FI104952B - Menetelmä ICAM-1:n (solujen välinen kiinnikemolekyylin) liukoisen, funktionaalisen johdoksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

, 104952

Menetelmä ICAM-1:n (solujen välinen kiinnikemolekyylin) liukoisen, funktionaalisen johdoksen valmistamiseksi Förfarande för framställning av ett lösligt, funktionellt derivat av ICAM-1 (intercellular adhesionsmolekyl) 5 Tämä patenttihakemus on osittaista jatkoa US-patenttihake-muksiin sarja n:ot 07/045,963 (jätetty 4. toukokuuta 1987), 07/115,798 (jätetty 2. marraskuuta 1987), 07/155,943 (jätetty 16. helmikuuta 1988), 07/189,815 (jätetty 3. touko-10 kuuta 1988), 07/250,446 (jätetty 28. syyskuuta 1988) ja 07/324,481 (jätetty 16. maaliskuuta 1989). Tämä keksintö tehtiin osittain (maan) hallituksen tuella. Hallituksella on tietyt oikeuden tähän keksintöön.

15 Esillä oleva keksintö koskee menetelmää ICAM-1:n (solujen välinen kiinnikemolekyylin) liukoisen, funktionaalisen johdoksen valmistamiseksi, joka eroaa ICAM:sta ainakin siinä, että se ei sisällä luonnollisen ICAM-1:n transmem-braanialuetta, joka johdos on liukoinen fysiologisissa 20 olosuhteissa.

Valkosolujen on kyettävä kiinnittymään solusubstraatteihin puolustaakseen oikealla tavalla isäntää vieraita hyökkääjiä kuten bakteereita tai viruksia vastaan. Erinomaisen kat-• 25 sauksen puolustusjärjestelmästä esittää Eisen, H.W. ("Mic robiology1' , 3. painos, Harper & Row, Philadelphia, PA, 1980, ss. 290 - 295 ja 381 - 418). Niiden on kyettävä kiinnittymään endoteelisoluihin kyetäkseen siirtymään ve- —- v renkierrosta käynnissä olevan tulehduksen esiintymiskoh-30 tiin. Lisäksi niiden tulee kiinnittyä antigeenin käsittä-: viin soluihin, jotta normaali spesifinen immuunivaste voisi tapahtua, ja lopuksi niiden tulee kiinnittyä tarkoituksenmukaisiin kohdesoluihin, jotta viruksen tartuttamissa soluissa tai kasvainsoluissa voisi tapahtua lyysi.

Vast'ikään tällaisten kiinnittymisien välitykseen osallistuvia valkosolupintamolekyylejä tunnistettiin käyttäen 35 2 104952 hybridoomateknologiaa. Suppeasti ottaen, tunnistettiin ihmisen T-solujen vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita (Davignon, D., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sei. USA 78. (1981) 4535 - 4539) sekä hiiren pernasoluja (Springer, T., et ai..

5 Eur. J. Immunol. 9, (1979) 301 - 306), jotka sitoutuivat val-kosolupintoihin ja inhiboivat edellä kuvattuja kiinnitys-liitteisiä funktioita (Springer, T., et ai.. Fed.Proc. 44 (1985) 2660 - 2663). Näiden vasta-aineiden tunnistamat molekyylit nimitettiin Mac-l:ksi ja imusolufunktioliitteik-10 si antigeeniksi 1 (LFA-1). Mac-1 on heterodimeeri, jota esiintyy syöjäsolu-, jyvässolupinnoilla sekä suurien jyväs-imusolujen pinnoilla. LFA-1 on heterodimeeri, jota esiintyy useimmilla imusoluilla (Springer, T.A. et ai.. Immunol.Rev. 68 (1982) 111 - 135). Nämä kaksi molekyyliä, sekä kolmas 15 molekyyli, pl50,95 (jonka kudosjakauma on samankaltainen kuin Mac-1:n), osallistuvat solukiinnittymiseen (Keizer, G., et ai.. Eur.J.Immunol. 15 (1985) 1142 - 1147) .

Edellä kuvattujen valkosolumolekyylien todettiin kuuluvan 20 sukulaisglykoproteiinien ryhmään (Sanchez-Madrid, F.

et ai., J.Exoer.Med. 158 (1983) 1785 - 1803; Keizer, G.D. et ai., Eur.J.Immunol. 15 (1985) 1142 - 1147) . Tämä gly-koproteiiniryhmä koostuu heterodimeereistä, joissa on yksi alfa-ketju ja yksi beeta-ketju. Vaikka näiden anti-• 25 geenien alfa-ketjut poikkeavat toisistaan, beeta-ketju todettiin erittäin säilyväksi (Sanchez-Madrid, F., et ai., J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 - 1803. Glykoproteiiniryhmän (jota toisinaan kutsutaan "CD18:ksi") beeta-ketjun mole-kyylipainoksi todettiin 95 kd:tä, kun taas alfa-ketjujen 30 todettiin vaihtelevan 150 kd:stä 180 kd:hen (Springer, T., : Fed.Proc. 44 (1985) 2660 - 2663). Vaikka membraaniproteii- nien alfa-alayksiköt eivät jaa beeta-yksiköiden keskinäistä laajaa homologiaa, analysoimalla tarkasti glykoproteiinien alfa-alayksiköitä on ilmennyt, että niiden välillä on huo-35 mättäviä yhtäläisyyksiä. Katsauksia LFA-l-sukuisten glykoproteiinien alfa- ja beeta-alayksiköiden samankaltaisuuk- 3 104952 sista esittävät Sanchez-Madrid, F., et ai., (J.Exper.Med.

158 (1983) 586 - 602; J.Exper.Med. 158 (1983) 1785 - 1803).

On tunnistettu ryhmä yksilöitä, jotka eivät kykene ilmen-5 tämään normaaleja määriä mitään tämän kiinnikeproteiini-ryhmän jäsentä valkosolujensa solupinnoilla (Anderson, D.C., et ai., J.Infect.Des. 152 (1985) 668 - 689). Näiden potilaiden imusolut osoittivat in vitro samankaltaisia puutteita, kuin normaalit kanssahenkilöt, joiden LFA-l-ryh-10 mämolekyylejä vastustivat vasta-aineet. Edelleen nämä yksilöt eivät kyenneet tuottamaan normaalia immuunivastetta, koska heidän solunsa eivät kyenneet kiinnittymään solusubs-traatteihin (Anderson, D.C., et ai., Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677; Anderson, D.C. et ai., J.Infect.Dis. 152 15 (1985) 668 - 689). Nämä tiedot osoittavat, että immuuni- reaktiot heikentyvät, kun imusolut eivät kykene kiinnittymään normaalilla tavalla LFA-l-ryhmän funktionaalisten kiinnikemolekyylien puuttumisen johdosta.

20 Täten yhteenvetona, imusolujen kyky ylläpitää eläimen terveyttä ja elinkelpoisuutta edellyttää, että imusolut kykenevät kiinnittymään toisiin soluihin (kuten endoteelisolui-hin). Tämän kiinnittymisen on todettu edellyttävän solu-solukontakteja, joihin liittyy spesifisiä reseptorimolekyy-• 25 lejä, joita esiintyy imusolujen solupinnoilla. Nämä resep torit mahdollistavat imusolun kiinnittymisen muihin imuso-luihin tai endoteelisoluihin ja muihin ei-verisuonisolui-hin. Solupinnan reseptorimolekyylit on todettu toisiaan hyvin likeisesti muistuttaviksi. Henkilöt, joiden imuso-30 luilta puuttuvat nämä solupintareseptorimolekyylit, potevat : kroonisia ja toistuvia tulehduksia, sekä muita kloonisiä oireita, mukaan lukien puutteelliset vasta-ainevasteet.

Koska imusolukiinnittyminen liittyy prosessiin, jolla vie-35 raskudos tunnistetaan ja hylätään, tämän prosessin ymmärtämisellä on huomattava merkitys elinsiirtojen, kudossiirtojen, yliherkkyyden ja kasvainopin aloilla.

4 104952 Tämä keksintö liittyy solujen väliseen kiinnikemolekyyli-l:een (ICAM-1) sekä sen funktionaalisiin johdannaisiin.

Keksinnön mukainen menetelmä ICAM-1:n saamiseksi oleelli-5 sesti puhtaassa muodossa, käsittää seuraavan vaiheen: viljellään isäntäorganismia, joka on transformoitu ICAM-1:n liukoista, funktionaalista johdosta koodaavalla rekombi-nanttivektorilla, joka johdos sisältää ainakin yhden muutetun aminohapporyhmän, tai on sen kemiallinen johdos, dele-10 toidussa ICAM-l-molekyylissä, olosuhteissa, joissa mainittu johdos ekspressoituu ja erittyy viljelyalustaan, minkä jälkeen johdos eristetään.

Kuviossa 1 esitetään diagrammin muodossa normaalin solun 15 ja solun, jolta LFA-1 puuttuu, välinen kiinnit tyminen .

Kuviossa 2 esitetään diagrammina normaali/normaalisolu-kiinnitysprosessi.

20

Kuviossa 3 esitetään soluaggregaation kinetiikka 50 ng:n/ml PMA:ta puuttuessa (X) tai läsnäollessa (o).

Kuviossa 4 esitetään LFA-1'- ja LFA-l+-solujen koaggregaa-·' 25 tio. ESV:llä transformoituja soluja (104) , jot ka oli leimattu karboksifluoreseiinidiasetaatil-la, kuvio mukaisesti, sekoitettiin 105 kpl:seen ei-leimattuja autologisia soluj (umpinaiset pylväät) ja JY-soluja (avoimet pylväät) PMA:n 30 läsnäollessa. 1,5 tunnin kuluttua leimatut so- I * lut, aggregaateissa tai vapaina, laskettiin käyttäen esimerkin 2 kvalitatiivista määritystä. Leimattujen solujen prosentuaalinen osuus aggregaateissa on merkitty. Esitetään yksi edustava 35 koe kahdesta suoritetusta.

104952 5

Kuviossa 5 esitetään ICAM-l:n ja LFA-l:n immuunisaostus JY-soluista. JY-solujen Triton X-100 -lysaatteja (vyöhykkeet 1 ja 2) tai verrokkilyysipuskuria (vyöhykkeet 3 ja 4) immuunisaostettiin vasta-5 aineella, joka kykenee sitoutumaan ICAM-l:een (vyöhykkeet 1 ja 3) , tai vasta-aineilla, jotka kykenevät sitoutumaan LFA-l:een (vyöhykkeet 2 ja 4). Paneelissa A on esitetty tulokset pelkistävissä olosuhteissa; paneelissa B on esitetty 10 tulokset, jotka saatiin ei-pelkistävissä olosuh teissa. Molekyylipainostandardit ajettiin vyöhykkeessä S.

Kuviossa 6 esitetään IL-1- ja gamma-interferonivaikutuksien 15 ICAM-l-ilmennykseen ihmisen ihon sidekudosmuo- dostusoluilla kinetiikka. Ihmisen ihon sideku-dosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2/kuoppa. IL-l:tä (10 U/ml, umpinaiset ympyrät) tai yhdistelmä-gamma-inter-20 feronia (10 U/ml, avoimet neliöt) lisättiin, minkä jälkeen merkittynä ajankohtana määritys-seos jäähdytettiin 4 °C:seen ja suoritettiin epäsuoran sitoutumisen määritys. Standardipoik-keama ei ylittänyt 10 %:ia.

25

Kuviossa 7 esitetään IL-1- ja gamma-interferonivaikutuksien ICAM-l:een pitoisuusriippuvuus. Ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2/kuoppa. IL-2:ta (avoimet 30 ympyrät), yhdistelmä-humaani-IL-1:tä (avoimet • · · neliöt), yhdistelmä-hiiri-IL-1:tä (umpinaiset neliöt), yhdistelmä-humaani-gamma-interferonia (umpinaiset ympyrät) ja yhdistelmä-beeta-inter-feronia (avoimet kolmiot) lisättiin merkittynä 35 laimennoksena ja seoksia inkuboitiin 4 tunnin ajan (IL-1) tai 16 tunnin ajan (beeta- ja gamma-interferoni) . Esitetyt tulokset ovat keskiarvoja 104952 6 nelinkertaisista määrityksistä; standardipoik-keama ei ylittänyt 10 %:ia.

Kuviossa 8 esitetään ICAM-l-cDNA:n nukleotidi- ja aminohap-5 posekvenssi. Ensimmäinen ATG on asemassa 58.

Trans-latoidut sekvenssit, jotka vastaavat ICAM-1-trypsiinipeptidejä, on alleviivattu. Hydrofo- * binen oletettu signaalipeptidi ja vastaavasti transmembraanisekvenssit on alleviivattu voimak-10 kaasti. N-kytkentäglykosylaatiokohdat on merkit ty laatikkoon. Polyadenylaatiosignaali AATAAA asemassa 2976 on merkitty yläpuolisella viivalla. HL-60-cDNA-kloonin sekvenssi on esitetty. Endoteelisolu-cDNA sekventoi-tiin lähes koko 15 pituudeltaan ja siinä esiintyi vain vähäisiä poikkeamia.

Kuviossa 9 esitetään ICAM-l-homologia-alueet ja suhde im- munoglobuliinisupergeeniryhmään. (A) 5 homologi-20 sen alueen rinnakkainasetus (DI-5). Kaksi rin nakkain asettunutta jäännöstä tai useampi rinnakkain asettunut jäännös on merkitty laatikolla. Jäännökset, jotka olivat säilyneet kaksi kertaa tai useamman kerran NCAM-alueilla, sekä i 25 jäännökset, jotka olivat säilyneet C2- ja Cl- sarja-alueilla, asetettiin ICAM-l:n sisäisten toistojen rinnalle. Ennakoitujen beeta-säikeiden sijainti ICAM-l-alueella on merkitty tankovii-voin ja pienillä kirjaimilla rinnakkainasetuksen 30 päällä, ja beeta-säikeiden tunnettu sijainti immunoglobuliini-C-alueilla on merkitty tanko-viivoilla ja rinnakkainasetuksen alapuolisin suurin kirjaimin. Oletetun disulfidisillan asema j ICAM-l-alueella on merkitty S-S. (B-D) Proteii- 1 35 nialueiden, jotka ovat ICAM-l-alueisiin nähden 1 homologisia, rinnakkainasettelu; proteiinit ase tettiin alustavasti rinnakkain suorittamalla 7 104952 haku NBRF-tietokannoissa FASTP-ohjelmaa käyttäen. Proteiinisekvenssit ovat MAG, NCAM, T-solu-reseptori-alfa-alayksikkö-V-alue, IgM-myy-ketju ja alfa-l-B-glykoproteiini.

5

Kuviossa 10 on esitetty diagrammina ICAM-l:n ja MAG:n se-kundaarirakenteiden vertailu.

Kuviossa 11 esitetään LFA-l-positiivisia EBV-transformoitu-10 ja B-varhaisimusolusoluja, jotka sitoutuvat ICAM-l:een tasomembraaneissa.

Kuviossa 12 esitetään LFA-l-positiivisia T-varhaisimusoluja ja T-lymfomasoluja sitoutumassa ICAM-l:een muo-15 viin sidotuissa rakkuloissa.

Kuviossa 13 esitetään JY-B-varhaisimusolun sitoutumisen ICAM-l:een estyminen muoviin sidotuissa rakkuloissa esikäsiteltäessä solut tai rakkulat mo-20 noklonaalisilla vasta-aineilla.

Kuviossa 14 esitetään lämpötilan vaikutus T-varhaisimusolu-jen sitoutumiseen ICAM-l:een muoviin sidotuissa rakkuloissa.

' ' 25 m ·

Kuviossa 15 esitetään kaksivalenssisten kationien tarve T-varhaisimusolujen sitoutumiselle ICAM-l:een , muoviin sidotuissa rakkuloisssa.

30 Kuviossa 16 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden '< vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena T-soluliitteisen antigeenin OKT3 tunnistukseen. T'OKT3" merkitsee antigeenin lisäystä.

Kuviossa 17 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn 35 104952 8 lisääntyä vasteena ei-spesifisen T-solumitogee-nin, konkavalliini-A:n, tunnistukseen. "CONA" merkitsee konkanavalliini-A:n lisäystä.

5 Kuviossa 18 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena avaimenreikämaljakotilohemo-syaniiniantigeenin tunnistukseen. Avaimenreikä-maljakotilohemosyaniinin lisäys soluihin on 10 merkitty "KLH".

Kuviossa 19 esitetään kiinnitystä estävien vasta-aineiden vaikutus ääreisveren yksitumasolujen kykyyn lisääntyä vasteena jäykkäkouristustoksoidianti-15 geenin tunnistukseen. Jäykkäkouristustoksoidi- antigeenin lisäys soluihin on merkitty "AGN".

Kuviossa 20 esitetään monoklonaalisten vasta-aineiden RR1/1, R6.5, LB2 ja CL203 sitoutumista ICAM-1-20 deletio-mutantteihin.

Kuviossa 21 esitetään ICAM-l-deletiomutanttien sitoutumista LFA-1:aan.

25 Kuviossa 22 esitetään anti-ICAM-l-monoklonaalisten vasta- • I . .

aineiden RR1/1, R6.5, LB2 ja CL203 tunnistamia epitooppeja.

Kuviossa 23 esitetään ICAM-l:n alueen 2 mutanttien sitoutu-30 miskykyä LFA-1:aan.

«

Kuviossa 24 esitetään ICAM-l:n alueen 3 mutanttien sitoutu-miskykyä LFA:l:aan.

35 Kuviossa 25 esitetään ICAM-l:n alueen 1 mutanttien sitoutu- miskykyä LFA-1:aan.

104952 9

Kuviossa 26 esitetään ICAM:in aminopään alueiden yhteensovittamista.

Tämän keksinnön yksi näkökohta koskee LFA-l:n luontaisen 5 sitoutumisligandin löytymistä. Molekyylejä, kuten LFA-1- ' ryhmän molekyylejä, jotka osallistuvat solukiinnitysproses- siin, kutsutaan "kiinnikemolekyyleiksi", Tämän keksinnön mukaista luontaista sitoutumisligandia kut-10 sutaan nimellä "solujen välinen kiinnikemolekyyli-1" tai "ICAM-1". ICAM-1 on 76 - 97 kd:n glykoproteiini. ICAM-1- ei ole heterodimeeri. Esillä oleva keksintö koskee ICAM-1:tä ja sen "funktionaalisia johdannaisia". ICAM-1:n "funktionaalinen johdannainen" on yhdiste, jolla on biologista ak-15 tiivisuutta (joko funktionaalista tai rakenteellista), joka on oleellisesti samanlaista kuin ICAM-1:n biologinen aktiivisuus. Ilmaisun "funktionaaliset johdannaiset" piiriin tarkoitetaan kuuluviksi molekyylin "fragmentit", "variantit", "analogit" tai "kemialliset johdannaiset". Molekyy-20 Iin, kuten ICAM-1:n, "framentilla" tarkoitetaan molekyylien mitä tahansa polypeptidialaryhmää. Erityisen hyvänä pidettyjä ovat ICAM-1:n fragmentit, joilla on ICAM-1-aktiivisuutta ja jotka ovat liukoisia (so. eivät ole membraaniin sitoutuneita). Erityisen edullisia ovat ICAM-1:n fragmen-25 tit, joilla on ICAM-l-aktiivisuutta ja jotka ovat liukoisia (eli eivät ole sidottuja membraaniin). Molekyylin, kuten ICAM-1:n, "variantilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on rakenteeltaan ja funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Molekyylin sanotaan 30 olevan "oleellisesti samanlainen" kuin jokin toinen mole- * r \ kyyli, jos kyseisten kahden molekyylin rakenteet ovat oleellisesti samanlaiset tai jos kummallakin molekyylillä on samanlainen biologinen aktiivisuus. Täten edellyttäen, että kahdella molekyylillä on samanlainen aktiivisuus, nii-35 tä pidetään toistensa variantteina ilmaisun tässä käytetyssä merkityksessä silloinkin, jos yhden molekyyleistä rakennetta ei esiinny toisessa, tai jos aminohappojäännössek- 104952 10 venssit eivät ole identtiset. Molekyylin kuten ICAM-1:n "analogilla" tarkoitetaan molekyyliä, joka on funktioltaan oleellisesti samanlainen kuin joko koko molekyyli tai sen fragmentti. Tässä käytettynä molekyyliä kutsutaan toisen 5 molekyylin "kemialliseksi johdannaiseksi", jos se sisältää ylimääräisiä kemiallisia ryhmiä, jotka eivät normaalisti kuulu molekyyliin. Tällaiset ryhmät voivat parantaa molekyylin liukoisuutta, imeytymistä, biologista puoliintumis-ikää jne. Ryhmät voivat vaihtoehtoisesti alentaa molekyylin 10 myrkyllisyyttä, poistaa tai heikentää molekyylin mahdollista epätoivottavaa sivuvaikutusta jne. Tällaisia vaikutuksia tuottamaan kykeneviä ryhmä julkistetaan käsikirjassa Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980. "Toksiinijoh-dannais"-molekyylit muodostavat "kemiallisten johdannais-15 ten" erityisluokan. "Toksiinijohdannais"-molekyyli on molekyyli (kuten ICAM-1 tai vasta-aine), joka sisältää toksii-niryhmän. Tällaisen molekyylin sitoutuminen soluun tuo tok-siiniryhmän lähelle solua ja edistää siten solun kuolemista. Voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa toksiiniryhmää; 20 kuitenkin edullisesti käytetään sellaisia toksiineja kuten esimerkiksi risiinitoksiini, difteriatoksiini, radioiso-tooppitoksiinit, membraaniväylän muodostavat toksiinit jne. Menettelyitä tällaisten ryhmien kytkemiseksi molekyyliin tunnetaan alalla hyvin.

* ' 25 • ♦

Antigeenimolekyylit kuten ICAM-1 tai LFA-l-ryhmämolekyylit ilmentyvät luontaisesti imusolujen pinnalla. Täten jos tällaisia soluja viedään sopivaan eläimeen, esimerkiksi vatsaonteloon ruiskuttamalla jne., seurauksena on vasta-aineiden 30 muodostuminen, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1reen tai LFA-l-ryhmämolekyyleihin. Haluttaessa tällaisesta eläimestä voidaan ottaa seerumia ja käyttää sitä lähteenä polyklonaa-listen vasta-aineiden saamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan näihin molekyyleihin. Edullisesti kuitenkin tällaisis-35 ta eläimistä otetaan pernasoluja, jotka fuusioidaan myeloo-masolulinjaan, minkä jälkeen näiden fuusiosolujen annetaan muodostaa hybridoomasolu, joka erittää monoklonaalisia 104952 11 vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-1:een tai johonkin LFA-l-ryhmämolekyyliin.

Edellä kuvatun mukaisesti saadut hybridoomasolut voidaan 5 seuloa erilaisilla menetelmillä haluttujen hybridoomasolu-jen tunnistamiseksi, jotka erittävät vasta-ainetta, joka kykenee sitoutumaan joko ICAM-1:een tai johonkin LFA-l-ryh-mämolekyyliin. Edullisessa seulontamäärityksessä tällaiset molekyylit tunnistetaan niiden kyvystä inhiboida Epstein-10 Barrin viruksella transformoitujen solujen aggregaatiota. Vasta-aineet, jotka kykenevät inhiboimaan tällaista aggregaatiota, seulotaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, inhiboivatko ne mainittua aggregaatiota sitoutumalla ICAM-l:een vai LFA-l-ryhmämolekyyliin. Tällaisessa seulonnassa 15 voidaan käyttää mitä tahansa keinoa ICAM-l:n erottamiseksi LFA-l-ryhmämolekyyleistä. Täten esimerkiksi vasta-aineen sitomaa antigeeniä voidaan analysoida esimerkiksi immuuni-saostamalla ja polyakryyliamidigeelielektroforeettisesti. Jos sidottu antigeeni kuuluu LFA-l-ryhmämolekyyleihin, im-20 muunisaostettu antigeeni todetaan dimeeriksi, kun taas jos sitoutunut antigeeni on ICAM-1, vain yksi molekyylipainola-ji on immuunisaostunut. Vaihtoehtoisesti on mahdollista erottaa ne vasta-aineet, jotka sitoutuvat LFA-l-ryhmämole-kyyleihin, niistä, jotka sitoutuvat ICAM-1:een, seulomalla • 25 vasta-aineen kyvyn suhteen sitoutua sellaisiin soluihin, kuten jyvässolut, jotka ilmentävät LFA-l:n, mutta eivät ICAM-1:tä. Vasta-aineen (jonka tiedetään inhiboivan solu-aggregaatiota) kyky sitoutua jyvässoluihin merkitsee, että vasta-aine kykenee sitoutumaan LFA-l:een. Tällaisen sitou-30 tumisen puuttuminen merkitsee vasta-ainetta, joka tunnistaa ICAM-1:n. Vasta-aineen kyky sitoutua soluun kuten jyvässo-luun voidaan todeta alan keskimääräistenkin taitajien tavanomaisesti käyttämin keinoin. Tällaisia keinoja ovat im-muunimääritykset, solu-agglutinaatio, suodatin-sitoutumis-35 tutkimukset, vasta-ainesaostus jne.

104952 12 Tämän keksinnön mukaiset aggregaatio-vastaiset vasta-aineet voidaan vaihtoehtoisesti tunnistaa mittaamalla niiden kyky sitoutua differentiaalisesti soluihin, jotka ilmentävät ICAM-l:n (kuten aktivoituihin endoteelisoluihin), ja niiden 5 kyvyttömyys sitoutua soluihin, jotka eivät ilmennä ICAM-l:tä. Alan keskimääräisetkin taitajat havainnevat vaikeuksitta, että edeltäviä määrityksiä voidaan modifoida, tai ne voidaan suorittaa erilaisessa keskinäisessä järjestyksessä, jolloin saadaan lukuisia erilaisia mahdollisia seulontamää-10 rityksiä, joista kullakin kyetään tunnistamaan tai erottamaan toisistaan ICAM-l:een LFA-l-ryhmämolekyylin asemesta sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita.

Esillä olevan keksinnön mukaiset tulehdusvastaiset aineet 15 voidaan saada luontaisilla prosesseilla (kuten esimerkiksi indusoimalla eläin, kasvi, sieni, bakteeri jne., tuottamaan ICAM-l:n ei-immunoglobuliini-antagonistia, tai indusoimalla eläin tuottamaan polyklonaalisia vasta-aineita, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een); synteettisillä menetelmillä 20 (kuten esimerkiksi käyttäen Merrifield-menetelmää polypep-tidien syntetisoimiseksi ICAM-l:n, ICAM-l:n funktionaalisten johdannaisten tai ICÄM-l:n proteiini-antagonistien (joko immunoglobuliini- tai ei-immunoglobuliini-) edelleen syntetisoimiseksi; hybridoomateknologisesti (kuten esimer-‘ 25 kiksi ICAM-l:een sitoutumaan kykenevien monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi); tai yhdistelmä-DNA-teknises-ti (kuten esimerkiksi esillä olevan keksinnön mukaisten tulehdusvastaisten aineiden tuottamiseksi erilaisissa isännissä (eli hiivassa, bakteereissa, sienissä, nisäkässolu-30 viljelmissä jne.) tai yhdistelmäplasmidi- tai virusvekto-·, reistä. Käytettävän menetelmän valinta riippuu sellaisista tekijöistä kuten kätevyys, haluttu saanto, jne. Välttämättä ei tarvitse käyttää vain yhtä edellä kuvattua menetelmää, prosessia tai tekniikkaa nimenomaisen tulehdusvastaisen 35 aineen tuottamiseksi; edellä kuvattuja prosesseja, menetelmiä ja tekniikoita voidaan yhdistää jonkin nimenomaisen tulehdusvastaisen aineen saamiseksi.

104952 13 A. LFA-1:n sitoutumisparin (ICAM-1) tunnistus I. LFA-l-riippuvaisen aggregaation määrityksiä 5 Monet Epstein-Barr-viruksella transformoidut solut osoittavat aggregaatiota. Tätä aggregaatiota voidaan tehostaa forboliesterien läsnäololla. Tällaisen homotyyppisen aggregaation (eli aggregaation, johon liittyy vain yksi solu-tyyppi) todettiin salpautuvan LFA-l-vastaisilla vasta-10 aineilla (Rothlein, R., et ai.. J.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149), joka viite sisällytetään tähän viitteeksi. Täten LFA-l-riippuvaisen sitoutumisen laajuus voidaan määrittää määrittämällä spontaanin tai forboli-esteririippu-vaisen aggregaattimuodostuksen laajuus.

15 LFA-l-riippuvaista aggregaatiota häiritsevä aine voidaan tunnistaa käyttämällä määritystä, jolla kyetään määrittämään, häiritseekö aine Epstein-Barr-viruksella transformoitujen solujen spontaania vai forboliesteri-riippuvaista 20 aggregaatiota. Tällaisessa määrityksessä voidaan käyttää useimpia Epstein-Barr-virus-transformoituja soluja, kunhan solut kykenevät ilmentämään LFA-l-reseptorimolekyylin. Tällaisia soluja voidaan valmistaa Springerin, T.A., et ai., J. Exper.Med. 160 (1984) 1901 - 1918, joka viite sisällyte-25 tään tähän viitteeksi, tekniikalla. Vaikka mitä tahansa tällaista solua voidaan käyttää esillä olevan keksinnön mukaisessa LFA-l-riippuvaisen sitoutumisen määrityksessä, edullisesti käytetään JY-solulinjasoluja (Terhost, C.T., et ai.. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 73 (1976) 910). Soluja voi-30 daan inkuboida missä tahansa sopivassa kasvualustassa; kui-·, tenkin edullisimmin soluja viljellään RPMI 1640 -kasvualus tassa, jota on täydennetty 10 %:lla vasi-kansikiöseerumia ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä (Gibco Laboratories, NY). Soluja tulisi viljellä olosuhteissa, jotka sopivat 35 nisäkässolulisäännytykseen (eli yleensä 37 °C:n lämpötilassa, ilmakehässä, jossa on 5 % C02:ta, 95 %:n suhteellisessa ilman kosteudessa jne.).

14 104952 2. LFA-1 sitoutuu ICAM-1:een

On tunnistettu henkilöitä, joiden imusoluista puuttuu LFA-l-reseptorimolekyyliryhmä (Anderson, D.C., et ai., 5 Fed.Proc. 44 (1985) 2671 - 2677/ Anderson, D.C., et ai..

J.Infect.Dis. 152 (1985) 668 - 689) . Tällaisten yksilöiden sanotaan kärsivän valkosolukiinnitysvajauksesta (LAD). Tällaisten yksilöiden EBV-transformoidut solut eivät kykene aggregoitumaan, eivät spontaanisti eivätkä forboliesterien 10 läsnäollessa edellä kuvatussa aggregaatiomäärityksessä. Kun tällaisia soluja sekoitetaan LFA-1:n ilmentäviin soluihin, todettiin aggregaatio (Rothlein, R., et ai., J.Exper.Med.

163 (1986) 1132 - 1149) (kuvio 1). Merkittävää on, että näitä aggregaatteja ei muodostunut, jos näitä soluja inku-15 boitiin LFA-l-vastaisten vasta-aineiden läsnäollessa. Täten vaikka aggregaatio edellytti LFA-1:tä, LFA-1-vajaiden solujen kyky muodostaa aggregaatteja LFA-l-pitoisten solujen kanssa osoitti, että LFA-1:n sitoutu-mispari ei ole LFA-1, vaan paremminkin aiemmin tuntemattomaksi jäänyt solukiinni-20 kemolekyyli. Kuviossa 1 esitetään solukiinnittymisen mekanismi .

B. Solujen välinen kiinnikemolekwli-l (ICAM-11 25 Uusi solujen välinen kiinnikemolekyyli ICAM-1 tunnistettiin ja osittain karakterisoitiin ensin Rothleinin, R., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274, joka viite sisällytetään tähän viitteeksi, menettelyn mukaan. ICAM-1-molekyylin toteamiseksi valmistettiin monoklonaalisia vasta-aineita 30 hiirien pernasoluista, kun hiiriä oli immunoitu soluilla, jotka olivat peräisin yksilöistä, joiden LFA-1-ilmennys oli geneettisesti puutteellinen. Saadut vasta-aineet seulottiin niiden kyvyn suhteen inhiboida LFA-1:n ilmentävien solujen aggregaatiota (kuvio 2). Yksityiskohtaisesti ottaen, ICAM-35 1-molekyylin toteamiseksi hiiriä immunoitiin EBV-transformoiduilla B-soluilla, jotka oli saatu LAD-potilaista, jotka eivät ilmennä LFA-l-antigeenia. Näistä eläimistä poistet- 104952 15 tiin sitten pernasolut, jotka fuusioitiin myeloomasoluihin ja annettiin monoklonaalisia vasta-aineita tuottavien hyb-ridoomasolujen muodostua. EBV-transformoituja B-soluja, jotka olivat peräisin normaaleista yksilöistä, jotka ilmen-5 tävät LFA-l:n, inkuboitiin sitten hybridoomasolun tuottaman monoklonaalisen vasta-aineen läsnäollessa mahdollisen mono-klonaalisen vasta-aineen tunnistamiseksi, joka kykenisi inhiboimaan EBV-transformoitujen B-solujen forboliesteri-välitteisen, LFA-l-riippuvaisen spontaanin aggregaation.

10 Koska hybridoomasolut saatiin soluista, jotka eivät olleet koskaan "tutustuneet" LFA-l-antigeeniin, LFA-l:n vastaista monoklonaalista vasta-ainetta ei muodostunut. Täten mikä tahansa vasta-aine, jonka todetaan inhiboivan aggregaatio-ta, kykenee välttämättä sitoutumaan antigeeniin, joka vaik-15 kakaan ei ole LFA-1 osallistuu LFA-l-kiinnitysprosessiin. Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää tällaisten monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi, edullisesti ICAM-l:een sitoutuvia monoklonaalisia vasta-aineita hankitaan immunoimalla BALB/c-hiiriä käyttäen teitä ja aikatau-20 luja, joita kuvaavat Rothlein, R., et ai. (J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274), Epstein-Barr-viruksella transformoitujen ääreisveren yksitumasolujen kanssa, jotka ovat peräisin yksilöistä, joilta puuttuu LFA-1. Tällaisia soluja julkistavat Springer, T.A., et ai♦ (J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 25 - 1918).

