JPH03157397A - 細胞間粘着分子およびその結合性リガンド - Google Patents

細胞間粘着分子およびその結合性リガンド

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JPH03157397A
JPH03157397A JP2065498A JP6549890A JPH03157397A JP H03157397 A JPH03157397 A JP H03157397A JP 2065498 A JP2065498 A JP 2065498A JP 6549890 A JP6549890 A JP 6549890A JP H03157397 A JPH03157397 A JP H03157397A
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Steven D Marlin
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Michael L Dustin
マイケル　ローラン　ダスティン
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/44—Antibodies bound to carriers

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産呈上皮社度分立 本発明はリンパ球の群が細胞基質を認識しそれに付着し
て炎症反応中に炎症部位に浸透し細胞と反応する過程で
含まれるＩ　ＣＡＭ−１のような細胞間粘着分子に関す
る。本発明はさらにそのような細胞間粘着分子に結合し
得るリガント分子、これらリガントのスクリーニングア
ッセイ、および該細胞間粘着分子、該リガント分子およ
び該スクリーニングアッセイの使用に関する。
ｌ米茨玉 白血球はホストをバクテリアまたはウィルスのような外
敵に対して適切に防御するために細胞基質に付着し得な
ければならない。防御システムの優れた見解はＩ！１ｓ
ｅｎ、　Ｈ，Ｗ、により″Ｍｉｃｒｏ−ｂｔｏｌｏｇ第
３版、ペンシルバニア州フィラデルフィア、Ｈａｒｐｅ
　＆　Ｒｏｗｓ社刊、（１９８０）、２９０−２９５お
よび３８１−４１８”において提示されている。
白血球は内皮細胞に結合できて循環系から進行中の炎症
部位に浸透できなければならない。さらにまた、白血球
は抗原提供細胞に付着して正常な特異的免疫応答が起り
得ねばならず、さらに、リンパ球は、適当なターゲット
細胞に付着してウィルス怒染または腫瘍細胞の分解が起
り得ねばならない。
最近、そのような付着の仲介において含まれる白血球表
面分子がハイプリドーマ°技術を用いて同定された。要
するに、ヒトＴ−細胞（Ｄａｖｉｇｎｏｎ、　Ｄ。
等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　７８　：　４５３５−４５３９　　（１９８１）
）とマウスひ臓細胞（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、等、　
ｌ！ｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｗｕｎｏ１、　９−：　３０１
−３０６　（１９７９））に対して向けられた各モノク
ローナル抗体は白血球表面に結合し、上述の付着関連機
能を抑制しているものと同定された（Ｓｐｒｉｎｇａｒ
、？０等、　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４４　：　２６６
０−２６６３　　（１９８５））。これらの抗体により
同定された分子はＭａｃ−１およびリンパ球機能会合抗
原１　　（ＬＦＡ−１）と称される。Ｍａｃ−１はマク
ロファージ、顆粒球および顆粒状リンパ球上に見い出さ
れたヘテロダイマーである。ＬＦＡ−１は大部分のリン
パ球に見い出されるヘテロダイマーである（Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒｔＴ、Ａ、等、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　Ｒｅｖ。
６Ｂ＝１１１−１３５　　（１９８２））、これらの２
つの分子、および第３分子ｐ１５０．９５（これはＭａ
ｃ−１と同様な組織分布を有する）は細胞粘着においで
ある役割を発揮する（Ｋｅｉｚｅｒ、Ｇ、等、Ｂｕｒ、
　　Ｊ、　　ｌｍ５ｕｎｏ１．　１５　　：　　　１　
１　４２−１　１　４７（１９８５））。
上記の白血球分子は糖たん白質の関連群の１員であるこ
とが見い出された（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　
Ｆ。
等、Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１５８　：　１７
８５−１８０３（１９８３）　　　：　Ｋｅｉｚｅｒ、
　　Ｇ、Ｄ、等、Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
。
１５：１１４２−１１４７　　＜１９８５））、この糖
たん白質群は１つのアルファー鎖と１つのベータ鎖を有
するヘテロダイマーからなっている。抗原の各々のアル
ファー鎖は互いに異なるけれども、ベータ鎖は高度に保
護されていることが判明している（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍ
ａｄｒｉｄ、　Ｆ、等、Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ。
Ｍ現：１７８５−１８０３　（１９８３））、ｔｌたん
白質群のベータ鎖（ある場合には“ＣＤ１８”と称す）
は９５ＫＤの分子量を有することが見い出され、一方ア
ルファー鎖は１５０ＫＯ−１８０に口で変化することが
見い出された（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　ｒｏ等。
Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４４　：２６６０−２６６３　
（１９８５））　。
膜たん白質のアルファーサブユニットはベータサブユニ
ットの有する広い相同性を有していないけれども、糖た
ん白質のアルファーサブユニットの近似分析は両者の間
に実質的な類似性があることを示している。ＬＦＡ−１
関連糖たん白質のアルファーおよびベータサブユニット
間の類似性の検討はＳａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｄ、　
Ｆ、等によりなされている（ム」狸肛、匣虹月坦：５８
６−６０２（１９８３）：Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｒｅｄ
、　１８５　：　１７８５−１８０３（１９８３））。
白血球表面上に上記粘着たん白質群のいずれかの１員の
正常量を発現することができない１群の人々が同定され
ている〔＾ｎｄｅｒｓ６ｎ、、　Ｄ、　Ｃ，等、Ｆｅｄ
、　Ｐｒｏｃ、　４４　：２６７１−２６７７　（１９
８５）；＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｄ、Ｃ，等、Ｊ、　Ｉｎ
ｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５２　：　６６８６８９　
（１９８５））。これらの患者からのリンパ球は分子の
ＬＦＡ−１群が抗体により中和されている健常者に類似
するインビボ欠陥を示していた。さらにまた、上記の患
者は、彼らの細胞が細胞基質へ粘着できないために、正
常な免疫応答を測定することができない（Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎ＋　Ｄ、Ｃ，等、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４４　：
２６７１−２６７７　＜１９８５）　；＾ｎｄｅｒｓｏ
ｎｔ　ｎ、ｃ、等、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、
　１５２：　６６８−６８９　（１９８５））。これら
のデータはリンパ球がＬＦＡ−１群の機能的粘着分子の
欠如により正常な形で粘着できない場合に免疫反応が緩
和されることを示している。
即ち、要約すれば、動物の健康および生命力を維持する
リンパ球の能力はリンパ球が他の細胞（内皮細胞のよう
な）に粘着できることを必要とする。この粘着はリンパ
球の細胞表面上に存在する特異的レセプター分子を含む
細胞−細胞接触を必要とすることが判明している。これ
らのレセプターはリンパ球が他のリンパ球または内皮お
よび他の非血管細胞に粘着することを可能する。細胞表
面レセプター分子は相互に高度に関連することが判明し
ている。リンパ球が上記の細胞表面レセプター分子を欠
損しているヒトは慢性で再発性の感染症、および欠陥抗
体応答を含む他の臨床的症状を示す。
リンパ球粘着は外来Ｍｉ織が認識され拒絶される過程で
起るので、この過程の理解が臓器移植、組織移植、アレ
ルギーおよび腫瘍学の分野において著しく価値がある。
又里少血産 本発明は細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）およびそ
の官能性誘導体に関する。本発明はさらにＩＣＡＭ−１
の機能を抑制し得る抗体および抗体フラグメント、およ
びＩ　ＣＡＭ−１機能に対する他のインヒビター、並び
にそのようなインヒビターを同定し得るアッセイに関す
る０本発明はさらに上記分子すべての診断および治療上
の用途に関する。
さらに詳細には、本発明は実質的に天然不純物を含まな
い細胞間粘着分子Ｉ　ＣＡＭ−１またはその官能性誘導
体を包含する０本発明はさらにリンパ球表面に存在する
分子に結合し得るそのような分子に関する。
本発明はさらに検出可能に標識した細胞間粘着分子Ｉ　
ＣＡＭ−１およびその誘導体に関する。
本発明はさらにＩ　ＣＡＭ−１またはその官能性誘導体
を発現し得る組換えＤＮＡ分子を包含する。
本発明はまた次の各工程を含む実質的に純粋な形でＩ　
ＣＡＭ−１を回収する方法を包含する：（ａ）　　ＩＣ
ＡＭ−１を発現する細胞膜からＩＣＡＭ−１を可溶化し
て、可溶化Ｉ　ＣＡＭ−１調製物を調製すること、 （ｂ）　　上記可溶化Ｉ　ＣＡＭ−１調製物をＩ　ＣＡ
Ｍ−１に結合し得る抗体を含有するアフィニティマトリ
ックスに導入すること、 （Ｃ）　　ＩＣＡＭ−１を上記アフィニティマトリック
スの抗体に結合させること、 （ｄ）　　上記マトリックスから抗体に結合し得ないす
べての化合物を除去すること、および （ｅ）　　ＩＣＡＭ−１を上記マトリックスから溶出さ
せることによりＩ　ＣＡＭ−１を実質的に純粋な形で回
収すること。
本発明はさらにＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能
性誘導体からなる群から選ばれた分子に結合し得る抗体
を包含する０本発明はまたそのような抗体を産生じ得る
ハイブリドーマ細胞を包含する。
本発明はさらにモノクローナル抗体Ｒｂ　　５−り、を
産生じ得るハイブリドーマ細胞を包含する。
本発明は、さらに、次の工程を含む、ＩＣＡＭ−１に結
合し得る抗体を産生ずる所望のハイブリドーマ細胞の産
生方法も包含する。
ｆａ）　　動物をＩ　ＣＡＭ−１を発現する細胞で免疫
すること、 （ｂ）　　上記動物のひ臓細胞をミエローマ細胞系と融
合させること、 ｔｃ＞　　融合させたひ臓およびミエローマ細胞から抗
体分泌性ハイブリドーマ細胞を調製すること、および （ｄｌ　　ハイブリドーマ細胞を所望のＩＣＡＭ−１結
合性抗体を産生し得るハイブリドーマ細胞にスクリーニ
ングすること。
本発明はまた上記方法で取得したハイブリドーマ細胞お
よびそのハイブリドーマ細胞から産生させた抗体も包含
する。
本発明はまた細胞間粘着の非免疫グロプリンアンタゴニ
ストの同定方法にも関し、その方法は次の工程よりなる
： ｆａ）　　細胞間粘着のアンタゴニストであり得る非免
疫グロブリン剤を凝集可能な複数の細胞を含有するリン
パ球調製物とインキュベートすること；および （′ｂ）上記リンパ球調製物を検査して上記非免疫グロ
ブリン剤の存在がリンパ球調製物の細胞凝集を抑制する
かどうかを測定すること；凝集抑制が上記非免疫グロブ
リン剤を細胞間粘着のアンタゴニストとして同定するこ
と。
本発明はまた哺乳動物の特異的防御システムの応答に由
来する炎症を治療する方法にも関し、その方法はそのよ
うな治療の必要な対象物に上記炎症を抑制するのに十分
な量の抗炎症側を与えることを含み、かつこの抗炎症剤
はＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体、Ｉ　ＣＡＭ−１に
結合し得る抗体のフラグメント、Ｉ　ＣＡＭ−１、Ｉ　
ＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩ　ＣＡＭ−１の非
免疫グロプリンアンタゴニストからなる群より選ばれる
。
本発明はさらにＩ　ＣＡＭ−１の非免疫グロプリンアン
タゴニストがＬＦＡ−１以外のＩ　ＣＡＭ−１の非免疫
グロプリンアンタゴニストである上述の炎症治療方法を
包含する。
本発明はまた浸透にＬＦＡ−１群の官能性−員を必要と
する造血腫瘍細胞の転移を抑制する方法にも関し、この
方法はそのような治療を必要とする患者に上記の転移を
抑制するのに十分な量の抗炎症剤を与えることを含み、
かつこの抗炎症剤はＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体、
Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体のフラグメント、Ｉ　
ＣＡＭ−１、Ｉ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩ
　ＣＡＭ−１の非免疫グロプリンアンタゴニストからな
る群より選ばれる。
本発明はさらにＩ　ＣＡＭ−１の非免疫グロプリンアン
タゴニストがＬＦＡ−１以外のＩ　ＣＡＭ−１の非免疫
グロプリンアンタゴニストである上記造血腫瘍細胞の転
移を抑制する方法も包含する。
本発明はまたＩＣＡＭ−１発現腫瘍細胞の成長を抑制す
る方法も包含し、その方法はそのような治療を必要とす
る患者に上記成長を抑制するのに十分な量の毒素を与え
ることを含み、この毒素はＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る
毒素由来抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る毒素由来抗体
フラグメント、ＬＦＡ−１群分子の毒素由来１員、およ
びＬＦＡ−１群分子の１真の毒素由来官能性誘導体から
なる群から選ばれる。
本発明はまたＬＦＡ−１発現性腫瘍細胞の成長を抑制す
る方法にも関し、その方法はそのような治療を必要とす
る患者にかかる成長を抑制するのに十分な量の毒素を与
えることを含み、この毒素は毒素由来Ｉ　ＣＡＭ−１お
よびＩ　ＣＡＭ−１の毒素由来官能性誘導体からなる群
から選ばれる。
本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体
の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位置
を診断する方法に関し、その方法は、 （ａ）　　上記の対象体にＩ　ＣＡＭ−１を発現する細
胞を同定し得為検出可能に標識した結合性リガントを含
有する組成物を投与すること、および山）　上記結合性
リガントを検出すること、を含む。
本発明はさらに炎症を有する懸念のある哺乳動物対象体
の特異的防御系の応答に由来する炎症の存在および位置
を診断する方法に関し、その方法は、 （ａ）　　上記対象体の組織のサンプルをＩ　ＣＡＭ−
１を発現する細胞を同定し得る検出可能に標識した結合
性リガントを含有する組成物とインキユベートすること
、および （ｂ）　　上記結合性リガントを検出すること、を含む
。
本発明はまたＩ　ＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸
念のある哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および
位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａ）　　上記対象体にＩＣＡＭ−１に結合し得る検出
可能に標識した結合性リガントを含有する組成物を投与
すること、このリガントは抗体およびＩ　ＣＡＭ−１に
結合し得る抗体フラグメントからなる群より選ばれるこ
と、および 伽）　上記結合性リガントを検出すること、を含む。
本発明はまたＩ　ＣＡＭ−１発現性腫瘍細胞を有する懸
念のある哺乳動物対象体のそのような細胞の存在および
位置を診断する方法にも関し、その方法は （ａ）　　上記対象体の組織のサンプルをＩ　ＣＡＭ−
１に結合し得る検出可能に標識した結合性リガントを含
有する組成物とインキユベートすること、このリガント
が抗体およびＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメ
ントからなる群より選ばれること、および （ｂ）　　上記結合性リガントを検出すること、を含む
。
本発明はまたＬＦＡ−１群分子の工員を発現する腫瘍細
胞を有する懸念のある対象体のそのような細胞の存在お
よび位置を診断する方法にも間し、その方法は、 （ａ）　　上記対象体にＬＦＡ−１群分子の１具に結合
し得る検出可能に標識した結合性リガントを含有する組
成物を投与すること、このリガントはＩ　ＣＡＭ−１お
よびＩ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体からなる群より選ば
れること、および山）　上記結合性リガントを検出する
こと、を含む。
本発明はまたＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細
胞を有する懸念のある対象体のそのような細胞の存在お
よび位置を診断する方法にも関し、その方法は、 （ａｌ　　上記対象体の組織のサンプルを分子のＬＦＡ
−１群の１員に結合し得る検出可能に標識した結合性リ
ガントの存在下にインキユベートすること、このリガン
トはＩ　ＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の官能性誘導体
からなる群より選ばれること、および （ｂ）　　上記組織サンプル中に存在する分子のＬＦＡ
−１群の７真に結合している上記結合性リガントを検出
すること、 を含む。
本発明は、さらに、 （ａｌ　　ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−
１に結合し得る抗体のフラグメント、ＩＣＡＭ−Ｌ　　
ＩＣＡＭ−１の官能性フラグメント、およびＩ　ＣＡＭ
−１の非免疫グロプリンアンタゴニストからなる群より
選ばれた抗炎症剤、および （ｂ）　　デクサメセソン、アゼチオビリンおよびシク
ロスポリンＡから選ばれた少なくとも１つの免疫抑制剤 を含む製薬組成物も包含する。
死棗旦と大豆…盪 本発明の１つの局面はＬＦＡ−１に対しての天然結合性
リガントの発見に関する。ＬＦＡ−１群分子のような分
子は、ｌｌｌ１ｔ２１間粘着の過程に含まれており、“
粘着分子“と称されている。
本発明の天然結合性リガントは“細胞間粘着分子−１（
Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ
１ｅｃｕｌｅ−１）　”または“Ｉ　ＣＡＭ−１”と表
示される。ｒｃＡＭ−１は７６−９７ｋｄの糖たん白質
