DK175577B1 - Intercellulære adhæsionsmolekyler og deres bindingsligander - Google Patents

Description

DK 175577 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår opløselige, funktionelle intercellulære adhæsionsmolekyler, såsom ICAM-1, som er involveret i processen, gennem hvilken populationer af lymfocytter genkender og hæfter til 5 cellesubstrater, således at de kan migrere til inflammationssteder og påvirke cellerne under inflammationsreaktioner. Den foreliggende opfindelse angår yderligere ligandmolekyler, der er i stand til at binde til sådanne intercellulære adhæsionsmolekyler, en screenings-10 prøve for disse ligander, og anvendelser af det intercellulære adhæsionsmolekyle, ligandmolekylerne og screeningsprøven.

Leukocytter skal være i stand til at fæstne til cellesubstrater for på rette måde at forsvare værten 15 mod fremmede invaderende, såsom bakterier eller vira.

Et udmærket overblik over forsvarssystemet er angivet af Eisen, H.W., (Microbiology, 3. udg., Harper & Row, Philadelphia, PA (1980), s 290-295 og 381-418).

De skal kunne fæstnes til endotelceller, således at de 20 kan migrere fra kredsløbet til steder med fortsat inflammation. Yderligere skal de være i stand til at fæstne til antigenpræsenterende celler, således at en normal specifik immunreaktion kan forekomme, og endelig skal de fæstne til egnede målceller, således at 25 lysis af virus-inficerede celler eller tumorceller kan ske.

For nylig identificeredes leukocytoverflade-molekyler, som er involveret i formidlingen af sådanne fæstnelser, under anvendelse af hybridoma-teknologi.

30 Kort fortalt identificeredes monoklonale antistoffer rettet mod humane T-celler (Davignon, D. et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 78:4535-4539 (1981)) og musemilt-celler (Springer, T. et al. Bur. J. Immunol. 9:301-306 2 DK 175577 B1 (1979)), hvilke bandt til leukocytoverflader og inhibe-rede de fæstnelsesrelaterede funktioner beskrevet ovenfor (Springer, T. et al., Fed. Proc. 44:2660-2663 (1985)). Molekylerne, der identificeredes med disse 5 antistoffer, kaldtes Mac-l og lymfocyt-funktionsassocieret antigen-1 (LFA-1). Mac-l er en heterodimer, som findes hos makrofager, granulocytter og store granulære lymfocytter. LFA-1 er en heterodimer, som findes hos de fleste lymfocytter (Springer, T.A., et 10 al. Immunol. Rev♦ 68: 111-135 (1982)). Disse to molekyler plus et tredje molekyle, pl50,95 (som har en vævsfordeling svarende til Mac-l) spiller en rolle ved cellulær adhæsion (Keizer, G. et al. , Eur. J. Immunol. 15:1142-1147 (1985)).

15 Ovennævnte leukocytmolekyler har vist sig at væ re medlemmer af en beslægtet familie af glycoproteiner (Sanchez-Madrid F. et al., J. Exper. Med. 158:1785-1803 (1983); Keizer, G.D. et al., Eur. J. Immunol.

15:1142-1147 (1985)). Denne glycoproteinfamilie består 20 af heterodimerer med én α-kæde og én β-kæde. Skønt hver af antigenernes α-kæde var forskellige fra hinanden, viste β-kæden sig at være bevaret i høj grad (Sanchez-Madrid, F. et al., J. Exper♦ Med.

158:1785-1803 (1983)). Glycoproteinfamiliens (under- 25 tiden omtalt som ”CD18") β-kæde viste sig at have en molekylvægt på 95 kd, hvorimod α-kædernes molekylvægt varierede fra 150 kd til 180 kd (Springer, T., Fed.

Proc. £4:2660-2663 (1985)). Skønt membranproteinernes α-underenheder ikke har den samme vidtstrakte homologi 30 som β-underenhederne, viste nærmere analyse af glyco-proteinernes α-underenheder, at der er væsentlige ligheder mellem dem. Undersøgelser over lighederne mellem a- og β-underenhederne i de LFA-l-relaterede glycopro- DK 175577 B1 3 teiner er angivet af Sanchez-Madrid, F. et al., (J.

Exper. Med. 158:586-602 (1983); Exper. Med. 158: 1785-1803 (1983)).

Man har identificeret en gruppe af personer, 5 som ikke er i stand til at eksprimere normale mængder af ethvert medlem af denne adhæsionsproteinfamilie på deres leukocytcelleoverflade (Anderson, D.C., et al.,

Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Lymfocytter fra 10 disse patienter udviste in vitro defekter svarende til normale modparter, hvis LFA-l-familie af molekyler var blevet antagoniseret af antistoffer. Disse personer var yderligere ude af stand til at opnå en normal immunrespons på grund af deres cellers manglende evne til 15 at hæfte til cellesubstrater (Anderson, D.C., et al., Fred. Proc♦ 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C., et_al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Disse data viser at immunreaktioner dæmpes når lymfocytter ikke er i stand til at fæstne på normal måde på grund 20 af de manglende funktionelle adhæsionsmolekyler af LFA-l-familien.

Lymfocytternes evne til at bevare et dyrs helbred og levedygtighed kræver således summarisk at lymfocytterne er i stand til at hæfte til andre celler 25 (såsom endotelceller). Denne hæftning har vist sig at kræve celle-cellekontakter, som involverer specifikke receptormolekyler, der findes på lymfocytternes celleoverflade. Disse receptorer gør det muligt for en lymfocyt at fæstne sig til andre lymfocytter eller til 30 endotelceller, og andre ikke-vaskulære celler. Celle-overfladereceptormolekylerne har vist sig at være yderst beslægtede med hinanden. Personer, hvis lymfocytter mangler disse celleoverfladereceptormolekyler, 4 DK 175577 B1 udviser kroniske og tilbagevendne infektioner og andre kliniske symptomer, herunder defekte antistofreaktio-ner.

Da lymfocytadhæsionen er involveret i processen 5 gennem hvilken fremmed væv identificeres og afvises, er en forståelse af denne proces af væsentlig værdi indenfor organtransplantationen, vævstransplantationen, allergi og onkologi.

Den foreliggende opfindelse angår opløselige, 10 funktionelle derivater af intercellulære adhæsions-molekyle-1 {ICAM1). Opfindelsen angår yderligere antistoffer og fragmenter af antistoffer, der er i stand til at inhibere funktionen af ICAM-1, og andre inhibitorer af ICAM-1funktionen, og prøver til identificering 15 af sådanne inhibitorer. Opfindelsen angår desuden diagnostiske og terapeutiske anvendelser af alle de ovennævnte molekyler.

Opfindelsen angår desuden sådanne molekylderi-vater, som yderligere er i stand til at binde til et 20 molekyle, som findes på en lymfocytoverflade.

Opfindelsen angår yderligere det intercellulære adhæsionsmolekyle ICAM-1 og dets derivater, som er detekterbart mærket.

Opfindelsen angår ydermere et rekombinant DNA-25 molekyle, som er i stand til at eksprimere opløselige, funktionelle derivater af ICAM-1.

Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til udvinding af ICAM-1 på i det væsentlige ren form, hvilken fremgangsmåde omfatter trinnene: 30 (a) Opløseliggørelse af ICAM-1 fra membranerne fra celler, der eksprimerer ICAM-1, til dannelse af et opløst iCAM-l-præparat, (b) introduktion af det opløste ICAM-l-præparat til en affinitetsmatrix, hvor matrixen indeholder anti-35 stof, der er i stand til at binde til ICAM-1, DK 175577 B1 5 (c) muliggørelse af at ICAM-1 binder til affinitetsmatrixens antistof, (d) fjernelse af enhver forbindelse, der ikke er i stand til at binde til antistoffet, fra matrixen, 5 og (e) udvinding af ICAM-1 på i det væsentlige ren form ved eluering af ICAM-1 fra matrixen.

Opfindelsen omfatter desuden et antistof, som er i stand til at binde til et molekyle valgt blandt et 10 opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1.

Opfindelen angår yderligere en fremgangsmåde til behandling af inflammationen, der er resultatet af en reaktion fra det specifikke forsvarssystem i et pattedyr eller menneske, hvilken fremgangsmåde omfatter 15 administrering af en mængde af et anti-inflammatorisk middel, der er i stand til at undertrykke inflammationen, til et individ, der har behov for en sådan behandling, og ved hvilken fremgangsmåde det anti-inflammatoriske middel består af et opløseligt, funk-20 tionelt derivat af ICAM-1.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til undertrykkelse af en hæmatopoietisk tumorcelles metastase, idet cellen kræver et funktionelt medlem af LFA-1-familien til migrering, hvilken fremgangsmåde omfatter 25 administrering af en mængde af et anti-inflammatorisk middel, der er tilstrækkelig til at undertrykke metastasen, til en patient med behov for en sådan behandling, og ved hvilken fremgangsmåde det anti-inflammatoriske middel består af et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1.

Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til undertrykkelse af væksten af en LFA-l-eksprimerende tumorcelle, hvilken fremgangsmåde omfatter administre- 6 DK 175577 B1 ring af en mængde af et toxin, der er tilstrækkelig til at undertrykke en sådan vækst, til en patient med et behov for en sådan behandling, idet toxinet vælges blandt et toxinafledt opløseligt, funktionelt derivat 5 af ICAM-1.

Opfindelsen angår yderligere en fremgangsmåde til diagnostisering og lokalisering af en tumorcelle, som eksprimerer et medlem af LFA-1-familien af molekyler, hos et individ, som man formoder indeholder 10 en sådan celle, hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) inkubering af en vævsprøve fra individet i nærværelse af et præparat, som indeholder et detekter-bart mærket opløseligt, funktionelt derivat af icam-1, og 15 (b) detektering af bindingsliganden, som er bun det til et medlem af LFA-l-familien af molekyler, som findes i vævsprøven.

Opfindelsen angår endvidere et farmaceutisk præparat, som omfatter 20 (a) et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1; og (b) mindst ét immunosuppressivt middel valgt blandt: dexamethason, azathioprin og cyclosporin A.

På tegningen viser: fig. 1, på diagramform, adhæsionen mellem en 25 normal og en LFA-1 deficient celle.

Fig. 2 viser, på diagramform, normal/normal celle-adhæsion-processen.

Fig. 3 viser kinetikken af cellulær aggregation i fravær (X) eller nærværelse af 50 ng/ml PMA (0).

30· Fig. 4 viser coaggregation mellem LFA-1- og LFA-l+-celler. Carboxyfluoresceindiacetatmærkede EBV-transformerede celler (104), som angivet i figuren bian- DK 175577 B1 7 dedes med 105 umærkede autologe celler (sorte søjler) eller JY-celler (ufarvede søjler) i nærværelse af PMA.

Efter 1,5 timer optaltes de mærkede celler, i aggregater eller frie, idet den kvantitative prøve fra eksem-5 pel 2 benyttedes. Procentdelen af mærkede celler i aggregater er vist. Et repræsentativt eksperiment ud af to er vist.

Pig. 5 viser immunopræcipitationen af ICAM-1 og LFA-1 fra JY-celler. Triton X-100 lysater fra JY-10 celler (bane 1 og 2) eller kontrollysispuffer (bane 3 og 4) immunopræcipiteredes med antistof, der er i stand til at binde til ICAM-1 (bane 1 og 3) eller antistoffer, der er i stand til at binde til LFA-1 (bane 2 og 4). Panel A viser resultater under reducerende betin-15 gelser; Panel B viser resultater opnået under ikke-reducerende betingelser. Molekylvægtstandarder bestemtes i bane S.

Fig. 6 viser kinetikken af IL-1- og y-interfe-ronvirkninger på ICAM-l-ekspression på humane, dermale 20 fibroblaster. Humane, dermale fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x 104 celler/0,32 cm2/brønd. IL-l (10 E/ml, sorte cirkler) eller rekombinant y-interferon (10 E/ml, ufarvede firkanter) tilsattes og på det angivne tidspunkt afkøledes prøven til 4°C og en indirekte 25 bindingsprøve gennemførtes. Standardafvigelsen oversteg ikke 10%.

Fig. 7 viser koncentrationsafhængigheden af IL-l- og γ-interferonvirkninger på ICAM-1. Humane, dermale fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x 104 30 celler/0,32 cm2/brønd. IL-2 (ufarvede cirkler), rekombinant human IL-l (ufarvede firkanter), rekombinant muse IL-l (sorte firkanter), rekombinant human y-interferon (sorte cirkler), og rekombinant β-interferon (ufarvede trekanter) tilsattes ved den angivne fortyn- 8 DK 175577 B1 ding og inkuberedes i 4 timer (IL-1) eller 16 timer (β-og γ-interferon). De viste resultater er middelværdier fra firedobbelt© bestemmelser; standardafvigelsen overskred ikke 10%.

5 Fig. 8 viser nukleotid- og aminosyresekvensen af ICAM-l-cDNA. Det første ATG er ved position 58. Translaterede sekvenser svarende til ICAM-1 tryptiske peptider er understreget. Det hydrofobe putative signalpeptid og transmembransekvenser har en kraftig 10 understregning. N-koblede glycosyleringssteder er indrammet. Polyadenyleringssignalet AATAAA ved position 2976 er angivet ved en streg ovenover signalet. Den viste sekvens er for HL-60 cDNA-klonen. Endotelcelle-cDNA'en sekvensbestemtes over det meste af dens længde 15 og viste kun mindre forskelle.

Fig. 9 viser de ICAM-1 homologe domæner og relationen til immunoglobulin-supergenfamilien. (A) opstilling af 5 homologe domæner (Dl-5). To eller flere identiske rester, som lå på linie, er indrammet. Rester 20 bevaret to eller flere gange i NCAM-domæner samt rester bevaret i domæner af sættene C2 og Cl opstilledes sammen med de ICMA-1 interne gentagelsesenheder. Lokaliseringen af de forudsagte β-strenge i ICAM-1-domænet er markeret med kraftige streger og små bogstaver ovenover 25 opstillingerne og den kendte lokalisering af β-strenge i immunoglobulin C domæner er markeret med kraftig streger og store bogstaver nedenunder opstillingen. Positionen af den putative disulfidbro indenfor ICAM-1-domæner er angivet med S-S. (B-D) optilling af protein-domæner homologe til ICAM-1 domæner; proteiner opstilledes til at begynde med ved søgning i NBRF-databaser under anvendelse af FASTP-programmet. Proteinsekvenserne er MAG, NACM, T-cellereceptor-a-underenhed-v-domæne, IgMp-kæde og a-l-B-glycoprotein.

DK 175577 B1 9

Fig. 10 er en skematisk sammenligning mellem de sekundære strukturer af ICAM-1 og MAG.

Fig. 11 viser LFA-l-positive EBV-transformerede B-lymfoblastoide cellers binding til ICAM-1 i plane 5 membraner.

Fig. 12 viser LFA-l-positive T-lymfoblaster og T-lymfomacellers binding til ICAM-1 i plast-bundne vesikler.

Fig. 13 viser inhiberingen af binding af JY ΒΙΟ lymfoblastoidcellebinding til ICAM-1 i plast-bundne vesikler ved forbehandling af celler eller vesikler med monoklonale antistoffer.

Fig. 14 viser virkningen af temperatur på binding af T-lymfoblaster til ICAM-1 i plast-bundne vesik-15 ler.

Fig. 15 viser behovet for divalente kationer til binding af T-lymfoblaster til ICAM-1 i plast-bundne vesikler.

Fig. 16 viser anti-adhæsion-antistoffers virk-20 ning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen, af det T-celle-associerede antigen 0KT3. "OKT3" angiver tilsætningen af antigen.

Fig. 17 viser anti-adhæsion-antistoffers virk-25 ning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen af det ikke-specifikke T-cellemitogen, concanavalin A. "CONA" angiver tilsætningen af concanavalin A.

Fig. 18 viser anti-adhæsion-antistoffers virk-30 ning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen af "keyhole limpet-"hæmocyaninantigenet. Tilsætningen af "keyhole limpet-"hæmocyanin til cellerne er angivet ved "KLH".

Fig. 19 viser anti-adhæsion-antistoffers virk-35 ning på perifere mononukleære blodcellers evne til proliferation som svar på genkendelsen af tetanustoxo-idantigenet. Tilsætningen af tetanustoxoidantigen til cellerne er angivet ved "AGN".

10 DK 175577 B1

Fig. 20 viser bindingen af monoklonale antistoffer RR1/1, R6.5, LB2 and CL203 til ICAM-1 deletionsmu-tanter.

Fig. 21 viser bindingen af ICAM-1 deletionsmu-5 tanter til LFA-1.

Fig. 22 viser epitoperne genkendt af anti-ICAM-1 monoklonale antistoffer RR1/1, R6.5, LB2 og CL203.

Fig. 23 viser bindingsevnen af ICAM-l domæne 2 mutanter til LFA-1.

10 Fig. 24 viser bindingsevnen af ICAM-1 domæne 3 mutanter til LFA-1.

Fig. 25 viser bindingsevnen af ICAM-l domæne l mutanter til LFA-1.

Fig. 26 viser opstillingen af ICAM amino-termi-15 nåle domæner.

Et aspekt ifølge opfindelsen angår opdagelsen af en naturlig bindingsligand til LFA-l. Molekyler, såsom de i LFA-1-familien, der er involveret i den cellulære adhæsionsproces, betegnes som "adhæsionsmolekyler".

20 Den omhandlede naturlige bindingsligand betegnes "Intercellulær Adhæsionsmolekyle-1" eller "ICAM-l".

ICAM-1 er et 76-97 kd glycoprotein. ICAM-1 er ikke en heterodimer. Opfindelsen angår et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1. Et "funktionelt derivat" af 25 ICAM-l er en forbindelse, som har en biologisk aktivitet (enten funktionelt eller strukturelt) som i det væsentlige er lig en biologisk aktivitet af ICAM-1. Udtrykket "funktionelle derivater" skal omfatte "fragmenter", "varianter", "analoger" eller "kemiske deriva-30 ter” af et molekyle. Et "fragment" af et molekyle, såsom ICAM-1 skal betegne enhver polypeptiddel af molekylet. Fragmenter af ICAM-1, som har ICAM-1 virkning, og som er opløselige (dvs. ikke-membranbundne), er særlig foretrukne. En "variant" af et molekyle, såsom ICAM-1 35 skal betegne et molekyle, der i det· væsentlige har samme struktur og funktion som enten hele molekylet eller DK 175577 B1 11 et fragment deraf. Et molekyle siges at være "i det væsentlige lig med" et andet molekyle, hvis begge molekyler har i det væsentlige ens strukturer, eller hvis begge molekyler har omtrent samme biologiske aktivitet.

5 Forudsat at to molekyler har omtrent samme aktivitet, betragtes de således som varianter, sådan som udtrykket benyttes heri, selv hvis strukturen af et af molekylerne ikke findes i det andet, eller hvis aminosyrerest-sekvenserne ikke er identiske. En "analog" af et mole-10 kyle, såsom ICAM-1, skal betegne et molekyle, der i det væsentlige har samme funktion som enten hele molekylet eller som et fragment deraf. Sådan som det benyttes heri, siges et molekyle at være et "kemisk derivat" af . et andet molekyle, når det indeholder yderligere kemi-15 ske dele, som normalt ikke er eii del af molekylet. Sådanne dele kan forbedre molekylets opløselighed, absorption og biologisk halveringstid, osv. Delene kan alternativt mindske molekylets toxicitet, eliminere eller dæmpe enhver uønsket bivirkning hos molekylet, osv.

20 Dele, der i stand til at mediere sådanne virkninger er angivet i Reminton's Pharmaceutical Sciences (1980). "Toxin-afledte"-molekyler udgør en speciel klasse af "kemiske derivater". Et "toxin-afledt" molekyle er et molekyle (såsom ICAM-1 eller et antistof), som 25 indeholder en toxindel. Bindingen af et sådant molekyle til en celle bringer toxindelen i umiddelbar nærhed af cellen og fremmer derved celledød. Enhver egnet toxindel kan anvendes; det foretrækkes imidlertid at anvende toxiner, såsom ricintoxinet, diphtheriatoxinet, radio-30 isotope toxiner, membrankanal-dannende toxiner, osv. Fremgangsmåder til kobling af sådanne dele til et molekyle er velkendte indenfor teknikken.

Et antigent molekyle, såsom ICAM-1 eller medlemmer af LFA-1-familien af molekyler eksprimeres natur-35 ligvis på overfladen af lymfocytter. Indføringen af sådanne celler i egnede dyr, såsom ved intraperitoneal 12 DK 175577 B1 injektion, osv., vil således resultere i produktionen af antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-I eller medlemmer af LFA-l-familien af molekyler. Serummet fra et sådant dyr kan, om ønsket, fjernes og benyt-5 tes som en kilde for polyklonale antistoffer, der er i stand til at binde til disse molekyler. Det foretrækkes imidlertid at fjernes splenocytter fra sådanne dyr, at sammensmelte sådanne miltceller med en myelomacelleli-nie og lade sådanne fusionsceller danne en hybridoma-10 celle som secernerer monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-l eller medlemmer af LFA-1 familien af molekyler.

Hybridomacellerne, opnået på samme måde som beskrevet ovenfor, kan underkastes screening ved en række 15 fremgangsmåder til identificering af ønskede hybrido-maceller, som secernerer antistof, der er i stand til at binde enten til ICAM-l eller til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler. Ved en foretrukket screeningsprøve identificeres sådanne molekyler ved deres evne 20 til at inhibere aggregationen af Epstein-Barr virustransformerede celler. Antistoffer, der er i stand til at inhibere sådanne aggregationer, underkastes dernæst yderligere screening for at bestemme hvorvidt de in-hiberer sådan aggregation ved binding til ICAM-l, eller 25 ved at binde til et medlem af LFA-l-familien af molekyler. Ethver middel, der er i stand til at skelne ICAM-l fra LFA-l-familien af molekyler kan anvendes i en sådan screening. Antigenet bundet af antistoffet kan således f.eks. analyseres ved immunfaeldning og 30 polyacrylamidgelelektroforese. Hvis det bundne antigen er et medlem af LFA-l-familien af molekyler vil det immunofældede antigen således vise sig at være en dimer, hvorimod en enkelt molekylvægtdel vil være blevet immunofældet, hvis det bundne antigen er ICAM-l. Det er 35 desuden muligt at skelne mellem de antistoffer, som binder til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler, og DK 175577 B1 13 dem, som binder til ICAM-1, ved screening for antistoffets evne til at binde til celler, såsom granulocytter, som eksprimerer LFA-1, men ikke ICAM-1. Evnen af et antistof (som vides at inhibere cellulær aggregation) til 5 at binde til granulocytter indikerer, at antistoffet er i stand til at binde til LFA-1. Fraværet af sådan binding viser, at et antistof er i stand til at genkende ICAM-1. Et antistofs evne til at binde til en celle, såsom en granulocyt, kan påvises ved metoder, der 10 sædvanligvis anvendes af en fagmand. Sådanne metoder omfatter immunoassays, cellulær agglutination, filter-bindingsstudier, antistoffældning, osv.

De omhandlede anti-aggregationsantistoffer kan alternativt identificeres ved måling af deres evne til 15 differentielt at binde til celler, som eksprimerer ICAM-1 (såsom aktiverede endotelceller), og deres manglende evne til at binde til celler, som ikke eksprimerer ICAM-1. Som det vil være klart for en fagmand, kan ovennævnte prøver modificeres, eller udføres 20 i en anden rækkefølge til opnåelse af en række potentielle screeningsprøver, som hver er i stand til at identificere og skelne mellem antistoffer, der er i stand til at binde til iCMA-i kontra medlemmer af LFA-l-familien af molekyler.

25 De omhandlede anti-inflammatoriske midler kan opnås ved naturlige processer (såsom ved at få et dyr, en plante, svamp, bakterie, osv. til at producere en ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1, eller ved at få et dyr til at producere polyklonale antistoffer, der 30 er i stand til at binde til ICAM-1); ved syntetiske metoder (såsom under anvendelse af Merrifield's metode til syntetisering af polypeptider til syntetisering af ICAM-l, funktionelle derivater af ICAM-1, eller proteinantagonister af ICAM-1 (enten immunoglobulin eller 35 ikke-immunoglobulin)); ved hybridomateknologi (såsom fremstilling af monoklonale antistoffer, der er i stand 14 DK 175577 B1 til at binde til ICAM-1); eller ved rekombinant-teknologi (såsom fremstilling af de omhandlede anti-inflammatoriske midler i forskellige værter (dvs. gær, bakterier, svampe, dyrkede pattedyrsceller, osv.), el-5 ler fra rekombinante plasmider eller virusvektorer.).

Valget af den fremgangsmåde, der skal benyttes vil afhænge af faktorer, såsom anvendelighed, ønsket udbytte, osv. Det er ikke nødvendigt kun at benytte én af ovennævnte fremgangsmåder, metoder eller teknologier til 10 fremstilling af et særligt antiinflammatorisk middel; de ovennævnte metoder, fremgangsmåder og teknologier kan kombineres for at opnå et særligt antiinflammatorisk middel.

15 A. Identifikation af LFA-l-bindingspartneren (ICAM-1).

1. Prøver for LFA-l-afhængig aggregation.

Mange Epstein-Barr virustransformerede celler 20 udviser aggregation. Denne aggregation kan øges i nærværelse af phorbolestere. En sådan homotype aggregation (dvs. aggregation, der kun involverer en celletype) har vist sig at blive blokeret af anti-LFA-1-antistoffer (Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163: 25 1132-1149 (1986)), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisningen dertil). Graden af LFA-l-afhængig binding kan således bestemmes ved at bestemme graden af spontan eller phorbolesterafhængig aggregatdannelse.

Et middel som interfererer med LFA-l-afhængig 30 aggregation kan identificeres ved anvendelsen af en prøve, der er i stand til at bestemme hvorvidt et middel interfererer med den spontane eller den phorbole-ster-afhængige aggregation af Epstein-Barr virustransformerede celler. De fleste Epstein-Barr virus-35 transformerede celler kan anvendes i en sådan prøve så længe cellerne er i stand til at eksprimere LFA-l- 15 DK 175577 B1 receptormolekylet. Sådanne celler kan fremstilles i overensstemmelse med teknikken angivet af Springer, T.A. et_al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984), hvilken reference inkorporeres heri i kraft af hen-5 visningen dertil. Skønt enhver sådan celle kan anvendes i den LFA-1-afhængige bindingsprøve ifølge opfindelsen, foretrækkes det at benytte celler fra JY cellelinien (Terhost, C.T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7_3:910 (1976)). Cellerne kan dyrkes i erhvert egnet 10 dyrkningsmedium; det foretrækkes imidlertid at dyrke cellerne i RMPI 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% fetalt kalveserum og SO yg/ml gentamycin (Gibco Laboratories, NY). Cellerne bør dyrkes under betingelser, der er egnet for pattedyrcelleproliferation (dvs. ved en 15 temperatur på sædvanligvis 37°C, i en atmosfære med 5% C02, ved en relativ fugtighed på 95%, osv.).

2. LFA-l binding til ICAM-1.

20

Man har fundet mennesker, hvis lymfocytter mangler familien af LFA-1-receptormolekyler (Anderson, D.C. et al.. Fed. Proc. 44:2671-2677 (1985); Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668-689 (1985)). Sådanne 25 mennesker siges at lide af leukocytadhæsionsmangel (LAD). EBV-transformerede celler fra sådanne mennesker aggregerer hverken spontant eller i nærværelse af phor-bolestere i ovennævnte aggregationsprøve. Når sådanne celler blandes med LFA-l-eksprimerende celler obser-30 veredes aggregation (Rothlein, R. et al., J. Exper♦

Med. 163:1132-1149 (1986)) (fig. 1). Det er af stor vigtighed, at disse aggregater ikke dannes, hvis disse celler inkuberedes i nærværelse af anti-LFA-1 antistoffer. Skønt aggregationen krævede LFA-1, indikerede 35 LFA-l-deficiente cellers evne til at danne aggregater med LFA-l-holdige celler således at LFA-1 bindings- 16 DK 175577 B1 partneren ikke var LFA-1, men snarere et hidtil ukendt celleadhæsionsmolekyle. Fig. 1 viser den cellulære adhæsionsmekanisme.