• φ

Edullisessa menetelmässä vasta-aineiden muodostamiseksi ja toteamiseksi, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, hiiriä immunoidaan joko EBV-transformoiduilla B-soluilla, jot-30 ka ilmentävät sekä ICAM-l:n että LFA-1:n, tai edullisemmin TNF-aktivoiduilla endoteelisoluilla, jotka ilmentävät ICAM-l:n mutta eivät LFA-1:tä. Edullisimmassa menetelmässä hyb-ridooma-solujen muodostamiseksi, jotka tuottavat ICAM-1-vastaisia vasta-aineita, BALB/c-hiiri immunoitiin toisiaan 35 seuraten JY-soluilla sekä differentioiduilla U937-soluilla (ATCC CRL-1593). Tällaisista eläimistä poistetaan pernaso- 104952 16 lut, jotka fuusioidaan myeloomasoluihin, ja annetaan vasta-ainetta tuottavien hybridoomasolujen muodostua. Vasta-aineet seulotaan niiden kyvyn suhteen inhiboida EBV-trans-formoidun solulinjan LFA-l-riippuvaista, forboliesteri-5 indusoitua aggregaatiota, kuten JY-solujen, jotka ilmentävät sekä LFA-l-reseptorin että ICAM-l:n, Kuten esittäneet Rothlein, R., et ai.. (J.Immunol. 137 (1987) 1270 - 1274), tällaista aggregaatiota inhiboimaan kykeneviä vasta-aineita testataan sitten niiden kyvyn suhteen inhiboida jonkin 10 solulinjan forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, kuten SKW3:n (Dustin, M., et ai., J.Exoer.Med. 165 (1987) 672 -692), jonka kykyä spontaanisti aggregoitua forboliesterin läsnäollessa inhiboi vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan LFA-l:een, mutta eivät inhiboi ICAM-l-vastaiset vasta-15 aineet. Vasta-aineet, jotka kykenevät inhiboimaan solujen kuten JY-solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, mutta eivät kykene inhiboimaan solujen kuten SKW3-solujen forboliesteri-indusoitua aggregaatiota, ovat todennäköisesti ICAM-l-vastaisia vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti vasta-20 aineet, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, voidaan tunnistaa seulomalla vasta-aineiden suhteen, jotka kykenevät inhiboimaan LFA-l-riippuvaisen aggregaation LFA:n ilmentävissä soluissa (kuten JY-soluissa), mutta eivät kykene sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät LFA-l:n mutta vain *, 25 vähän tai ei lainkaan ICAM-l:tä (kuten normaalit jyvässo- lut) tai kykenevät sitoutumaan soluihin, jotka ilmentävät ICAM-l:n mutta eivät LFA-l:tä (kuten TNF-aktivoidut endo-teelisolut). Toinen vaihtoehto on immuunisaostus soluista, jotka ilmentävät ICAM-l:n, LFA-l:n tai molemmat käyttäen 30 vasta-aineita, jotka inhiboivat solujen, kuten JY-solujen, *. LFA-l-riippuvaista aggregaatiota, jolloin SDS-PAGE:lla tai vastaavalla menetelmällä määritetään vasta-aineen saostaman molekyylin joitakin molekyyliominaisuuksia. Jos ominaisuus on sama kuin ICAM-l:n vastaava, vasta-aine voidaan olettaa 35 ICAM-l-vastaiseksi vasta-aineeksi.

104952 17 Käyttäen edellä kuvatulla tavalla valmistettuja monoklonaa-lisia vasta-aineita ICAM-l-solupintamolekyyli puhdistettiin ja karakterisoitiin. ICAM-1 puhdistettiin ihmissoluista ja -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteetti-5 kromatografiaa. Tällaisessa menetelmässä ICAM-1:n kanssa reagoiva monoklonaalinen vasta-aine kytketään inerttiin kolonnimatriisiin. Tällaisen kytkennän saamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa menetelmää; kuitenkin edullisesti käytetään Oettgenin, H.C., et ai., J.Biol.Chem. 259 (1984) 10 12034, menetelmää. Kun solulysaatti käytetään matriisin läpi, läsnä olevat ICAM-l-molekyylit adsorboituvat ja jäävät matriisiin. Muuttamalla kolonnin pH:ta tai ionipitoi-suutta sitoutuneet ICAM-l-molekyylit voidaan eluoida kolonnista. Vaikka mitä tahansa sopivaa matriisia voidaan käyt-15 tää, edullisesti matriisimateriaalina käytetään Sepharose-geeliä (Pharmacia). Kolonnimatriisien muodostaminen ja niiden käyttö proteiinin puhdistamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuj a.

20 Alan keskimääräistenkin taitajien hallitsemalla tavalla edellä kuvattuja määrityksiä voidaan käyttää yhdisteiden tunnistamiseksi, jotka kykenevät heikentämään tai inhiboimaan solukiinnittymisen nopeutta tai laajuutta.

25 ICAM-1 on solupintaglykoproteiini, joka ilmentyy ei-verta-muodostavilla soluilla, kuten verisuonten endoteelisolut, kateenkorva-epiteelisolut, tietyt muut epiteelisolut ja sidekudosmuodostussolut, ja vertamuodostavilla soluilla kuten kudossyöjäsolut, mitogeenistimuloidut T-imusolu-emo-30 solut, ja imusolmukkeen itukeskus-B-solut ja hermosolun ; tuojahaarakesoluilla risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa. ICAM-1 ilmentyy voimakkaasti verisuonen endoteelisoluilla T-solu-alueilla imusolmukkeissa ja risoissa, jotka osoittavat reaktiivista liikakasvua. ICAM-1 35 ilmentyy alhaisina määrinä ääreisveren imusoluissa. Joidenkin myelomonosyyttisolulinjojen forboliesteri-stimuloitu differentiaatio lisää voimakkaasti ICAM-l-ilmennystä. Täten ie 104952 ICAM-1 ilmentyy ensisijaisesti tulehduskohdissa, eikä ilmenny yleensä "hiljaisissa" soluissa. ICAM-l-ilmennys ihon sidekudosmuodostussoluilla kasvaa kolminkertaisesta viisinkertaiseksi sekä interleukiini-I:n että gamma-interferonin 5 vaikutuksesta tasoilla 10 U/ml neljän ja vastaavasti 10 tunnin aikana. Induktio riippuu proteiini- ja mRNA-syntee-sistä ja on takautuva.

ICAM-1 osoittaa molekyylipainoheterogeniaa eri solutyypeis-10 sä, jolloin molekyylipaino on 97 kd:tä sidekudosmuodostussoluilla, 114 kd:tä myelomonosyyttisolulinjalla U937, ja 90 kd:tä B-varhaisimusolulla JY. ICAM-1:n biosynteesiin on todettu liittyvän noin 73 kd:n solunsisäisen prekursorin. Tunikamysiinillä (joka inhiboi glykosylaatiota) käsittele-15 mällä saatavan ei-N-glykosyloidun muodon molekyylipaino on 55 kd:tä.

Forboliesterillä stimuloiduista U937-soluista tai sideku-dosmuodostussoluista eristetyn ICAM-1:n pääasiallinen tuote 20 on sama ja sen molekyylipaino on 60 kd:tä kemiallisen de-glykosylaation jälkeen. ICAM-l-monoklonaalivasta-aineet häiritsevät fytohemagglutiniini-emosolujen kiinnittymistä solulinjoihin, joilta puuttuu LFA-1. Esikäsittelemällä si-dekudosmuodostussoluja, mutta ei imusoluja, monoklonaali-*. 25 silla vasta-aineilla, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM- l:een, estetään imusolu-sidekudosmuodostussolukiinnittymi-nen. Esikäsittelemällä imusoluja, mutta ei sidekudosmuodos-tussoluja, LFA-l-vastaisilla vasta-aineilla on todettu niin ikään saatavan imusolu-sidekudos-muodostussolukiinnittymi-30 sen inhibitio.

« · ICAM-1 on täten CDl8-kompleksin sitoutumisligandi valkosoluilla. Se on indusoitavissa sidekudosmuodostussoluilla ja endoteelisoluilla in vitro tulehdusvälittäjillä kuten 35 IL-l:llä, gamma-interferonilla ja kasvainnekroositekijällä aikavälillä, joka sopii imusolujen suodattumiseen tulehdus- * < vauriokohtiin in vivo (Dustin, M.L., et ai., J.Immunol. 137 19 104952 (1986) 245 - 254; Prober, J.S., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 1893 - 1896). Edelleen ICAM-1 ilmentyy ei-vertamuo-dostavilla soluilla, kuten verisuonten endoteelisoluilla, kateenkorvan epiteelisoluilla, muilla epiteelisoluilla 5 ja sidekudosmuodostussoluilla ja vertamuodostavilla soluilla kuten kudossyöjäsoluilla, mitogeenistimuloiduilla T-imusolu-emosoluilla ja imusolmukkeen itukeskus-B-soluil-la ja hermosolun tuojahaarakesoluilla risoissa, imusolmukkeissa ja Peyerin imusolmukkeissa (Dustin, M.L., et ai., 10 J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). ICAM-1 ilmentyy keratinosyyteillä hyvänlaatuisissa tulehdusvaurioissa kuten yli-herkkyysihottuma, ihon jäkälätauti, tulehdustautiin liittyvä ihottuma, nokkosrokko ja rakkulasairaus. Allergisissa ihoreaktioissa, jotka oli aiheutettu sivelemällä potilaan 15 iholle hapteenia, jolle tämä on yliherkkä, ilmeni myös voimakas ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä. Toisaalta myrkylliset iholaastarit iholla eivät aikaansaaneet ICAM-l-ilmen-nystä keratinosyyteillä. ICAM-1:tä esiintyy keratinosyyteillä, jotka on saatu kudosnäytteistä, jotka ovat peräisin 20 erilaisiin ihohäiriötiloihin liittyvistä ihovaurioista, ja iCAM-ilmennys indusoituu yliherkkyyslaastarikoevaurioissa, kun taas keratinosyytit myrkkylaastarikoevaurioissa eivät ilmentäneet ICAM-1:tä.

25 ICAM-1 on täten solusubstraatti, johon imusolut voivat kiinnittyä, jolloin imusolut voivat migroitua tulehduskohtiin ja/tai suorittaa erilaisia efektorifunktioita, jotka myötävaikuttavat tähän tulehdukseen. Tällaisia funktioita ovat vasta-ainetuotanto, viruksen tartuttamien kohdesolujen 30 lyysi jne. Tässä yhteydessä tarkoitetaan nimityksellä "tulehdus" spesifisen tai epäspesifisen puolustusjärjestelmien reaktioita. Tässä käytettynä ilmaisulla "spesifinen puolustusjärjestelmä" tarkoitetaan immuunijärjestelmän osaa, joka reagoi spesifisten antigeenien läsnäoloon. Tu-35 lehduksen sanotaan olevan seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, jos tulehduksen aiheuttaa, tai sitä välittää, tai siihen liittyy spesifisen puolustusjärjestel- t 104952 20 män reaktio. Esimerkkejä tulehduksesta, joka on seurausta spesifisen puolustusjärjestelmän vasteesta, ovat vaste antigeeneille, kuten rubella-virukselle, autoimmuunisairaudet, viivästyneen tyypin T-soluvälitteinen yliherkkyysvaste 5 (kuten esimerkiksi yksilöillä, joiden Mantaux-koe on "positiivinen"), psoriasis jne.

"Epäspesifisen puolustusjärjetelmän reaktio" on immunologiseen muistiin kykenemättömien leukosyyttien välittämä reak-10 tio. Granulosyytit ja makrofaagit kuuluvat tällaisiin soluihin. Tässä yhteydessä käytettynä tulehduksen sanotaan johtuvan epäspesifisen puolustusjärjestelmän reaktiosta, jos tulehdus johtuu epäspesifisen puolustusjärjestelmän reaktiosta, on sen välittämä tai liittyy siihen. Esimerk-15 kejä tulehduksesta, joka ainakin osittain johtuu epäspesifisen puolustusjärjestelmän reaktiosta, ovat sellaisiin tiloihin liittyvät tulehdukset kuin: astma; ARDS (adult respiratory distress syndrome) tai septisemiaa tai traumaa seuraavat usean elimen vaurioitumissyndroomat; sydänlihak-20 sen tai muiden kudosten toistuvan perfuusion aiheuttama vamma; akuutti glomerulonefriitti, reaktiivinen artriitti; dermatoosit, joissa on akuutteja tulehduskomponentteja; akuutti märkivä meningiitti tai muut keskushermostojärjes-telmän tulehdustaudit; lämpövamma; hemodialyysi; leukafe-25 reesi; haavaimen koliitti; Crohn'in tauti; nekrotisoituva eterokoliitti; granulosyyttien transfuusioon liittyvät syndroomat ja sytokiinin indusoima toksisuus.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti voidaan epäspesifisen 30 puolustusjärjestelmän tällaisten reaktioiden hoitamiseen ;; tai terapiaan käyttää ICAM-l:n funktionaalisia johdoksia ja ' erityisesti tällaisia johdoksia, jotka sisältävät ICAM-l:n i S fragmentteja tai muntattivariantteja, joilla on alueet 1, 2 j ja 3. Vieläkin paremapana pidettyjä tällaiseen hoitoon tai \ 35 terapiaan ovat ICAM-l:n fragmentit tai mutanttivariantit, 1 jotka sisältävät ICAM-l:n alueen 2. Kaikkein parhaimpina • « pidettyjä tällaisessa hoidossa tai terapiassa ovat ICÄM-l:n 104952 21 fragmentit tai mutanttivariantit, jotka sisältävät ICAM-l:n alueen 1.

C. ICAM-l-aeenin kloonausta 5 ICAM-l-geenin kloonaamiseksi voidaan käyttää mitä tahansa lukuisista menettelyistä. Yhdessä tällaisessa menetelmässä analysoidaan kuljetinvektorikirjasto, joka koostuu cDNA-inserteistä (jotka on saatu ICAM-l:n ilmentävästä solusta), 10 insertin läsnäolon suhteen, joka sisältää ICAM-l-geenin.

Tällainen analyysi voidaan suorittaa transfektoimalla soluja vektorilla ja määrittämällä sitten ICAM-l-ilmennys. Edullisen menetelmän mukaan tämän geenin kloonaamiseksi määritetään ICAM-l-molekyylin aminohapposekvenssi. Tämän 15 tehtävän suorittamiseksi ICAM-l-proteiini voidaan puhdistaa ja analysoida automaattisella sekventoijalla. Vaihtoehtoisesti molekyyli voidaan fragmentoida syaanibromidilla, tai proteaaseilla kuten papaiinilla, kymotrypsiinillä tai tryp-siinillä (Oike, Y., et ai., J.Biol.Chem. 257 (1982) 9751 -20 9758; Liu, C., et ai., Int.J.Pept.Protein Res. 21 (1983) 209 - 215). Vaikka on mahdollista määrittää ICAM-l:n aminohapposekvenssi kokonaisuudessaan, edullisesti määritetään molekyylin peptidifragmenttien sekvenssi. Jos peptidit ovat pituudeltaan yli 10 aminohappoa, sekvenssi-informaatio on 25 yleensä riittävä jonkin geenin kuten ICAM-l-geenin kloonaamiseksi .

Aminohappojäännöksien sekvenssi peptidissä merkitään tässä joko käyttämällä niistä yleisesti käytettyä 3-kirjaimista 30 merkintää tai niiden 1-kirjain merkintää. Luettelo näistä ·· 3- ja 1-kirjainmerkinnöistä voidaan etsiä käsikirjoista, kuten Biochemistry, Lehninger, A., Worth Publishers, New York, NY, 1970. Kun tällainen sekvenssi on merkitty pystysuoraan, tarkoitetaan aminopään jäännöksen sijaitsevan 35 luettelossa ylimpänä, ja peptidin karboksyylipään jäännöksen luettelossa alimpana. Vastaavasti kun merkintä on vaa- 9 i kasuorassa, tarkoitetaan aminopään olevan vasemmalla ja 104952 22 karboksyylipään puolestaan oikealla viimeisenä. Peptidin käsittämät aminohappojäännökset voidaan erottaa väliviivoilla. Näiden väliviivojen tarkoitus on yksinomaan selkeyttää sekvenssimerkinnän ulkoasua. Pelkästään havainnollis-5 tavana esimerkkinä aminohapposekvenssi, joka on merkitty: -Gly-Ala-Ser-Phe- tarkoittaa, että Ala-jäännös on kytketty Gly.n karboksyyli-10 ryhmään, ja että Ser-jäännös on kytketty Ala-jäännöksen karboksyyliryhmään ja Phe-jäännöksen aminoryhmään. Merkintä ilmoittaa edelleen, että aminohapposekvenssi sisältää tet-rapeptidin Gly-ALa-Ser-Phe. Merkinnän tarkoitus ei ole rajata aminohapposekvenssiä tähän yhteen tetrapeptidiin, vaan 15 sen tarkoituksena on käsittää (1) tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappojäännös on kytketty joko amino- tai karboksyylipäätyyn, (2) tetrapeptidi, jossa yksi tai useampi aminohappojäännös on kytketty sekä amino- että karboksyylipäätyyn, (3) tetrapeptidi, joka ei käsitä ylimääräisiä 20 aminohappojäännöksiä.

Sitten kun yksi tai useampi sopiva peptiditragmentti on sekventoitu, tarkastellaan niitä koodittamaan kykeneviä DNA-sekvenssejä. Geneettisen koodin degeneraattiluonteen *. 25 johdosta jonkin tietyn aminohapon koodittamiseen voidaan käyttää useampaa kuin yhtä kodonia (Watson, Molecular Bioloov of the Gene, 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977, ss. 356 - 357). Peptiditragmentteja analysoidaan aminohapposekvenssien tunnistamiseksi, joita kyke-. 30 nevät koodittamaan oligonukleotidit, joiden degeneraatti- . aste on alhaisin. Tämä suoritetaan edullisesti tunnistamal la sekvenssejä, jotka sisältävät aminohappoja, joita koo-dittaa vain yksi ainoa kodoni. Vaikka toisinaan tällaisia aminohapposekvenssejä voi koodittaa vain yksi oligonukleo-35 tidi, useimmiten aminohapposekvenssin kykenee koodittamaan . useampi kuin yksi samankaltaisten oligonukleotidien sarjas ta. Tärkeätä on, että kun sarjan kaikki jäsenet sisältävät 104952 23 oligonukleotideja, jotka kykenevät koodittamaan peptidi-fragmentin, ja täten sisältävät mahdollisesti saman nukleo-tidisekvenssin kuin geeni, joka koodittaa peptidifragment-tia, vain yksi sarjan jäsen sisältää nukleotidisekvenssin, 5 joka on identtinen tämän geenin nukleotidisekvenssiin nähden. Koska tämä jäsen esiintyy sarjassa, ja kykenee hybri-doitumaan DNA:han jopa sajan muiden jäsenien läsnäollessa, on mahdollista käyttää ei-fraktioitua oligonukleotidisarjaa samalla tavalla kuin käytettäisiin yksittäistä oligonukleo-10 tidia peptidiä koodittavan geenin kloonaamiseksi.

Edellä kuvattuun nähden täysin analogisesti voidaan käyttää oligonukleotidia (tai oligonukleotidisarjaa), jonka nukleo-tidisekvenssi komplementoi oligonukleotidisekvenssiä, tai 15 sekvenssisarjaa, joka kykenee koodittamaan peptidifragmen-tin.

Sopiva oligonukleotidi, tai sopivia oligonukleotidideja, joka kykene/jotka kykenevät koodittamaan ICAM-l-geenifrag-20 mentin, (tai joka kykenee komplementoimaan tällaista oligonukleotidia, tai oligonukleotidisarjaa) tunnistetaan (käyttäen edellä kuvattua menettelyä), syntetisoidaan ja hybri-doidaan alalla hyvin tunnettuun tapaan DNA:hän tai edullisemmin cDNA-valmisteeseen, joka on saatu ihmissoluista, 25 jotka kykenevät ilmentämään ICAM-l-geenisekvenssejä. Nukle-iinihappohybridointitekniikoita julkistavat Maniatis, T., et ai., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY, 1982, ja Haymes, B.D., et al.. Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach. IRL Press, Washington, 30 DC, 1985, jotka viitteet liitetään tähän viitteiksi. Käy-! tetty DNA- tai cDNA-lähde on edullisesti rikastettu ICAM-1- sekvenssien suhteen. Tällainen rikastuminen voidaan helpoimmin saada cDNA:sta, joka on saatu uuttamalla RNA soluista, joita on viljelty olosuhteissa, jotka indusoivat 35 ICAM-l-synteesiä (kuten U937, jota kasvatetaan forbolieste-rin läsnäollessa, jne.).

24 104952

Edellä kuvatuilla tai niiden kaltaisilla tekniikoilla on menestyksekkäästi kyetty kloonaamaan ihmisen aldehydidehyd-rogenaasigeenejä (Hsu, L.C., et ai., Proc.Natl.Acad.Sei.

USA 82 (1985) 3771 - 3775), fibronektiinigeeni (Suzuki, S., 5 et ai., Eur.J.Mol.Biol.Oraan.J. 4 (1985) 2519 - 2524), ihmisen estrogeenireseptorigeeni (Walter, P., et ai., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 82 (1985) 7889 - 7893), kudostyyppi-plasminogeeniaktivaattorigeeni (Pennica, D., et ai.. Nature 301 (1983) 214 - 221) ja ihmisen istukan alkalisen fosfa-10 taasin kömpiementti-DNA (Kam, W., et ai., Proc.Natl.Acad. Sei. USA 82 (1985) 8715 - 8719).

Edullisen vaihtoehtoisen tavan mukaan ICAM-l-geenin kloonaamiseksi valmistetaan ilmennysvektorikirjasto kloonaamal-15 la DNA tai edullisemmin cDNA ICAM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta ilmennysvektoriin. Sitten kirjasto seulotaan jäseniensä suhteen, jotka kykenevät ilmentämään proteiinin, joka sitoutuu ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen, ja jolla on sellainen nukleotidisekvenssi, että se kykenee kooditta-20 maan polypeptidejä, joilla on sama aminohapposekvenssi kuin ICAM-l:llä tai ICAM-l-fragmenteilla.

Kloonattu ICAM-l-geeni, joka on saatu edellä kuvatuilla menetelmillä, voidaan toiminnallisesti kytkeä ilmennysvek-25 toriin, ja viedä bakteerisoluihin tai eukaryoottisiin soluihin ICAM-l-proteiiinin tuottamiseksi. Tekniikoita tällaisia suorituksia silmälläpitäen julkistavat Maniatis, T., ! et ai., suora, ja ne ovat alalla hyvin tunnettuja.

30 D. LFA-l-riioouvaisen aqqreqaation määrityksien käyttönä I g •

Edellä kuvattua määritystä, jolla kyetään mittaamaan LFA-1-riippuvaista aggregaatiota, voidaan käyttää aineiden tunnistamiseksi, jotka toimivat antagonisteina inhiboiden LFA-35 1-riippuvaisen aggregaation astetta. Tällaiset antagonistit voivat toimia häiritsemällä LFA-l:n tai ICAM-l:n kykyä välittää aggregaatiota. Täten tällaisia aineita ovat immuno- 104952 25 globuliinit kuten vasta-aine, joka kykenee sitoutumaan joko LFA-l:een tai ICAM-l:een. Lisäksi ei-immunoglobuliini- (eli kemiallisia) aineita voidaan tutkia käyttäen edellä kuvattu määritystä sen määrittämiseksi, ovatko ne LFA-l-aggregaati-5 on antagonisteja.

E. ICAM-l-reseptorioroteiineihin sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden käyttöjä 10 1. Tulehdusvastaiset aineet CD18-kompleksijäsenien vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat valkosolujen monia kiinnitysriippuvaisia funktioita, mukaanlukien sitoutuminen endoteeliin (Haskard, 15 D., et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 2901 - 2906), homotyyppi- set kiinnittymiset (Rothlein, R., et ai., J.Exo.Med. 163 (1986) 1132 - 1149), antigeeni- ja mitogeeni-indusoitu imu-solujen lisääntyminen (Davignon, D., et ai., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 78 (1981) 4535 - 4539), vasta-ainemuodostus 20 (Fischer, A., et ai., J.Immunol. 136 (1986) 3198 - 3203), ja kaikkien valkosolujen efektorifunktiot kuten sytotoksi-nen lyysiaktiivisuus T-soluilla (Krensky, A.M., et ai..

J.Immunol. 132 (1984) 2180 - 2182), syöjäsoluilla (Strassman, G., et ai.. J.Immunol. 136 (1986) 4328 - 4333), 25 ja kaikilla soluilla, jotka osallistuvat vasta-aineriippu-vaisiin solusytotoksisuusreaktioihin (Kohl, S., et ai..

J.Immunol. 133 (1984) 2972 - 2978). Kaikissa edeltävissä funktioissa vasta-aineet inhiboivat valkosolun kykyä kiinnittyä sopivaan solusubstraattiin, mikä puolestaan inhiboi 30 lopputulosta.

« 9

Kuten edellä esitetty ICMA-l-molekyylien sitoutuminen LFA-1-ryhmämolekyyleihin on ensiarvoisen merkityksellistä solu-kiinnittymisessä. Kiinnitysprosessin välityksellä imusolut 35 kykenevät jatkuvasti tarkkailemaan eläintä vieraiden antigeenien läsnäolon varalta. Vaikka nämä prosessit ovat nor- • < maalisti toivottavia, ne voivat niin ikään aiheuttaa elin- 104952 26 siirrehyljintää, kudossiirrehyljintää ja monia autoimmuunisairauksia. Täten mikä tahansa keino, jolla kyettäisiin heikentämään tai inhiboimaan solukiinnitystä, olisi erittäin toivottava elinsiirre-, kudossiirrevastaanottajille 5 sekä autoimmuunipotilaille.

ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät monoklonaaliset vasta-aineet sopivat erittäin hyvin tulehdusvastaisiksi aineiksi nisäkäskohteessa. Merkittävästi tällaiset aineet poikkeavat 10 yleisistä tulehdusvastaisista aineita sikäli, että ne kykenevät selektiivisesti inhiboimaan kiinnittymistä, eivätkä tuota muita sivuvaikutuksia, kuten myrkyllisyys munuaisille, joita tavataan tavanomaisilla aineilla. ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan 15 tämän vuoksi käyttää estämässä elin- tai kudoshyljintää ja autoimmuunivasteiden modifioimiseksi pelkäämättä tällaisia sivuvaikutuksia nisäkäskohteessa.

Merkittävästi, käyttämällä ICAM-l:n tunnistamaan kykeneviä 20 monoklonaalisia vasta-aineita kyetään mahdollisesti suorittamaan elinsiirtoja jopa HLA-ei-yhteensopivien yksilöiden välillä.

2. Viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktion suppressorit 25

Koska ICAM-l-molekyylit ilmentyvät valtaosin tulehduskohdissa, kuten kohdissa, joissa esiintyy viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio, ICAM-l-molekyyleihin sitoutumaan kykenevillä (erityisesti monoklonaalisilla) vasta-aineilla on 30 terapeuttisia käyttömahdollisuuksia tällaisten reaktioiden ;; heikentämiseksi tai eliminoimiseksi. Tätä terapeuttista käyttömahdollisuutta voidaan hyödyntää jommallakummalla kahdesta tavasta. Ensinnäkin koostumusta, joka sisältää ICAM-l-vastaista monoklonaalista vasta-ainetta, voidaan 35 antaa potilaalle, jolla on viivästyneen tyypin yliherkkyysreaktio, Esimerkkiksi tällaisia koostumuksia voidaan antaa • · yksilölle, joka on joutunut kosketuksiin antigeenien kuten 104952 27 myrkkymuratin, myrkkytammen jne., kanssa. Toisessa suoritusmuodossa ICAM-l:een sitoutumaan kykenevää monoklonaalis-ta vasta-ainetta annetaan potilaalle yhdessä antigeenin kanssa myöhemmän tulehdusreaktion estämiseksi. Antamalla 5 lisäksi antigeeniä ICAM-l:n sitovan monoklonaalisen vasta-aineen kanssa voidaan siten väliaikaisesti antaa vastustuskyky henkilölle, joka myöhemmin joutuu tälle antigeenille alttiiksi.

10 3. Terapia kroonisille tulehdussairauksille

Koska LAD-potilaat, joilta puuttuu LFA-1, eivät tuota tu-lehdusvastetta, arvellaan, että LFA-1:n luontaisen ligan-din, ICAM-l:n, antagonismi niin ikään estää tulehdusvas-15 teen. ICAM-l-vastaisten vasta-aineiden kyky inhiboida tulehdusta on perusta niiden terapeuttiselle käytölle kroonisten tulehdussairauksien ja autoimmuunisairauksien hoidossa, kuten punahukka, autoimmuuni-kilpirauhastulehdus, kokeellinen aivojen ja selkäytimen yliherkkyystulehdus 20 (EAE), multippeliskleroosi, Reynaudin oireyhtymän tietyt muodot, nivelreuma, jne. Tällaisia vasta-aineita voidaan käyttää terapiana myös psoriasiksen hoidossa. Yleensä ottaen ICAM-l-molekyyleihin sitoutumaan kykenveiä monoklonaali-sia vasta-aineita voidaan käyttää sellaisten sairauksien 25 hoidossa, joita tällä hetkellä hoidetaan steroiditerapial-la.

4. Diagnostisia ja prognostisia käyttöjä 30 Koska ICAM-1 ilmentyy pääasiassa tulehduskohdissa, ICAM-\\ 1:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää keinona tartunta- ja tulehduskohdan kuvan-tamiseksi tai visualisoimiseksi potilaassa. Tällaisessa käytössä monoklonaaliset vasta-aineet leimataan todettaval-35 la leimalla, käyttäen radioisotooppeja, affiniteettileimoja (kuten biotiini, avidiini, jne.), fluoroivia leimoja, para-magneettisia atomeja jne. Menettelyt tällaisen leimaamisen 104952 28 suorittamiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja. Vasta-aineiden kliinistä käyttöä diagnostisessa kuvantamisessa tarkastelevat Grossman, H.B., Urol.Clin. North Amer. 13 (1986) 465 - 474; Unger, E.C., et ai.. Invest.Radioi. 20 (1985) 5 693 - 700, ja Khaw, B.A., et ai.. Science 209 (1980) 295 - 297.

Tulehduksen läsnäolo voidaan niinikään todeta käyttämällä sitoutumisligandeja, kuten mRNA, cDNA tai DNA, joka sitou-10 tuu ICAM-l-geenisekvensseihin, tai ICAM-l-mRNA-sekvenssei-hin, ICAM-l:n ilmentävissä soluissa. Tekniikoita tällaisten hybridointi-määrityksien suorittamiseksi kuvaavat Maniatis, T. (suora).

15 Tällaisten todettavalla leimalla leimattujen vasta-aineiden sijaintipaikan toteaminen merkitsee tulehduskohtaa tai kas-vainkehitystä. Yhdessä suoritusmuodossa tämä tulehduksen etsintä suoritetaan ottamalla kudos- tai verinäytteitä ja inkuboimalla tällaisia näytteitä todettavalla leimalla lei-20 mattujen vasta-aineiden läsnäollessa. Edullisessa suoritusmuodossa tämä tekniikka toteutetaan ei-invasiivisella tavalla käyttäen magneettikuvannusta, fluorografiaa jne. Tällaista diagnostista koetta voidaan käyttää elinsiirrevas-taanottajien tarkkailemiseksi mahdollisen kudoshyljinnän 25 varhaisten merkkien varalta. Tällaisia määrityksiä voidaan suorittaa samoin pyrittäessä määrittämään potilaan taipumus nivelreumaan tai muihin kroonisiin tulehdussairauksiin.

5. Apuaine antigeenisen materiaalin antamiseksi terapeutti-30 sessa tai diagnostisessa tarkoituksessa • «.

Immuunivasteet terapeuttisille tai diagnostisille aineille kuten esimerkiksi nautainsuliini, interferoni, kudostyypin plasminogeeniaktivaattori tai hiiren monoklonaaliset vasta-35 aineet, heikentävät huomattavasti tällaisten aineiden terapeuttista tai diagnostista arvoa ja voivat itse asiassa • < aiheutta sairauksia kuten seerumisairauden. Tällaista ti- 104952 29 lannetta voidaan helpottaa käyttämällä tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita. Tässä suoritusmuodossa tällaisia vasta-aineita annettaisiin yhdessä terapeuttisen tai diagnostisen aineen kanssa. Vasta-aineita lisäämällä estetään 5 vastaanottajaa tunnistamasta ainetta, jolloin vastaanottajaa estetään käynnistämästä sen vastaista immuunivastetta. Seurauksena tällaisen immuunivasteen puuttumisesta potilaalle voidaan antaa enemmän terapeuttista tai diagnostista ainetta.

10 F. Solujen välisen kiinnikemolekvvli-1:n (ICAM-1) kävttöiä JCAM-1 on LFA-l:n sitoutumispari. Sellaisena ICAM-1:tä tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää vastavuo-15 roisesti vaihdettavasti LFA-l:een sitoutumaan kykenevien vasta-aineiden kanssa sairauden hoidossa. Täten liukoisessa muodossa tällaisia molekyylejä voidaan käyttää tulehduksen, elinhyljinnän, siirre-hyljinnän, jne., estämiseksi. ICAM-1:tä tai sen funktionaalisia johdannaisia voidaan käyttää 20 vastaavalla tavalla ICAM-vastaisina vasta-aineina terapeuttisten tai diagnostisten aineiden immunogeenisyyden alentamiseksi .

ICAM-l:tä, sen funktionaalisia johdannaisia ja sen antago-25 nisteja voidaan käyttää ICAM-l:n tai LFA-l:n pinnoillaan ilmentävien kasvainsolujen etäispesäkemuodostuksen tai lisääntymisen salpaamiseksi. Tällaisen päämäärän saavuttamiseksi voidaan käyttää lukuisia menetelmiä. Esimerkiksi ver-tamuodostavien solujen migraatio edellyttää LFA-l-ICAM-1-30 sitoutumista. Tällaisen sitoutumisen antagonistit estävät · siksi tämän migraation ja salpaavat etäispesäkkeiden muo dostumisen valkosolulinjojen kasvainsoluista. Vaihtoehtoisesti potilaalle voidaan antaa toksiinijohdannaismolekyyle-jä, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-l:een tai LFA-1-35 ryhmämolekyyliin. Tällaisten toksiinijohdannaismolekyylien sitoutuessa kasvainsoluihin, jotka ilmentävät ICAM-l:n tai • « 30 104952 LFA-l-ryhmämolekyylin, toksiinin läsnäolo tappaa kasvainso-lun estäen siten kasvaimen kasvun.