である。　ＩＣＡＭ−１はヘテロダイマーではない０本
発明はＩＣＡＭ−１およびその“官能性誘導体”に関す
る。（ＣＡ？！−１の１官能性誘導体”はＩ　ＣＡＭ−
１の生物学的活性に実質的に同様な生物学的活性（機能
的または構造的に）を有する化合物である。“官能性誘
導体”なる用語は分子の“フラグメント”“変異体”同
族体”または“化学誘導体”を包含するものとする。Ｉ
　ＣＡＭ−１のような分子の“フラグメント”は分子の
任意のポリペプチドサブセットを意味する。ＩＣＡＭ−
１活性を有しかつ可溶性（即ち、膜結合していない）で
あるＩ　ＣＡＭ−１のフラグメントは特に好ましい。
Ｉ　ＣＡＭ−１のような分子の“変異体″とは全分子ま
たはそのフラグメントと構造上または機能上実質的に同
様である分子を称する。分子は他の分子と両分子が実質
的に同様な構造を有するかあるいは両分子が同様に生物
学的活性を有する場合に“実質的に同様”と称される。
即ち、２つの分子が同様な活性を有する場合、これらの
分子は変異体であるとみなされ、該用語は本明細書にお
いて分子の１つの構造が他の分子中に見い出されない場
合あるいはアミノ酸残基配列が同じでない場合でも使用
される。Ｉ　ＣＡＭ−１のような分子の“アナログ、つ
まり“同族体”とは分子全体またはそのフラグメントに
対し機能上実質的に同様である分子を称する。本明細書
で使用するとき、分子が通常分子の１部でない追加の化
学的成分を含む場合、その分子は他の分子の“化学的誘
導体”であると称する。そのような成分は分子の溶解性
、吸収性、生物学的半減期等を改善し得る。これらの成
分はまた分子の毒性を低減させ、分子の望ましくない副
作用等を消去または減衰させる。そのような作用を緩和
させ得る成分は“Ｒｅｍ１…旦〔シＰｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８０）　　”に
記載されている。“毒素由来”分子は“化学誘導体”の
特別のクラスを構成している。“毒素由来゛分子は毒素
成分を有する分子（ＩＣＡＭ−１または抗体のような）
である。そのような分子の細胞への結合は細胞の極く近
くに毒素成分を運びそれによって細胞死を促進する。任
意の適当な毒素成分を使用できるが、例えば、リシン毒
素、ジフテリア毒素、ラジオアイソトープ毒素、膜−チ
ャンネル形成性毒素等の毒素を用いることが好ましい。
そのような成分を分子に結合させる方法は当該技術にお
いて周知である。
Ｉ　ＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群分子の１員のような
抗原性分、子はリンパ球表面に天然に発現している。即
ち、そのような細胞の適当な動物への腹腔内注射等によ
るような導入はＩ　ＣＡＭ−１またはＬ　Ｆ　Ａ　−’
　１群分子の１員に結合し得る抗体の産生をもたらすで
あろう。場合によっては、そのような動物の血清を取り
出しこれら分子に結合し得るポリクローナル抗体の原料
として使用することもできる。しかしながら、好ましい
のはそのような動物からひ臓球（ｓｐｌｅｎｏ　ｃｙｔ
ｅｓ）を取り出し、かかるひ臓細胞をミエローマ細胞系
と融合させ、得られた融合細胞からＩ　ＣＡＭ−１また
はＬＦＡ−１群分子の１具に結合し得るモノクローナル
抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を確立することであ
る。
上記の方法で得たハイブリドーマ細胞はＩＣＡＭ　−１
またはＬＦＡ−１群分子の一員のいずれかに結合し得る
抗体を産生ずる所望のハイブリドーマ細胞を同定する種
々の方法によってスクリーニングできる。１つの好まし
いスクリーニングアッセイにおいては、そのような分子
はそのニブスティン−パールウィルス形質転換細胞の凝
集を抑制する能力によって同定される。そのような凝集
を抑制し得る抗体をさらにスクリーニングしてこれら抗
体がそのような凝集をＩＣＡＭ−１またはＬＦＡ−１群
分子の一員への結合によって抑制したかどうかを決定す
る。Ｉ　ＣＡＭ−１をＬＦＡ−１群分子から区別できる
任意の手段をそのようなスクリーニングに用いることが
できる。例えば、抗体と結合した抗原は免疫沈降および
ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるようにして分析
できる。結合抗原がＬＦＡｉ群の分子の一員である場合
には、免疫沈降した抗原がダイマーとして見い出される
であろうし、一方、結合抗原がＩ　ＣＡＭ−１である場
合には、単一分子量種が免疫沈降して来るであろう。ま
た、ＬＦＡ−１群分子の１貝に結合する抗体はＩ　ＣＡ
Ｍ−１に結合する抗体からＬＦＡ−１を発現するがＩ　
ＣＡＭ−１は発現しない顆粒球のような細胞に結合する
抗体の能力をスクリーニングすることによっても区別で
きる。顆粒球に結合する抗体（ＩＩＩ胞凝集を抑制する
ことが知られている）の能力はその抗体がＬＦＡ−１に
結合し得ることを示す。そのような結合のない場合はＩ
　ＣＡＭ−１を認識し得る抗体を示唆し得る。
顆粒球のような細胞に結合する抗体の能力は通常の熟練
者により普通に用いられる方法によっても検出し得る。
そのような方法にはイムノアッセイ、細胞凝集、フィル
ター結合試験、抗体沈降等がある。
本発明の抗凝集抗体はまたそのＩ　ＣＡＭ−１を発現す
る細胞（活性化内皮細胞のような）に特異的に結合する
能力およびそのＩ　ＣＡＭ−１を発現しない細胞に結合
し得ない能力を測定することによっても同定し得る。当
業者によって容易に理解されるように、上記の各アッセ
イは修正して即ち、異なる順序で行って種々の可能性あ
るスクリーニングアッセイを提供でき、これらアッセイ
の各々はＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体とＬＦＡ−１
群分子の１員との間で同定および区別化を行い得るもの
である。
本発明の抗炎症剤は、天然方法（例えば、動物、植物、
真菌、バクテリア等をＩ　ＣＡＭ−１の非免疫グロプリ
ンアンタゴニストを産生ずるよう誘導することによっで
あるいは動物をＩ　ＣＡＭ−１に結合し得るポリクロー
ナル抗体を産生ずるよう誘導することによるような）に
より、合成方法〔例えば、ポリペプチド合成用のメリフ
ィールド法を用いてＩ　ＣＡＭ−１、Ｉ　ＣＡＭ−１の
官能性誘導体またはＩＣＡＭ−１のたん白質アンタゴニ
スト（免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンのいずれ
か）を合成することによるような）により、ハイブリド
ーマ技術（例えば、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノク
ローナル抗体を産生させるような）により、または組換
え技術〔例えば、本発明の抗炎症剤を種々の宿主（例え
ば、酵母、バクテリア、真菌、培養動物細胞等）中で、
あるいは組換えべクターまたはウィルスベクターから産
生させるような〕により得ることができる。用いる方法
の選択は便宜さ、所望の収率等のファクターによる。
上記の方法、手法または技術の１つのみを用いて特定の
抗炎症剤を産生させる必要はなく、上記の方法、手法お
よび技術は組合せて特定の抗炎症剤を得てもよい。
１、　　ＬＦＡ−１依存凝集のアッセイ多くのエプスタ
イン−バール・シイルス形質転換細胞は凝集を示す。こ
の凝集はホルボールエステルの存在下で促進できる。そ
のような同型（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ）の凝集（即ち、１
種のみの細胞種を含む凝集）は抗ＬＦＡ−１抗体によっ
てブロックされることが見い出された〔Ｒｏｔｈｌｅｉ
ｎ、Ｒ。
等、Ｊ、Ｅｘｅｒ、Ｍｅｓ、１６３：１１３２−１１４
９（１９８６）　　、該文献は参考として本明細書に引
用する〕。即ち、ＬＦＡ−１依存性結合の度合は自発性
またはホルボールエステル依存性凝集形成の度合を評価
することによって決定できる。
ＬＦＡ−１依存性凝集を干渉する試剤は該試剤がエプス
タイン−バールウィルス形質転換細胞の自発またはホル
ボールエステル依存のいずれの凝集を抑制するかどうか
を測定し得るアッセイを用いることによって同定できる
。殆んどのエプスタイン−バールウィルス形質転換細胞
はこれら細胞がＬＦＡ−ルセブター分子を発現し得る限
りそのようなアッセイに用い得る。
そのような細胞は”　ＳｐｒｉｎｇｅｒｔＴ、Ａ、等、
ム」狂肛。
Ｍｅｄ、１６０　　：１９０１−１９１８　（１９８４
）”の方法によって調製できる。該文献は参考として本
明細書に引用する。任意のそのような細胞を本発明のＬ
ＦＡ−１依存性結合アッセイにおいて使用できるけれど
も、好ましいのはＪＹ＠胞系の細胞を使用することであ
る（Ｔｅｒｈｏｓｔ、Ｃ。
Ｔｏ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｔ
、　ＵＳＡ＋　　７３　：９１０（１９７＆））。これ
らの細胞は任意の適当な培養培地で培養できるが、最も
好ましいのは１０％ウシ胎児血清および５０μｇ／ａ＋
４’のゲンタマイシン（ギブコラボラトリーズ社、ニュ
ーヨーク）を加えたＲＭＰ　Ｉ　１６４０培地中で細胞
を培養することである。これらの細胞は動物細胞増殖に
適する条件（！ｐち、一般に３７°Ｃの温度で、５％Ｃ
Ｏｚの雰囲気中で、９５％の相対湿度にてなど）下で培
養すべきである。
２、　　ＩＣＡＭ−１へのＬＦＡ−１の結合リンパ球が
ＬＦＡ−ルセブター分子の群を欠損するヒト個人は同定
されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　。
Ｄ、Ｃ，等、Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４４　：　２６７
１−２６７７（１９８５）　　；Ａｎｄｅｒｓｏｎ＋　
Ｄ、Ｃ，等、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｄｉｓ、１５２　：　６６Ｂ−６８９（１９８５））。
そのような人は白血球粘着欠損症（ＬＡＤ）をこうむる
と云われている。そのような人のＥＢＶ形買転換細胞は
上述の凝集アッセイにおいて自発またはホルボールエス
テル存在下のいずれにおいても凝集しない。そのような
細胞をＬＦＡ＝１発現性細胞と混合したときは、凝集が
観察される［Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等、Ｊ、　　Ｅ
ｘｐｅｒ、　！Ｊｅｄ、　　１６３１１３２−１１４９
　　（１９８６）〕　（第１図）。
重要なことは、これら凝集はこれらの細胞を抗ＬＦＡ−
１抗体の存在下でインキュベートした場合には形成され
なかったことである。即ち、凝集はＬＦＡ−１を必要と
したが、ＬＦＡ−１欠損細胞のＬＦＡ−１含有細胞によ
る凝集形成能力はＬＦＡ−１結合パートナーはＬＦＡ−
１ではなくむしろ従来未発見の細胞間粘着分子であった
ことを示唆していた。第１図は細胞間粘着のメカニズム
ヲ示ス。
Ｂ、細胞間粘着分子−１（ＩＣＡ〜１−１）新規な細胞
間粘着分子ＩＣＡＭ−１は’Ｒｏｔｈｌｅｉｎ。
Ｒ９等の手順ＣＪ、　１ｍｍｕｎｏ１、　　１３７　：
　１２７０−１２７４（１９８６）、該文献は参考とし
て本明細書に引用する）によって最初同定された部分的
に特徴付された。Ｉ　ＣＡＭ−１分子を検出するために
、モノクローナル抗体をＬＦＡ−１発現が遺伝的に欠損
しているヒトの細胞で免疫したマウスのひ臓細胞から調
製した。得られた抗体をそのＬＦＡ−１発現細胞の凝集
を抑制する能力についてスクリーニングした（第２図）
。詳細には、Ｉ　ＣＡＭ−１分子マウスをＬＦＡ−１抗
原を発現しないＬＡＤ患者からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞
で免疫した。これら動物からのひ臓細胞を取り出し、ミ
エローマ細胞と融合させてモノクローナル抗体産生性ハ
イブリドーマ細胞になるようにした。次に、ＬＦＡ−１
を発現する正常人からのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を上記ハ
イブリドーマ細胞のモノクローナル抗体の存在下でイン
キュベートしてＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のホルボールエス
テル媒介、ｔ、ＦＡ−Ｈ＆存、自発性凝集を抑制し得る
任意のモノクローナル抗体を同定した。上記のハイブリ
ドーマ細胞はＬＦＡ−１抗原を全く含まない細胞から誘
導したので、ＬＦＡ−１に対するモノクローナル抗体は
産生されなかった。従って、凝集を抑制することが判っ
た抗体はいずれも、ＬＦＡ−ＬではないけれどもＬＦＡ
−１粘着過程にかかわっていた抗原に結合し得るもので
なければならない。そのようなモノクローナル抗体を取
得する方法は任意の方法を使用できるけれども、好まし
いのはＢＡＬＢ／ＣマウスをＲｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，
等（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　１３７　：１２７０−１
２７４　（１９８６））により開示された経路およびス
ケジュールを用いてＬＦＡ−１欠損者からのエプスタイ
ン−パールウィルス形質転換末梢血単核細胞でもって免
疫することによってＩ　ＣＡＭ−１結合性モノクローナ
ル抗体を得ることである。そのような細胞はＳｐｒｉｎ
ｇｅｒ、　Ｔ、　Ａ。
等により開示されているり、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ、
　１６０　：１９０１−１９１８　　（１９８４））。
Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体の産生および検出のた
めの好ましい方法においては、マウスはＩ　ＣＡＭ−１
およびＬＦＡ−１の両方を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細
胞によりあるいはより好ましくはＩ　ＣＡＭ−１を発現
するがＬＦＡ−１を発現しないＴＮＦ活性化内皮細胞に
より免疫する。抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体を産生ずるハイブ
リドーマ細胞を調製する最も好ましい方法においては、
Ｂａ１ｂ／ＣマウスをＪＹ細胞および特異化Ｕ９３７細
胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３）により順次免疫する。
そのような動物からのひ臓細胞を取り出しミエローマ細
胞と融合させ抗体産生性ハイブリドーマ細胞に発展させ
る。得られた抗体をそのＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１
の両方を発現するＪＹ細胞のようなＥＢＶ形質転換細胞
系のＬＦＡ−１依存、ホルボールエステル誘起凝集を抑
制する能力についてスクリーニングする。Ｒｏｔｈｌｅ
ｉｎ、　Ｒ，等（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３７　
：　１２７０−１２７４（１９８７））により開示され
ているように、そのような凝集を抑制し得る抗体をＳＫ
Ｗ。
（Ｄｕｓｔｉｎ、　Ｍ、等、Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅ
ｄ、　１６５　：　６７２−６９２　（１９８７）　、
そのホルボールエステルの存在下で自発的に凝集する能
力はＬＦＡ−１に結合し得る抗体によっては抑制される
が抗ＩＣＡＭ　−１抗体によっては抑制されない〕のよ
うな細胞系のホルボールエステル誘起凝集を抑制する能
力について試験する。ＪＹ細胞のような細胞のホルボー
ルエステル誘起凝集を抑制し得るがＳＫＷ、のような細
胞のホルボールエステル誘起凝集を抑制し得ない抗体は
恐らく抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体である。
また、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体は、ＬＦＡ発現
性細胞（ＪＹ細胞のような）のＬＦＡ−１依存性凝集を
抑制し得るがＬＦＡ−１を発現するがＩ　ＣＡＭ−１を
殆んどまたは全く発現しない細胞（正常顆粒球のような
）に結合し得ない抗体あるいはＩＣＡＭ−１を発現する
がＬＦＡ−１を発現しない細胞・（ＴＮＦ活性化内皮細
胞のような）に結合し得る抗体のスクリーニングによっ
ても同定し得る。別の方法は、Ｉ　ＣＡＭ−１、Ｌ、Ｆ
Ａ−１または両方を発現する細胞から、ＪＹ＠胞のよう
な細胞のＬＦＡ−１依存性凝集を抑制する抗体を用いて
免疫沈降させ、５ＤＳ−ＰＡＧＥあるいは等価の方法に
より抗体により沈降した分子のいくつかの分子特性を測
定することである。その特性がＩ　ＣＡＭ−１の特性と
同じであるならば、その抗体は抗Ｉ　ＣＡＭ−１−抗体
であるとみなし得る。
上述の方法で調製したモノクローナル抗体を用いて、Ｉ
　ＣＡＭ−１細胞表面分子を精製し特性付した。Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１はヒト細胞またはＭｉ織からモノクローナル抗
体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した
。そのような方法においては、Ｉ　ＣＡＭ−１と反応性
のモノクローナル抗体を不活性カラムマトリックスに結
合させる。そのような結合を行う任意の方法を使用でき
るが、好ましいのは０ｅｔｔｈｅｎ、　Ｈ，Ｃ，等、Ｊ
、　Ｂｉｏ１、　Ｃｈｅｗ。
２５９　：　１２０３４　（１９８４）　　”の方法を
用いることである。細胞溶解物を上記マトリックスに通
したとき、存在するＩ　ＣＡＭ−１分子はマトリックス
に吸着され保持される。カラムのｐＨまたはイオン濃度
を変えることにより、結合したＩＣＡＭ　−１分子はカ
ラムから溶出し得る。任意の適当なマトリックスを使用
できるけれども、好ましいのはマトリックス材料として
セファローズ（ファルマシア）を用いることである。カ
ラムマトリックスの作製およびそのたん白質精製での使
用は当該技術において周知である。
当業者によって理解された方法において、上述のアッセ
イ法を用いて細胞粘着の速度または程度を減衰しあるい
は抑制し得る化合物を同定することができる。
１、ＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、ある種
の他の上皮細胞、および繊維芽球のような非造血細胞上
並びに組織マクロファージ、マイトジェン刺激Ｔリンパ
芽球、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、リ
ンパ節、およびバイエル板のような造血細胞上に発現し
た細胞表面糖たん白質である。Ｉ　ＣＡＭ−１はリンパ
節および反応性増殖を示すへん桃腺内のＴ細胞領域の血
管内皮細胞状に高度に発現される。Ｉ　ＣＡＭ−１は末
梢血リンパ球上に少量発現される。ある骨ずい単球細胞
系のホルボールエステル刺激特異化はＩ　ＣＡＭ−１発
現を大きく増大させる。即ち、Ｉ　ＣＡＭ−１は炎症部
位に優先的に発現され静止状態の細胞には一般に発現さ
れない。皮ふ繊維芽球上のＩＣＡＭ−１発現は１０μ／
ｍβのレベルのインターロイキン１またはガンアーイン
ターフェロンによりそれぞれ４時間または１０時間以上
で３倍〜５倍増大する。その誘発はたん白質およびｍＲ
ＮＡ合成に依存し可逆的である。
ＩＣＡＭ−１は繊維芽球上での９７Ｋｄ、骨ずい単球細
胞系上での１１４にｄｌおよびＢ’Ｊンパ芽球細胞ＪＹ
上での９０Ｋｄの分子量を有する異なる細胞種での分子
量異種抗原性を示す。ＩＣＡＭ−１生合成は約７３Ｋｄ
の細胞間プレカーサーを含むことが判っている。ツニカ