5 B. Intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-I).

Det omhandlede intercellulære adhæsionsmolekyle ICAM-I blev først identificeret og delvis karakterise-10 ret i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Rothlein, R. et al. (J. Immunol. 137:1270-1274 (1986)), hvilken reference inkorporeres heri i kraft af henvisningen dertil. Til påvisning af ICAM-1-molekylet fremstilledes monoklonale antistoffer ud fra miltceller fra 15 mus, immuniseret med celler fra mennesker med genetisk defekt i LFA-l-ekspression. De opnåede antistoffer underkastedes screening for deres evne til at inhibere aggregationen af LFA-l-eksprimerende celler (fig. 2). Nærmere angivet immuniseredes mus med EBV-transformere-20 de B-celler fra LAD-patienter, som ikke eksprimerer LFA-l-antigenet. Milcellerne fra disse dyr fjernedes dernæst, sammensmeltedes med myelomaceller og fik lov til at blive monoklonale antistof-producerende hybrido-maceller. EBV-transformerede B-celler fra normale men-25 nesker, som eksprimerer LFA-1, inkuberedes dernæst i nærværelse af det monoklonale antistof fra hybridoma-cellen til identificering af ethvert monoklonalt antistof, som var i stand til at inhibere den phorbolester-medierede, LFA-1-afhængige, spontane aggregation af de 30 EBV-transformerede B-celler. Eftersom hybridomacellerne stammede fra celler, som aldrig havde stødt på LFA-l-antigenet, produceredes der intet monoklonalt antistof mod LFA-1. Ethvert antistof, som viste sig at inhibere aggregation, må således være i stand til at binde til 35 et antigen som, skønt det ikke er LFA-1, deltager i LFA-l-adhæsionsprocessen. Skønt enhver fremgangsmåde 17 DK 175577 B1 til opnåelse af sådanne monoklonale antistoffer kan benyttes, foretrækkes det at opnå ICAM-1-bindende monoklonale antistoffer ved immunisering af BALB/C-mus, idet de metoder og planer, der er beskrevet af 5 Rothlein, R. et al., (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)), benyttes med Epstein-Barr virustransformerede, perifere mononukleære blodceller fra mennesker med en LFA-l-defekt. Sådanne celler er angivet af Springer, T.A., et al., (J. Exper. Med. 160: 1901-1918 (1984)).

10 Ved en foretrukken fremgangsmåde til frembrin gelse og påvisning af antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, immuniseres mus med enten EBV-transformerede B-celler, som eksprimerer både ICAM-1 og LFA-l, eller mere foretrukket med TNF-aktiverede 15 endotelceller, der eksprimerer ICAM-l, men ikke LFA-1.

Ved den mest foretrukne fremgangsmåde til frembringelse af hybridomaceller, som producerer anti-ICAM-l-anti-stoffer, immuniseredes en Balb/C-mus efter hinanden med JY-celier og med differentierede U937-ceiier (ATCC CRL-20 1593). Miltcellerne fra sådanne dyr fjernedes, sammen- smeltedes med myelomaceller og fik lov til at udvikle sig til antistofproducerende hybridomaceller. Antistofferne underkastes screening for deres evne til at inhi-bere den LFA-l-afhængige, phorbolester-inducerede ag-25 gregation af en EBV-transformeret celleline, såsom JY-celler, der eksprimerer både LFA-1-receptoren og ICAM- 1. Som vist af Rothlein, R., et al., (J. Immunol. 137: 1270-1274 (1987)), testes antistoffer, der er i stand til at inhibere en sådan aggregation, dernæst for deres 30 evne til at inhibere den phorbolesterinducerede aggregation af en cellelinie, såsom SKW3 (Dustin, M., et al., J. Exper. Med. 165:672-692 (1987)) hvis evne til spontan aggregation i nærværelse af en phorbolester inhiberes af antistof, der er i stand til at binde 35 LFA-1, men ikke inhiberes af anti-ICAM-l-antistoffer. Antistoffer, der er i stand til at inhibere den phorbo- 18 DK 175577 B1 lester-inducerede aggregation af celler, såsom JY-celler, men som ikke er i stand til inhibere den phor-bolesterinducerede aggregation af celler, såsom SKW3-celler er sandsynligvis anti-ICAM-l-antistoffer. Alter-5 nativt kan antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1 identificeres ved screening for antistoffer, som er i stand til at inhibere den LFA-1-afhængige ag-, gregation af LFA-ekspressionsceller (såsom jY-celler), men som ikke er i stand til at binde til celler, der lo eksprimerer LFA-1, men kun lidt eller intet ICAM-1 (såsom normale granulocytter), eller som er i stand til at binde til celler, som eksprimerer ICAM-l, men ikke LFA-1 (såsom TNF-aktiverede endotelceller). Et andet alternativ er immunofældning fra celler, der eksprime-15 rer ICAM-1, LFA-1, eller begge, under anvendelse af antistoffer, der inhiberer den LFA-l-afhængige aggregation af celler, såsom JY-celler, og bestemmelse af visse molekylegenskaber af molekylet, der udfældede med antistoffet, gennem SDS-PAGE eller en ækvivalent 20 metode. Hvis egenskaberne er de samme som for ICAM-1, kan det antages, at antistoffet er et anti-ICAM-l-anti-stof.

Idet man benytter monoklonale antistoffer, der er fremstillet analogt med ovennævnte, rensedes ICAM-25 1-celleoverflademolekylet, og dets egenskaber bestemtes. ICAM-1 rensedes fra humane celler eller væv, idet monoklonalt-antistof-affinitetschromatogra-fi benyttedes. Ved en sådan fremgangsmåde kobles et monoklonalt antistof, der er reaktivt med ICAM-1 til en 30 inert kolonnematrix. Enhver fremgangsmåde til opnåelse af en sådan kobling kan benyttes; det foretrækkes imidlertid at benyttet fremgangsmåden beskrevet af Oettgen, H.C. et al., J. Biol, Chem. 259:12034 (1984)). Når et cellelysat passerer gennem matrixen adsorberes de til-35 stedeværende ICAM-1-molekyler og tilbageholdes af matrixen. Ved at ændre pH-værdien eller ionkoncentratio- 19 DK 175577 B1 nen i kolonnen kan de bundne iCAM-i-molekyler elueres fra kolonnen. Skønt enhver egnet matrix kan benyttes, foretrækkes det at anvende Sepharose (Pharmacia) som matrixmaterialet. Fremstillingen af kolonnematricer, og 5 deres anvendelse indenfor proteinrensning er velkendt indenfor teknikken.

På en måde som forstås af en fagmand, kan ovennævnte prøver benyttes til identificering af forbindelser, der er i stand til at dæmpe eller inhibere graden 10 eller udstrækningen af cellulær adhæsion.

ICAM-1 er et celleoverfladeglycoprotein ekspri-meret på ikke-hematopoietiske celler, såsom vaskulære endotelceller, thymusepitelceller, visse andre epitelceller, og fibroblaster, og på hæmatopoietiske celler, 15 såsom vævsmakrofager, mitogen-stimulerede T-lymfocyt-blaster, og germinale, centrerede B-celler og dendrit-celler i tonsiler, lymfeknuder og "Peyer's-patches".

ICAM-1 eksprimeres stærkt på vaskulære endotelceller i T-celleområder i lymfeknuder og tonsiler, der udviser 20 reaktiv hyperplasia. ICAM-1 eksprimeres i små mængder på perifere blodlymfocytter. Phorbolesterstimuleret differentiering af visse myelomonocytiske cellelinier øger ICAM-l-ekspressionen kraftigt. ICAM-1 eksprimeres således fortrinsvis på steder med inflammation og eks-25 primeres generelt ikke af passive celler. ICAM-l-eks-pression på dermale fibroblaster øges 3-5 gange med enten interleukin 1 eller y-interferon i koncentrationer på 10 E/ml i løbet af henholdsvis 4 eller 10 timer. Induktionen er afhængig af protein- og mRNA-syntese og 30 er reversibel.

ICAM-1 udviser molekylvægtuensartethed i forskellige celletyper med en molekylvægt på 97 kd i fibroblaster, 114 kd i den myelomonocytiske celleline U937 og 90 kd i B-lymfoblastoidcellen JY. iCAM-l-bio-35 syntese har vist sig at involvere en ca. 7 3 kd inter-cellulær precursor. Den ikke-N-glycosylerede form, der 20 DK 175577 B1 stammer fra tunicamycinbehandling (som inhiberer glyco-sylering) har en molekylvægt på 55 kd.

ICAM-l isoleret fra phorbolesterstimulerede U937-celler eller fra fibroblastceller giver et til-5 svarende hovedprodukt med en molekylvægt på 60 kd efter kemisk deglycosylering. ICAM-l monoklonale antistoffer interfererer med adhæsionen af phytohæmagglu-tininblaster til LFA-l-deficiente celleliner. Forbehandling af fibroblaster, men ikke lymfocytter, med 10 monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde ICAM-l, inhiberer lymfocyt-fibroblastadhæsion. Forbehandling af lymfocytter, men ikke fibroblaster, med antistoffer mod LFA-1 har også vist sig at inhibere lymfocyt-fibroblastadhæsion.

15 ICAM-l er således CD 18 kompleksets bindings ligand på leukocytter. Det er inducerbart på fibroblaster og endotelceller in vitro ved inflammatoriske mediatorer, såsom IL-1, y-interferon og tumornecrosis-faktor indenfor en tidsramme, der er i overensstemmelse 20 med infiltrationen af lymfocytter i inflammatoriske læsioner in vivo (Dustin, M.L., et al., J. Immunol 137:245-254, (1986); Prober, J.S., et. al., J. Immunol 137:1893-1896, (1986)). ICAM-l eksprimeres yderligere på ikke-hæmatopoietiske celler, såsom vaskulære endotel-25 celler, thymusepitelceller, andre epitelceller, og fibroblaster og på hæmatopoietiske celler, såsom vævsmakrofager, mitogen-stimulerede T-lymfocytblaster, og germinalcenter-B-celler og dendritceller i tonsiler, lymfeknuder og "Peyer's patches" (Dustin, M.L. et.

30 al., J. Immunol 137:245-254, (1986)). ICAM-l eksprime res på keratinocytter i godartede inflammationsskader såsom allergisk eksem, lichen ruber, exanthema, urticaria og sygdomme med blæredannelse. Allergiske hudreaktioner, provokeret ved påførsel af et hapten på huden 35 overfor hvilket patienten er allergisk, viste også en kraftig ICAM-l-ekspression på keratinocytter. på den 21 DK 175577 B1 anden side viste toxiske lapper på huden ikke ICAM-1-ekspression på keratinocytterne. ICAM-1 findes på kera-tinocytter fra biopsier af hudskader fra forskellige dermatologiske sygdomme og ICAM-1-ekspression induceres 5 på skader fra allergiske lappetests, medens keratino-cytter fra toxiske lappetestskader ikke eksprimerede ICAM-1.

ICAM-1 er derfor et cellesubstrat til hvilket lymfocytter kan fæstnes, således at lymfocytterne kan 10 migrere til steder med en inflammation og/eller gennemføre forskellige effektorfunktioner som bidrager til denne inflammation. Sådanne funktioner omfatter produktionen af antistof, lysis af virusinficerede målceller, osv. Udtrykket “inflammation", sådan som 15 det benyttes heri, skal kun omfatte reaktioner fra det specifikke og ikke-specifikke forsvarssystem. Sådan som det benyttes heri skal udtrykket "specifikt forsvarssystem" referere til den bestanddel i immunsystemet, som reagerer i nærværelse af specifikke antigener. In-20 flammation siges at opstå som en reaktion fra det specifikke forsvarssystem, hvis inflammationen er forårsaget af, medieret af, eller knyttet til en reaktion fra det specifikke forsvarssystem. Eksempler på inflammationer, som opstår fra en reaktion fra det specifikke 25 forsvarssystem omfatter reaktionen overfor antigener, såsom rubellavirus, autoimmunsygdomme, forsinket type af hypersensitivitetreaktion medieret af T-celler (som det f.eks. ses hos mennesker, hvis test er "positiv" i Mantaux-testen), osv.

30 En "ikke-specifik forsvarssystemsreaktion" er en reaktion medieret af leukocytter uden immunologisk hukommelsesevne. Sådanne celler indbefatter granulocyt-ter og makrofager. Som anvendt heri siges inflammation at opstå som en reaktion fra det ikke-specifikke for-35 svarssystem, hvis inflammationen er forårsaget af, medieret af eller knyttet til en reaktion fra det ikke- 22 DK 175577 B1 specifikke forsvarssystem. Eksempler på inflammation, som hidrører i det mindste delvis fra en reaktion fra det ikke-specifikke forsvarssystem, indbefatter inflammation forbundet med tilstande såsom: "adult 5 respiratory distress syndrom (ARDS) eller multiple organlæsionssyndromer som sekundære syndromer til septicaemia eller trauma, reperfusionslæsion af myocardia-væv eller andre væv, akut glomerulonephritis, reaktiv arthritis, dermatoser med akutte imflammatoriske kompo-10 nenter; akut purulent meningitis eller andre inflammatoriske lidelser i centralnervesystemet; termisk beskadigelse, hæmodialyse; leukapheresis, ulcerativ colitis,

Crohn's sygdom; nekrotiserende enterocolitis; granulo-cyt-transfusionassocierede syndromer, og cytokin-indu-15 ceret toksicitet.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse kan ICAM-1 funktionelle derivater, og specielt sådanne derivater som omfatter fragmenter eller mutantvarianter af ICAM-1, der har domæner 1, 2 og 3, anven-20 des til behandling eller terapi af sådanne reaktioner fra det ikke-specifikke forsvarssystem. Mere foretrukket til sådan behandling eller terapi er ICAM-l fragmenter eller mutant-varianter, der indeholder domæne 2 fra ICAM-1. Mest foretrukket til sådan behandling eller 25 terapi er ICAM-1 fragmenter eller mutant-varianter, der indeholder domæne 1 fra ICAM-1.

C. Kloning af ICAM-l-genet.

30

Enhver af en række forskellige metoder kan benyttes til kloning af ICAM-l-genet. En sådan fremgangsmåde medfører analyse af et pendulvektorbibliotek af cDNA-indføj eiser {stammende fra en ICAM-1-eksprime- 23 DK 175577 B1 rende celle) for tilstedeværelsen af en indføjelse, som indeholder lCAM-1-genet. En sådan analyse kan gennemføres ved transfektion af celler med vektoren og dernæst prøvning for ICAM-l-ekspression. Den foretrukne frem-5 gangsmåde til kloning af dette gen medfører bestemmelse af ICAM-1-molekylets aminosyresekvens. Til gennemførsel af denne opgave skal ICAM-1-protein renses og analyseres af automatiserede sekvenatorer. Molekylet kan alternativt underkastes fragmentering med bromcyan eller 10 med proteaser, såsom papain, chymotrypsin eller trypsin (Oike, Y. et al., J. Biol. Chem. 257:9751-9758 (1982);

Liu, C. et al ♦, Int. J. Pept. Protein Res. 21:209-215 (1983)).

Skønt det er muligt at bestemme ICAM-1's hele 15 aminosyresekvens, foretrækkes det at bestemme sekvensen af peptidfragmenter af molekylet. Hvis peptiderne er mere end 10 aminosyrer lange, er sekvensinformationen sædvanligvis tilstrækkelig til at man kan klone et gen, såsom genet for ICAM-1.

20 Sekvensen af aminosyrerester i et peptid be tegnes heri enten gennem anvendelsen af deres sædvanligt anvendte 3-bogstavsbetegnelser eller ved deres enkelt-bogstavsbetegnelser. En liste af disse 3-bog-stavs- og 1-bogstavsbetegnelser kan findes i lære-25 bøgér såsom Biochemistry, Lehninger, A. , Worth Publishers, New York, NY (1970). Når en sådan sekvens opføres lodret, er det meningen at amino-terminal-resten skal stå øverst på listen og carboxy-terminal-resten af peptidet skal stå nederst på listen. Når sekvensen op-30 føres vandret er det på samme måde meningen at amino-terminal-resten skal stå til venstre, hvorimod carboxy-terminal-resten skal stå til højre. Aminosyreresterne i et peptid kan adskilles med bindestreger.

Sådanne bindestreger tilsigter alene at lette præsen-35 tationen af en sekvens. Som et rent illustrativt eksempel indikerer aminosyresekvensen betegnet: 24 DK 175577 B1 -Gly-Ala-Ser-Phe- at en Ala-rest er bundet til Gly's carboxygruppe, og at 5 en Ser-rest er bundet til Ala-restens carboxygruppe og til en Phe-rests aminogruppe. Betegnelsen indikerer yderligere at aminosyresekvensen indeholder tetrapepti-det Gly-Ala-Ser-Phe. Det er ikke hensigten at betegnelsen skal begrænse amiosyresekvensen til dette ene te-10 trapeptid, men det er hensigten at inkludere (1) tetra-peptidet indeholdende en eller flere aminosyrerester, bundet til enten dets amino- eller carboxyende, (2) tetrapeptidet indeholdende en eller flere aminosyre-rester, bundet til både dets amino- og carboxyende, 15 (3) tetrapeptidet uden nogen yderligere aminosyrerester .

Når først et eller flere passende egnede peptidfragmenter er blevet sekvenseret, undersøges DNA-sekvenser , der er i stand til at kode for dem. Fordi den 20 genetiske kode er degenereret, kan mere end et Jcodon benyttes til at kode for en bestemt aminosyre (Watson, J.D., I: Molecular Biology of the Gene, 3. udg., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), s. 356-357). Peptidfragmenterne analyseres til identificering af 25 sekvenser af aminosyrer, som kan kodes af oligonukleo-tider med den laveste grad af degenerering. Dette gennemføres fortrinsvis ved identificering af sekvenser, som indeholder aminosyrer, der kun kodes af et enkelt kodon. Skønt sådanne aminosyresekvenser en gang imellem 30 kan kodes af kun et enkelt oligonucleotid kan amino-syresekvensen ofte kodes af et vilkårlig nucleotid fra et sæt af lignende oligonucleotider. Medens alle medlemmer af sættet indeholder oligonucleotider, som er i stand til at kode for peptidfragmentet, og således 35 potentielt indeholder den samme nucleotidsekvens som genet, der koder for peptidfragmentet, er det væsent- 25 DK 175577 B1 ligt at kun et medlem af sættet indholder en nucleotid-sekvens, der er identisk med dette gens nukleotid-sekvens. Fordi dette medlem findes i sættet og er i stand til at hybridisere til DNA, selv i nærværelse af 5 andre medlemmer i sættet, er .det muligt at benytte det ufraktionerede sæt af oligonucleotider på samme måde som man ville anvende en enkelt oligonucleotid til kloning af genet, som koder for peptidet.

På en måde nøjagtigt analog med ovennævnte kan 10 man anvende et oligonucleotid (eller sæt af oligonucleotider), som indeholder en nucleotidsekvens, som er komplementær til oligonucleotidsekvensen eller sættet af sekvenser, der er i stand til at kode for peptidfragmentet.

15 Et egnet oligonucleotid eller sæt af oligo nucleotider, som er i stand til at kode for et fragment af ICAM-1-genet (eller som er komplementært til et sådant oligonucleotid, eller sæt af oligonucleotider) identificeres (idet ovennævnte fremgangsmåde be-20 nyttes), syntetiseres og hybridiseres, ved metoder der er velkendte indenfor teknikken, overfor et DNA eller, mere foretrukket, et cDNA-præparat, som stammer fra humane celler, der er i stand til at eksprimere ICAM-1-gensekvenser. Metoder til nucleinsyrehybridisering er 25 angivet af Maniatis, T. et al., I: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY (1982), og af Haymes, B.D. et al., I: Nucleic Acid Hybrization, a Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), hvilke referencer inkorporeres heri ved henvisning.

30 Den benyttede DNA eller cDNA kilde vil fortrinsvis være blevet beriget for ICAM-l-sekvenser. En sådan berigelse kan lettest opnås ud fra cDNA opnået ved ekstraktion af RNA fra celler dyrket under betingelser som inducerer ICAM-l-syntese (såsom U937 dyrket i nær-35 værelse af phorbolestere, osv.).

Teknikker såsom, eller svarende til dem, der er beskrevet ovenfor, har med succes muliggjort kloning af 26 DK 175577 B1 gener til human aldehyd-dehydrogenaser (Hsu, L.C.

et_al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3771-3775 (1985)), fibronectin (Suzuki, S. et al., Eur. Mol.

Biol. Organ. J. 4:2519-2524 (1985)), det humane 5 estrogen-receptorgen (Walter, P. et al., Proc, Natl.

Acad. Sci. USA 82:7889-7893 (1985)), vævstype plasmino-gen-aktivator (Pennica, D. et al♦, Nature 301:214-221 (1983)) og humant ende-placental-alkalisk-phosphatase-komplementært-DNA (Kam, W. et al♦, Proc. Natl. Acad.

10 SCI. USA 82:8715-8719 (1985)).

Ved en foretrukken alternativ fremgangsmåde til kloning af ICAM-l-genet fremstilles et bibliotek af ekspressionsvektorer ved kloning af DNA eller, mere foretrukket cDNA, fra en celle, der er i stand til at 15 eksprimere ICAM-1 ind i en ekspressionsvektor. Biblioteket screenes dernæst for medlemmer, der er i stand til at eksprimere et protein, som binder til anti-ICAM-l-antistof, og som har en nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for polypeptider, som har den samme 20 aminosyresekvens som ICAM-l eller fragmenter af ICAM-1.

Det klonede ICAM-1-gen, opnået gennem ovennævnte fremgangsmåder, kan bindes operabelt til en ekspressionsvektor og indføres i bakterie- eller eukaryotiske 25 celler til produktion af ICAM-l-protein. Teknikker for sådanne manipulationer er angivet af Maniatis. T. et al., supra, og er velkendte indenfor teknikken.

30 D. Anvendelser af prøver for LFA-l-afhængig aggregation.

Ovennævnte prøve, hvor man er i stand til at måle LFA-l-afhængig aggregation kan benyttes til identi-35 fikation af mdiler, der virker som antagonister til inhibering af omfanget af LFA-l-afhængig aggregation.

•27 DK 175577 B1 Sådanne antagonister kan virke ved at svække LFA-1 eller ICAM-l's evne til at formidle aggregation. Sådanne midler omfatter således immunoglobuliner, såsom et antistof der er i stand til at binde til enten LFA-1 el-5 ler ICAM-1. Ikke-immunoglobuline (dvs. kemiske) midler kan yderligere undersøges under anvendelse af ovennævnte prøve, for at bestemme om de er antagonister til LFA-1-aggregation.

10 E. Anvendelser af antistoffer, der er 1 stand til at binde til ICAM-1 receptorproteiner.

I. Anti-inflammatoriske midler.

15

Monoklonale antistoffer til medlemmer af CD 18-komplekset inhiberer mange leukocytters adhæsionsafhængige funktioner, herunder binding til endothelium (Haskard, D., et al., J. Immunol. 137:2901-2906 20 (1986)), homotypiske adhæsioner (Rothlein, R., et al., J. Exp. Med. 163:1132-1149 (1986)), antigen- og mito-geninduceret proliferation af lymfocytter (Davignon, D., et al., Proc. Natl. Acad, Sci., USA 78:4535-4539 (1981)), antistofdannelse (Fischer, A., et al. , J.

25 Immunol. 136:3198-3203 (1986)), og alle leukocytters effektorfunktioner, såsom cytotoxiske T-cellers lytiske aktivitet (Krensky, A.M., et al. J. Immunol. 132: 2180-2182 (1984)), makrofager (Strassman, G., et al.

J. Immunol. 136:4328-4333 (1986)), og alle celler in-30 volveret i antistof-afhængige cellecytotoxiske reaktioner (Kohi, S., et al., J. Immunol. 133:2972-2978 (1984)). I alle ovennævnte funktioner inhiberer antistofferne leukocyttens evne til at hæfte til det passende cellesubstrat, som på sin side inhiberer det en-35 delige resultat.

Som omtalt ovenfor er bindingen af ICAM-l-mole-kyler til medlemmer af LFA-l-familien af molekyler af 28 DK 175577 B1 stor vigtighed ved cellulær adhæsion. Gennem adhæsionsprocessen er lymfocytter i stand til kontinuert at undersøge et dyr for nærværelsen af fremmede antigener.

Skønt disse processer normalt er ønskelige, er de også 5 årsagen til organtransplantationafvisning, vævstransplantationafvisning og mange autoimmune sygdomme. Ethvert middel, der er i stand til at dæmpe eller inhibe-re cellulær adhæsion, vil således være meget ønskværdigt hos patienter, der underkastes organtransplanta-10 tioner, vævstransplantationer eller hos autoimmune patienter.

Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-l, er særdeles egnede som antiinflamma-toriske midler hos et pattedyr eller menneske. Sådanne 15 midler adskiller sig i væsentlig grad fra sædvanlige antiinflammatoriske midler, idet de er i stand til selektivt at inhibere adhæsion og ikke giver andre bivirkninger såsom nephrotoxicitet, som findes hos sædvanlige midler. Monoklonale antistoffer, der er i stand 20 til at binde til ICAM-l kan derfor benyttes til at hindre organ- eller vævsafvisning, eller modificere autoimmune reaktioner uden frygt for sådanne bivirkninger hos pattedyret eller mennesket.

Det er af stor vigtighed, at anvendelsen af mo-25 noklonale antistoffer, der er i stand til at genkende ICAM-l, muliggør gennemførsel af organtransplantationer selv mellem individer med stort HLA-uensartethed.

30 2. Suppressorer af forsinket-type-hypersensibili- tetsreaktion.

Da ICAM-l-molekyler oftest eksprimeres på steder med inflammation, såsom de steder, der er in-35 volveret i forsinket-type-hypersensibilitetsreaktion, har antistoffer (især monoklonale antistoffer), der er 29 DK 175577 B1 i stand til at binde til ICAM-l-molekyler, terapeutisk mulighed for at dæmpe eller eliminere sådanne reaktioner. Denne mulige terapeutiske anvendelse kan udnyttes på to måder. For det første kan et middel in-5 deholdende et monoklonalt antistof overfor ICAM-1 administreres til en patient, der lider af forsinket-type-hypersensibilitetsreaktion. Sådanne midler kan f.eks. gives til et individ, som har været i kontakt med antigener såsom giftig efeu, giftig eg, osv. ved en 10 anden udførelsesform administreres det monoklonale antistof, der er i stand til at binde til ICAM-l, til en patient sammen med et antigen, for at hindre en efterfølgende inflammationsreaktion. Denne co-administrerlng af et antigen og et ICAM-l-bindende 15 monoklonalt antistof kan således midlertidigt få et individ til efterfølgende at tolerere udsættelse for dette gen. 1 3. Behandling af kronisk inflammationssyqdom.

Eftersom LAD-patienter som mangler LFA-1 ikke opnår en inflammatorisk reaktion, formodes det at antagonisme af LFA-1's naturlige ligand, ICAM-1, også vil 25 inhibere en inflammatorisk reaktion. Antistoffers evne til overfor ICAM-1 at inhibere inflammation tilvejebringer det grundlæggende for deres terapeutiske anvendelse ved behandlingen af kroniske inflammationssygdomme og autoimmune sygdomme, såsom lupus erythematosus, 30 autoimmun thyroiditis, eksperimentel allergisk encephalomyelitis (EAE) multipel sclerosis, visse former for diabetes Reynaud's syndrom, rheumatoid arthritis, osv.

Sådanne antistoffer kan også anvendes som terapi ved behandling af psoriasis. De monoklonale antistoffer, 3 5 der er i stand til at binde ICAM-l, kan sædvanligvis anvendes til behandingen af disse sygdomme, der for ti- 30 DK 175577 B1 den behandles gennem steroidterapi.

4. Diagnostiske og prognostiske anvendelser.

5

Da ICAM-1 oftest eksprimeres på steder med inflammation kan monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-1, anvendes som et middel til at beskrive eller visualisere steder med infektion og 10 inflammation hos en patient. Ved en sådan anvendelse mærkes de monoklonale antistoffer detekterbart gennem anvendelsen af radioisotoper, affinitetsmærker (såsom biotin, avidin, osv.) fluorescerende markører, para-magnetiske atomer, osv. Fremgangsmåder til gennemførel-15 se af en sådan mærkning er velkendte inden for teknikken. Klinisk anvendelse af antistoffer til diagnostisk beskrivelse er angivet af Grossman, H.B., Urol. Clin.

North Amer. 1^:465-474 (1986)), Unger, E.C. et al..

Invest. Radiol. 2O:693-700 (1985)), og Khaw, B.A. et 2° al., Science 209:295-297 (1980)).

Tilstedeværelsen af inflammationen kan desuden påvises gennem anvendelsen af bindingsligander, såsom mRNA, cDNA eller DNA, som binder til ICAM-1-gensekvenser eller til ICAM-l-mRNA-sekvenser hos celler 25 som eksprimerer ICAM-1. Teknikker til gennemførelse af sådanne hybridiseringsprøver er beskrevet af Maniatais, T. (supra).

Påvisningen af foci af sådanne detekterbart mærkede antistoffer er angivende for et sted med inflamma-30 tion eller tumorudvikling. Ved en udførelsesform gennemføres denne undersøgelse for inflammation ved at fjerne vævsprøver eller blod og inkubere sådanne prøver i nærværelse af detekterbart mærkede antistoffer. Ved en foretrukken udførelsesform gennemføres denne teknik 35 på en ikke-invasiv måde gennem anvendelse af magnetisk billedoptagelse, fluorografi, osv. En sådan diagnostisk 31 DK 175577 B1 test kan benyttes ved overvågning af organtransplantat-modtagere for tidlige tegn på potentiel vævsafvisning.

Sådanne prøver kan desuden gennemføres i forsøg på at bestemme et individs predilektion for rheumatoid 5 arthritis eller andre kroniske inflammationssygdomme.

5. Supplement til indføringen af antiqent materiale administreret til terapeutiske eller diagnostiske 10 formål.

Immunreaktioner overfor terapeutiske eller diagnostiske midler, såsom bovint insulin, interferon, vævstype-plasminogen-aktivator eller murine monoklonale 15 antistoffer, svækker i væsentlig grad den terapeutiske eller diagnostiske værdi af sådanne midler, og kan faktisk forårsage sygdomme såsom serumsygdom. En sådan situation kan afhjælpes gennem anvendelsen af de omhandlede antistoffer. Ved denne udførelsesform vil så-20 danne antistoffer blive administreret sammen med det terapeutisk eller diagnostisk middel. Tilsætningen af antistofferne hindrer modtageren i at genkende midlet og hindre derfor modtageren i initiering af en immunreaktion overfor dette. Fravær af en sådan immun-25 reaktion gør det muligt for patienten at modtage yderligere administreringer af det terapeutiske eller diagnostiske middel.