G. ICAM-1-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immunoalobuliini 5 antagonistien kävttöiä ICAM-l-riippuvainen kiinnittyminen voidaan estää ei-immuno-globuliini-antagonisteilla, jotka kykenevät sitoutumaan joko ICAM-1:een tai LFA-1:een. Yksi esimerkki ICAM-1:n ei-10 immunoglobuliini-antagonistista on LFA-1. Esimerkki ei-immunoglobuliini-antagonistista, joka sitoutuu LFA-1:een, on ICAM-1. Käyttämällä edellä kuvattuja määrityksiä voidaan tunnistaa ja puhdistaa muita ei-immunoglobuliini-antagonis-teja. ICAM-l-riippuvaisen kiinnittymisen ei-immunoglobu-15 liini-antagonisteja voidaan käyttää samassa tarkoituksessa kuin LFA-l-vastaisia vasta-aineita tai ICAM-l-vastaisia vasta-aineita.

H. Tämän keksinnön mukaisten koostumuksien antaminen 20 ICAM-1:n terapeuttiset vaikutukset voidaan saada antamalla potilaalle ICAM-l-molekyyliä kokonaisuudessaan, tai sen mitä tahansa terapeuttisesti aktiivista peptidifragmenttia.

25 ICAM-1 ja sen funktionaaliset johdannaiset voidaan saada joko synteettisesti, käyttämällä yhdistelmä-DNA-tekniikkaa tai proteolyyttisesti. ICAM-1:n terapeuttisia etuja voidaan lisätä käyttämällä ICAM-1:n funktionaalisia johdannaisia, joihin on lisätty ylimääräisiä aminohappojäännöksiä kytke-30 misen kantajaan helpottamiseksi tai ICAM-1:n aktiivisuuden ·· tehostamiseksi. Tämän keksinnön piiriin tarkoitetaan edel leen kuuluvaksi ICAM-1:n funktionaaliset johdannaiset, joista puuttuvat tietyt aminohappojäännökset, tai jotka sisältävät muutettuja aminohappojäännöksiä, kunhan tällai-35 set johdannaiset osoittavat kykyä vaikuttaa solukiinnityk-seen.

• f 104952 31

Sekä esillä olevan keksinnön mukaisten vasta-aineiden että tässä julkistetun ICAM-1-molekyyIin sanotaan "oleellisesti ei sisältävän luontaisia epäpuhtauksia", jos niitä sisältävät valmisteet ovat oleellisesti vapaita materiaaleista, 5 joiden yhteydessä näitä tuotteita normaalisti ja luontaisesti esiintyy.

Kyseiseen keksintöön kuuluvat vasta-aineet, ja niiden biologisesti aktiiviset fragmentit (riippumatta siitä, ovatko 10 ne polyklonaalisia vai monoklonaalisia), jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een. Tällaisia vasta-aineita voidaan tuottaa joko eläimessä, tai kudosviljelmässä tai yhdistel-mä-DNA-teknisesti.

15 Annettaessa potilaalle vasta-aineita, tai niiden fragmentteja, jotka kykenevät sitoutumaan ICAM-l:een, tai annettaessa ICAM-l:tä (tai sen fragmenttia, varianttia tai johdannaista) vastaanottavalle potilaalle annetun aineen annostus vaihtelee riippuen tekijöistä kuten potilaan ikä, paino, 20 pituus, sukupuoli, yleinen terveydentila, aiempi sairaus-historia jne. Yleensä ottaen on toivottavaa antaa vastaanottajalle vasta-aineannostus, joka on noin 1 pg/kg - 10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa), vaikka voidaan antaa alempiakin tai korkeampiakin annostuksia. Annettaessa potilaal-25 le ICAM-1-molekyylejä tai niiden funktionaalisia johdannaisia, edullisesti tällaisia molekyylejä annetaan annostus, joka samoin on noin 1 pg/kg - 10 mg/kg (potilaan ruumiinpainoa) , vaikka voidaan antaa alempiakin tai korkeampiakin annostuksia. Kuten alla esitetään terapeuttisesti tehokasta 30 annosta voidaan alentaa, jos LFA-l-vastaisen vasta-aineen « 1 ohella annetaan ICAM-l-vastaista vasta-ainetta. Tässä yh teydessä käytettynä jonkin yhdisteen sanotaan annetun lisänä toisen yhdisteen kanssa, kun nämä kaksi yhdistettä annetaan ajallisesti niin lähekkäin, että molemmat yhdisteet 35 voidaan havaita potilaan seerumissa samalla hetkellä.

« 32 104952

Sekä ICAM-l:een sitoutumaan kykenevää vasta-ainetta että itse ICAM-l:tä voidaan antaa potilaille laskimonsisäisesti, lihaksensisäisesti, ihonalaisesti, ruoansulatuskanavan kautta tai sen ulkopuolisesti. Annettaessa vasta-aine tai 5 ICAM-1 ruiskuttamalla antaminen voidaan suorittaa jatkuvan nestesiirron välityksellä tai kerta- tai moniannoksena.

Kyseisen keksinnön mukaisia tulehdusvastaisia aineita on tarkoitus antaa vastaanottaville kohteille määrä, joka on 10 riittävä tukahduttamaan tulehduksen. Määrän sanotaan olevan riittävä "tukahduttamaan" tulehduksen, jos aineen annostus, antotie jne. ovat riittävät heikentämään tai estämään tulehduksen.

15 Anti-ICAM-l-vasta-aine tai sen fragmentti voidaan antaa joko yksinään tai yhdistelmänä yhden tai useamman muun im-munosupressiivisen aineen kanssa (erityisesti elin- tai kudossiirrosteen saaneelle). Tällaisen yhdisteen (yhdisteiden) antaminen voi olla tarkoitukseltaan joko "profylakti-20 nen" tai "terapeuttinen". Profylaktisessa tarkoituksessa annetaan immunosupressiivinen yhdiste (yhdisteet) ennen mitään tulehdusreaktiota tai -oiretta (esimerkiksi ennen elin- tai kudossiirrostetta, sen aikana tai hieman sen jälkeen, mutta ennen mitään elinhylkimisoireita). Yhdisteen ;25 (yhdisteiden) profylaktiseen antamiseen tarkoituksena on estää tai heikentää mahdollinen myöhempi tulehdusreaktio (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hylkiminen jne.). Terapeuttisessa tarkoituksessa annetaan immunosupressiivinen yhdiste (yhdisteet) varsinaisen tulehduksen 30 (kuten esimerkiksi elimen tai kudoksen hylkimisen) oireen _ alkaessa (tai hieman sen jälkeen). Yhdisteen (yhdisteiden) terapeuttisen antamisen tarkoituksena on heikentää varsinaista tulehdusta (kuten esimerkiksi siirretyn elimen tai kudoksen hylkimistä). Esillä olevan keksinnön mukaiset tu-35 lehduksia ehkäisevät aineet voidaan siten antaa joko ennen tulehduksen alkamista (tukahduttamaan odotetun tulehduksen) tai tulehduksen alkamisen jälkeen.

104952 33

Koostumuksen sanotaan olevan "farmakologisesti hyväksyttävä", jos vastaanottava potilas voi sietää sen annon. Tällaista ainetta sanotaan annettavan "terapeuttisesti tehokas määrä", jos annettu määrä on fysiologisesti merkittävä.

5 Aine on fysiologisesti merkittävä, jos seurauksena sen läsnäolosta todetaan muutos vastaanottavan potilaan fysiologiassa .

Esillä olevan keksinnön mukaiset vasta-aine ja ICAM-l-mole-10 kyylit voidaan koostaa tunnetuilla menetelmillä farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumuksien valmistamiseksi, jolloin näitä materiaaleja, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, yhdistetääm seokseksi farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan. Sopivia kantajia ja niiden koostamista, 15 mukaanlukien muut humaaniproteiinit, esim. humaaniseerumi-albumiini, kuvataan esimerkiksi käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. painos, Osol, A., toim. Mack, Easton PA, 1980. Farmaseuttisesti hyväksyttävän koostumuksen muodostamiseksi, joka soveltuu tehokkaaseen antoon, 20 tällainen koostumus sisältää tehokkaan määrän ICAM-vastais-ta vasta-ainetta tai ICAM-l-molekyyliä, tai niiden jotain funktionaalista johdannaista, yhdessä sopivan määrän kantajaa kanssa.

: * 25 Muita farmaseuttisia menetelmiä voidaan käyttää vaikutuksen keston kontrolloimiseksi. Kontrolloidun vapautumisen valmisteita voidaan saada käyttämällä polymeerejä ICAM-l-vas-taisen vasta-aineen tai ICAM-l:n, tai niiden funktionaalisten johdannaisten, kompleksoimiseksi tai absorboimiseksi.

30 Kontrolloituun vapautumiseen voidaan päästä valitsemalla ’ tarkoituksenmukaisia makromolekyylejä (esimerkiksi polyes terit, polyaminohapot, polyvinyylipyrrolidoni, etyleenivi-nyyliasetaatti, metyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloo-sa, tai protamiinisulfaatti) ja makromolekyylien pitoisuuk-35 siä sekä menetelmiä niiden sisällyttämiseksi vapautumisen kontrolloimiseksi. Toinen mahdollinen menetelmä vaikutuksen keston säätelemiseksi käytettäessä kontrolloidun vapautumi- 34 104952 sen valmisteita on sisällyttää ICAM-l-vastainen vasta-aine tai ICAM-l-molekyylejä, tai niiden funktionaalisia johdannaisia, polymeerimateriaalihiukkasiin, jolloin materiaaleina tulevat kyseeseen polyesterit, polymaminohapot, hydro-5 geelit, poly(maitohappo) tai etyleenivinyyliasetaattikopo-lymeerit. Vaihtoehtoisesti sen sijaan että nämä aineet sisällytettäisiin polymeerihiukkasiin, on mahdollista sulkea nämä materiaalit mikrokapseleihin, jotka on valmistettu esimerkiksi koaservaatiotekniikoilla tai rajapintapolyme-10 roinnilla, esimerkiksi hydroksimetyyliselluloosa- tai gela-tiinimikrokapseleihin ja vastaavasti poly(metyylimetasy-laatti)mikrokapseleihin, tai kolloidisiin lääkekuljetusjär-jestelmiin, esimerkiksi liposomeihin, albumiinimikropalloi-hin, mikroemulsioihin, nanohiukkasiin ja nanokapseleihin 15 tai makroemulsioihin. Tällaisia tekniikoita julkistetaan käsikirjassa "Remington's Pharmaceutical Sciences", 1980.

Kuvattuamme nyt keksintöä yleisesti se tulee ymmärrettävämmäksi tutustumalla seuraaviin esimerkkeihin, jotka esite-20 tään havainnollistamismielessä, jolloin niiden tarkoituksena ei ole rajoittaa esillä olevaa keksintöä, ellei siten nimenomaan mainittu.

ESIMERKKI 1 25 Nisäkässolujen viljely

Yleensä ottaen esillä olevan keksinnön mukaisia EBV-trans-formoituja soluja ja hybridoomasoluja säilytettiin RPMI 1640 -kasvualustassa, jota oli täydennetty pitoisuudella 30 20 mM L-glutamiinia, 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä ja .· _ 10 %:lla nautasikiö- (tai vasikansikiö-) seerumia. Soluja viljeltiin 37 °C:ssa 5 % hiilidioksidia käsittävässä ilmakehässä 95 %:n ilman suhteellisessa kosteudessa.

35 Epstein-Barr-virus-(EBV-)transformanttien saamiseksi 106 kpl:ta T-soluja, joista oli poistettu ääreisveren yksi-tumasolut, millilitraa kohden RPMI 1640-kasvualustaa, jota 35 104952 oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia (FCS) ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä, inkuboitiin 16 tunnin ajan B95-8-solujen EBV-pitoisella supernatantilla (Thorley-Lawson, D.A., et ai., J.Exper.Med. 146 (1977) 495).

5 0,2 ml:n solueriä sijoitettiin 10 mikrotiitterilevykuop- paan. Kasvualustaa korvattiin RPMI 1640-kasvualustalla (jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia ja 50 mikrogrammalla/ml gentamysiiniä) kunnes havaittiin solu-kasvua. Soluja kasvoi useimmissa kuopissa ja niitä lisään-10 nytettiin samassa kasvualustassa. Fytohemagglutiniini-(PHA) emosoluja sijoitettiin pitoisuudeksi 106 solua/ml RPMI 1640 -kasvualustaan (jota oli täydennetty 20 %:lla vasikansikiöseerumia), joka sisälsi 1:800 laimennoksena PHA-P:tä (Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI). PHA-solu-15 linjoja lisäännytettiin interleukiini-2:11a (IL-2:lla) käsitellyssä kasvualustassa ja käsiteltiin viikoittain PHA:lla (Cantrell, D.A., et ai., J.Exper.Med. 158 (1983) 1895). Edeltävän menettelyn julkisti Springer, T., et ai., J.Exper.Med. 160 (1984) 1901 - 1918, joka viite sisällyte-20 tään tähän viitteeksi. Edeltävällä menettelyllä saadut solut seulotaan sitten LFA-l-vastaisilla vasta-aineilla sen määrittämiseksi, ilmentävätkö ne LFA-l-antigeenin. Tällaisia vasta-aineita julkistavat Sanchez-Madrid, F., et ai., J.Exper.Med. 158 (1983) 1785.

25 ESIMERKKI 2

Soluaggregaation ja -kiinnityksen määrityksiä

Solukiinnityksen asteen määrittämiseksi käytettiin aggre-30 gaatiomäärityksiä. Näissä määrityksissä käytetyt solulinjat ,·' pestiin kahdesti RPMI 1640 -kasvualustalla, joka käsitti pitoisuuden 5 mM Hepes-puskuria (Sigma Chemical, Co., St. Louis), ja uudelleenlietettiin pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml. Tasapohjaisiin, 96 kuopan mikrotiitterilevyihin 35 (n:o 3596, Costar, Cambridge, MA) lisättiin 50 mikrolitraa sopivaa monoklonaalivasta-ainesupernatanttia tai 50 mikro-litraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi tai ei sisäl- 36 104952 tänyt puhdistettuja monoklonaalisia vasta-aineita, 50 mik-rolitraa täydellistä kasvualustaa, joka sisälsi 200 ng/ml forboliesteri forbolimyristaattiasetaattia (PMA), ja 100 mikrolitraa soluja pitoisuudeksi 2 x 106 solua/ml täydel-5 listä kasvualustaa. Tällöin loppupitoisuudeksi tuli 50 ng/ml PMA:ta ja 2 x 105 solua/kuoppa. Solujen annettiin laskeutua vapaasti, jolloin aggregaatioaste arvosteltiin eri ajankohtina. Arvot vaihtelivat välillä 0 - 5+, jolloin 0 merkitsi, että oleellisesti lainkaan soluja ei ollut ry-10 kelmissä; 1+ merkitsi, että alle 10 % soluista oli aggregaateissa; 2+ merkitsi, että alle 50 % soluista oli aggre-goitunut; 3+ merkitsi, että solut olivat 100-%:isesti pienissä, irtonaisissa rykelmissä; 4+ merkitsi, että solut olivat 100-%:isesti aggregoituneet suuremmiksi rykelmiksi; 15 ja 5+ merkitsi, että solut olivat 100-%:isesti suurissa, hyvin tiiviissä rykelmissä. Kvantitatiivisemman arvion saamiseksi solukiinnityksestä reagensseja ja soluja lisättiin 5 ml:n polystyreeniputkiin samassa järjestyksessä kuin edellä. Putket asetettiin telineessä kiertoravistelijaan 20 37 °C:seen. Putkia ravisteltiin tunnin ajan noin 200 kierr./min kierrosnopeudella, minkä jälkeen 10 mikrolitraa solususpensiota sijoitettiin hemosytometriin ja kvantitoi-tiin vapaiden solujen lukumäärä.

25 Aggregaatio-% laskettiin seuraavasta yhtälöstä: vapaiden solujen lukumäärä aggregaatio-% - 100 x (1 ------------------------------) käytettyjen solun lukumäärä 30 Käytettyjen solujen lukumäärä edellisessä kaavassa on solu-jen lukumäärä millilitrassa verrokkiputkisisältöä, joka sisälsi vain soluja ja täydellistä kasvualustaa ja jota ei inkuboitu. Vapaiden solujen lukumäärä edeltävässä yhtälössä on sama kuin ei-aggregoitujen solujen lukumäärä millilit-35 rassa kokeessa käytettyä putkisisältöä. Edeltäviä menettelyitä on kuvannut Rothlein, R., et ai.. J.Exoer.Med. 163 (1986) 1132 - 1149.

37 104952 ESIMERKKI 3 LFA-1-riippuvainen solu-aggregaatio

Esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaatiota mit-5 taava määritys suoritettiin käyttäen Epstein-Barr-transfor-moitua solulinjaa JY. Lisättäessä PMA:ta kasvualustaan mik-rotiitterilevyillä todettiin solu-aggregaatiota. Ajankulu-videonauhoitukset osoittivat, että JY-solut mikrotiitteri-levyjen pohjalla olivat liikkuvia ja osoittivat aktiivista 10 membraanin rypistymistä ja valejalkaliikettä. Naapurussolu-jen valejalkojen välinen kontakti johti usein solu-solu-kiinnittymiseen. Jos kiinnittyminen oli pitävä, solukontak-tialue siirtyi uropodiin. Kontakti pystyttiin säilyttämään huolimatta kiivaasta soluliikehdinnästä ja solujen vedosta 15 vastakkaisiin suuntiin. PMA:lla käsiteltyjen ja ei-käsitel-tyjen solujen välinen pääasiallinen ero vaikutti olevan näiden kontaktien stabiilisuudessa kontaktien kerran muodostuttua. PMA:lla muodostui solurykelmiä, jotka kasvoivat kooltaan sitä mukaa kun lisää soluja kiinnittyi niiden ää-20 rilaitamille.

Toisena keinona kiinnityksen mittaamiseksi käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvantitatiivista määritystä. Solusus-pensioita ravistettiin 200 kierr./min kierrosnopeudella 2 ' 25 tunnin ajan, minkä jälkeen ne siirrettiin hemosytometriin ja laskettiin sellaisten solujen lukumäärä, jotka eivät olleet aggregaateissa. PMA:n puuttuessa 42 % (SD = 20 %, N = 6) JY-soluista oli aggregaateissa 2 tunnin kuluttua, kun taas JY-soluista, joita oli inkuboitu identtisissä olo-30 suhteissa 50 ng:lla/ml PMA:ta, 87 % (SD = 8 %, N = 6) oli aggregaateissa. Aggregaation kineettisissä tutkimuksissa ilmeni, että PMA tehosti aggregaation nopeutta ja laajuutta kaikkina testattuina ajankohtina (kuvio 3).

« 104952 38 ESIMERKKI 4

Solujen aggregaation inhibitio käyttäen LFA-l-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita 5 LFA-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksien PMA-indusoituun soluaggregaatioon tutkimiseksi näitä vasta-aineita lisättiin soluihin, joita inkuboitiin kuten esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa aggregaatiomääri-tyksessä. Monoklonaalisten vasta-aineiden todettiin inhi-10 boivan soluaggregaattien muodostusta PMA:n sekä läsnäollessa että toisaalta puuttuessa. Monoklonaalisten vasta-aineiden LFA-l-alfa-ketjun vastaiset sekä F(ab')2- että Fab'-fragmentit kykenivät inhiboimaan soluaggregaatiota. Kun oleellisesti 100 % soluista muodosti aggregaatteja LFA-1-j 15 vastaisen vasta-aineen puuttuessa, alle 20 %:n soluista todettiin olevan aggregaateissa vasta-ainetta käytettäessä. Tämän kokeen tuloksia kuvaavat Rothlein, R., et ai. fJ.Exper.Med. 163 (1986) 1132 - 1149).

20 ESIMERKKI 5

Soluaggregaatio edellyttää LFA-l-reseptorin läsnäoloa ! EBV-transformoituja varhaisimusoluja valmistettiin poti- ! laista kuten kuvattu esimerkissä 1. Tällaiset solut seulot- 25 tiin monoklonaalisia vasta-aineita vastaan, jotka kykenevät tunnistamaan LFA-1:n, ja LFA-1:n todettiin puuttuvan soluilta.

Käytettiin esimerkissä 2 kuvattua kvalitatiivista aggregaa-30 tiomääritystä käyttäen edellä kuvattuja soluja, joista ,* puuttuu LFA-1. Tällaiset solut eivät spontaanisti aggregoi- tuneet edes PMA:n läsnäollessa.

104952 39 ESIMERKKI 6 ICAM-l:n löytäminen

Esimerkin 5 solut, joista puuttuu LFA-1, leimattiin karbok-5 sifluoreseiinidiasetaatilla (Patarroyo, M., et ai.. Cell. Immunol. 63 (1981) 237 - 248). Leimattuja soluja sekoitettiin suhteessa 1:10 autologisiin soluihin tai JY-soluihin ja määritettiin aggregaateissa olevien fluoreseiinilla leimattujen solujen prosentuaalinen osuus Rothleinin, R., et 10 ai., J.Exoer.Med. 163 (1986) 1132 - 1149, menetelmän mukaan. Solujen, joista puuttui LFA-1, todettiin kykenevän ko-aggregoitumaan LFA-1:n ilmentä-vien solujen kanssa (kuvio 4) .

15 Sen määrittämiseksi, oliko LFA-1:llä merkitystä vain aggre-gaattimuodostuksessa vai (myös) niiden ylläpidossa, edellä kuvattuihin ennaltamuodostettuihin aggregaatteihin lisättiin LFA-1:een sitoutumaan kykeneviä vasta-aineita. Vasta-ainelisäyksen todettiin voimakkaasti rikkovan valmista agg-20 regaattia. Ajankuluvideonauhoitus vahvisti, että monoklo-naalisten vasta-aineiden lisääminen valmiisiin aggregaatteihin alkoi aiheuttaa rikkoontumista 2 tunnin kuluessa (taulukko 1). LFA-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisäämisen jälkeen valejalkaliikehdintä ja muutokset 25 yksittäisten solujen aggregaateissa muodossa jatkuivat muuttumattomina. Yksittäisiä soluja erkani vähän kerrallaan aggregaatin laidalta; 8 tunnin kuluttua solut olivat valtaosin hajautuneet. Videoajankulunauhoituksen mukaan ennalta-muodostettujen aggregaattien rikkoontuminen LFA-l-monoklo-30 naalivasta-aineiden toimesta vaikutti ekvivalenttiselta • · ·· aggregaatioprosessille LFA-l-monoklonaalivasta-aineen puut tuessa ajassa taaksepäin.

104952 40 TAULUKKO 1 LFA-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden kyky rikkoa ennalta muodostettuja PMA-indusoituja JY-soluaggregaat-5 teja

Kasautumispisteet Koe 18 h 2 ha -mAb +mAb 10 1 4+ 4+ l+b 2 3+ 4+ l+c 3 5+ 5+ l+d 15 Aggregaatio kvalitatiivisessa mikrotiitterilevymääritykses-sä arvioitiin visuaalisesti. Kun LFA-l-vastaista vasta-ainetta oli läsnä koko määritysaikajakson, aggregaatio oli alle 1+.

20 aAggregaation määrä juuri ennen monoklonaalivasta-ainelisä-ystä ajankohtana 2 tuntia.

bTSl/18 + TS1/22 • m 25 CTS1/18 dTSl/22 ESIMERKKI 7 ;· 30 LFA-l-riippuvaisen aggregaation kaksivalenssisten ionien tarve LFA-l-riippuvaiset kiinnitykset sytotoksisten T-solujen ja kohteiden välillä edellyttävät magnesiumin läsnäoloa ; 35 (Martz, E., J.Cell. Biol. 84 (1980) 584 - 598) . PMA-indusoi- dun JY-solu-aggregaation riippuvuutta kaksivalenssisesta 104952 41 kationista testattiin. JY-solut eivät aggregoituneet (käytettäessä esimerkin 2 määritystä) kasvualustassa, joka ei sisältänyt kalsium- tai magnesiumioneja. Kaksivalenssisen magnesiumin lisääminen tuki aggregaatiota niinkin alhaisena 5 ionipitoisuutena kuin 0,3 mM. Pelkästään kalsiumionien lisäämisellä oli vähäinen vaikutus. Kalsiumionien todettiin kuitenkin lisäävän magnesiumionien kykyä tukea PMA-indusoi-tua aggregaatiota. Kun kasvualustaan lisättiin pitoisuus I, 25 mM kalsiumioneja, niin alhaisten magnesiumionipitoi-10 suuksien kuin 0,02 mM todettiin tukevan aggregaatiota. Nämä tulokset osoittavat, että solujen LFA-l-riippuvainen aggre-gaatio edellyttää magnesiumioneja ja että kalsiumionit, vaikkakin yksinään riittämättömiä, voivat vaikuttaa syner-gisesti magnesiumionien kanssa aggregaatiota edistäen.

15 ESIMERKKI 8

Hybridoomasolujen eristys, jotka kykenevät ilmentämään lCAM-1-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita 20 ICAM-l:een sitoutumaan kykeneviä monoklonaalisia vasta- aineita eristettiin Rothleinin, R., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274, menetelmän mukaan, jolloin mainittu viite on sisällytetty tähän viitteeksi. Täten 3 BALB/c-hiirtä immunoitiin vatsaontelonsisäisesti EBV-transformoi-25 duilla ääreisveri-yksitumasoluilla, jotka oli saatu yksilöstä, jolta puuttui LFA-1 (Springer, T.A., et ai..

J. Exoer.Med, 160 (184) 1901). Kussakin immunoinnissa käytettiin noin 107 solua kohden millilitraa RPMI 1640 -kasvualustaa. Immunointiruiskeet annettiin 45, 29 ja 4 päivää 30 ennen kuin hiiristä otettiin pernasoluja haluttujen hybri- • * ·· doomasolulinjojen tuottamiseksi. Päivänä 3 ennen pernasolu jen ottoa hiirille annettiin vielä 107 solua 0,15 mlrssa kasvualustaa (laskimonsisäisesti).

35 Edellä kuvatuista eläimistä eristetyt pernasolut fuusioitiin P3X73Ag8.653-myeloomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren, G., et ai.. Nature 266 (1977) 550, menettelyn mukaan. Näyt- 104952 42 teitä saaduista hybridoomasoluista sijoitettiin 96 kuopan mikrotiitterilevyille. Hybridoomasupernatantit seulottiin aggregaatio-inhibition suhteen ja yksi inhiboiva hybridooma (testatusta 600 kuopasta) kloonattiin ja alakloonattiin 5 käyttäen rajaavan laimentamisen tekniikkaa. Tämä alaklooni nimettiin RR1/1.1.1:ksi (tästäeteenpäin merkitty "RR1/1").

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 todettiin toistettavalla tavalla inhiboivan LFA-l:n ilmentävän solulinjan JY PMArlla 10 stimuloitua aggregaatiota. RRl/l-monoklonaalivasta-aine inhiboi aggregaatiota samanasteisesti, tai hieman vähemmän, kuin jotkut LFA-l-alfa-/-beeta-alayksiköiden vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet. Sitä vastoin HLA:n, joka ilmentyy runsaasti JY-soluilla, vastaiset verrokkimonoklonaali-15 vasta-aineet eivät inhiboineet aggregaatiota. Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 sitoma antigeeni määritellään solujen väliseksi kiinnikemolekyyli-1:ksi (ICAM-1).

ESIMERKKI 9 20 ICAM-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö ICAM-1-molekyyIin karakterisoimiseksi ICAM-1:n luonteen määrittämiseksi ja erityisesti sen määrittämiseksi, poikkesiko ICAM-1 LFA-l:stä, soluproteiineja 25 immuunisaostettiin käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta RR1/1. Immuunisaostus suoritettiin Rothleinin, R., et ai.

(J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274) menetelmän mukaan. JY-soluihin tuotettiin lyysi niiden pitoisuudessa 5 x 107 so-lua/ml liuoksessa, jossa oli 1 % Triton X-100 -valmistetta, 30 0,14 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, ja juuri ennen käyttöä • · lisättävä 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi, käyttäen 0,2 yksikköä/ml trypsiini-inhibiittoria aprotiini (lyysi-puskurissa) 20 minuutin ajan 4 °C:ssa. Lysaatteja sentrifu-goitiin 10 000 x g:ssä 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne 35 esikirkastettiin lisäämällä 50-%:isena suspensiona 50 mik-. rolitraa CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B -geeliä, jolloin käsittelyaika oli 1 tunti 4 °C:ssa.

104952 43

Yksi millilitra lysaattia immuunisaostettiin lisäämällä 20 mikrolitraa 50-%:ista suspensiota, jossa oli monoklonaa-lista vasta-ainetta RR1/1 kytkettynä Sepharose Cl-4B-hart-siin (1 mg/ml), jolloin käsittelyaika oli yön yli 4 °C:ssa 5 (Springer, T.A., et ai., J.Exper.Med. 160 (1984) 1901) . Sepharoseen sidottu monoklonaalinen vasta-aine valmistettiin käyttäen Sepharose Cl-4B:n CNBr-aktivointia karbonaat-tipuskurissa Marchin, S., et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmän mukaan. Pestyillä immuunisakoi11a suoritet-10 tiin SDS-PAGE ja hopeavärjäys Morrisseyn, J.H., Anal.

Biochem. 117 (1981) 307, menettelyn mukaan.

Kun proteiineja oli eluoitu SDS-näytepuskurilla (Ho, M.K., et ai., J.Biol.Chem. 258 (1983) 636, 100 °C:ssa, näytteet 15 jaettiin puoliksi ja niillä suoritettiin elektroforeesiajo (SDS-8 % PAGE) pelkistävissä (kuvio 5A) tai ei-pelkistävis-sä (kuvio 5B) olosuhteissa. Nauhat, joiden molekyylipaino on 50 kd:tä ja 25 kd:tä, vastaavat immunoglobuliinien monoklonaali-vasta-aine-Sepharosesta raskasta ja kevyttä 20 ketjua (kuvio 5A, vyöhyke 3). Havaittiin myös vaihtelevia määriä muita nauhoja 25 - 50 kd -painoalueella, mutta niitä ei esiintynyt sakoisssa, jotka olivat peräisin karvaisista leukemiasoluista, joista saatiin vain 90 kd:n molekyylipai-nonauha. LFA-l:n 177 kd:n alfa-alayksikön ja 95 kd:n beeta-’ 25 alayksikön todettiin migroituvan eri tavalla kuin ICAM-1 sekä pelkistävissä (kuvio 5A, vyöhyke 2) että ei-pelkistä-vissä (kuvio 5B, vyöhyke 2) olosuhteissa.

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 vaikutuksen PHA-varhais-30 imusolu-aggregaatioon määrittämiseksi käytettiin esimerkis-sä 2 kuvattua kvantitatiivista aggregaatiomääritystä. Täten T-soluemosoluja stimuloitiin 4 päivän ajan PHA:lla, minkä jälkeen ne pestiin perusteellisesti ja kasvatettiin sitten 6 päivän ajan IL-2:lla käsitellyssä kasvualustassa. PHA:n 35 todettiin sisäistyvän tämän 6 päivän mittaisen viljelyn aikana, ja se ei myötävaikuttanut aggregaatiomääritykseen. Kolmessa eri määrityksessä erilaisilla T-soluemosoluvalmis- 44 104952 teillä ICAM-l-monoklonaalivasta-aineet inhiboivat aggregaa-tiota toistettavalla tavalla (taulukko 2).

TAULUKKO 2 5 PMA-stimuloidun PHA-varhaisimusoluaggregaation inhibitio RRl/l-monoklonaalivasta-aineella3

Koe PMA Mab Kasautumis-% Estämisb-% 10 lc - Kontrolli 9 + Kontrolli 51 0 + HL-A,B 58 -14b + LFA-1 alfa 31 39 + ICÄM-1 31 39 15 2e - Kontrolli 10 + Kontrolli 78 0 + LFA-1 beta 17 78 + ICAM-1 50 36 3f - --- 7 20 + Kontrolli 70 + HLA-A,B 80 -14 + LFA-3 83 -19 + LFA-1 alfa 02 97 + LFA-1 beta 03 96 25 + ICAM-1 34 51 aPHA-indusoitujen varhaisimusolujen aggregaatio, jota stimuloitiin 50 ng:lla/ml PMA:ta, kvantitoitiin epäsuorasti 30 laskemalla mikroskoopin avulla ei-aggregoitujen solujen • ( lukumäärä kuten kuvattu esimerkissä 2.

bInhibitio-% verrattuna soluihin, joita käsiteltiin PMA:11a ja X63-monoklonaalivasta-aineella.

35 104952 45 cAggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanaikaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA. Soluja ravisteltiin 175 kierr./min kierrosnopeudella.

5 Negatiivinen luku merkitsee aggregaation prosentuaalista tehostumista.

eAggregaatio mitattiin tunnin kuluttua siitä, kun oli samanaikaisesti lisätty monoklonaalinen vasta-aine ja PMA.

10 Soluja pelletoitiin 200 x g:ssä 1 min ajan, niitä inkuboi-tiin 37 °C:ssa 15 minuutin ajan, minkä jälkeen ne uudel-leenlietettiin varovaisesti ja ravisteltiin 45 minuutin ajan 100 kierr./min kierrosnopeudella.

15 fSoluja esikäsiteltiin PMA:lla 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Sitten kun monoklonaalinen vasta-aine oli lisätty, putkien sisältöä inkuboitiin 37 °C:ssa ravistelematta 20 minuutin ajan ja sitten ravistellen 100 minuutin ajan 75 kierr./min kierrosnopeudella.

20 LFA-l-monoklonaalivasta-aineet olivat toistettavalla tavalla voimakkaammin inhiboivia kuin ICAM-l-monoklonaalivasta-aineet, kun taas ULA A -, B - ja LFA-3-monoklonaalivasta-aineilla ei ollut vaikutusta. Nämä tulokset osoittavat, 25 että testatuista monoklonaalisista vasta-aineista vain LFA-l:een tai ICAM-l:een sitoutumaan kykenevät kykenivät estämään solukiinnitystä.

ESIMERKKI 10 30 ICAM-l-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistus Immunointi BALB/c-hiiri immunoitiin vatsaontelonsisäisesti (i.p.) 35 ruiskuttamalla 0,5 ml:n erinä 2 x 107 JY-solua RPMI-kasvu-alustassa 103 ja 24 päivää ennen fuusiota. Päivinä 4 ja 3 104952 46 ennen fuusiota hiiriä immunoitiin i.p. 107 PMA-differenti-oidulla U937-solulla 0,5 ml:ssa RPMI-kasvualustaa.