マイシン処理（グリコジル化を抑制する）から得られる
非−Ｎ−グリコジル化形は分子量５５Ｋｄを有する。
ホルボールエステル刺激Ｕ９３７細胞からあるいは繊維
芽球細胞から単離したＩＣＡＭ−１は化学説グリコジル
化後６０にｄの分子量を有する同一の主要生成物を与え
る。ＩＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体はプイトヘマグル
チニン芽球のＬＦＡ−１欠損細胞系への粘着を干渉する
。Ｉｌｌｌｌ法（リンパ球でない）のＩＣＡＭ−１に結
合したモノクローナル抗体による前処理はリンパ球−繊
維芽球粘着を抑制する。リンパ球のＬＦＡ−１に対する
抗体による前処理（繊維芽球は行なわない）もリンパ球
−繊維芽球粘着を抑制することが見い出されている。
従って、Ｉ　ＣＡＭ−１は白血球上のＣＤ１８？ｊ！合
体の結合性リガントである。Ｉ　ＣＡＭ−１はＩ　Ｌ−
Ｌガンマ−インターフェロンおよび腫瘍壊死因子のよう
な炎症メデイエータ−によりインヒドロで繊維芽球およ
び内皮細胞上にインビボでの炎症領域中へのリンパ球の
浸潤と時間枠的に一致して誘起可能である（Ｄｕｓｔｉ
ｎ、　Ｍ、　Ｌ、等、ム１８９６、（１９８６））。さ
らに、Ｉ　ＣＡＭ−１は血管内皮細胞、胸腺上皮細胞、
他の上皮細胞および繊維芽球のような非造血細胞上にま
た組織マクロファージ、マイトジェン刺激Ｔリンパ芽球
、へん桃腺内の胚中心Ｂ細胞および樹枝状細胞、リンパ
節およびバイエル板のような造血細胞上にも発現される
（Ｄｕｓｔｔｎ、　Ｍ、　Ｌ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ。
１３７：２４５−２５４、　（１９８６））　　。
ｒ　ＣＡＭ−１はアレルギー性湿疹、扁平苔唐、発疹、
じんま疹および水涸性疾患のような良性炎症のケラナノ
サイト上にも発現される。アレルギー性である患者の皮
ふへのハブテンの適用により誘発させたアレルギー性成
ふ反応もケラナノサイト上に多量のＩ　ＣＡＭ−１発現
を生じた。これに対して、皮ふ上の有毒パッチはケラナ
ノサイト上にＩ　ＣＡＭ−１発現を生じなかった。Ｉ　
ＣＡＭ−１は種々の皮ふ掌上の不整からの皮ふ傷害の生
検がらのケラナノサイト上に存在し、Ｉ　ＣＡＭ−１発
現はアレルギーパンチ試験からの傷害において誘発され
たが、毒性パッチ試験傷害からのケラチノサイトはＩ　
ＣＡＭ−１を発現しなかった。
Ｉ　ＣＡＭ−１は、従って、リンパ球が付着できる細胞
基質であり、その結果、リンパ球は炎症部位に浸透し得
および／またはこの炎症に貢献する各種のエフェクター
機能を伝達し得る。そのような機能には抗体の産生、ウ
ィルス感染ターゲット細胞の溶解等がある。本明細書で
使用する“炎症”なる用語は特異的または非特異的防御
系の反応を含むことを意味する。“特異的防御系”なる
用語は特異的抗原の存在と反応する免疫系の成分を称す
るものとする。炎症は、特異的防御系の反応によって引
き起され、媒介されあるいはそれに伴う場合には、特異
的防御系の応答に由来するものといわれている。特異的
防御系の応答に由来する炎症の例には風疹ウィルス、自
己免疫疾患、Ｔ細胞によって仲介された遅延型過敏症（
例えば、Ｍａｎｔａｕｘ試験で“陽性１となる患者にお
けるような）、乾唐等がある。
“非特異的防御系反応”は免疫記憶のできない白血球に
より媒介される応答である。そのような細胞には顆粒球
およびマクロファージがある。本明細書で使用するとき
、炎症は、その炎症が非特異的防御系の反応によって引
き起され、仲介されあるいはその反応に伴う場合には、
非特異的防御系の応答に由来するものといわれる。少な
くとも１部が非特異的防御系に由来する炎症の例には、
喘息、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）または敗血症も
しくは外傷の副次的な重複器官損症群、心筋または他の
組織の再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　）　ｔｊｉ傷
、急性糸球体腎炎、反応性関節炎、急性炎症成分による
皮ふ炎、急性化温性髄膜炎または他の中枢神経系炎症疾
患、熱傷、血液透析、ロイカフニレシス（ｌｅｕｋａｐ
ｈｅｒｅｓｉｓ　）　、潰瘍性大腸炎、クローン病、壊
死性全腸炎、顆粒球輸血関連症候群、およびサイトカイ
ン誘起毒性のような状態に伴う炎症がある。
本発明によれば、Ｉ　ＣＡＭ−１官能性誘導体、特に、
ドメイン１．２および３を有するＩ　ＣＡＭ−１のフラ
グメントまたは突然変異体を含むような誘導体を上記の
ような非特異的防御系反身の処置または治療において使
用できる。そのような処置または治療においてより好ま
しいのはＩＣＡＭ−１のドメイン２を含有するＩ　ＣＡ
Ｍ−１７ラグメントまたは突然変異体である。そのよう
な処置または治療において最も好ましいのはＩＣＡＭ−
１のドメイン１を含有するＩ　ＣＡＭ−１フラグメント
または突然変異体である。
Ｃ，ＩＣＡＭ−１のクローニング 任意の多くの方法を用いてＩ　ＣＡＭ−１遺伝子をクロ
ーニングできる。そのような方法の１つはＩ　ＣＡＭ−
１遺伝子を含有する挿入物の存在についてｃＤＮＡ挿入
物のシャトルベクターライブラリー（ＩＣＡＭ発現性細
胞由来の）を分析することである。そのような分析は細
胞を上記ベクターで移入し次いでＩ　ＣＡＭ−１発現に
ついてアッセイすることによって実施できる。この遺伝
子をクローニングする好ましい方法はＩ　ＣＡＭ−１分
子のアミノ酸配列を決定することが含まれる。これを行
うには、Ｉ　ＣＡＭ−またん白質を精製して自動化シー
クエネーターにより分析できる。また、分子は臭化シア
ンによりあるいはパパイン、キモトリプシンまたはトリ
プシンのようなプロテアーゼによるようにして分解でき
る（Ｏｔｋｅ、　Ｙｌ等、ムＢｉｏ１．Ｃｈｅｍ、２５
７：９７５１　　９７５Ｂ（１９８２）　　；Ｌｉｕ、
　Ｃ，等、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ。
ＰｒｏｔｅｉｎＲｅｓ、２１　：　２０９　２１５　　
（１９８３）　）。
Ｉ　ＣＡＭ−１の全アミノ酸配列を決定できるけれども
、好ましいのは分子のペプチドフラグメントの配列を決
定することである。ペプチドがｌＯケのアミノ酸より長
い場合、その配列情報は一般にＩ　ＣＡＭ−１の遺伝子
のような遺伝子をクローニングするのに十分である。
ペプチド中のアミノ酸残基の配列は、普通用いられてい
る３文字表示または１文字表示を用いて本明細書におい
ても表示する。これら３文字および１文字表示の目録は
“旦匹抑旦葺■、　Ｌｅｈｎｔｎｇｅｒ＋Ａ、、　Ｗｏ
ｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊、ニューヨーク、（１
９７０）　　”のような教科書において見い出される。
そのような配列を縦に書くときには、アミン末端基は列
の頂部にあるようにし、カルボキシ末端基は列の底部に
あるようにする。同様に、横方向に書くときには、アミ
ノ末端は左にあるようにし、カルボキシ末端は右末端に
あるようにする。
ペプチド中のアミノ酸残基はハイホンによって分離でき
る。そのようなハイホンは単に配列の存在を容易にする
ことを意図しているだけである。単なる例示としては、 −Ｇｌｙ−Ａｊ！ａ−３ｅｔ−Ｐｈｅ−と表示したアミ
ノ酸配列はＡｌａ残基がｃ＋ｙのカルボキシ基に結合し
ていることおよびＳｅｒ残基がＡｌａ残基のカルボキシ
基およびＰｈｅ残基のアミノ基に結合していることを示
している。この表示はさらにアミノ酸配列がテトラペプ
チドＧｊ２ｙ−Ａｊ！ａ−３ｅｔ−Ｐｈｅを含有してい
ることも示している。この表示はアミノ酸配列をこの１
つのテトラペプチドに限定するものではなく、＜１）ア
ミノまたはカルボキシに結合した１種以上のアミノ酸残
基を有するテトラペプチド、（２）アミノおよびカルボ
キシ末端の両方に結合した１種以上のアミノ酸残基を有
するテトラペプチド、（３）追加のアミノ酸残基を有し
ていないテトラペプチドを包含するものとする。
１種以上の適当なペプチドフラグメントがシーケンシン
グされると、これらをコードし得るＤＮＡ配列を検査す
る。遺伝子コードは縮重するので、１種以上のコドンを
用いて特定のアミノ酸をコードできる〔Ｗａｔｓｏｎ、
　Ｊ、　　Ｄ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ
　ｏｆｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第３版、Ｗ、　Ａ、　Ｂｅｎ
ｊａｍｉｎ社、カルホルニア　メンローパーク、（１９
７７）、ｐｐ３５６−３５７）。ペプチドフラグメント
を分析して最低度の縮重性を有するオリゴヌクレオチド
によってコードされ得るアミノ酸配列を同定する。これ
は好ましくは単一コドンのみによってコードされている
アミノ酸を含有する配列を同定することによって行う。
場合によっては、そのようなアミノ酸配列は単一オリゴ
ヌクレオチドのみによってコードされ得るけれども、多
くの場合、そのアミノ酸配列は任意の１セツト　（組）
の同様なオリゴヌクレオチドによってコードされ得る。
重要なのは、上記セットのすべてのメンバーがそのペプ
チドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオチドを
含有し、かくしてそのペプチドフラグメントをコードす
る遺伝子として同じヌクレオチド配列を潜・性的に含む
のに対し、上Δ己のセットの１メンノイーのみはこの遺
伝子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含
むことである。このメンノイーは上記のセット内に存在
し、上記セットの他のメンバーの存在においてさえもＤ
ＮＡにハイブリ・ノドし得るので、単一オリゴヌクレオ
チドを用いて上記ペプチドをコードする遺伝子をクロー
ニングするのと同じ方法で分解していないオリゴヌクレ
オチドセットを用いることができる。
上述の方法と正確に同じ方法において、ペプチドフラグ
メントをコードし得るオリゴヌクレオチド配列または配
列セットに相補的であるヌクレオチド配列を有するオリ
ゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドのセット）
を用い得る。
Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子のフラグメントをコードし得る適
当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセ
ット（またはそのようなオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチドに相補性であるもの）を同定しく上述の
手順を用いて）、ＤＮ＾について当該技術で周知の手段
を用いて、好ましくはＩ　ＣＡＭ−１遺伝子配列を発現
し得るヒト細胞由来のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉｌｌ製物によ
り合成しハイブリッド化する。核酸ハイブリッド化技術
はＭａｎｉａｔｉｓ。
Ｔ、等、により”　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、　ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ１、　　Ｃ
ｏｌｄｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒｔ　　ＮＹ　　（
１９８２）において、またＨａｙｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、
等により“Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｚａｔ
ｉｏｎ、ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　　ａｐｐｒｏａｃｈ
＋　　１員ＬＰｒｅｓｓ社、ワシントンＤ、Ｃ，（１９
８５）”において開示されており、これら文献は参考と
して本明細書に引用する。使用するＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａ源は好ましくはＩ　ＣＡＭ−１配列に富む。そのよう
な濃厚化はＩ　ＣＡＭ−１合成を誘起する条件下で培養
された細胞（ホルボールエステルの存在下で増殖させた
０９３７等のような）からＲＮＡを抽出することによっ
て得たｃＤＮＡから最も容易になし得る。
上述した方法のようなあるいは同様な方法はヒト　アル
デヒド　デヒドロゲナーゼの遺伝子（Ｈｓｕ、　Ｌ、　
Ｃ，等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、＾ｃａｄ、　Ｓｅｔ、
　　ＵＳＡ工２：３７７１−３７７５　　（１９８５）
）、フィブロネクチン（Ｓｕｚａｋｉ、　Ｓ、等、Ｅｕ
ｒ、　Ｍｏ１、　Ｂｉｏｌ。
０ｒａｎ、Ｊ、４：２５１９−２５２４　（１９８５）
）ヒト　エストロゲン　レセプスー遺伝子（Ｗａｌｔｅ
ｒ。
Ｒ８等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ
　　ＤＮＡ８　　ニア８８９−７８９３　（１９８５）
）　、組織型プラスミノーゲン　アクチベータ（Ｐｅｎ
ｎｉｃａ、　Ｄ、等、Ｎａｔｕｒｅ　３０１：２１４−
２２１　　（１９８３））およびヒト胎盤アルカリ　ホ
スファターゼ相補Ｄ　Ｎ　Ａ　ＣＫａｒａ、　Ｗ、等、
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
八へ２：８７１５−８７１９　（１９８５））のクロー
ニングを成功裏に可能にしている。
Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子をクローニングする別の好ましい
方法においては、発現ベクターのライブラリーをＩ　Ｃ
ＡＭ−１を発現ベクター中に発現できる細胞からＤＮＡ
または好ましくはｃＤＮＡをクローニングすることによ
って調製する。このライブラリーを次いで抗Ｉ　ＣＡＭ
−１抗体に結合しＩ　ＣＡＭ−１またはＩ　ＣＡＭ−１
フラグメントと同じアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードし得るヌクレオチド配列を有するたん白質を発
現し得るメンバーについてスクリーニングする。
上記方法により得られたクローニングＩＣＡＭ−１遺伝
子は操作によって発現ベクターに結合させバクテリアま
たは真核生物細胞に組み込んでＩ　ＣＡＭ−またん白質
を産生させる。そのような操作技術はＭａｎｉａｔｉｓ
、　’ｒ、等（前出）により開示され、当該技術におい
て周知である。
Ｄ、　　ＬＦＡ−１のアッセイの ＬＦＡ−１依存性凝集を測定し得る前述のアッセイを用
いてＬＦＡ−１依存性凝集の度合を抑制するアンタゴニ
ストとして作用する試剤を同定できる。そのようなアン
タゴニストは凝集に関係するＬＦＡ−１またはＩ　ＣＡ
Ｍ−１の能力を付与することによって作用し得る。即ち
、そのような試剤はＬＦＡ−１またはＩ　ＣＡＭ−１に
結合し得る抗体のような免疫グロブリンを包含する。さ
らに、非免疫グロブリン（即ち、化学）剤も、上記アッ
セイを用いてこれらがＬＦＡ−ｆｉｌ集のアンタゴニス
トであるかどうかを決定し得る。
１゜抗炎症剤 ＣＤ　＋　ｓ複合体の各１員に対するモノクローナル抗
体は内皮への結合（Ｆｌａｓｋａｒｄ、　Ｄ、等、ムＩ
ｍｍｕｎｏ１．１　３７　　：　　２９０　１−２９０
６（１９８６））、ホモタイプ粘着（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ
。
Ｒ１等、Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、　１６３　：　１１
３２−１１４９（１９８６））リンパ球の抗原およびマ
イトジェン誘起増殖（Ｄａｖｉｇｏｎ、　Ｄ、等、Ｐｒ
ｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、Ｓｃｉ、ＤＮＡ７８：４５
３５−４５３９（１９８１））、抗体形成（Ｆｉｓｈｅ
ｒ、　Ａ、等、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３６　：　３１９８−３２０３
（１９８６））、および細胞毒性Ｔ細胞（Ｋｒｅｎｓｋ
ｙ＋＾１Ｍ１等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３２　
：２１８０−２１８２　　（１９８４））、マクロファ
ージ（Ｓｔｒａｓｓｍａｎ、　Ｇ、ｊ等、Ｊ、　ｒｍｍ
ｕｎｏ１、　１３６　：４３２８−４３３３　（１９８
６））、および抗体依存性細胞毒反応に含まれるすべて
の細胞（Ｋｏｈｉ、　Ｓ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、
　　１３３　：　２９７２−２９７８　（１９８４））
の溶解活性のようなすべての白血球のエフェクター機能
を包含する白血球の多くの粘着依存性機能を抑制する。
これら機能のすべてにおいて、上記抗体は白血球の適当
な細胞基質への粘着能力（この能力は最終結果を抑制す
る）を抑制する。
前述したように、Ｉ　ＣＡＭ−１分子のＬＦＡ−１群分
子の１員への結合は細胞粘着において極めて重要である
。粘着の過程において、リンパ球は外来抗原の存在につ
いて動物を連続的にモニターし得るものである。これら
の過程は通常は望ましいものであるけれども、これらの
過程はまた臓器移植拒絶、＆Ｉｌ織移植拒絶、および多
くの自己免疫患者の原因でもある。従って、細胞粘着を
減衰または抑制できる何らかの手段が臓器移植、組織移
植の受は入れ者または自己免疫患者に大いに望まれてい
る。
Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体は哺乳
動物の抗炎症剤として極めて適している。明らかに、そ
のような薬剤は粘着を選択的に抑制でき通常の薬剤で見
い出し得るネフロ毒性のような他の副作用を示さない点
で一般の抗炎症剤と異なっている。従って、Ｉ　ＣＡＭ
−１に結合し得るモノクローナル抗体を用いて哺乳動物
においてそのような副作用の恐れなしに臓器または組織
の拒絶反応を防止し２あるいは自己免疫応答を修正でき
る。
重要なことは、Ｉ　ＣＡＭ−１を認識し得るモノクロー
ナル抗体の使用はＨＬＡ不均衡を有する個々人において
さえも臓器移植を行うことができるということである。
２゜　　　　　敏　応のサプレッサー Ｉ　ＣＡＭ−１分子は殆んど遅延型過敏反応に含まれる
部位のような炎症部位に発現するので、Ｉ　ＣＡＭ−１
分子に結合し得る抗体（特にモノクローナル抗体）はそ
のような反応の減衰または排除において治療的潜在力を
有する。この潜在的治療用途は２つの方法のいずれかで
活用できる。第１は、Ｉ　ＣＡＭ−１に対するモノクロ
ーナル抗体を含有する組成物を遅延型過敏反応を呈する
患者に投与できる。例えば、そのような組成物は毒キツ
ダ、毒オーク等の抗原と接触した人に投与できるであろ
う。第２のＢ様においては、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得
るモノクローナル抗体を抗原と共に患者に投与してその
後の炎症反応を防止する。即ち、抗原とＩ　ＣＡＭ−１
結合性モノクローナル抗体との共投与は上記抗原の投与
後に人に一時的に許容し得る。
３、慢性炎症疾患の治療 ＬＦＡ−１を欠損するＬＡＤ患者は炎症応答を示さない
ので、ＬＦＡ−１の天然リガント、Ｉ　ＣＡＭ−１の拮
抗作用もまた炎症応答を抑制するものと信じている。Ｉ
　ＣＡＭ−１に対する抗体の炎症を抑制する能力は円板
状エリスマトーデス、自己免疫甲状腺炎、実験的アレル
ギー件部をずい炎（ＥＡＥ）　、多発性硬化症、糖尿病