30 F. Anvendelser af intercellulær adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1).

ICAM-1 er en bindingspartner af LFA-1. ICAM-1 eller dets funktionelle derivater kan som sådan an-35 vendes ombytteligt med antistoffer, der er i stand til at binde til LFA-1, ved behanding af sygdom. I opløst 32 DK 175577 B1 form kan sådanne molekyler således anvendes til in-hibering af inflammation, organafvisning, vævsafvisning, osv. ICAM-1 eller dets funktionelle derivater kan benyttes på samme måde som anti-ICAM-l-antistoffer 5 til at mindske immunogeniciteten af terapeutiske eller diagnostiske midler.

ICAM-1, dets funktionelle derivater og dets antagonister kan benyttes til blokering af metastasis eller proliferation af tumorceller, som eksprimerer 10 enten ICAM-1 eller LFA-1 på deres overflader. En lang række fremgangsmåder kan benyttes til opnåelse af et sådant mål. Migreringen af hæmatopoietiske celler kræver f.eks. LFA-l-ICAM-l-binding. Antagonister af en sådan binding undertrykker derfor denne migrering og 15 blokerer metastasis af tumorceller af leukocyt-herkomst. Toxin-derivatiserede molekyler, der er i stand til at binde til enten ICAM-1 eller et medlem af LFA-l-familien af molekyler kan alternativt administreres til en patient. Når sådanne toxinafledte molekyler 20 binder til tumorceller, der eksprimerer ICAM-1 eller et medlem af LFA-l-familien af molekyler, dræber tilstedeværelsen af toxinet tumorcellerne, hvorved proliferation af tumoren inhiberes.

25 G. Anvendelser af ikke-lmmunoqlobuline antagonister af ICAM-1-afhængig adhæsion.

ICAM-l-afhængig adhæsion kan inhiberes ved hjælp 30 af ikke-immunoglobuline antagonister, der er i stand til at binde til enten ICAM-1 eller LFA-1. Et eksempel på en ikke-immunoglobulin antagonist af ICAM-1 er LFA-l. Et eksempel på en ikke-immunoglobulin antagonist, som binder til LFA-1, er ICAM-1. Gennem anvendel-35 sen af de ovennævnte prøver kan yderligere ikke-immunoglobuline antagonister identificeres og renses. Ikke- 33 DK 175577 B1 immunoglobuline antagonister af ICAM-l-afhængig adhæsion kan benyttes til det samme formål som antistoffer mod LFA-1 eller antistoffer mod ICAM-1.

5 H. Administrering af de omhandlede midler.

De terapeutiske virkninger af ICAM-I kan opnås ved at forsyne en patient med hele ICAM-l-molekylet el-10 ler ethvert terapeutisk aktivt peptidfragment deraf.

ICAM-1 og dets funktionelle derivater kan opnås enten syntetisk, gennem anvendelsen af rekombinant-DNA-teknologi, eller ved proteolyse. De terapeutiske fordele ved ICAM-1 kan øges gennem anvendelsen af funktio-15 nelle derivater af ICAM-1, der indeholder yderligere tilsatte aminosyrerester, for at øge koblingen til bærere eller øge aktiviteten af ICAM-l. Opfindelsen omfatter yderligere funktionelle derivater af ICAM-1, som mangler visse aminosyrerester, eller som inde-20 holder ændrede aminosyrerester, så længe sådanne derivater besidder evnen til celluæradhæsionspåvirkning .

Både de omhandlede antistoffer og det nævnte ICAM-1-molekyle siges at være "i det væsentlige uden 25 naturlig forurening", hvis præparaterne, som indeholder disse, i det væsentlige ikke indeholder materialer, som normalt og naturligt findes i disse produkter.

Den foreliggende opfindelse angår antistoffer og biologisk aktive fragmenter deraf (enten polyklonale 30 eller monoklonale), som er i stand til at binde til ICAM-1. Sådanne antistoffer kan fremstilles enten i dyr eller på vævskulturer eller ved rekombinant-DNA-midler.

Når man giver en patient antistoffer, eller 35 fragmenter deraf, der er i stand til at binde til ICAM-1, eller når man giver ICAM-1 (eller et fragment, 34 DK 175577 B1 variant eller derivat deraf) til en modtagende patient, vil dosis af administreret middel variere afhængigt af sådanne faktorer som patientens alder, vægt, højde, køn, generelle medicinske tilstand, tidligere medicin-5 ske historie, osv. Det er sædvanligvis ønskeligt at forsyne modtageren med en dosis antistof, som ligger indenfor området fra ca. 1 pg/kg til 10 mg/kg (patientens kropsvægt), idet dog en mindre eller større dosis kan administreres. Når man til en patient administrerer 10 iCAM-i-molekyler eller deres funktionelle derivater, foretrækkes det at administrere sådanne molekyler i en dosis, som også ligger i området fra ca. 1 pg/kg til 10 mg/kg (patientens kropsvægt), idet dog en mindre eller større dosis også kan administreres.

15 Som omtalt nedenfor kan den terapeutiske virk ningsfulde dosis mindskes, hvis anti-lCAM-l-anti-stoffet co-administreres med et anti-LFA-l-antistof.

Som benyttet heri siges en forbindelse at blive co-ad-ministreret med en anden forbindelse, når administre-20 ringen af de to forbindelser tidsmæssigt ligger så tæt på hinanden, at begge forbindelser kan påvises samtidig i patientens serum.

Både antistoffet, der er i stand til at binde til ICAM-1, og ICAM-1 i sig selv kan administreres til 25 patienter intravenøst, intramuskulært, subkutant, en-teralt eller parenteralt. Når antistof eller ICAM-l administreres ved injektion, kan administreringen ske ved kontinuer infusion, eller ved hjælp af en enkel eller flere boli.

30 Det er med de omhandlede anti-inflammatoriske midler tilsigtet at give dem til modtagende individer i en mængde, der er tilstrækkelig til at undertrykke inflammation. En mængde siges at være tilstrækkelig til at "undertrykke" inflammation, hvis dosis, administra-35 tionsmåde, osv af midlet, er tilstrækkelig til at dæmpe eller hindre inflammation.

35 DK 175577 B1

Anti-ICAM-1-antistof, eller et fragment heraf, kan administreres enten alene eller i kombination med et eller flere yderligere immunosuppressive midler (specielt til en modtager af et organ- eller vævstrans-5 plantat). Administreringen af en sådan eller sådanne forbindelser kan have enten et "profylaktisk" eller "terapeutisk" formål. Ved profylaktisk administrering administreres den eller de immunosuppressive forbindelser før nogen som helst inflammatorisk reaktion eller 10 symptom (f.eks. før, samtidig med eller kort efter tidspunktet for en organ- eller vævstransplantation, men forud for nogen.som helst symptomer på organafvisning eller -afstødning). Den profylaktiske administrering af forbindelsen eller forbindelserne tjener til 15 at forhindre eller svække enhver efterfølgende inflammatorisk reaktion (som f.eks. afstødning af et transplanteret organ eller væv osv.), ved terapeutisk administrering administreres den eller de immunosuppressive forbindelser ved (eller kort efter) indtræden af et 20 symptom på egentlig inflammation (som f.eks. organeller vævsafstødning. Den terapeutiske administrering af forbindelsen eller forbindelserne tjener til at svække enhver egentlig inflammation (som f.eks. afstødningen af et transplanteret organ eller væv). De anti-25 inflammatoriske midler ifølge den foreliggende opfindelse kan således administreres enten før indtræden af inflammation (til undertrykkelse af en forventet inflammation) eller efter starten af inflammationen.

Et middel siges at være "farmakologisk accepta-30 belt" hvis dets administrering kan tolereres af en modtagende patient. Et sådant middel siges at blive administreret i en "terapeutisk virkningsfuld mængde", hvis den administrerede mængde er fysiologisk signifikant. Et middel er fysiologisk signifikant, hvis dets 35 tilstedeværelse resulterer 1 en påviselig ændring i fysiologien hos en modtagende patient.

36 DK 175577 B1

Antistoffet og ICAM-1-molekyler ifølge opfindelsen kan formuleres i overensstemmelse med kendte fremgangsmåder til fremstilling af farmaceutisk nyttige midler, hvor disse materialer eller deres funktionelle 5 derivater kombineres i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærevehikel. Egnede vehikler og deres formulering, herunder andre humane proteiner, f.eks. humant serum albumin, er beskrevet f.eks. i Remington's Pharmaceutical Sciences (16. udg., Osol, A., Ed., Mack, 10 Easton PA (1980)). For at danne et farmaceutisk acceptabelt middel, der er egnet til effektiv administrering, vil sådanne midler indeholde en virkningsfuld mængde af ant i-ICAM- antistof eller ICAM-l-molekyle eller deres funktionelle derivater, sammen med en egnet 15 mængde af et bærevehikel.

yderligere farmaceutiske fremgangsmåder kan anvendes til at kontrollere virkningsvarigheden. Præparater med kontrolleret frigivelse kan opnås ved anvendelsen af polymere til kompleksdannelse eller absorp-20 tion af anti-ICAM-l-antistof eller ICAM-1 eller deres funktionelle derivater. Den kontrollerede tilførsel kan gennemføres ved at vælge passende makromolekyler (f.eks. polyestere, polyaminosyrer, polyvinylpyrroli-don, ethylenvinylacetat, methylcellulose, carboxyme-25 thylcellulose eller protamin-sulfat) og koncentrationen af makromolekyler samt fremgangsmåderne til inkorporering, for at kontrollere frigivelse. En anden egnet fremgangsmåde til at kontrollere virkningsvarighed hos præparater med kontrolleret frigivelse er inkorporering 30 af anti-ICAM-l-antistof eller ICAM-l-molekyler, eller deres funktionelle derivater, i partikler af et polymert materiale, såsom polyestere, polyaminosyrer, hy-drogeler, poly(mælkesyre) eller ethylenvinylacetatco-polymerer. I stedet for inkorporering af disse midler i 35 polymere partikler er det alternativt muligt at indeslutte disse materialer i mikrokapsler fremstillet 37 DK 175577 B1 f.eks. ved coacerveringstekflikker eller ved grænsefladepolymerisation, f.eks. henholdsvis hydroxymethyl- cellulose- eller gelatinemikrokapsler og poly(methyl-methacrylat)mikrokapsler, eller i kolloide medikament-5 tilførselssystemer, f.eks. liposomer, albumin-mikro kugler, mikroemulsioner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsioner. Sådanne teknikker er beskrevet i Reminton's Pharmaceutical Sciences (1980).

Efter således at have bekrevet opfindelsen gene-10 relt, belyses den nu nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, som ikke skal være begrænsende for opfindelsen, med mindre det er angivet nærmere.

Eksempel 1 15 Dyrkning af pattedyrceller.

De omhandlede EBV-transformerede og hybridoma-celler opbevaredes generelt i RMPI 1640 dyrkningsmedium, suppleret med 20 mM L-glutamin, 50 yg/ml gentamicin og 10% fetal bovin- (eller fetal kalve-) serum.

20 Cellerne dyrkedes ved 37°C i en atmosfære med 5% C02, 95% luftfugtighed.

Til etablering af Epstein-Barr virus-(EBV-) transformanter inkuberedes 106 T-celle-fattige perifere mononukleære blodceller/ml i RPMI 1640 medium, supple-25 ret med 20% fetal kalveserum (FCS) , og 50 )jg/ml gentamicin i 16 timer med EBV-holdig supernatant af B95-8-celler (Thorley-Lawson, D.A. et al. , J. Exper.

Med. 146:495 (1977)). Celler i 0,2 ml aliquot anbragtes i 10 mikrotiterbrønde. Mediet erstattedes med RPMI 30 1640 medium (suppleret med 20% fetal kalveserum og 50 yg/ml gentamicin) indtil cellevækst konstateredes.

Cellerne voksede i de fleste brønde og ekspanderedes i det samme medium. Phytohæmagglutinin (PHA)~blaster etableredes ved 106 celler/ml i RPMI 1640 medium 35 (suppleret med 20% fetal kalveserum) indeholdende en 1:800 fortynding af PHA-P (Difco Laboratories, Inc., 38 DK 175577 B1

Detroit, MI). PHA-linier ekspanderedes med interleukin 2 (IL-2)-konditioneret medium og pulseredes ugentlig med PHA (Cantrell, D.A. et al., J. Exper. Med. 158:1895 (1983)). Ovennævnte fremgangsmåde er angivet 5 af Springer, T. et al., J. Exper. Med. 160:1901-1918 (1984), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisningen dertil. Celler opnået gennem ovennævnte fremgangsmåde screenes dernæst med anti-LFA-l-antistoffer til bestemmelse af hvorvidt de eksprimerer LFA-l-anti-10 genet. Sådanne antistoffer er angivet af Sanches-Madrid, F. et al., J. Exper. Med. 158:1785 (1983).

Eksempel 2.

Prøver for cellulær aggregation og adhæsion.

15 For at prøve udstrækningen af cellulær adhæsion anvendtes aggregationsprøver. De i sådanne prøver benyttede cellelinier vaskedes 2 gange med RPMI 1640 medium indeholdende 5 mM Hepes-puffer (Sigma Chemical Co., St. Louis) og genopslæmmedes til en koncentration 20 på 2 x 10® celler/ml. Til fladbundede, 96-brøndes mikrotiterplader (no. 3596; Costar, Cambridge, MA) sattes 50 μΐ af passende monoklonalt antistof-supernatant eller 50 μΐ komplet medium med eller uden rensede mohoklonale antistoffer, 50 μΐ fuldstændigt medium in-25 deholdende 200 ng/ml af phorbolesteren phorbolmyrlsta-tacetat (PMA) og 100 μΐ celler i en koncentration på 2 x 10® celler/ml i fuldstændigt medium. Dette gav en endelig koncentration på 50 ng/ml PHA og 2 x 10® celler/brønd. Cellerne fik lov til spontant at sætte 30 sig, og graden af aggregationen registreredes på forskellige tidspunkter. Resultater lå på fra 0-5+, hvor 0 indikerer at i det væsentlige ingen celler fandtes i klynger; 1+ indikerede at højst 10% af cellerne var i aggregater; 2+ indikerede at højst 50% af celler-35 ne var samlet; 3+ indikerede at op til 100% af cellerne var 1 små, løse klynger; 4+ indikerede at op- 39 DK 175577 B1 til 100% af cellerne var samlet i større klynger; og 5+ indikerede at 100% af cellerne var i store, meget kompakte aggregater. Til opnåelse af en mere kvantitativ vurdering af cellulær adhæsion sattes reagenser og 5 celler til 5 ml polystyrenrørglas på samme måde som ovenfor. Rørglassene anbragtes i et stativ på en rotationsryster ved 37°C. Efter en time ved ca. 200 omdr./ min. anbragtes 10 μΐ cellesuspensionen i et hasmocytome-ter, og antallet af frie celler bestemtes. Procent agio gregation betemtes ved den følgende ligning: % aggregation « 100 x (1 - ) antal tilførte celler 15 Antallet af tilførte celler i ovennævnte formel er antallet af celler per ml i et kontrolrør, der kun indeholder celler og fuldstændigt medium som ikke er blevet inkuberet. Antallet af frie celler i ovennævnte ligning svarer til antallet af ikke-aggregerede celler 20 per ml fra eksperimentalrør. Ovennævnte fremgangsmåde er beskrevet af Rothlein, R., et al., J♦ Exper. Med. 163:1132-1149 (1986).

Eksempel 3.

25 LFA-1-afhængig cellulær aggregation.

Den kvalitative aggregationsprøve beskrevet i eksempel 2 gennemførtes med anvendelse af den Epstein-Barr-transformerede cellelinie JY. Ved tilsætning af PMA til dyrkningsmediet i mikrotiterpladerne observere-30 des aggregation af celler. Tidsforkortede videooptagelser viste, at JY-cellerne på bunden af mikrotiterbrøn-dene var bevægelige og udviste aktiv membrankrusning og pseudopodiabevægelse. Kontakt mellem nabocellers pseu-dopodia resulterede ofte i celle-celleadhærence. Hvis 35 adhærence fastholdtes bevægede området med cellekontakt sig til uropodet. Kontakt kunne opretholdes til trods 40 DK 175577 B1 for kraftige cellebevægelser og cellernes trækken i modsatte retninger. Den primære forskel mellem PMA-behandlede og ubehandlede celler viste sig at være stabiliteten af disse kontakter når de først var dan-5 net. Med PMA udvikledes klynger af celler, der voksede i størrelse efterhånden som yderligere celler hæftedes til deres periferi.

Som et andet middel til måling af adhæsion benyttedes den kvantitative prøve beskrevet i eksempel 2.

10 Cellesuspensioner rystedes ved 200 omdr./min. i 2 timer, overførtes til et hæmocytometer, og celler, der ikke var i aggregater optaltes. I fravær af PMA var 42% (standardafvigelse = 20%, N = 6) af JY-cellerne i aggregater efter 2 timer, medens JY-celler inkuberet 15 under identiske betingelser med 50 ng/ml PMA havde 87% (standardafvigelse = 8%, N * 6) af cellerne i aggregater. Kinetiske studier af aggregation viste at PMA øgede hastigheden og størrelsen af aggregation på alle testede tidspunkter (fig. 3).

20

Eksempel 4.

Inhibering af aggregation af celler under anvendelse af anti-LFA-l-monoklonale antistoffer.

Por at undersøge virkningen af anti-LFA-1 mono-25 klonale antistoffer på PMA-induceret cellulær aggregation sattes sådanne antistoffer til celler inkuberet i overensstemmelse med den kvalitative aggregationsprøve fra eksempel 2. De monoklonale antistoffer viste sig at inhibere dannelsen af celleaggregater enten i nær-30 værelse eller fravær af PMA. Både F(ab')2- og Fab'-fragmenterne af monoklonale antistoffer overfor LFA-l's α-kæde var i stand til at inhibere cellulær aggregation. Medens i det væsentlige 100% celler dannede aggregater i fravær af anti-LFA-l-antistof, viste det sig 35 at højst 20% af cellerne var i aggregater når antistof tilsattes. Resultaterne af dette forsøg er beskrevet af DK 175577 B1

Al

Rothlein, R, et al. (J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986).

Eksempel 5.

5 Cellulær aggregation behøver LFA-1-receptoren.

EBV-transformerede lymfoblastoidceller fremstilledes fra patienter analogt med metoden beskrevet i eksempel l. Sådanne celler underkastedes screening over for monoklonale antistoffer, der er i stand til at gen-10 kende LFA-1 og cellerne viste sig at være LFA-1-defi-ciente.

Den kvalitative aggregationsprøve beskrevet i eksempel 2 anvendtes, idet de ovennævnte LFA-l-defi-ciente celler benyttedes. Sådanne celler var ikke i 15 stand til spontant at danne aggregater, selv i nærværelse af PMA.

Eksempel 6

Opdagelsen af ICAM-1.

20 De LFA-l-deficiente celler fra eksempel 5 mær kedes med carboxyfluoresceindiacetat (Patarroyo, M. et al., Cell. Immunol. 63:237-248 (1981)). De mærkede celler blandedes i et forhold på 1:10 med autologe eller JY-celler, og procentdelen af fluorescein-mærkede 25 celler i aggregatet bestemmes i overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., J. Exper. Med. 163:1132-1149 (1986). De LFA-l-deficiente celler viste sig at være i stand til at coaggregere med LFA-1 eksprimerende celler (fig. 4).

30 For at afgøre om LFA-1 kun var vigtig ved dan nelse af aggregater eller ved deres bevarelse sattes antistoffer, der er i stand til at binde til LFA-1, til de ovennævnte præformede aggregater. Tilsætningen af antistof viste sig kraftigt at sprænge den præformede 35 aggregation. Tidsforkortet videooptagelse bekræftede at tilsætningen af de monoklonale antistoffer til præ- 42 DK 175577 B1 formede aggregater startede sprængning indenfor 2 timer (Tabel. 1). Efter tilsætning af monoklonale antistoffer mod LFA-1 fortsatte pseudopodiale bevægelser og formændringer hos individuelle celler indenfor aggregatet 5 uændret. Individuelle celler disassocierede gradvis fra aggregatets periferi; efter 8 timer var de fleste celler dispergerede. Ved baglæns korsel af tidsforkortet videooptagelse viste sprængningen af præformede aggregater med LFA-1-monoklonale antistoffer sig at være 10 ækvivalent med aggregationsprocessen i fravær af LFA-1-monoklonalt antistof.

DK 175577 B1 43

Tabel 1

Anti-LFA-l~monoklonale antistoffers evne til at sprænge præformede PMA-inducerede JY-celle-aggregater.

5

Forsøg Agqregationsreqistrering 18 timer _2 timer3_ -mAb_+mAb_ 10 1 4+ 4+ l+b

2 3+ 4+ 1+C

3 _5+_5+_l+d

Aggregation i den kvalitative mikrotiter-pladeprøve re-15 gistreredes visuelt. Med anti-LFA-1 tilstede gennem hele prøveperioden var aggregationen højst l+.

20 aMængden af aggregation lige før tilsætning af mono-klonalt antistof efter 2 timer.

bTSl/18 + TSI/22.

CTS1/18.

25 dTSl/22.

Eksempel 7.

Behovet for divalente ioner til LFA-1-afhængig aggregation.

30 LFA-l-afhængige adhæsioner mellem cytotoxiske T-celler og målceller kræver tilstedeværelsen af magnesium (Martz, E. J. Cell. Biol. 84:584-598 {1980)).

PMA-induceret JY-celleaggregation testedes for divalent kationafhængighed. JY-celler dannede ikke aggregater 35 (idet prøven fra eksempel 2 benyttedes ) i medium uden calcium- eller magnesiumioner. Tilsætningen af 44 DK 175577 B1 divalent magnesium understøttede aggregation ved koncentrationer helt ned til 0,3 mM. Tilsætningen af calciumioner alene havde kun ringe effekt. Calciumioner viste sig imidlertid at øge magnesiumioners evne til 5 at understøtte PMA-induceret aggregation. Når 1,25 mM calciumioner sattes til mediet, viste magnesium-ionkoncentrationer helt ned til 0,02 mM sig at støtte aggregationen. Disse data viser at den LFA-1 afhængige aggregation af celler kræver magnesiumioner, og at 10 calciumioner, skønt de i sig selv er utilstrækkelige, kan virke synergistisk med magnesiumioner til at give mulighed for aggregation.

Eksempel 8 15 Isoleringen af hybridomaceller, der er i stand til at eksprimere anti-lCAM-l-monoklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer, der er i stand til at binde til ICAM-i, isoleredes i overensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., J. immunol.

20 137:1270-1274 {1986), hvilken reference inkorporeres heri ved henvisningen dertil. 3 BALC/C-mus immuniseredes intraperitonealt med EBV-transformerede perifere blodmononukleære celler fra et LFA-l-deficient individ (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901 25 (1984)). Ca. 107 celler i 1 ml RPMI 1640 medium be nyttedes til hver immunisering. Immuniseringerne administreredes 45, 29 og 4 dage før miltceller fjernedes fra musene til produktion af de ønskede hybridoma-cellelinier. På dag 3 før fjernelsen af miltcellerne 30 modtog musene yderligere 107 celler i 0,15 ml medium (intravenøst).

Isolerede miltceller fra ovennævnte dyr fusioneredes med P3X73Ag8.653 myelomaceller i et forhold på 4:1 i overensstemmelse med Galfre, G. et al., Nature 35 266:550 (1977). Aliquoter af de opnåede hybridomaceller indførtes i 96-brønds mikrotiterplader. Hybridomasuper- 45 DK 175577 B1 natanterne underkastedes screening for inhibering af aggregation og én inhiberende hybridoma (af over 600 testede brønde) klonedes og subklonedes ved grænsefortynding. Denne subklon betegnedes RRl/l.1.1 (herefter 5 betegnet "RRl/l").

Monoklonalt antistof RRl/l viste sig konsekvent at inhibere den LFA-l-eksprimerede cellelinie JY's PMA-stimulerede aggregation. Det RRl/l-monoklonale antistof inhiberede aggregation tilsvarende, eller en 10 smule mindre end visse monoklonale antistoffer mod LFA-1-α eller -β-underenheder. Kontrolmonoklonalt antistof over for HLA, som eksprimeres rigeligt på JY-cel-ler, inhiberede i modsætning hertil ikke aggregation. Antigenet bundet af monoklonalt antistof RRl/l define-15 res som det intercellulære adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1).

Eksempel 9.

Anvendelse af anti-lCAM-l-monoklonale antistoffer til 20 karakterisering af ICAM-1 molekylet.

For at bestemme ICAM-1's natur og især hvorvidt ICAM-1 var forskellig fra LFA-1, immunofældedes celleproteiner under anvendelse af monoklonalt antistof RRl/l. Immunopræcipitationen gennemførtes i over-25 ensstemmelse med fremgangsmåden af Rothlein, R. et al., J. Immunol. 137;1270-1274 (1986)). JY-celler lyseredes ved 5 x 107 celler/ml i 1% Triton X-100, 0,14 m NaCl,

10 mM Tris, pH 8,0, med frisk tilsat 1 mM phenylmethyl-sulfonylfluorid, 0,2 enheder per ml trypsin-inhibitor 30 aprotinin (lysis puffer) i 20 minutter ved 4°C. Lysatet centrifugeredes ved 10.000 x g i 10 min. og præklaredes med 50 μΐ af en 50%' s suspension af CNBr-aktiveret, glycin-quenched sepharose C1-4B i 1 time ved 4°C. 1 ml lysat immunopræcipiteredes med 20 μΐ af en 50%'s su-35 spension af monoklonalt antistof RRl/l koblet til Sepharose C1-4B (1 mg/ml) natten over ved 4°C

46 DK 175577 B1 (Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160:1901 (1984)). Sepharose-bundet monoklonalt antistof fremstilledes, idet CNBr-aktivering af Sepharose CL-4B i carbonat-puffer benyttedes, i overensstemmelse med fremgangsmå-5 den af March, S. et al. (Anal. Blochem. ^0:149 (1974)).

Vaskede immunopræcipitater underkastedes SDS-PAGE og sølvfarvning i overensstemmelse med fremgangsmåden af Morrissey, J.H. Anal♦ Biochem. 117:307 (1981).

Efter eluering af proteiner med SDS-prøvepuffer 10 (Ho, M.K. et al., J. Biol. Chem. 258-636 (1983)) ved 100°C, halveredes prøverne og udsattes for elektrofore-se (SDS-8% PAGE) under reducerende (fig. 5A) eller ikke-reducerende betingelser (fig. 5B). Bånd med molekylvægte på 50 kd og 25 kd svarede til de tunge og let-15 te kæder af immunoglobuliner fra det monoklonale anti-stof-Sepharose (fig. 5A, bane 3). Varierende mængder af andre bånd i 25-50 kd vægtområdet observeredes desuden, men ikke i præcipitater fra lodne leukemiaceller, som kun gav et 90 kd molekylvægtbånd. LFA-l's 177 kd a-20 underenhed og 95 kd β-underenhed viste sig at migrere forskelligt fra ICAM-1 under både reducerende (fig. 5A, bane 2) og ikke-reducerende (fig. 5B, bane 2) betingelser .

For at bestemme monoklonalt antistof RRl/l's 25 virkning på PHA-lymfoblast-aggregation anvendtes den kvantitative aggregationsprøve beskrevet i eksempel 2. T-celle-blastceller stimuleredes således i 4 dage med PHA, vaskedes grundigt og dyrkedes dernæst i 6 dage i nærværelse af IL-2 konditioneret medium. PHA viste 30 sig at blive internaliseret under denne 6 dages dyrkning og bidrog ikke til aggregationsprøven. I tre forskellige prøver med forskellige T-celle-blastpræparater inhiberede ICAM-1 monoklonale antistoffer konsekvent aggregation (Tabel 2).

DK 175577 B1 47

Tabel 2

Inhibering af PMA-stimuleret PHA-lymfoblast aggregation af RR1/1 monoklonalt antistof3 5 % %

Forsøg PMA Mab_ Aggregation Inhibering 1c - Kontrol 9 --- + Kontrol 51 0 10 + HLA-A,B 58 -14d + LFA-1-α 31 39 + ICAM-1 31 39 2e - Kontrol 10 --- + Kontrol 78 0 15 + LFA-1-β 17 78 + ICAM-1 50 36 3f - —— 7 + Kontrol 70 + HLA-A,B 80 -14 20 + LFA-3 83 -19 + LFA-1-α 2 97 + LFA-1-β 3 96 + ICAM-1 34 51 25

Aggregation af PHA-inducerede lymfoblaster stimuleret med 50 ng/ml PMA mængdebestemtes indirekte ved mikroskopisk tælling af antallet af ikke-aggregerede celler som beskrevet i eksempel 2.

30 ^Procent inhibering i forhold til celler behandlet med PMA og X63 monoklonalt antistof.