U937-soluien differentiaatio I 5 U937-soluja (ATCC CRL-1593) differentioitiin inkuboimalla niitä pitoisuutena 5 x lOVml RPMI:ssä, joka sisälsi 10 % nautasikiöseerumia, 1 %:n glutamiinia ja 50 mikrogrammaa/ml gentamysiiniä (täydellinen kasvualusta), joka sisälsi 10 2 ng/ml forboli-12-myristaattiasetaattia (PMA), steriilissä polypropyleeniastiassa. Tämän inkuboinnin 3. päivänä puolet kasvualustatilavuudesta poistettiin ja korvattiin tuoreella täydellisellä ja PMA:ta sisältävällä kasvualustalla. Päivänä 4 solut poistettiin, pestiin ja valmisteltiin immunoin-15 tia silmälläpitäen.

Fuusio

Immunoiduista hiiristä saadut pernasolut fuusioitiin P3x63 . 20 Ag8.653 -myeloomasoluihin suhteessa 4:1 Galfren et ai., (Nature 266 (1977) 550) mukaan. Fuusioinnin jälkeen solut | maljoitettiin 96 kuopan tasapohjaisiin mikrotiitterilevyi- ! hin pitoisuudeksi 105 pernasolua/kuoppa.

25 ICAM-l-vastaisina positiivisten solunen valinta

Viikon kuluttua 50 mikrolitraa supernatanttia seulottiin esimerkin 2 mukaisessa kvalitatiivisessa määrityksessä käyttäen sekä JY- että SKW3-soluja aggregoituvina solulin-30 joina. Solut supernatanteista, jotka inhiboivat JY-solu-;* aggregaatiota mutta eivät SKW3-solu-aggregaatiota, valit tiin ja kloonattiin 2 kertaan käyttäen rajaavan laimentamisen menetelmää.

35 Tällä kokeella saatiin tunnistetuksi ja sittemmin kloonattiin kolme erillistä hybridoomasolulinjaa, jotka tuottivat ICAM-l-vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita. Näiden hyb- 47 104952 ridoomasolu-linjojen tuottamat vasta-aineet olivat IgG2a, IgG2b ja vastaavasti IgM. Hybridoomasolulinja, joka tuotti ICAM-l-vastaista vasta-ainetta IgG2a, nimettiin nimellä R6,5’D6’E9,B2. Edullisen hybridoomasolulinjan tuottama 5 vasta-aine nimettiin nimellä R6T5'D6'E9'B2 (tässä nimellä "R6-5-D6").

ESIMERKKI 11 ICAM-l:n ilmennys ja säätely 10 ICAM-l:n ilmentymisen mittaamiseksi kehitettiin radio-im-muunimääritys. Tässä määrityksessä puhdistettua RRl/l:tä jodattiin käyttäen jodogeenia, jonka spesifinen aktiivisuus oli 10 mikrocurie-yksikköä/mikrogramma. Endoteelisoluja 15 kasvatettiin 96 kuopan levyillä ja käsiteltiin kuten kuvattu kullekin kokeelle. Maljat jäähdytettiin 4 °C:seen sijoittamalla ne kylmähuoneeseen 0,5-1 tunniksi, eikä (siis) välittömästi jäihin. Solu-yksikerrokset pestiin 3x kylmällä täydellisellä kasvualustalla ja inkuboitiin sitten 20 30 minuutin ajan 4 °C:ssa ^öI-RRl/l:llä. Solu-yksikerrokset pestiin sittten 3x täydellisellä kasvualustalla. Sitoutunut *251 vapautettiin käyttäen 0,1 N natriumhydroksidiliuosta ja laskettiin. ^öI-RRl/lin spesifinen aktiivisuus säädettiin käyttäen ei-leimattua RRl/l:tä lineaarisen signaalin * 25 saamiseksi tässä tutkimuksessa tavatuilla antigeenitiheyk- sillä. Ei-spesifinen sitoutuminen määritettiin lOOOx ylimäärän ei-leimattua RRl/l:tä läsnäollessa ja saatu arvo vähennettiin kokonaissitoutumisesta spesifisen sitoutumisen saamiseksi.

30 !! ICAM-l-ilmennys, edellä kuvatulla radioimmuunimäärityksellä mitattuna, kasvaa ihmisen napalaskimon endoteelisoluilla (HUVEC) ja ihmisen alaraajan iholaskimon endoteelisoluilla (HSVEC) IL-l:n, TNF:n, LPS:n ja IFN-gamman vaikutuksesta 35 (taulukko 3). Alaraajan iholaskimon endoteelisoluja käytettiin tässä tutkimuksessa napalaskimon endoteelisoluilla saatujen tuloksien varmistamiseksi viljellyissä suuren las- i 48 104952 kimon endoteelisoluissa, jotka oli saatu täysikasvuisen I henkilön kudoksesta. IGAM-l:n perusilmennys on 2x korkeampi alaraajan iholaskimon endoteelisoluilla kuin napalaskimon endoteelisoluilla. Altistettaessa napalaskimon endoteeli-5 solut yhdistelmä-IL-l-alfalle, -IL-l-beetalle ja -TNF-gam-malle ICAM-1-ilmennys kasvoi 10 - 20 kertaisesti. IL-l-al-fa, TNF ja LPS olivat tehokkaimmat indusorit ja IL-1 oli vähemmän tehokas painosta laskettuna ja myös vasteen kyl-lästyspitoisuuksina (taulukko 3). IL-l-beeta pitoisuutena 10 100 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 9-kertaisesti HUVEC-so- luilla ja 7,3-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin puolimak-simaalinen kasvu saatiin pitoisuudella 15 ng/ml. rTNF pitoisuutena 50 ng/ml lisäsi ICAM-l-ilmennystä 16-kertaisesti HUVEC-soluilla ja 11-kertaisesti HSVEC-soluilla, jolloin 15 puolimaksimaalinen vaikutus saatiin pitoisuudella 0,5 ng/ml. Interferoni-gamma tuotti merkittävän kasvun ICAM-1-ilmennykseen, joka oli 5,2-kertainen HUVEC-soluilla tai 3,5-kertainen HSVEC-soluilla, pitoisuudessa 10 000 U/ml.

LPS:n vaikutus pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml oli samaa 20 suuruusluokkaa kuin rTNF:n. Näiden välittäjien yhdistäminen pareittain johti additiivisiin tai additiivista hieman alhaisempiin vaikutuksiin ICAM-l-ilmennykseen (taulukko 3). Ristititraamalla rTNF rIL-l-beetalla tai rlFN-gammalla ei saatu synergismiä näiden optimin alapuolisten tai optimaa-'* 25 listen pitoisuuksien välille.

Koska LPS nosti ICAM-l-ilmennystä endoteelisoluilla pitoi-j suuksina, joita joskus esiintyy kasvualustassa, mahdolli suutta, että perus-ICAM-l-ilmennys johtuisi LPSrstä, tut-30 kittiin. Testattaessa useampia seerumieriä todettiin, että V. alhaisen endotoksiinipitoisuuden käsittävä seerumi antoi 25 % alhaisemman ICAM-l-pohjailmennyksen. Kaikki tässä ilmoitetut tulokset oli saatu endoteelisoluilla, joita kasvatettiin alhaisen endotoksiinipitoisuuden käsittävässä see-j 35 rumissa. Kuitenkin lisäämällä LPS:ää neutraloivaa antibi- _ oottia polymyksiini-B pitoisuutena 10 mikrogrammaa/ml ICAM- 1-ilmennys laski enää vain 25 % (taulukko 3) . ICAM-l-ilmen- · it- ΧΛ 104952 49 nyksen kasvuun IL-l:llä tai TNFrllä käsiteltäessä ei vaikuttanut 10 mikrogramman/ml polymyksiini-B:ta läsnäolo, mikä sopii yhteen näiden valmisteiden käsittämien alhaisten endotoksiinitasojen kanssa (taulukko 3).

5 TAULUKKO 3 ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet 10 Käsittely (16 h) Spesifisesti sitoutunut 125I (CPM)

HUVEC HSVEC

Kontrolli 603 ±11 - 1132 ±31 100 ng/ml yIL-1 beta 5680 ± 638 9x 8320 ± 766 7,3x 50 ng/ml yIL-1 alfa 9910 ± 538 16x 15 50 ng/ml yTNF alfa 9650 * 1500 16x 12690 ± 657 H,2x 10 pg/ml LPS 9530 * 512 16iI 10459 1 388 9·2* 3120 ± 308 5,2x 4002 ± 664 3,5x 10 ng/ml ylFN gamma yIL-1 beta + TNF 1469 ± 1410 24x 16269 ± 660 14x yIL-1 beta + LPS 13986 ± 761 23x 10870 ± 805 lOx 20 yIL-1 beta + ylFN gamma 7849 ± 601 13x 8401 ± 390 7'4x yTNF + LPS 15364 * 1241 24x 16141 ± 1272 14x t-t 13480 ± 1189 22x 13238 ± 761 12x yTNF + IFN gamma 10206 ± 320 17x 10987 ± 668 lOx LPS + IFN gamma polymyksiini B (10 pg/ml) 480 ± 23 25 polymyksiini B + yIL-1 5390 ± 97 llx polymyksiini B + yTNF 9785 ± 389 20x 1 pg/ml LPS 7598 * 432 13x " , . . . „ TTW, 510 ± 44 1, lx

polymyksiini B + LPS

30 ·· ICAM-1-ilmennyksen säätäminen ylöspäin HVEC- ja HUVEC-so- luilla - HUVEC- tai HSVEC-soluja maljoitettiin 96 kuopan levyille suhteessa 1:3 yhteenkasvaneesta solu-yksikerroksesta ja annettiin kasvaa yhteen. Sitten soluja käsiteltiin 35 mainituilla materiaaleilla tai kasvualustalla 16 tunnin ajan, minkä jälkeen suoritettiin RIA-määritys kuten mene- 50 104952 telmien yhteydessä esitetty. Kaikki määrityslukemat ovat 4-kertaisista rinnakkaismäärityksistä.

ESIMERKKI 12 5 ICAM-l:n interleukini-1- ja gamma-interferoni- induktion kinetiikka

Interleukiini-1:n ja gamma-interferonin vaikutuksien ICAM-1-ilmennykseen ihon sidekudosmuodostussoluilla kinetiikkaa , 10 tutkittiin käyttäen vuohen :25l-leimattua anti-hiiri-IgG- j vasta-ainesitoutumismääritystä, Dustin, M.L., et ai.

i (J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254; joka viite sisällytetään tähän viitteeksi). Tämän sitoutumismäärityksen suorittamiseksi ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin 15 96 kuopan mikrotiitterilevyllä tiheyteen 2 - 8 x 104 so- lua/kuoppa (0,32 cm2). Solut pestiin kahdesti RPMI 1640 -kasvualustalla, jota oli täydennetty kuten kuvattu esimerkissä 1. Solut pestiin vielä kerran Hankin tasapainoitetul-la suolaliuoksella (HBSS), jossa oli pitoisuudet 10 mM 20 Hepes, 0,05 % NaN3, ja 10 % lämpöinaktivoitua nautasikiö-seerumia. Pesu tällä sitoutumispuskurilla suoritettiin ' 4 °C:ssa. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 50 mikrolitraa edellä ! kuvattua sitoutumispuskuria ja 50 mikrolitraa sopivaa hyb- ! ridoomasupernatanttia, jolloin negatiivisena ja positiivi- V 25 sena verrokkina käytettiin X63:ea ja vastaavasti W6/32:ta.

I Kuoppien sisältöä inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 °C:ssa " samalla kevyesti ravistellen, minkä jälkeen kuopat pestiin kahdesti sitoutumispuskurilla ja toista vasta-ainetta, vuohen ^Sl-leimattua anti-hiiri-IgG:tä, lisättiin pitoisuus 30 50 nCi/100 mikrolitraa. Vuohen ^öl-leimattu hiirivastainen «·· vasta-aine valmistettiin käyttäen Iodogen-valmistetta (Pierce) Frakerin, P.J. et ai. (Biochem.Bioohvs.Res.Commun.

' 8_0 (1978) 849) menetelmän mukaan. 30 minuutin 4 °C:ssa ku luttua solut pestiin kahdesti 200 mikrolitralla sitoutumis-35 puskuria ja solukerros tehtiin liukoiseksi lisäämällä 100 : mikrolitraa 0,1 N natriumhydroksidiliuosta. Tämä ja 100 mikrolitran pesuerä laskettiin Beckmanin malli 5500 gamma-

M

51 104952 laskijalla. Sitoutuneet spesifiset tuikkeet/min laskettiin kaavasta [tuiketta/min monoklonaalivasta-aineella] - [tui-ketta/min X63:lla]. Kaikki vaiheet, mukaan lukien indusoin-ti spesifisillä reagensseilla, suoritettiin 4-kertaisin 5 rinnakkaismäärityksin.

Interleukiini-1:n, jonka puoliintumisaika ICAM-l-induktios-sa on 2 tuntia, vaikutus oli nopeampi kuin gamma-interferonin, jonka puoliintumisaika on 3,75 tuntia (kuvio 6). Aika-10 käyrä paluussa ICAM-l-lepotasoille vaikutti riippuvan solu-syklistä tai solu-kasvunopeudesta. Lepotilassa olevissa soluissa interleukiini-1:n ja gamma-interferonin vaikutukset ovat stabiileja 2-3 päivän ajan, kun taas log-faasi-viljelmissä ICAM-l-ilmennys pysyttelee lähellä pohjatasoa 2 15 päivää näiden indusorien poistamisen jälkeen.

Kuviossa 7 on esitetty annos-vastekuvaajat ICAM-l-induk-tiolle yhdistelmä-hiiri- ja yhdistelmä-humaani-interleu-kiini-l:llä ja yhdistelmä-humaani-gamma-interferonilla.

20 Gamma-interferonilla ja interleukiini-1:llä todettiin olevat samankaltaiset pitoisuusriippuvuudet, jolloin vaikutukset pitoisuudessa 1 ng/ml olivat lähes identtiset. Humaani-ja hiiri-yhdistelmä-interleukiini-1:llä oli niinikään samankaltaiset kuvaajat, mutta ne ovat paljon vähemmän tehok-.* 25 kaita kuin humaani-interleukiini-l-valmisteet ICAM-1-ilmen nyksen indusoinnissa.

Sykloheksamidi, joka inhiboi proteiinisynteesiä, ja aktino-mysiini-D, joka inhiboi mRNA-synteesiä, tuhoavat sekä 30 interleukiini-1:n että gamma-interferonin vaikutukset ICAM-·; 1-ilmennykseen sidekudosmuodostussoluilla (taulukko 4).

Lisäksi tunikamysiini, joka inhiboi N-kytkenteistä glyko-sylaatiota, inhiboi interleukiini-1:n vaikutusta vain 43 %:lla. Nämä tulokset osoittavat, että proteiini- ja 35 mRNA-synteesi, mutta ei N-kytkenteinen glykosylaatio, ovat edellytyksiä interleukiini-1- ja gamma-interferoni-stimu- loiduille ICAM-1-ίlmennyksen nousuille.

• I

104952 52 TAULUKKO 4

Sykloheksimidin, aktinomysiini-D:n ja tunikamysiinin vaikutukset ICAM-l-induktioon IL-l:llä ja gamma-IFN:llä ihmisen ihon sidekudosmuodostussoluilla® 5

Spesifisesti sitoutunut 125I vuohen anti-hiiri IgG (cpm)

Käsittely anti-ICAM-1 anti-HLA-A,B,C

Kontrolli (4 h) 1425 ± 140 11928 ± 600 10 + sykloheksimidi 1513 ± 210 10678 ± 471 + aktinomysiini D 1590 ± 46 12276 ± 608 + tunikamysiini 1461 ± 176 12340 ± 940 UL 1 (10 U/ml (4 h) 4264 ± 249 12155 ± 510 + sykloheksimidi 1619 ± 381 12676 ± 446 . 15 + antinomysiini D 1613 ± 88 12294 ± 123 j + tunikamysiini 3084 ± 113 13434 ± 661 IFNy (10 U/ml) (18 h) 4659 ± 109 23675 ± 500 + sykloheksimidi 1461 ± 59 10675 ± 800 + antimysiini 1326 ± 185 12089 ± 550 20 aIhmisen sidekudosmuodostussoluja kasvatettiin tiheyteen 8 x 104 solua/0,32 cm2 kuoppa. Käsittelyt suoritettiin 50 : mikrolitran lopputilavuudessa, joka sisälsi mainitut rea-

genssit. Sykloheksimidiä, aktinomysiini-D:tä ja tunikamy-" 25 siinia lisättiin pitoisuus 20 mikrogrammaa/ml, 10 mikro-M

ja vastaavasti 2 mikrogrammaa/ml sytokiinien kanssa samanaikaisesti. Kaikki lukemat ovat keskiarvoja 4-kertaisista rinnakkaismäärityksistä, +/- SD.

• * • * i 30 ESIMERKKI 13 ICAM-l:n kudosjakauma

Kudosopilliset tutkimukset suoritettiin käyttäen jäädytettyä humaani-elinkudosta ICAM-l:n jakauman määrittämiseksi 35 kateenkorvassa, imusolmukkeissa, suolessa, ihossa, munuai- 104952 53 sissa ja maksassa. Tällaisen analyysin suorittamiseksi normaaleista ihmiskudoksista peräisin olevia jäädytettyjä kudosleikkeitä (paksuus 4 mikrometriä) kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne värjättiin 5 monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1 immunoperoksidaasi-tekniikkaa käyttäen, jolloin suorituksessa käytettiin avi-diinibiotiinikompleksimenetelmää (Vector Laboratories, Burlingame, CA), jota kuvaavat Cerf-Bensussan, N., et ai.

(J.Immunol. 130 (1983) 2615). Vasta-aineella inkuboinnin 10 jälkeen leikkeitä inkuboitiin toisiaan seuraten biotinyloi-dulla hevosen anti-hiiri-IgG:llä ja avidiini-biotinyloi-duilla peroksidaasikomplekseilla. Leikkeet kastettiin lopuksi liuokseen, jossa oli 3-amino-9-etyylikarbatsolia (Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI) värireaktion 15 kehittämiseksi. Leikkeitä kiinnitettiin sitten 4-prosentti-sessa formaldehydiliuoksessa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen ne vastavärjättiin hematosykliinillä. Verrokkeina käytettiin leikkeitä, joita inkuboitiin ei-sukulaismonoklonaali-vasta-aineilla RRl/l-vasta-aineen asemesta.

20 ICAM-l:n jakauma todettiin hyvin samanlaiseksi kuin pääasiallisen kudosyhteensopivuuskompleksin (MHC) luokka-II-anti-geenien. Suurin osa verisuonista (sekä pienistä että suurista) kaikissa kudoksissa osoitti endoteelisolujen vär-Y 25 jääntymistä ICAM-l-vasta-aineella. Verisuonten endoteeli-värjäys oli voimakkaampaa follikkelien välisillä (parakor-tikaali-) alueilla imusolmukkeissa, risoissa ja Peyerin imusolmukkeissa kuin munuaisten, maksan ja normaalin ihon verisuonissa. Maksassa värjäys oli valtaosin rajoittunut 30 hiussuonipoukamavuorisoluihin; maksasolut ja endoteelisolut valtaosan porttilaskimoista ja -valtimoista seinämissä eivät olleet värjääntyneet.

Kateenkorvaytimessä havaittiin suurien solujen diffuusia 35 värjääntymistä ja dendriittinen värjäyskuvio. Korteksissa värjäyskuvio oli paikallinen ja ja pääasiassa dendriittinen. Kateenkorvasolut eivät värjääntyneet. Ääreisimukudok- 104952 54 sessa sekundaaristen imurakkuloiden imusolmuke-itusolut olivat voimakkaasti värjääntyneet. Joissain imurakkuloissa värjäyskuvio oli valtaosin dendriittinen, jolloin imusolujen näkyvää värjääntymistä ei ollut todettavissa. Havait-5 tiin myös solujen heikkoa värjääntymistä vaippavyöhykkeel-lä. Lisäksi sytoplasmajatkeita käsittävät dendriittisolut (interdigitaatio-retikulosolut) ja pieni osuus imusoluista follikkelien välisillä tai parakortikaali-alueilla värjään-tyivät ICAM-1:n sitovalla vasta-aineella.

10

Syöjäsoluja muistuttavat solut värjääntyivät imusolmukkeissa ja ohutsuolen keskikerroksessa. Useimpien tutkittujen elimien peruskudokseen hajaantuneet sidekudosmuodostussolu-jen kaltaiset (kierteen muotoiset) solut ja dendriittisolut 15 värjääntyivät ICAM-1:n sitovalla vasta-aineella. Värjäänty-mistä ei havaittu Langerhans/indeterminanttisoluissa orvas-kedessä. Värjääntymistä ei havaittu sileälihaskudoksessa.

Epiteelisolujen värjääntymistä todettiin toistettavalla 20 tavalla risojen limakalvossa. Vaikka maksasolut, sappitie-hytepiteeli, suolen epiteelisolut ja putkimaiset epiteelisolut munuaisissa eivät värjääntyneet useimmissa tapauksissa, normaalimunuaiskudosleikkeet, jotka oli saatu munuais-solusyöpäliitteisestä munuaisenpoistonäytteestä, osoittivat ! V 25 monien proksimaaliputkisolujen ICAM-l-värjääntymistä. Nämä putkiepiteelisolut värjääntyivät myös HLA-DR-vastaisella sitoutumisvasta-aineella.

Yhteenvetona ICAM-1 ilmentyy ei-vertamuodostavilla soluilla 30 kuten verisuonten endoteelisolut ja vertamuodostavilla so-· luilla kuten kudoksen syöjäsolut ja mitogeeni-stimuloidut T-imusolu-emosolut. ICAM-1:n todettiin ilmentyvän alhaisina pitoisuuksina ääreisveren imusoluilla.

104952 55 ESIMERKKI 14 ICAM-1:n puhdistaminen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografiällä 5 Puhdistuksen vleiskaavio ICAM-1 puhdistettiin humaanisoluista tai -kudoksesta käyttäen monoklonaalivasta-aine-affiniteettikromatografiaa. Monoklonaalinen vasta-aine, RRl/1, joka reagoi ICAM-1:n 10 kanssa, puhdistettiin ensin ja kytkettiin sitten inerttiin kolonnimatriisiin. Tätä vasta-ainetta kuvaavat Rothlein, R., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274, ja Dustin, M.L., et ai. (J.Immunol. 137 (1986) 245) . ICAM-1 liuotet tiin solumembraaneista tuottamalla soluihin lyysi ei-ioni-15 sessa pesuaineessa, Triton X-100, lähellä neutraalia olevassa pH:ssa. Liuenneen ICAM-1:n sisältävä solulysaatti käytettiin sitten esikolonneissa, joiden tehtävänä oli poistaa materiaaleja, jotka sitoutuvat ei-spesifisesti ko-lonnimatriisimateriaaliin, ja sitten monoklonaalivasta-20 ainekolonni-matriisin läpi, jotta ICAM-1 saattoi sitoutua vasta-aineeseen. Sitten vasta-ainekolonni pestiin sarjalla pesuaine-pesupuskureita, joiden pH kasvoi aina 11,0:aan. Näiden pesujen aikana ICAM-1 pysyi sitoutuneena vasta-aine-matriisiin, kun taas ei-sitoutuvia ja heikosti sitoutuneita .· 25 epäpuhtauksia poistui. Sitoutunut ICAM-1 eluoitiin sitten spesifisesti kolonnista käyttämällä pesuainepuskuria, jonka pH oli 12,5.

Monoklonaalisen vasta-aineen RR1/1 puhdistaminen ia kova-30 lentti kytkeminen Sepharose C1-4B -geeliin « · ICAM-l-vastainen monoklonaalinen vasta-aine RR1/1 puhdistettiin hybridooman käsittävien hiirien vatsaontelonestees-tä tai hybridoomaviljelmäsupernatanteista tavanomaisilla 35 tekniikoilla ammoniumsulfaatilla saostamalla ja käyttämällä proteiini-A-affiniteettikromatografiaa (Ey, et ai.. Immunochem. 15 (1978) 429). Puhdistettu IgG, tai rotan 104952 56

IgG:tä (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) kytkettiin kova-lentisti Sepharose C1-4B -geeliin (Pharmacia, Upsala, Ruotsi) käyttäen muunnosta Marchin et ai. (Anal.Biochem. 60 (1974) 149) menetelmästä. Lyhyesti, Sepharose C1-4B pestiin 5 tislatulla vedellä, aktivoitiin käyttäen 40 mg/ml CNBriää 5 M kaliumvetyfosfaattiliuoksessa (pH noin 12) 5 minuutin ajan ja pestiin sitten perusteellisesti 0,1 mM kloorivety-hapolla 4 °C:ssa. Suodatettu aktivoitu Sepharose uudelleen-lietettiin vastaavaan tilavuuteen puhdistettua vasta-ainet-10 ta (2 - 10 mg/ml 0,1 M natriumvetykarbonaattiliuoksessa, 0,1 M NaCl). Lietettä inkuboitiin 18 tunnin ajan 4 °C:ssa pyörittäen kevyesti ympäri. Sitten supernatantista tutkittiin ei-sitoutuneen vasta-aineen läsnäolo mittaamalla absorbanssi 280 nm:n aallonpituudella, ja aktivoidun Sepha-15 rosen jäljellä olevat reaktiiviset keskukset kyllästettiin lisäämällä glysiiniä pitoisuuteen 0,05 M. Kytkentäteho oli tavallisesti > 90 %.

Ihmisen pernasta valmistettujen membraanien liuottaminen 20 pesuaineella

Kaikki operaatiot suoritettiin 4 °C:ssa. Jäädytetyt ihmisen pernat (200 g:n fragmentteina), jotka oli saatu karvainen solu-leukemiaa potevista potilaista, sulatettiin jäissä 25 200 ml:ssa Tris-suolaliuosta (50 mM Tris, 0,14 M NaCl, pH 7,4, 4 °C), jossa oli pitoisuus 1 mM fenyylimetyylisul-fonyylifluoridia (PMSF), 0,2 U/ml aprotiinia ja 5 mM jodo-asetamidia. Kudos leikeltiin pieniksi palasiksi ja homogenoitiin 4 °C:ssa Tekmar-tehohomogenisaattorissa. Tilavuus 30 täytettiin sitten 300 ml:ksi lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin 100 ml 10-%:ista Tween 40 - (polyoksietyleeni-sorbitaanimonopalmitaatti-) liuosta Tris-suolaliuoksessa, jolloin Tween 40 -valmisteen loppupitoisuudeksi tuli 2,5 %, 35 Membraanien valmistamiseksi homogenaattia uutettiin käyttäen kolmea iskua Dounce-, tai edullisemmin Teflon Potter Elvejhem -homogenisaattorissa, minkä jälkeen sentrifugoi- 104952 57 tiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan. Supernatantti otettiin talteen ja pellettiä uutettiin toistamiseen 200 ml :11a 2,5-%:ista Tween 40 -liuosta Tris-suolaliuoksessa. Seosta sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 15 minuutin ajan, minkä jäl-5 keen supernatantit kummastakin uutosta yhdistettiin ja niitä sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan membraani-en pelletoimiseksi. Membraanit pestiin uudelleenliettämällä 200 ml:aan Tris-suolaliuosta sentrifugoiden 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Membraanipelletti uudelleenlietettiin 10 200 ml:aan Tris-suolaliuosta ja homogenoitiin moottorikäyt töisessä homogenisaattorissa käyttäen Teflon-survinta, kunnes liete oli tasaisen samea. Sitten tilavuus täytettiin 900 ml:ksi lisäämällä Tris-suolaliuosta ja lisättiin N-lau-royylisarkosiinia loppupitoisuuteen 1 %. Seosta sekoitet-15 tiin 4 °C:ssa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen ei-liukoinen materiaali pesuaine-lysaatissa poistettiin sentrifugoimalla 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan. Sitten supernatanttiin lisättiin Triton X-100-valmistetta loppupitoisuuteen 2 % ja lysaattia sekoitettiin 4 °C:ssa 1 tunnin ajan.

20 JY-B-varhaisimusolujen pesuaine-liuotus EBV-transformoitua B-varhaisimusolulinjaa JY kasvatettiin RPMI 1640 -kasvualustassa, joka sisälsi pitoisuudet 10 % 25 vasikansikiöseerumia (FCS) ja 10 mM Hepes, solutiheyteen noin 0,8 - 1,0 x 106 solua/ml. ICAM-l:n solupintailmennyk-sen lisäämiseksi lisättiin forboli-12-myristaatti-13-ase-taattia (PMA:ta) pitoisuuteen 25 ng/ml 8-12 tunniksi ennen kuin solut otettiin talteen. Viljelmiin lisättiin täl-30 löin myös natriumvanadaattia (50 mikro-M). Solut pelletoi- • · tiin sentrifugoimalla 500 x g:ssä 10 minuutin ajan ja pestiin sitten kahdesti Hankin tasapainotetulla suolaliuoksella (HBSS) uudelleenliettämällä ja sentrifugoimalla. Soluihin (noin 5 g 5 litrassa viljelmää) tuotettiin lyysi 35 50 ml:ssa lyysipuskuria (0,14 NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 1 %

Triton X-100, 0,2 U/ml aprotiini, 1 mM PMSF, 50 mikro-M natriumvanadaatti) sekoittamalla 4 °C:ssa 30 minuutin ajan.

104952 58

Ei-lyysin läpikäyneet tumat ja ei-liukoinen jäte sentrifu-goitiin eroon 10 000 x g:ssä 15 minuutissa, minkä jälkeen supernatanttia sentrifugoitiin 150 000 x g:ssä 1 tunnin ajan ja suodos suodatettiin Whatmanin 3 mm:n suodatinpape-5 rin läpi.

ICAM-1:n af f initeettikromatocrrafia silmälläpitäen rakennetutkimuksia 10 ICAM-1:n puhdistamiseksi suuressa mittakaavassa rakennetutkimuksissa käytettäväksi käytettiin kolonnia, jossa oli 10 ml RRl/l-Sepharose C1-4B -geeliä (kytkentä 2,5 mg vasta-ainetta/ml geeliä) ja kahta esikolonnia, joissa oli 10 ml CNBr-aktivoitua, glysiinillä sammutettua Sepharose C1-4B 15 -geeliä ja rotta-IgG:tä kytkettynä Sepharose C1-4B -geeliin (2 mg/ml). Kolonnit kytkettiin sarjaksi ja esipestiin 10 kolonnitilavuudella lyysipuskuria, 10 kolonnitilavuudella pH 12,5 -puskuria (50 mM trietyyliamiini, 0,1 % Triton X-100, pH 12,5, 4 °C) , minkä jälkeen niitä tasapainoitet-20 tiin 10 kolonnitilavuudella lyysipuskuria. Yksi litra ih-mispernan pesuainelysaattia panostettiin virtausnopeudella 0,5 - 1,0 ml/min. Kahta esikolonnia käytettiin ei-spesifi-sesti sitoutuneen materiaalin poistamiseksi lysaatista ennen sen käyttämistä RRl/l-Sepharose-kolonnissa.

7 25

Panostuksen jälkeen kolonni, jossa oli RRl/l-Sepharose ja siihen sitoutunut ICAM-1, pestiin toisiaan seuraten virtausnopeudella 1 ml/min vähintään 5 kolonnitilavuudella kutakin seuraavaa liuosta: 1) lyysipuskuri, 2) 20 mM Tris, 30 pH 8,0/0,14 M NaCl/0,1 % Triton X-100, 3) 20 mM glysiini, • pH 10,0/0,1 % Triton X-100, ja 4) 50 mM trietyyliamiini, pH 11,0/0,1 % Triton X-100. Kaikki pesupuskurit sisälsivät pitoisuuden 1 mM PMSF ja 0,2 U/ml aprotiinia. Pesun jälkeen jäljelle jäänyt sitoutunut ICAM-1 eluoitiin 5 kolonnitila-35 vuudella eluointipuskuria (50 mM trietyyliamiini/0,1 %

Triton X-100/pH 12,5, 4 °C) virtausnopeu-della 1 ml/3 min. Eluoitu ICAM-1 kerättiin 1 ml:n fraktioina ja neutraloitiin 104952 59 välittömästi lisäämällä 0,1 ml liuosta 1 M Tris, pH 6,7. ICAM-l:tä sisältävät fraktiot identifioitiin suorittamalla SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi 10 mikrolitran erille (Springer et ai., J.Exp.Med. 160 (1984) 1901), ja 5 sen jälkeen hopeavärjäys (Morrissey, J.H., Anal.Biochem.

117 (1981) 307). Näissä olosuhteissa valtaosa ICAM-l:stä eluoitui noin 1 kolonnitilavuudessa ja sen puhtausaste oli yli 90 % hopealla värjätyistä elektroferogrammeista arvioiden (pääasiallinen epäpuhtaus oli pieni määrä IgGrtä, joka 10 oli vuotanut affiniteettimatriisista). ICAM-l:tä sisältävät fraktiot yhdistettiin ja niitä konsentroitiin noin 20-ker-taisesti käyttäen Centricon-30-mikrokonsentraattoreita (Amicon, Danvers, MA). Puhdistettu ICÄM-1 kvantitoitiin suorittamalla Lowryn proteiinimääritys etanolilla saoste-15 tusta poolinäytteestä: 200 g:sta ihmisen pernaa saatiin tuotettua noin 500 mikrogrammaa puhdasta ICAM-l:tä.

Noin 200 mikrogrammalla puhdistettua ICAM-l:tä suoritettiin toinen puhdistusvaihe käyttäen preparatiivista SDS-polyak-20 ryyliamidigeelielektroforeesia. ICÄM-1:tä vastaava nauha tehtiin näkyväksi liottamalla geeliä 1 M kaliumkloridili-uoksessa. ICAM-l:n sisältävä geeli-alue leikattiin sitten irti ja sillä suoritettiin elektroeluutio Hunkapillerin et ai., Meth.Enzvmol. 91 (1983) 227 - 236, menetelmän mu-25 kaan. Puhdistetun proteiinin puhtausaste oli > 98 % SDS-PAGErn ja hopeavärjäyksen nojalla pääteltynä.