レイナート症候群のある態様、リウマチ様関節炎等の慢
性炎症および自己免疫疾患の治療における治療用途の基
本を与える。一般に、Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノ
クローナル抗体はステロイド療法により現在治療可能な
疾患の治療に用い得る。
４、診断および判定的用途 Ｉ　ＣＡＭ−１は殆んど炎症部分に発現するので、Ｉ　
ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体は患者の感
染および炎症部位を画像化または可視化する手段として
使用できる。そのような用途においては、モノクローナ
ル抗体はラジオアイソトープ、アフイニテイラベル（ビ
オチン、アビジン等のような）、螢光ラベル、常磁性原
子等の使用により検出可能に標識化する。
そのような標識化を行う手順は当該技術において周知で
ある。画像診断における抗体の臨床的応用はＧｒｏｓｓ
ｍａｎ、　）１．　Ｂ、、Ｕｒｏ１、　Ｃｌ１ｎ、　Ｎ
ｏｒｔｈＡｍｅｒ、１３：４６５−４７４　（１９８６
）Ｕｎｇｅｒ、　Ｅ、　Ｃ，等、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｒａ
ｄｉｏ１、　　２０　：６９３−７００　（１９８５）
”および“ＫｈａｗＢ、　Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２
０９　：　２９５　２９７（１９８０）　　″により検
討されている。
炎症の存在はまたＩ　ＣＡＭ−１を発現する細胞のＩ　
ＣＡＭ−１遺伝子配列にまたはＩ　ＣＡＭ１ｍＲＮＡ配
列に結合するｍ　ＲＮ　Ａ　、　　ｃＤＮＡまたはＤＮ
Ａのような結合性リガントの使用によっても検出できる
。そのようなハイブリッド化アッセイを行う技術はＭａ
ｎｉａｔａＬｓ、　Ｔ、　（前出）によって開示されて
いる。
そのような検出可能に標識した抗体の病巣の検出は炎症
または腫瘍発現部位を示し得る。１つの実施態様におい
ては、この炎症検査は組織または血液のサンプルを取り
出しそのようなサンプルを上記検出可能に標識した抗体
の存在下にインキュベートすることによって行う、好ま
しい実施態様においては、この方法を磁性画像診断、フ
ルオログラフィ等を用いて非侵略的方法で行う。そのよ
うな診断試験は臓器移植受は入れ者を潜在的な組織拒絶
の早期発見のためにモニターするのに用い得る。そのよ
うなアッセイはまたリウマチ様関節炎または他の慢性炎
症疾患に対する個々人の対応を決定するにも実施し得る
。
５、治療または診断目的で投与する抗原物質の導入の補
佐 例えば、ウシインシュリン、インターフェロン、組織型
ブラズミノーゲンアクチベーターまたはマウスモノクロ
ーナル抗体のような治療または診断剤への免疫応答はそ
のような薬剤の治療または診断価値を実質的に減少させ
、実際に、血清病のような疾患を生じ得る。そのような
事情は本発明の抗体を用いて改善できる。この実施態様
においては、そのような抗体を治療剤または診断剤と組
合せて投与する。抗体の添加は受は入れ者を上記薬剤の
認識から防止し、従って、受は入れ者が薬剤に対する免
疫応答を開始するのを防止する。そのような免疫応答が
ないことは患者の治療剤または診断剤の追加の投与を受
は入れる能力をもたらす。
Ｆ、細　　着　−１（ＩＭＡＣ−１）のＩＣＡＭ−１は
ＬＦＡ−１の結合パートナ−である、かくして、Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１またはその官能性誘導体は疾患の治療において
ＬＦＡ−１に結合し得る抗体と相互変化的に使用できる
。即ち、可溶化形において、そのような分子は炎症、臓
器拒絶、移植拒絶等を抑制するのに用い得る。ＩＣＡＭ
−１またはその官能性誘導体は抗ＩＣＡＭ抗体と同じ方
法で用いて治療剤または診断剤の免疫原性を減少させ得
る。
Ｉ　ＣＡＭ−１、その官能性誘導体、およびそのアンタ
ゴニストを用いて表面上にＩ　ＣＡＭ−１またはＬＦＡ
−１を発現する腫瘍細胞の転移または増殖をブロックし
得る０種々の方法がそのような目的を達成するのに用い
得る０例えば、造血細胞の浸透はＬＦＡ−１−ＩＣＡＭ
−１結合を必要とする。従って、そのような結合のアン
タゴニストは上記の浸透を抑制し白血球由来の腫瘍細胞
の転移をブロックする。また、Ｉ　ＣＡＭ−１またはＬ
ＦＡ−１群分子の１具に結合し得る毒素由来分子も患者
に投与し得る。そのような毒素由来分子がＩ　ＣＡＭ−
１またはＬＦＡ−１群分子の１員と結合する場合、毒素
の存在が腫瘍細胞を殺しそれによって腫瘍の増殖を抑制
する。
Ｉ　ＣＡＭ−１依存性粘着はＩ　ＣＡＭ−１またはＬＦ
Ａ−１に結合し得る非免疫グロプリンアンタゴニストに
より抑制し得る。ＩＣＡＭ−１の非免疫グロプリンアン
タゴニストの１つの例はＬＦＡ−１である。ＬＦＡ−１
に結合する非免疫グロプリンアンタゴニストの例はＩ　
ＣＡＭ−１である。
前述のアッセイを使用することによって、追加の非免疫
グロプリンアンタゴニストを同定し精製できる。Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１依存粘着の非免疫グロプリンアンタゴニストは
ＬＦＡ−１に対する抗体またはＩ　ＣＡＭ−１に対する
抗体と同じ目的で使用できる。
ＨｏＩＩの組　　の１ １ＣＡＭ−１の治療効果は患者に全Ｉ　ＣＡＭ−１−ま
たはその任意の治療上活性なペプチドフラグメントを投
与することによって得られる。
ＩＣＡＭ−１およびその官能性誘導体は組換えＤＮＡを
用いて合成的にあるいはたん白質分解により取得できる
。ＩＣＡＭ−１の治療上の利点は追加のアミノ酸残基を
有してキャリヤーに対する結合性を改善しあるいはＩ　
ＣＡＭ−１の活性を改善したＩＣＡＭ−１の官能性誘導
体の使用により増強され得る。本発明の範囲はさらにあ
る種のアミノ酸残基を欠損しあるいは別のアミノ酸残基
を含むｉ　ＣＡＭ−１の官能性誘導体もそのような誘導
体が細胞粘着に作用する能力を示す限り包含するものと
する。
本発明の抗体およびＩ　ＣＡＭ−１分子は、これらを含
有する調製物がこれらの生成物と共に通常天然に見出さ
れる物質を実質的に含まない場合、“天然不純物を実質
的に含まない”といえる。
本発明はＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体およびその生
物学的活性を有するフラグメント（ポリクローナルまた
はモノクローナル）にも及ぶ、そのような抗体は動物、
組織培養または組換えＤＮＡ手段により調製できる。
患者にＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体またはそのフラ
グメントを投与するには、あるいは、ＩＣＡＭ−１（ま
たはそのフラグメント、変異体または誘導体）を受は入
れ患者に投与するには、その投与量は患者の年令、体重
、身長、性別、−般的医療条件、病歴等のファクターに
よる。一般には、患者に約ＩＰｇ／ｋｇ〜１０■／　ｋ
ｇ　（患者体重）の範囲の抗体投与量で投与することが
望ましいが、それにより低量または高量の投与量も投与
できる。
Ｉ　ＣＡＭ−１分子またはその官能性誘導体を患者に投
与するときは、同じく約ＩＰｇ／ｋｇ〜１０■／ｋｇ　
（患者の体重基準）の範囲の投与量でそのような分子を
投与することが好ましいが、それより低量または高量の
投与量も使用できる。後述するように、上記の有効投与
量は抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体を抗ＬＡＭ−１投与と共投与
する場合は少なくすることができる。本発明においては
、１つの化合物は第２の化合物と、その２つの化合物の
投与がこれら再化合物を患者血清中で同時に検出できる
ような条件にある場合において患者に共投与できると云
える。
Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体及びＩ　ＣＡＭ−１自
体の両者は患者に静注、筋注、皮下、腸内または非経口
的に投与できる。抗体またはＩＣＡＭ−１を注射により
投与するときは、投与は連続注入によりあるいは１回ま
たは多数回ポーラスにより行い得る。
本発明の抗炎症剤は炎症を抑制するのに十分な量で受は
入れ対象体に投与するものである。その量は、薬剤の投
与量、投与経路等が炎症を減衰させあるいは防止するに
十分である場合において炎症を“抑制°するに十分であ
ると云える。
本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症を抑
制するために）または炎症発症後のいずれにおいても投
与できる。
抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体またはそのフラグメントは単独ま
たは１種以上の追加の免疫抑制剤と組合せて投与できる
（特に、臓器または組織移植の受は入れ者に対して）。
そのような化合物の投与は“予防”または“治療”目的
のいずれかであり得る。予防的に投与する場合には、こ
れらの免疫抑制剤は炎症応答または症候の前に投与する
（例えば、臓器または組織の移植前、移植中または移植
直後で臓器拒絶症候の前）。これら化合物の予防的投与
は後の何らかの炎症応答（例えば、移植臓器またはＵ織
の拒絶等）を防止または低減するのに役立つ。治療的に
投与する場合には、これらの免疫抑制化合物は実際の炎
症の症候（例えば、臓器または組織拒絶のような）の発
症時（またはその直後）に投与する。これら化合物の治
療的投与は何らかの実際の炎症（例えば、移植臓器また
は組織の拒絶のような）を低減するのに役立つ。かくし
て、本発明の抗炎症剤は炎症の発症前（予想される炎症
を抑制するように）または炎症の開始後のいずれかで投
与できる。
組成物はその投与が受は入れ患者に許容される場合に“
薬学上受は入れ可能である“と云える。
そのような薬剤はその投与量が生理学上有意である場合
に“治療上有効な量”で投与されると云える。薬剤はそ
の存在が受は入れ患者の生理に検知可能な変化をもたら
す場合に生理学上有意である。
本発明の抗体およびＩ　ＣＡＭ−１分子は薬学上有用な
組成物を調製する公知の方法によって処方でき、それに
よってこれらの物質またはその官能性誘導体を薬学上許
容できるキャリヤーベヒクルと混合物として組合せ得る
。適当なベヒクルおよびその調製物（例えば、他のヒト
たん白質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む）は、例
えば、’Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　（第１６版、０
３０１．　Ａ、！！、マーク・イーストン（ＰＡ）、（
１９８０）　　”に記載されている。有効な投与に適す
る薬学上許容し得る組成物を調製するためには、そのよ
うな組成物は適当量のキャリヤーベヒクルと共に有効量
の抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体またはＩ　ＣＡＭ−１分子、ま
たはその官能性誘導体を含有する。
追加の薬学的方法を用いて活性の持続を制御することが
できる。制御放出性製剤は抗ＩＣＡＭ−１抗体またはＩ
　ＣＡＭ−１、またはこれらの官能性誘導体を複合体化
しあるいは吸収するポリマーを使用することによって得
ることができる。制御された伝達は適当なマクロ分子（
例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロ
リドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、またはプロタミン硫酸塩）
および該マクロ分子の濃度並びに放出を制御するための
混入方法を選択することによって達成できる。制御放出
製剤により活性持続を制御するもう１つの可能性ある方
法は抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体またはＩ　ＣＡＭ−１分子、
またはこれらの官能性誘導体をポリエステル、ポリアミ
ノ酸、ヒドロゲル、ポリラクトン酸またはエチレン−酢
酸ビニルコポリマーのような高分子物質の粒子に混入さ
せることである。また、これら薬剤を高分子粒子に混入
させる代りに、これらの薬剤を例えばコアセルベーショ
ン法によりあるいは界面重合法により調製したマイクロ
カプセル例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラ
チンマイクロカプセルおよび（メチルメタクリレート）
マイクロカプセル中に、あるいはコロイド状薬物伝達系
例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイ
クロエマルジョン、ナノパーティクル、ナノカプセルま
たはマクロエマルジョン中に内包させることも可能であ
る。そのような方法も“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　　（１９
８０）　　’中に記載されている。
大施尉 これまで本発明を一般的に説明して来たが、以下の実施
例は本発明をより容易に理解できるであろう。これらの
実施例は例示を目的とするものであり本発明を限定する
ものではない。
実施例１ 動物細胞の培養 一般に、本発明のＥＢＶ形質転換およびハイプリドーマ
各細胞は２０ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ＩＩＩ
Ｉｌのジェンタマイシン、および１０％のウシ胎児血清
を加えたＲＭＰ　Ｉ　１６４０培地中に保存した。細胞
は３７℃で、５％Ｃｏ、、９５％湿度雰囲気下で培養し
た。
エプスタイン−バールウィルス（ＥＢＶ）形ｉｔ転換体
を確立するために、２０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）およ
び５０μｇ／１ｓｌｌのジェンタマイシンを加えたＲＰ
Ｍ１１６４０培地中＋７）１培地中細７Ｔ細胞放血末梢
単核細胞／ＩｌＮを１６時間Ｂ９５−８細胞のＥＢＶ含
有上清でインキュベートした（Ｔｈｏｒｌｅｙ−Ｌａｗ
ｓｏｎ、、Ｄ、　Ａ、等、Ｌ−ム旦虹工Ｍｅｄ、１４６
：４９５　（１９７７））、０．２　ｒ＊１細胞アリコ
ートを１０マイクロタイターウエルに入れた。培地をＲ
ＰＭ１１６４０培地（２０％ウシ胎児血清および５０μ
ｍ／ｌジンタマイシンを加えた）で細胞増殖が見られる
まで置換えた。細胞は殆んどのウェルで増殖し同じ培地
中に拡った。
フィトヘマグルチニン（Ｐ　ＨＡ）　芽球ヲ１　：　８
００稀釈ＰＨＡ−Ｐ　（口１ｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ社、デトロイト、Ｍｌ）を含有するＲＰＭＪ１
６４０培地（２０％ウシ胎児血清加）中１０”細胞／１
ＩＩＩ！テ確立した。ＰＨＡ系はインターロイキン２　
　（ＩＬ−２）調整培地で拡がりＰＨＡにより弱く脈動
した（Ｃａｎｔｒｅｌ１、　Ｄ、＾１等、Ｊ、　Ｅｘ　
ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１５８：１８９５　（１９８３））
。上記手順は“Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｔｏ等、Ｊ、　Ｅｘ
　ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１６０　：　１９０１−１９１８
（１９８４）　　”により開示されており、その記載は
参考として本明細書に引用する。上記手順で得た細胞を
次いで抗ＬＦＡ−１抗体でスクリーニングしてこれらが
ＬＦＡ−１抗原を発現するがどうかを決定した。そのよ
うな抗体は“ＳａｎｃｈｅｙＭａｄｒｉｄ、　Ｆ、等、
Ｊ、　Ｅｘ　８ｒ、　Ｍｅｄ、１５８：１７８５（１９
８３）　　″に開示されている。
実施例２ 細胞凝集および粘着のアッセイ 細胞粘着の度合を評価するために、凝集アッセイを用い
た。かかるアッセイに用いた細胞系は５ｍＭのＦｌｅｐ
ｅｓバッフｙ　−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社、
セントルイス）を含有するＲＰＭＩＩ６４０培地で２回
洗浄し２Ｘ１０”細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。平
底９６ウエルマイクロタイタープレート　（Ｎ１３５９
６　；　Ｃｏａｓｔａｒ社、ケンブリッジ、ＭＡ）に５
０μｌの適当なモノクローナル抗体上清、５０μｌの精
製モノクローナル抗体を含むまたは含まない完全培地、
５０μｌの２００ｎｇ／Ｉｌｌホルボールエステルホル
ボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）含有完全培地
および１００μｌの完全培地中２Ｘ１０”細胞／＠ＮＭ
度の細胞を加えた。これは５０ｎｇ／　ｍｌＰＭＡと２
×１０’細胞／ウエルの最終濃度を与えた。細胞を自然
に沈降させ、凝集度を各時点で計数した０度数はＯ〜５
°の範囲にあった。ここでＯは密集中に本質的に細胞が
ないことを示し；１゛は１０％以下の細胞が凝集物中に
あり；２゛は５０％以下の細胞が凝集していることを示
し；３゛は１００％までの細胞が小さいゆるやかな密集
中にあったことを示し；４゛は１００％までの細胞が大
密集中に凝集したことを示し；５゛は１００％の細胞が
大きい極めて密な凝集物中にあったことを示す。
細胞粘着のより定量的な評価を得るために、試剤および
細胞を上記と同じ順序で５　ｍ！！ポリスチレンチュー
ブに加えた。チューブを３７℃でグリシトリ−シェーカ
ー上の台中に置いた。約２００ｒｐｎ＋で１時間後に、
１０μｌの細胞懸濁液をヘモサイトメーター中に入れ遊
離細胞の数を定量した。
％凝集を次の等式によって決定した。
上記等式中の入れた細胞の数はインキュベートしていな
い細胞と完全培地のみを含有するコントロールチューブ
中のｒａｌ当りの細胞数である。上記等式中の遊離細胞
の数は試験チューブからのｌ１ｌＩ！当りの非凝集細胞
の数に等しい。上記の手順はＲｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，
等、Ｊ、ＩＥｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１６３　：１１３
２−１１４９　（１９８６）　　”によって開示されて
いる。
実施例３ ＬＦＡ−１依存性細胞凝集 実施例２で記載した定量的凝集アッセイをエプスタイン
−バールウィルス形質転換細胞系ＪＹを用いて行った。
マイクロタイタープレート中の培地にＰＭＡを加えて、
細胞凝集を観察した。時間経過ビデオ記録計はマイクロ
タイターウェル底部のＪＹ細胞が動いており活性な膜波
動および仮定運動を示していた。ｌ！Ｊ接細胞の仮定間
の接触はしばしば細胞−細胞粘着をもたらした。粘着が
持続した場合、細胞接触領域は属調（ｕｒｏｐｏｄ）に
移動した。接触は激しい細胞運動および反対方向への細
胞の引っ張り合いにも依らず維持できた。ＰＭ＾処理お
よび未処理細胞間の主な違いは１度形成された上記接触
の安定性において現われていた。
ＰＭＡにおいては、細胞密集が出現し、その周りに粘着
した追加の細胞として粒度の成長があった。
粘着を測定する第２の手段としては、実施例２で記載し
た定量的アッセイを用いた。細胞懸濁液を２時間、２０
０ｒｐｍで振り、ヘモサイトメーターに移し、凝集物中
に含まれない細胞を計数した。
ＰＭＡ（７）不存在では、４２％（ＳＤ＝２０％、Ｎ−
６）のＪＹ細胞が２時間後、凝集物中にあったが、５０
μｇ／ｌｌ１ｌのＰＨＡと共に同じ条件下でインキュベ
ートしたＪＹ細胞は凝集物中に８７％（ＳＤ＝８％、Ｎ
＝６）の細胞を有していた。
凝集の動力学的検討はＰＭＡがすべての試験時間で凝集