Aggregation måltes 1 time efter den samtidige til-35 sætning af monoklonalt antistof og PMA. Celler rystedes ved 175 omdr./min.

48 DK 175577 B1

J

aEt negativt tal indikerer procent aggregationsforøgelse.

Aggregation måltes 1 time efter den samtidige til-5 sætning af et monoklonalt antistof og PMA. Celler pelleteredes ved 200 x G i 1 min., inkuberedes ved 37°C i 15 min., resuspenderedes forsigtigt og rystedes i 45 min. ved 100 omdr./min.

10 ^Celler forbehandledes med PMA i 4 timer ved 37°C. Efter at monoklonalt antistof var tilsat inkuberedes rørene ved 37°c stationært i 20 min. og rystedes ved 75 omdr./min. i 100 min.

49 DK 175577 B1 lfa-1-monoklonale antistoffer var konsekvent mere inhiberende end ICAM-l-monoklonale antistoffer, hvorimod HLA-A, B og LFA-3 monoklonale antistoffer var uden virkning. Disse resultater indikerer at af de te-5 stede monoklonale antistoffer var kun de, der var i stand til at binde til LFA-1 eller ICAM-l, i stand til at inhibere cellulær adhæsion.

Eksempel 10 10 Fremstilling af monoklonalt antistof mod ICAM-l. Immunisering.

En Balb/C mus immuniseredes intraperitonealt (i.p) med 0,5 ml 2 x' 107 JY-celler i RPMI medium 103 15 dage og 24 dage før fusion. På 4. og 3. dagen før fusion immuniseredes mus i.p. med 107 celler af PMA-differentierede U937~celler i 0,5 ml RPMI medium.

Differentiering af U937-celler.

20 U937-celler (ATCC CRL-1593) differentieredes ved inkubering af disse ved 5 x l05/ml i RPMI med 10% fetal bovin serum , 1% glutamin og 50 pg/ml gehtamyin (fuldstændigt medium) indeholdende 2 ng/ml phorbol-12-myristatacetat (PMA) i en steril polypropylenbeholder.

25 På 3. dagen af denne inkubering fjernedes halvdelen af volumenet af mediet og erstattedes med frisk, fuldstændigt medium indeholdende PMA. På dag 4 fjernedes celler, vaskedes og præpareredes til immunisering.

30 Fusion.

Miltceller fra de immuniserede mus fusioneredes med P3x63 Ag8.653 myelomaceller i et forhold på 4:1 i overensstemmelse med Galfre et al., (Nature 266:550 (1977)). Efter fusionen udpladedes cellerne i en 35 96 brøndes fladbundet mikrotiterplade med 105 milt- celler/brønd.

50 DK 175577 B1

Selektion af antl-ICAM-1 positive celler.

Efter én uge underkastedes 50 μΐ supernatant screening ved den kvalitative aggregationsprøve ifølge eksempel 2, idet både JY og SKW-3 benyttedes som 5 aggregerende cellelinier. Celler fra supernatanter, der inhiberer JY-celleaggregation, men ikke SKW-3, udvalgtes og klonedes to gange under anvendelse af grænsefortynding.

Dette forsøg resulterede i identifikationen 10 og kloningen af tre separate hybridomalinier, som frembragte anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer. Antistofferne produceret af disse hybridomalinier var henholdsvis IgG2a, IgG·^ og IgM. Hybridomacellelinien, som producerede IgG2a anti-lCAM-l-antistoffet tills deles betegnelsen R6'5'D6Έ9'B2. Antistsoffet produceret af den foretruken hybridomacellelinie betegnedes R6'5'D6 Έ9 ' B2 (herefter omtalt som "R6-5-D6").

Eksempel 11 20 Ekspressionen og reguleringen af ICAM-1.

For at måle ICAM-l-ekspressionen udvikledes en radioimmunprøve. I denne prøve ioderedes renset RR1/1 under anvendelse af iodogen til en specifik aktivitet på 10 yCi/yg. Endotelceller dyrkedes i 25 96 brøndes plader og behandledes som beskrevet for hvert forsøg. Pladerne afkøledes til 4°C ved anbringelse i et koldt rum i 0,5-1 time, ikke direkte på is. Monolagene vaskedes 3 gange med kolde, fuldstændige medier og inkuberedes dernæst 30 min. ved 4°C 30 med ·*·2^Ι rri/i. Monolagene vaskedes dernæst 3 gange med fuldstændige medier. Det bundne frigjordes under anvendelse af 0,1 N NaOH og taltes. Den specifikke aktivitet af 125I rri/i indstilledes, ved hjælp af ikke-mærket RRl/l, til opnåelse af et linært signal in-35 denfor de antigentætheder, man støder på under dette studium. Ikke-specifik binding bestemtes i nærværelse 51 DK 175577 B1 af et tusind gange overskud af ikke-mærket RB1/1 og substraheredes fra den totale binding til opnåelse af den specifikke binding.

ICAM-1-ekspression, målt under anvendelse af 5 ovennævnte radioimmunprøve, øges på humane umbilical-vene-endotelceller (HUVEC) og humane saphenevene-endotelceller (HSVEC) af IL-1, TNF, LPS og IFN-γ (Tabel 3). Saphenevene-endotelceller anvendtes i dette studium til bekræftelse af resultaterne fra umbilicalvene-10 endotelceller i dyrkede store vene-endotelceller fra fuldt udviklet væv. Den basale ekspression af ICAM-1 er 2 gange højere på saphenevene-endotelceller end på umbilicalevene-endotelceller. Udsættelse af umbilicalvene-endotelcelle for rekombinant-IL-1-15 a, IL-l-β og TNF-γ øger ICAM-l-ekspression 10-20 gange.

IL-1-α, TNF og LPS var blandt de mest potente inducere og IL-1 var mindre potent på vægtbasis og desuden ved mætningskoncentrationer for responsen (Tabel 3).

IL-1-β ved 100 ng/ml øgede ICAM-l-ekspression 9 gange 20 på HUVEC og 7,3 gange på HSVEC med halv-maksimal øgning forekommende ved 15 ng/ml. rTNF ved 50 ng/ml øgede ICAM-l-ekspressionen 16 gange på HUVEC og 11 gange på HSVEC med halv-maksimale virkninger ved 0,5 ng/ml. Interferon-y frembragte en signifikant øgning i 25 ICAM-l-ekspression på 5,2 gange på HUVEC eller 3,5 gange på HSVEC ved 10.000 E/ml. Virkningen af LPS ved 10 yg/ml var af tilsvarende størrelsesorden som rTNF.

Parvise kombinationer af disse mediatorer resulterede i additive eller lidt mindre end additive virkninger 30 på ICAM-1 ekspression (Tabel 3). Kryds-titrering af rTNF med rIL-1-β eller rIFN-y viste ingen synergisme mellem disse ved suboptimale eller optimale koncentrationer.

Eftersom LPS øgede ICAM-l-ekspression på endo-35 telceller i koncentrationer, der under tiden findes i dyrkningsmedier, undersøgtes den mulighed at den ba- 52 DK 175577 B1 sale ICAM-1-ekspression kan skyldes LPS. Når adskillige serumbatches testedes viste det sig, at lav-endotoxin-serum gav lavere ICAM-l-basal-ekspression ved 25%. Alle de her angivne resultater var for endotelceller dyr-5 ket i lav-endotoxinserum. Inkluderingen af det LPS-neutraliserende antibiotikum polymyxin B ved 10 yg/ml mindskede imidlertid kun ICAM-l-ekspressionen yderligere 25% (Tabel 3). Øgningen i ICAM-l-ekspresion ved behandling med IL-1 eller TNF påvirkedes ikke ved nær-10 værelse af 10 yg/ml polymyxin B, hvilket er i overensstemmelse med de lave endotoxinkoncentrationer i disse præparater (Tabel 3).

53 DK 175577 B1

Tabel 3

Anti-ICAM-l-monoklonale antistoffer.

Tilstand (16 timer) 125I specifik bundet (CPM)

5 HUVEC HSVEC

Kontrol 603 ± 11 - 1132 + 31 100 ng/tnl rIL-1 beta 5680 + 633 9x 8320 + 766 7,3x 50 ng/ml rIL-1 alpha 9910 ± 538 16x - 50 ng/ml rTNF alpha 9650 + 1500 16x 12690 ± 657 11,2x in 10 rø/ml LPS 9530 + 512 16x 10459 ± 388 9,2x iU 10 ng/ml rlFN gamma 3120 + 308 5.2x 4002 + 664 3,5x rIL-1 beta + rTNF 1469 + 1410 24x 16269 + 660 14x rIL-1 beta + LPS 13986 + 761 . 23x 10870 ± 805 lOx rIL-1 beta + rlFN gamma 7849 + 601 13x 8401 + 390 7,4x rTNF + LPS 15364“+ 1241 24x 16141 + 1272 14x rTNF + rlFN gamma 13480 + 1189 22x 13238 ± 761 12x 15 LPS + IFN gamma 10206 + 320 17x 10987 ± 668 lOx polymyxin B (10 øg/ml) 480 + 23 - polymyxin B + rlL-1 5390 +97 lix - polymyxin B + rTNF 9785 + 389 20x - 1 //g/ml LPS 7598 + 432 13x - polymyxin B + LPS 510 + 44 l,lx 20

Opregulering af ICAM-l-ekspression på HVEC og HSVEC-HUVEC eller HSVEC podedes i plader med 96-brønde ved 25 1:3 fra et sammenflydende monolag og fik lov til at gro til sammenløb. Cellerne behandledes dernæst med de angivne materialer eller medier i 16 timer, og RIA udførtes scm ved fremgangsmåder. Alle punkter gennemførtes 4 gange.

30

Eksempel 12

Kinetik af interleukin 1 og y-interferon-induktion af ICAM-1.

Kinetikken af interleukin. 1 og y-interferon-35 virkninger på ICAM-l-ekspression på dermale fibro-blaster bestemtes under anvendelse af 125χ gede- 54 DK 175577 B1 anti-muse-IgG-bindingsprøven ifølge Dustin, M.L. et al.

(J. Immunol. 137:245-254 (1986); hvilken reference inkorporeres heri i kraft af henvisning dertil). Til gennemførelse af denne bindingsprøve, dyrkedes humane, 5 dermale fibroblaster i en 96-brøndes mikrotiterplade til en tæthed på 2-8 x 104 celler/brønd (0,32 cm2). Cellerne vaskedes 2 gange med RPMI 1640 medium suppleret som beskrevet i eksempel 1. Cellerne vaskedes yderligere en gang med Hanks balancerede saltopløsning 10 (HBSS), 10 mM HEPES, 0,05% NaNg og 10% varmeinaktiveret fetal bovin serum. Vaskning med denne bindingspuffer gennemførtes ved 4°C. Til hver brønd sattes 50 yl af ovennævnte bindingspuffer og 50 μΐ af den pågældende hybrldoma-supernatant med X63 og W6/32 som henholdsvis 15 de negative og positive kontroller. Efter inkubering i 30 minutter ved 4°C under forsigtig omrøring vaskedes brøndene to gange med bindingspuffer, og det andet antistof 125I-gede-anti-muse-IgG, tilsattes ved 50 nCi i 100 μΐ. ^2^I-gede-anti-muse-antistoffet fremstilledes 20 under anvendelse af iodogen (Pierce) i overensstemmelse med fremgangsmåden af Fraker, P.J. et al. (Blochem. Biophys. Res. Commun. 80:849 (1978)). Efter 30 min.

ved 4°C vaskedes brøndene to gange med 200 yl bindingspuffer og cellelaget opløstes ved tilsætning af 100 25 yl 0,1 N NaOH. Dette og en 100 yl vask taltes i en Beckman 5500 γ-counter. Det specifikke antal counts per min. beregnedes som [cpm med monoklonalt antistof]-[cpm med X63]. Alle trin, herunder induktion med specifikke reagenser, gennemførtes 4 gange.

30 Virkningen af interleukin 1 med en halverings tid for ICAM-1-induktion på 2 timer var hurtigere end virkningen af γ-interferon med en halveringstid på 3,75 timer (fig. 6). Tidsforløbet til returnering til resterende koncentrationer af ICAM-1 viste sig at være af-35 hængig af cellecyklusen eller hastigheden af cellevækst. I hvilende celler er interleukin 1 og y- 55 DK 175577 B1 interferonvirkninger stabile i 2-3 dage, hvorimod ICAM-l-ekspressionen afbildet som logfasekulturer er nær grundlinien 2 dage efter fjernelsen af disse inducerende midler.

5 Dosis-responskurver for induktionen af ICAM-1 ved rekombinant muse- og human interleukin 1 og for rekombinant human y-interferon er vist i fig. 7. y-interferon og interleukin 1 viste sig at have ens koncentrationsafhængigheder med næsten identiske virk-10 ninger ved 1 ng/ml. Humant og rekombinant muse-interleukin 1 havde også næsten ens kurver, men er mindre virkningsfulde end human interleukin 1-præparater ved inducering af ICAM-l-ekspression.

Cyclohexamid, en inhibitor for proteinsyntese, 15 og actinomycin-D, en inhibitor for mRNA-syntese, ophæver virkningerne af både interleukin 1 og y-interferon på ICAM-l-ekspression på fibroblaster {Tabel 4). Tunicamycin, en inhibitor for N-bundet glycosylering, inhiberede yderligere kun interleukin 1-virkningen 20 med 43%. Disse resultater indikerer at protein- og mRNA-syntese, men ikke N-bundet glycosylering er nødvendig for interleukin 1- og y-interferon-stimulerede øgninger i ICAM-l-ekspression.

DK 175577 B1 56 TABEL 4 ,

Virkninger af cycloheximid, actinomycin D og tunica-mycin på ICAM-1-induktion med IL-1 og y-IPN på humane, dermale fibroblaster9. c 125 I Gede-Anti-Muse IgG Specifikt bundet (cmp)

Behandling_anti-ICAH-1_anti-HLA-A.B.C

Kontrol (4 timer) 1524 ± 140 11928 4 600 4 cycloheximide 1513 + 210 10678 + 471 10 + actinomycin 0 1590 + 46 12276 + 608 4 tunicamycin 1461 + 176 12340 + 940 IL 1 (10 U/ml) (4 timer) 4264 + 249 12155 ± 510 4 cycloheximide 1619 ± 381 12676 ± 446 4 actinomycin D 1613 ± 88 12294 ± 123 4 tunicamycin 3084 ± 113 13434 4 661 15 lFN-γ (10 U/ml) (18 tiner) 4659 ± 109 23675 ± 500 4 cycloheximide 1461 ± 59 10675 ± 800 4 actinomycin D 1326 ± 186 12089 ± 550 1 aHumane fibroblaster dyrkedes til en tæthed på 8 x 104 celler/0,32 cm^ brønd. Behandlinger gennemførtes i et slutvolumen på 50 μΐ indeholdende de angivne reagenser.

25 Cycloheximid, actinomycin D og tunicamycin tilsattes i henholdsvis 20 yg/ml, 10 μΜ og 2 yg/ml samtidig med cytokinerne. Alle punkter er middelværdier fra fire bønde + standardafvigelse.

DK 175577 B1 57

Eksempel 13 ICAM-l's vævsfordeling.

Histokemiske studier gennemførtes på frosset væv fra menneskeorganer til bestemmelse af fordelingen af 5 ICAM-l i thymus, lymfeknuder, tarm, hud, nyrer og lever. Til gennemførelse af en sådan analyse fikseredes frosne vævsstykker (4 pm tyk) af normalt, humant væv i acetone i 10 min. og farvedes med det monoklonale antistof RRl/l ved en immunoperoxidaseteknik, under anven-10 delse af avidin-biotin-kompleksmetoden (Vector Laboratories, Burlingame, CA) beskrevet af Cerf-Bensussan, N. et al. (J. Immunol, 130:2615 (1983)). Efter inkubering med antistoffet, inkuberedes stykkerne fortløbende med biotinylerede heste-anti-muse-igG og avidin-15 biotinylerede peroxidasekomplekser. Stykkerne dyppedes til sidst i en opløsning indeholdende 3-amino-9-ethyl-carbazol (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, Wl) til udvikling af en farvereaktion. Stykkerne fikseredes dernæst i 4% formaldehyd i 5 min. og modfarvedes med 20 hematoxylin, Kontroller omfattede stykker inkuberet med ikke-relaterede monoklonale antistoffer i stedet for RBl/l-antistoffet.

ICAM-l viste sig at have en fordeling, der i det væsentlige er lig med den hos størstedelen af 25 histokompatibilitetskompleks (MHC) klasse II antigenerne. De fleste blodkar (både små og store) i alt væv viste farvning af endotelceller med ICAM-l-antistof.

Den vaskulære endotelfarvning var mere intens i de interfoilikulære (paracorticale) områder i lymfeknuder, 30 tonsiler og Peyer's "patches" i sammenligning med kar i nyre, lever og normal hud. I leveren var farvningen i det væsentlige begrænset til sinusformede beklædningsceller; hepatocytterne og endotelcellerne, som indvendigt beklæder de fleste portalvenerne og ar-35 terierne var ikke farvede.

I thymusmarven observeredes diffus farvning af store celler og et dentritisk farvningsmønster. I

58 DK 175577 B1 cortex var farvningsmønsteret focalt og i det væsentlige dentritisk. Thymocytter var ikke farvede. I det perifere lymfoide væv var de sekundære lymfoide folliklers germinale centerceller intenst farvede. I nogle 5 lymfoide follikler var farvningsmønstret i det væsentlige dentritisk uden genkendelig farvning af lymfocytter. Der observeredes desuden svag farvning af celler i kappezonen. Dendritiske celler med cytoplasmiske udstrækninger {interdigiterende reticulumceller) og et 10 lille antal lymfocytter i de interfollikulære eller paracorticale områder var desuden farvet med ICAM-1-bindingsantistoffet.

Celler, der lignende makrofager, var farvet i lymfeknuderne og tyndtarmens lamina propria. Fibro-15 blast-lignende celler {spindelformede celler) og dendritiske celler spredt i stroma og de fleste af de undersøgte organer farves med iCAM-l-bindingsanti-stoffet. Der konstateredes ingen farvning i de Langerhanske/indeterminante celler i epidermis. Der 20 konstateredes ingen farvning i glat muskelvæv.

Farvningen af epitelceller kunne tilsvarende ses i tonsilernes mucosa. Skønt hepatocytter, galdekanal-epitelium, intestinale epitelceller og rørformede epitelceller i nyrer i de fleste tilfælde ikke farves, 25 viste stykker af normal nyrevæv, opnået fra et nephrek-tomiprøvestykke med nyrecellecarcinoma, farvning af mange proximale rørformede celler for ICAM-1. Disse rørformede epitelceller farves desuden med et anti-HLA-DR-bindingsantistof.

30 Sammenfattende eksprimeres ICAM-1 på ikke-hema- topoietiske celler, såsom vaskulære endotelceller og på hæmatopoietiske celler, såsom vævsmakrofager og mitogen-stimulerede T-lymfocytblaster. ICAM-1 viste sig at blive eksprimeret i små mængder på perifere blod-35 lymfocytter.

DK 175577 B1 59

Eksempel 14

Rensningen af ICAM-1 ved monoklonalt antistof afflnltetschromatoqrafl 5 Generelt rensningsskema.

ICAM-1 rensedes fra humane celler eller væv under anvendelse af monoklonalt antistof-affinitetschro-matografi. Monoklonalt antistof, RRI/l, reaktivt overfor ICAM-1 rensedes først og kobledes til en inert ko-10 lonnematrix. Dette antistof er beskrevet af Rothlein, R et al. J. Immunol. 137:1270-1274 (1986), og Dustin, M.L. et al. (J. Immunol. 137:245 (1986). ICAM-1 solubi-liseredes fra cellemembraner ved lysering af cellerne i en ikke-ionisk detergent, Triton X-100, nær en neu-15 tral pH-værdi. Cellelysatet indeholdende opløst ICAM-1 passeredes dernæst gennem prækolonner bestemt til fjernelse af materialer, der binder ikke-specifikt til ko-lonnematrixmaterialet, og dernæst gennem den monoklona-le antistof-kolonnematrix, der gør det muligt for 20 ICAM-1 at binde til antistoffet. Antistofkolonnen vaskedes dernæst med en serie af detergentvaskepuffere med stigende pH-værdi op til pH 11,0. Under disse vask-ninger forblev ICAM-1 bundet til antistofmatrixen, medens ikke-bindende og svagt bindende forurenende mate-25 rialer fjernedes. Det bundne ICAM-1 elueredes dernæst specifikt fra kolonnen ved tilførsel af en detergentpuffer med pH 12,5.

Rensning af monoklonalt antistof RRl/1 og covalent kob-30 ling til Sepharose CL-4B.

Det anti-ICAM-1 monoklonale antistof RRl/1 rensedes fra ascitesvæske fra hybridoma-bærende mus, eller fra hybridoma-kultursuperhatanter ved standardteknikker for ammoniumsulfatudfældnings- og protein A-35 affinitetschromatografi (Ey et al., Immunochem. 15: 429 (1978)). Det rensede IgG, eller rotte-IgG (Sigma 60 DK 175577 B1

Chemical Co., St. Louis, MO) kobl edes covalent til Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Sverige) under anvendelse af en modifikation af fremgangsmåden af March et al. (Anal. Blochem. 6J):149 (1974)). Kort for-5 talt vaskedes Sepharose CL-4B i destilleret vand, aktiveret med 40 mg/ml CNBr i 5 M K2HPO4 (pH ca. 12) i 5 min. og vaskedes dernæst ekstensivt med 0,1 mM HCl ved 4°C. Det filtrerede, aktiverede Sepharose resuspen-deredes med en tilsvarende mængde renset antistof 10 (2-10 mg/ml i 0,1 M NaHC03, 0,1 M NaCl). Suspensionen inkuberedes i 18 timer ved 4°C under nænsom "end-over-end”-rotation. Supernatanten kontrolleredes dernæst for ubundet antistof ved absorbans ved 280 nm, og resterende reaktive steder på det aktiverede Sepharose blev 15 mættet ved tilsætning af glycin til 0,05 M. Koblingsvirkningsgraden var sædvanligvis over 90%.

Deterqentsolubilisering af membraner fremstillet ud fra human milt.

20 Alle fremgangsmåder gennemlførtes ved 4°c. Fros sen, human milt (200 g fragmenter) fra patienter med hårcelleleukemi optøedes på is i 200 ml Tris-saltop-løsning (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4 ved 4°C) indeholdende 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,2 25 E/ml aprotinin og 5 mM iodacetamid. Vævet blev skåret i små stykker og homogeniseret ved 4°C med en Tekmar power homogenisator. Voluminet øgedes dernæst til 300 ml med Tris-saltopløsning, og 100 ml 10% Tween 40 (polyoxyethylensorbitanmonopalmitat) i Tris- 30 saltopløsning tilsattes til opnåelse af en endelig koncentration på 2,5% Tween 40.

Til fremstilling af membraner ekstraheredes homogenatet med tre slag fra en Dounce eller, mere foretrukket, en Teflon Potter Elvej hern homogenisator 35 og centrifugeredes dernæst ved 1000 x g i 15 min. Supernatanten bevaredes og pelleten reekstraheredes med 61 DK 175577 B1 200 ml 2,5% Tween 40 i Tris-saltopløsning. Efter centrifugering ved 1000 x g i 15 min. samledes superna-tanterne fra begge ekstraktioner og centrifugeredes ved 150.000 x g i 1 time til pelletering af membranerne.

5 Membranerne vaskedes ved genopslaemning i 200 ml Trissaltopløsning og centrifugeredes ved 150.000 x g i 1 time. Membranpelleten genopslæmmedes i 200 ml Trissaltopløsning og homogeniseredes med en motoriseret ho-mogenisator og en teflonstøder indtil suspensionen var 10 ensartet uklar. Voluminet øgedes dernæst til 900 ml med Tris-saltopløsning og N-lauroylsarcosin tilsattes til en slutkoncentration på 1%. Efter omrøring ved 4eC i 30 min. fjernedes uopløseligt materiale i detergentlysatet ved centrifugering ved 150.000 x g i l time. Triton 15 X-100 sattes dernæst til supernatanten til en slutkon centration på 2%, og lysatet omrørtes ved 41^ i 1 time,

Deterqentsolubilisering af JY B-lymfoblastoidceller.

20 Den EBV-t rans formerede B-lymfoblastoidcelle- linie JY dyrkedes i RPMI-1640 indeholdende 10% fetal kalveserum (PCS) og 10 mM HEPES til en tæthed på ca. 0,8-1,0 x 106 celler/ml. For at øge celleoverfladeekspressionen af ICAM-1 tilsattes phorbol-12-myristat-25 13-acetat (PMA) til 25 ng/ml i 8-12 timer før høst af cellerne. Natriumvanadat (50 pM) sattes også til kulturerne i dette tidsrum. Cellerne pelleteredes ved centrifugering ved 500 x g i 10 min., og vaskedes 2 gange i Hank's balancerede saltopløsning (HBSS) ved 30 genopslæmning og centrifugering. Cellerne {ca. 5 g per 5 1 kultur) lyseredes i 50 ml lysispuffer (0,14 M NaCl, 50 mM Tris pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,2 E/ml aprotinin, 1 mM PMSP, 50 pM natriumvandat) under omrøring ved 4°C i 30 min. Ikke-lyserede kærner og uopløselige brud-35 stykker fjernedes ved centrifugering ved 10.000 x g i 15 min. efterfulgt af centrifugering af supernatanten 62 DK 175577 B1 ved 150.000 x g i 1 time og filtrering af supernatanten gennem Whatman 3 mm filterpapir.

Afflnitetschromatografl af ICAM-1 til strukturunder-5 søqelser.

Til rensning i stor skala af ICAM-1, som skal benyttes ved strukturstudier, benyttedes en kolonne med 10 ml RRl/l-Sepharose CL-4B (koblet ved 2,5 mg antistof/ml gel), og to 10 ml præ-kolonner med CNBr-10 aktiveret, glycin-quenched Sepharose CL-4B, og rotte-igG koblet til Sepharose CL-4B (2 mg/ml) benyttedes. Kolonnerne blev serieforbundet og præ-vasket med 10 kolonne-voluminer lysispuffer, 10 kolonnevoluminer puffer på pH 12,5 (50 mM triethylamin, 0,1% Triton X-100, 15 pH 12,5 ved 4eC), efterfulgt af ligevægtsindstilling med 10 kolonnevoluminer lysispuffer. En liter af deter-gentlysat af human milt tilførtes med en strømhastighed på 0,5-1,0 ml per min. De to præ-kolonner benyttedes til fjernelse af ikke-specifikt bindingsmateriale fra 20 lysatet før passage gennem RRl/l-Sepharose-kolonnen.

Efter tilsætningen vaskedes RRl/l-Sepharose-kolonnen og bundet ICAM-1 fortløbende med en strømhastighed på 1 ml/min. med mindst 5 kolonnevoluminer af hver af de efterfølgende: 1) lysispuffer, 2) 20 mM 25 Tris pH 8,0/0,14 M NaCl/0,1% Triton X-100, 3) 20 mM

glycin pH 10,0/0,1% Triton X-100, og 4) 50 mM tri ethylamin pH 11,0/0,1% Triton X-100. Alle vaskpuffere indeholdt 1 mM PMSF og 0,2 E/ml aprotinin. Efter vask-ningen elueredes det resterende bundne ICAM-l med 30 5 kolonnevoluminer elueringspuffer (50 mM triethyl- amin/0,1% Triton X-100/pH 12,5 ved 4°C) med en strømningshastighed på 1 ml/3 min. Det eluerede ICAM-1 opsamledes i l ml fraktioner og neutraliseredes straks ved tilsætning af 0,1 ml 1 M Tris, pH 6,7. Fraktionerne 35 indeholdende ICAM-1 identificeredes ved SDS-polyacryl-amidelektroforese af 10 yl aliquoter (Springer et al., 63 DK 175577 B1 J» Exp. Med. 160:1901 (1984)), efterfulgt af sølvfarvning (Morrissey, J.H., Anal. Biochem. 117:307 (1981)).

Under disse betingelser var hovedmængden af ICAM-1 elueret i ca. 1 kolonnevolumen og var mere end 90% rent 5 bedømt ud fra sølvfarvede elektropherogrammer (en lille mængde IgG, udvasket fra affinitetsmatrixen, var den største forurener). Fraktionerne indeholdene ICAM-1 samledes i en pulje og koncentreredes ca. 20 gange ved hjælp af Centricon-30-mikrokoncentratorer (Amicon, 10 Danvers, MA). Det rensede ICAM-1 mængdebestemtes ved Lowry-proteinprøve af en ethanol-præcipiteret aliquot fra puljen: Ca. 500 yg rent ICAM-1 produceredes ud fra 200 g human milt.

Ca. 200 yg renset ICAM-1 udsattes for en 15 andentrins rensning ved præparativ SDS-polyacrylamid-gel-elektroforese. Båndet, der repræsenterer ICAM-l, blev gjort synligt ved gennemblødning af gelen i l M XC1. Det gelområde, som indeholdt ICAM-1, blev dernæst udskåret og elektroelueret i overensstemmelse med frem-20 gangsmåden af Hunkapiller et al., Meth. En2ymol. 91: 227-236 (1983). Det rensede protein var mere end 98% rent bedømt ved SDS-PAGE og sølvfarvning.

