringstid. ;Videre vil den multimere beskaffenhet av disse konstruerte molekyler gjøre det mulig at de kan vekselvirke med større itensitet med rhinovirus så vel som med celleoverflate-LFA-1, avhengig av den diagnostiske sammenheng. Hvis kimære IgG-H-kjedemolekyler ønskes, ville det være mulig å mutere områder som inngår ved tilhefting til komplement såvel som ved vekselvirkninger med Fc-reseptorer. ;EKSEMPEL 32 ;Dannelse av ICAM-1-mutanter ;Olignonukleotid- rettet mutagenese ;Kodeområdet for en ICAM-l-cDNA i et 1,8 kb Sal1-Kpnl-fragment, ble subklonet i ekspresjonsvektoren CDMB (B. Seed et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (U.S.A.), 84:3365-3369 (1987)). Basert på fremgangsmåten ifølge T. Kunkel, (Proe. Nati. Acad. Sei. ;(U.S.A.), 82:488-492 (1985)) og modifikasjoner ifølge D. Staunton et al., (D.E. Staunton et al., Cell, 52:925-933 ;(1988)), ble denne konstruksjon (pCDl.8) anvendt til dannelse av et enkeltkjedet uracil-holdig templat for anvendelse ved oligonukleotid-rettet mutagenese. ;Kort angitt ble E. coli stamme XS127 transformert med pCD1.8. Enkeltkolonier ble dyrket i 1 ml Luria-buljong (LB)-medium (Difco) med 13 /xg/ml ampicillin og 8 Mg/ml tetracyklin inntil metningspunktet nesten var nådd. 100 ll! av kulturen ble infisert med R408-hjelperfag (Strategene) med en infeksjons-multiplisitet (MOI) på 10, og 10 ml LB-medium med ampicillin og tetracyklin ble tilsatt for en 16 timers kultur ved 37°C. Etter sentrifugering ved 10.000 rpm i 1 minutt, og 0,22 /im-filtrering av supernatanten, ble fag-suspensjonen anvendt til å infisere E. coli BW313/P3, som så ble utplatet på LG-agar (Difco)-plater supplert med ampicillin og tetracyklin. Kolonier ble plukket ut, dyrket i 1 ml LB-medium med ampicillin og tetracyklin til metning nesten var nådd, og infisert med hjelper-fag med en MOI på 10. Kulturvolumet ble så øket til 250 ml, og cellene ble dyrket over natten. Enkeltkjedet DNA ble isolert ved standard-fagekstraksjon. ;Mutante oligonukleotider ble fosforylert og anvendt med pCDl.8-templatet ved en annenkjede-syntesereaksjon (D.E. Staunton et al., Cell, 52:925-933 (1988)). ;Transfeksjon ;COS-celler ble utsådd i 10 cm vevskulturplater slik at de ville være 50% sammenflytende etter 16-24 timer. COS-cellene ble så vasket en gang med TBS og inkubert i 4 timer med 4 ml RPMI som inneholdt 10% Nu-sera (Collaborative) 5 /xg/ml klorokin, 3 fig mutant plasmid og 200 /xcj/ml DEAE-dekstransulfat. Cellene ble så vasket med 10% DMSO/PBS, fulgt av PBS, og dyrket i 16 timer i dyrkningsmedium. Dyrkningsmediet ble erstattet med friskt medium, og 48 timer etter transfektering (OS-cellene ble suspendert ved trypsin/EDTA (Gibco)-behandling og delt i 2, 10 cm plater såvel som 24-brønns vevs-kulturplater for HRV-binding. Etter 72 timer ble cellene høstet fra 10 cm plater med 5 mM EDTA/HBSS og bearbeidet for adhesjon til LFA-l-belagt plast og immunfluorecens. ;LFA- 1- og HRV- binding ;LFA-1 ble renset fra SKW-3-lysater ved immunaffinitets-kromatograf i på TS2/4 LFA-1 mAb-Sepharose og eluert ved pH 11,5 i nærvær av 2 mM MgCl2 og 1% oktylglukosid. LFA-1 (10 /ig pr. 200 ul pr. 6 cm-plate) ble bundet til bakteriologiske petriskåler ved fortynning av oktylglukosid til 0,1% i PBS (fosfatbufferet saltoppløsning) med 2 mM MgCl2 og inkubering over natten ved 4°C. Platene ble blokkert med 1% BSA (bovint serumalbumin) og lagret i PBS som inneholdt 2 mM MgCl2, 0,2% BSA, 0,025% azid og 50 Mg/™1 gentamycin. ;<51>Cr-merkede COS-celler iPBS som inneholdt 5% FCS (føtalt kalveserum), 2 mM MgCl2 og 0,025% azid (buffer) ble inkubert med eller uten 5 £tg/ml RRl/1 og R6.5 i LFA-l-belagte mikrotiterplater ved 25°C i 1 time. Ikke-tilheftende celler ble fjernet ved 3 vaskinger med buffer. Tilheftende celler ble eluert ved tilsetting av EDTA til 10 mM og y-tellet. ;Resultater ;Anti-ICAM-l-antistoffer så som RRl/1, R6.5, LB-2 og CL203 er blitt identifisert. Hvis disse antistoffer kan inhibere ;ICAM-l-funksjonen, må de kunne bindes til et spesielt sted i ICAM-l-molkylet som også er viktig for ICAM-l-funksjonen. Ved fremstilling av de ovenfor beskrevne utslettelsesmutanter av ICAM-1, og bestemmelse av omfanget ved hvilket anti-ICAM-l-antistof f ene kan bindes til utslettelsesstedet, er det således mulig å bestemme hvorvidt de utslettede felter er viktige for funksjonen. ;ICAM-1 er et membranprotein, hvor det ekstracellulære felt er forutsett å bestå av 5 Ig-lignende C-felter. For identifikasjon av felter som inngår ved binding av LFA-1, ble felt 3 og feltene 4 og 5 (karboksylterminale) utslettet ved oligonukleotid-rettet mutagenese og undersøkt funksjonelt etter ekspresjonen i COS-celler. Dessuten ble hele cytoplasmafeltet utslettet for å sikre dets potensielle innvirkning på ICAM-1-vekselvirkninger. Som ventet, viste utslettelsen av cytoplasmafeltet, Y476/<*>, intet tap av RRl/1-, R6.5-, LB-2- og CL203-reaktivitet, mens utslettelse av felt 3, F185-R451, resulterte i en minskning og tap av CL203-reaktivitet (figur 20). Således ser det ut til at CL203-epitopen finnes i felt 4, mens RRl/1, R6.5 og LB-2 ser ut til å finnes i de to amino-terminale felter.