速度および強度を促進していることを示した（第３図）
。
実施例４ 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体を用いての細胞の凝集
抑制 ＰＭＡ誘起細胞凝集への抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗
体の効果を試験するために、そのような抗体を実施例２
の定量凝集アッセイに従ってインキュベートした細胞に
加えた。このモノクローナル抗体はＰＭＡの存在または
不存在下のいずれにおいても細胞凝集の形成を抑制して
いることが判った。ＬＦＡ−１のアルファー鎖に対する
モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）ｇおよびＦａｂ　’
フラグメントは双方とも細胞凝集を抑制できた。一方、
本質的に１００％の細胞が抗ＬＦＡ−１抗体の不存在下
では凝集を形成し、抗体を加えたときは２０％以下の細
胞が凝集物中に見い出された。この実験の結果はＲｏｔ
ｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等により開示された〔ムＥｘｅｒ、
Ｍｅｄ、　　１．６３：１１３２−１１４９（１９８６
））。
実施例５ 細胞凝集はＬＦＡ−ルセプターを必要とする二ＥＢＶ形
質転換リンパ芽球細胞を実施例１で記載した方法により
患者から調製した。この細胞をＬＦＡ−１を認識し得る
モノクローナル抗体に対してスクリーニングし、細胞が
ＬＦＡ−１欠損であることを見い出した。
実施例２で記載した定量凝集アッセイを上記ＬＦＡ−１
欠損細胞を用いて行った。この細胞はＰＭＡの存在にお
いても自発的に凝集しなかった。
実施例６ Ｉ　ＣＡＭ−１の発見 実施例５のＬＦＡ−１欠損細胞をカルボキシフルオレス
セインジアセテートで標識した（Ｐａｔａｒｒｏｙｏ、
　Ｍ、等、Ｃｅ１１．　Ｉｍｍｕｎｏ１、　６３　：　
２３７−２４８　（１９８１））。標識細胞を回加また
はＪＹ細胞と１：１０の比で混合し凝集物中のフルオレ
スセイン標識細胞の割合をＲｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等
、Ｊ、　Ｅｘ　ｅｒ、　Ｍｅｄ、　１６３　：　１１３
２−１１４９（１９８６）　　”の方法に従って測定し
た。ＬＦＡ−１欠損細胞はＬＦＡ−１発現性細胞と共凝
集し得ることを見い出した（第４図）。
ＬＦＡ−１が凝集形成またはその維持にのみに重要であ
るかどうかを決定するために、ＬＦＡ−１に結合し得る
抗体を上記の前取って形成させた凝集に加えた。抗体の
添加は上記の前取って形成させた凝集を強く分裂させる
ことが判った。時間経過ビデオ記録計は前取って形成さ
せた凝集へのモノクローナル抗体の添加が２時間以内で
分裂を生じ始めることを示した（第１表）。ＬＦＡ−１
に対するモノクローナル抗体の添加後、凝集中の個々の
細胞の従尾運動および形状変化は変らないまま続いた０
個々の細胞は凝集物の周囲から次第に解離し、８時間ま
でに細胞は殆んど分散した。
ビデオ時間経過によれば、ＬＦＡ−１モノクロ一ナル抗
体による前取って形成させた凝集の分裂は時間を逆のぼ
って行ったＬＦＡ−１モノクロ一ナル抗体の不存在下で
の凝集過程と等価であった。
第１表 ８ｈ ＋ｍＡｂ １″″ｂ １＊ｃ ｌ″４ 定量マイクロタイタープレート中の凝集を観察的に計数
した。アッセイ時間全体を通じて存在した抗ＬＦＡ−１
においては、凝集はＦ以下であった。
ａモノクローナル抗体添加２時間直前の凝集量ｂＴＳ　
１／１８　＋Ｔ’Ｓ　ｌ／２２ｃＴＳＩ／１８ ’ＴＳＩ／２２ 実施例７ ＬＦＡ−１依存性凝集における２価イオンの必要性 細胞毒性Ｔ＄１胞とターゲット間のＬＦＡ−１依存性粘
着はマグネシウムの存在を必要とする（Ｍａｒｔｚ、　
Ｅ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｏｉ１、　　８４　：　
５８４．５９Ｂ　（１９８０））。ＰＭＡ誘起ＪＹ細胞
凝集を２価カチオン依存性について試験した。ＪＹ細胞
はカルシウムまたはマグネシウムイオンを含まない培地
中では凝集しなかった（実施例２のアッセイを用いて）
。２価マグネシウムの添加は０．３ｍＭ程の低い濃度で
凝集を行った。カルシウムイオン単独の添加は殆んど効
果がなかったゆしかしながら、カルシウムイオンはマグ
ネシウムイオンのＰＭＡ誘起凝集を補佐する能力を増強
することが判った。１．２５ｍＭのカルシウムイオンを
培地に加えたときは、０．０２ｍ、Ｍ程の低いマグネシ
ウムイオン濃度で凝集を補佐することが判った。これら
のデータは細胞のＬＦＡ−１依存性凝集がマグネシウム
イオンを必要とすること、およびカルシウムイオンがそ
れ自体は不十分であるけれどもマグネシウムイオンと共
に凝集を増大させることを示している。
実施例８ 抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体を発現し得るハイ
ブリドーマ細胞の単離 Ｉ　ＣＡＭ−１に結合し得るモノクローナル抗体を“Ｒ
ｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等、Ｊ、　Ｉｎｕｗｕｎｏ１、
　　１３７　：　１２７０−１２７４　（１９８６）　
　″の方法に従って単離した。該文献は参考として本明
細書に引用する。即ち、３匹のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウ
スをＬＦＡ−１欠損患者からのＥＢＶ形質転換末梢血単
核細胞で腹腔内免疫した（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、＾
１等、Ｊ、　Ｅｘｐｅｒ。
Ｍｅｄ、１６０：１９０１　　（１９８４））、　　１
　　ｍｌＲＰＭＬ１６４０培地中約１０１個の細胞を各
免疫に用いた。免疫はひ臓細胞をマウスから取り出す前
の４５日、２９日および４日で行い所望のハイブリドー
マ細胞系を産生させた。ひ臓細胞の取り出し前３日に、
マウスに追加の０．１５ｍｆ培地中１０′Ｆ細胞を投与
した（静注）。
上記の動物からの単離ひ臓細胞をＰ３Ｘ７３Ａｇ８．６
５３ミエローマ細胞と４：１の比率で“Ｇａ１ｆｒｅ、
　Ｇ、等、Ｎａｔｕｒｅ２６６　：　５５０　（１９７
７）″のプロトコールに従って融合させた。得られたハ
イブリドーマ細胞の各アリコートを９６ウエルマイクロ
タイタープレートに入れた。各ハイブリドーマ上清を凝
集抑制についてスクリーニングし、１つの抑制ハイブリ
ドーマ（６００以上のすべてのウェル試験のうちから）
をクローニングし限定稀釈によりサブクローニングした
。このサブクローンはＲＰＩ／１．１．１．と表示した
（以後“ＲＰ　１／１”と表示する）。
モノクローナル抗体ＲＰ　１／１はＬＦＡ−１発現性細
胞系ＪＹのＰＭＡ刺激凝集を一貫して抑制することを見
い出した。ＲＰ　１／１モノクロ一ナル抗体はいくつか
のＬＦＡ−１αまたはβサブユニットに対するモノクロ
ーナル抗体よりも等価かわずかに小さく凝集を抑制した
。これに対し、コントロールのＨＬＡに対するモノクロ
ーナル抗体（これはＪＹ細胞上に多量に発現する）は凝
集を抑制しなかった。モノクローナル抗体ＲＰＩ／１と
結合した抗原は細胞間粘着分子−１（ＩＣＡＭ−１）と
定義する。
実施例９ Ｉ　ＣＡＭ−１を特性決定するための抗Ｉ　ＣＡＭ＝１
モノクローナル抗体の使用 Ｉ　ＣＡＭ−１の性質を限定するために、特にＩ　ＣＡ
Ｍ−１がＬＦＡ−１と異なるかどうかを決定するために
、細胞たん白質をモノクローナル抗体ＲＰ　１／１を用
いて免疫沈降させた。免疫沈降は“Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、
　Ｒ，等の方法に従って行った〔ムＪＹ細胞を新たに１
ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、０．２単
位／ｍｆのトリプシンインヒビターアプロチニンを加え
た１％トリトンＸ−１００，０，１４ｍのＮａＣｊ！　
、　１０　ｍＭのトリス、ｐＨ８，０（溶解バッファー
）中で５Ｘ１０’細胞／ｆａｌで２０分間、４℃で溶解
させた。溶解物を１０．０００ｘｇで１０分間遠心しＣ
ＮＢｒ活性化グリシン抑制セファローズＣｌ−４Ｂの５
０％懸濁液５０ｍ１で１時間、４°Ｃで前処理した。ｌ
ｌｌ１の溶解物をセファローズＣ１−４Ｂに結合させた
モノクローナル抗体（１■／！１１１）の５０％懸濁液
の２０μ２で４℃で一夜免疫沈降させた（Ｓｐｒｉｎｇ
ｅｒ、　Ｔ、　Ａ、等、Ｊ、　Ｅｘｐｅｒ、　Ｍｅｄ、
　１６０　：１９０１　　（１９８４））。セファロー
ズ結合モノクローナル抗体は“Ｍａｒｃｈ、　Ｓｏ等、
の方法に従って炭酸塩バフファー中のセファローズＣ１
−４８のＣＮＢｒ活性化法を用いて調製した（Ａｎａｌ
。
Ｂｔｏｃｈｅｍ、６０　：　１４９　　（１９７４）　
）　、洗浄した免疫沈降物を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀
染色に”　ＦＩｏｒｒ＋５ｓｅｙ、　Ｊ、　Ｈ，Ａｎａ
１、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１７：３０７　　（１９８１
）　　”の手順に従って供した。
ＳＤＳサンプルバッファー（ＨＤ、　Ｍ、　Ｋ、等、Ｊ
、　Ｂｉｏ１、　Ｃｈｅｍ、２５８　：　６３６　（１
９８３）　）による１００℃でのたん白質溶出後、各サ
ンプルを半分に分けて還元（第５Ａ図）または非還元（
第５Ｂ図）の各条件下で電気泳動（ＳＤＳ−８％ＰＡＧ
Ｅ）に供した。分子量５０Ｋｄおよび２５Ｋｄを有する
バンドはモノクローナル抗体セファローズからの免疫グ
ロブリンの長鎖および短鎖に相当した（第５Ａ図、レー
ン３）。２５〜５０Ｋｄ分子量範囲の可変量の他のバン
ドも観察したが、ヘアリー白血病細胞・からの沈降物中
では見られず、この白血病細胞は９０Ｋｄ分子量バンド
のみを与えた。
ＬＦＡ−１の１７７Ｋｄαサブユニツトおよび９５Ｋｄ
βサブユニツトは還元（第５Ａ図、レーン２）および非
還元（第５Ｂ図、レーン２）の両条件下でＩ　ＣＡＭ−
１とは異なって浸透した。
ＰＨＡ−リンパ芽球凝集に対してのモノクローナル抗体
ＲＰ　１／ｌの効果を測定するために、実施例２で記載
した定量凝集アッセイを用いた。即ち、Ｔ細胞芽球細胞
をＰＨＡで４日間刺激し、十分に洗浄し、次いでＩＬ−
２状Ｍ調節培地の存在下に６日間培養した。ＰＨＡはこ
の６日間培養で取り込まれ凝集アッセイに寄与しなかっ
た。異なるＴ細胞芽球調製物による３種のアッセイにお
いて、Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体は一貫して凝
集を抑制したく第２表）。
第２表 ｃ １１ ＋ ＋ ＋ 対照 ）ＩＬ＾−Ａ、Ｂ ＬＦＡ−１アルフア ＣＡＭ−１ 対照 ＬｐＡ−ｘ＜−タ ＣＡＭ−１ １ 対照 ＨＬＡ−＾、Ｂ ＬＦＡ−３ ＬＦＡ−１アルフア ＬＦＡ−１ベータ ＣＡＭ−１ ５０ｎｇ／ｓＪのＰＨＡで刺激したＰＨＡ誘起リンパ芽
球の凝集は実施例２に記載したようにして非凝集細胞の
数を顕微鏡により計数することによって間接的に定量し
た。
’　　ＰＭＡおよびＸ６３モノクロ一ナル抗体で処理し
た細胞に対する％抑制 凝集はモノクローナル抗体およびＰＭＡの刺激的添加後
１時間で測定した。
４　負の数は凝集の％促進を示す。
凝集はモノクローナル抗体およびＰＭＡの刺激的添加後
１時間で測定した。細胞は２００ＸＧで１分間でベレッ
ト化し、３７℃で１５分間インキュベートし、ゆるやか
に再懸濁し、１１００ｒｐで４５分間振とうした。
ｆ　細胞はＰＨＡで３７℃、４時間前処理した。
モノクローナル抗体添加後、各チューブを３７℃で２０
分間静置インキュベートし、７５ｒｐｍで１００分間振
とうさせた。
ＬＦＡ−１モノクロ一ナル抗体はＩ　ＣＡＭ−１モノク
ロ一ナル抗体よりも一貫して抑制的であり、一方ＨＬＡ
−Ａ、ＢおよびＬＦＡ−３モノクロ一ナル抗体は効果な
しであった。これらの結果は試験したモノクローナル抗
体のうち、ＬＦＡ−１またはＩ　ＣＡＭ−１に結合し得
るモノクローナル抗体のみが細胞粘着を抑制し得ること
を示している。
実施例１０ Ｉ　ＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体の調製 免疫 Ｂａ１ｂ／ｃマウスをＲＰＭＩ培地中の２Ｘ１０’ＪＹ
細胞０．５ｉｆで融合前の１０３日および２４日で腹腔
内（ｉ、ｐ、）免疫した。融合前４日および３日に、マ
ウスを０．５＋＋＋ｊ’のＲＰＭＩ培地中のＰＭＡ分化
Ｕ９３７細胞でｉ、ｐ、免疫した。
旦工主工廠開■分化 Ｕ９３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３）を１０％の
ウシ胎児血清、１％グルタミンおよび５０ｍＡの２ｎｇ
／ａ＋ｌホルボールー１２−ミリステートアセテート（
ＰＭＡ）含有ジエタマイシン（完全培地）を含むＲＰＭ
Ｉ中５Ｘ１０’／ａ＋ｆで滅菌ポリプロピレン容器中で
インキュベートすることによって分化した。このインキ
ュベーションの第３日で、ｌ／２容量の培地を除去し新
しいＰＭＨ含有完全培地で置き換えた。４日目で、細胞
を取り出し、洗浄して免疫用に調製した。
照査 免疫マウスからのひ臓細胞をＧａ１ｆｒｅ等に従ってＰ
３Ｘ６３Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と４：１の比で
融合させた（　Ｎａｔｕｒｅ　２６６　：　５５０（１
９７７））。融合後、細胞を９６ウエル平底マイクロタ
イタープレートに１０Ｓひ臓細胞／ウェルで入れた。
抗ＩＣＡＭ−１”　　　　！７）”■ １週間後、５０μｌの上清を凝集用細胞系としてＪＹお
よび５ＫＷ−３の両方を用いて実施例２の定量凝集アッ
セイでスクリーニングした。ＪＹ細胞凝集を抑制するが
５ＫＷ−３凝集は抑制しない上清からの細胞を選択し限
定稀釈を用いて２回クローニングした。
この実験により、抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体
を産生ずる３種のハイブリドーマ系の同定およびクロー
ニングができた。これらのハイブリドーマ系により産生
じた抗体は、それぞれ、ＩｇＧｔイＩｇＧｔｂおよびＩ
ｇ？ｌであった＊　ＩｇＧｚａ抗ＩＣＡＭ−１抗体を産
生ずるハイブリドーマ細胞系は表示Ｒ６’　５　’　Ｄ
６　’　Ｂ９　’　Ｂ２とした。この好ましいハイブリ
ドーマ細胞系により産生した抗体はＲ６’　５’Ｄ６’
Ｅ９’Ｂ２と表示したく以下、“Ｒ６−５−Ｄ６”と称
する）。
実施例１１ １　ＣＡＭ−１の発現と規格化 Ｉ　ＣＡＭ−１発現を測定するために、ラジオイムノア
ッセイを行った。このアッセイにおいては、精製ＲＰ　
１／１をイオドゲンを用いて１０μＣｉ／μｇの特定の
活性にヨー素化した。内皮細胞を９６ウエルプレート中
で増殖させ各実験で述べたようにして処理した。各プレ
ートを直接氷上ではなく冷室に００５〜１時間置くこと
によって４℃に冷却した。各単一層を冷完全培地で３回
洗浄し次いで４℃で３０分間”’Ｉ　　ＲＰＩ／１でイ
ンキュベートした。次いで、単一層を完全培地で３回洗
浄した。結合１２５Ｉを０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨを用い
て放出し計数した。′ｚ’Ｉ　　ＲＰＩ／１の特異活性
を未標識ＲＰ　１／１を用いて調整して本試験において
用いる抗原密度範囲に亘って直線状シグナルを得た。非
特異結合を１．　ｏ　ｏ　ｏ倍過剰の未標識ＲＰＩ／ｌ
の存在下で測定し総結合から差引き特異性結合を得た。
上述のラジオイムノアッセイを用いて測定したＩ　ＣＡ
Ｍ発現はヒトヘソ帯静豚内皮細胞（ＨＩＪＶ［ＩＣ）お
よびヒト状状静脈内皮細胞（Ｈ３ＶＥＣ）上でＩＬ−１
、ＴＮＦ−１ＬＰＳおよびＩＮＦガンマ−により増大す
る（第３表）。状状静脈内皮細胞は本試験においては成
人Ｍｉ織由来の培養大静脈内皮細胞中のヘソ帯静脈内皮
細胞からの結果を確認するために用いた。Ｉ　ＣＡＭ−
１の基礎的発現はヘソ帯静脈内皮細胞よりも状状静脈内
皮細胞上で２倍高い。ヘソ帯静脈内皮細胞の組換えＩＬ
−１アルフア、ＩＬ−１ベータ、およびＴＮＦへの露出
はＩＣＡＭＣＡＭ発現〜２０倍増大させる。
ＩＬ−１アルフア、ＴＮＦおよびＬＰＳは最大効力イン
デューサーであり、ＩＬ−１は重量基準および応答の飽
和濃度では効力はそれより小さい（第３表）　、　Ｌ　
００ｎｇ／　ｍｆｆ１でのＩＬ−１ベータはＩ　ＣＡＭ
−１発現をＨＵＶＥＣ上で９倍、Ｈ３ＶＥＣ上で７．３
倍増大させ、半一最高増加は１５ｎｇ／　ｍｌで起った
。５０ｎｇ／ｎＩｌのｒＴＮＦはＩＣＡＭ−１発現をＨ
ＵＶＥＣ上で１６倍、Ｈ３ＶＥＣ上で１１倍増大させ、
半一最高効果は０．５ｎｇ／ｍβであった。インターフ
ェロンガンマ−はＩ　ＣＡＭ−１発現において１０，０
ＯＯＵ／ＩＩＩＩｌでＨ！ＪｖＥＣ上テ５．２倍または
Ｈ３ＶＥＣ上で３．５倍の有意の増大を示した。１０μ
ｇ／ｍｌでのＬＰＳの効果はｒＴＮＦの効果と強さにお
いて同じようであった。これら媒介物の対の組合せ＋：
！ＩＣＡＭ−１発現において追加の効果または追加の効
果よりもわずかに小さい効果をもたらした（第３表）、
ｒＴＭＦとｒｌＬ−１ベータまたはｒｌＦＮガンマ−と
の交差滴定は次善または最善の濃度での効果において共
働作用を示さなかった。
ＬＰＳは培地中でときどき見い出される基準で内皮細胞
上でのＩ　ＣＡＭ−１発現を増大させたので、基礎的Ｉ
　ＣＡＭ−１発現がＬＰＳに基づき得る可能性を試験し
た。いくつかの血清バッチを試験したとき、低エンドト
キシン血清が２５％までの低Ｉ　ＣＡＭ−１基礎発現を
与えることを見い出した。ここで示した結果はすべて低
エンドトキシン血清中で増殖させた内皮細胞のものであ
った。
しかしながら、ＬＰＳ中和性抗生物質ポリミキシンＢの
１０ｕｇ／ｍｊ！での添加はＩＣＡＭ１発現をわずかに
追加の２５％に減少させた（第３表）。
ＩＬ−１またはＴＮＦによる処理時のＩ　ＣＡＭ−１発
現の増大はこれらの調製物中の低エンドトキシン値と一
致させた１０μｇ／ｒｓｌポリミキシンＢの存在によっ
ては効果はなかったく第３表）。
第３表 抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体 対照 ｌＱＱｎｇ／ｍ　ｌ　　ｒｆＬ−１＜−タ５０ｎｇ／ｍ
　ｌ　　ｒＩＬ−１フルファ５０ｎｇ／ｍｊ！　　　ｒ
ＴＮＦ　　７Ｌ７ｙ１０μｇ／閤Ｉ　　ＬＰＳ １０ｎｇ／ｍｆ　　ｒｌＦＮ　　ｆンマーｒｌＬ−１＜
−夕　＋　ｒＴＮＦ ｒｌＬ−１＜−タ　＋　　ＬＰＳ ｒＩＬ−１ベータ　＋　ｒｌＮＦｆン？−ｒＴＮＦ　＋
　ＬＰＳ ｒＴＮＦ　　＋　　ｒｉＦＮ　　ガンマ−ＬＰＳ　　＋
　　ＩＦＮ　　１ンマー ポリミキシンＢ（１０μｇ／■ｌ） ポリミキシンＢ　　＋　　ｒＩＬ４ ポリミキシンＢ　　＋　　ｒＴＮＦ １μｇｅｍ　ｌ　　ＬＰＳ ポリミキシンＢ　　＋　　ＬＰＳ ６０３±１１ ５６８０±６３３ ９９１０±５３８ ９６５０±１５００ ９５３０±５１２ ３１２０±３０８ １４６９±１４１０ １３９８６±７６１ ７８４９±６０１ １５３６４±１２４１ １３４８０±１１８９ １０２０６±３２０ ４８０±２３ ５３９０±９７ ９７８５±３８９ ７５９８±４３２ ５１０±４４ １１３２±３１ ８３２０±７６６　７．３ｘ １２６９０±６５７ １０４５９±３８８ ４００２±６６４ １６２６自±６６０ １０８７０±８０５ ８４０１±３９０ １６１４１±１２７２ １３２３８±７６１ １０９８７土６６８ １１．２ｘ ９．２ｘ ３．５ｘ ４ｘ ０ｘ ７．４ｘ ４ｘ ２ｘ １０× ＨＶＥＣおよびＨ３ＶＥＣ−ＨＵＶＥＣまたはＨ３ＶＥ
Ｃ上（７）Ｉ　ＣＡＭ−１発現の上方規格化（ｕｐｒｅ
ｇｕｌａｔｉｏｎ）は９６ウエルプレートに１：３で融
合性単一層から種付し融合状に増殖させた。
次いで細胞を各物質または培地で１６時間処理しＲＩＡ
を方法的に行った。すべての数値は４回繰返しで行った