ICAM-l:n affiniteettipuhdistus funktionaalisia tutkimuksia silmälläpitäen 30 • t *· ICAM-l:tä käytettäväksi funktionaalisissa kokeissa puhdis tettiin JY-solujen pesuainelysaateista edellä kuvatun mukaisesti, mutta pienemmässä mittakaavassa (1 ml:n kolonni, jossa RRl/l-Sepharosea), ja käyttäen seuraavia modifikaati-35 oita. Kaikki liuokset sisälsivät pitoisuuden 50 mikro-M natriumvanadaattia. Kun kolonni oli pesty pH 11,0 -puskurilla, jossa oli 0,1 % Triton X-100 -valmistetta, kolonni 104952 60 pestiin jälleen viidellä kolonnitilavuudella samaa puskuria, joka sisälsi 1 %:n n-oktyyli-beeta-D-glukopyranosidia (oktyyliglukosidi) 0,1 %:n Triton X-100 -valmistetta asemesta. Oktyyliglukosidipesuaine korvaa ICAM-1:een sitoutu-5 neen Triton X-100 -valmisteen ja vastoin kuin Triton X-100, se voidaan sittemmin poistaa dialysoimalla. ICAM-1 eluoi-tiin sitten pH 12,5 -puskurilla, jossa oli 1 % oktyyliglu-kosidia 0,1 %:n Triton X-100-valmistetta asemesta, minkä jälkeen se analysoitiin ja konsentroitiin kuten edellä ku-10 vattu.

ESIMERKKI 15

Puhdistetun ICAM-1:n ominaisuudet 15 Ihmisen pernasta puhdistettu ICAM-1 migroituu SDS-polyak-ryyliamidigeeleissä leveänä nauhana, jonka Mr on 72 000 -91 000. JY-soluista puhdistettu ICAM-1 migroituu myös leveänä nauhana, jonka Mr on 7 6 500 - 97 000. Nämä Mr-arvot ovat eri solulähteistä immuunisaostetulle ICAM-1:lie ilmoitetul-20 la alueella: Mr = 90 000 JY-soluille, 114 000 myelomono-syyttisolulinjalle U937, ja 97 000 sidekudosmuodostusso-luille (Dustin et ai.. J.Immunol. 137 (1986) 245). Tämä laaja Mr-alue on katsottu johtuvaksi voimakkaasta mutta vaihtelevasta glykosylaatioasteesta. Ei-glykosyloidun pre-:· 25 kursorin Mr on 55 000 (Dustin et ai.). Joko JY-soluista tai ihmisen pernasta puhdistetulla proteiinilla on tallella sen antigeeniaktiivisuus, minkä osoittavat sen kyky sitoutua uudelleen alkuperäiseen affiniteettikolonniin ja immuuni-saostuminen RRl/l-Sepharose-geelissä ja SDS-polyakryyliami-30 dielektroforeesi.

ICAM-l-peptidifragmenttien tuottamiseksi noin 200 mikro-grammaa pelkistettiin käyttäen seosta 2 mM ditiotreito-li/2 % SDS, minkä jälkeen alkyloitiin käyttäen 5 mM jodi-35 etikkahappoa. Proteiini saostettiin etanolilla ja uudel-leenliuotettiin liuokseen 0,1 M NH4CO3/0, 1 mM CaCl2/0,l % Zwittergent 3-14 (Calbiochem), minkä jälkeen sitä pilkot- i 104952 61 tiin pitoisuudella 1 % w/w trypsiiniä 37 °C:ssa 4 tunnin ajan, minkä jälkeen pilkottiin edelleen 1 %:lla trypsiiniä 12 tunnin ajan 37 °C:ssa. Trypsiinipeptidit puhdistettiin käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen 0,4 x 15 cm:n C4-kolonnia 5 (Vydac). Peptidit eluoitiin käyttäen lineaarista gradient-tia 0 % - 60 % asetonitriili/O,l-%:inen trifluorietikkahap-po. Valituilla peptideillä suoritettiin sekvenssianalyysi kaasufaasi-mikrosekventorilla (Applied Biosystems). Tästä tutkimuksesta saatu sekvenssi-informaatio on esitetty tau-10 lukossa 5.

TAULUKKO 5 ICAM-l-trvpsiinipeptidien aminohapposekvenssit 15 Amino- Peptidi happo- ------------ .. 50a 50b 46a 46b X 45 K AA J U O Ml jäännös

1 [T/V] A (V/A) EV S LEAL VL

2 F SQ PEFNLGLT L/E

20 3 L IT ALPPDSGL P/(G)

4 T SF AATLVI P

5 V LP PPVRLE G/Y

6 Y GL LNTPVT N/L

7 P WP PVYQTP (N) 25 8 T P I I T/I G G C P/V (Q) - 9 S F G (G) L - L S K (E) Γ 10 E E (Q) - D E T (D)

11 A S D/P K SLS

12 G/S V V P F F C

30 13 A T DQSED

14 G V W V/L A - Q

15 I K T P

16 SK

' 17 A

35 18 P

19 X

20 Q

21 L

62 104952 ( ) = sekvenssi, jonka todennäköisyys on alhainen.

[ ] = sekvenssi, jonka todennäköisyys on hyvin alhainen.

/ = merkitsee epäselvyyttä sekvenssissä; todennäköisin aminohappo on merkitty ensimmäiseksi.

5 a = runsaasti esiintyvä peptidi b = vähän esiintyvä peptidi ESIMERKKI 16 ICAM-l-geenin kloonaus : 10 ICÄM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen mitä tahansa lukui-; sista eri menettelyistä. Esimerkiksi aminohapposekvenssi- j informaatiota, joka saatiin sekventoimalla ICAM-l-trypsii- ! nifragmentteja (taulukko 5), voidaan käyttää oligonukleoti- 15 disekvenssin identifioimiseksi, joka vastaisi ICAM-l-gee- niä. Vaihtoehtoisesti IGAM-l-geeni voidaan kloonata käyttäen ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICÄM-l:tä tuottavien kloonien tunnistamiseksi.

20 ICÄM-l-geenin kloonaaminen käyttämällä oligonukleotidikoet-timia Geneettistä koodia (Watson, J.D., Molecular Biology of the Gene. 3. painos, W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA, 1977) hyödyntäen voidaan tunnistaa yksi tai useampi erilainen oligonukleotidi, joista kukin kykenee kooditta-Γ 25 maan ICAM-l-trypsiinipeptidejä. Todennäköisyyttä sille, että tietty oligonukleotidi on todella tosiasiallinen ICAM-l:tä koodittava sekvenssi, voidaan arvioida tarkastelemalla epänormaali emäsparimuodostus -suhteita ja tiheyttä, jolla tiettyä kodonia tosiasiallisesti käytetään (tie-30 tyn aminohapon koodittamiseksi) eukaryoottisissa soluissa.

« ! Tällaisia "kodonikäytäntösääntöjä" julkistavat Lathe, R., et ai., J.Molec.Biol. 183 (1985) 1-12. Käyttämällä Lathen "kodonikäytäntösääntöjä" tunnistetaan yksittäinen oligonuk-Γ leotidi, tai oligonukleotidisarja, joka sisältää teoreetti- " 35 sen "todennäköisimmän" nukleotidisekvenssin (eli nukleoti- ^ _ disekvenssin, jonka runsaus on alhaisin), joka kykenee koo- dittamaan ICAM-l-trypsiinipeptidisekvenssejä.

104952 63

Oligonukleotidia, tai oligonukleotidisarjaa, joka sisältää teoreettisen "todennäköisimmän" sekvenssin, joka kykenee koodittamaan ICAM-l-fragmentteja, käytetään komplementoi-van oligonukleotidin tai oligonukleotidisarjan sekvenssin 5 tunnistamiseksi, joka kykenee hybridoitumaan "todennäköi-simpään" sekvenssiin, tai sekvenssisarjaan. Tällaisen komplementoivan sekvenssin sisältävää oligonukleotidia voidaan käyttää koettimena ICAM-l-geenin tunnistamiseksi ja eristämiseksi (Maniatis, T., et ai., Molecular Cloning -10 A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

Kuten kuvattu osassa C, edellä, on mahdollista kloonata ICÄM-l-geeni eukaryoottisista DNA-valmisteista, joiden ar-15 vellaan sisältävän tämän geenin. ICAM-l-proteiinia koodit-tavan geenin tunnistamiseksi ja kloonaamiseksi DNA-kirjasto seulotaan sen kyvyn suhteen hybridoitua edellä kuvattuihin oligonukleotidi-koettimiin. Koska on todennäköistä, että normaali diploidinen solu käsittää ICAM-l-geenistä vain 20 kaksi kopiota, ja koska on mahdollista, että ICAM-l-geeniin saattaa sisältyä suuria ei-transkriboituvia välisekvensse-jä (introneja), joita ei haluta kloonata, edullisesti ICAM-l:tä koodittavat sekvenssit eriste-tään cDNA-kirjas-tosta, joka on valmistettu mieluummin ICAM-l:tä tuottavan ·' ' 25 solun mRNA:sta kuin genomi-DNA:sta. Sopiva DNA- tai cDNA- valmiste pilkotaan entsymaattisesti tai rikotaan umpimähkään ja ligatoidaan yhdistelmävektoreihin. Sen jälkeen mitataan näiden yhdistelmävektoreiden kyky hybridoitua edellä kuvattuihin oligonukleotidikoettimiin. Menettelyitä hybri-30 doinnin suorittamiseksi esitetään esimerkiksi julkaisuissa

r V

; Maniatis, T., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982, tai Haymes, B.T., et al,, Nucleic Acid Hybridization - A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK, 1985. Tällaiseen 35 hybridoitumiseen kykeneviä vektoreita analysoidaan sitten niiden sisältämien ICAM-l-sekvenssien määrän ja laadun määrittämiseksi. Vain tilastollisten näkökohtien nojalla jokin 64 104952 geeni, kuten ICAM-1-molekyylin koodittava geeni, voitaisiin yksikäsitteisesti tunnistaa (hybridointiseulonnalla) käyttäen vain 18 oligonukleotidia sisältävää oligonukleotidi-koetinta.

: 5 Täten yhteenvetona ICAM-l-peptidisekvenssien tosiasiallinen tunnistus mahdollistaa teoreettisen "todennäköisimmän" DNA-sekvenssin, tai tällaisten sekvenssien sarjan, joka kykenee koodittamaan tällaisen peptidin, tunnistuksen. Rakentamalla 10 oligonukleotidi, joka komplementoi tätä teoreettista sek-= venssiä (tai rakentamalla oligonukleotidisarja, joka komp lementoi "todennäköisimpien" oligonukleotidien sarjaa), * saadaan DNA-molekyyli (tai DNA-molekyylisarja), joka kyke- j nee toimimaan koettimena ICAM-l-geenin tunnistamiseksi ja 15 eristämiseksi.

Käyttäen taulukon 5 mukaisia ICAM-l-peptidisekvenssejä oli-gonukleotidin, jolla on "todennäköisin" sekvenssi, sekvenssi, joka kykenee koodittamaan AA- ja J-peptidejä, tunnis-20 tettiin (taulukko 6 ja vastaavasti 7). Näitä sekvenssejä komplementoivia oligonukleotideja syntetisoitiin ja puhdistettiin käytettäviksi koettimina ICAM-l-geenisekvenssien eristämiseksi. Sopivia koon suhteen valikoituja cDNA-kir-jastoja muodostettiin poly (A)+-RNA: sta, joka oli peräisin ' 25 PMArlla indusoiduista HL-60-soluista tai PS-stimuloiduista napalaskimo-endoteelisoluista. Koon suhteen valikoitu cDNA-kir j asto valmistettiin käyttäen poly (A)+-RNA: ta, joka oli saatu PMA-indusoiduista HL-60-soluista, Gublerin, U., et ai. (Gene 25 (1983) 263 - 269) ja Corbin, A., et ai.

30 (EMBO J. 6, (1987) 4023 - 4028), jotka viitteet sisällyte-; tään tähän viitteiksi, menetelmän mukaan.

Koon suhteen valikoitu cDNA-kirjasto valmistettiin käyttäen poly (A)+-RNA:ta, joka oli peräisin napalaskimo-endoteeliso-35 luista, joita oli stimuloitu 4 tunnin ajan PSrllä, 5 mikro-grammaa/ml. RNA uutettiin homogenoimalla solut 4 M guanidi-f i niumisotiosyanaatissa ja ultrasentrifugoimalla supernatant- h i Ί 65 104952 ti CsCl-gradienttia käyttäen (Chirgwin, J.M., et ai., Biochem. 18 (1979) 5294 - 5299). Poly (A)+-RNA eristettiin kokonais-RNA-lajiseoksesta käyttämällä oligo-(dT)-sellu-loosakromatografiaa (tyyppi 3, Collaborative Research) 5 (Aviv, H., et ai., Proc.Natl.Acad.Sei. USA 69 (1972) 1408 - 1412) .

66 1 0 4 9 5 2 TAULUKKO 6

Oligonukleotidi, joka kömpiementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-l-AA-peptidin ICAM:n Kaikkein amino- todennäköisin happo- ICAM-1 AA-peptidiä Komplementtinen ryhmä AA-peptidi koodaava sekvenssi sekvenssi 5’ 3’

162 Glu G C

A T

G C

163 Leu C G

T A

G C

164 Asp G C

A T

C G

165 Leu C G

T A

G C

166 Arg C G

G C

G C

167 Pro C G

C G

C G

168 Gin C G

A T

G C

169 Gly G C

G C

j CG

170 Leu C G

T A

G C

171 Glu G C

A T

G C

172 Leu C G

\ TA

G C

173 Phe T A

T A

T A

174 Glu G C

A T

G C

3' 5' 104952 67 TAULUKKO 6 (jätk.)

Oligonukleotidi, joka komplementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-l-AA-peptidin ICAM:n Kaikkein amino- todennäköisin happo- ICAM-1 AA-peptidiä Komplementtinen ryhmä AA-peptidi koodaava sekvenssi sekvenssi

175 As n A T

A T

C G

176 Thr A T

C G

C G

177 Ser U A

C G

A

3' 5’ W 9 — » 9 104952 68 TAULUKKO 7

Oligonukleotidi, joka kömpiementoi todennäköisintä nukleotidisekvenssiä, joka kykenee koodittamaan ICAM-1-J-peptidin ICAM:n Kaikkein amino- todennäköisin happo- ICAM-1 AA-peptidiä Kömpiementtinen ryhmä AA-peptidi koodaava sekvenssi sekvenssi 5' 3'

19 Vai G C

T A

G C

20 Thr A T

C G

C G

21 Cys T A

G C

C G

22 Ser T A

C G

C G

23 Thr A T

C G

C G

24 Ser T A

C G

C G

25 Cys T A

G C

T A

' 2 6 Asp G C

AT C G

27 Gin C G

A T

G C

28 Pro C G

C G

C G

2 9 Lys A T

AT 3' 5' 104952 69

Ensimmäinen cDNA-säie syntetisoitiin käyttäen 8 mikrogrammaa poly (A)+-RNA: ta, linnun myeloblastoosi-virus-käänteis-transkriptaasia (Life Sciences) ja oligo(dT)-aluketta. DNA-RNA-hybridi pilkottiin RN-aasi-H:11a (BRL) ja toinen säie 5 syntetisoitiin käyttäen DNA-polymeraasi-I:tä (New England Biolabs). Tuote metyloitiin EcoRI-metylaasilla (New England Biolabs), ja tasaiseksi saatetut päät ligatoitiin EcoRI-liittäjiin (New England Biolabs), minkä jälkeen pilkottiin EcoRI:llä ja valikoitiin koon mukaan alhaisen sulamispis-10 teen omaavassa agaroosigeelissä. Kooltaan suuremmat cDNA:t kuin 500 ep:tä ligatoitiin lambda-gtlO:een, jota oli edeltäpäin pilkottu EcoRI:llä ja defosforyloitu (Stratagene). Ligatointituote pakattiin sitten (Stratagene-kulta).

15 Sitten napalaskimo-endoteelisolu- ja HL-60-cDNA-kirjastoja maljoitettiin pitoisuudeksi 20 000 pmy/150 mm:n malja. Yhdistelmä-DNA siirrettiin kaksinkertaisin rinnakkaismääri-tyksin nitroselluloosasuodattimille, denaturoitiin käyttäen 0,5 M NaOH/1,5 NaCl -liuosta, neutraloitiin lisäämällä 1 M 20 Tris-puskuria, pH 7,5/1,5 M NaCl, ja paistettiin 80 °C:ssa 2 tunnin ajan (Benton, W.D., et ai., Science 196 (1977) 180 - 182) . Suodattimet esihybridoitiin ja sitten hybridoi-tiin 5XSSC:ssä, joka sisälsi 5X Denhardtin liuosta, 50 mM NaP04 ja 1 mikro-gramman/ml lohensperma-DNA:ta. Esihydri-»' 25 dointi suoritettiin 45 °C:ssa ja sen annettiin kestää 1 tunnin.

Hybridoinnissa käytettiin 32 ep:n (5-TTGGGCTGGTCACAGGAGGTG-GAGCAGGTGAG) tai 47 ep:n (5'-GAGGTGTTCTCAACAGCTCCAGGCCCTGG-30 GGCCGCAGGTCCAGTCTC) ei-tieto-oligonukleotideja, joiden ra-kenne perustui edellä kuvatulla tavalla ICAM-l-trypsiini-peptidiin J ja vastaavasti AA (taulukko 7 ja 6) (Lathe, R., J.Molec.Biol. 183 (1985) 1 - 12). Oligonukleotidien päät leimattiin gamma- (32P)ATP:llä käyttäen T4-polynukleotidi-35 kinaasia ja valmistajan (New England Biolabs) suosittelemia olosuhteita. Suodattimia hybridoitiin yön yli, minkä jälkeen niitä pestiin kahdesti 2XSSC/0,1 % SDS -liuoksella 30 104952 70 minuutin ajan 45 °C:ssa. Fagit eristettiin niistä pesäkkeistä, joissa oli tapahtunut hybri-doitumista, minkä jälkeen niitä puhdistettiin maljoittamalla ja seulomalla useaan kertaan.

5 ICAM-l-qeenin kloonaaminen käyttämällä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta ICAM-l-geeni voidaan vaihtoehtoisesti kloonata käyttämällä 10 ICAM-l-vastaista vasta-ainetta. DNA:ta, tai edullisemmin cDNA:ta, uutetaan ja puhdistetaan ICAM-l:n ilmentämään kykenevästä solusta. Puhdistettu cDNA fragmentoidaan (rikkomalla, endonukleaaseilla pilkkomalla, jne.) DNA- tai cDNA-fragmenttipoolin saamiseksi. Tämän poolin DNA- tai cDNA-15 fragmentit kloonataan sitten ilmennysvektoriin ilmennysvek-torigenomikirjaston tuottamiseksi, jonka jäsenistä kukin sisältää yksittäisen kloonatun DNA- tai cDNA-fragmentin.

ESIMERKKI 17 20 cDNA-kloonien analysointi

Positiivisista klooneista saatu fagi-DNA pilkottiin EcoRI:llä ja sitä tutkittiin Southernin analysilla käyttäen yhden kloonin cDNA:ta koettimena. Ristihybridoituvat maksi-; 25 mikoon omaavat cDNA-insertit alakloonattiin plasmidivekto- rin pGEM4Z (Promega) EcoRI-keskukseen. cDNA:n kummankin suunnan mukaan suuntautuneena sisältävät HL-60-alakloonit tuhottiin pilkkomalla eksonukleaasi-III:11a (Henikoff, S., Gene 28 (1984) 351 - 359) valmistajan (Erase-a-Base, Prome-30 ga) suosituksia noudattaen. Asteittain tuhotut cDNA:t kloo-nättiin sitten ja niille suoritettiin dideoksinukleotidi-ketjupääsekventointi (Sanger, F., et ai., Proc.Natl.Acad.

Sei. USA 74 (1977) 5463 - 5467) valmistajan (Sequenase, U.S. Biochemical) ohjeiden mukaan. HL-60-cDNA:n 5'-ja koo-35 dialueet sekventoitiin täydellisesti kummastakin säikeestä ja 3'-alue sekventoitiin noin 70-%:isesti kummastakin säikeestä. Edustava endoteeli-cDNA sekventoitiin lähes koko 104952 71 pituudeltaan "haulikko"-kloonaamalla 4 ep:n tunnistusres-triktioentsyymifragmenttej a.

Määritettiin yhden HL-60- ja yhden endoteelisolu-cDNA:n 5 cDNA-sekvenssi (kuvio 8). 3023 ep:n sekvenssi sisältää lyhyen 5'-ei-translatoituvan alueen ja 1,3 ep:n 3'-ei-trans-latoituvan alueen, jolloin asemassa 2966 sijaitsee konsen-suspolyadenylaatiosignaali. Pisin avoin lukualue alkaa ensimmäisestä ATG-kodonista asemassa 58 ja päättyy TGA-lope-10 tuskolmikkoon asemassa 1653. Koska translatoitu aminohapposekvenssi ja kahdeksasta (8) eri trypsiinipeptidistä, kaikkiaan 91 aminohappoa (alleviivattu kuviossa 8), määritetyt sekvenssit olivat samankaltaiset, varmistui, että oli eristetty autenttisia ICAM-l-cDNA-klooneja. ICAM-l-trypsii-15 nipeptidien aminohapposekvenssit on esitetty taulukossa 8.

TAULUKKO 8 ICAM-l-trypsiinipeptidien aminohapposekvenssejä 20 Peptidi Ryhmät Sekvenssi

J 14-29 X G S V L VTCSTSCDOPK

U 30-39 L L G I E T P L (P) (K)

50 78-85 (T) F L T V Y X T

X 89-95 V E L A P L P

; 25 AA 161-182 X ELDLRPOGLE —

L F E X T S A P X Q L

K 232-246 LNPTVTYGXDSFSAK

45 282-295 S F P A P N V (T/I) L X K P Q (V/L) 30 — merkitsee, että sekvenssi jatkuu seuraavalla rivillä; ; alleviivattuja sekvenssejä käytettiin oligonukleotidikoet- timien valmistuksessa.

Hydrofobisuusanalyysin (Kyte, J., et al·., J.Molec.Biol. 157 35 (1982) 105 - 132) tuloksien mukaan läsnä on 27 jäännöksen signaalisekvenssi. +l-glutamiinin sijoitus sopii siihen, et-temme onnistuneet saamaan N-pääsekvenssiä kolmelle eri 104952 72 ICAM-l-proteiinivalmisteelle; glutamiini mahdollisesti syk-lisoituu pyroglutamiinihapoksi, jolloin muodostuu salvattu N-pää. Translatoitu sekvenssi 1 - 453 on voittopuolisesti hydrofiilinen, jolloin sen jälkeen seuraa 24 jäännöksen 5 hydrofobinen oletettu membraanin läpäisevä alue. Tätä mem-braanin läpäisevää aluetta seuraa välittömästi useita varauksen käsittäviä jäännöksiä, jotka sijoittuvat 27 alueen oletetulle sytoplasma-alueelle.

10 Kypsälle polypeptidiketjulle ennustettu koko on 55 219 dal-tonia, mikä sopii oikein hyvin deglykosyloidulle ICAM-1:lie saatuun kokoon 55 000 (Dustin, M.L., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Ennustetaan 8 N-kytkenteistä glykosylaa-tiokeskusta. Asparagiinin puuttuminen trypsiinipeptidisek-15 vensseistä kahdessa näistä keskuksista varmistaa niiden glykosylaation ja solunulkoisen orientaation. Jos korkean mannoosipitoisuuden käsittävän N-kytkenteisen hiilihydraatin kooksi oletetaan 2500 daltonia, ICAM-l-prekursorin ko-koennusteeksi saadaan 75 000 daltonia verrattuna havaittuun 20 73 000 daltoniin (Dustin, M.L., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254). Kun korkean mannoosipitoisuuden käsittävä tuote on muutettu kompleksiseksi hiilihydraatiksi, kypsän ICAM-l-glykoproteiinin koko on 76 - 114 kd:tä, solutyypin mukaan (Dustin, M.L., et ai., J.Immunol. 137 (1986) Γ 25 245 - 254). Täten ICAM-1 on voimakkaasti glykosyloitu, mut ta muutoin tyypillinen integraalinen membraaniproteiini.

ESIMERKKI 18 ICAM-1 on immunoglobuliinisupergeeniryhmän 30 integriiniä sitova jäsen * ICAM-1:n sisäiset toistot asetettiin rinnan käyttäen | Microgenie-proteiinisuuntausohjelmaa (Queen, C., et ai.,

Nucl.Acid Res. 12 (1984) 581 - 599), ja tulosta tarkastel-35 tiin. ICAM-1 astettiin IgM:n, N-CAM:in ja MAG:in rinnalle käyttäen Microgenie- ja ALIGN-ohjelmaa (Dayhoff, M.O., et ai., Meth.Enzvmol. 91 (1983) 524 - 545). Neljässä proteii- 73 1 0 4 9 5 2 nisekvenssitietokannassa, joita ylläpitää laitos the National Biomedical Research Foundation, suoritettiin atk-haut proteiinisekvenssi-yhtäläisyyksiä etsien Williamsin ja Pearsonin FASTP-ohjelmaa käyttäen (Lipman, D.J., et ai., 5 Science 227 (1985) 1435 - 1439).

Koska ICAM-1 on integriini-igandi sen kuuluminen immunoglo-buliinisupergeeniryhmään oli odottamatonta. Kuitenkin tarkastelemalla ICAM-l-sekvenssiä todetaan, että se täyttää 10 kaikki kriteerit, jotka asetetaan immunoglobuliinisupergee-niryhmään kuulumiselle. Näitä kriteerejä puolestaan käsitellään alla.

ICAM-l:n solunulkoinen alue kokonaisuudessaan koostuu 5 15 homologisesta immunoglobuliinin kaltaisesta alueesta, jotka esitetään rinnakkain kuviossa 9A. Alueet 1-4 ovat pituudeltaan 88, 97, 99 ja vastaavasti 99 jäännöstä, ja edustavat siten tyypillistä Ig-aluekokoa; alue 5 on typistynyt 68 jäännökseen. Suoritettaessa atk-haku NBRF-tietokannassa 20 FASTP-ohjelmalla todettiin merkittäviä homologioita immuno-globuliinisupergeeniryhmän jäseniin, mukaanlukien IgM- ja IgG-C-alueet, T-solure-septori-alfa-alayksikön vaihtuva alue ja alfa-l-beeta-glyko-proteiini (kuvio 9B - D).

; ' 25 Edeltävää informaatiota käyttäen ICAM-l:n aminohapposek venssiä verrattiin muiden immunoglobuliinisupergeeniryhmän jäsenien aminohapposekvensseihin.

Toisistaan erotetaan kolmen tyyppisiä Ig-superryhmäalueita, , 30 V, Cl ja C2. Sekä V- että C-alueet koostuvat kahdesta _ beeta-levystä, jotka kytkee toisiinsa alueensisäinen disul- fidisidos; V-alueet sisältävät 9 anti-paralleeli-beeta-säiettä, jolloin C-alueet puolestaan sisältävät 7. Pysyvät alueet jaettiin ryhmiksi Cl ja C2 kuviossa 9A esitettyjen 35 tyypillisten jäännöksien nojalla. Cl-ryhmään kuuluu anti-geenitunnistukseen liittyviä proteiineja. C2-ryhmään kuuluu useita Fc-reseptoreita ja proteiineja, jotka liittyvät so- 74 104952 lukiinnitykseen, mukaanlukien CD2, LFA-3, MAG ja NCAM. ICAM-1-alueiden todettiin olevan erittäin voimakkaasti homologisia C2-ryhmän alueisiin nähden, mikä osoitti ICAM-1:n tähän ryhmään; tämä heijastuu voimakkaampana samankaltai-5 suutena säilyviin jäännöksiin C2- kuin Cl-alueilla kuten esitetty beeta-säikeille B - F kuviossa 9. Samoin ICAM-1-alueet asettuivat huomattavasti paremmin C2-alueiden beeta-säikeiden A ja G rinnalle kuin näiden säikeiden V- ja Cl-alueilla rinnalle, jolloin saatiin hyvä rinnanasetus kautta 10 C2-alueen koko mitan. Rinnanasetukset C2-alueiden NCAMrsta, MAGrsta ja alfa-l-beeta-glykoproteiinista kanssa on esitetty kuvioissa 9B ja 9C; samankaltaisuus vaihteli 28 %:sta 33 %:iin. Rinnanasetukset T-solureseptori-V-alfan kanssa, 27 %:n samankaltaisuus, ja IgM-C:n alue-3:n kanssa, 34 %:n 15 samankaltaisuus, on niinikään esitetty (kuviot 9B, 9D).

Yksi immunoglobuliinialueiden tärkeimmistä ominaisuuksista ovat disulfidikytkenteiset kysteiinit, jotka yhdistävät sillalla B- ja F-beeta-säikeet, mikä stabiloi beeta-levyn 20 "sandwich''-muotoon; ICAM-1 :ssä kysteiinit säilyvät kaikissa tapauksissa lukuunottamatta alueen 4 sää'että f, jossa esiintyy leusiini, joka on mahdollisesti kääntynyt - "sandwich"-rakennetta kohden ja voi mahdollisesti stabiloi da kontaktin, kuten esitetty joillekin muille V- ja C2-ryh-: ’ 25 mäalueille. Kysteiinien väliset etäisyydet (43, 50, 52 ja 37 jäännöstä) ovat kuten kuvattu C2-ryhmälle.

Ketjunsisäisten disulfidisidoksien läsnäolon ICAM-1:ssä tutkimiseksi endoteelisolu-ICAM-1:llä suoritettiin SDS-PAGE 30 pelkistävissä ja toisaalta ei-pelkistävissä olosuhteissa.

*

Endoteelisolu-ICAM-l: tä käytettiin, koska se osoittaa vähemmän glykosylaatio-heterogeniaa kuin JY- tai karvainen solu -perna-ICAM-1 ja koska siinä Mr-siirtymät ovat herkempiä. ICAM-1:tä puhdistettiin siten 16 tunnin LPS:llä (5 35 mikrogrammaa/ml) stimuloiduista napalaskimo-endoteelisolu-viljelmistä immuno-affiniteettikromatografisesti kuten edellä kuvattu. Asetonilla saostettu ICAM-1 uudelleen- 104952 75 lietettiin näytepuskuriin (Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680 - 685) käyttäen 0,25 % 2-merkaptoetanolia tai pitoisuutta 25 mM jodoasetamidi ja lämmitettiin 100 °C:seen 5 minuutiksi. Näytteillä suoritettiin SDS-PAGE 4670 -ajo ja 5 hopeavärjäys 4613. Endoteelisolu-ICAM-1:n näennäinen Mr oli 100 kd:tä pelkistävissä olosuhteissa ja 96 kd:tä ei-pelkis-tävissä olosuhteissa, mikä viittaa voimakkaasti ketjun-sisäisten disulfidien läsnäoloon natiivissa ICAM-l:ssä.

10 Käyttämällä primaarisekvenssiä sekundaarirakenteen ennustamiseksi (Chou, P.Y., et ai., Biochem. 13 (1974) 211 - 245) todettiin 7 ennakoitua beeta-säiettä kussakin ICAM-l-alu-eessa, merkittyinä a - g kuviossa 9A ylhäällä, mikä täysin vastaa ennustetta immunoglobuliinialueesta ja vastaa säi-15 keiden A - H asemia immunoglobuliineissa (kuvio 9A, alhaalla) . Alueelta 5 puuttuvat A- ja C-säikeet, mutta koska nämä muodostivat levyjen reunat, levyt voivat silti edelleen muodostua, mahdollisesti siten, että säie D asettuu säikeen C paikalle, kuten esitetty joillekin muille C2-alueille; 20 jolloin karakteristinen disulfidisidos B- ja F-säikeiden välillä jäisi ennalleen. Täten kriteerit, jotka koskevat aluekokoa, sekvenssihomologiaa, säilyviä kysteiinejä, jotka muodostavat oletetun alueensisäisen disulfidisidoksen, disulf idisidoksien läsnäoloa ja ennustettua beeta-levyraken-: 25 netta, on kaikki täytetty silmälläpitäen ICAM-l:n lukemista immunoglobuliinisupergeeniryhmään.

ICAM-l:n todettiin voimakkaimmin homologiseksi C2-sarjan glykoproteiineihin NCAM ja MAG nähden. Tämä on erityisen 30 kiinnostavaa, koska sekä NCAM että MAG välittävät solu-so-lukiinnitystä. NCAM on tärkeä hermosolu-hermosolu- ja hermo-lihasvuorovaikutuksissa (Cunningham, B.A., et ai., Science 236 (1987) 799 - 806), kun taas MAG on merkityksellinen hermosolu-oligodendrosyytti- ja oligodendrosyytti-35 oligodendrosyyttivuorovaikutuksissa myelinaation aikana (Poltorak, M., et ai., J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 -1899). NCAM:n ja MAG:n solupintailmennys tulee kehityksen 76 104952 myötä säädellyksi hermoston muodostuksen ja vastaavasti myelinaation aikana analogisesti ICAM-1:n säädeltyyn induktioon tulehduksen aikana nähden (Springer, T.A., et ai., Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 - 252). ICAM-1, NCAM (Cun-5 nigham, B.A., et ai.. Science 236 (1987) 799 -806) ja MAG (Salzer, J.L., et ai., J.Cell.Biol. 101 (1987) 957 - 965) ovat samankaltaisia yleisrakenteeltaan sekä homologisia, koska kukin on integraalinen membraaniglykoproteiini, joka koostuu viidestä C2-alueesta, jotka muodostavat N-pään so-10 lunulkoisen alueen, vaikka NCAM:ssa jonkin verran ylimääräistä ei-Ig-kaltaista sekvenssiä esiintyy viimeisen C2-alueen ja transmembraanialueen välissä. ICAM-1 asettuu koko pituudeltaan mukaanlukien transmembraani- ja sytoplasma-alueet MAG:n rinnalle, jolloin samankaltaisuus on 21 %; 15 sama samankaltaisuus-% todetaan verrattaessa ICAM-1:n ja NCAM-l:n viittä aluetta. Kuviossa 10 on esitetty diagrammi-; na ICAM-1:n ja MAG:n sekundaarirakenteet. Vertaamalla alue kohtaisesti todetaan, että ICAM-1- ja NCAM-molekyylien sisäisten alueiden välisen homologian aste (x +/- s.d.; 21 20 +/- 2,8 % ja vastaavasti 18,6 +/- 3,8 %) vastaa homologia-tasoa verrattaessa ICAM-l-alueita NCAM- ja MAG-alueisiin (20,4 +/- 3,7 ja vastaavasti 21,9 +/- 2,7). Vaikka löytyy todisteita siitä, että NCAM:n C-pää-alueilla tapahtuu vaih-* toehtoista silmukoi tiimistä (Cunnigham, B.A, et ai.. Science f : 25 216 (1987) 799 - 806; Barthels, D., et ai., EMBO J. 6 (1987) 907 - 914), kuten myös MAG:n (Lai, C., et ai.,

Proc.Natl.Acad.Sei. USA 84 (1987) 4377 - 4341), mitään to-l disteita tästä ei ole löydetty sekventoitaessa endoteeli- " tai HL-60-ICAM-l-klooneja tai tutkittaessa ICAM-l-prote- 30 iinirunkoa ja -prekursoria eri solutyypeissä (Dustin, M.L., ! et ai., J.Immunol. 137 (1986) 245 - 254).