Alle de 3 utslettelsesmutanter viser villtype-nivåer når det gjelder tilhefting til LFA-1 (figur 21). Aminosyre-substitusjoner i forutsette S-dreininger i felt 1, 2 og 3 ble også dannet og funksjonelt utprøvd etter ekspresjon i COS-celler. R6.5-epitopen ble således lokalisert til sekvensen E111GGA i felt 2, og kan også innbefatte E39 i felt 1, mens RRl/1 og LB-2 begge er avhengig av R13 i felt 1 (figur 22). Dessuten minskes RRl/1-binding ved mutasjoner i sekvensen D71GQS. Mutasjoner som utsletter N-bundne glykosyleringsseter ved N103 og N165, resulterer i minsket RRl/1-, R6.5- og LB-2, LFA-l-HRV-binding. Disse mutasjoner ser ut til å bevirke bearbeidelse slik at ICAM-l-dimerer dannes.

Andre mutasjoner i felt 2 eller 3 resulterte ikke i forandret LFA-1-adhesjon (figurene 23 og 24). Aminosyrene i felt 1, Ri3 og D60, inngår begge ved binding av LFA-1 (figur 25).

Således ser det ut til at LFA-1- og HRV-binding er en funksjon av det aminoterminale lg-lignende felt av ICAM-1.

Figur 26 viser en oppstilling av aminoterminale ICAM-felter.

Claims

1. Diagnostisk anvendelig vannløselig, funksjonelt derivat av ICAM-1 som er et fragment av ICAM-1, karakterisert ved at at mangler cytoplasmafeltet og transmembranfeltet i ICAM-1, og det inneholder felt 1 eller feltene 1 og 2, eller feltene 1, 2 og 3.

2. Anvendelse av derivatet i følge krav 1, for in vitro diagnostisering av tilstedeværelse og lokasjon av en tumorcelle som uttrykker et medlem av LFA-1-molekylfamilien i et individ som man har mistanke om har en slik celle, ved a) inkubering av en vevsprøve fra individet i nærvær av en blanding som inneholder et påvisbart, merket, vannløselig,funksjonelt derivat ifølge krav 1, og b) påvisning av nevnte bindingsligand som er bundet til et medlem av LFA-l-molekylfamilien som er tilstede i vevs-prøven .