。
実施例１２ Ｉ　ＣＡＭ−１のインターロイキン１およびガンマ−イ
ンターフェロン誘起の動力半 成ふ繊維芽細胞上でのＩ　ＣＡＭ−１発現へのインター
ロイキン−１およびガンマ−インターフェロン効果の動
力学をＤｕｓｔｉｎ、　Ｍ、　Ｌ、等の１５１ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ結合アッセイを用いて測定した（Ｊ、　Ｉｍ
ｍｕｎｏ１、　　１３７　：　２４５−２５４（１９８
６）；該文献は参考として本明細書に引用する。〕この
結合アッセイを行うために、ヒト皮ふ繊維芽球を９６ウ
エルマイクロタイタープレート中で２〜８×１０４細胞
／ウエル（０，３２ｃｄ）に増殖させた。
細胞を実施例１で記載したようにして補充したＲＰＭ１
１６４０培地で２回洗浄した。細胞をさらにハンクス平
衡塩溶液（ＨＢＳＳ）　、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．
０５％ＮａＮ　３および１０％の熱不活化ウシ胎児血清
で１回洗浄した。この結合用バッファーでの洗浄は４℃
で行った。各ウェルに上記の結合用バッファー５０μｌ
およびＸ６３およびＷ６／３２による適当なハイブリド
ーマ上清５０ｍｊ２を、それぞれ陰性および陽性コント
ロールとして加えた。３０分間、４℃でのインキュベー
ション後、ウェルを２団結合用バフファーで洗浄し、第
２の抗体目５■−ヤギ抗マウスＩｇＧを１００μｉ中５
０ｎＣ４で加えた。目ＳＩ−ヤギ抗マウス抗体はイオド
ゲン（Ｐｔｅｒｃｅ社）を用いてＦｒａｋｅｒ＋　Ｐ、
　Ｊ、等の方法に従って調製した（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｍｍｕｎ、　８０
　：　８４９（１９７Ｂ））、４℃で３０分後、ウェル
を２凹２００１１１の結合用バッファーで洗浄し、細胞
層を１００ｔｔｌの０．　Ｉ　Ｎ　Ｎａ０）ｌを加える
ことによって可溶化した。この処理および１００μｌ洗
浄はバンクマン５５００ガンマーカウンター中で計数し
た。分当り結合の特異的カウントを〔モノクローナル抗
体によるｃｐｍ）　　　（Ｘ６３によるｃｐＩＩ！〕と
して計算した。特異的試剤による誘起を含むすべての工
程は４回繰返しで行った。
Ｉ　ＣＡＭ−１誘起における半減期２時間を有するイン
ターロイキン１の効果は半減期３．７５時間を有するガ
ンマ−インターフェロンの効果よりも急速であった（第
６図）、ＩＣＡＭの静止レベルに戻る時間は細胞サイク
ルまたは細胞増殖によっているようであった。静止状態
細胞においては、インターロイキン１およびガンマ−イ
ンターフェロン効果は２〜３日安定であり、一方対数期
培養においては、Ｉ　ＣＡＭ−１発現はこれら誘起剤の
除去後２日で基本線に近い。
組換えマウスおよびヒトインターロイキン１によるＩ　
ＣＡＭ−１誘起および組換えガンマ−インターフェロン
によるＩ　ＣＡＭ−１誘起のドーズレスポンス曲線を第
７図に示す。ガンマ−インターフェロンおよびインター
ロイキン１はｌｏｇ／ｍｚで殆んど同一の効果を有する
同じような濃度依存性を有することが判った。ヒトおよ
びマウス組換えインターロイキン１も同様な曲線を有す
るが、Ｉ　ＣＡＭ−１発現の誘起においてヒトインター
ロイキン１製剤よりもかなり低い効果を示している。
シクロヘキシミド（たん白質合成のインヒビター）およ
びアクチノマイシンＤ　（ｍＲＮＡ合成のインヒビター
）は繊維芽球上でのＩ　ＣＡＭ−１発現におけるインタ
ーロイキン１およびガンマ−インターフェロンの効果を
壊滅させる（第４表）。
さらにまた、ツニカマイシン（Ｎ結合グリコジル化のイ
ンヒビター）のみはインターロイキン１効果を４３％ま
で抑制した。これらの結果はたん白質およびｍ　ＲＮ　
Ａ合成がＩ　ＣＡＭ−１発現におけるインターロイキン
１およびガンマ−インターフェロン誘起増大において必
要であるがＮ−結合グリコシル化の方はそれを必要とし
ないことを示している。
第 対照（４ｈｒ） ＋シクロヘキシミド ＋アクチノマイシン　ロ ＋ツニカマイシン １Ｌ−１（ＬＨ／ｍ　ｌ　）（４ｈｒ）＋シクロヘキシ
イミド ＋アクチノマイシン　Ｄ ＋ツニカマイシン ＩＦＮ−ｒ　＜１００／ｍ　Ｉ！　）　（１８ｈｒ）本
シクロへキシミン ＋アクチノマイシン　Ｄ ４表 １５２４±１４０ １５１３±２１０ １５９０±　４６ １４６１土１７６ ４２６４±２４９ １６１９±３８１ １６１３±　８８ ３０８４±１１３ ４６５９±１０９ １４６１±５９ １３２６±１８６ １１９２８±６００ １０６７８±４７１ １２２７６±６０８ １２３４０±９４０ １２１５５±５１０ １２６７６±４４６ １２２９４±１２３ １３４３４±６６１ ２３６７５±５００ １０６７５土８００ １２０８９±５５０ １：）＄！ｌ維芽球ヲ８Ｘ　１０’　ｉＢｍｌｏ、　３
２ｃａｆウエルの密度に増殖させた。処理は各試剤を含
有する５０μＥ最終濃度で行った。シクロヘヰシミド、
アクチノマイシンＤおよびツニカマイシンは、それぞれ
、サイトカインと同じ時間で２０μｇ／ｒｍβ、１０μ
Ｍおよび２μｇ／ｒａｉ！で加えた。すべての数値は４
回重複ウェルの平均士ＳＤである。
実施例１３ Ｉ　ＣＡＭ−１の組織分布 組織化学試験をヒト器官の凍結組織上で行い胸腺、リン
パ節、届、皮ふ、じん臓および肝臓中のＩ　ＣＡＭ−１
の分布を測定した。そのような分析を行うために、正常
ヒト組織の凍結組織切片（４μｍ厚さ）をアセトン中で
１ｏ分間固定しモノクローナル抗体５ＲＲＩ／１でＣｅ
ｒｆ　−Ｂｅｎ５ｕｓｓａｎ＋Ｎ３等により開示された
アビジン−ビオチンコンプレックス法（Ｖｅｃｔｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリンゲーム、ＣＡ）
を用いたイムノパーオキシダーゼ法により染色した（Ｊ
、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３０　：　２６１５（１９
８３））、抗体とのインキュベーション後、切片をビオ
チン化ウマ抗マウスＩｇＧおよヒアヒチンービオチン化
パーオキシダーゼ複合体で順次インキュベートした。各
切片は最終的には３−アミノ−９−エチル−カルバゾー
ル（アルトリフチケミカル社、ミルウォーキー、Ｗｌ）
を含有する溶液に浸して呈色反応を行った。次いで、各
切片を４％ホルムアルデヒド中で５分間固定させてヘマ
トキシリンで対向染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎ）さ
せた。
コントロール（対照）はＲＲＩ／１抗体の代りに無関係
のモノクローナル抗体でインキュベートした切片を含ん
でいた。
Ｉ　ＣＡＭ−１は主要組織親和性コンプレックス（ＭＨ
Ｃ）クラス■抗原の分布と殆んど同じ分布を有している
ことが判った。すべての組織中の血管（大および小共に
）の殆んどはＩ　ＣＡＭ−１抗体による内皮細胞染色を
示した。管内皮染色はじん臓、肝臓および正常度ふ中の
血管に較べてリンパ節、へん桃腺およびバイヤー班中の
小胞間（パラコーチカル）領域でより強い、肝臓におい
ては、染色は殆んど洞様毛細血管ライニング細胞に限定
され、門静脈および動脈の殆んどをライニングしている
ヘパトサイトおよび内皮細胞は染色されなかった。
胸腺ずい質においては、大細胞の拡散染色および樹木染
色模様がみられた。皮質においては、染色像は巣状であ
り主として樹木状であった。胸腺細胞は染色されてなか
った。末梢リンパ球組織においては、２次リンパ濾胞の
胚中心細胞は強く染色していた。あるリンパ濾胞におい
ては、染色像は殆んど樹木状であり、リンパ球の認識し
得る染色はなかった。マントル領域の細胞のかすかな染
色も観察された。さらに、細胞質拡大（指間小網細胞）
を有する樹木状細胞および小胞内またはバラコーチカル
領域のリンパ球の小数はＩＣＡＭ−１結合性モノクロー
ナル抗体で染色していた。
細胞様マクロファージはリンパ節および小腸の薄膜プロ
ブリア内で染色されていた。試験した器官の殆んどのス
トローマ内に拡散している繊維芽球様細胞（スピンドル
形細胞）はＩ　ＣＡＭ−１結合性抗体により染色してい
た。外皮中のランゲルハンス／不定細胞中では染色は認
められなかった。
平滑筋組織中でも染色は観察されなかった。
外皮細胞の染色はへん桃線の粘膜中で一貫して見られた
。肝細胞、肝管外皮、腸外皮細胞、およびじん臓中の管
状外皮細胞は殆んどの情況において染色されなかったが
、じん細胞がん腫を有するしん摘出片からの正常じん臓
組織の切片はＩＣＡＭ−１の多くの隣接管状細胞の染色
を示した。これらの管状外皮細胞はまた抗ＨＬＡ−ＤＲ
結合性抗体によっても染色していた。
要するに、Ｉ　ＣＡＭ−１は管状外皮細胞のような非造
血細胞上、および組織マクロファージおよびマイトジェ
ン刺激Ｔリンパ芽球のような造血細胞上に発現する。Ｉ
　ＣＡＭ−１は末梢血リンパ球に少量発現することが判
った。
実施例１４ モノクローナル抗体アフィニティクロマトグラフィーに
よるＩ　ＣＡＭ−１の精製 二股何且製王皿 Ｉ　ＣＡＭ−１をヒト細胞または組織からモノクローナ
ル抗体アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製
した。Ｉ　ＣＡＭ−１と反応性のモノクローナル抗体Ｒ
Ｒ１／１を最初に精製して不活性カラムマトリックスに
結合させた。この抗体は”　Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，
等、Ｊ、　ｔｍｍｕｎｏ１、　　１３７　：　１２７０
−１２７４　（１９８６）”および“Ｄｕｓｔｉｎ、門
、Ｌ。
等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３７　：　２４５　
（１９８６）に記載されている。Ｉ　ＣＡＭ−１を細胞
膜から細胞を非イオン性清浄剤トリトンＸ−１００中で
近中性ｐＨで溶解１することによって可溶化した。可溶
化Ｉ　ＣＡＭ−１を含有する細胞溶解物をカラムマトリ
ックス材料に非特異的に結合する物質を除去するように
設計されたプレカラムに通し、次いでモノクローナル抗
体カラムマトリックスに通してＩ　ＣＡＭ−１を抗体に
結合させた。抗体カラムをｐＨをｐＨ１１，０まで上昇
させた一連の洗浄剤洗浄バッファーで洗浄した。これら
の洗浄中、ＩＣＡＭ−１は抗体マトリックスに結合した
ままであり、結合してないまた弱く結合している不純物
は除去された。次いで、結合Ｉ　ＣＡＭ−１をｐｉ（１
２，５の洗浄剤バッファーを適用することによってカラ
ムから特異的に溶出させた。
モノクローナル　　ＲＲ１／１の　　およびセ抗Ｘ　Ｃ
ＡＭ−１モノクロ一ナル抗体ＲＲＩ／１をハイプリドー
マ含をマウスの腹水または）＼イブリドーマ培養上清か
ら標準の硫酸アンモニウム沈降法およびプロティンＡア
フィニティークロマトグラフィーにより精製した（Ｅｙ
等、Ｉｍｍｕｎｏｅｈｅｍ。
１５：４２９　（１９７８））。精製１ｇＧまたはラフ
目ｇＧ　　（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）
をセファローズＣＬ−４Ｂ　　（ファルマシア社、スウ
ェーデン）にＭａｒｃｈ等の方法〔＾ｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、６０　：　１４９　　（１９７４）　
）の修正法を用いて共有結合させた。要するに、セファ
ローズＣＬ−４Ｂを蒸留水中で洗浄し、５Ｍのに、）Ｉ
ＰＯ。
（ｐＨ約１２）中の４　Ｏｎ＋ｇ／　ｒｓｌＣＮＢｒで
５分間活性化し、次いで０．１ｍＭＨＣｊｌ！で４℃に
て長く洗浄した。濾過し活性化したセファローズを等容
量の精製抗体（０，Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　、０．　Ｉ
　Ｍ　ＮａＣｌ中２−１０■／＋＊ｊりで再懸濁させた
。懸濁液を４℃で１８時間ゆるやかな端から端までの回
転によリインキュベートした。次いで、上清を未結合抗
体について２８０ｎｍの吸収によりモニターし、活性化
セファローズの残りの反応部位をグリシンを０．０５Ｍ
に加えることによって飽和させた。結合効率は通常９０
％以上であった。
ヒトひ　から　　した　の゛　　可 すべての手順を４℃で行った。ヘアリー細胞白血病の患
者からの凍結ヒトひ［（２００ｇフラグメント）を氷上
で１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｐ
ＭＳＦ）　、０．２Ｕ／　ｍｅのアプロチニンおよび５
ｍＭのイオドアセタミドを含有する２００ＩＩｌ！トリ
ス−塩水（５０ｍＭのＴｒｉｓ、０．１４ＭのＮａＣ１
、４℃でｐＨ７，４）中に？容量させた。Ｕ織を小片に
切断し４℃でチクマー強力ホモジナイザーで均質化した
。容量をトリス−塩水で３００ｍｊ２とし、トリス−塩
水中１０％トウィーン４０　（ポリオキシエチレンソル
ビタンモノパルミテート）１００ｎ＋ｊ２を加え最終濃
度２．５％トウィーン４０を得た。
膜を調製するため、均質化物を３ストロークのドンス（
Ｄｏｕｎｃｅ）またはより好ましくはテフロンボッター
エルブジャムホモジナイザーを用いて抽出し、次いで１
１０００Ｘで１５分間遠心した。
上清を残し、ペレットをトリス−塩水中の２．５％トウ
ィーン４０の２５Ｏｎ＋６で再抽出した。１１００Ｏｘ
で１５分間の遠心後、両袖出物からの上清を一緒にし１
５０．ＯＯＯｘｇで１時間遠心して膜をペレット化した
。膜を２００ｍｊ？のトリス−塩水中に再懸濁させるこ
とによって洗浄し、１５０，０００ｘｇで１時間遠心し
た。膜ベレットを２００＋ｎｌのトリス−塩水中に再懸
濁させ、モーター駆動ホモジナイザーおよびテフロンベ
ストルで懸濁液が濃密になるまで均質化した。容量を次
いでトリス−塩水で９００　Ｉｌｌまでにし、Ｎ−ラウ
ロイルサルコシンを最終濃度１％になるよう加えた。４
℃で３０分の攪拌後、洗浄剤溶解物中の不溶性物質を１
５０．ＯＯＯｘｇ、１時間での遠心により除去した。ト
リトンＸ−１００を上清に最終濃度２％に加え、溶解物
を４℃で１時間攪拌した。
ＪＹＢ−リンパ　　　　の　　　可 ＥＢＶ形質転換Ｂ−リンパ芽球細胞系ＪＹをｌＯ％ウシ
胎児血清（Ｆｅ２）および１０ｍＭＨＥＰＥＳを含有す
るＲＰＭ１１６４０中で０．８〜１．０Ｘ１０ｈ細胞／
ｍｌの密度に増殖させた。
Ｉ　ＣＡＭ−１の細胞表面発現を増大させるため、ホル
ボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）
を細胞を収穫する前に２５ｎｇ／ｍｆで８〜１２時間で
加えた。バナジン酸ナトリウム（５０μＭ）もこの時間
中に培養物に加えた。細胞を５００ｘｇで１０分間遠心
することによってベレット化しハンス平衡塩溶液（ＨＢ
ＳＳ）中で再懸濁および遠心することによって２回洗浄
した。
細胞（５１の培養物当り約５ｇ）を５０ｍｊ！の溶解バ
ッフｙ　−（０，１４Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ。
ｐＨ８，０，１％トリトンＸ−１００，０，２μ／慇ｌ
アプロチニン、１ｍＭのＰＭＳＦ、５０．ｕＭバナジン
酸ナトリウム）中に４℃で３０分間攪拌することによっ
て溶解させた。未溶解核および不溶性片を１０．ＯＯＯ
ｘｇで１５分間の遠心、次いで１５０、ＯＯＯｘｇでの
１時間の上清の遠心および上清のワンドマン３鶴フイル
タ一紙による濾過により除去した。
構造検討に使用するＩＣＡＭ−１の大規模精製として、
１０ＩＩＩｌのＲＲＩ／１−セファローズＣＬ−４Ｂの
カラム（２，５■の抗体／ゲルのｍｆｆ１で結合）、お
よびＣＮＢｒ−活性化、グリシン安定化セファローズＣ
Ｌ−４ＢおよびラットＩｇＧ結合セファローズＣＬ−４
Ｂ　（２ｗ／　ｌｌ１）の２種のプレカラムを用いた。
各カラムを直列につなぎ、１０カラム容量の溶解バッフ
ァー　１０カラム容量のｐＨ１２，５バツフアー（５０
ｍＭ　ｌ−リエチルアミン、０．１％トリトンＸ−１０
０，４℃でｐＨ１２、５）で予備洗浄し次いで１０カラ
ム容量の溶解バフファーで平衡させた。１１のヒトひ臓
の洗浄剤溶解物を０．５〜１．０＊ｊ！／分の流速で負
荷させた。２つのプレカラムはＲＲＩ／１−セファロー
ズカラムに通す前の溶解物から非特異結合物質を除去す
るのに用いた。
負荷後、ＲＲ１／１−セファローズのカラムおよび結合
Ｉ　ＣＡＭ−１を（１）溶解バッファー、（２）２０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８，０１０，１４Ｍ　Ｎａ（１１０
，１％トリトンＸ−１００、（３１２０ｍＭグリシンｐ
ｌ（１０，０１０、１％トリトンＸ−１００、および（
４）　５０　ｍ　Ｍ　トリエチルアミンｐ）１１１．０
１０．１％トリトンＸ−１００の各々最低５カラム容量
で１ｍｌ／分の流速で順次洗浄した。すべての洗浄バッ
ファーは１ｍＭのＰＭＳＦと０．２μ／糟βのアプロチ
ニンを含んでいた。洗浄後、残留結合Ｉ　ＣＡＭ−１を
５カラム容量の溶出バフファー（５０ｍＭ）リエチルア
ミン１０．１％トリトンＸ−１００／４℃でｐ［１１２
，５）によりｌｎｌ／３分の流速で溶出させた。
溶出Ｉ　ＣＡＭ−１を１　ｍｌｌシラシランに集め直ち
に０．１ｍｊ！のＩＭＦリス、ＰＨ６，７を加えて中和
させた。Ｉ　ＣＡＭ−１を含有するフラクションをｌＯ
μｌのアリコートの５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等、Ｊ、　Ｅｘ　、　ｌ’ｌｅｄ
、１６０：１９０１　　（１９８４））により次いで銀
染色（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　　Ｊ、　　Ｆ！、、　　
＾ｎａ１．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ｌ　１７　：３０７
　　（１９８１））によって同定した。これらの条件下
で、Ｉ　ＣＡＭ−１のバルクが約１カラム容量に溶出し
、銀染色電気泳動から判断して９０％以上の純度であっ
た（アフィニティーマトリックスから漏出した少量のＩ
ｇＧが主要不純物であった）。Ｉ　ＣＡＭ−１を含有す
るフラクションをプールしセントリコン−３０マイクロ
コンセントレータ−（アミコン社、デンバース、ＭＡ）
を用いて約２０倍に濃縮した。精Ｉ！ＩｃＡＭ−１をプ
ールのエタノール沈降アリコートのローリ−（Ｌｏｗｒ
ｙ　）たん白質アッセイにより定量した。約５００μｇ
の純ＩＣＡＭ−１を２００ｇのヒトひ臓から調製できた
。
約２００μｇの精製Ｉ　ＣＡＭ−１を分離用５ＯＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により第２段階の精製に
供した。Ｉ　ＣＡＭ−１を示すバンドはゲルをＩＭＫＣ
１中にソーキングすることによって可視化させた。ＩＣ
ＡＭ−１を含むゲル領域を検査して”　Ｈｕｎｋａｐｉ
ｌｌｅｒ等、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ１、　９１　：
２２７−２３６　（１９８３）　　”の方法によって電
気溶出させた。精製たん白質は５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび
銀染色で判断したとき９８％以上の純度であった。
官能性試験用のＩ　ＣＡＭ−１を前述したようなＪＹ細
胞からの洗浄剤溶解物から精製したが、小スケール（ｌ
　ｍｌｌのＲＲＬ／１−セファローズカラム）で次の修
正を加えて行った。すべての溶液は５０μＭバナジン酸
ナトリウムを含んでいた。
カラムを０．１％トリトンｘ−ｉｏｏ含有ｐＨ１１，０
バツフアーで洗浄後、カラムを０．１％トリトンＸ−１
００に代えて１％のｎ−オクチル−ベーター−Ｄ−グル
コピラノサイド（オクチルグルコシド）含有の同じバッ
ファー５カラム容量で再洗浄した。
オクチルグルコシド洗浄剤はＩ　ＣＡＭ−１に結合した
トリトンＸ−１００を除去し、トリトンＸ−１００と異