• w ‘ ^ ' ICAM-1 toimii LFA-1:n ligandina imusoluvuorovaikutuksissa !’ lukuisilla eri solutyypeillä. Imusolut sitoutuvat Γ 35 ICAM-1:een, joka on sisäistynyt keinotekoisiin membraani- " kaksikerroksiin, ja tämä edellyttää LFA-1:n läsnäoloa imu- soluilla, mikä osoittaa suoraan LFA-1:n vuorovaikutuksen 77 104952 ICAM-l:n kanssa (Marlin, S.D., et ai., Cell 51 (1987) 813 - 819). LFA-1 on valkosoluintegriini eikä sillä ole mitään immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä. Valkosoluin-tegriinit käsittävät yhden integriinialaluokan. Muut kaksi 5 alaluokkaa välittävät solu-matriisivuorovaikutuksia ja tunnistavat sekvenssin RGD ligandeissaan, joita ovat fib-ronektiini, vitronektiini, kollageeni ja fibrinogeeni (Hynes, R.O., Cell 48 (1987) 549 - 554; Ruoslahti, E., et ai.. Science 238 (1987) 491 - 497). Valkosoluintegriinit 10 ilmentyvät vain valkosoluilla, ja osallistuvat solu-solu-vuorovaikutuksiin, jolloin ainoat tunnetut ligandit ovat ICAM-1 ja iC3b, joka on komplementtikomponentti-C3-frag-mentti, joka ei osoita mitään immunoglobuliinin kaltaisia piirteitä ja jonka tunnistaa Mac-1 (Kishimoto, T.K., et 15 ai., Leukocyte Typing III; McMichael, M. (toim.), Springer-Verlag, New York (1987); Springer, T.A., et ai., Ann.Rev. Immunol. 5 (1987) 223 - 252; Anderson, D.C., et ai., Ann. Rev.Med. 38 (1987) 175 - 194). Sekventointianalyysin perusteella saatuja LFA-1:n mahdollisesti tunnistamia ICAM-1-20 sekvenssiin kuuluvia peptidejä on esitetty taulukossa 9.

TAULUKKO 9 ICAM-l-sekvenssiin sisältyviä peptidejä, jotka LFA-1 mahdollisesti tunnistaa : ' 25 -L-R-G-E-K-E-L- -R-G-E-K-E-L-K-R-E-P- -L-R-G-E-K-E-L-K-R-E-P-A-V-G-E-P-A-E- -P-R-G-G-S- 30 -P-G-N-N-R-K- -Q-E-D-S-Q-P-M- -T-P-E-R-V-E-L-A-P-L-P-S- -R-R-D-H-H-G-A-N-F-S- -D-L-R-P-Q-G-L-E- ICAM-1 on ensimmäinen esimerkki immunoglobuliinisupergeeni-ryhmäjäsenestä, joka sitoutuu integriiniin. Vaikka molemmat 35 104952 78 nämä ryhmät esittävät tärkeää osaa solukiinnityksessä, niiden välisen vuorovaikutuksen toteaminen oli odottamatonta. Sitä vastoin vuorovaikutukset immunoglobuliinigeenisuper-ryhmän puitteissa ovat varsin tavallisia. On varsin mahdol-5 lista, että myöhemmin löydetään lisää esimerkkejä integ-riini- ja immuno-globoliiniryhmien välisistä vuorovaikutuksista. LFA-1 tunnistaa ICAM-1:stä poikkeavan ligandin (Springer, T.A., et ai., Ann.Rev.Immunol. 5 (1987) 223 -252) ja valkosoluintegriini Mac-1 tunnistaa C3bi:stä poik-10 keavan ligandin neutrofiili-neutrofiilikiinnityksessä (Anderson, D.C., et ai., Ann.Rev.Med. 38 (1987) 175 - 194). Lisäksi puhdistetut MAG:tä sisältävät rakkulat sitoutuvat MAG-pitoisiin hermoviejähaarakkeisiin, joten MÄG:n on kyettävä heterofiiliseen vuorovaikutukseen jonkin nimenomaisen 15 reseptorin kanssa (Poltorak, M., et ai., J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899).

NCAM:n osuuden hermosolu-hermosolu- ja hermosolu-lihassolu-vuorovaikutuksissa on esitetty johtuvan homofiilisistä 20 NCAM-NCÄM-vuorovaikutuksista (Cunnigham, B.A., et ai.,

Science 236 (1987) 799 - 806). MAG:n tärkeä rooli Schwannin solujen, jotka ympäröivät hermosolujen pitkää haaraketta myeliinitupen muodostuksen aikana, viereisten käänteiden välisissä vuorovaikutuksissa johtuu mahdollisesti vuorovai-: 25 kutuksesta jonkin nimenomaisen reseptorin kanssa, tai homo fiilisistä MAG-MAG-vuorovaikutuk-sista. Homologia NCAMiiin nähden ja alue-aluevuorovaikutuksien taajaan toistuva esiintyminen immunoglobuliinisupergeeniryhmässä nostaa esiin mahdollisuuden, että ICAM-1 mahdollisesti osallistuu 30 homofiilisiin vuorovaikutuksiin sekä ICAM-l-LFA-l-hetero-J fiilisiin vuorovaikutuksiin. Kuitenkin B-varhaisimusolujen, jotka kanssailmentävät samanlaisia LFA-1- ja ICAM-l-tiheyk-siä, sitoutuminen ICAM-1:een keinotekoisissa faaseissa tai solu-yksikerroksissa voidaan estää täysin esikäsittelemällä 35 B-varhaisimusoluja LFA-l-MAb:llä, kun taas kiinnitykseen ei vaikuta B-varhaisimusolujen esikäsittely ICAM-l-MAb:llä.

f [ Esikäsittelemällä yksikerrosta ICAM-l-MAb:llä tuhotaan si- 79 104952 toutuminen täysin (Dustin, M.L., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 245 -254; Marlin, S.D., et al., Cell 51 (1987) 813 - 819) . Nämä löydökset osoittavat, että jos ICAM-1-homofiilivuorovaikutuksia lainkaan esiintyy, niiden täytyy 5 olla heikompia kuin heterofiiliset LFA-l-vuorovaikutukset.

Mahdollisuus, että valkosoluintegriinit tunnistavat ligan-deja pohjimmaltaan täysin erilaisella tavalla, sopii 180 jäännöksen sekvenssin läsnäoloon niiden alfa-alyksiköissä, 10 jolla sekvenssillä saattaa olla merkitystä ligandisitoutu-misessa ja jota ei esiinny RGD:n tunnistavissa integrii-neissä (Corbi, A., et ai., EMBO J. 6 (1987) 4023 - 4028) . Vaikka Mac-l:n on esitetty tunnistavan iC3b-5086:ssa esiintyvän RGD-sekvenssin, ICAM-l:een ei sisälly RGD-sekvenssiä 15 (kuvio 8). Tämä sopii yhteen fibronektiinipeptidin GRGDSP ja verrokkipeptidin GRGESP kyvyttömyyden kanssa inhiboida ICAM-l-LFA-l-kiinnitystä (Marlin, S.D., et ai.. Cell 51 (1987) 813 - 819). Kuitenkin sukulaissekvenssit kuten PRGGS ja RGEKE esiintyvät ICAM-l:ssä alueilla, joiden ennustetaan 20 muodostavat silmukan alueen 2 beeta-säikeiden a ja b väliin ja vastaavasti alueen 2 säikeiden c ja d väliin (kuvio 9) ja jotka täten ovat saatavilla tunnistusta varten. Kiinnostavaa on, että homologinen MAG-molekyyli sisältää RGD-sekvenssin alueiden 1 ja 2 välillä (Poltorak, M., et ai., : 25 J.Cell.Biol. 105 (1987) 1893 - 1899; Salzer, J.L., et ai., J.Cell.Biol. 104 (1987) 957 - 965) .

ESIMERKKI 19

Southern- ja Northern-blot-määritykset 30 9

Southernin blot-määritykset suoritettiin käyttäen 5 mikro-grammaa genomi-DNA:ta, joka oli uutettu kolmesta solulin-jasta: BL2, Burkittin lymfomasolulinja (lahja Dr. Gilbert Lenoirilta); JY ja Er-LCL, jotka ovat EBV-transformoituja 35 B-varhaisimusolusolu-linjoja.

104952 80 DNA:t pilkottiin 5X valmistajan (New England Biolabs) suosittelemalla määrällä BamHI:tä ja EcoRIrtä. Pilkkomis-tuotteilla suoritettiin elektroforeesiajo 0,8-%:isessa agaroosigeelissä, minkä jälkeen DNA:t siirrettiin nylonkal-5 voile (Zeta Probe, BioRad). Suodatin esihybridoitiin ja sitten hybridoitiin noudatten vakiomenettelyitä käyttäen ICAM-cDNA:ta, joka oli peräisin HL-60:stä ja leimattu alfa- (32P) dXTP: eillä satunnais-alukemuodostusta käyttäen (Boehringer Mannheim). Northern-blot-määritykset suoritet-10 tiin käyttäen 20 mikrogrammaa kokonais-RNA:ta tai 6 mikro-grammaa poly (A)+-RNA: ta. RNA denaturoitiin ja sillä suoritettiin elektroforeesi-ajo 1 % agaroosi-formaldehydigeelis-sä, minkä jälkeen tuotteet siirrettiin sähköisesti Zeta Probe -kalvolle. Suodattimia esihybridoitiin ja sitten hyb-15 ridoitiin kuten aiemmin kuvattu (Staunton, D.E., et ai., EMBO J. 6. (1987) 3695 - 3701) käyttäen HL-60-cDNA-koetinta, joka käsitti 32P-leimattuja oligonukleotidikoettimia (kuvattu edellä).

20 Southernin blot-määrityksissä käyttäen 3 ep:n cDNA-koetinta ja genomi-DNA:ta, joka oli pilkottu BamHI:llä ja EcoRIcllä, esiintyi yksittäinen pääasiallinen hybridoituva fragmentti, jonka koko oli 20 ja vastaavasti 8 ep:tä, mikä viittaa yksittäiseen geeniin ja siihen, että suurin osa kooditiedosta • 25 sisältyy 8 ep:n palaseen. Kolmen eri solulinjan blot-määri tyksissä ei ilmennyt mitään restriktiofragmenttipolymorfi-aan viittaavaa.

ESIMERKKI 20 30 ICAM-l-geenin ilmennys "Ilmennysvektori" on vektori, joka (johtuen sopivien transkriptio- ja/tai translaatiosäätösekvenssien läsnäolosta) kykenee ilmentämään DNA- tai (cDNA-) molekyylin, joka on 35 kloonattu vektoriin, ja siten tuottamaan polypeptidin tai proteiinin. Kloonatut sekvenssit ilmentyvät, kun ilmennys-vektori viedään sopivaan isäntäsoluun. Jos käytetään proka- 104952 81 ryoottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä tahansa prokaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään kloonattuja sekvenssejä. Vastaavasti jos käytetään eukary-oottista ilmennysvektoria, sopiva isäntäsolu olisi mikä 5 tahansa eukaryoottinen solu, joka kykenee ilmentämään kloonattuja sekvenssejä. Tärkeätä on, että koska eukaryoottinen DNA saattaa sisältää välisekvenssejä ja koska prokaryootti-set solut eivät kykene oikealla tavalla prosessoimaan tällaisia sekvenssejä, edullisesti käytetään cDNA:ta, joka on 10 peräisin solusta, joka kykenee ilmentämään ICAM-1:n, prokaryoottinen genomi-ilmennysvektorikirjaston muodostamiseksi. Menettelyitä cDNArn valmistamiseksi ja genomikirjaston tuottamiseksi julkistavat Maniatis, T., et ai. (Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 15 Cold Spring Harbor, NY, 1982)).

Edellä kuvatun ilmennysvektorigenomikirjaston avulla muodostetaan isäntäsolupankki (jolloin jokainen solu sisältää kirjaston yhden jäsenen). Ilmennysvektori voidaan viedä 20 isäntäsoluun millä tahansa lukuisista eri tavoista (eli transformoimalla, transfektoimalla, protoplastifuusiolla, elektroporaatiolla jne,). Ilmennysvektoripitoisten solujen muodostamaa pankkia lisäännytetään kloonaamalla ja sen jäsenet määritetään yksittäin (immuunimääritystä käyttäen) j 25 sen määrittämiseksi, tuottavatko ne proteiinia, joka kyke nee sitoutumaan ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen.

Niiden solujen ilmennysvektoreita, jotka tuottavat ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen sitoutumaan kykenevää proteii-30 nia, analysoidaan sitten edelleen sen määrittämiseksi, il- r « J mentävätkö ne (ja siten sisältävät mainitun) ICÄM-l-geenin kokonaisuudessaan, ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) vain ICÄM-l-geenifragmentin, vai ilmentävätkö ne (ja siten sisältävät) geenin, jonka tuote, vaikkakin immunologisesti 35 ICAM-1-sukuinen, ei ole ICAM-1. Vaikka tällainen analyysi voidaan suoritta millä tahansa kätevällä tavalla, edulli-sesti määritetään ilmennysvektoriin kloonatun DNA- tai 104952 82 cDNA-fragmentin nukleotidisekvenssi. Näitä nukleotidisek-venssejä tutkitaan sitten sen määrittämiseksi, kykenevätkö ne koodittamaan polypeptidejä, joilla on sama aminohappo-sekvenssi kuin ICAM-1:n trypsiinipilkkomisfragmenteilla 5 (taulukko 5).

Ilmennysvektori, joka sisältää ICAM-l-geeniä koodittavan DNA- tai cDNA-molekyylin, voidaan siten tunnistaa (i) kyvystä ohjata proteiinin ilmennystä, joka kykenee sitoutu-10 maan ICAM-l-vastaiseen vasta-aineeseen; ja (ii) nukleotidi-sekvenssin läsnäolosta, joka kykenee koodittamaan kutakin I ICAM-l-trypsiinifragmenttia. Tällaisen ilmennysvektoriin kloonattu DNA-molekyyli voidaan poistaa ilmennysvektorista ja eristää puhtaana.

15 ESIMERKKI 21 ( Puhdistetun ICAM-l:n funktionaalisia aktiivisuuksia

Soluissa ICAM-1 toimii normaalisti pintaproteiinina, joka 20 liittyy solumembraaniin. Tämän vuoksi puhdistetun ICAM-1:n funktiota tutkittiin sen jälkeen, kun molekyyli oli rekons-tituoitu keinotekoisiin lipidimembraaneihin (liposomeihin I tai rakkuloihin) liuottamalla proteiini pesuaineeseen liuo tettuihin lipideihin, minkä jälkeen pesuaine poistettiin Γ- | 25 dialysoimalla. ICAM-1, joka oli puhdistettu JY-soluista ja eluoitu pesuaine-oktyyliglukosidiin kuten edellä kuvattu, rekonstituoitiin rakkuloihin, ja ICAM-1:n sisältävät rakkulat fuusioitiin lasipäälilevyihin tai muovisiin viljely-kuoppiin, jotta proteiiniin sitoutuvat solut kyettäisiin 30 toteamaan.

' Tasomembraanien ia muoviin sidottujen rakkuloiden valmistus

Rakkuloita valmistettiin Gayn et ai. (J.Immunol. 136 (1986) 35 2026) menetelmällä. Lyhyesti, munafosfatidyylikoliinia ja kolesterolia liuotettiin kloroformiin ja sekoitettiin moo-lisuhteessa 7:2. Lipidiseos kuivattiin ohueksi kalvoksi 104952 83 pyörittämällä typpikaasuvirrassa ja sitä kylmäkuivattiin sitten tunnin ajan viimeistenkin kloroformijäämien poistamiseksi .

5 Lipidikalvo liuotettiin sitten liuokseen 1 % oktyyligluko-sidi/0,14 M NaCl/20 mM Tris (pH 7,2) loppupitoisuuteen 0,1 mM fosfatidyylikoliini. Noin 10 mikrogrammaa puhdistettua ICAM-l:tä tai humaaniglykoforiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) verrokkimembraaniglykoproteiinina lisättiin 10 kohden kutakin millilitraa liuotettuja lipidejä. Proteiini-lipidi-pesuaineliuosta dialysoitiin sitten 4 °C:ssa käyttäen 3 vaihtoa ja 200 tilavuutta liuosta 20 mM Tris/0,14 M NaCl, pH 7,2, ja yhtä vaihtoa HBSS:ää.

15 Tasomembraaneja valmistettiin Brianin et ai., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 81 (1984) 6159, menetelmällä.

Lasipäälilevyjä (halkaisija 11 mm) keitettiin 15 minuutin ajan 1:6 laimennoksessa 7X pesuaineliuosta (Linbro), minkä 20 jälkeen niitä pestiin yön yli tislatussa vedessä ja liotettiin sitten 70-%:isessa etanoliliuoksessa sekä kuivattiin ilmassa. 80 mikrolitran pisara rakkulaliuosta, joka sisälsi joko ICAM-l:tä tai glykoforiinia, sijoitettiin kuoppien pohjalle 24 kuopan rykelmälevylle, ja valmistetut lasilevyt • 25 asetettiin varovaisesti niiden päälle. Noin 20 - 30 minuu tin inkuboinnin huoneenlämpötilassa jälkeen kuopat täytettiin HBSS:llä ja päälilevyt käännettiin, jolloin tasomem-braani tuli ylöspäin. Kuoppia pestiin sitten runsaalla määrällä HBSS:ää ei-sitoutuneiden rakkuloiden poistamiseksi.

30 Tasomembraanipintaa varottiin altistamasta ilmalle.

•

Lasipintoihin fuusioiduilla tasomembraaneilla suoritettujen kokeiden puitteissa ICAM-l:tä sisältävien rakkuloiden todettiin sitoutuvan suoraan monikuoppa-kudosviljelylevyjen 35 muovipintaan ja säilyttävän funktionaalisen aktiivisuutensa, minkä osoitti spesifinen solusitoutuminen. Tällaisia rakkuloita kutsutaan tästä eteenpäin "muoviin sidotuiksi 104952 84 rakkuloiksi" (PBV), koska muoviin sidottujen lipidirakku-loiden luonnetta ei ole selvitetty. Muoviin sidotut rakkulat valmistettiin lisäämällä 30 mikrolitraa rakkulasuspen-siota suoraan kuoppien pohjalle 96 kuopan kudosviljelmäle-5 vyillä (Falcon), minkä jälkeen levyjä inkuboitiin ja kuopat pestiin kuten kuvattu tasomembraaneille.

Solukiinnitvsmääritvkset 10 Solukiinnitysmääritykset tasomembraaneja tai muoviin sidottuja rakkuloita käyttäen suoritettiin oleellisessa mielessä samalla tavalla lukuunottamatta, että soluluvut ja tilavuudet PBV-määrityksissä olivat 1/5 tasomembraanimäärityksissä käytetyistä.

15 T-imusoluja normaaleista verrokeista ja potilaasta, joka poti valkosolukiinnitysvajausta (LAD) eikä siis kyennyt ilmentämään LFA-1:tä (Anderson, D.C., et ai., J.Infect.Dis. 152 (1985) 668), valmistettiin viljelemällä ääreisveren 20 yksitumasoluja 1 mikrogrammalla/ml konkanavalliini-A:ta (Con-A) RPMI 1640-kasvualustassa, jota oli täydennetty 20 %:lla FCS:tä, pitoisuutena 5 x lOVml 3 päivän ajan. Sitten solut pestiin kahdesti RPMI:llä ja kerran 5 mM metyyli-alfa-D-mannopyranosidiliuoksella lektiinijäämän ' 25 poistamiseksi solupinnalta. Solut kasvatettiin RPMI/20 % FCS:ssä, joka sisälsi 1 ng:n/ml yhdistelmä-IL-2:ta, ja niitä käytettiin 10. - 22. päivänä kasvatuksen aloittamisesta.

Solusitoutumisen tasomembraaneihin tai PBV:hen toteamiseksi 30 Con-A-emosoluja, T-lymfoma-SKW3-soluja ja EBV-transformoi-; tuja B-varhaisimusolusolulinja-JY-soluja (LFA-l-positiivi- nen) ja LFA-l-vajaan varhaisimusolulinjan (BBN) soluja (jotka oli saatu potilaasta 1, Springer, T.A., et ai., J.Exoer,Med. 160 (1986) 1901 - 1918) leimattiin radioaktii-35 visesti inkuboimalla 1 x 107 solua 1 ml kohden RPMI-

1640/10 % FCS:ää 100 mikrocurie-yksiköllä Na5lCr04:ää tunnin ajan 37 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin 4 kertaan RPMI

8 5 104952 1640 -kasvualustalla ei-sisäistyneen leiman poistamiseksi. Monoklonaalivasta-ainekokeissa soluja tai muoviin sidottuja rakkuloita esikäsiteltiin 20 mikrogrammalla/ml puhdistettua vasta-ainetta RPMI-1640/10 % FCSrssä 4 °C:ssa 30 minuutin 5 ajan, minkä jälkeen niitä pestiin 4 kertaan ei-sitoutuneen vasta-aineen poistamiseksi. Kokeissa, joissa tutkittiin kaksivalenssisten kationien vaikutuksia solusitoutumiseen, solut pestiin vain kerran HBSS:llä, joka ei sisältänyt Ca2+-, Mg2+-ioneja mutta sisälsi 10 % dialysoitua FCS:ää, ja 10 CaCl:ää ja MgCl:ää lisättiin merkittyihin pitoisuuksiin.

Kaikissa kokeissa soluja ja tasomembraaneja tai PBV:tä esi-tasapainotettiin sopivassa lämpötilassa (4 °c, 22 °C, tai 37 °C) sopivassa määrityspuskurissa) .

15 Solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-l:een mittaamiseksi 5lCr-leimattuja soluja (2 x 105 EBV-transformanttia taso-membraani-määrityksissä; 1 x 105 EBV-transformanttia tai SKW3-solua, 2 x 155 Con-A-emosolua PBV-määrityksissä) sent-rifugoitiin 2 minuutin ajan 25 x g:ssä tasomembraaneihin 20 tai PBVrhen, minkä jälkeen inkuboitiin 4 °C:ssa, 22 °C:ssa tai 37 °C:ssa tunnin ajan. Inkuboinnin jälkeen ei-sitoutu-neet solut poistettiin suorittamalla 8 kierrosta, joilla täytettiin ja imettiin pois puskuri, joka oli tasapainotettu sopivaan lämpötilaan. Sitoutuneet solut kvantitoitiin 25 liuottamalla kuoppasisällöt liuoksella 0,1 N NaOH/1 % Triton X-100, ja laskemalla gamma-laskijassa. Prosentuaalinen solusitoutuminen määritettiin jakamalla tuikkeet/min sitoutuneista soluista käytetyllä soluliitteisellä tuiketta/min -arvolla. Tasomembraanikokeissa käytettyjä tuikkeita/min 30 -arvoa korjattiin siten, että otettiin huomioon päälilevy- • · jen pinta-alan suhde viljelykuoppien pinta-alaan.

Näissä määrityksissä EBV-transformoidut B-varhaisimusolut, SKW3-T-lymfomasolut ja Con-A-T-imusoluemosolut sitoutuivat 35 spesifisesti ICAM-l:een keinotekoisilla membraaneilla (kuviot 11 ja 12). Sitoutuminen oli spesifinen, koska solut sitoutuivat hyvin huonosti verrokkitasomembraaneihin tai 8 6 104952 rakkuloihin, jotka sisälsivät ekvivalenttisia määriä toista humaanisolupintaglykoproteiinia, glykoforiinia. Lisäksi LFA-l-positiiviset EBV-transformantit ja Con-A-emosolut sitoutuivat, kun taas niiden LFA-l-negatiiviset vastineet 5 eivät sitoutuneet mainittavassa määrin, mikä osoittaa, että sitoutuminen oli riippuvaista LFA-1:n läsnäolosta soluilla.

Sekä solusitoutumisen spesifisyys että riippuvuus solu-LFA-1:stä vahvistettiin monoklonaalisilla vasta-aineilla 10 suoritetuissa salpauskokeissa (kuvio 13). JY-solujen sitoutuminen pystyttiin estämään 97-%risesti kun ICAM-l-pitoiset PBV:t esikäsiteltiin ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1. Esikäsittelemällä soluja samalla vasta-aineella oli vähäinen vaikutus. Sitä vastoin LFA-1-15 vastainen monoklonaalinen vasta-ainen TS1/18 esti sitoutumisen 96-%:isesti, mutta vain silloin kun solut, ei PBV, esikäsiteltiin. Verrokkivasta-aineella T2/9, joka reagoi LFA-3:n kanssa (toinen imusolupinta-antigeeni), ei ollut merkittävää inhiboivaa vaikutusta, kun joko solut tai PBV 20 oli esikäsitelty. Tämä koe osoittaa, että keinomembraaneis-sa itse ICAM-1, eikä jokin vähäinen epäpuhtaus, välittää havaittua solukiinnittymistä ja että kiinnittyminen on riippuvainen LFA-1:n läsnäolosta sitovalla solulla.

25 Solujen sitoutuminen ICAM-1:een keinomembraaneilla osoitti niinikään kahta muuta LFA-l-riippuvaisen kiinnitysjärjes-telmän ominaisuutta: lämpötilariippuvuus ja kaksivalenssis-ten kationien tarve. Kuten esitetty kuviossa 14, Con-A-emosolut sitoutuivat ICAM-1:een PBVreissä erittäin tehokkaasti 30 37°C:ssa, osittain 22 °C:ssa ja hyvin heikosti 4 °C:ssa.

* I

.· Kuten esitetty kuviossa 15, sitoutuminen oli täysin riippu vainen kaksivalenssisten kationien läsnäolosta. Fysiologisissa pitoisuuksissa Mgz+ yksinään oli riittävä maksimaaliselle solusitoutumiselle, kun taas Ca2+ yksinään aikaansai 35 hyvin alhaisia sitoutumistasoja. Kuitenkin maksimaalinen sitoutuminen saatiin Mg2+:lla l/10:na normaalista pitoisuu- 104952 87 desta kun siihen oli yhdistetty Ca2+:aa, jonka vaikutus oli synergistinen.

Yhteenvetona solusitoutumisen puhdistettuun ICAM-1:een, 5 joka on sisällytetty keinomembraaneihin, spesifisyys, mono-klonaalisilla vasta-aineilla saatu spesifinen inhibitio ja lämpötilariippuvuus sekä riippuvuus kaksivalenssisista kationeista osoittavat, että ICAM-1 on LFA-l-riippuvaisen kiinnitysjärjestelmän spesifinen ligandi.

10 ESIMERKKI 22 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys yliherkkyys- ja myrkkylaastarikoereaktioissa 15 Viiden normaalin yksilön iho-otoksia tutkittiin niiden ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennyksen osalta. Todettiin, että kun endoteelisolut joissain verisuonissa tavallisesti ilmensivät ICAM-1:n, ICAM-1 ei ilmentynyt normaalista ihosta otetuilla keratinosyyteillä. HLA-DR-värjääntymistä ei todettu 20 yhdelläkään keratonisyytillä, joka peräisin oli normaali-ihonäytteestä. Sitten tutkittiin ICAM-1- ja luokka-II-anti-geenien ilmennyksen kinetiikkaa soluilla, jotka oli saatu yliherkkyys- tai myrkkyvaikutusihovaurionäytteistä. Todettiin, että puolella kuudesta tutkitusta yksilöstä oli kera-25 tinosyyttejä, jotka ilmensivät ICAM-1:n, neljän tunnin kuluttua hapteenin levittämisestä (taulukko 10). ICAM-1:n keratinosyyteillään ilmentävien yksilöiden prosentuaalinen osuus kasvoi altistusajan hapteenille funktiona, jolloin myös kerätinosyyttiä kohden värjääntymisintensiteetti 30 joka osoitti ICAM-l-ilmennyksen lisääntymistä - kasvoi ajankohtaan 48 tuntia asti. Itse asiassa tänä ajankohtana tietty osuus keratinosyyteistä kaikissa kudosnäytteissä värjääntyi positiivisesti ICAM-1:llä. Ajankohtana 72 tuntia (24 tuntia sen jälkeen kun hapteeni oli poistettu) 7 kah-35 deksasta yksilöstä ilmensi edelleen ICAM-1:n keratinosyyteillään, jolloin kuitenkin ICAM-1:n ilmennys yhdellä yksilöllä poistui ajankohtien 48 ja 72 tuntia välillä.

es 104952 TAULUKKO 10 ICAM-1- ja HLA-DR-induktion kinetiikka keratinosyyteillä yliherkkyyslaastarikoenäytteistä 5

Aika laas- Biop- tarin lait- sioiden Vain Vain ICAM-1&

tamisesta määrä ICAM-1 HLA-DR HL-DR

10 Normaali iho 5000

Laastarial- lergiatesti 4 6 3a 0 0 8 9 3 0 0 15 24 8 7 0 0 48b 8 5 0 3 72 8601 aNäytteet katsottiin positiivisiksi, jos ainakin pieniä 20 keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.

Kudosopillisesti ICAM-1-värjääntymiskuvio keratinosyyteillä 25 kudosnäytteistä, jotka otettiin neljän tunnin kuluttua hap-teenin levittämisestä, oli tavallisesti pieninä rykelminä. Ajankohtana 48 tuntia ICAM-1 ilmentyi valtaosan keratino-syyteistä pinnalla, jolloin minkäänlaista eroa ei havaittu vaurion keski- ja äärialueiden välillä. Värjääntymisen in-; 30 tensiteetti aleni keratinosyyttien lähestyessä ihon sar- veiskerrosta. Tämä todettiin sekä vaurioiden keski- että äärialueilta otetuissa kudosnäytteissä. Samoin tänä ajankohtana laastarikoe oli positiivinen (vuotamista, punoitusta ja rakkuloita). ICAM-l-ilmennyksessä ei havaittu mitään 35 eroa käytettäessä herkillä yksilöillä eri hapteeneja. Kera- 89 1 0 4 9 5 2 tinosyyttien ohella ICAM-1 ilmentyi myös joillakin yksitu-masoluilla ja endoteelisoluilla vaurio-kohdassa.

HLA-DR-ilmennys keratinosyyteillä yliherkkyysihovaurioissa 5 oli vähemmän yleistä kuin ICAM-1:n. Yhdelläkään tutkituista yksilöistä ei ollut vaurioita, joissa keratinosyytit vär-jääntyivät positiivisesti HLA-DR:lle, aina ajankohtaan 24 tuntia asti hapteenin käyttämisestä. Itse asiassa vain neljässä kudosnäytteessä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensi-10 vät HLA-DR:n, eikä yhdessäkään kudosnäytteessä ollut keratinosyyttejä, jotka olisivat positiivisia HLA-DR:lie mutta eivät ICAM-1:lie (taulukko 10).

Vastoin kuin yliherkkyyslaastarikoevauriossa, myrkkylaasta-15 rikoevauriossa, joka oli indusoitu krotoniöljyllä tai nat-riumlauryylisulfaatilla, esiintyi keratinosyyttejä, jotka osoittivat vain vähän, jos ollenkaan ICAM-1:tä pinnoillaan kaikkina testattuina ajankohtina (taulukko 11). Itse asiassa 48 tunnin kuluttua laastarin asettamisesta, joka ajan-20 kohta oli optimaalinen ICAM-l-ilmennykselle yliherkkyys-laastarikoeyksilöillä, vain yhdellä 14 myrkkylaastari-koehenkilöstä oli ICAM-1:n ilmentäviä keratinosyyttejä vaurioissaan. Samoin vastoin kuin yliherkkyyslaastarikoenäyt-teissä, myrkkylaastarikoevaurioissa keratinosyyteillä ei : 25 ilmentynyt lainkaan HLA-DR:ää.

Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-1 ilmentyy immuunipoh-jaisessa tulehduksessa mutta ei myrkkypohjaisessa tulehduksessa, ja täten ICAM-1-ilmennystä voidaan käyttää immuuni-30 pohjaisen ja myrkkypohjaisen tulehduksen erottamiseksi toi-:* sistaan, kuten akuutin munuaisten toiminnan heikkenemisen munuaissiirtopotilaissa tunnistamiseksi, koska on vaikeata määrätä, johtuuko toiminnan heikkeneminen hyljinnästä tai immuunivastetta heikentävän terapeuttisen aineen myrkkyvai-35 kutuksista munuaiseen.

104952 90

Ottamalla kudosnäyte ja määrittämällä ICAM-l-ilmennyksen ylössäätö voidaan erottaa toisistaan immuunipohjainen hyl-jintä ja ei-immuunipohjainen myrkkyreaktio.

5 TAULUKKO 11 ICAM-1- ja HLA-DR-induktion kinetiikka keratinosyyteillä myrkkylaastarikoenäytteistä 1 10

Aika laastarin lait- Biop- i ' tamisesta sioiden Vain Vain ICAM-1&

(h) määrä ICAM-1 HLA-DR HL-DR

15 4 4 0 0 0 8 3 la 0 0 24 3100 48b 14 1 0 0 72 3101 20 - aNäytteet katsottiin positiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

bKaikki laastarit poistettiin tänä ajankohtana.

25 ESIMERKKI 23 ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys hyvänlaatuisissa ihosairauksissa 30 Soluista, jotka oli otettu eri tyyppisiä ihon tulehdussairauksia potevien potilaiden ihovaurionäytteistä, tutkittiin niiden ICAM-1- ja HLA-DR-ilmennys. Osa keratinosyyteistä näytteissä, jotka olivat peräisin yliherkkyyskosketusihot-tumasta, rakkulaihottuman kaltaisesta ihottumasta/rakkula-35 ihottumasta ja ihon punajäkälätaudista, ilmensivät ICAM-1:n. Ihon punajäkälätautinäytteet osoittivat voimak- 91 104952 kainta värjääntymistä, jolloin kuvio oli samankaltainen tai jopa voimakkaampi kuin se, joka havaittiin 48 tunnin yli-herkkyyslaastarikoenäytteillä (taulukko 12). Yhtäpitävästi tuloksien kanssa, jotka saatiin yliherkkyys-laastarikokees-5 sa, intensiivisin ICAM-l-värjääntyminen todettiin kohdissa, joissa oli tapahtunut voimakasta yksitumasoluvuotamista. Lisäksi 8 tutkituista 11 punajäkälätautinäytteestä oli positiivista HLA-DR-ilmennykselle keratinosyyteillä.