Affinitetsrensning af ICAM-l til funktionelle studier.

25 ICAM-1 til anvendelse i funktionelle studier rensedes fra detergentlysater af JY-celler som beskrevet ovenfor, men i mindre målestok (en 1 ml kolonne af RRl/l-Sepharose) og med følgende modifikationer.

Alle opløsninger indeholdt 50 yM natriumvanadat. Efter 30 vaskning af kolonnen med pH 11,O-puffer indeholdende 0,1% Triton X-100, vaskedes kolonnen igen med fem kolonnevoluminer af den samme puffer indeholdende 1% n-octyl-p-D-glucopyranosid (octylglucosid) i stedet for 1,0% Triton X-100. Octylglucosid-detergenten 35 fortrænger Triton X-100 bundet til ICAM-1 og modsat Triton X-100 kan det senere fjernes ved dialyse.

64 DK 175577 B1 ICAM-1 elueredes dernæst med pH 12,5-puffer indeholdende 1% octylglucosid i stedet for 0,1% Triton x-100, og analyseredes og koncentreredes som beskrevet ovenfor.

5 Eksempel 15

Karakteristika af renset ICAM-1.

ICAM-1 renset fra human milt migrerer i SDS-polyacrylamid-geler som et bredt bånd med Mr på 72.000 til 91.000. ICAM-1 renset fra JY-celler migrerer også 10 som et bredt bånd med Mr på 76.500 til 97.000. Disse Mr ligger indenfor det angivne område for ICAM-l immuno-præcipiteret fra forskellige cellekilder: Mc=90.000 for JY-celler, 114.000 på den myelomonocytiske cellelinie U937 og 97,000 på fibroblaster (Dustin et al., J.

15 Immunol. 137:245 (1986)). Dette brede område i Mr tilskrives en extensiv, men variabel grad af glyco-sylering. Den ikke-glycosylerede precursor har en Mr på 55.000 (Dustin et al.). Proteinet renset enten fra JY-celler eller human milt bevarer dets antigene virk-20 ning som godtgjort af dets evne til at genbinde til den oprindelige affinitetskolonne og ved immunopræcipita-tion med RRl/l-Sepharose og SDS-polyacrylamidelektro-forese.

Til fremstilling af peptidfragmenter af ICAM-1 25 reduceredes ca. 200 pg med 2 mM dithiothreitol/2% SDS, efterfulgt af alkylering med 5 mM iodeddikesyre. Proteinet udfældedes med ethanol og genoplostes i 0,1 M NH4COg/0,l mM CaCl2/0,l% zwittergent 3-14 (Calbio-chem), og underkastedes digestion med 1 vægt% trypsin 30 ved 37°C i 4 timer, efterfulgt af yderligere digestion med 1% trypsin i 12 timer ved 37 “c. De tryptiske peptider rensedes ved omvendt-fase HPLC under anvendelse af en 0,4 x 15 cm C4-kolonne (Vydac). Peptiderne elueredes med en lineær gradient på 0% til 60% acetonitril i 0,1% 35 trifluoreddikesyre. Udvalgte peptider underkastedes sekvensanalyse på en gasfasemikrosekvenator (Applied 65 DK 175577 B1

Biosystems). Sekvensinformationen opnået fra dette studium er vist i Tabel 5.

66 DK 175577 B1

Tabel 5

Aminosyresekvenser af ICAM-l-tryptiske peptider.

Amino- Pel>t1d syre- ________ 5 rest 5Qa 50b 46a 46b X 45 K AA J U 0 Ml

1 [T/V] A (V/A) E VS LE ALV L

Z F S Q P E F N L G l T L/E

3 L IT ALPPDSGL P/(G)

4 T S F AATLVI P

5 V L P P P V R L E G/Y

6 Y G L L N T .P V T N/L

10 7 p W P P V Y Q T P (N) 8 T PI I T/I G G C P/V (Q) 9 S F G (G) L - L S K (E) 10 E i (Q) - D E T (0)

Π A S D/P K S L S

12 G/S V V P F F C

13 A T D Q S E D

15 14 G V W V/L A - Q

15 I K T P

16 S K

17 i

18 J

19 *

20 Q

20 21 L

( ) - Lav konfidenssekvens.

[ ] * Meget lav konfidenssekvens.

25 / - Indikerer flertydelighed i sekvensen; den mest sandsynelige aminosyre er angivet først, a = Større peptid, b - Mindre peptid.

DK 175577 B1 67

Eksempel 16

Kloning af ICAM-1-genet.

Genet for ICAM-l kan klones under anvendelse af enhver af en lang række fremgangsmåder. P.eks. kan ami-5 nosyresekvensinformationen, opnået gennem sekvenserin gen af de tryptiske fragmenter af ICAM-1 (Tabel 5), benyttes til identificering af en oligonucelotidsekvens, som vil svare til ICAM-l-genet. ICAM-l-genet kan alternativt klones under anvendelse af anti-lCAM-l-antistof 10 til detektering af kloner, som producerer ICAM-1.

Kloning af genet for ICAM-1 gennem anvendelsen af oligonucleotidprober.

Under anvendelse af den gentiske kode (Watson, 15 J.D., In: Molecular Biology of the Gene, 3. udg. Ed., w.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), kan et eller flere forskellige oligonucleotider identificeres, som hver især vil være i stand til at kode for de ICAM-1 tryptiske peptider. Sandsynligheden for at et særligt 20 oligonucleotid i virkeligheden udgør den aktuelle ICAM-1-kodende sekvens kan bedømmes ved betragtning af abnorme baseparforhold og hyppigheden med hvilken et særligt codon faktisk benyttes (for at kode for en særlig aminosyre) i eukaryotiske celler. Sådanne "codon 25 kutymeregler" er angivet af Lathe, R., et al., J.

Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Ved anvendelse af "codon kutymereglerne" af Lathe, identificeres et enkelt oligonucleotid, eller et sæt af oligonucelotider, som indeholder en teoretisk "mest sandsynlig" nucleo-30 tidsekvens (dvs. den nucleotidsekvens, der har det mindste overskud), som er i stand til at kode for de ICAM-l tryptiske peptidsekvenser.

Oligonucleotidet eller sættet af oligonucleotider, der indeholder den teoretiske "mest sandsynlige" 35 sekvens, der er i stand til at kode for ICAM-l fragmenterne benyttes til identificering af sekvensen af et 68 DK 175577 B1 komplementært oligonucleotid eller sæt af oligonucleo-tider, som er i stand til at hybridisere til den "mest sandsynlige" sekvens, eller sæt af sekvenser. Et oligonucleotid indeholdende en sådan komplementær sekvens 5 kan anvendes som en probe til identificering og isolering af ICAM-l-genet (Maniatis, T., et al., Molecular Cloning A Laboriatory Manual, Cold Spring Harbor Press,

Cold Spring Harbor, NY (1982).

Som beskrevet i afsnit C ovenfor, er det muligt 10 at klone ICAM-l-genet fra eukaryoetiske DNA-præparater, som formodes at indeholde dette gen. Til identificering og kloning af genet, som koder for I CAM-1 -proteinet, underkastes et DNA-bibliotek screening for dets evne til at hybridisere med de ovennævnte oligonucleotidpro-15 ber- Da det er sandsynligt at der kun vil være to kopier af genet for ICAM-1 i en normal diploid celle, og fordi det er muligt at dette ICAM-l-gen kan indeholde store ikke-transkriberede mellemliggende sekvenser (introner), hvis kloning ikke er ønsket, er det ønske-20 ligt at isolere ICAM-1-kodende sekvenser fra et cDNA-bibliotek fremstillet ud fra mRNA fra en ICAM-1-producerende celle fremfor fra genomisk DNA. Egnede DNA eller cDNA præparater spaltes enzymatisk eller klippes tilfældigt og ligeres i rekombinant vektorer.

25 Disse rekombinante vektorers evne til at hybridisere til ovennævnte oligonucleotidprober måles dernæst. Fremgangsmåder til hybridisering er angivet f.eks. i Maniatis, T., Molecular Cloning A Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1982) 30 eller i Haymes, B.T., et al., Nucleic Acid Hybridization a Practicial Approach, IRL Press, Oxford, England (1985). Vektorer, som viste sig at være i stand til en sådan hybridisering analyseres dernæst til bestemmelse af udstrækningen, og naturen af de iCAM-l-sekvenser som 35 de Indeholder. Baseret på rent statistiske betragtninger kunne et gen, såsom det der koder for ICAM-1- 69' DK 175577 B1 molekylet, identificeres entydigt (via hybridiserings-screening) under anvendelse af en oligonucleotidprobe med kun 18 nucleotider.

Den aktuelle identifikation af ICAM-l-peptid-5 sekvenser tillader således kort fortalt identifikationen af en teoretisk "mest sandsynlig" DNA-sekvens eller et sæt af sådanne sekvenser, der er i stand til at kode for et sådant peptid. Ved konstruktion af et oligonu-cleotid komplementært til denne teoretiske sekvens 10 (eller ved konstruktion af et sæt af oligonucleotider komplementære til sættet af de "mest sandsynlige" oligonucleotider) , opnås et DNA-molekyle (eller sæt af DNA-molekyler), der er i stand til at fungere som en probe til identifikation og isolering af lCAM-1-genet.

15 Under anvendelse af de i tabel 5 angivne ICAM-1- peptidsekvenser, bestemtes sekvensen af den "mest sandsynlige" sekvens af et oligonucleotid, der er i stand til at kode for AA- og J-peptider (henholdsvis Tabel 6 og 7). Oligonucleotider komplementære til disse sekven-20 ser syntetiseredes og rensedes til anvendelse som prober til isolering af ICAM-1-gensekvenser. Egnede størrelse-selekterede cDNA-biblioteker produceredes ud fra poly(A)+ RNA fra begge PMA-inducerede HL-60 celler og fra PS-stimulerede umbilicalveneendotelceller. Et 25 størrelse-selekteret cDNA-bibliotek fremstilledes under anvendelse af poly(A)+ RNA fra PMA-inducerede HL-60 celler i overensstemmelse med fremgangsmåden af Gubier, U., et al. ((Gene 25:263-269 (1983)) og Corbi, A., et al. (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)), hvilke refe-30 rencer inkorporeres heri ved henvisningerne dertil.

Et størrelse-selekteret cDNA-bibliotek fremstilledes under anvendelse af poly(A)+ RNA fra umbilicalve-ne-endotelceller, som havde været stimuleret i 4 timer med PS 5 ug/ml- RNA ekstraheredes ved homogenisering af 35 cellerne i 4 M gu anid iniumiso thi ocy anat og udsættelse af supernatanten for ultracentrifugering gennem en CsCl 70 DK 175577 B1 gradient (Chirgwin, J. M., et al. , Biochem. 18:5294--5299 (1979)). Poly(A)* RNA isoleredes fra blandingen af totale RNA-stykker via anvendelsen af oligo-(dT)-cellu-losechromatografi (Type 3, Collaborative Research) 5 ( Aviv, H., et al·, Proc. Natl. Acad. Scl. (USA) 69: 1408-1412 (1972).

DK 175577 B1 71

Tabel 6

Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for ICAM-l-AA-peptidet.

5 ____

Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der sekvens af ICAM-1 koder for AA- peptid , - y y

10 162 Glu 6 C

A T

G C

163 leu C G

T A

G C

164 Asp G C

A T

15 C G

165 Leu C G

T A

G C

166 Arg C G

G C

G C

20 167 Pro C G

C G

C G

168 Gin CG

A T

G C

169 Gly G C

G C

25 CG

170 Leu C G

T A

G C

171 Glu G C

A T

G C

30 172 .Leu C G

T A

G C

173 Phe T A

T A

T A

174 Glu G C

35 AT

G C

3' 5' DK 175577 B1 72

Tabel 6 (forsat)

Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for ICAM-1 -AA-peptidet.

5___·_______

Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der sekvens af ICAM-1 koder for AA- peptid _

10 175 Asn A T

A T

C G

176 Thr A T

C G

C 6

177 Ser U A

C G

15 A

3' 5' DK 175577 B1 73

Tabel 7

Oligonucleotid komplementært til den mest sandsynlige nucleotidsekvens, der er i stand til at kode for ICAM-1-J-peptidet.

5 __

Amino- ICAM-1 Mest sandsynlig Komplementær syrerest AA-peptid sekvens, der sekvens af ICAM-1 koder for AA- ____peptid_ 10 5' 3' 19 Val 6 i

T A

G C

20 Thr A T

C G

C G

15 21 Cys T J

G C

C G

22 Ser T i

C G

C G

23 Thr A T

20 CG

C G

24 .Ser T A

C G

C G

25 c*s I t

T A

25 26 Asp G G

C G

27 Gin C G

A T

G C

28 Pro C G

30 . I t

29 Lys A T

A T

3' 5' 74 DK 175577 B1 Første streng-cDNA syntetiseredes under anvendelse af 8 pg poly(A)+ RNA, avian myeloblastosis virus revers transkriptase (Life Sciences) og en oligo(dT) primer. DNA-RNA-hybridet underkastedes digestion med 5 RNase H (BRL) og den anden streng syntetiseredes under anvendelse af DNA-polymerase I (New England Biolabs). Produktet methyleredes med Eco Rl-methylase (New England Biolabs), blunt-end ligeredes til Eco Ri-linke-re (New England Biolabs), underkastedes digestion med 10 Eco RI og størrelse-selekteredes på en agarosegel med lavt smeltepunkt. cDNA større end 500bp ligeredes til kgtlO, som i forvejen havde været underkastet digestion med Eco RI og dephosphoryleret (Stratagene). Ligeringsproduktet pakkedes dernæst (Stratagene gold).

15 Umbilicalveneendotelcellen og HL-60 cDNA- biblioteker udpladedes dernæst ved 20.000 PFU/150 mm plade. Rekombinant DNA dobbeltoverførtes til nitrocellulosefiltre, denatureredes i 0,5 M NaOH/l,5M NaCl, neutraliseredes i 1M Tris, pH 7,5/l,5M NaCl og bagtes 20 ved 80°C i 2 timer (Benton, W.D., et al., Science 196: 180-182 (1977)). Filtre præhybridiseredes og hybridi- seredes i 5X SSC indeholdende 5X Denhardt’s opløsning, 50 mM NaP04 og 1 pg/ml laksesperm DNA. Præhybridise-ring gennemførtes ved 45 °C i 1 time.

25 Hybridiseringen gennemførtes under anvendelse af 32bp (5 ' -TTGGGCTGGTCACAGGAGGTGGAGCAGGTGAC) eller 47bp (5' -GAGGTGTTCTCAAACAGCTCCAGGCCCTGGGGCCGCAGGTCCAGCTC) anti-sense oligonucleotider baseret på, analogt med ovennævnte, henholdsvis de iCAM-l-tryptiske peptider 30 J og ÅA (Tabel 6 og 7) (Lathe, R. , J. Molec. Biol..

183:1-12 (1985)). Oligonucleotider endemærkedes med Y-(32P)ATP under anvendelse af T4 polynucleotid-kinase og de betingelser, der anbefales af fabrikanten (New England Biolabs). Efter hybridisering natten over 35 vaskedes filtrene to gange med 2X SSC/0,1% SDS i 30 min. ved 45 °C. Fager isolerede.s fra disse plaques, 75 DK 175577 B1 hvilke udviste hybridisering og rensedes ved efterfølgende genudpladning og rescreening.

Kloning af genet for ICAM-l gennem anvendelsen af anti-5 ICAM-antistof.

Genet for ICAM-1 kan alternativt klones gennem anvendelsen af anti-ICAM-l-antistof. DNA eller mere foretrukket cDNA ekstraheres og renses fra en celle, som er i stand til at eksprimere ICAM-l. Det rensede 10 cDNA underkastes fragmentering (ved klipning, endonuclease digestion, osv.) til frembringelse af en pulje af DNA- eller cDNA-fragmenter. DNA- eller cDNA-fragmenter fra denne pulje kloner dernæst i en ekspressionsvektor til produktion af et genomisk bibliotek af 15 ekspressionsvektorer, hvis medlemmer hver indeholder et unikt klonet DNA- eller cDNA-fragment.

Eksempel 17

Analyse af cDNA-klonerne.

20 Pag DNA fra positive kloner underkastedes diges tion med Eco Ri og undersøgtes ved Southern analyse under anvendelse af et cDNA fra én klon som en probe. Maksimale størrelse-cDNA-indføjninger som kryds-hybridiserede, subklonedes i Eco Rl-stedet i plasmid-25 vektor pGEM 4Z (Promega). HL-60 subkloner indeholdende c DNA i begge orienteringer deleteredes ved exonuclease

Ill-digestion (Henikoff, S., Gene 28:351-359 (1984)) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger (Erase-a-Sase, Promega). Progressivt deleterede cDNA'er klone-30 des dernæst og udsattes for dideoxynucleotidkædetermi-neringssekvensering (Sanger, F. et al., Proc. Natl,

Acad. Sci. (USA) 74:5463-5467 (1977) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger (Sequenase, u.S.

Biochemical). HL-60 cDNA 5' og kodende områder sekven-35 seredes komplementært på begge strenge og 3'-området sekvenseredes ca. 70% på begge strenge. En representa- 76 DK 175577 B1 tiv endotel cDNA sekvenseredes over det meste af dens længde ved shotgun kloning af 4bp-genkendelsesrestrik-tionsenzymfragmenter.

cDNA-sekvensen af én HL-60 og én endotelcelle 5 cDNA etableredes (fig. 8). 3023 bp-sekvensen indeholder et kort 5'-ikke-trans later et område og et 1,3 kb 3'-ikke-translateret område med et consensus polyadenyle-ringssignal i position 2966. Den længst åbne læseramme begynder med det første ATG i position 58 og slutter 10 med en TGA terminerende triplet i position 1653. Identitet mellem den translaterede aminosyresekvens og sekvenser bestemt ud fra otte forskellige tryptiske peptider med i alt 91 aminosyrer (understreget i fig. 8) bekræftede at autentiske ICAM-1 cDNA-kloner var blevet 15 isoleret. Aminosyresekvenserne af ICAM-1 tryptiske peptider er vist i tabel 8.

Tabel 8

Aminosyresekvenser af ICAM-1 tryptiske peptider.

20

Peptid Rester Sekvens

J 14-29 X G S V L VTCSTSCDQPK

U 30- 39 L L G I E T P L (P) (K)

50 78- 85 (T) P L.T V Y X T

25 X 89- 95 VELAPLP

AA 161-182 X ELDLRPQGLE —

L F E X T S A P X Q L

K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK

45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) 30 _ — Indikerer at sekvensen fortsætter på næste linie. Understregede sekvenser benyttedes til fremstilling af oligonucleotidprober.

Hydrofobicitetsanalyse (Kyte, J. et al., J.

Molec. Blol., 157:105-132 (1982)) foreslår tilstedevæ- 35 77 DK 175577 B1 reisen af en 27 restsignalsekvens. Udpegelsen af +1 glutaminet er i overensstemmelse med vores manglende evne til at opnå N-terminalsekvens på 3 forskellige ICAM-l-proteinpræparater; glutamin kss. cyclisere til 5 pyroglutaminsyre, hvilket resulterer i en blokkeret N-terminus. Den translaterede sekvens fra 1-453 er i det væsentlige hydrofil, efterfulgt af et 24 rest-hydrofo-bisk formodet transmembrandomæne. TrEnsmembrandomænet efterfølges af adskillige ladede rester indeholdt i et 10 27 rest formodet cytoplasmisk domæne.

Den forudsatte størrelse af der fuldt udviklede polypeptidkæde er 55.219 dalton, hvilket er i udmærket overensstemmelse med den observerede størrelse på 55.000 for deglycosylerede ICAM-1 (Dustin, M.L. et al., 15 J, Immunol. 137:245-254 (1986)). Otte Ji-linkede glyco-syleringssteder er forudsagt. Manglerde asparagin i de tryptiske peptidsekvenser af to af disse steder bekræfter deres glycosylering og deres ekstracellulære orientering. Antages 2.500 dalton pr. høj-mannose N-20 bundet carbonhydrat, forudsiges en størrelse på 75.000 dalton for ICAM-l-precursoren i sammenligning med de observerede seks på 73.000 dalton (Distin, M.L., et al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). Ifter omdannelse af høj-mannose til kompleks carbonhycrat ligger det 25 fuldt udviklede ICAM-1 glycoprotein pé 76 til 114 kd, afhængig af celletype l(Dustin, M.L., ez al., J. Immunol. 137:245-254 (1986)). ICAM-1 er således et kraftigt glycosyleret, men ellers et typisk integralmembran-protein.

30

Eksempel 18 ICMA-l er et integrin-blndlngsmedlem af immunoglobulin supergenfamillen.

Gruppering af ICAM-l-interne gentagelser gennem-35 førtes under anvendelse af "Microgenie protein alignment programmet" (Queen, C., et al., Nuci. Acid. Res., 78 DK 175577 B1 12: 581-599 (1984)) efterfulgt af inspektion. Gruppering af ICAM-1 overfor IgM, N-CAM og MAG gennemførtes under anvendelse af "Microgenie and the align programmet" (Dayhoff, M.O., et al./ Meth. Enzymol. 91:524-545 5 (1983)). Fire proteinsekvensdatabaser, opbevaret ved the National Biomedical Research Foundation, gennemsøg-tes for proteinsekvensligheder under anvendelse af FASTP-programmet af Williams og Pearson (Lipman, D.J., et al., Science 227:1435-1439 (1985)).

10 Eftersom ICAM-1 er en ligand af et integrin, var det uventet, at det ville være et medlem af immunoglobulinsupergenfamilien. Inspektion af ICAM-1-sekvensen viser imidlertid, at den opfylder alle kriterier, der foreslås for medlemsskab af immunoglobulin-15 supergenfamilien. Disse kriterier omtales efter tur i det efterfølgende.

Hele det ektracellulære område af ICAM-1 er konstrueret ud fra 5 homologe immunoglobulin-lignende områder, som er vist opstillet i fig. 9A. Områder 1-4 20 er henholdsvis 88, 97, 99 og 99 rester lang og er således af typiske Ig områdestørrelse; område 5 er afkortet indenfor 68 rester. Søgninger i NBRF-databasen under anvendelse af FASTP-programmet afslørede signifikante homologier mellem medlemmer af immunoglobulin-25 supergenfamilien, herunder IgM og igG C områder, T-cellereceptor-a-underenhed variabelt område og α-1-β-glycoprotein (fig. 9B-D).

Under anvendelse af ovennævnte information sammenlignedes aminosyresekvensen af ICAM-1 med aminosyre-30 sekvenserne af andre medlemmer af immunoglobulinsupergenfamilien.

Tre typer af Ig superfamilieområder, v. Cl og C2 er differentieret. Både V- og C-områder er konstrueret ud fra 2 β-plader bundet sammen ved intraområde-35 disulfidbindingen; V-områder indeholder 9 anti-parallelle β-strenge, mens C-områder indeholder 7. Kon- 79 DK 175577 B1 stante områder deltes i Cl- og C2-sæt baseret på karakteristiske rester vist i fig. 9A. Cl-sættet omfatter proteiner, der er involveret i antigen-genkendelse. C2-sættet omfatter adskillige Fc-receptorer og protei-5 ner indvolveret i call-adhæsion herunder CD2, LFA-3, MAG og NCAM. ICAM-1-områder viste sig at være kraftigst homologe med områder fra C2-sættet anbringende ICAM-1 i dette sæt; dette afspejles i stærkere lighed med bevarede rester i C2- end i Cl-områder som vist for β-10 strengene B-F i fig. 9. ICAM-områder står således meget bedre på linie med β-strenge A og G i C2-områder end med disse strenge i v- og Cl-områder, hvilket muliggør gode grupperinger på tværs af hele C2 område-styrken. Opstillinger med C2-områder fra NCAM, MAG og αΐ-β-gly-15 coprotein er vist i fig. 9B og 9C; identitet varierer fra 28 til 33%. Opstillinger med en τ-cellereceptor Va, 27% identitet og igM C område 3 34% er også vist (fig.

9B, 9D).

En af de vigtigste karakteristika for immuno-20 globul inomr åd er er de disulfid-bundne cysteiner, der danner brobindinger mellem B og F β-strenge, som stabiliserer β-lagsandwichen; i ICAM-1 er cysteinerne bevaret i alle tilfælde undtagen i streng f i område 4, hvor et leucin findes, som kan være rettet mod sand-25 wichen og stabilisere kontakten som foreslået for visse andre V- og C2-sæt områder. Afstanden mellem cysteinerne (43, 50, 52 og 37 rester) er som beskrevet for C2-sættet.

Til test for tilstedeværelsen af intrakæde-30 disulfidbindinger i ICAM-1 udsattes endotelcelle-ICAM-l for SDS-PAGE under reducerende og ikke-reducerende betingelser. Endotelcelle-ICAM-1 benyttedes fordi det udviser mindre glycosyleringsheterogenitet end JY eller hårcellemilt-ICAM-1 og tillader større 35 følsomhed overfor skift i Mr. ICAM-1 rensedes derfor fra 16 timer LPS (5 pg/ml) stimulerede umbilicalvene- 80 DK 175577 B1 endotelcellekulturer ved immunoaffinitetschromatografi som beskrevet ovenfor. Acetoneudfældet ICAM-1 genop-slæmmedes i prøvepuffer (Laemmli, U.K., Nature 227: 680-685 (1970)) med 0,25% 2-mercaptoethanol eller 25 mM 5 iodacetamid og bragtes til 100°C i 5 min. Prøverne underkastedes SDS-PAGE 4670 og sølvfarvning 4613. Endo-telcelle-ICAM-1 havde et tilsyneladende Mr på 100 kd under reducerende betingelser og 96 kd under ikke-reducerende betingelser, hvilket i høj grad tyder på 10 nærværelsen af intrakædedisulfider i nativ ICAM-l.

Anvendelsen af den primære sekvens til forudsigelse af den sekundære struktur (Chou, P.Y., et al., Blochem. IB:211-245 (1974)) viste de 7 forventede β-strenge i hvert ICAM-l-område, mærket a-g øverst i 15 fig. 9A, hvilket præcis opfylder forudsigelsen for et immunoglobulinområde og svarer til positionerne af strenge A-H i immunogl o buliner (nederst fig. 9A). Område 5 mangler A- og C-strengene, men da disse danner rammer om lagene, kan lagene stadig formes, f.eks.

20 hvor streng D erstatter streng C, son foreslået for andre C2 områder; og den karakteristiske disulfidbinding mellem B- og F-strengene ville være upåvirket. Kriterierne for område-størrelse, sekvenshomologi, bevarelse af cysteiner, der danner den formodede intra-25 område-disulf idbinding, tilstedeværelse af disulf idbindinger, og forudsagt β-lagstruktur opfyldes således alle til inkludering af ICAM-1 i immunoglobulin-supergenfamilien.

ICAM-1 viste sig at være yderst stærkt homolog 30 med NCAM- og MAG-glycoproteinerne fra C2-sættet. Dette er af særlig interesse eftersom både NCAM og MAG medierer celle-celleadhæstion. NCAM er vigtig i neuron-neuron og neuro-muskulære interaktioner (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)), mecens MAG er vig-35 tig i neuron-oligodendrocyt og oligocendrocyt-oligo-dendrocyt interaktioner under myelinering (Poltorak, 81 DK 175577 B1 M., et al^, J. Cell Biol. 105:189 3-1899 (1987)). Celleoverfladeekspressionen af NCAM og MAG reguleres udviklingsmæssigt under henholdsvis nervesystemdannelse og myelinering analogt med den regulerede indføring af 5 ICAM-i ved inflammation (Springer, T.A., et al. , Ann.

Rev. Immunol. 5:223-252 (1987)). ICAM-1, NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987)) og MAG

(Salzer, J.L., et_al., J. Cell. Biol. 104:957-965 (1987)) er ens i hovedstrukturen samt homologe efter-10 som hver er et integreret membranglycoprotein konstrueret ud fra 5 C2-områder, der danner det N-terminale ekstracellulære område, skønt nogle yderligere ikke-Ig-lignende sekvenser findes i NCAM mellem det sidste C2-område og det transmembrane område. ICAM-1 står over 15 hele dets længde, herunder i de transmembrane og cyto-plasmiske områder på linie med MAG med 21%'s identitet; den samme % identitet findes ved sammenligning af de 5 områder i ICAM-1 og NCAM-1. En skematisk sammenligning mellem de sekundære strukturer af ICAM-1 og MAG er vist 20 i fig. 10. Område-for-område-sammenligninger viser at homologiniveauet mellem områderne indenfor ICAM-1 og NCAM-molekylerne (x + standardafvigelse, henholdsvis 21 + 2,8% og 18,6 +3,8%) er det samme som homologiniveauet ved sammenligning af ICAM-1 områder med NCAM- og 25 MAG-områder (henholdsvis 20,4 + 3,7 og 21,9 + 2,7).

Skønt der er tegn på alternativ splejsning i de c-ter-minale områder i NCAM (Cunningham, B.A., et al., Science 236:799-806 (1987); Barthels, D., et al., EMBO J. 6:907-914 (1987)) og MAG (Lai, C., et al. , 30 Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84 4377-4341 (1987)), har man ikke fundet noget tegn på dette ved sekvenseringen af endotel- eller HL-60 ICAM-l-kloner eller i de undersøgelser af ICAM-l-proteinhovedkæden og precursoren i en lang række celletyper (Dustin M.L., et al., J. Im-35 munol. 137:245-254 (1986)).