なりその後透析により除去できる。次いで、Ｉ　ＣＡＭ
−１を０．１％トリトンＸ−１００の代りに１％のオク
チルグルコシドを含むｐＨ１２，５バツフアーで溶出さ
せ、分析し、上述のようにして濃縮した。
実施例１５ ’ＩＣＡＭ−１の１ ヒトひ臓から精製したｒ　ＣＡＭ−１ば５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル中でＭｒ７２．０００〜９１．０００
の広いバンドとして浸透する。ＪＹ細胞から精製したＩ
　ＣＡＭ−１もＭｒ７６．５００〜９７．０００の広い
バンドとして浸透する。これらＭｒは種々の細胞源から
免疫沈降させたＩＣＡＭ＝１の報告された範囲にある：
ＪＹ細胞からのＭｒ＝９０．０００、骨ずい単球細胞系
Ｕ９３７上の１１４，０００、および繊維芽球上の９７
．０００（Ｄｕｓｔｉｎ等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　
　１３７　：　２４５（１９８６））。Ｍｒのこの広い
範囲は広汎であるが変化し得る度合のグリコジル化に貢
献する。
非グリコジル化プレカーサーはＭｒ５５，０００を有す
る（Ｄｕｓｔｉｎ等）、ＪＹ細胞またはヒトひ臓から精
製したたん白質は、その元のアフィニティカラムへの再
結合能力によりまたＲＲＩ／１セファローズによる免疫
沈降および５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により
明らかなように、その抗原活性を保持している。
ＩＣＡＭ−１のペプチドフラグメントを調製するために
は、約２００μｇを２ｍＭジチオスレイトール／２％Ｓ
ＤＳで還元し、次いで５ｍＭの沃化酢酸でアルキル化し
た。たん白質をエタノールで沈降させ、Ｏ，ＩＭ　ＮＬ
ｃｏｚ　１０．１＋ｎＭ　ＣａＣ６ｚ　７０、１％双性
イオン剤（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）　３−１４（カル
ビオケミ社）中に再溶解させ、１％Ｗ／Ｗ　）リブシン
で３７℃、４時間消化し、次いで１％トリプシンで３７
℃、１２時間の追加の消化を行った。トリプシンペプチ
ドを逆相ＨＰＬＣにより０．４Ｘ１５ｃｍＣＪカラム（
Ｖｙｄａｃ社）を用いて精製した。ペプチドは０．１％
トリフルオロ酢酸中で０％〜６０％アセトニトリルの直
線勾配によって溶出した。選択したペプチドをガス相マ
イクロシーケネーター（アプライドバイオシステムズ社
）での配列分析に供した。この試験から得られた配列情
報を第５表に示す。
実施例１６ Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子のクローニング Ｉ　ＣＡＭ−１の遺伝子は任意の種々の手順を用いてク
ローニングできる。例えば、ＩＣＡＭ−１のトリプシン
フラグメントのシーケンシング（第５表）から得られた
アミノ酸配列情報を用いてＩ　ＣＡＭ−１遺伝子に相当
するオリゴヌクレオチド配列を同定し得る。また、ｆ　
ＣＡＭ−１遺伝子は抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体を用いてＩ　
ＣＡＭ−１を産生ずるクローンを検出することによって
もクローニングできる。
遺伝子コード（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、口、、　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ　　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第
３版、讐、＾９ベンジャミン社、メロノパーク、ＣＡ（
１９７７））を用いて、１種以上の異なるオリゴヌクレ
オチドを同定でき、その各々はＩＣＡＭ−１）リプシン
ペプチドをコードし得るものである。特定のオリゴヌク
レオチドが実際に現実のＩ　ＣＡＭ−１コ一ド配列を構
成する可能性は異常な塩基対関係および特定のコドンを
現実に真核細胞に用いて（特定のアミノ酸をコードする
）頻度を考慮することによって評価できる。そのような
６コドン利用法則”は“Ｌａ　ｔｈｅｌ　Ｒ，等、Ｊ、
　Ｍｅｌｅｃ、　Ｂｉｏ１、　　１８３　：　ｌ　〜１
２（１９８５）　　”により開示されている。
Ｌａ　ｔｈｅの“コドン利用法則”を用いて、理論的に
１最も可能性のある”ＩＣＡＭ−１）リプシンペプチド
配列をコードし得るヌクレオチド配列（即ち、最低の不
要物を有するヌクレオチド配列）を含有する単一オリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセントを同定
する。
Ｉ　ＣＡＭ−１フラグメントをコードし得る理論的に“
最も可能性のある”配列を含むオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドのセットを用いて“最も可能性あ
る”配列または配列のセットにハイブリッド化し得る相
補オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセッ
トの配列を同定する。そのような相補配列を含むオリゴ
ヌクレオチドはＩ　ＣＡＭ−１遺伝子を同定し単離する
ブロ−ブとして使用できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、
等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎ　　Ａ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ＋コールド　スプリング
　ハーバ−プレス社、コールドスプリング、ＮＹ（１９
Ｂ２））。
上記文献のセクションＣに記載されているように、Ｉ　
ＣＡＭ−１遺伝子を含有する可能性ある真核ＤＮＡ調製
物からＩ　ＣＡＭ−１遺伝子をクローニングすることは
可能である。ＩＣＡＭ−またん白質をコードする遺伝子
を同定しクローニングするためには、ＤＮＡライブラリ
ーをその上記のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ッド化する能力についてスクリーニングする。正常な二
倍体細胞中にはＩ　ＣＡＭ−１の遺伝子のほんの２つの
コピーしか存在しないようであるので、またＩＣＡＭ−
１遺伝子はクローニングが望まれない大きな非転写介在
配列（イントロン）を有し得る可能性があるので、好ま
しいのはゲノムＤＮＡよりはむしろＩ　ＣＡＭ−１産生
性細胞のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーか
らｆ　ＣＡＭ−１コ一ド配列を単離することである。適
当なりＮＡまたはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｌｉ製物は酵素的に
開裂させ、ランダムにせん断し、連結反応させて組換え
べクターとする。
次いで、これら組換えべクターの上述のオリゴヌクレオ
チドプローブとハイブリッド化する能力を測定する。ハ
イブリッド化の手順は、例えば、”ＭａｎｉａｔｉｓＴ
ｏｌＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｔｎｇ　Ａ　Ｌａｂ
ｏ−ｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＬコールド　スプリング
　パーバープレス社、コールド　スプリング　ハーバ−
ＮＹ　（１９８２）”または’　Ｈａｙｍｅｓ、　Ｂ、
　Ｔ、等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｔ
ｚａｔｉｏｎ　ａ　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃ
ｈ、　　Ｉ　ＲＬブレス社、オックスフォード、英国（
１９８５）　　”において開示されている。そのような
ハイブリッド化ができることが判っているベクターを分
析してベクターが含有するＩＣＡＭ　−１配列の程度お
よび性質を分析する。純粋に仮説的な考察によれば、Ｉ
　ＣＡＭ−１分子をコードするような遺伝子はほんの１
８ケのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを用い
て明確に同定できるであろう　（ハイブリッド化スクリ
ーニングにより）。
即ち、要約すれば、Ｉ　ＣＡＭ−１ペプチド配列の現実
の同定により、そのようなペプチドをコードし得る理論
的に“最も可能性あるＤ　Ｎ　Ａ配列またはそのような
配列のセットの同定ができる。
この理論的配列に相補性のオリゴヌクレオチドを構築す
ることにより（あるいは“最も可能性ある”オリゴヌク
レオチドのセットに相補的なオリゴヌクレオチドのセッ
トを構築することによｊＱ）、Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子を
同定し単離するプローブとして機能し得るＤＮＡ分子（
またはＤＮＡ分子のセット）が得られる。
第５表のＩ　ＣＡＭ−１ペプチド配列を用いて、ＡＡお
よびＪペプチドをコードし得るオリゴヌクレオチドの“
最も可能性ある”配列の配列を決定したくそれぞれ、第
６表および第７表）。これら配列に相補性のオリゴヌク
レオチドを合成し精製してＩ　ＣＡＭ−１遺伝子配列を
単離するプローブとした。適当なサイズ選定ｃＤＮＡラ
イブラリーをＰＭＡ誘起ＨＬ−６０細胞からおよびｐｓ
刺激へそ帯静脈内皮細胞からのポリ（Ａ）’　ＲＮＡか
ら調製した。サイズ選定ｃＤＮＡライブラリーは”　Ｇ
ｕｂｌｅｒ、　Ｕ、等（Ｇｅｎｅ　　２５　：　２６３
　２６９（１９８３））およびＣｏｒｂｉ、　Ａ、等（
ＥＭＢＯムエ１４０２３−４０２８　（１９８７））の
方法に従ってＰＭＡ誘起ＨＬ−６０細胞からのポリ（Ａ
）”　ＲＮＡを用いて調製した。これらの文献は参考と
して本明細書に引用する。
サイズ選定ｃ　ＤＮＡライブラリーはＰＳ５μｇ／ｌｌ
で４時間刺激したへそ帯静脈内皮細胞からのポリ　（Ａ
）“を用いて調製した。ＲＮＡは上記細胞を４Ｍグアニ
ジニウムイソシアネート中で均質化し上清をＣｓＣｌ勾
配により超遠心に供することによって抽出した（Ｃｈｉ
ｒｇｗｉｎ、　Ｊ、　Ｍ、等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：
５２９４　５２９９（１９７９））。
ポリ　（Ａ）”　ＲＮＡは全ＲＮＡスベイシスの混合物
からオリゴ（ｄＴ）−セルロースクロマトグラフィー（
タイプ３、コラボラティブ　リサーチ社）を用いて単離
した（Ａｖｉｖ、　Ｈ，等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。
＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）６９：１４０８　１４１
２（１９７２））。
ｏｏｓｕｕｕｏｏ＜ｏＯ←ｕｏ＜ｕ＜＜＜ｏ←０叩←←
０ｓｏｏ＜。
００　　　■　　ロ　　　−　　〜　　曽　　　啼ｃｏ
　　　ｃｏ　　　！”−ト　　ト　　ト　　トのロト ト　　ト　　ト つＯ←ｏｏ＜ｏｏ＜○＜ｏＥ−ｏｏ←ｏ００ａ＋←叩ｖ
ａ＜ｏａ←００←ｏｓｏ＜ｕｏ＜ｏＯｏｕ＜＜の第１の
ストランドｃＤＮＡを８μｇのポリ（Ａ）”　ＲＮＡ、
！−リ骨ずい芽球症ウィルス逆転写酵素（ライフサイエ
ンス社）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーと用いて合成
した。ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドはラナーゼＨ（ＢＲ
Ｌ社）で消化、第２ストランドはＤＮＡポリメラーゼＩ
にューイングランド　バイオラブ入社）を用いて合成し
た。生成物をＥｃｏＲＩリンカ−にューイングランド　
バイオラブ入社）でメチル化し、ＥＣ０ＲＩリンカ−に
ューイングランド　バイオラブ入社）にプラントエンド
連結反応させ、ＥＣ０ＲＩで消化し低融点アガロースゲ
ル上でサイズ選定した。５ｏｏｂｐより大きいｃＤＮＡ
を前取てＥｃｏＲＩ消化させ脱リン酸化させているλｇ
ｔＬｏに連結反応させた（ストラタジーン）。
連結反応生成物を次いでパッケージツクした（ストラタ
ジーンゴールド）。
次に、へそ帯静脈内皮細胞およびＨＬ　−６０ｃ　ＤＮ
Ａライブラリーを２０．０００ＰＦμ／１５０鶴プレー
トに塗布した。組換えＤＮＡを複製中でニトロセルロー
スフィルターに移Ｌ、０．５ＭＮａＯＨ／　１．５　Ｍ
　ＮａＣｌ中で変性しＩＭ）リス、ｐＨ７、５／　１．
５　Ｍ　ＮａＣ１中で中和し、８０℃で２時間ベーキン
グした（Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、　Ｄ、等、５ｃｉｅｎｃ
ｅ１９６：１８０−１８２　（１９７７））。フィルタ
ーをプレハイブリ７ド化し、５　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ
溶液、５０　ｍ　Ｍ　ＮａＰＯ＊および１μｇ／１１１
のサケ精子ＤＮＡを含むＳ　Ｘ５ＳＣ中でハイブリッド
化した。プレハイブリッド化は４５℃で１時間行なった
。
ハイブリッド化は３２　ｂｐ　（’　５−ＴＴＧＧＧＣ
ＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＧＴＧＡ
Ｃ）または４７　ｂｐ　（５’　−ＧＡＧＧＴＧＴＴＣ
ＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣ
ＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣ）抗感覚オリゴヌクレオチ
ドを上述の方法で、それぞれ、ＩＣＡＭ−１トリプシン
ペプチドＪおよびＡＡ　（第６表および第７表）上で用
いて行なった（Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，Ｊ、　Ｍｅ！ｅｃ、
　Ｂｉｏ１、　　１８３　：　１−１２（１９８５））
、オリゴヌクレオチドはｒ−（”Ｐ）ＡＴＰでＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼおよび製造者にューイングランド
　バイオラブ入社）に推奨される条件４用いて末端標識
した。
オーバーナイトハイブリッド化に続いて、フィルター２
ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで３０分間、４５℃で２回洗
浄した。ファージをハイブリッド化を示すプラーグから
単離し、連続再塗布および再スクリーニングにより精製
した。
Ｉ　ＣＡＭ−１の遺伝子を別法として抗Ｉ　ＣＡＭ−１
抗体の使用によりクローニングできる。ＤＮＡまたはよ
り好ましくはｃＤＮＡをＩ　ＣＡＭ−１を発現し得る細
胞から抽出し精製する。精製ｃＤＮ＾をフラグメント化
しくせん断化、エンドヌクレアーゼ消化等により）ＤＮ
ＡまたはｃＤＮＡフラグメントのプールを調製する。こ
のプールからのＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを発
現ベクターにクローニングして各々のメンバーが特異的
クローン化ＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを含有す
る発現ベクターの遺伝子ライブラリーを調製する。
実施例１７ ｃＤＮＡクローンの分析 陽性クローンからのファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化
し、１つのクローンからのｃＤＮＡをプローブとして用
いてサウサーン分析により試験した。
交差ハイブリッド化した最大サイズｃＤＮＡ挿入物をプ
ラスミドベクターｐＧＥＭ４Ｚ　（プロメガ社）のＥｃ
ｏＲＩサイトにサブクローニングした。
再配向でｃＤＮＡを含むＨＬ−６０サブクローンをエン
ドヌクレアーゼ■消化（Ｆｌｅｎｉｋｏｆｆ、　ｓ、＋
Ｇｅｎｅ　　２８：３５１　３５９　（１９８４））に
より製造者の推奨（エラスーアーベース、プロメガ社）
に従って欠落させた。漸次的に欠落させたｃＤＮＡを次
いでクローニングしてジデオキシヌクレオチド鎖終端シ
ーケンシングに製造者の推奨（シーケナーゼ、Ｕ、　Ｓ
、バイオケミカル社）に従って供した（Ｓａｎｇｅｒ、
　Ｆ、等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ。
（１９７７））、ＨＬ−６０ｃＤＮＡ５’およびコード
領域を両ストランド上で完全にシーケンシングし、３′
領域を両ストランド上で約７０％シーケンシングした。
代表的な内皮ｃＤＮＡをその長さの殆どに亘って４ｂｐ
認識制限酵素フラグメントのショトガンクローニングに
よりシーケンシングした。
１種のＨＬ−６０および１種の内皮細胞ｃＤＮ＾のｃＤ
ＮＡ配列を確立した（第８図）、３０２３ｂｐ配列は短
い５′未はん訳領域と位置２９６６に共通ポリアゾヒル
化シグナルを有する１、　３　ｋ　ｂ３′未はん訳領域
を含む。最長開放読み枠は位置５８の第１ＡＴＧで始ま
り位置１６５３のＴＧＡ終端トリブレットで終る。はん
訳アミノ酸配列と合計９１個のアミノ酸の８種の異なる
トリプシンペプチドから決定した配列（第８図中でアン
ダーラインを施している）との間の同一性は信軌できる
Ｉ　ＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローンが単離されたことを確
認した。ＩＣＡＭ−１）リブシンペプチドのアミノ酸配
列を第８表に示す。
疎水性分析（Ｋｙｔｅ、　Ｊ、等、Ｊ、　Ｍｅｌｅｃ、
　Ｂｉｏｌ。
１５７：１０５−１３２　（１９８２））は２７残基シ
グナル配列の存在を示唆している。＋１グルタミンの役
目は３種のＩ　ＣＡＭ−またん白質調製物上にＮ−末端
配列を本発明で得ることができないことと一致しており
；グルタミンはフィログルタミン酸に環状化しブロック
したＮ−末端をもたらす。１〜４５３のほん訳配列は主
として親水性であり２４残基の疎水性の推定トランスメ
ンブランドメインが続く。トランスメンブランドメイン
はその後すぐに２７残基の推定細胞質ドメイン内に含ま
れた数個の荷電残基が続く。
成熟ポリペプチド鎖の予示すイズは５５，２１９ダルト
ンであり、脱グリコジル化Ｉ　ＣＡＭ−１の観察された
サイズ５５．０００と良好に一致している（Ｄｕｓｔｉ
ｎ、　Ｎ、　Ｌ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　１３７
　：２４５−２５４　（１９８６））。８個のＮ−結合
グリコシル化部位が予示される。これらの部位の２つの
トリプシンペプチド配列中のアスパラギンの不存在はそ
れらのグリコジル化とそれらの細胞外配向を確認してい
る。高マンノースＮ−結合カルボハイドレート当り２．
５００ダルトンを想定すると、７５．０００ダルトンの
サイズがＩ　ＣＡＭ−１プレカーサーについて予示され
、観察されたサイズ７３．０００ダルトン（Ｄｕｓｔｉ
ｎ、　Ｍ、　Ｌ、等、Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏ１、１３７：２４５　２５４　（１９８６
））に匹敵する。高マンノースのコンプレックスカルボ
ハイドレートへの転換後、成熟Ｉ　ＣＡＭ−１１！たん
白質は細胞の種類により７６〜１１４Ｋｄである（Ｄｕ
ｓｔｉｎ、　Ｍ、　Ｌ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　
　ｌ　３７　：２４５−２５４　（１９８６））。即ち
、Ｉ　ＣＡＭ−１は高度にグリコジル化されているが典
型的な完全膜たん白質である。
実施例１８ Ｉ　ＣＡＭ−１は免疫グロブリン超遺伝子群のインケグ
リン結合性１員である： Ｉ　ＣＡＭ−１内部繰返し配列をミクロジ一二（Ｍｉｃ
ｒｏｇｅｎｉｅ）たん白質配列プログラム（Ｑｕｅｅｎ
。