10 ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä, jotka oli saatu tuleh-dusihottumaa tai nokkosrokkoa potevien potilaiden kudosnäytteistä, oli vähemmän ilmeinen. Vain neljällä tutkituista 7 potilaasta, joilla oli jompikumpi näistä sairauksista, oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät ICAM-l:n vauriokoh-15 dassa. HLA-DR-ilmennystä tavattiin vain yhdellä potilaalla ja se esiintyi ICAM-l:n yhteydessä.

Endoteelisolut ja osa yksitumasoluvuodosta kaikista tutkituista hyvänlaatuisista ihon tulehdussairauksista ilmensi-20 vät ICAM-l:n vaihtelevissa määrin.

TAULUKKO 12 ICAM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä, jotka ' 25 ovat peräisin hyvänlaatuisista ihosairauksista

Tapauksien Vain Vain ICAM-1& Diagnoosi määrä ICAM-1 HLA-DR HL-DR

Allerginen 30 kosketuskeseema 5 3a 0 2 • <

Lichen Planus 11 308 %

Pemphigoid/ 2 200 35 Pemphigus

Eksanteema 3 200

Utrikaria 4 101 40 104952 92 aNäytteet katsottiin positiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

ESIMERKKI 24 5 ICAM-l:n ilmennys keratinosyyteillä, jotka ovat peräisin hilsetystauti-ihovaurioista ICAM-l-ilmennystä ihonäytteissä, jotka olivat viidestä hil-setystautia potevasta potilaasta, tutkittiin ennen PUVA-10 hoidon käynnistämistä ja ajoittain hoitojakson aikana.

Näytteitä otettiin 5 potilaasta, jotka sairastivat kudos-opillisesti vahvistettuna tavanomaista hilsetystautia. Näytteet otettiin sarjana ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana ilmoitettuna ajankohtana. PUVA:aa annettiin 15 3-4 kertaa viikossa.

Näytteet otettiin viideltä potilaalta hilsetystautipesäk-keiden äärialueilta, minkä ohella näytteitä otettiin kliinisesti normaalista ihosta neljältä näistä potilaista.

20

Vastaotetut ihokudosnäytteet jäädytettiin ja varastoitiin nestetyppeen. Kuuden mikronin kryostaattiviipaleita kuivattiin ilmassa yön yli huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen niitä kiinnitettiin asetonissa 10 minuutin ajan ja sitten : ’ 25 joko värjättiin välittömästi tai käärittiin alumiinikalvoon ja varastoitiin -80 °C:seen värjäämiseen asti.

Värjääminen suoritettiin seuraavasti. Viipaleita inkuboi-tiin monoklonaalisilla vasta-ainella ja värjättiin kolmi-30 vaiheisella immunoperoksidaasimenetelmällä (Stein, H., et ·/ ai., Adv.Cancer Res. 42 (1984) 67 - 147) käyttäen diamino- bentsidiini-vety-peroksidi-substraattia. Positiivisina verrokkeina ICAM-1 ja HLA-DR-värjääntymiselle käytettiin risoja ja imusolmukkeita Negatiivisina verrokkeina toimivat 35 primaarivasta-aineen puuttuessa värjätyt kudosnäytteet.

104952 93 HLA-DR:n vastaiset monokonaaliset vasta-aineet hankittiin Becton Dickinson -valmistajalta (Mountainview, Kalifornia). Monoklonaalinen ICAM-l-vastainen vasta-aine oli R6-5-D6. Peroksidaasikonjugoitu kaniinin anti-hiiri-Ig ja peroksi-5 daasikonjugoitu sian anti-kaniini-Ig hankittiin Dakapatts-valmistajalta, Kööpenhamina, Tanska. Diaminobentsidiini-tetrahydrokloridi hankittiin Sigma-valmistajalta (St. Louis, MO).

10 Tutkimuksen tulokset osoittavat, että endoteelisolut joissain verisuonissa ilmentävät ICAM-1:n sekä sairaassa että normaalissa ihossa, mutta värjäyksen intensiteetti ja ICAM-1:n ilmentävien verisuonien lukumäärä oli kasvanut hilsetystauti-ihovaurioissa. Lisäksi ICAM-1:n ilmennyskuvio 15 keratinosyyteillä, jotka olivat hoitamattomista hilsetys-tauti-ihovaurioista viidestä potilaasta, vaihteli vain hyvin pienien solurykelmien värjääntymisestä moniin värjään-tyneisiin keratinosyytteihin.

20 PUVA-hoidon aikana ICAM-l-ilmennys kahdella potilaista (potilaat 2 ja 3) osoitti merkittävää vähenemistä, joka edelsi tai tapahtui samanaikaisesti kuin kliininen toipuminen (taulukko 13). Potilailla 1, 4 ja 5 oli laskuja ja nousuja ICAM-l-ilmennyksessä PUVA-hoidon aikana, jotka korreloivat : ' 25 kliinisiin toipumisiin ja vastaavasti uudelleensairastumi- siin. ICAM-1-ilmennystä ei esiintynyt normaalista ihosta saaduilla keratinosyyteillä ennen PUVA-hoitoa tai sen jälkeen. Tämä osoittaa, että PUVA ei indusoi ICAM-1:tä normaalin ihon keratinosyyteillä.

30

Huomion arvoinen oli havinto, että yksitumasoluvuodon tiheys korreloi ICAM-1-ilmennyksen määrään keratinosyyteillä. Tämä koski sekä yksitumasolujen määrän laskua vaurioissa PUVA-hoidon aikana, jolloin myös ICAM-l-ilmennys heikkeni, 35 sekä yksitumasolujen lukumäärän kasvuun PUVA-hoidon aikana, jolloin ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä oli selvempi. Endoteelisolut ja ihon yksitumasolut olivat niinikään ICAM- 104952 94 1-positiivisia. Kliinisesti normaalissa ihossa ICAM-l-il-mennys rajoittui endoteelisoluihin, jolloin keratinosyytit i eivät leimaantuneet.

5 HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä vaihteli. Ei löytynyt yhtään HLA-DR-positiivista kudosnäytettä, joka ei ollut myös ICAM-l-positiivinen.

' Yhteenvetona nämä tulokset osoittavat, että ennen hoitoa 10 ICAM-1-ilmennys on ilmeistä keratinosyyteillä ja korreloi tiheään yksitumasoluvuotoon. PUVA-hoidon aikana todetaan selvä ICAM-l-värjääntymisen lasku samanaikaisesti, kun ta-" pahtuu kliinistä paranemista. Kudosopillisesti ihovuoto I niinikään väheni. Kun kliininen uudelleensairastuminen hoi- 15 don aikana oli ilmeinen, ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä kasvoi, kuten kasvoi myös ihovuodon tiheys. Kun hoidon aikana havaitiin kliinistä toipumista, tapahtui samanaikaisesti keratinosyyttien ICAM-l-värjääntymisessä alenemista kuten myös ihovuodossa laskua.

20 Täten ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä korreloi ihon yksi-tumasoluvuodon tiheyteen. Nämä tulokset osoittavat, että Γ kliinisenä vasteena PUVA-hoitoon tapahtui selvä lasku ICAM- 1-ilmennnyksessä keratinosyyteillä samanaikaisesti, kun 25 tapahtui kohtuullisempi vähennys yksitumasolujen määrässä. Tämä osoittaa, että ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä on vastuussa ihovuodon käynnistämisestä ja ylläpidosta ja että PUVA-hoito säätää alaspäin ICAM-1:tä, mikä puolestaan heikentää ihovuotoa ja tulehdusvastetta. Tulokset osoittavat 30 myös, että HLA-DR-ilmennys keratinosyyteillä vaihteli PUVA-hoidon aikana.

ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä hilsetystautiin liittyvissä vaurioissa korreloi vaurion kliiniseen vakavuuteen 35 sekä ihon-vuodon määrään. Täten ICAM-1 esittää keskeistä osaa hilsetystaudissa, jolloin sen ilmennyksen ja/tai vuorovaikutuksen CD18-kompleksin yksitumasolujen kanssa inhi- 104952 95 boinnista tullaan saamaan tämän sairauden tehokas hoito. Lisäksi ICAM-1-ilmennyksen tarkkailusta keratinosyyteillä tullaan saamaan tehokas apu-väline hilsetystaudin diagnoosiin ja prognoosiin, sekä terapian etenemisen arviointiin. 5 TAULUKKO 13 ICAM-l-ilmennys keratinosyyteillä hilsetystautivaurioissa (PS) ja kliinisesti normaalissa ihossa (N) ajan funktiona 10 ennen PUVA-hoidon aloittamista ja sen aikana

Aika ennen Potilas n:o PUVA-käsit- ----- telyä ja sen _}___^__^____5

15 jälkeen p$ ps N PS N PS N PS N

0 ++-++-++- +++ 1 päivä + 1 viikko + +- --++ - + - o 20 2 viikkoa ++ +-+-+- 3 viikkoa ++ * o 4 viikkoa +++---++ * * 25 5-6 viikkoa - - - o 7 viikkoa (++) (+) +++ * * 10 viikkoa (+) 30 +++ Paljon positiivisia keratinosyyttejä ++ Kohtuullisesti positiivisia keratinosyyttejä + Paikallisesti positiivisia keratinosyyttejä (+) Hajaantuneesti vain hyvin vähän positiivisia keratino- ·' 35 syyttejä • <

Ei positiivista värjääntymistä * Kliininen toipuminen o Kliininen uudelleensairastuminen 96 1 0 4 9 5 2 ESIMERKKI 25 ICÄM-l:n ja HLA-DR:n ilmennys pahanlaatuisissa ihosairauksissa 5 Vauriokohtiin hyvänlaatuisissa ihosairauksissa verrattuna ICAM-1-ilmennys keratinosyyteillä pahanlaatuisissa ihovau-riokohdissa oli huomattavasti vaihtelevampi (taulukko 14). Tutkituista 23:sta ihon T-solulymfomasta ICAM-l-positiivi-sia keratinosyyttejä todettiin vain 14 tapauksessa. Kera-10 tinosyyteillä, jotka olivat peräisin mycosis fungoides -vaurionäytteistä, oli taipumus menettää ICAM-l-ilmennyk-sensä taudin jatkovaiheissa. Kuitenkin ICAM-l-ilmennystä todettiin vaihtelevassa osuudessa yksitumasoluvuotoa useimmista ihon T-solulymfomavaurioista. Tutkituista jäljellä 15 olevista lymfomista neljällä kahdeksasta oli ICAM-1:n ilmentäviä keratinosyyttejä. Tutkituista 29 potilaasta, joilla oli pahanlaatuisia ihosairauksia, viidellä oli keratinosyyttejä, jotka ilmensivät HLA-DR:n ilmentämättä ICAM-1:tä (taulukko 14).

20 TAULUKKO 14 ICAM-1:n ja HLA-DR:n ilmennys keratinosyyteillä, jotka olivat peräisin pahanlaatuisista ihosairauksista 25

Tapausten Vain Vain ICAM-&

Diagnoosi määrä ICAM-1 HLA-DR HLA-DR

CTCL, MFI 8 la 0 4 30 CTCL, MFII-III 10 1 2 5 CTCL, SS 3102 • · ' CTCL, suuri solu 2020 35 CBCL 2 0 0 1

Iholeukemia 3111 40 Histiosytoosi Xl 0 0 0 104952 97 aNäytteet katsottiin positiivisiksi, jos ainakin pieniä keratinosyyttirykelmiä oli värjääntynyt.

ESIMERKKI 26 5 ICAM-l-vastaisten vasta-aineiden vaikutus ihmisen ääreisveren yksitumasolujen lisääntymiseen

Ihmisen ääreisveren yksitumasolut indusoituvat lisääntymään antigeeni- tai mitogeeniläsnäolon ja -tunnistuksen seurauk-10 sena. Tietyt molekyylit, kuten mitogeeni konkanavalliini-A, tai T-soluihin sitoutuva vasta-aine OKT3, aiheuttavat ääreisveren yksitumasolujen ei-spesifistä lisääntymistä.

Ihmisen ääreisveren yksitumasolut ovat heterogeenisiä siinä 15 mielessä, että ne koostuvat solu-alapopulaatioista, jotka kykenevät tunnistamaan spesifisiä antigeenejä. Kun ääreisveren yksitumasolu, joka kykenee tunnistamaan tietyn spesifisen antigeenin, tapaa tuon antigeenin, vastaavan yksitu-masolu-alapopulaation lisääntyminen indusoituu. Jäykkäkou-20 ristus-toksiini ja avaimenreikä-maljakotilohemosyaaniini ovat esimerkkejä antigeeneistä, jotka ääreisveren yksituma-solu-alapopulaatiot tunnistavat, mutta joita kaikki ääreisveren yksitumasolut eivät tunnista kerkistyneissä yksilöissä .

25

Tutkittiin ICAM-1-vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen R6-5-D6 kykyä estää ihmisen ääreisveren yksitumasolujen lisääntymisvasteet järjestelmissä, joiden tiedetään edellyttävän solu-solukiinnityksiä.

30 • Ääreisveren yksitumasoluja puhdistettiin Ficoll-Paque-(Pharmacia) gradientteja käyttäen valmistajan ohjeiden mukaan. Rajafaasi otettiin talteen ja solut pestiin kolmeen kertaan RPMI 1640 -kasvualustalla, minkä jälkeen niitä vil-35 jeltiin tasapohjaisilla 96 kuopan mikrotiitterilevyillä pitoisuutena 106 solua/ml RPMI 1640 -kasvualustassa, jota 98 1 0 4 9 5 2 oli täydennetty 10 %:lla nautasikiöseerumia, pitoisuudella 2 mM glutamiini ja gentamysiinilla (50 mikrogrammaa/ml) .

Antigeeni, joko T-solumitogeeni, konkanavalliini-A (0,25 j 5 mikrogrammaa/ml); T-soluja sitova vasta-aine, OKT3 (0,001 ! mikrogrammaa/ml)/ avaimenreikä-maljakotilo-hemosyaniini (10 g/ml) tai jäykkäkouristustoksiini (1:100 laimennos läh-! teestä) lisättiin soluihin, joita viljeltiin kuten edellä kuvattu joko ICAM-vastaisen vasta-aineen (R6-5-D6; loppupi-10 toisuus 5 g/ml) läsnäollessa tai vastaavasti puuttuessa. Soluja viljeltiin 3,5 päivän ajan (konkanavalliini-A-koe), ’ 2,5 päivän ajan (OKT3-koe) tai 5,5 päivän ajan (avaimen- : reikä-maljakotilo-hemosyaniini- sekä jäykkäkouristustok- ' siinikokeet), minkä jälkeen kokeet päätettiin.

15 18 tuntia ennen kokeen päättämistä viljelmiin lisättiin 2,5 mikrocurie-yksikköä 3H-tymidiiniä. Solujakaantuminen määritettiin mittaamalla tymidiinin siirtyminen ääreisveren yksitumasolujen DNA:hän. Siirtynyt tymidiini kerättiin ja 20 laskettiin nestetuikelaskijassa (Merluzzi et ai., J.Immunol. 139 (1987) 166 - 168). Näiden kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 16 (konkanavalliini-A-koe), kuviossa 17 (OKT3-koe), kuviossa 18 (avaimenreikä-maljakotilo-hemosy-aniinikoe) ja kuviossa 19 (jäykkäkouristustoksiinikoe).

25

Todettiin, että ICAM-l-vastainen vasta-aine inhiboi lisään-tymisvasteita ei-spesifiselle T-solumitogeenille, Con-A; ei-spesifiselle T-soluliitteiselle antigeenille, OKT-3; ja spesifisille antigeeneille, avaimenreikä-maljakotilo-hemo-30 syaniini ja jäykkäkouristustoksiini; yksitumasoluissa. In-hibitio ICAM-l-vastaisella vasta-aineella oli verrattavissa inhibitioon LFA-l-vastaisella vasta-aineella, mikä viittaa siihen, että ICAM-1 on LFA-l:n funktionaalinen ligandi ja että ICAM-l-antagonismi inhiboi spesifisen puolustusjärjes-35 telmän vasteita.

104952 99 ESIMERKKI 27 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus sekaimusolureaktioon 5 Kuten edellä esitetty, ICAM-1 on välttämätön tehokkaille soluvuorovaikutuksille immuunivasteissa, joita välittää LFA-l-riippuvainen solukiinnitys. ICAM-l:n induktio immuunivasteiden yhteydessä tai tulehdussairaudessa mahdollistaa valkosolujen vuorovaikutuksen toistensa sekä endo-10 teelisolujen kanssa.

Kun kahdesta ei-sukulaisyksilöstä peräisin olevia imusoluja viljellään toistensa läsnäollessa, havaitaan imusolujen emosolumuodostusta ja solujakaantumista. Tämä vaste 15 yhden imusolupopulaation vaste toisen imusolupopulaation läsnäoloon - tunnetaan sekaimusolureaktiona (MLR), ja se on analoginen imusolujen vasteeseen mitogeenia lisättäessä (Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Klein, J., John Wiley & Sons, NY, 1982, ss. 453 - 458).

20

Suoritettiin kokeita ICAM-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden vaikutuksen humaani-MLR:ään määrittämiseksi. Nämä kokeet suoritettiin seuraavasti. Aäreisverta otettiin normaaleista terveistä luovuttajista laskimosta punktoimal-... 25 la. Veri kerättiin hepariinilla käsiteltyihin koeputkiin, joissa sitä laimennettiin 1:1 huoneenlämpötilassa Puck's G - (Gibco) tasapainotetulla suolaliuoksella (BSS). Veriseos (20 ml) asetettiin kerrokseksi 15 ml:lie Ficoll/Hypaque-tiheysgradienttia (Pharmacia, tiheys = 1,078, huoneenlämpö-30 tilassa) ja sentrifugoitiin 1000 x g:ssä 20 minuutin ajan.

·· Rajafaasi otettiin sitten talteen ja pestiin 3X Puck's G

-valmisteella. Solut laskettiin hemasytometrissä ja uudel-leenlietettiin RPMI 1640 -kasvualustaan (Gibco), joka sisälsi 0,5 % gentamysiiniä, pitoisuuden 1 mM L-glutamiinia 35 (Gibco) ja 5 % lämpöinaktivoitua (56 °C, 30 min.) humaani-AB-seerumia (Flow Laboratories) (johon kasvualustaan tästä eteenpäin viitataan "RPMI-kasvualustana").

104952 100 Näissä kokeissa käytettiin hiiren ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (R6-5-D6). Kaikkia monoklonaalisia vasta-aineita (jotka valmistettiin vatsaontelonesteestä Jackson Immuno Research Laboratories -laboratoriossa, Boston, MA) käytet-5 tiin puhdistettuina IgG-valmisteina.

Ääreisveren yksitumasoluja (PBMC) viljeltiin kasvualustassa pitoisuutena 6,25 x 105 solua/ml Linbron pyöreäpohjaisilla mikrotiitterilevyillä (# 76-013-05). Toisesta luovuttajasta 10 saatuja stimulaattorisoluja säteilytettiin 1000 R:llä, minkä jälkeen niitä viljeltiin vastesolujen kanssa samana pitoisuutena. Viljelmän kokonaistilavuus oli 0,2 ml. Verrok-! keina toimivat vastesolut yksinään sekä stimulaattorisolut yksinään. Viljelymaljoja inkuboitiin 37 °C:ssa 5 % C02:ta 15 sisältävässä kostutetussa ilmakehässä 5 päivän ajan. Kuoppia sykäytettiin 0,5 mikrocurie-yksikön pitoisuudella tri- tioitua tymidiiniä (3HT) (New England Nuclear) viljelyn 18 viimeisen tunnin aikana. Joissain tapauksissa suoritettiin kaksisuuntainen MLR. Menettelyjärjestys oli sama lukuunot-20 tamatta, että toisen luovuttajan soluja ei inaktivoitu sä-teilyttämällä.

’ Solut otettiin talteen lasikuitusuodattimille käyttäen au tomaattista näytekerääjää (Skatron, Norja), minkä jälkeen 25 ne huuhdottiin vedellä ja metanolilla. Suodattimia kuivattiin uunissa, minkä jälkeen ne laskettiin Aquasol-nesteessä Beckmanin (LS-3801) nestetuikelaskijalla. Tulokset ilmaistaan keskimääräisenä tuiketta/min-arvona +/- s.d. kuudesta ; eri viljelmästä.

30

• I

Taulukosta 15 ilmenee, että puhdistetut ICAM-l-vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet inhiboivat MLR:ää annosriippuvaisella tavalla, jolloin merkittävää suppressiota ilmeni pitoisuudella 20 ng/ml. Puhdistetulla hiiri-IgG:llä oli !' 35 vain vähäinen tai ei lainkaan suppressiivista vaikutusta.

MLR:n suppressiota ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella 104952 101 vasta-aineella tapahtuu, kun vasta-aine lisätään viljelyn ensimmäisten 24 tunnin aikana (taulukko 16).

TAULUKKO 15 5 ICÄM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus yksisuuntaiseen imusolureaktioon

Reagoi- , n 1 2HT: n liittyminen

10 vat Stimulaat- J

solut1 torisolutb Vasta-ainec (CPH) - - - 445d ± 143 - + - 148 ± 17 + - - 698 ± 72 15 + + - 42,626 ± 1,579 + + mlgG (10,0 pg) 36,882 ± 1,823 (14%) + + mlgG ( 0,4 pg) 35,500 ± 1,383 (17%) + + mlgG ( 0,02 pg) 42,815 ± 1,246 ( 0%) + + R6-5-D6 (10,0 pg) 8,250 ± 520 (81%) 20 + + R6-5-D6 ( 0,4 pg) 16,142 ± 858 (62%) + +_ R6-5-D6 ( 0,03 pg) 28,844 ± 1,780 (32%)

Vastesoluja 6,25 x 103 kpl/ml bStimulaattorisoluja 6,25 x 103 kpl/ml, säteilytetty 1000 25 R: llä • · 2 cICAM-l-vastainen puhdistettu monoklonaalinen vasta-aine (R6-5-D6) tai puhdistettu hiiri-IgG (mlgG), loppupitoisuu-det (mikrogrammaa/ml).

3 dKeskiarvo +/- s.d. 5-6 viljelmästä; luvut sulkeissa il-30 moittavat MLRrn prosentuaalisen inhibition.

• < 102 TAULUKKO 16 104952 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen lisäysajankohta

5 Ra Sb Lisäykset0 3HT:n liittyminen (CPM

Alustan tai vasta-aineen lisäämisaika Päivä 0 Päivä 1 Päivä 2 alusta 205d± 14 476± 132 247± 75 - + alusta 189± 16 nd® nd ]^q + _ alusta 1, 850± 615 nd nd + + alusta 41,06312,940 45,95512,947 50,94313,072 R6-5-D6 17,78111,293 38,40911,681 47,30812,089 (57%) (16%) (7%) aVastesoluja 6,25 x 105 kpl/ml 15 bStimulaattorisoluja 6,25 x 105 kpl/ml, säteilytetty 1000 R: llä kasvualustaa tai ICAM-l-vastaista puhdistettua monoklonaa-. lista vasta-ainetta (R6-5-D6) pitoisuutena 10 mikrogram-maa/ml lisättiin päivästä 0 24 tunnin välein.

20 keskiarvo +/- s.d. 4-6 viljelmästä; " end = ei määritetty

Prosentuaalinen inhibitio ^ ♦··· Yhteenvetona ICAM-l-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida 25 MLR:ää osoittaa, että ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on terapeuttista käyttöä akuutissa siirre-hyljinnässä. ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on niinikään terapeuttista käyttöä liittyvissä . immuuni(järjestelmä)välitteisissä häiriöissä, jotka ovat 30 riippuvaisia LFA-l/ICAM-l-säätöisistä solu-soluvuorovaiku-tuksista.

Tässä kuvatut kokeet osoittavat, että ICAM-l-vastaisten monoklonaalisten vasta-aineiden lisääminen inhiboi sekaimu-35 solureaktiota (MLR), kun ne lisättiin reaktion ensimmäisten 104952 103 24 tunnin kuluessa. Lisäksi ICAM-1 säätyy ylöspäin ihmisen ääreisveren monosyyteissä in vitro -viljelyssä.

Lisäksi todettiin, että ICAM-1 ei ilmenny lepotilassa ole-5 villa ihmisen ääreisveren imusoluilla tai monosyyteillä. ICAM-1 säätyy ylös yksinään viljellyillä monosyyteillä sekä soluilla, joita viljellään yhdessä ei-sukulaisluovuttaja-solujen kanssa, sekaimusolureaktiossa, jolloin mittaukset suoritetaan käyttäen tavanomaisia virtaussytometria-analyy-10 seja. Tätä ICAM-1:n ylössäätöä monosyyteillä voidaan käyttää tulehdusindikaattorina; erityisesti, jos ICAM-1 ilmentyy tuoreilla monosyyteillä, jotka ovat peräisin yksilöistä, jotka potevat akuuttia tai kroonista tulehdusta.

15 ICAM-1:n spesifisyys aktivoiduille monosyyteille ja ICAM-1-vastaisen vasta-aineen kyky inhiboida MLR:ää viittaavat siihen, että ICAM-l-vastaisilla monoklonaalisilla vasta-aineilla on diagnostisia ja terapeuttisia käyttömahdollisuuksia akuutin siirrehyljinnän ja liittyvien immuuni(jär-20 jestelmä)välitteisten häiriöiden yhteydessä, jotka edellyttävät solu-soluvuorovaikutuksia.

ESIMERKKI 28 ICAM-l-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden 25 yhteisannon synergiavaikutukset

Kuten esitetty esimerkissä 27, MLR:ää inhiboi ICAM-l-vas-tainen vasta-aine. MLR:ää voi inhiboida myös LFA-l-vastai-nen vasta-aine. Sen määrittämiseksi, onko ICAM-l-vastaisten 30 ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhteisannolla tehostava, eli synergistinen vaikutus, suoritettiin MLR-määritys (kuten kuvattu esimerkissä 27) eri pitoisuuksien näitä kahta vasta-ainetta läsnäollessa.

35 Tässä MLR-kokeessa ilmeni, että ICAM-l-vastaisen vasta-aineen ja LFA-l-vastaisen vasta-aineen yhdistelmä - pitoisuuksina, joissa kumpikaan vasta-aine yksinään ei erityi- 104952 104 sesti inhiboi MLR:ää - oli merkittävästi tehokkaampi MLR-vasteen inhiboinnissa (taulukko 17). Tämä tulos osoittaa, että terapioilla, joissa lisäksi annetaan ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja) ja LFA-l-vastaista 5 vasta-ainetta (tai niiden fragmentteja), on kapasiteettia tuottaa tehokkaampi tulehdusvastainen hoito. Tällaista tehostettua terapiaa käyttämällä voidaan antaa alhaisempia vasta-aineannoksia, kuin mitkä muutoin olisivat terapeuttisesti tehokkaita, millä on merkitystä olosuhteissa, joissa 10 yksittäisten vasta-aineiden korkeat pitoisuudet indusoivat anti-idiotyyppivasteen.

TAULUKKO 17 15 Vaihtelevien anti-ICAM-1- ja anti-LFA-1- (R3.1-) annoksien vaikutus sekaimusolureaktioon

Ehkäisy-%

Konsentraatio (pg/ml) 20 Anti-ICAM-1 (R6-5-D6)

Anti-LFA-1 0 .004 .02 .1 .5 2,5 0,0 0 7 31 54 69 70 0,0008 1 7 28 48 62 71 0,004 0 13 30 50 64 72 25 0, 02 29 38 64 75 84 86 0, 1 92,5 90 91 92 92 92 0, 5 93 90 90 92 93 91 • · • · 104952 105 ESIMERKKI 29

Optimaalisen alittavien anti-ICAM-l-annoksien ja muiden immuunivastetta heikentävien aineiden yhdistetyn annon additiiviset vaikutukset MLR:ään 5

Kuten esitetty esimerkissä 28, MLR:ää inhiboivat ICAM-1-vastaisten ja LFA-l-vastaisten vasta-aineiden yhdistelmät. Sen määrittämiseksi, olisiko myös anti-ICAM-1:n ja muiden immuuni-vastetta heikentävien aineiden [kuten deksametaso-10 ni, atsatiopriini, syklosporiini-A ja steroidit (kuten esimerkiksi prednisoni jne.)] yhteisannolla tehostuneita vaikutuksia, suoritettiin MLR-määrityksiä käyttäen optimaalista alhaisempina pitoisuuksina (eli pitoisuuksina, jotka ovat alhaisempia kuin se optimaalinen pitoisuus, jona ai-15 netta yksinään annettaisiin kohteelle) R6-5-D6:ta yhdessä muiden immuunivastetta heikentävien aineiden kanssa, jolloin menettelysuoritus oli kuten esimerkissä 27.

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6:n inhiboivat vaikutukset 20 ovat vähintäänkin additiivisia suboptimaalisten annoksien deksametasonia (taulukko 18), atsatiopriinia (taulukko 19) ja syklosporiini-A:ta (taulukko 20) inhibitiovaikutuksiin. Tämä viittaa siihen, että ICAM-l-vastaisilla vasta-aineilla voi olla vaikutusta pyrittäessä alentamaan tunnettujen im-25 muunivastetta heikentävien aineiden välttämättömiä annoksia, jolloin näiden myrkylliset sivuvaikutukset vähenevät. Käytettäessä ICAM-l-vastaista vasta-ainetta (tai sen fragmenttia) tällaiseen immuunivasteheikennykseen pääsemiseksi, on mahdollista yhdistää vasta-aineen (tai sen fragmentin) 30 antaminen joko yhteen ylimääräiseen immuunivastetta heiken-

II

.. tävään aineeseen tai useamman kuin yhden immuunivastetta heikentävän aineen yhdistelmään.

106 TAULUKKO 18 104952

Anti-ICAM-1:n ja deksametasonin vaikutus humaani-MLR:ään 5 3HT: n

Inhibiittori liittymi- Inhibi-

Ryhmä (ng/ml) nen (CPM) tio-%

Kasvualusta - 15 6 - 10 Stimulaattorit (S) - 101

Vastetuottajat (R) - 4,461 R x S - 34,199 R x S R6-5-D6 (8) 26,225 23 R X S Dex (50) 14,158 59 15 R x S R6-5-D6 (8) + Dex (50) 7,759 77

Dex: deksametasoni TAULUKKO 19 20

Anti-ICAM-1:n ja atsatiopriinin vaikutus huma ani-MLR:ään 3HT: n 25 Inhibiittori liittymi- Inhibi-

Ryhmä (ng/ml) nen (CPM) tio-%

Kasvualusta - 78 -

Stimulaattorit (S) - 174

Vastetuottajat (R) - 3,419 - .. 30 R x S - 49,570 - R X S R6-5-D6 (8) 44,374 11 R x S Atsatiopriini (1) 42,710 14 R X S R6-5-D6 (8) + Atsatio- 34,246 31 priini (1) iti &i 107 TAULUKKO 20 104952

Anti-ICAM-1:n ja syklosporiini-A:n vaikutus humaani-MLR:ään 5 3HT: n

Inhibiittori liittymi- Inhibi-

Ryhmä (ng/ml) nen (CPM) tio-%

Kasvualusta - 87 - 10 Stimulaattorit (S) - 206

Vastetuottajat (R) - 987 R x S - 31,640 R X S R6-5-D6 (8) 26,282 17 R x S CyA (10) 23, 617 25 15 R X S R6-5-D6 (8) + CyA (10) 19,204 39

CyA: syklosporiini-A

ESIMERKKI 30 20 ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus saman lajin toisesta yksilöstä siirrettyjen elimien hyljinnän tukahduttamisessa ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutuksen osoittamiseksi " ] 25 siirretyn allogeenisen elimen hyljinnän tukahduttamisessa

Cynomolgus-apinoihin siirrettiin munuaisia toisesta saman lajin yksilöstä menetelmän mukaan, jota ovat kuvanneet Cosimi et ai. (Transplant.Proc. 13 (1981) 499 - 503) sillä modifikaatiolla, että nukutusaineina käytettiin valiumia ja 30 ketamiinia.

• ·

• I

Täten munuaisensiirto suoritettiin oleellisesti seuraavasti. Heterotrooppisia munuaissiirtoja suoritettiin 3-5 kg:n painoisille Cynomolgus-apinoille, oleellisesti kuten kuvan-35 nut Marquet (Marquet et ai., Medical Primatoloov, osa II,

Basel, Karger, 1972, s. 125), kun apinat oli ensin nukutettu 104952 108 valiumilla ja ketamiinilla. Luovuttajan munuaissuoniin rakennettiin yhdyshaarat, joissa toisen rakenteen pää oli yhdistetty toisen sivuun, aortta- tai onttolaskimopalaseen, käyttäen 7-0 Prolene -ommelta. Luovuttajan virtsanjohdin 5 spatuloitiin ja istutettiin virtsarakkoon ekstravesikaalisen lähestymistavan mukaan (Taguchi, Y., et ai., Dausset et ai. (toim.): Advances in Transplantation, Baltimore, Williams & Wilkins, 1968, s. 393) Munuaisfunktiota arvioitiin viikoittain tai kahdesti viikossa määrittämällä seerumikreatiniini. 10 Lisäksi otettiin tajaan siirrenäytteitä kudosopillista tarkastelua varten ja kaikille kokeessa kuolleille vastaanottajille suoritettiin täydelliset ruumiinavaukset. Useimmissa vastaanottajissa suoritettiin molemminpuolinen munuaispoisto siirtoajankohtana ja myöhemmän virtsamyrkytyksestä johtuvan 15 kuoleman ajankohta katsottiin siirreselviämisen loppuajan-kohdaksi. Joissain vastaanottajissa siirtoajankohtana suoritettiin yksipuolinen natiivi munuaisen poisto ja vastapuoli-nen virtsarakkosidonta. Kun tapahtui siirteen hylkimistä, autologisen virtsanjohtimen ommel poistettiin, jolloin seu-20 rauksena oli normaalin munuaisfunktion palautuminen ja mahdollisuus jatkaa vastaanottaja-eläimen immunologista tarkkailua .

Monoklonaalista vasta-ainetta R6-5-D6 annettiin päivittäin .. . 25 12 päivän ajan alkaen kaksi päivää ennen siirtoa annoksena 1-2 mg/kg/päivä. Seerumin kreatiniinitasot määritettiin ajoittain hyljinnän tarkkailemiseksi. ICAM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus samasta lajista saadun munuaisen hyl-jintään immuuni-järjestelmän toimesta on esitetty taulukossa 30 21.