ICAM-1 fungerer som en ligand for LFA-l i lymfo-cytinteraktioner med en række forskellige celletyper.

82 DK 175577 B1

Lymfocytter binder til ICAM-1 inkorporeret i kunstige membranbilag, og dette kræver LFA-1 på lymfocytten, hvilket direkte påviser LFA-l-interaktion med ICAM-1 (Marlin, S.D., et al.. Cell 51:813-619 (1987)). LFA-1 5 er et leukocytintegrin og har ingen immunoglobulin-lignende træk. Leukocytintegriner omfatter én integrin subfamilie. De andre to underfamilier medierer celle-matrlx interaktioner og genkender sekvensen RGD indenfor deres ligander, som omfatter fibronectin, vitronec-10 tin, collagen og fibrinogen (Hynes, R.O., Cell 48:549-554 (1987); Ruoslahti, E., et al. , Science 238:491-497 (1987)). Leukocytintegrinerne eksprimeres kun på leuko-cytter, er involveret i celle-celleinteraktioner og de eneste kendte ligander er ICAM-1 og iC3b, et frag-15 ment af den komplementære komponent C3, som ikke udviser immunoglobulin-lignende træk, og som genkendes af Mac-1 (Kishimoto, T.K., et al., I: Leukocyt Typing III, McMichael, M. (ud.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 20 223-252 (1987); Anderson, D.C., et al·., Ann. Rev. Med.

38^:175-194 (1987)). Baseret på sekvensanalyse er mulige peptider indenfor ICAM-l-sekvensen, genkendt af LFA-1, vist i Tabel 9.

DK 175577 B1 83

Tabel 9

Peptider Indenfor ICAM-l-sekvensen, som muligvis genkendes af LFA-1.

5 -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-X-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- -P-G-N-N-R-K- 10 -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- 15 ICAM-1 er det første eksempel på et medlem af immunoglobulin-supergenfamilien, som binder til et integrin. Skønt begge disse familier spiller en vigtig rolle ved celleadhæsion, har interaktioner mellem dem ikke tidligere været forventet. I modsætning hertil 20 er Interaktioner indenfor immunoglobul ingensuper familien ganske almindelig. Det er meget sandsynligt, at yderligere eksempler på interaktioner mellem integrinet og immunoglobulinfamilierne vil kunne findes. LFA-1 genkender en ligand forskellig fra ICAM-1 (Springer, 25 T.A., et al., Ann. Rev. Immunol. 5 :223-252 (1987)), og leukocytintegrinet Mac-1 genkender en ligand forskellig fra C3bi i neutrofil-neutrofiladhæsion (Anderson, D.C., et al., Ann. Rev. Med♦ 38:175-194 (1987)). Rensede MAG-holdige vesikler binder yderlige-30 re til neuritter, som er MAG, og MAG må således være i stand til heterofil interaktion med en særskilt receptor (Poltorak, M., et al., J. Cell Biol. 105:1893-1899 (1987)).

NCAM's rolle i neural-neural og neural-muskulære 35 celleinteraktioner har været foreslået at skyldes de homofile NCAM-NCAM-interaktioner (Cunningham, B.A., 84 DK 175577 B1 et al., Science 236:799-806 (1987)). MAG's vigtige rolle i interaktioner mellem tilstødende, omdrejende løkker af Schwann-celler omsluttende axoner under myelinskededannelse kan skyldes interaktion med en 5 særskilt receptor eller homofile MAG-MAG interaktioner. Homologien mellem NCAM og den hyppige forekomst af område-område-interaktioner indenfor immucogobulin-super-gerifamilien rejser muligheden for at ICAM-1 kunne deltage i homofile interaktioner samt ICAM-l-LFA-1-10 heterofile interaktioner. Binding af B-Iymfoblastceller som co-eksprimerer lignende tætheder af LFA-1 og ICAM-1 til ICAM-1 i kunstige eller cellulære monolag kan imidlertid fuldstændig inhiberes ved forbehandling af B-lymfoblasten med LFA-l-MAb, mens adhærence er upåvirket 15 af B-lymfoblast-for behandling med ICAM-l-MAb. Forbehandling af monolaget med ICAM-l-Mab ophæver fuldstan-dig binding (Dustin, M.L., et. al., J. Immunol.

1_37:245-254 (1986); Marlin, S.D., et al., Cell 51:813-819 (1987)). Disse erkendelser viser at hvis 20 ICAM-1 homofile interaktioner overhovedet forekommer, må de være meget svagere end heterofile interaktioner med LFA-1.

Muligheden for at leukocytintegrinerne genkender ligander på en fundamental anden måde stemmer overens 25 med nærværelsen af en 180 rest-sekvens i deres a-under-enheder, der kan være vigtig i ligandbinding og som ikke findes i RGD-genkendelsesintegrinerne (Corbi, A. , et al. (EMBO J. 6:4023-4028 (1987)). Skønt man har foreslået at Mac-1 genkender RGD sekvens, som findes i 30 iC3b 5086, er der ingen RGD-sekvens i ICAM-1 (fig. 8).

Dette er i overensstemmelse med det fibronetiske peptid GRGDSP og kontrolpeptidet GRGESP's manglende evne til at inhibere ICAM-l-LFA-l-adhæsion (Marlin, S.D., et al., Cell 51:813-819 (1987)). Beslægtede sekvenser, så-35 som PRGGS og RGEKE findes imidlertid i ICAM-1 i områder, som forudsiges at danne sløjfe mellem henholdsvis 85 DK 175577 B1 β-strenge a og b i område 2 og c og d i område 2 (fig.

9), og skulle således have mulighed for genkendelse.

Det er af interesse at det homologe MAG-molekyle indeholder en RGD-sekvens mellem område 1 og 2 (Poltorak, 5 M., et al., J. Cell Biol, 105:1893-1899 (1987); Salzer, J.L., et al., J. Cell. Biol. 104:957-965 (1987)).

Eksempel 19

Southern og Northern Blots.

10 Southern blots gennemførtes under anvendelse af 5 yg genomisk DNA ekstraheret fra tre cellelinier: BL2, en Burkitt lymfomacellelinie (en gave fra Dr. Gilbert Lenoir); JY og Er-LCL, EBV-transformerede B-lymfo-blastoidcellelinier.

15 DNA'erne underkastedes digestion med 5X den af fabrikanten anbefalet mængde af Barn Hl og Eco Ri endo-nucleaser (New England Biolabs). Efter elektroforese gennem en 0,8% agarosegel, overførtes DNA'erne til en nylonmembran (Zeta Probe, BioRad). Filteret præhybridi-20 seredes og hybridiseredes idet standardfremgangsmåderne fulgtes under anvendelse af ICAM cDNA fra HL-60 mærket med a-(32P)d XTP'er ved vilkårlig priming (Boehringer Mannheim). Northern blots gennemførtes under anvendelse af 20 yg total RNA eller 6 yg poly(A)+ RNA. RNA denatu-25 reredes og underkastedes elektroforese gennem en 1% agarose-formaldehydgel og elektro-overførtes til Zeta probe. Filtre præhybridiseredes og hybridiseredes som beskrevet tidligere (Staunton, D.E., et al., Embo J.

6^: 3695-3701 (1987)) under anvendelse af HL-60 cDNA- 30 proben af 32P-mærkede oligonucleotidprober (beskrevet ovenfor).

Southern blots, hvor man benytter 3 kb cDNA-proben og genomisk DNA underkastet digestion med Barn Hl og Eco Ri viste enkelte dominerende hybridiserings-35 fragmenter på henholdsvis 20 og 8 kb, hvilket tyder på et enkelt gen og på at det meste af den kodende infor- 86 DK 175577 B1 mation findes indenfor 8 kb. I blots med tre forskellige cellelinier var der ikke tegn på restriktions-f ragment-polymorfisme.

5 Eksempel 20

Ekspression af ICAM-l-qenet.

En "ekspressionsvektor" er en vektor, som (på grund af tilstedeværelsen af passende transkriptions-og/eller translationskontrolsekvenser) er i stand til 10 at eksprimere et DNA- (eller cDNA)-molekyle, som har været klonet i vektoren, og dermed at producere et po-lypeptid eller protein. Ekspression af de klonede sekvenser forekommer, når ekspressionsvektoren indføres i en passende værtscelle. Hvis en prokaryotisk ek s -15 pressionsvektor benyttes vil en passende værtcelle således være enhver prokaryotisk celle, der er i stand til at eksprimere de klonede sekvenser. Hvis man på lignende måde benytter en eukaryotisk ekspressionsvektor, vil en passende værtscelle være enhver eukaryotisk 20 celle, der er i stand til at eksprimere de klonede sekvenser. Da eukaryotisk DNA kan indeholde intervenerende sekvenser, og da sådanne sekvenser ikke kan bearbejdes korrekt i prokaryotiske celler, foretrækkes det at anvende cDNA fra en celle, som er i stand til at eks-25 primere ICAM-I til opnåelse af et prokaryotisk genomisk ekspressions vektorbibliotek. Fremgangsmåder til fremstilling af cDNA og fremstilling af et genomisk bibliotek er angivet af Maniat is, T., et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 30 Cold Spring Harbor, NY (1982)).

Det ovennævnte ekspressionsvektors genomiske bibliotek benyttes til at frembringe en bank af værtceller (som hver indeholder ét medlem af biblioteket). Ekspressionsvektoren kan indføres i værtcellen ved et 35 vilkårligt af en række forskellige midler (dvs. transformation, transfektion, protoplastsammensmeltning, 87 DK 175577 B1 elektroporering osv.)· Banken med ekspressionsvektor-holdige celler formeres klonisk, og dets medlemmer prøves individuelt (under anvendelse af en immunoprøve) for at bestemme om de producerer et protein, der er i 5 stand til at binde til anti-ICAM-l-antistof.

Ekspressionsvektorerne fra de celler, som producerer et protein, der er i stand til at binde til anti-ICAM-antistof, analyseres dernæst yderligere for at bestemme om de eksprimerer (og således indeholder) 10 hele ICAM-l-genet, om de kun eksprimerer (og indeholder) et fragment af ICAM-l-genet, eller om de eksprimerer (og indeholder) et gen, hvis produkt ikke er ICAM-1, skønt det immunologisk er beslægtet med ICAM-1. Skønt en sådan analyse kan gennemføres med 15 ethvert egnet middel, foretrækkes det at bestemme nucleotidsekvensen af DNA- eller cDNA-fragmentet, som er klonet i ekspressionsvektoren. Sådanne nucleotid-sekvenser undersøges dernæst for at bestemme om de er i stand til at kode for polypeptider, som har den samme 20 aminosyresekvens som ICAM-1's tryptiske digestionfragmenter (Tabel 5).

En ekspressionsvektor som indeholder et DNA- eller cDNA-molekyle, der koder for ICAM-l-genet, kan således genkendes ved : (i) Evnen til direkte ekspression 25 af et protein, som et i stand til at binde, til anti-ICAM-l-antistof; og (ii) tilstedeværelsen af en nucleo-tidsekvens, der er i stand til at kode for hver af de tryptiske fragmenter af ICAM-1. Det klonede DNA-molekyle af en sådan ekspressionsvektor kan fjernes fra 30 ekspressionsvektoren og isoleres på ren form.

Eksempel 21

Funktionelle aktiviteter af renset ICAM-1.

I celler fungerer ICAM-1 normalt som et over-35 fladeprotein knyttet til cellemembranen. Funktionen af renset ICAM-1 testedes derfor, efter at molekylet var 88 DK 175577 B1 rekonstitueret, i kunstige lipidmembraner (liposomer eller veslkler) ved opløsning af proteinet i detergent-solubiliserede lipider, efterfulgt af fjernelse af detergentet ved dialyse. ICAM-1 renset fra JY-celler og 5 elueret i detergentet octylglucosid, som beskrevet ovenfor, rekonstitueredes i vesikler, og ICAM-1-indeholdende vesikler fusioneredes til daekglas eller plastkul turbrønde, for at muliggøre påvisningen af cellebinding til proteinet.

10

Fremstilling af plane membraner og plast-bundne vesikler.

Vesikler fremstilledes ved fremgangsmåden ifølge Gay et al. (J Immunol. 136:2026 (1986)). Kort fortalt 15 opløstes aeggephosphatidylcholin og cholesterol i tri-chlormethan og blandedes i et molært forhold på 7:2. Lipidblandingen tørredes til en tynd film under rotering under en strøm af nitrogengas og lyofiliseredes dernæst i 1 time for at fjerne alle spor af trichlor-20 methan. Lipidfilmen opløstes dernæst i 1% octylgluco-sid/0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) til en slutkoncen-tration af phosphatidylcholin på 0,1 mM. Ca. 10 yg renset ICAM-1 eller human glycophorin (Sigma Chemical Co.,

St. Louis, MO) som et kontrolmembranglycoprotein, sat-25 tes til hver ml af opløste lipider. Protein-lipid-detergentopløsningen dialyseredes dernæst ved 4°C mod 3 hold af 200 voluminer af 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH

7,2, og et hold af HBSS.

Plane membraner fremstilledes ved fremgangsmåden 30 angivet af Brian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6159 (1984). Dækglas (med en diameter på 11 mm) kogtes i 15 min. i en 1:6 fortynding af 7X detergent (Linbro), vaskedes natten over i destilleret vand, gennemvædedes i 70% ethanol og lufttørredes. En 80 yl dråbe af en ve-35 sikelsuspension indeholdende enten ICAM-1 eller glycophorin anbragtes på bunden af brøndene i en 24-brøndes 89 DK 175577 B1 klyngetestplade, og de præparerede dækglas bragtes forsigtigt til at flyde på toppen. Efter 20-30 min. inku-bering ved stuetemperatur fyldtes brøndene med HBSS, og dækglasset vendtes om for at bringe den plane mem-5 branflade opad. Brøndene vaskedes dernæst omhyggeligt med HBSS for at fjernes ubundne vesikler. Den plane membranoverflade udsattes aldrig for luft.

Under forsøgene med plane membraner fusioneret til glasoverflader viste det sig, at vesikler indehol-10 dende ICAM-i binder direkte til plastoverfladen af mul-tibrønds-vævskulturplader og bevarer funktionel aktivitet som bevist ved specifik cellebinding, sådanne vesikler omtales herefter som "plast-bundne vesikler" (PBV), eftersom naturen af de til plastet bundne lipid-15 vesikler ikke er blvet bestemt. Plast-bundne vesikler fremstilledes ved tilsætning af 30 μΐ vesikelsuspension direkte til bunden af brøndene i 96-brøndes vævskulturbakker (Falcon) efterfulgt af inkubering og vaskning, som beskrevet for plane membraner.

20

Celleadhæsionsprøver.

Celleadhæsionsprøver under anvendelse af plane membraner eller plast-bundne vesikler gennemførtes begge to på i det væsentlige samme måde, med undtagelse af 25 at celleantallet og voluminer for PBV-prøver reduceredes til en femtedel af det, der benyttedes ved plane membranprøver.

T-lymfocytter fra normale kontroller og en patient med leukocytadhæsionsdeficiens (LAD), hvis 30 celler ikke eksprimerer LFA-1 (Anderson, D.C. et al., J. Infect. Dis. 152:668 (1985)), fremstilledes ved dyrkning af mononukleære perifere blodceller med 1 pg/ml Concanavalin-A (Con-A) i RPMI-1640 plus 20% FCS med 5 x 105 celler/ml i 3 dage. Cellerne vaskedes der-35 næst to gange med RPMI og en gang med 5 mM methyl-a-D-mannopyranosid til fjernelse af resterende lectin fra 90 DK 175577 B1 celleoverfladen. Cellerne dyrkedes i RPMl/20% FCS indeholdende 1 ng/ml rekombinant IL-2, og benyttedes mellem 10 og 22 dage efter initieringen af kultur.

Til påvisning af cellebinding til plane membra-5 ner eller PBV, radiomærkedes Con-A blaster, T-lymfoma SKW-3 og de EBV-transformerede B-lymfoblastoidcelle-linier JY (LFA-1 positive) og den LFA-l-deficiente lymfoblastoidcellelinie (BBN) (som stammer fra patient nr. 1, Springer, T.A. et al., J. Exper. Med. 160: 10 1901-1918 (1986)) ved inkubering af l x 107 celler i 1 ml RPMI-1640/10% FCS med 100 uCi Na51Cr04 i 1 time ved 37’c efterfulgt af 4 vaskninger med RPMI-1640 til fjernelse af ikke-inkorporeret mærkninngsmiddel. I mo-noklonalt antistof-blokeringsforsøg forbehandledes cells ler eller plast-bundne vesikler med 20 yg/ml renset antistof i RPMI-1640/10% FCS ved 4°C i 30 min., efterfulgt af 4 vaskninger til fjernelse af ubundet antistof. I forsøg for divalente kationers virkning på cel-lebinding vaskedes cellerne en gang med Ca2+-, Mg2+-20 frit HBSS plus 10% dialyseret FCS, og CaCl og MgCl tilsattes til de angivne koncentrationer. I alle forsøg præækvilibreredes celler og plane membraner eller PBV ved passende temperatur (4°C, 22°C eller 37°C) i en passende prøvepuffer.

25 Til måling af cellebinding til renset ICAM-1 centrifugeredes 51Cr-mærkede celler (5 x 105 EBV-transformanter i plane membranprøver; 1 x 10^ EBV-transformanter eller SKW-3-celler, 2 x 105 Con-A-bla-ster i PBV-prøver) i 2 min. ved 25 x g på plane mem-30 braner eller PBV, efterfulgt af inkubering ved 4°C, 22°C eller 37°C i 1 time. Efter inkubering fjernedes ubundne celler ved otte cycler med påfyldning og bortsugning af puffer praeækvilibreret til den rette temperatur. Bundne celler bestemtes ved solubilisering 35 af brøndindholdet med 0,1 N NaOH/1% Triton X-100 og tælling på en γ-tæller. Procent cellebinding bestemtes 91 DK 175577 B1 ved at dividere cpm fra bundne celler med input celleassocieret cpm. I plane membranprøver korrigeredes input cpm for forholdet mellem dækglassets overfladeareal og dyrkningsbrøndenes overfladeareal.

5 I disse prøver bandt EBV-transformerede B- lymfoblastoidceller, SKW-3 T-lymfomaceller og Con-A T-lymfoblaster specifikt til ICAM-1 i kunstige membraner (fig. 11 og 12). Bindingen var specifik, eftersom cellerne bandt meget svagt til kontrol plane membraner 10 eller vesikler indeholdende ækvivalente mængder af et andet humant celleoverfladeglycoprotein, glycophorin. Yderligere bandt LFA-l-positive EBV-transformanter og Con-A blaster medens deres LFA-l-negative modparter ikke bandt i nogen signifikant udstrækning, hvilket viser 15 at bindingen var afhængig af tilstedeværelsen af LFA-1 på cellerne.

Både specificiteten af cellebinding og afhængighed af cellulær LFA-1 bekræftedes i monoklonale antistofblokeringsforsøg (fig. 13). Bindingen af JY-celler 20 kunne inhiberes med 97%, når ICAM-1 indeholdende PBV forbehandledes med anti-lCAM-1 monoklonalt antistof RR1/1. Forbehandling af cellerne med det samme antistof havde kun ringe virkning. Omvendt inhiberede det anti-LFA-1-monoklonale antistof TSl/18 binding med 96%, 25 men kun når cellerne, men ikke PBV, var præbehandlet.

Et kontrolantistof TS2/9 reaktivt med LFA-3 (et andet lymfocytoverfladeantigen) havde ingen signifikant inhi-berende virkning, hverken når celler eller pbv forbehandledes. Dette forsøg viser, at ICAM-1 i sig selv i 30 de kunstige membraner, og ikke en eller anden mindre kontaminant, medierer den observerede cellulære adhæsion, og at adhæsionen er afhængig af LFA-1 på bindingscellen.

Bindingen af celler til ICAM-1 i kunstige mem-35 braner viser desuden to andre egenskaber hos det LFA-1-afhængige adhæsionssystem: Temperaturafhængighed og 92 DK 175577 B1 et behov for divalente kationer. Som vist i fig. 14 bandt Con-A blaster mest effektivt til ICAM-1 i PBV ved 37°C, delvis ved 22°C og meget svagt ved 4°C. Som vist i fig. 15 var bindingen fuldstændig afhængig af til-5 stedeværelsen af divalente kationer. Ved fysiologiske koncentrationer var Mg2+ alene tilstrækkelig til maksimal cellebinding, mens Ca2+ alene giver meget lave niveauer af binding. En tiendedel Mg2+ af den normale koncentration sammen med Ca2+ var imidlertid synergi-10 stisk og frembragte maksimal binding.

Sammenfattende viser specificiteten af cellebinding til renset ICAM-1, inkorporeret i kunstige membraner, den specifikke inhibering med monoklonale antistoffer og temperaturbehovet og det divalente kationbe-15 hov, at ICAM-1 er en specifik ligand for det LFA-i afhængige adhæsionsystem.

Eksempel 22

Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR 1 20 allergiske og toxiske lappetestreaktioner.

Hudbiopsier fra fem normale individer undersøgtes for deres ekspression af ICAM-1 og HLA-DR. Det viste sig, at medens endotelcellerne i nogle blodkar sædvanligvis eksprimerede ICAM-1, eksprimeredes der in-25 gen ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud. Ingen farvning for HLA-DR på nogen keratinocytter fra normale hudbiopsier observeredes. Kinetikken af ekspression af ICAM-1 og klasse Il-antigener undersøgtes dernæst på celler i biopsier fra allergiske og toxiske hudlæsio-3 0 ner. Det viste sig at halvdelen af de seks undersøgte individer havde keratinocytter, som eksprimerede ICAM-1, fire timer efter påføring af haptenet (Tabel 10). Der var en øgning i procentdelen af individer, der eksprimerer ICAM-1 på deres keratinocytter, med ti-35 den for udsættelse for haptenet, samt en øgning af intensiteten af farvning, hvilket indikerer mere ICAM-1 93 DK 175577 B1 ekspression pr. keratinocyt op til 48 timer. Faktisk er der på dette tidspunkt en del keratinocytter i alle biopsier farvet positivt for ICAM-l. ved 72 timer (24 timer efter haptenet fjernedes) havde 7 ud af 8 indivi-5 der stadigvæk ICAM-l eksprimeret på deres keratinocytter, mens ekspressionen af ICAM-l på ét individ dalede mellem 48 og 72 timer.

DK 175577 B1 94

Tabel 10

Kinetik af Indføring af ICAM-l og HLA-DR på keratlno-cytter fra allergiske lappetestblopsier.

5 ____

Tid efter Antallet ICAM-l HLA-DR ICAM-l og

lappepåføring af alene alene HLA-DR

(timer)_biopsier__

Normal hud_5_0___0_0_ 10 Allergisk lappetest 4 6 3a 0 0 8 9 3 0 0 24 8 7 0 0 15 48b 8 5 0 3 72 8 6 0 1 20 1 a Prøver betragtedes som værende positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes. b Alle lapper fjernedes på dette tidspunkt.

95 DK 175577 B1

Histologisk var farvningsmønsteret for ICAM-1 på keratinocytter fra biopsier taget fire timer efter påføring af haptenet sædvanlig i små klynger. Ved 48 timer eksprimeredes ICAM-1 på overfladen af størstedelen 5 af keratinocytterne, idet der ikke sås nogen forskel mellem skadens center og periferi. Intensiteten af farvningen aftog efterhånden som keratinocytterne nærmede sig stratum corneum. Dette konstateredes hos biopsier taget fra centrum og periferien af læsionerne. På 10 dette tidspunkt var lappetesten også positiv (infiltration, erythema og vesikler). Der observeredes ingen forskel i ICAM-1 ekspression når forskellige haptener påførtes følsomme individer. Foruden på keratinocytter eksprimeredes ICAM-1 også på visse mononukleære celler 15 og endotelceller på læsionsstedet.

Ekspressionen af HLA-DR på keratinocytter i de allergiske hudlæsioner var mindre hyppig end ekspressionen af ICAM-1. ingen af de undersøgte individer havde læsioner med keratinocytter, som farvedes positivt 20 for HLA-DR op til 24 timer efter påføring af haptenet.

Faktisk havde kun fire biopsiprøver keratinocytter, som eksprimerede HLA-DR, og ingen biosier havde keratinocytter, der var positive overfor HLA-DR og ikke ICAM-1 {Tabel 10).

25 I modsætning til den allergiske lappetestlæsion havde den toxiske lappetestlæsion, induceret med kro-tonolie eller natriumlaurylsulfat, keratinocytter, der udviste en kun ringe mængde, om nogen, ICAM-1 på deres overflader på alle testede tidspunkter (Tabel 11). Fak-30 tisk havde kun ét af de 14 individer, der var udsat for den toxiske lappetest, keratinocytter, der eksprimerede ICAM-1 i deres læsioner, 48 timer efter lappepåføring, hvilket tidspunkt er det optimale tidspunkt for ICAM-1-ekspression hos de allergiske lappetestindivider. I 35 modsætning til de allergiske lappetestbiopsier eksprimeredes der desuden ikke HLA-DR på keratinocytter fra toxiske lappetestlæsioner.

96 DK 175577 B1

Disse data indikerer at ICAM-1 eksprimeres i immunbaseret inflammation og ikke i toxisk baseret inflammation, og ekspressionen af ICAM-1 kan således benyttes til at skelne mellem immunobaseret og toxisk 5 baseret inflammation, såsom akut nyresvigt hos nyretransplantationspatienter, hvor det er vanskeligt at bestemme hvorvidt svigtet skyldes afvisning eller nephrotoxicitet af det immunoundertrykkende terapeutiske middel. Nyrebiopsi og vurdering af opregulering af 10 ICAM-1 ekspressionen vil tillade differentiering mellem immunbaseret afvisning og ikke-immunbaseret toxicitets-reaktion.

Tabel 11

Kinetik af indføring af ICAM-1 og HLA-DR på kerati-15 nocytter fra toxlske lappetestbiopsier.

Tid efter Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og

lappepåføring af alene alene HLA-DR

20 (timer)_biopsler_ 4 4 0 0 0 8 3 la 0 0 24 3 1 0 0 48b 14 10 0 25 72 3 1 0 0 a Prøver betragtedes som værende positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes.

30 b Alle lapper fjernedes på dette tidspunkt._ 97 DK 175577 B1

Eksempel 23

Eksprimering af ICAM-1 og HLA-DR 1 godartede kutane sygdomme.

Celler fra hudbiopsier med læsioner fra patien-5 ter med forskellige typer af inflammatoriske hudsygdomme undersøgtes for deres ekspression af ICAM-1 og HLA-DR. En del keratinocytter i biopsier med allergisk kontakteksem, pemphigoid/pemphigus og lichen planus eks-primerede ICAM. Lichen planus-biopsier viste den mest 10 intense farvning med et mønster svarende til eller endog stærkere end den, der konstateredes hos de 48 timer allergiske laptestbiopsier (Tabel 12). I overensstemmelse med resultaterne, der sås ved den allergiske lappetest, konstateredes den mest intensive lCAM-1-farv-15 ning på steder med kraftig mononukleær celleinfiltration. 8 ud af de 11 testede lichen planus-biopsier var yderligere positive for HLA-DR ekspression på keratinocytter.

Ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytter fra 20 hudbiopsier fra patienter med exanthema og urticaria var mindre udtalt. Kun fire ud af de syv testede patienter med disse sygdomme havde keratinocytter, der eksprimerede ICAM-l på læsionsstedet. HLA-DR ekspression viste sig kun på én patient, og dette var i for-25 bindelse med ICAM-1.

Endotelceller og en del af de mononukleære cel-leinfiltrater fra alle de testede godartede inflammatoriske hudsygdomme eksprimerede ICAM-1 i forskellig udstrækning .

DK 175577 B1 98

Tabel 12

Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR på keratinocytter fra godartede kutane sygdomme.

5 Diagnose Antallet ICAM-1 HLA-DR ICAM-1 og _af tilfælde alene alene HLA-DR_

Allergisk kontakteksem 5 3a o 2

Lichen Planus 11 . 3 0 8 10 Pemhigoid/

Pemhigus 2 200

Exanthema 3 20 0

Urticaria 4 101 15 aPrøver betragtedes som værende positive, hvis mindst 20 små klynger af keratinocytter farvedes.

DK 175577 B1 99

Eksempel 24

Ekspression af ICAM-1 på keratlnocytter fra psorlatiske hudlæsioner.

Ekspressionen af ICAM-1 i hudsbiopsier fra 5 pa-5 tienter med psoriasis undersøgtes før initieringen og periodisk under et forløb med PUVA-behandling. Biopsier opnåedes fra fem patienter med klassisk psoriasis bekræftet ved histologi. Biopsier blev udtaget i rækkefølge før og under indikeret tid for PUVA-behandling.

10 PUVA tilførtes 3-4 gange om ugen. Biopsier blev taget fra periferien af de psoriatiske plaques hos fem patienter og yderligere biopsier blev taget fra klinisk normal hud fra fire af patienterne.

Friske hudbiopsistykker blev frosset og opbevaret 15 i flydende nitrogen. Seks pm cryostatsektioner lufttørredes natten over ved stuetemperatur, fikseredes i acetone i 10 min. og farvedes enten straks eller indpakkedes i aluminiumfolie og opbevaredes ved -80eC indtil farvning.