109 TAULUKKO 21 104952 R6-5-D6:n aktiivisuus saman lajin yksilöstä siirretyn munuaisen selviytymiseen suojatoimenpiteitä 5 käytettäessä Cynomolgus-apinassa3

Selviämispäivä R6-5-D6-annos käsittelyn Apina (mg/kg) jälkeen 10 Verrokki 1 - 8

Verrokki 2 11

Verrokki 3 - 11

Verrokki 4 10

Verrokki 5 - 9 15 Verrokki 6 - 10 M15 1,0 20

Ml 9 1,0 T

M17 1,0 30 20 M25 1,5 29 M2 3 1,0 llc M27 2,0 34 M7 0,5 22 MH 0,5 26 25 Ml 0 0, 5 22 M8 0,5__26*_ aApinoille annettiin R6-5-D6:ta 12 perättäisenä päivänä alkaen 2 päivää ennen siirtoa.

30 bKuolinsyy tuntematon; todisteita piilevästä malariasta löytyi.

cKuolinsyy munuaiskuolio.

35 dEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.

104952 110

Tulokset osoittavat, että R6-5-D6 pidensi tehokkaasti apinoiden elinikää, joihin oli siirretty munuainen saman lajin toisesta yksilöstä.

5 ESIMERKKI 31 ICÄM-l-vastaisen vasta-aineen vaikutus siirrettyjen elimien akuutin hyljinnän tukahduttamisessa

Sen osoittamiseksi, että ICAM-l-vastainen vasta-aine on telo hokas siirrehyljinnän akuutissa mallissa, R6-5-D6:ta testattiin myös terapeuttisessa tai akuutissa munuaisenhyljintä-mallissa. Tässä mallissa apinan munuaisia siirrettiin (käyttäen esimerkissä 30 kuvattua menettelyjärjestelyä), ja niille annettiin toimenpide-ajankohdan molemmin puolin 15 mg/kg 15 syklosporiini-A:ta (CyA) i.m. kunnes päästiin stabiiliin munuaisfunktioon. Sitten CyA-annosta alennettiin kahdesti viikossa 2,5 mg:n/kg välein, kunnes hyjintää ilmeni, minkä osoitti veren kreatiniinitasojen nousu. Tällöin R6-5-D6:ta annettiin 10 päivän ajan ja eloon-jääntiaikaa tarkkailtiin. 20 Tärkeätä on huomata, että tässä menettelyjärjestelyssä CyA-annos pysyy suboptimaalisena, koska se ei muutu sen jälkeen, kun akuutti hyijintävaihe on käynnistynyt. Tässä mallissa kudosopilliset verrokit (N=5), joilla ei käytetä vasta-ainesuojaa, selviävät 5-14 päivän ajan hyijintävaiheen käyn-·. 25 nistymisestä. Tähän mennessä kuusi eläintä on testattu käyt täen R6-5-D6:ta tämä menettelyjärjestelyn mukaan (taulukko 22). Kaksi näistä eläimistä on edelleen elossa (M12, 31 päivää; ja M5, 47 päivää laskettuna R6-5-D6:n annosta). Kaksi eläintä eli 38 ja vastaavasti 55 päivää R6-5-D6-terapian 30 käynnistämisestä ja kaksi eläimistä kuoli muista syistä kuin « akuutin hyljinnän seurauksena (yksi eläin kuoli CyA-myrkky-vaikutuksiin ja toinen kuoli, kun sille annettiin nukutuksessa R6-5-D6:ta). Tämä malli muistuttaa (edellisiä) likei-semmin kliinistä tilannetta, jossa R6-5-D6:ta alunperin an-35 nettaisiin.

111 TAULUKKO 22 104952 R6-5-D6-aktiivisuus saman lajin toisesta yksilöstä siirretyn munuaisen selviämisen pidentämisessä terapeuttisissa menet-5 telyjärjestelyissä Cynomolgus-apinassa3

Selviämispäivä

Apina Hyijintävaihe päivänäb käsittelyn jälkeen

Kontrolli0 14-98 5-14 10 M24 41 38 M21 34 4d M3 41 55 M9 12 lle 15 M12 37 >31f M5 2 6 >47f_ aApinoille annettiin 1-2 mg/kg R6-5-D6:ta 10 perättäisenä päivänä hyljinnän alkamisesta laskettuna.

20 bPäivä, jona kreatiniinitasot kohosivat seurauksena CyA-an-nostuksen alentamisesta ja jona R6-5-D6-hoito aloitettiin. cViisi eläintä testattiin käyttäen edellä kuvattua terapeuttista menettelyjärjestelyä lukuunottamatta, ettei käytetty suojaterapiaa. "Selviämispäiviä käsittelyn jälkeen" on sel-·: 25 viämispäivien lukumäärä laskettuna kreatiniinitasojen kohoa misen alkamisesta.

dEläin kuoli nukutuksessa; kreatiniinitasot olivat alhaiset. eEläin kuoli CyA-myrkkyvaikutuksiin; kreatiniinitasot olivat alhaiset.

30 fEläin oli edelleen elossa 15. elokuuta 1988.

104952 ESIMERKKI 32 , Typistettyjen ICAM-1-johdannaisten geneettinen rakentaminen ja ilmennys 5 Luontaisessa tilassaan ICAM-1 on solumembraaniin sitoutunut proteiini, joka sisältää viidestä immunoglobuliinin kaltaisesta alueesta koostuvan solunulkoisen alueen, transmembraa-nialueen ja sytoplasma-alueen. Halusimme rakentaa ICAM-1:n Ξ funktionaalisia johdannaisia, joista puuttuu transmembraani- 10 alue ja/tai sytoplasma-alue, liukoisen, erittyvän ICAM-1-muodon saamiseksi. Nämä funktionaaliset johdannaiset rakennettiin ICAM-l-geenin oligonukleotidi-ohjatulla mutatoinil-la, minkä jälkeen mutanttigeeni ilmennettiin transfektoimal-la se apinasoluihin.

15 ICAM-l-geenimutantteja, jotka käsittivät aminohapposubsti-tuutioita ja/tai typistettyjä johdannaisia, muodostettiin Kunkelin, T., (Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 488 - 492) menetelmän mukaan. ICAM-l-cDNA valmistettiin kuten edellä 20 kuvattu ja sitä pilkottiin restriktioendonukleaaseilla

Sa-11 ja Kpnl, minkä jälkeen saatu 1,8 ep:n DNA-fragmentti alakloonattiin plasmidivektoriin CDM8 (Seed, B., et ai. Proc.Natl.Acad.Sei. USA M (1987) 3365 - 3369). Tällä pCD1.8C:ksi nimetyllä rakenteella transformoitiin sitten 25 E. coli duf'unq”kanta. Transformanteista saatiin talteen yk- Γ 1 i:. j sisäikeinen urasiilipitoinen templaatti käyttämällä avusta- jafagi R408 - (StratageneR) tartutusta. Sitten muodostettiin mutantti-ICAM-l-cDNA-säikeitä alustamalla toisen säikeen synteesi oligonukleotidilla, joka sisälsi ei-yhteensopivia 30 emäspareja, ja transformoimalla sitten unq+-isäntä * (MC1061/P3) saadulla heterodupleksilla. Mutantit eristettiin seulomalla juuri muodostettujen, mutanttioligonukleotidin mukanaan tuomien endonukleaasirestriktiokeskuksien suhteen. Mutantti-ICAM-l-proteiini ilmennettiin transfektoimalla Cos-35 -7-soluja mutantti-DNA:11a eukaryoottisessa ilmennysvekto-rissa CDM8 käyttäen DEAE-dekstraanivakiomenettelyitä Selden, R.F., et ai. , Current Protocols in Molecular Biology inia !ΓΓ:ΐ31 104952 113

Ausubel, F.M., et ai., toim.), ss. 9.2.1.-9.2.6. (1987).

Valmistettiin typistetty ICAM-1:n funktionaalinen johdannainen, josta puuttuivat transmembraani- ja sytoplasma-alueet, 5 mutta joka sisälsi kaikki viisi immunoglobuliinin kaltaista aluetta käsittävän solunulkoisen alueen. 30 ep:n mutantti-oligonukleotidia (CTC TCC CCC CGG TTC TAG ATT GTC ATC ATC) käyttäen muutettiin aminohappojen tyrosiini (Y) ja glutamii-nihappo (E) kodonit asemissa 452 ja vastaavasti 453 fenyyli-10 alaniiniksi (F) ja translaation lopetuskodoniksi (TAG). Mu-tantti eristettiin yksittäisen Xbal-restriktiokeskuksensa nojalla ja nimettiin "Y452E/F,TAG".

Mutanttiproteiinin ilmentämiseksi COS-soluja transfektoitiin 15 kolmella mutanttialakloonilla ("2, #7 ja #8). Kolmen päivän kuluttua transfektoinnista näillä kolmella mutanttialakloonilla viljelmäsupernatantteja ja solulysaattia analysoitiin immuunisaostamalla ICAM-l-vastaisella monoklonaalisella vasta-aineella RR1/1 ja SDS-PAGE:11a. ICAM-1 saostettiin mu-20 tantti-alaklooneilla #2 ja #8 transfektoitujen solujen vil-jelmäsupernatanteista, mutta ei näiden solujen pesuainely-saateista. Viljelmäsupernatantista todetun ICAM-1:n molekyy-lipaino oli noin 6 kd:tä alhaisempi kuin ICAM-1:n membraani-muodon, mikä sopii mutantti-DNA:lie ennakoituun kokoon. Tä-·: 25 ten tämä ICAM-1:n funktionaalinen johdannainen erittyy liu koisena proteiinina. Sitä vastoin ICAM-1 ei immuunisaostunut natiivilla ICAM-1:llä transfektoitujen solujen verrokkivil-jelmäsupernatanteista, mikä osoittaa, että ICAM-1:n membraa-nimuoto ei erity Cos-soluista. Lisäksi ICAM-1:tä ei immuuni-30 saostunut negatiivisena verrokkina toimineiden valetransfek-’ toitujen solujen sen paremmin viljel-mäsupernatanteista kuin solulysaateistakaan.

Transfektoitujen solujen erittämä typistetty ICAM-1 puhdis-35 tettiin immunoaffiniteettikromatografisesti ICAM-1:lie spesifisellä vasta-aineella (R6-5-D6), minkä jälkeen sen funktionaalista aktiivisuutta testattiin solusitoutumismäärityk- 104952 114 sellä. Valmisteita, jotka sisälsivät natiivia ICAM-1:tä tai typistettyä, erittyvää muotoa, puhdistettiin pesuaineoktyy-liglukosidin läsnäollessa, minkä jälkeen niitä laimennettiin loppupitoisuuteen 0,25 % oktyyliglukosidia (joka pitoisuus 5 alittaa pesuaineen kriittisen misellipitoisuuden). Näiden ICAM-l-valmisteiden annettiin sitoutua muovisten, 96 kuopan kuoppa-levyjen (Nunc) kuoppapintoihin kiinteään faasiin sidotun ICAM-1:n saamiseksi. Ei-sitoutunut materiaali pestiin pois, minkä jälkeen todettiin, että noin 75 - 80 % ja vas-10 taavasti 83 - 88 % SKW-3-soluista, jotka käsittivät solupin-noillaan LFA-l:n, sitoutui spesifisesti ICAM-1:n natiiviin ja typistettyyn muotoon. Nämä tulokset osoittavat, että ICAM-1:n erittyvällä, typistetyllä ja liukoisella funktionaalisella johdannaisella oli tallella sekä immunologinen 15 reaktiivisuus että kyky välittää ICAM-l-riippuvaista kiinnittymistä, jotka ominaisuudet ovat karakteristisia natii-ville ICAM-1:lie.

Funktionaalinen ICAM-1-johdannainen, josta puuttuu vain sy-20 toplasma-alue, valmistettiin samankaltaisilla menetelmillä. Aminohapon 476 (Y) vaihtamiseksi TAG-translaatiolopetusko-ΐ doniksi käytettiin 25 ep:n oligonukleotidia (TC AGC ACG TAC

CTC TAG AAC CGC CA) . Mutantti nimettiin "Y476/TAG". Immuuni-I saostamalla ja suorittamalla SDS-PAGE Cos-soluilla, jotka I .,25 oli transfektoitu mutantilla, todettiin ICAM-1:n membraaniin ; sitoutunut muoto, jonka molekyylipaino oli noin 3 kd:tä al haisempi kuin natiivin ICAM-1:n. Mutantilla transfektoitujen Cos-solujen epäsuoralla immunofluresenssilla todettiin sa-; mankaltainen täplikäs värjääntymiskuvio kuin LPS:llä stimu- ' 30 loiduilla humaani-endoteelisoluilla ilmennetyn natiivin ICAM-1:n. Lopuksi mutantti-DNA:11a transfektoidut solut sitoutuivat spesifisesti puhdistettuun LFA-l:een muovipinnoilla samaan tapaan kuin natiivilla ICAM-l-DNA: 11a transfektoi-dut Cos-solut (taulukko 23).

35 TAULUKKO 23 115 104952 ICAM-l:n tai funktionaalisen ICAM-1-johdannaisen ilmentävien solujen kyky sitoutua LFA-l:een 5 LFA-l:een sitoutuvien, ICAM-1:n ilmentävien solujen %-osuus, kun läsnä on:_ 10 TRANSFEKTOINTI Ei vasta-ainetta RR1/1

Vale- 0 0

Natiivi ICAM-1 20 0 Y476/TAG 20 0 15 _ ESIMERKKI 33 ICAM-1:n funktionaalisten alueiden kartoitus 20 ICAM-1:tä tutkittaessa ilmeni, että molekyyli käsittää 7 aluetta. Näistä alueista viisi on solunulkoista (jolloin lähinnä solupintaa on alue 1 ja kauimpana solupinnasta on alue 1), yksi alue on transmembraanialue ja edelleen yksi 25 alue on sytoplasma-alue (eli on solun sisällä). Sen määrittämiseksi, mitkä alueet myötävaikuttavat ICAM-1:n kykyyn sitoutua LFA-l:een, voidaan käyttää epitooppikartoitustutki-muksia. Tällaisten kokeiden suorittamiseksi valmistetaan erilaisia deleetiomutantteja, joiden kyky sitoutua LFA-l:een 30 karakterisoidaan. Vaihtoehtoisesti tutkimukset voidaan suo-rittaa käyttäen ICAM-vastaista vasta-ainetta, jonka tiedetään häiritsevän ICAM-1:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkkejä tällaisista sopivista vasta-aineista ovat RR1/1 (Rothlein, R., et ai., J.Immunol. 137 (1986) 1270 - 1274); 35 R6.5 (Springer, T.A., et ai., US-hakemusjulkaisu sarjan:o 07/250, 446), LB-2 (Clark, E.A., et ai.. Leukocyte Typing I, A. Bernard, et ai., toim., Springer-Verlag, 1984, ss. 339 -.

104952 116 346) tai CL203 Staunton, D.E., et ai., Cell 56 (1989) 849 -853) .

ICAM-l-deleetiomutantteja voidaan muodostaa millä tahansa 5 lukuisista eri tavoista. Edullisesti tällaisia mutantteja muodostetaan kuitenkain paikkaohjautuvalla mutatoinnilla tai muutoin yhdistelmägeeniteknisesti (kuten rakentamalla ICAM-l:n ilmentäviä geenisekvenssejä, joista tiettyjä pro-teiinialueita koodittavat sekvenssit on eliminoitu. Menet-10 telyt, jotka soveltuvat tällaisten mutanttien tuottamiseen, ovat alalla hyvin tunnettuja. Tällaisia menettelyitä käyttäen valmistettiin kolme ICAM-l-deleetiomutanttia. Ensimmäisestä mutantista puuttuvat aminohappojäännökset F185 -P284 (eli alue 3 on deletoitu). Toisesta mutantista puuttu-15 vat aminohappojäännökset P284 - R451 (eli alueiden 4 ja 5 deleetio). Kolmannesta mutantista puuttuvat Y476:n jälkeiset aminohappojäännökset (eli sytoplasma-alueen deleetio). Näiden tutkimusten tuloksista ilmenee, että alueet 1, 2 ja 3 liittyvät pääasiassa ICAM-l:n ja ICAM-l-vastaisen vasta-20 aineen tai LFA-l:n välisiin vuorovaikutuksiin.

ESIMERKKI 34 ICAM-l:ssä suoritettujen mutatointien vaikutus LFA-l-sitoutumiseen ·: 25 ICAM-l:n kyvyn olla vuorovaikutuksessa ja sitoutua LFA-l:een välittävät ICAM-l-aminohappojäännökset, jotka sijaitsevat ICAM-1-molekyyIin alueilla 1 (kuviot 8, 9 ja 10). Tällaisiin vuorovaikutuksiin myötävaikuttavat kuitenkin ICAM-l:n alu-30 eilla 2 ja 3 sijaitsevat aminohapot. Täten esillä olevan » keksinnön mukaisiin edullisiin funktionaalisiin johdannaisiin lukeutuvat liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka sisältävät ICAM-l-alueet 1, 2 ja 3. Edullisempia ovat liukoiset ICAM-l-molekyylifragmentit, jotka sisältävät ICAM-1-35 alueet 1 ja 2. Edullisimpia ovat liukoiset ICAM-l-molekyyli-fragmentit, jotka sisältävät ICAM-l:n alueen 1. ICAM-l:n ja LFA-l:n väliseen vuorovaikutukseen osallistuvat useat amino- 104952 117 happojäännökset ensimmäiseltä ICAM-l-alueelta. Näiden aminohappojen korvaaminen muilla aminohapoilla muuttaa ICAM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Nämä aminohappojäännökset ja mainitut substituutiot on esitetty kuviossa 25. Kuviossa 25 5 esitetään myös tällaisten mutatointien vaikutukset saadun mutantti-ICAM-l-molekyylin kykyyn sitoutua LFA-l:een. Kuvioissa 23 - 25 jäännökset on merkitty aminohappojen yksikir-jainkoodilla, jota seuraa jäännöksen asema ICAM-1-molekyylissä. Täten esimerkiksi "E90" tarkoittaa glutamiinihappo-10 jäännöstä ICAM-l:n asemassa 90. Vastaavasti "E90V" tarkoittaa dipeptidiä, joka koostuu glutamiinihappojäännöksestä asemassa 90 ja väliinijäännöksestä asemassa 91. Substituu-tiosekvenssi on merkitty vinoviivan ("/") oikealle puolelle. ICAM-l:n jäännökset V4, R13, Q27, Q58 ja D60S61 osallistuvat 15 LFA-l-sitoutumiseen.

Näiden aminohappojen korvaaminen muutti ICAM-l:n kykyä sitoutua LFA-l:een. Esimerkiksi korvaamalla V4 G:llä saadaan mutantti-ICAM-l-molekyyli, joka kykenee huonommin sitoutu-20 maan LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n R13-jäännös E:llä saadaan mutanttimolekyyli, jolla on huomattavasti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25). Korvaamalla ICAM-l:n Q58-jäännös H:11a saadaan mutanttimolekyyli, jolla on oleellisesti normaali kyky sitoutua LFA-l:een (kuvio 25).

. 25 Korvaamalla ICAM-l:n D60S-jäännökset KL:llä saadaan mutant timolekyyli, jolla on oleellisesti vähemmän kykyä sitoutua LFA-l:een (kuvio 25).

Toisen alueen glykosylaatiokeskukset liittyvät niinikään 30 LFA-l-sitoutumiseen (kuvio 23). Korvaamalla N103 K:11a, tai A155N SV:llä, saadaan mutantti-ICAM-l-molekyyli, joka oleellisesti ei kykene sitoutumaan LFA-l:een. Sitä vastoin glykosylaatiokes-kuksen N175 korvaaminen A:11a ei ilmeisesti oleellisesti vaikuttanut mutantti-ICAM-1:n kykyyn sitou-35 tua LFA-l:een.

104952 118

Kolmannen ICAM-l-alueen mutaatiot eivät sanottavasti muuttaneet ICAM-l:n LFA-l-sitoutumista (kuvio 24).

5 ESIMERKKI 35 ICAM-l-multimeerejä, joiden biologinen puoliintumisaika-affiniteetti ja "selviämiskyky" ovat kasvaneet 10

Rakennetaan kimeerisiä molekyylejä, joissa ICAM-l:n alueet 1 ja 2 ovat kiinnittyneet immunoglobuliinin raskaan ketjun sarana-alueelle. Edullisissa rakenteissa ICAM-l:n alueen 2 C-pää on kiinnitetty immunoglobuliinin raskas ketju -gee-15 nisegmenttiin, joka on sarana-alueeseen nähden välittömästi N-pään puolella, jolloin segmentin jousto voi siirtyä sarana-alueeseen. ICAM-l-alueet 1 ja 2 korvaavat täten vasta-aineen Fab-fragmentin. Kiinnittämällä rakenne IgG-luokan raskaisiin ketjuihin ja eläinsoluissa sitten tuotta-20 maila saadaan kimeerinen molekyyli. Tuotettaessa molekyylejä, jotka sisältävät IgA:sta tai IgM:stä peräisin olevia raskaita ketjuja, saadaan molekyylejä, joiden multimeria-aste on korkeampi, jolloin ne sisältävät 2-12 ICAM-l-mo-, lekyyliä. Yhteisilmaisemalla J-ketjugeeni eläinsoluissa, .. 25 jotka tuottavat kimeerisiä ICAM-l-raskasketjumolekyylejä, saadaan kootuksi oikealla tavalla IgA- ja IgM-multimeerejä, jolloin saadaan pääasiassa IgA-molekyylejä, jotka sisältävät 4-6 ICAM-l-molekyyliä, ja IgM-molekyylejä, jotka sisältävät noin 10 ICAM-l-molekyyliä. Näillä kimeerisillä 30 molekyyleillä saattaa olla useita hyviä puolia. Ensinnäkin Ig-molekyylit on suunniteltu pitkäikäisiksi verenkierrossa, mikä mahdollisesti nostaa biologista puoliintumisaikaa.

Lisäksi näiden rakennettujen molekyylien multimeeriluonne 35 sallii niiden olla vuorovaikutuksessa korkeammalla affiniteetilla nuhaviruksen sekä solupinta-LFA-1:n kanssa, terapiayhteydestä riippuen, jolloin se yhdistelmäproteiini-' 104952 119 määrä, joka on annettava tehokkaan annoksen saamiseksi, laskee voimakkaasti. IgA ja IgM ovat erittäin glykosyloitu-ja molekyylejä, joita normaalisti esiintyy limakalvoerit-teissä esimerkiksi nenässä.

5

Niiden erittäin hydrofiilinen luonne edistää niiden sitomien bakteerien ja viruksien pysymistä limakalvolla, jolloin viimemainittujen kiinnittyminen soluihin sekä epiteelisolu-membraaniesteen läpäisy estyvät. Täten niiden terapeuttinen 10 teho on mahdollisesti kasvanut. IgM ja erityisesti IgA ovat stabiileja limakalvoympäristöissä ja ne voivat nostaa ICAM-1-rakenteiden stabiilisuutta. Jos tällaista funktionaalista ICAM-1-johdannaista annetaan verenkiertoon, tämä mahdollisesti niinikään kasvattaa biologista puoliintumisaikaa. IgA 15 ei kiinnitä komplementtia ja olisi täten ihanteellinen sovellutuksissa, joissa mainittu olisi kohtalokasta. Jos halutaan IgG-H-ketjukimeerejä, voitaisiin mutatoida komplementin kiinnitykseen sekä Fc-reseptorivuorovaikutuksiin osallistuvia alueita.

20 ESIMERKKI 36 ICAM-l-mutanttien muodostus

Oligonukleotidiohiattu mutatointi 25 ICAM-l-cDNA:n koodialue 1,8 ep:n SaiI-Kpnl-fragmentissa alakloonattiin ilmennysvektoriin CDMB (Seed, B., et ai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84 (1987) 3365 - 3369). Kunkelin, T., (Proc.Natl.Acad.Sei. USA 82 (1985) 488 - 492) menetel-30 män ja Stauntonin, D., et ai., (Staunton, D.E., et ai..

Cell 52 (1988) 925 - 933) modifikaatioiden mukaan tämän rakenteen (pCD1.8) avulla muodostettiin yksisäikeinen ura-siilipitoinen templaatti käytettäväksi oligonukleotidiohja-tussa mutatoinnissa.

35

Suupeasti, pCDl.8:11a transformoitiin E. coli -kanta XS127. Yksittäisiä pesäkkeitä kasvatettiin 1 ml:ssa Luria-liemi- 104952 120 (LB-)kasvualustaa (Difco), joka sisälsi 13 mikrogrammaa/ml ampisilliinia ja 8 mikrogrammaa/ml tetrasykliiniä, lähelle kyllästyspistettä. 100 mikrolitraan viljelmää tartutettiin R408-avustajafagi (Stratagene) monikerta- (10) tartutuksena 5 (MOI), minkä jälkeen lisättiin 10 ml LB-kasvualustaa, joka sisälsi ampisilliinia ja tetrasykliiniä, ja kasvatettiin 16 tunnin ajan 37 °C:ssa. Viljelmää sentrifugoitiin 10 000 kierr./min kierrosnopeudella 1 minuutin ajan, minkä jälkeen supernatantti suodatettiin 0,22 mikro-m:n suodattimena ja 10 fagisuspensiolla tartutettiin E. coli -kanta BW313/P3, joka maljoitettiin sitten LB-agar-kasvualusta- (Difco) maljapin-noille, jolloin kasvualus-taa oli täydennetty ampisillii-nilla ja tetrasykliinillä. Pesäkkeet noukittiin ja niitä kasvatettiin 1 ml:ssa LB-kasvualustaa, jossa oli ampisil-15 liinia ja tetrasykliiniä, lähelle kyllästyspistettä, minkä ; jälkeen viljelmiin tartutettiin avustajafagi MOI 10 -tartu- 1 tuksena. Sitten viljelytilavuus nostettiin 250 ml:ksi ja soluja viljeltiin yön yli. Yksisäikeinen DNA eristettiin vakiollisella fagiuutolla.

20

Mutanttioligonukleotidit fosforyloitiin ja niitä käytettiin pCDl.8-templaatin ohella toisen säikeen synteesireaktiossa ( (Staunton, D., et ai.. Cell 52 (1988) 925 - 933) .

·; 25 Trans fektointi COS-soluja siirrostettiin 10 cm:n kudosviljelmämaljoihin ; sellainen määrä, että viljelmä olisi 50-%:isesti yhteenkas- vanut 16 - 24 tunnissa. Sitten COS-solut pestiin kerran ' 30 TBS:llä ja inkuboitiin 4 tunnin ajan 4 ml:11a RPMI:tä, joka 9 sisälsi 10 % seerumia (Collaborative), 5 mikrogrammaa/ml klorokiinia, 3 mikrogrammaa mutanttiplasmidia ja 200 mikro-grammaa DEAE-dekstraanisulfaattia. Sitten solut pestiin 10 % DMSO/PBS:llä ja sen jälkeen PBSrllä, minkä jälkeen 35 niitä viljeltiin 16 tunnin ajan kasvualustassa. Kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla ja ajankohtana 48 tuntia tartutuksesta COS-solut lietettiin trypsiini/EDTA- 104952 121 (Gibco) käsittelyllä ja jaettiin 2, 10 cm:n maljoihin sekä 24 kuopan kudosviljelmälevyille HRV-sitoutumista varten. Ajankohtana 72 tuntia solut otettiin talteen 10 cm:n maljoista käyttäen 5 mM EDTA/HBSS:ää ja niitä käsiteltiin sil-5 mälläpitäen kiinnittämistä LFA-l-päällysteiseen muoviin ja immunofluoresenssimääritystä.

LFA-l:n ia HRV;n sitoutuminen 10 LFA-1 puhdistettiin SKW-3-lysaateista immunoaffiniteetti-kromatografisesti TS2/4-LFA-l-MAb-Sepharose -geelissä ja eluoitiin pH:ssa 11,5 2 mM MgCl2:n ja 1 %:n oktyyligluko-sidia läsnäollessa. LFA-1 (10 mikrogrammaa/200 mikrolit-raa/6 cm:n malja) sidottiin bakteriologisiin petrimaljoihin 15 laimentamalla pitoisuuteen 0,1 % oktyyliglukosidia PBS:ssä (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos), joka sisälsi 2 mM MgCl2, ja inkuboimalla yön yli 4 °C:ssa. Maljat salvattiin l-%:isella BSA-liuoksella (nautaseerumialbumiini-) ja varastoitiin PBS:ssä, joka sisälsi pitoisuudet 2 mM MgCl2, 20 0,2 % BSA:ta, 0,025 % atsidia ja 50 mikrogrammaa/ml genta- mysiiniä.

5lCr-leimattuja COS-soluja PBS:ssä, joka sisälsi 5 % FCS:ää (vasikansikiöseerumia), 2 mM MgCl2, 0,025 % atsidia (pusku-·: 25 ri), inkuboitiin lisäten 5 mikrogrammaa/ml RRl/l:tä ja R6.5:tä, tai mainittua lisäystä suorittamatta, LFA-l-pääl-lysteisillä mikrotiitterilevyillä 25 °C:ssa 1 tunnin ajan. Ei-kiinnittyneet solut poistettiin pesemällä 3 kertaan puskurilla. Kiinnittyneet solut eluoitiin lisäämällä EDTArta 30 pitoisuuteen 10 mM ja suoritettiin gamma-laskenta.

TULOKSET

On tunnistettu ICAM-l-vastaisia vasta-aineita kuten RR1/1, 35 R6.5, LB-2 tai CL203. Jos nämä vasta-aineet kykenevät estä mään ICAM-l-funktion, ne välttämättä kykenevät sitoutumaan johonkin tiettyyn kohtaan ICAM-l-molekyylissä, joka on tär- 104952 122 keä myös ICAM-l-funktiolle. Täten valmistamalla edellä kuvattuja ICÄM-l-deleetiomutantteja ja määrittämällä, missä määrin ICAM-l-vastaiset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan deleetioon, voidaan määrittää, ovatko deletoidut alueet 5 tärkeitä funktiolle.

ICAM-1 on integraalinen membraaniproteiini, jonka solunul-koisen alueen ennustetaan koostuvan viidestä Ig:n kaltaisesta C-alueesta. LFA-l-sitoutumiseen osallistuvien aluei-10 den tunnistamiseksi alue 3 ja alueet 4 ja 5 (karboksyyli-pää) deletoitiin oligonukleotidiohjattua mutatointia käyttäen, minkä jälkeen ne ilmennettiin COS-soluissa ja suoritettiin funktionaalisia kokeita. Lisäksi sytoplasma-alue kokonaisuudessaan deletoitiin sen mahdollisen vaikutuksen 15 ICAM-l-vuorovaikutuksiin todentamiseksi. Kuten ennakoitu sytoplasma-alue deleetio, Y476/*, ei osoittanut RR1/1-, R6.5-, LB-2- ja CL203-reaktiivisuuden menetystä, kun puolestaan alueen 3, F185 - R451, deleetion seurauksena CL203-reaktiivisuus vastaavasti laski (kuvio 20). Täten CL203-20 epitooppi sijaitsee ilmeisesti alueella 4 kun taas RR1/1, R6.5 ja LB-2 vaikuttavat sijaitsevan 2 aminopää-alueella.

Kaikki 3 deleetiomutanttia osoittavat villityypin LFA-1-kiinnitystasoja (kuvio 21). Aminohapposubstituutioita ποιον . 25 dostettiin myös alueiden 1, 2 ja 3 ennakoituihin beeta- käänteisiin, rakenteet ilmennettiin COS-soluissa ja niiden funktionaalisuutta testattiin. R6.5-epitooppi paikannettiin täten sekvenssiin E111GGA alueessa 2, ja siihen saattaa niinikään liittyä E39 alueella 1, kun taas RR1/1 ja LB-2 30 kumpikin ovat riippuvaisia R13:sta alueella 1 (kuvio 22).

«

Lisäksi RRl/l-sitoutumista alentavat mutaatiot sekvenssissä D71GQS. Mutaatioiden seurauksena, jotka eliminoivat N-kyt-kentäglykosylaatiokeskuksia N103:ssa ja N165:ssä, RRl/l:n, R6.5:n ja LB-2:n LFA-l-HRV-sitoutuminen laskee. Nämä mutaa-35 tiot ilmeisesti vaikuttavat prosessointiin siten, että muodostuu ICAM-l-dimeerejä.

104952 123

Muiden mutaatioiden alueilla 2 tai 3 seurauksena LFA-1-kiinnitys ei muuttunut (kuviot 23 ja 24). Alueen 1 aminohapot R13 ja D60 kumpikin osallistuvat LFA-l-sitoutumiseen (kuvio 25).

5 Täten LFA-l:n ja HRV:n sitoutuminen vaikuttaa olevan ICAM-l:n Ig-kaltaisen alueen aminopään funktio. Kuviossa 26 esitetään ICAM-aminopää-alueiden rinnakkainasettelu.

10 Vaikka keksintöä on kuvattu liittyen sen spesifisiin suoritusmuotoihin, tulee huomata, että siihen voidaan tehdä muita modifikaatioita, jolloin tämän hakemuksen tarkoituksena on kattaa keksinnön kaikki muunnokset, käytöt tai sovellutukset, jotka yleensä ottaen noudattavat keksinnön periaat- 15 teitä ja poikkeavat tästä julkaisusta tavalla, joka pysyttelee keksinnön koskeman alan tunnetun tai tavanomaisen käytännön puitteissa ja johon voidaan soveltaa tässä edellä esitettyjä oleellisia ominaispiirteitä oheisten patenttivaatimuksien kattaman alueen puitteissa.

20

Claims (3)

104952

1. Menetelmä ICAM-l:n (solujen välinen kiinnikemolekyylin) liukoisen, funktionaalisen johdoksen valmistamiseksi, joka 5 eroaa ICAM:sta ainakin siinä, että se ei sisällä luonnollisen ICÄM-l:n transmembraanialuetta (kuva 8), joka johdos on liukoinen fysiologisissa olosuhteissa, tunnettu siitä, että viljellään isäntäorganismia, joka on transformoitu ICAM-l:n liukoista, funktionaalista johdosta koodaavalla rekombi-10 nanttivektorilla, joka johdos sisältää ainakin yhden muutetun aminohapporyhmän, tai on sen kemiallinen johdos, dele-toidussa ICAM-l-molekyylissä, olosuhteissa, joissa mainittu johdos ekspressoituu ja erittyy viljelyalustaan, minkä jälkeen johdos eristetään. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ICAM-l:n funktionaaliselta johdokselta puuttuu ICAM-l:n sytoplasminen alue.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ICAM-l:n funktionaaliselta johdokselta puuttuu aminohapporyhmät alueen 1 (kuva 25) tai alueiden 1 ja 2 (kuva 23) tai alueiden 1, 2 ja 3 (kuva 24) jälkeen. • » t 104952