20 Farvning gennemførtes på den efterfølgende måde.

Sektioner inkuberedes med monoklonale antistoffer og farvedes ved en 3-trins immunoperoxidasemetode (Stein, H., et al., Adv. Cancer Res 42:67-147, (1984)), under anvendelse af diaminobenzidin H202-substrat. Tonsiler 25 og lymfeknuder benyttedes som en positiv kontrol på anti-ICAM-1- og HLA-DR-farvning. Væv farvet i fravær af et primært antistof var negative kontroller.

De monoklonale antistoffer mod HLA-DR erhveredes fra Becton Dickinson (Mountainview, California). Det 30 monoklonale anti-ICAM-l-antistof var R6-5-D6. Peroxida-se-konjugeret kanin-anti-muse-Ig og peroxidase-konjugeret svine-anti-kanin-Ig erhvervedes fra DAKOPATTS, København, Danmark. Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid opnåedes fra Sigma (St. Louis, Mo.).

35 Resultaterne af undersøgelsen viste, at endotel- cellerne i nogle blodkar eksprimerer ICAM-1 i både syg 100 DK 175577 B1 og normal hud, men intensiteten af farvning og antallet af blodkar, der eksprimerer ICAM-1 øgedes i de psoria-tiske hudlæsioner. Mønsteret af ekspression af ICAM-1 varierede desuden i keratinocytter fra ubehandlede 5 psoriatiske-hudlæsioner fra de fem patienter, fra at kun små klynger af celler var farvet til at mange keratinocytter var farvet. Under forløbet med PUVA-behand-ling viste ICAM-1-ekspressionen på to af patienterne (patient nr. 2 og 3) udbredt reduktion, som gik forud 10 for eller var samtidig med klinisk remission (Tabel 13). Patienterne nr. l, 4 og 5 havde formindskelse og øgning af ICAM-l-ekspression under PUVA-behandlingen, hvilket korrelerer med henholdsvis kliniske remissioner og tilbagefald. Der var ingen ICAM-l-ekspression på 15 keratinocytter fra normal hud før eller efter PUVA-behandling. Dette indikerer, at PUVA ikke inducerer ICAM-1 på keratinocytter fra normal hud.

Observationen af at densiteten af det mononukle-ære celleinfiltrat korrelerede med mængden af ICAM-1-20 ekspression på keratinocytter var af betydning. Dette vedrører både et aftagende antal mononukleære celler i læsioner under PUVA-behandling, når ICAM-l-ekspression også aftog, og et øget antal af mononukleære celler under PUVA-behandling, når ICAM-l-ekspression på kera-25 tinocytter var mere fremtrædende. Endotelceller og dermale mononukleære celler er også iCAM-l-positive.

I klinisk normal hud var ICAM-l-ekspressionen begrænset til endotelceller uden mærkning af keratinocytter .

30 Ekspressionen af HLA-DR på keratinocytter var variabel. Der var ingen HLA-DR-positiv biopsi, der ikke også var lCAM-1-positiv.

Sammenfattende viser disse resultater, at før behandling er ICAM-l-ekspression udtalt på keratinocyt-35 terne og korrelerer med et tæt mononukleær celleinfiltrat. Under PUVA-behandling ses en udtalt mindskelse af 101 DK 175577 B1 ICAM-l-farvning parallelt med den kliniske forbedring. Histologisk mindskedes det dermale infiltrat også. Når et klinisk tilbagefald var tydelig under behandlingen, øgedes ekspressionen af ICAM-l på keratinocytterne og 5 tætheden af dermal infiltrat. Når en klinisk remission konstateredes under behandlingen, var der en samtidig aftagelse i ICAM-l-farvning på keratinocytterne og en mindskelse i det dermale infiltrat. Ekspressionen af ICAM-l på keratinocytter svarede således til tætheden 10 af mononukleær celleinfiltrat på dermis. Disse data viser at klinisk reaktion overfor PUVA-behandling resulterer i en udtalt mindskelse af ICAM-l-ekspression på keratinocytter parallelt med en mere moderat aftagelse af de mononukleære celler. Dette indikerer, at ICAM-1-15 ekspression på keratinocytter er ansvarlig for inite-ring og opretholdelse af det dermale infiltrat, og at PUVA-behandling nedregulerer ICAM-l, som på sin side mindsker det dermale infiltrat og den inflammatoriske reaktion. Dataene indikerer desuden at der var en va-20 riabel HLA-DR-ekspression på keratinocytter under PUVA-behandling.

Ekspressionen af ICAM-l på keratinocytter i psoriatiske læsioner korrelerer med den kliniske alvorlighed af læsionen samt størrelsen af det dermale in-25 filtrat. ICAM-l spiller således en central rolle ved psoriasis og inhibering af dets ekspression og/eller inhibering af dets interaktion med CD 18 komplekset på mononucleære celler vil være en virkningsfuld behandling af sygdommen. Registrering af ICAM-l-ekspression 30 på keratinocytter vil yderligere være et effektivt værktøj til diagnostisering og prognose, samt evaluering af terapiforløbet for psoriasis.

102 DK 175577 B1

Tabel 13

Sekventiel ICAM-l-ekspression af keratinocytter i pso-riatiske hudlæsioner (PS) og klinisk normal hud (N) før og under PUVA-behandling.

5 _______ patient nr.

Tid før og 1 2 3 4 5 under

PUVA-behandling PS PS N PS N PS N PS N

10 0 + + -++-++-+++-1 dag + 1 uge + + ' -++ - + -

O

2 uger ++ + -+-+- 3 uger ++ * o 15 4 uger ++ + - ++ * * 5-6 uger - .

O

7 uger (++) (+) +++ _ * * 10 uger (+) - - 20 +++ Mange positive keratinocytter.

++ En del positive keratinocytter.

+ Fokale positive-keratinocytter.

25 (+) Meget få, spredte positive keratinocytter.

Ingen positiv farvning.

* Klinisk remission, o Klinisk tilbagefald.

DK 175577 B1 103

Eksempel 25

Ekspression af ICAM-i og HLA-DR 1 maligne kutane sygdomme.

Modsat læsioner fra godartede kutane tilstande 5 var ekspressionen af ICAM-1 på keratinocytter fra maligne hudlæsioner meget mere variable (Tabel 14). Af de 23 undersøgte kutane T-cellelymfomaer identificeredes ICAM-l-positive keratinocytter kun i 14 tilfælde. Der var en tendens til at keratinocytter fra biopsier med 10 mycosis fungoide læsioner mister deres ICAM-1-ekspression ved udvikling af sygdommen til mere fremskredne stadier. ICAM-l-ekspression observeredes imidlertid på en varierede del af det mononucleære celleinfiltrat fra de fleste af de kutane T-cellelymfomalæsioner. Blandt 15 de resterende undersøgte lymfomaer havde fire ud af otte keratinocytter, der eksprimerede ICAM-1. Af de 29 patienter med maligne kutane sygdomme, som undersøgtes, havde 5 keratinocytter, som eksprimerede HLA-DR uden at eksprimere ICAM-1 (Tabel 14).

DK 175577 B1 104

Tabel 14,

Ekspression af ICAM-1 og HLA-DR på keratinocytter fra maligne kutane sygdomme.

5

Diagnose Antal ICAM-1 HLA-DR ICAM-l og

_tilfælde alene alene HLA-DR

CTCL, MFI 8 la 0 4 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 10 CTCL, SS 3102 CTCL, Stor celle 2020 CBCL 2 0 0 1

Leukemia Cutis 3111

Histiocytosis X 1 0 0 0 15 __________ aPrøver betragtedes som positive, hvis i det mindste små klynger af keratinocytter farvedes.

DK 175577 B1 105

Eksempel 26

Virkning af antl-ICAM-l-antistoffer på prollferationen af humane perifere mononukleaere blodceller.

Humane perifere mononukleaere blodceller induce-5 res til at proliferere ved tilstedeværelsen og genkendelsen af antigener eller mitogener. Visse molekyler, såsom mitogenet concanavalin A, eller det T-celle-bindende antistof OKT3, forårsager en ikke-specifik proliferation af perifere mononukleaere blodceller.

10 Humane perifere mononukleaere blodceller er heterogene, idet de består af subpopulationer af celler, som er i stand til at genkende specifikke antigener. Når en perifer mononukleaer blodcelle, som er i stand til at genkende et bestemt specifikt antigen, 15 møder dette antigen induceres proliferationen af denne subpopulation af mononukleær celle. Tetanus-toxoid og "keyhole limpet"-hæmocyanin er eksempler på antigener, som genkendes af subpopulationer af perifere mono-hukleære blodceller, men som ikke genkendes af alle pe-20 rifere mononukleaere celler hos sensibiliserede individer.

Anti-ICAM-l-monoklonalt antistof R6-5-D6's evne til at inhibere proliferaktive reaktioner fra humane perifere mononukleære blodceller i systemer, der vides 25 at kræve celle-celleadhæsioner, testedes.

Perifere mononukleære blodceller rensedes på Ficoll-Paque (Pharmacia) gradienter ifølge fabrikantens instruktioner. Efter opsamling af grænsefladen vaskedes cellerne tre gange med RPMI 1640 medium og dyrkedes i 30 fladbundede, 96-brøndes mikrotiterplader i en koncentration på 106 celler/ml i RPMI 1640 medium suppleret med 10% fetal bovin serum, 2 mM glutamin og gentamicin (50 yg/ml).

Antigen, enten T-cellemitogenet, concanavalin A 35 (0,25 pg/ml), det T-celle-bindende antistof, OKT3 (0,001 pg/ml), "keyhole limpet"-hæmocyanin (10 g/ml) 106 DK 175577 B1 eller tetanus-toxoid {1:100 fortynding fra kilde) sattes til celler, som dyrkedes som beskrevet ovenfor enten i nærværelse eller fravær af anti-lCAM-antistof (R6-5-D6; slutkoncentration på 5 g/ml). Cellerne dyrke-5 des i 3,5 dage (concanavalin A forsøg), 2,5 dage (0KT3-forsøg) eller 5,5 dage ("keyhole limpet"-hæmocyanin og tetanus-toxoid-forsøg) før prøverne afsluttedes.

18 timer før afslutningen af prøven sattes 2,5 MCi 3H-thymidin til kulturerne. Cellulær prolifera-10 tion prøvedes ved at måle inkorporeringen af thymidin i DNA ved de perifere mononukleære blodceller. Inkorporeret thymidin opsamledes og taltes i en væskescin-tillationstæller (Merluzzi et al., J. Immunol.

139:166-168 (1978)). Resultaterne af disse forsøg er 15 vist i fig. 16 (concanavalin A-forsøg), fig. 17 (OKT3-forsøg), fig. 18 ("keyhole limpet"-hæmocyanin-forsøg) og fig. 19 (tetanus-toxoid-forsøg).

Det viste sig, at anti-ICAM-l-antistof inhiberer proliferative reaktioner overfor det ikke-specifikke T-20 cellemitogen, ConA; det ikke-specifikke T-celleassocie-rede antigen, OKT-3; og de specifikke antigener, "keyhole limpet"-hæmocyanin og tetanus-toxoid, i mononukleære celler. Inhiberingen af anti-ICAM-lantistof var sammenlignelig med inhiberingen af anti-LFA-l-anti-25 stof, hvilket tyder på, at ICAM-l er en funktionel ligand af LFA-1, og at antagonisme af ICAM-l vil inhibere specifikke forsvarssystemreaktioner.

Eksempel 27 30 Virkning af anti-ICAM-l-antistof på den blandede lymfocytreaktion.

Som omtalt ovenfor er ICAM-l nødvendig for effektive cellulære interaktioner under en immunreaktion medieret gennem LFA-1-afhængig celleadhæsion. Induk-35 tionen af ICAM-l under immunreaktioner eller inflammatorisk sygdom tillader interaktionen af leukocytter med hinanden og med entodelceller.

107 DK 175577 B1 Når lymfocytter fra to ikke-relaterede individer dyrkes i hinandens nærværelse observeres blasttransfor-mation og celleproliferation af lymfocytterne. Denne reaktion af én population af lymfocytter overfor nærvæ-5 reisen af en anden population af lymfocytter er kendt som en blandet lymfocytreaktion (MLR), og den er analog med reaktionen af lymfocytter overfor tilsætningen af mitogener (Immunology The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein. J., John Wiley & Sons, NY (1982), 10 S. 453-458).

Der gennemførtes forsøg til bestemmelse af virkningen af anti-lCAM-l-monoklonale antistoffer på human MLR. Disse forsøg gennemførtes som følger. Perifert blod opsamledes fra normale raske donorer ved vene-15 punktur. Blodet opsamledes i hepariniserede rør og fortyndes 1:1 ved stuetemperatur med Puck's G (GIBCO) balancerede saltopløsning (BSS). Blodblandingen (20 ml) anbragtes som et lag ovenpå 15 ml af en Ficoll/Hypaque densitetsgradient (Pharmacia, tæthed = 1,078, stuetem-20 peratur) og centrifugeredes ved 1000 x g i 20 min. Grænsefladen opsamledes og vaskedes 3X i Puck's G. cellerne taltes på et hæmacytometer og genopslæmmedes i RPMI-1640 dyrkningsmedium (GIBCO) indeholdende 0,5% gentamicin, 1 mM L-glutamin (GIBCO) og 5% varmeinakti-25 veret (56°C, 30 min.) human AB sera (Flow Laboratories) (herefter omtalt som RPMI-dyrkningsmedium).

Muse-anti-ICAM-1 (R6-5-D6) benyttedes i disse forsøg. Alle monoklonale antistoffer (fremstillet fra ascites af Jackson ImmunoResearch Laboratories, Boston, 30 MA) benyttedes som rensede IgG-præparater.

Perifere mononucleære blodceller (PBMC) dyrkedes i medium med 6,25 x 105 celler/ml i Linbro rund-bundede mikrotiterplader (# 76-013-05). Stimulator celler fra en adskilt doner bestråledes ved 1000 R og 35 dyrkedes med respondercellerne ved den samme koncentration. Det totale volumen per kultur var 0,2 ml. Kon- 108 DK 175577 B1 troller omfattede responderceller alene og stimulatorceller alene. Dyrkningspladerne inkuberedes ved 37°C i en 5% CC^-fugtet luftatmosfære i 5 dage. Brøndene pulseredes med 0,5 yCi tritieret thymidin (3HT) {New Eng-5 land Nuclear) under de sidste 18 timers dyrkning. I nogle tilfælde gennemførtes en 2-vejs MLR. Protokollen var den samme med undtagelse af at den anden donors celler ikke inaktiveredes ved bestråling.

Cellerne høstedes på glasfiberfiltre under an-10 vendelse af et automatiseret multiprøvehøstapparat (Skatron, Norge), idet der skylledes med vand og methanol. Filtrene ovntørredes og taltes i Aquasol i en Beckman (LS-3801) væske-scintillationstæller. Resultaterne er angivet som middelværdien af CPM + middelfejl for 15 6 individuelle kulturer.

Tab. 15 viser at rensede anti-lCAM-1 monoklonale antistoffer inhiberer MLR på en dosisafhængig måde med signifikant undertrykkelse synlig ved 20 ng/ml. Renset muse-IgG havde kun ringe eller ingen undertrykkende 20 virkning. Undertrykkelse af MLR med det anti-ICAM-1 monoklonale antistof forekommer når antistoffet tilsættes indenfor de første 24 timers dyrkning (Tabel 16).

DK 175577 B1 109

Tabel 15

Virkning af anti-ICAM-l-antistof på én-vejs lymfocyt-reaktionen._ 5 a c ,

Responderceller Stimulator- Antistof JHT-Inkorporation (CPM) celler 445d i 143 + - 148 i 17 + - 698 ± 72 10 _______ + + - 42.626 ± 1.579 + + mlgG (10,0 øg) 36.882 ±1.823(14%) + + mlgG ( 0,4 øg) 35.500 ± 1.383 (17%) 15 + + mlgG ( 0,02 øg) 42.815 ± 1.246 ( 0%) + + R6-5-D6 (10,0 øg) 8.250 ± 520 (81%) + + R6-5-D6 ( 0,4 øg) 16.142 ± 858 (62%) ♦ + R6-5-D6 ( 0,03 øg) 28.844 ± 1.780 (32%) 1 2 3 4 5 6 a. Responderceller (6,25 X 105/ml) 2 b. Stimulatorceller (6,25 X 105/ml, bestrålet ved 3 10000R).

4 c. Renset monoklonalt antistof mod ICAM-1 (R6-5-D6) 5 eller renset muse IgG (mlgG) ved slutkoncentra- 6 tioner (øg/ml).

d. Middelværdi + middelfejl af 5-6 kulturer, tal i parenteser angiver procent inhibering _af MLR._ _ DK 175577 B1 110

Tabel 16

Tilsætningstidspunkt for anti-iCAM-l.

^ Ra 3HT Inkorporering (CPM)

Tilsætningstidspunkt for medium eller antistof Dag 0 Dag 1 Dag 2 10 medium 205^ ± 14 476 ± 132 247 ± 75 - + medium 189 ± 16 nde nd + - medium 1.860 i 615 nd nd 15 + + medium 41.063 ± 2.940 45,955 ± 2.947 50.943 i 3.072 + + R6-5-D6 17.781 i 1.293 38.409 ± 1.681 47.308 i 2.089 (57%)f (16%) (7%) a. Responderceller (6,25 x 105/ml).

20 b. Stimulatorceller (6,25 x 105/ml, bestrålet ved 1000 R).

c. Dyrkningsmedium eller renset monoklonalt anti stof mod ICAM-l (R6-5-D6) ved 10 pg/ml tilsattes på dag 0 med 24 timers intervaller.

25 d. Middelværdi + middelfejl af 4-6 kulturer.

e. nd = ikke udført.

f. Procent inhibering 111 DK 175577 B1

Sammenfattende kan det anføres, at evnen hos antistof mod ICAM-l til at inhibere MLR viser, at ICAM-1 monoklonale antistoffer har terapeutisk anvendelighed ved akut transplantationsafvisning. ICAM-1 monoklonale 5 antistoffer har desuden terapeutisk virkning ved beslægtede immunmedierede sygdomme, der afhænger af LFA-1/ICAM-1 regulerede celle-til-celle-interaktioner.

De her beskrevne forsøg viser at tilsætningen af monoklonale antistoffer til ICAM-1 inhiberer den blan-10 dede lymfocytreaktion (MLR), når de tilsættes under de første 24 timer af reaktionen. ICAM-1 bliver yderligere opreguleret på humane perifere blodmonocytter under in vitro dyrkning.

Det har yderligere vist sig, at ICAM-1 ikke 15 eksprimeres på hvilende humane perifere blodlymfocytter eller -monocytter. ICAM-1 opreguleres på monocytterne af dyrkede celler alene eller celler, der er codyrket med ikke-relaterede donorceller i en blandet lymfocytreaktion under anvendelse af almindelige flowcyto-20 metriske analyser. Denne opregulering af ICAM-l på monocytter kan anvendes som en indikator for inflammation, især hvis ICAM-1 eksprimeres på friske monocytter fra individer med akut eller kronisk inflammation.

ICAM-1's specificitet for aktiverede monocytter 25 og evnen hos antistof mod ICAM-1 til at inhibere en MLR tyder på, at ICAM-1-monoklonale antistoffer kan have en mulig diagnostisk og terapeutisk anvendelighed ved akut transplantationsafvisning og relaterede immunmedierede sygdomme, der kræver celle-til-celle-interaktioner.

30

Eksempel 28

Synerqlstiske virkninger af den kombinerede administrering af anti-ICAM-1- og antl-LFA-l-antistoffer.

Som vist i eksempel 27 inhiberes MLR af anti-35 ICAM-l-antistof. MLR kan desuden inhiberes af anti-LFA-l-antistoffet. For at bestemme hvorvidt den kombi- 112 DK 175577 B1 nerede administration af anti-ICAM-1- og anti-LFA-1-antistoffer ville have en forbedret eller synergistisk virkning gennemførtes en MLR-prøve (gennemført som beskrevet i eksempel 27) i nærværelse af forskellige 5 koncentrationer af de to antistoffer.

Denne MLR-prøve viste, at kombinationen af anti-ICAM-1 plus anti-LFA-1, i koncentrationer, hvor intet af de to antistoffer alene dramatisk inhiberer MLR, er signifikant mere potente mht. inhibering af MLR-reak-10 tionen (Tabel 17). Dette resultat indikerer at terapier som involverer coadministreringen af anti-ICAM-l-anti-stof (eller fragmenter deraf) og anti-LFA-1-antistof (eller fragmenter deraf) har evnen til at bibringe en forbedret anti-inflammatorisk terapi. En sådan forbed-15 ret terapi muliggør administrering af lavere doser af antistof, end der ellers ville være terapeutisk effektive, og dette er af vigtighed, hvor høje koncentrationer af individuelle antistoffer inducerer en antiidio-typisk reaktion.

DK 175577 B1 113

Tabel 17

Virkning af forskellige doser af anti-ICAM-1 og (R3.1) anti-LFA-1 på blandet lymfocytreaktion.

5 % Inhibering

Koncentration (yg/ml)

Anti-ICAM-1 (R6-5-D6)

Anti-LFA-1 0 0,004 0,02 0,1 0,5 2,5 10 0,0 0 7 31 54 69 70 0,0008 1 7 28 48 62 71 0,004 0 13 30 50 .64 72 0,02 29 38 64 75 84 86 0,1 92,5 90 91 92 92 92 15 0,5 93 90 90 92 93 91

Eksempel 29 20 Additive virkninger af kombineret administrering af sub-optlmale doser af anti-ICAM-1 og andre immunosuppressive midler i MLR.

Som vist i eksempel 28 inhiberes MLR af kombina-25 tioner af anti-ICAM-1- og anti-LFA-l-antistoffer. Til bestemmelse af, hvorvidt den kombinerede administration af anti-ICAM-1 og andre immunosuppressive midler (såsom dexamethason, azathioprin, cyclosporin A eller steroider, som f.eks. prednison osv.) også ville have forøge-30 de virkninger, udførtes der MLR-prøver under anvendelse af sub-optimale koncentrationer (dvs. koncentrationer, som vil være lavere end den optimale koncentration, ved hvilken midlet alene vil blive administreret til et individ) af R6-5-D6 sammen med andre immunosuppressive 35 midler ifølge protokollen i eksempel 27. Dataene angiver, at de inhiberende virkninger af R6-5-D6 er i det 114 DK 175577 B1 mindste additive med de inhiberende virkninger af sub-optimale doser af dexamethason (Tabel 18), azathioprin (Tabel 19) og cyclosporin A (Tabel 20). Dette indebærer, at anti-ICAM-l-antistoffer kan være effektive med 5 hensyn til at sænke de nødvendige doser af kendte immunosuppressive midler og således nedsætte deres toksiske bivirkninger. Ved anvendelse af et anti-ICAM-l-antistof (eller et fragment heraf) til opnåelse af en sådan immunosuppression er det muligt at kombinere administre-10 ringen af antistoffet (eller fragmentet heraf) med enten et enkelt yderligere immunosuppressivt middel, eller med en kombination af mere end et yderligere immunosuppressivt middel.

15 Tabel 18

Virkning af anti-ICAM-1 og dexamethason på human MLR

Inhibitor 3HT

20 Gruppe (ng/ml) Inkorporering % _(CPM)_Inhibering

Medier - 156

Stimulatorer (S) - 101

Respondere (R) - 4.461 25 R x S_=_34.199 -_ R x S_R6-5-D6 (B) 26.224_23_ R x S_Dex (50) 14.158_59_ R x S R6-5-D6 (8) _+ Dex (50) 7.759_77_ 30 Dex: Dexamethason 115

Tabel 19 DK 175577 B1

Virkning af anti-lCAM-1 og azathioprin på human MLR

5 3 HT

Gruppe Inhibitor Inkorporering % _ (nq/ml)_(CPM)_Inhiberlnq

Medier - 78

Stimulatorer (S) - 174 10 Respondere (R) - 3.419 R x S_=_49.570 _ R X S_R6-5-D6 (8) 44.374_11 R x S_Azathioprin (1) 42.710_14_ R X S R6-5-D6 (8) 15 _+ Azathioprin (1) 34.246_ 31_

Tabel 20

Virkning af anti-lCAM-1 og cyclosporin A på human MLR

20' _

Inhibitor 3HT

Gruppe (ng/ml) Inkorporering % _______(CPM)_Inhiberinq

Medier - 87 25 Stimulatorer (S) - 206

Respondere (R) - 987 Η X S__-_31.640_:_ R X s_R6-5-D6 (8) 26.282_17_ R x s_CyA (10) 23.617_25_ 30 R x S R6-5-D6 (8) ____+ CyA (10) 19.204 _39_

CyA: Cyclosporin A

116 DK 175577 B1

Eksempel 30

Virkning af antl-ICAM-l-antistof mht. undertrykkelse af afvisningen af transplanterede allogene organer.

For at vise virkningen af anti-ICAM-l-antistof 5 mht. undertrykkelse af afvisningen af et allogenisk transplanteret organ, transplanteredes Cynomolgus aber med allogene nyrer i overensstemmelse med fremgangsmåden beskrevet af Cosimi et al. (Transplant. Proc. 13: 499-503 (1981)) med den ændring, at valium og ketamin 10 benyttedes som anæsthetika.

Nyretransplantationen gennemførtes således i det væsentlige som følger. Heterotropiske nyreallotrans-plantationer gennemførtes hos 3-5 kg Cynomolgus aber, i det væsentlige som beskrevet af Marquet (Marguet et 15 al. , Medical Primatology, Part II, Basel, Karger, s.

125 (1972)) efter induktion af anæsthesi med valium og ketamin. Ende-til-side anastomoser af donor-nyrekar på et stykke af aorta eller vena cava konstrueredes under anvendelse af 7-0 Prolene sutur. Donorureteren 20 spatuleredes og implanteredes ind i blæren ved hjælp af den ekstravesiale metode (Taguchi, Y., et al., i Daus-set et al. (eds), i: Advances in Transplantation, Baltimore, Williams & Wilkins, s. 393 (1968)). Nyrefunktionen evalueredes ved ugentlige eller to gange ugent-25 lige serumcreatinin-bestemmelser. Yderligere skaffedes hyppige allotransplantationsbiopsier til histopatologiske undersøgelser, og fuldstændige autopsier gennemførtes på alle ikke-overlevende modtagere. Hos de fleste modtagere gennemførtes bilateral nephrectomi på trans-30 plantationstidspunktet, og efterfølgende uræmisk død betragtedes som slutpunktet for allotransplantations-overlevelse. Hos nogle modtagere gennemførtes unilateral nativ nephrectomi og kontralateral ureteral ligation på transplantationstidspunktet. Når allotrans-35 plantationsafvisning forekom, fjernedes ligaturen på den autologe ureter, hvilket resulterede i restituering 117 DK 175577 B1 af normal nyrefunktion og muligheden for at fortsætte immunologisk overvågning af det modtagende dyr.

Monoklonalt antistof R6-5-D6 administreredes dagligt i 12 dage, startende to dage før transplanta-5 tion, i en dosis på 1-2 mg/kg/dag. Serumkoncentrationer af creatinin testedes periodisk for at overvåger afvisning. Virkningen af anti-ICAM-l-antistof på immunsystemets afvisning af de allogeniske nyrer er vist i Tabel 21.

DK 175577 B1 118

Tabel 21 R6-5-D6-aktivitet mht. til forlængelse af nyreallo-transplantationsoverlevelse ved profylaktiske protokoller hos Cynomulgus abena 5 _

Dage af overle-

Abe Dosis af R6-5-D6 (mg/kg) velse/efterbe- _handling_ 10 Kontrol 1 8

Kontrol 2 11

Kontrol 3 11

Kontrol 4 10

Kontrol 5 9 15 Kontrol 6 - 10 M15 1,0 20 M19 1,0 7b M17 1,0 30 M25 1,5 29 20 M23 1,0 llc M27 2,0 34 M7 0,5 22

Mil 0,5 26 M10 0,5 22 25 M8_0J5_ 26d_ a Aber fik indgivet R6-5-D6 i 12 på hinanden følgende dage begyndende to dage før transplantationen. b Dødsårsag er ukendt. Der var tegn på latent mala-30 ria.

c Død af nyre-infarkt.

d Stadig i live den 15. august 1988.

Resultaterne viser, at R6-5-D6 var effektivt med 35 hensyn til at forlænge livet hos aber, der havde fået foretaget allogeniske nyretransplantationer.

119

Eksempel 31 DK 175577 B1

Virkning af anti-ICAM-l-antistof med hensyn til undertrykkelse af akut afstødning af transplanterede orga-5 ner.

Por at vise at anti-ICAM-l-antistof er effektivt i en akut model af transplantatafstødning, testedes R6-5-D6 også i en terapeutisk eller akut nyreadstød-10 ningsmodel. I denne model transplanteredes abenyrer (under anvendelse af den i eksempel 30 beskrevne protokol), og der blev perioperativt indgivet 15 mg/kg cyclosporin A (CyA) i.m., indtil der var opnået stabil nyrefunktion. Dosen af CyA formindskedes derefter to 15 gange om ugen i spring på 2,5 mg/kg, indtil der indtrådte afstødning som angivet ved en stigning i blod-kreatininkoncentrationerne. På dette tidspunkt administreredes R6-5-D6 i 10 dage, og overlevelseslængde registreredes. Det er vigtigt at bemærke, at ved denne 20 protokol forbliver dosen af CyA suboptimal, da den ikke ændrer sig, når først den akutte afstødningsepisode indtræder. I denne model overlever historiske kontroldyr (N=5) uden nogen antistof-redning i 5 til 14 dage fra starten af afstødningsepisoden. Til dato testedes 25 seks dyr under anvendelse af R6-5-D6 i denne protokol (Tabel 22). To af disse dyr er stadig overlevende (M12, 31 dage og M5, 47 dage efter administreringen af R6-5-D6). To dyr levede 38 og 55 dage efter påbegyndelsen af R6-5-D6-terapi, og to dyr døde af andre årsager 30 end akut afstødning (et dyr døde af CyA-toksicitet), og det andet døde, medens det fik indgivet R6-5-D6 under anæsthesi. Denne model ligger tættere på den kliniske situation, i hvilken R6-5-D6 først ville blive anvendt.

120

Tabel 22 DK 175577 B1 R6-5-D6-aktivitet mht. forlængelse af nyreallotrans-plantationsoverlevelse i terapeutiske protokoller hos 5 Cynomulgus aben3

Dag for afstødnings- Dage af over-

Abe episode^ levelse/efter- _behandling_ 10 Kontroldyrc 14-98 5-14 M24 41 38 M21 34 4d M3 41 55 M9 12 lle 15 M12 37 >31f M5_26_>46f_ 3 Aber fik indgivet 1-2 mg/kg af R6-5-D6 i 10 på hinanden følgende dage efter starten af afstødning.

20 b Dag, på hvilken kreatininkoncentrationerne steg som følge af nedsættelse af CyA-doseringen, og R6-5-D6-terapien startede.

c Fem dyr testedes under anvendelse af den ovenfor beskrevne terapeutiske protokol, bortset fra at 25 der ikke var nogen redningsterapi. Dage af over- levelse/efterbehandling repræsenterer overlevelsesdage, når først kreatininkoncentrationerne begyndte at stige.

^ Døde under anæsthesi. Kreatininkoncentrationerne 30 var lave.

e Død af CyA-toksicitet. Kreatininkoncentrationerne var lave.

^ Stadig i live den 15. august 1988.

121

Eksempel 32 DK 175577 B1

Genetisk konstruktion og ekspression af afkortede derivater af ICAM-1 5 I dets naturlige tilstand er ICAM-l et cellemembran-bundet protein, der indeholder en ekstracellu-lær region med 5 immunoglobulinlignende domæner, et transmembrandomæne og et cytoplasmisk domæne. Det var 10 ønskeligt at konstruere funktionelle derivater af ICAM-1, der mangler transmembrandomænet og/eller det cytoplasmiske domæne, idet der kunne frembringes en opløselig, secerneret form af ICAM-1. Disse funktionelle derivater konstrueredes ved oligonucleotid-dirigeret 15 mutagenese af ICAM-l-genet, efterfulgt af ekspression i abeceller efter transfektion med mutantgenet.

Mutationer i ICAM-l-genet resulterende i amino-syresubstitutioner og/eller afkortede derivater frembragtes ved hjælp af den metode, der er angivet af 20 Kunkel, T., (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 488-492 (1985)). ICAM-l cDNA fremstillet som beskrevet ovenfor underkastedes digestion med restriktionsendo-nucleaser Sal 1 og Kpn 1, og det opnåede 1,8 kb DNA-fragment subklonedes ind i plasmidvektoren CDM8 (Seed, 25 B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A. ) 84: 3365- 3369 (1987)). En dut~, ung" stamme af coli (BW313/P3) transformeredes derefter med denne konstruktion betegnet pCDl.BC. Et enkeltstrengs uracilholdigt templat udfriedes fra transformanterne ved infektion 30 med hjælper-fagen R408 (Stratagene). Mutant-ICAM-1-cDNA'er frembragtes derefter ved priming af en anden-strengs-syntese med et oligonucleotid med umage baser og efterfølgende transformation af en ung* vært (MC1061/P3) med det opnåede heteroduplex. Mutanter 35 isoleredes ved screening for nyskabte endonuclease-restriktionssteder indført af mutant-oligonucleotidet.

122 DK 175577 B1

Mutant-lCAM-l-proteinet eksprimeredes ved transfek-tion af Cos-7 celler med mutant-DNA'et i den eukaryoti-ske ekspressionsvektor CDM8 under anvendelse af sædvanlige DEAE-dextran-metoder (Selden, R.F. et al. , I: 5 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.rø. et al., eds. (side 9.2.1-9.2.6 (1987)).

Et afkortet funktionelt derivat af ICAM-1, der mangler transmembrandomænet og det cytoplasmiske domæne, men indeholder den ekstracellulære region med alle 10 5 immunoglobulinlignende domæner, fremstilledes. Et 30 bp mutant-oligonucleotid (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) anvendtes til transformering af kodonerne for aminosyrerne tyrosin (Y) og glutaminsyre (E) i henholdsvis stillingerne 452 og 45 3 til. en phenylalanin 15 (F) og et translations-stopkodon (TAG). Mutanten isole- redes ved hjælp af dens unikke Xba 1 restriktionssted og betegnedes Y452E/F,TAG.

Til ekspression af mutant-proteinet transficere-des COS-celler med tre mutant-subkloner (nr. 2, nr. 7 20 og nr. 8). Tre dage efter transfektion med de tre mutant-subkloner analyseredes kultursupernatanter og cellelysater ved immunopræcipitation med anti-ICAM-1 monoklonalt antistof RR1/1 og SDS-PAGE. ICAM-1 præci-piteredes fra kultursupernatanterne fra celler trans-25 ficeret med mutant-subkloner nr. 2 og nr. 8, men ikke fra detergent-lysater af disse celler. Molekylvægten af i kultursupernatanten fundet ICAM-l var formindsket ca.

6 kd i forhold til membranformen af ICAM-1, hvilket stemmer med den ud fra mutant-DNA'et forudsagte stør-30 relse. Dette funktionelle derivat af ICAM-l ekskreteres således som et opløseligt protein. I modsætning hertil immunopræcipiteredes ICAM-1 ikke fra kontrolkultursu-pernatanter fra celler transficeret med nativt ICAM-1, hvilket viser, at membranformen af ICAM-1 ikke udgydes 35 fra Cos-celler. Endvidere immunopræcipiteredes der ikke noget ICAM-1 fra hverken kultursupernatanter eller cel- 123 DK 175577 B1 lelysater fra negativ kontrol skin-transficerede celler.

Det fra transficerede celler secernerede afkortede ICAM-l rensedes ved immunoaffinitetschromatografi 5 med et ICAM-l specifikt antistof (R6-5-D6) og testedes for funktionel aktivitet ved en cellebindingsprøve.

Efter rensning i nærværelse af detergentet octylgluco-sid fortyndedes præparater indeholdende nativt ICAM-l eller den afkortede, secernerede form til en slutkon-10 centration på 0,25% octylglucosid (en koncentration under den kritiske micellekoncentration af detergentet).

Man lod disse præparater af ICAM-l binde til overfladerne af 96-brønds plastplader (Nunc) til frembringelse af ICAM-l bundet til en fast fase. Efter udvaskning af 15 ubundet materiale bandt ca. 75-80% og 83-88% af SKW-3-celler, som bar LFA-1 på deres overflade, specifikt til henholdsvis den native og den afkortede form af ICAM-l.

Disse data viser, at det secernerede, afkortede opløselige funktionelle derivat af ICAM-l bevarede både den 20 immunologiske reaktivitet og den evne til at mediere ICAM-l-afhængig adhæsion, som er karakteristisk for nativt ICAM-l.

Et funktionelt derivat af ICAM-l, der kun mangler det cytoplasmiske domæne, fremstilledes ved lignen-25 de metoder. Et 25 bp oligonucleotid (TC AGC ACG TAC CTC TAG AAC CGC CA) anvendtes til at ændre kodonet for aminosyre 476 (Y) til et TAG-translationsstopkodon. Mutanten betegnedes Y476/TAG. Ved immunopræcipitationsanaly-se og SDS-PAGE af Cos-celler transficeret med mutanten 30 påvistes en membranbundet form af ICAM-l med en molekylvægt på ca. 3 kd mindre end for nativt ICAM-l. Indirekte immunofluorescens af de mutant-transficerede Cos-celler viste et lignende punkteret farvningsmønster som for nativt ICAM-l eksprimeret på LPS-stimulerede 35 humane endothelceller. Endelig bandt celler transficeret med mutant-DNA'et specifikt til renset LPA-1 på 124 DK 175577 B1 plastoverflader på lignende måde som Cos-celler trans-ficeret med nativt ICAM-1 DNA (Tabel 23).

Tabel 23 5

Evne hos celler, der eksprimerer ICAM-1 eller et funktionelt derivat af ICAM-1 til at binde LFA-1 % Celler, der eksprime- 10 rer ICAM-1, som binder LFA-1 i nærværelse af: Transfektion Intet antistof RR1/1 15 Skin 0 0

Nativt ICAM-1 20 0 Y4 7 6/TAG_20_0

Eksempel 33 20

Kortlægning af funktionelle domæner i ICAM-1

Undersøgelser af ICAM-1 har vist, at molekylet har 7 domæner. Fem af disse domæner er ekstracellulære 25 (idet domæne 5 ligger nærmest celleoverfladen og domæne 1 ligger fjernest fra celleoverfladen), ét domæne er et transmembrandomæne, og ét domæne er cytoplasmisk (dvs. ligger inde i cellen). Til bestemmelse af hvilke domæner, der bidrager til ICAM-1's evne til at binde LFA-1, 30 kan der anvendes epitopkortlægningsundersøgelser. Til udførelse af sådanne undersøgelser fremstiller man forskellige deletionsmutanter og karakteriserer dem med hensyn til deres evne til at binde til LFA-1. Alternativt kan undersøgelserne gennemføres under anvendelse 35 af anti-ICAM-antistof, som vides at gribe ind i ICAM-1's evne til at binde LFA-1. Eksempler på sådant 125 DK 175577 B1 egnet antistof indbefatter RRl/l (Rothlein, R. et. al., J. Immunol. 137: 1270-1274 (1986)), R6.5 (Springer, T.A. et al., US patentansøgning nr. 07/250.446), LB-2 (Clark, E.A. et al., I: Leukocyt Typing (A. Bernard, 5 et al., Eds.), Springer-Verlag side 339-346 (1984)) eller CL203 (Staunton, D.E. et al. , Cell 56: 849-853 (1989)).

Deletionsmutanter af ICAM-1 kan frembringes ved hjælp af et vilkårligt af flere forskellige midler. Det 10 foretrækkes Imidlertid at frembringe sådanne mutanter via sted-dirigeret mutagenese, eller ved hjælp af en anden rekombinant-metode (såsom ved konstruktion af ICAM-l-eksprimerende gensekvenser, hvori sekvenser, der koder for bestemte proteinregioner, er blevet delete-15 ret. Procedurer, der kan tilpasses til at frembringe sådanne mutanter, er velkendte i teknikken. Under anvendelse af sådanne procedurer fremstilledes der tre ICAM-l-deletionsmutanter. Den første mutant mangler aminosyreresterne F185 til og med P284 (dvs. deletion 20 af domæne 3). Den anden mutant mangler aminosyreresterne P284 til og med R451 (dvs. deletion af domænerne 4 og 5). Den tredje mutant mangler aminosyreresterne efter Y476 (dvs. deletion af det cytopiasmiske domæne). Resultaterne af sådanne undersøgelser viser, at 25 domænerne 1, 2 og 3 er overvejende involveret i ICAM-i-interaktioner med anti-ICAM-l-antistof og LFA-1.

Eksempel 34 30 virkning af mutationer i ICAM-l på LFA-l-binding ICAM-1’s evne til at reagere med og binde til LFA-1 medieres af ICAM-1-aminosyrerester, der er til stede i domæne 1 i ICAM-1-molekylet (fig. 8, 9 og 10).

35 Sådanne interaktioner understøttes imidlertid ved bidrag fra aminosyrer, der er til stede i domænerne 2 og 126 DK 175577 B1 3 i ICAM-1. Blandt de foretrukne funktionelle derivater ifølge den foreliggende opfindelse er således opløselige fragmenter af ICAM-1-molekylet, som indeholder domænerne l, 2 og 3 fra ICAM-1. Mere foretrukket er opløse-S lige fragmenter af ICAM-l-molekylet, som indeholder dp-mænerne 1 og 2 fra ICAM-1. Mest foretrukket er opløselige fragmenter af ICAM-1-molekylet, som indeholder domæne 1 fra ICAM-1. Flere aminosyrerester indenfor det første lCAM-1-domæne er involveret i interaktionen mel-10 lem ICAM-l og LFA-l. Substitutioner af disse aminosyrer med andre aminosyrer ændrer ICAM-1's evne til at binde LFA-l. Disse aminosyrerester og substitutionerne er vist i fig. 25. Fig. 25 viser virkningerne af sådanne mutationer på det opnåede mutant-ICAM-l-molekyle's evne 15 til at binde til LFA-l. I fig. 23-25 er der beskrevet rester under angivelse af étbogstavskoden for aminosyrer, efterfulgt af restens position i lCAM-1-molekylet. Således refererer f.eks. "E90" til glutaminsyreresten i position 90 i ICAM-1. Tilsvarende refererer "E90V” til 20 det dipeptid, der er sammensat af glutaminsyreresten i position 90 og valinresten i position 91. Substitutionssekvensen er angivet til højre for skråstregen ("/"). Resterne V4, R13, Q27, Q58 og D60S61 i ICAM-l er involveret i LFA-l-binding.

25 Erstatning af disse aminosyrer ændrede ICAM-1's evne til at binde til LFA-l. F.eks. resulterer erstatning af V4 med G i dannelsen af et mutant-ICAM-l-molekyle, der har mindre evne til at binde til LFA-l (fig.

25). Erstatning af Ri3-resten i ICAM-l med E fører til 30 dannelsen af et mutant-molekyle med væsentlig mindre evne til at binde LFA-l (fig. 25). Erstatning af Q58-resten i ICAM-1 med H fører til dannelsen af et mutantmolekyle med i det væsentlige normal evne til at binde LFA-l (fig. 25). Erstatning af D60S-resterne i ICAM-l 35 med KL fører til dannelsen af et mutant-molekyle med væsentlig mindre evne til at binde LFA-l (fig. 25).

127 DK 175577 B1

Glycosyleringssteder i det andet domæne er også involveret i LFA-l-binding (fig. 23). Erstatning af N103 med K, eller A155N med SV, resulterer i dannelsen af et mutant-ICAM-1 -molekyle, der er i det væsentlige 5 uden evne til at binde LFA-1. I modsætning hertil syntes erstatning af glycosyleringsstedet N175 med A ikke i væsentlig grad at påvirke mutant-ICAM-1's evne til at binde LFA-1.

Mutationer i det tredje lCAM-1-domæne ændrer ik-10 ke i nævneværdig grad ICAM-l-LFA-l-bindingen (fig. 24).

Eksempel 35

Multimere former af ICAM-1 med forøget biologisk hal-15 veringstidaffinitet og clearance-evne

Der konstrueres kimæriske molekyler, hvori domænerne l og 2 fra ICAM-l er knyttet til hængselsregionen i immunoglobulins tunge kæde. Foretrukne konstruktioner 20 har knyttet C-terminalen i lCAM-1-domæne 2 til et segment i genet for immunoglobulins tunge kæde lige N-terminalt til hængselsregionen, hvilket muliggør den segmentale fleksibilitet, der bibringes af hængselsregionen. ICAM-1-domænerne l og 2 vil således erstatte 25 Fab-fragmentet i et antistof. Tilknytning til tunge kæder af IgG-klassen og produktion af dyreceller vil resultere i produktion af et kimærisk molekyle. Produktion af molekyler, der indeholder tunge kæder hidrørende fra IgA eller IgM vil resultere i produktion af mo-30 lekyler med højere multimericitet indeholdende fra 2 til 12 ICAM-1-molekyler. Co-ekspression af J-kæde-gen i de dyreceller, der producerer de kimæriske ICAM-1-tung-kæde-molekyler vil muliggøre korrekt samling af IgA- og IgM-multimere resulterende hovedsageligt i IgA-35 molekyler indeholdende 4 til 6 ICAM-1-molekyler og i tilfælde af IgM indeholdende ca. 10 ICAM-1-molekyler.

128 DK 175577 B1

Disse kimæriske molekyler kan have flere fordele. For det første er lg-molekyler konstrueret til at have lang levetid i kredsløbet, og dette kan forbedre den biologiske halveringstid.

5 Endvidere vil den multimere natur af disse mani pulerede molekyler gøre det muligt for dem at reagere med større iver med rhinovirus såvel som med celleover-flade-LFA-1, afhængig af den terapeutiske sammenhæng, og således i høj grad formindske mængde af rekombinant-10 protein, som man behøver administrere for at få en effektiv dosis. IgA og IgM er i høj grad glycosylerede molekyler, der normalt er til stede i sekreter på steder med slimhinder såsom i næsen. Deres i høj grad hydrofile natur hjælper til med at holde bakterier og vi-15 rus, hvortil de binder, ude i slimhinden, hvorved de forhindrer vedhæftning til celler og forhindrer passage gennem epithelcellemembranbarrieren. De kan således have forøget terapeutisk effektivitet. IgM og især IgA er stabile i slimhindeområder, og de kan forøge stabilite-20 ten af ICAM-1-konstruktionerne. Hvis et sådant funktionelt derivat af ICAM-1 administreres i blodstrømmen, kan det også forøge den biologiske halveringstid. IgA binder ikke komplement og vil således være ideelt til anvendelser, hvor dette ville være skadeligt. Hvis der 25 ønskes IgG-H-kæde-kimærer, ville det være muligt at mutere regioner involveret i vedhæftning til komplement såvel som i interaktioner med Fc-receptorer.

DK 175577 B1 129

Eksempel 36

Frembringelse af ICAM-1-mutanter 5 Oliqonucleotid-dirigeret mutagenese

Koderegionen i et ICAM-1 cDNA i et 1,8 kb Sall-Kpnl-fragment subklonedes ind i ekspressionsvektoren CDMB {Seed, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 10 84: 3365-3369 (1987)). Baseret på metoder angivet af

Kunkel, T., (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82: 488-492 (1985)) og modifikationer angivet af Staunton D.

et al. (Staunton, D.E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)) anvendtes denne konstruktion (pCDl.8) til frembringelse 15 af et enkeltstrengs uracilholdigt templat, der skal anvendes ved oligonucleotid-dirigeret mutagenese.

Kort beskrevet transformeredes coll stamme XS127 med pCDl.8. Enkeltkolonier dyrkedes i 1 ml af Luria Broth (LB) medium (Difco) med 13 yg/ml ampicillin 20 og 8 yg/ml tetracyclin indtil nær mætning. 100 μΐ af kulturen inficeredes med R408 hjælper-fag (Strategene) ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10, og der tilsattes 10 ml LB medium med ampicillin og tetracyclin 0 til en 16 timers kultur ved 37 C. Efter centrifugering 25 ved 10.000 o/min i 1 minut og 0,22 ym filtrering af su-pernatanten anvendtes fag-suspensionen til at inficere E. coli BW313/P3, som derefter udpladedes på LB agar (Difco) plader suppleret med ampicillin og tetracyclin. Kolonier udplukkedes, dyrkedes i 1 ml LB medium med 30 ampicillin og tetracyclin til nær mætning og inficeredes med hjælper-fag ved en MOI på 10. Dyrkningsvolumenet forøgedes derefter til 250 ml, og cellerne dyrkedes natten over. Enkeltstrengs DNA isoleredes ved sædvanlig fag-ekstraktion.

35 Mutant-oligonucleotider phosphoryleredes og an vendtes med pCD1.8-templatet i en andenstrengs-syntese- 130 DK 175577 B1 reaktion (Staunton, D.E. et al., Cell 52: 925-933 (1988)) .

Transfektlon 5 COS-celler podedes i 10 cm vævskulturplader, således at de ville være 50% sammenflydende efter 16-24 timer. COS-cellerne vaskedes derefter en gang med TBS og inkuberedes i 4 timer med 4 ml RPMI indeholdnde 10% 10 Nu-sera (Collaborative), 5 pg/ml chloroquin, 3 pg mu-tant-plasmid og 200 pg/ml DEAE-dextran-sulfat. Cellerne vaskedes derefter med 10% DMSO-PBS efterfulgt af PBS og dyrkedes i 16 timer i kulturmedium. Kulturmediet erstattedes med frisk medium, og 48 timer efter transfek-15 tion suspenderedes COS-cellerne ved trypsin/EDTA (Gibco) behandling og deltes i to, 10 cm plader samt 24 brønds vævskulturplader til HRV-binding. ved 72 timer høstedes cellerne fra 10 cm pladerne med 5 mM EDTA/ HBSS og behandledes til adhæsion til LFA-1-overtrukket 20 plast og immunofluorescens.

LFA-1- og HRV-binding LFA-l oprensedes fra SKW-3 lysater ved immuno-25 affinitetschromatografi på TS2/4 LFA-1 mAb Sepharose og elueredes ved pH 11,5 i nærværelse af 2 mM MgCl2 og 1% octylglucosid. LFA-1 (10 pg pr. 200 μΐ pr. 6-cm plade) bandtes til bakteriologiske Petri skåle ved fortynding af octylglucosid til 0,1% i PBS (phosphat-pufret salt-30 opløsning) med 2 mM MgCl2 og inkubation natten over ved 4 C. Pladerne blokeredes med 1% BSA (bovin serumalbumin) og opbevaredes i PBS indeholdende 2 mM MgCl2, 0,2% BSA, 0,025% azid og 50 yg/ml gentamycin.

51Cr-mærkede COS-celler i PBS indeholdende 5% 35 FCS (fetal kalveserum), 2 mM MgCl2, 0,025% azid (puffer) inkuberedes med eller uden 5 yg/ml RRI/1 og 131 DK 175577 B1

O

R6.5 i LFA-1-overt rukne mikrotiterplader ved 25 C i 1 time. Ikke-vedhæftende celler fjernedes ved tre vask-ninger med puffer. Vedhæftende celler elueredes ved tilsætning af EDTA til 10 mM og taltes i en y-tæller.

5

Resultater

Anti-iCAM-l-antistoffer, såsom RRi/l, R6.5, LB-2 eller CL203 er blevet identificeret. Hvis disse anti-10 stoffer er i stand til at inhibere ICAM-l-funktion, må de være i stand til at binde til et bestemt sted i ICAM-l-molekylet, som også er vigtigt for ICAM-l-funk-tionen. Ved at fremstille de ovenfor beskrevne deletionsmutanter af ICAM-l og bestemmte det omfang, hvori 15 anti-ICAM-l-antistofferne kan binde til deletionen, er det muligt at bestemme, hvorvidt de deleterede domæner er af betydning for funktionen.

ICAM-l er et integrerende membranprotein, hvoraf det ekstracellulære domæne forudsiges at være sam-20 mensat af 5 Ig-lignende C-domæner. Til identificering af domæner involveret i binding af LFA-1 deleteredes domæne 3 og domænerne 4 og 5 (carboxyl-terminal) ved oligonucleotid-dirigeret mutagenese og testedes funktionelt efter ekspression i COS-celler. Desuden dele-25 teredes hele det cytoplasmiske domæne for at fastslå dets eventuelle indvirkning på ICAM-l-interaktioner.

Som forventet viste deletionen af det cytoplasmiske domæne Y476/* intet tab af RR1/1-, R6.5-, LB-2- og CL203-reaktivitet, medens deletion af domæne 3, F185-R451, 30 resulterede i henholdsvis et fald i og tab af CL203-reaktivitet (fig. 20). CL203-epitopet synes således at være placeret i domæne 4, medens RR1/1, R6.5 og LB-2 synes at være placeret i de to amino-terminale domæner.

Alle tre deletionsmutanter viser vild-type-ni-35 veauer med hensyn til adhærence til LFA-1 (fig. 21). Aminosyresubstitutioner i forudsagte β-snoninger i do- 132 DK 175577 B1 mænerne 1, 2 og 3 blev også frembragt og testet funktionelt efter ekspression i COS-celler. R6.5-epitopet lokaliseredes således til sekvensen E111GGA i domæne 2 og kan også involvere E39 i domæne 1, medens RRl/i og 5 L.B-2 begge er afhængige af R13 i domæne 1 (fig. 22).

Desuden nedsættes RRl/l-binding ved mutationer i sekvensen D71GQS. Mutationer, der eliminerer N-tilknyttede glycosyleringssteder ved NI03 og N165, resulterer i nedsat RRl/l, R6.5 og LB-2, LFA-l-HRV-binding. Disse 10 mutationer synes at bevirke bearbejdning, således at der frembringes ICAM-l-dimere.

Andre mutationer i domæne 2 eller 3 resulterede ikke i ændret LFA-1-adhæsion (fig. 23 og 24). Aminosy-rerne RI3 og D60 i domæne l er begge involveret i bin-15 ding af LFA-1 (fig. 25).

LFA-1- og HRV-binding synes således at være en funktion af det amino-terminale ig-lignende domæne i ICAM-l. Fig. 26 viser en opstilling af amino-terminale domæner i ICAM.

20 Medens opfindelsen er beskrevet i forbindelse med specifikke udførelsesformer derfor, er det klart, at yderligere modifikationer er mulige, og den foreliggende beskrivelse tilsigter at dække alle variationer, anvendelser eller tilpasninger af opfindelsen, idet man 25 generelt følger principperne ifølge opfindelsen og herunder sådanne afvigelser fra den foreliggende beskrivelse som falder indenfor kendt eller sædvanlig praksis indenfor det område, hvortil opfindelsen hører, og som kan anvendes på de ovenfor anførte væsentlige træk in-30 denfor omfanget af de efterfølgende krav.

Claims (13)

1. Opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1, kendetegnet ved, at det adskiller sig fra ICAM-1 ved i det mindste at mangle transmembran-domænet i naturlig ICAM-l, hvilket derivat er opløseligt under 5 fysiologiske forhold.

2. Opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-l ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder mindst én ændret aminosyrerest i, eller er et kemisk funktionelt ækvivalent derivat af, det dele- 10 terede ICAM-1 molekyle.

3. Opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det yderligere mangler det cytoplasmiske domæne i ICAM-l.

4. Opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det mangler aminosyreresterne efter domæne 1, eller efter domænerne 1 og 2, eller domænerne 1, 2 og 3 .

5. Opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 4, til anvendelse ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat til behandling af inflammation hidrørende fra en reaktion fra det specifikke eller ikke-specifikke forsvarssystem.

6. Opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene l til 4, til anvendelse ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat til undertrykkelse af en hæmatopoietisk tumorcelles metastase, hvor nævnte celle kræver et funktionelt medlem af

20 LFA-l-familien til migrering. DK 175577 B1

7. Toxin-derivatiseret, opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 5, til anvendelse ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat til undertrykkelse af væksten af en LFA-1-eks- 5 primerende tumorcelle.

8. Anti-inflammatorisk middel til anvendelse ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat, der skal anvendes sammen med et immunosuppressivt medikament fortrinsvis valgt blandt dexamethason, azathioprin og 10 cyclosporin A, til behandling af inflammation hidrørende fra en reaktion fra det specifikke forsvarssystem, hvilket anti-inflammatoriske middel er valgt blandt et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-i ifølge et vilkårligt af kravene l til 4.

9. Anti-inflammatorisk middel til anvendelse ved fremstillingen af et farmaceutisk præparat til behandling af inflammation hidrørende fra en reaktion af det specifikke forsvarssystem, og som skal anvendes sammen med et andet middel valgt blandt et antistof, 20 der er i stand til at binde til LFA-1; et funktionelt derivat af et antistof, hvilket funktionelle derivat er i stand til at binde til LFA-1; og en ikke-immunoglobulin antagonist for LFA-l; hvilket anti-inflammatoriske middel er et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 4.

10. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter: a) et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 4 og on b) en konventionel bærer eller excipiens.

11. Rekombinant DNA-molekyle, kende.t egne t ved, at det er i stand til at eksprimere et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 som angivet i et vilkårligt af kravene 1 til 4. DK 175577 B1

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1, kendetegnet ved, at man dyrker en værtsmikroorganisme, som er blevet transformeret med en rekombinant vektor, der koder for et opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene 1 til 4 vinder betingelser, hvor nævnte derivat eksprimeres og secerneres i kulturmediet, og derefter isolerer derivatet.

13. Fremgangsmåde til diagnosticering af tilstedeværelsen og lokaliseringen af en tumorcelle, som eks-primerer et medlem af LFA-l-familien af molekyler hos et individ, som man formoder indeholder en sådan celle, kendetegnet ved, at den omfatter: a) inkubering af en vævsprøve fra individet i nærværelse af et middel, der indeholder et detekterbart mærket, opløseligt, funktionelt derivat af ICAM-1 ifølge et vilkårligt af kravene l til 4, og b) detektering af nævnte bindingsligand, som er bundet til et medlem af LFA-l-familien af molekyler, der er til stede i vævsprøven.