Ｃ１等、Ｎｕｃ１、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　　１２　：
　５８１−５９９（１９８４））を用い次いで検査する
ことにょうて行なった。ＩＣＡＭ−１のＩ　ｇＭＳＮ−
ＣＡＭおよびＭＡＧへの配列をミクロジ一二およびＡＬ
ＩＧＮプログラム（Ｄａｙｐｏｆｆ、　Ｍ、　Ｏ，等、
Ｍｅｔｈ。
Ｅｎｚｍｏ１、　９１　：５２４−５４５　（１９８３
）　）を用いて行なった。ナショナル　バイオメゾカル
リサーチ　ファンデーション（Ｎａｔｔｏｎａｌ　Ｂｉ
ｏｍｅ−ｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ　）に保管されている４種のたん白質配列デー
タベースをＷｉｌｌｉａｍｓとＰｅａｒｓｏｎのＦＡＳ
ＴＰプログラムを用いてたん白質配列の類似性について
調査した（Ｌｉｐｎ＋ａｎ、　Ｄ、　Ｊ。
等、５ｃｉｅｎｃｅ　２２７　：　１４３５−１４３９
（１９８５）　）。
Ｉ　ＣＡＭ−１はインテグリンのりガントであるので、
免疫グロブリン超遺伝子群の１員であることは予期され
なかった。しかしながら、ＩＣＡＭ−１配列の調査はそ
の配列が免疫グロブリン超遺伝子群中の身内関係に提唱
されたすべての規準を満たすことを示している。これら
の基準を以下に説明する。
Ｉ　ＣＡＭ−１の全細胞外ドメインを第９Ａ図に配列し
て示した５つの相同性免疫グロブリン様ドメインから構
築する。ドメイン１−４はそれぞれ８８．９７．９９お
よび９９の残基長であり、かくして典型的な１ｇドメイ
ンサイズを有しており；ドメイン５は６８個の残基中で
切り取られている。
ＦＡＳＴＰプログラムを用いてのＮＢＲＦデータベース
の調査はＩｇＭとＩｇＧ　　Ｃドメインを包含する免疫
グロブリン超遺伝子群の１員、Ｔ細胞レセプターαサブ
ユニット可変ドメイン、およびアルファｌベータ糖たん
白質と有意の相同性を示していた（第９８−Ｄ図）。
上記の情報を用いて、ＩＣＡＭ−１のアミノ酸配列を免
疫グロブリン超遺伝子群の他の１員のアミノ酸配列と比
較した。
１ｇ超遺伝子群ドメインの３つのタイプであるＶ、Ｃ１
およびＣ２は分化されている。ＶとＣの両ドメインは内
部ドメインジスルフィド結合により一緒に結合している
２β−シートから構築されており：■ドメインは９つの
抗平行β−ストランドを育しＣドメインは７つ有してい
る。定常ドメインを第９Ａ図に示した特徴的残基に基づ
いてＣ１およびＣ２−セットに分割した。Ｃ１−セット
は抗原認識中に含まれるたん白質を含んでいる。
Ｃ２−セントは数個のＦｅレセプターとＣＤ２、ＬＦＡ
−３、ＭＡＧおよびＮＣＡＭを包含する細胞粘着中に含
まれるたん白質とを含んでいる。
Ｉ　ＣＡＭ−１ドメインはこのセント中でＩＣＡＭ＝１
と置き変っているＣ２−セントのドメインと最も強い相
同性を有することが判った；このことは第９図のβ−ス
トランドＢ−Ｆについて示されているようにＣＩドメイ
ンよりもＣ２中の保持残基により強く類似している点に
も反映されている。
また、Ｉ　ＣＡＭ−１ドメインは■およびＣ１ドメイン
中の上記ストランドとよりもＣ２ドメインのβストラン
ドＡおよびＧとより一層良好に列んでおり、全０２ドメ
イン強度を横切って良好な配列を可能としている。ＮＣ
ＡＭＳＭＡＧおよびアルファ１−β糖たん白質からの０
２ドメインとの配列は第９Ｂ図および第９Ｃ図に示され
ており；同一性は２８〜３３％の範囲であった。７Ｍ１
１胞レセプタ−Ｖα２７％同−性およびＩｇＭ　　Ｃド
メイン３３４％同一性との配列も示されている（第９Ｂ
、９Ｂ図）。
免疫グロブリンドメインの最も重要な特徴の１つはβシ
ートサンドインチを安定化するＢおよびＦβストランド
を架橋するジスルフィド結合システィンであり；ＩＣＡ
Ｍ−１においてはシスティンはすべての場合に保持され
ているが、ドメイン４のストランドｆにおいては、上記
サンドインチに面しかついくつかの他のＶ−およびＣ２
−セットドメインにおいて提案されたような接触を安定
化しているロイシンが見い出される。システィン（４３
，５０，５２および３７残基）間の距離は０２セツトに
ついて述べたとおりである。
Ｉ　ＣＡＭ−１中の値開ジスルフィド結合の存在につい
て試験するために、内皮細胞Ｉ　ＣＡＭ−１を還元およ
び非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。内皮細胞
Ｉ　ＣＡＭ−１はこれがＪＹまたは毛状ひ臓細胞Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１よりも小さいグリコジル化異種原性を示しＭｒ
中のシフトにより太きな感応性を示すことから使用した
。従って、ＩＣＡＭ−１を１６時間ＬＰＳ　（５μｇ／
ｒｎｆ）刺激ヘソ帯静脈内皮細胞培養物から前述したよ
うなイノムアフィニティークロマトグラフィーにより精
製した。アセトン沈降ＩＣＡＭ−１を０．２５％２−メ
ルカプトエタノールまたは２５ｍＭイオドアセタミド含
有のサンプルバッファ　−（Ｌａｅｒｎｍｌｉ、　Ｕ、
　Ｋ、。
Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　：６８０−６８５　　（１９
７０）Ｅ中に再懸濁させ１００℃に５分間もたらした。
サンプルを５ＤＳ−ＰＡＧＥ４６７０および銀染色４６
１３に供した。内皮細胞ＩＣＡＭ−１は還元条件下で１
ｏＯｋｄの見掛けのＭｒをまた非還元条件下で９５ｋｄ
を示し天然ＩＣＡＭ−１中の鋼量ジスルフィドの存在を
強く示唆していた。
二次構造を予想するだめの一次配列の使用（Ｃｈｏｎ、
　Ｐ、　Ｙ、　等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３：　２１１
−２４５（１９７４））は、第９Ａ図上方にａ−ｇと表
示され、免疫グロブリンドメインについての予想を正確
に満たしまた免疫グロブリン中のストランドＡ−Ｈの各
位置（第９Ａ図下方）に相応する各Ｉ　ＣＡＭ−１ドメ
イン中の７つの予期されたβ−ストランドを示していた
。ドメイン５はＡおよびＣストランドを欠損しているが
、これらはシートの端部を形成しているので、各シート
は依然として恐らくはストランドＤによって形成してお
りいくつかの他の０２ドメインで提案されたようにスト
ランドＣの代理をしており；またＢおよびＦストランド
間の特徴的ジスルフィド結合は影響を受。
けないであろう、即ち、ドメインサイズ、配列相同性、
推定ドメイン間ジスルフィド結合を形成する保持システ
ィン、ジスルフィド結合の存在、および予想βシート構
造の基準はすべて免疫グロブリン超遺伝子群中でのＩ　
ＣＡＭ−１の内在を満たしている。
ＩＣＡＭ−１は０２セントのＮＣＡＭおよびＭＡＧｌｉ
たん白質と最も強く相同性であることが判明した。この
ことはＮＣＡＭとＭＡＧが共に細胞−細胞粘着を媒介す
るので特に興味深い、　ＮＣＡＭはニューロンーニエー
ロンおよび神経−筋相互作用において重要であり（Ｃｕ
ｎｎｉｎｇｈａｍ、　ａ、　Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　
　２３６：７９９　８０６　　（１９８７））、またＭ
ＡＧはミニリン化（ｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）中のニュ
ーロン−オリゴデンドロサイトおよびオリゴデントロサ
イトーオリゴデントロサイト相互作用において重要であ
る（Ｐｏｌｔｏｒａｋ、　Ｍ、　　等、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ
。
Ｒｉａ１、１０５；１８９３−１８９９　（１９８７）
）。
ＮＣＡＭとＭＡＧの細胞表面発現は神経系形成およびミ
リエン化中に、それぞれ、炎症におけるｔｃＡＭ−１の
調整された誘起と類似して発展的に調整されるｌ’ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、＾、　等、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ。
Ｉｍｍｕｎｏ１、　５：２２３−２５２　（１９８７）
］。
ＩＣＡＭ−１、ＮＣＡＭ　［：Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、
　８．Ａ、　等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　７９９
−８０６　（１９８７）”Ｊ、右よびＭＡＧ　（Ｓａｌ
ｚｅｒ、　Ｊ、Ｌ、　　等、Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏ１、　１０４：９５７−９６５　（１９８７））
は全体構造において類似しまた相同性である、何故なら
ば、各々はＮ末端細胞外領域を形成する５つのＣ２ドメ
インから構成された完全膜糖たん白質であるからである
。ただし、ＮＧＡＭにおいては、ある追加の非１ｇ様配
列が最後のＣ２ドメインとトランスメンブランドメイン
間に存在する。ＩＣＡＭ−１はトランスメンブランと細
胞質ドメインを含むその全体長に亘ってＭＡＧと２１％
の同一性を有して列んでおり；同一％の同一性がＩＣＡ
Ｍ−１とＮＧＡＭ−１の５つのドメインを比較したとき
見出される。ＩＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の図式的
比較は第１０図に示している。ドメイン対ドメインの比
較はＩＣＡＭ−１とＮＣＡＭ分子内のドメイン間の相同
性のレベル（それぞれ、Ｘ±ｓ、ｄ、２１±２．８％お
よび１８．６±３．８％）はＩＣＡＭ−１ドメインをＮ
ＣＡＭおよびＭＡＧドメインと比較したときの相同性の
レベル（それぞれ、２０．４±３．７および２１．９±
２．７）と同じであることを示している。Ｎ　ＣＡＭ　
（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ。
Ｂ、Ａ、等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３６　：　７９９−８
０６（１９８７）　］　；８ａｒｔｈｅｌｓ、　０．等
、ＥＭＢＯＪ。
６：９０７−９１４　（１９８７））およびＭＡＧ（Ｌ
ａｉ、　Ｃ，等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）８４：４３７７−４３４１　（１
９８７））（７）Ｃ−末端領域における別の接合の証拠
は存在するけれども、これが内皮またはＨＬ−６０ＩＣ
ＡＭ−１クローンのシーケンシングにおいであるいは種
々のタイプのＩ　ＣＡＭ−またん白質バックボーンおよ
びプレカーサーの研究（Ｄｕｓｔｉｎ、　Ｍ、　Ｌ、等
、ムＩｍｍｕｎｏ１．１３７：２４５−２５４　（１９
８６））において見出されたという証拠はない。
Ｉ　ＣＡＭ−１は多くの種々の細胞種とのリンパ球相互
作用におけるＬＦＡ−１用のリガントとして機能する。
リンパ球は人工膜２重層に含まれたＩ　ＣＡＭ−１と結
合し、これはリンパ球上にＬＦＡ−１を必要としＩ　Ｃ
ＡＭ−１とＬＦＡ−１の相互作用を直接示唆している（
Ｍａｒｌｉｎ、　Ｓ、　Ｄ、等、Ｃｅ１ｌ　５１：８１
３　８１９　（１９８７））−ＬＦＡ−１は白血球イン
テグリンであり免疫グロブリン様特徴を有しない、白血
球インテグリンは１種のインテグリン亜族を含む、他の
２つの亜族は細胞マトリックス相互作用を媒介し、フィ
ブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンおよびフィ
フリノーゲンを包含するそのリガント内の配列ＲＧＤを
認識する（Ｈｙｎｅｓ、　Ｒ，Ｏ，ｓ　Ｃｅ１ｌ　４８
　　：５４９−５５４　　（１９８７））　　；　　Ｒ
ｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｅ。
等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：　４９１−４９７（１
９８７）　）　−白血球インテグリンは白血球上のみに
発現し、細胞−細胞相互作用に含まれ、わずかに公知の
リガントはＩ　ＣＡＭ−１と１ｃ３ｂ（即ち免疫グロブ
リン様特徴を示さない補体成分Ｃ３のフラグメント）で
あり、Ｍａｃ−Ｌによって認識される〔にｔｓｈｉｍｏ
ｔｏ、　Ｔ、　Ｋ８等、Ｌｅｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ　　ｉ
ｎｇ　ｍ。
Ｍ　ｃ　Ｍ　ｉ　　Ｃｈａｅ１、　Ｍ、）Ｊｉ、スプリ
ンガー　ベルラーグ、ニューヨーク（１９８７）　　；
　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ＋　Ｔ、Ａ。
等、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　５　：
　２２３−２５２（１９Ｂ　？　）　　：　Ａｎｄｅｒ
ｓｏｎ、　Ｄ、　Ｃ，等、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。
Ｗｅｄ、３８：１７５−１９４　（１９８７））、配列
分析により、ＬＦＡ−１によりＵ２識されるＩＣＡＭ−
１配列内の潜在的ペプチドは第９表に示す。
第９表 ＬＦＡ−１に認識され得る Ｉ　ＣＡＭ−１内のポリペプチド −Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｅ−に−Ｅ−Ｌ− −Ｒ−Ｇ−８−に−ＩＥ−Ｌ−に一貸−Ｅ−Ｐ−−Ｌ−
Ｒ−Ｇ−［！−に−［！−Ｌ−に−Ｒ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｖ
−Ｇ−Ｅ−Ｐ−Ａ−Ｅ−−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｓ− −Ｐ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−１？−に− −Ｑ−Ｅ−Ｄ−５−Ｑ−Ｐ−台 −Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｒ−Ｖ−Ｅ−Ｌ−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｐ−５−
−Ｒ−Ｒ−Ｄ−）１−１（−Ｇ−＾−Ｎ−Ｆ−３−−Ｄ
−Ｌ−Ｒ−Ｐ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−［！−Ｉ　ＣＡＭ−１はイ
ンテグリンに結合する免疫グロブリン超遺伝子群の１員
の最初の例である。これらの群の両方は細胞粘着におい
て重要な役割を発揮するけれども、両者間の相互作用は
以前には予期されてなかった。これに対し、免疫グロブ
リン超遺伝子群内の相互作用は全（一般的である。
インテグリンと免疫グロブリン群との間の相互作用のさ
らなる例が発見されるであろうことは全く可能である。
ＬＦＡ−１はＩ　ＣＡＭ−１とは異なるリガントを認識
しく　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ＋　Ｔ、Ａ、等、展ＲｅＮ／、
　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　５　：　２２３−２５２　（１
９８７）　）、白血球インテグリンＭａｃ−１は好中球
−好中球粘着のＣ３ｂ１と異なるリガントを認識する（
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　。
Ｏ，Ｃ，等、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、　　３８　
：　１７５−１９４（１９Ｂ？＞）、さらにまた、精製
したＭＡＧ含有ベシクル（小胞）はＭＡＧであるニュー
リフト（ｎｅｕｒｉｔｅｓ　）に結合し、かくしてＭＡ
Ｇは異種レセプターと異好性相互作用可能でなければな
らない（Ｐｏ１ｔｏｒａｋ、　Ｍ、等、Ｊ、　Ｃｅ１１
．　Ｂｉｏ１、　　１０５：１８９３−１８９９　（１
９８７）：ｌ。
神経−神経および神経−筋肉細胞相互作用におけるＮＣ
ＡＭの役割は同種親和性ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用に
基づくことは示唆されている（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、
　　Ｂ＋＾０等、　５ｃｉｅｎｃｅ　　２　３　６　　
：　　７　９　９−８０６　（１９８７）］。ミニリン
鞘形成中に軸索を取り込むシュヴアン細胞の隣近回転ル
ープ間の相互作用におけるＭＡＧの重要な役割は異種レ
セプターとの相互作用または同種親和性ＭＡＧ−ＭＡＧ
相互作用に基づき得る。ＮＣＡＭとの相同性および免疫
グロブリン超遺伝子群内でのドメイン−ドメイン相互作
用の頻繁な出現はＩＣＡＭ−１が同種親和性相互作用並
びにＩ　ＣＡＭ−１−ＬＦＡ−１異姓性相互作用に係わ
り得る可能性を引き起こす、しかしながら、同様な密度
のＬＦＡ−１とＩ　ＣＡＭ−１を共発現するＢリンパ芽
球細胞の人工または細胞単一層中のＩ　ＣＡＭ−１への
結合はＢ−リンパ芽球のＬＦＡ−Ｉ　　ＭＡｂによる前
処理によって完全に抑制され得るが、粘着はＩＣＡＭ−
Ｉ　　ＭＡｂによるＢ−リンパ芽球前処理によって影響
されない、ＩＣＡＭ−Ｉ　　Ｍａｂによる単一層の前処
理は結合を完全に壊滅させている（　Ｄｕｓｔｉｎ、　
Ｍ、Ｌ、等、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３７　：２
４５　２５４　（１９８６）　　；　　Ｍａｒｌｉｎ、
　Ｓ、Ｄ、等、皿、１し８１３−８１９　（１９８７）
）、これらの知見は、Ｉ　ＣＡＭ−１同種親和性相互作
用が全く起った場合、その作用がＬＦＡ−１との異姓性
相互作用よりもかなり弱くなければならないことを示し
ている。
白血球インテグリンが基本的に異なる方法でリガントを
認識する可能性はリガント結合において重要でありＲＧ
Ｄ認識認識性インリグリン中存在しないそれらのαサブ
ユニット中の１８０残基配列の存在と一致する（Ｃｏｒ
ｂｉ、　Ａ、　等、ＥＭＢＯＪ、６：４０２３−４０２
８　（１９８７））。
Ｍａｃ−１は１ｃ３ｂ５０８６中に存在するＲＧＤ配列
を認識することが提示されているけれども、ＩＣＡＭ−
１中にはＲＧＤ配列はない（第８図）。
これはフィブロネクチンペプチドＧＲＧＤＳＰとコント
ロールペプチドＧＲＧＥＳＰがＩＣＡＭ−１−ＬＦＡ−
１粘着を抑制できないことと一致している（Ｍａｒｌｉ
ｎ、　Ｓ、Ｄ、等、Ｃｅ１１、　　５１　：８１３−８
１９　　（１９８７））。しかしながら、ＰＲＧＧＳお
よびＲＧＥＫＥのような関連配列はＩＣＡＭ−１中に、
それぞれ、ドメイン２のβ−ストランドａとｂおよびド
メイン２のＣとｄ間のループに予示される領域において
存在しており（第９図）、従って、！２に識について受
は入れられ得る。興味あることは相同性ＭＡＧ分子がド
メイン１と２の間にＲＧＤ配列を含むことである（　Ｐ
ｏ１ｔｏｒａｋ、　Ｍ、等、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
１、　　ユニ５罎１８９３−１８９９（１９８７）　；
　５ａｌｚｅｒ、　Ｊ、Ｌ、等、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂ
ｉｏｌ。
１０４：９５７−９６５　（１９Ｂ？））。
実施例１９ サウサーンおよびノウサーンプロット サウサーンプロットを３種の細胞系から抽出した５μｇ
の遺伝子ＤＮＡを用いて行なったｊＢＬ２、バーキット
リンパ腫細胞系（Ｑｒ、Ｇ１１ｂｅｒｔＬｅｎｏｉｒか
ら供与）：ＪＹおよびＥｒ−ＬＣＬのＥＢＶ形賞転換Ｂ
−リンパ腫様細胞系。
各ＤＮＡを５×製造者が推奨する量のＢａｍＨｌとＥｃ
ｏＲＩエンドヌクレアーゼにューイングランド　バイオ
ラプス社）で消化した。０．８％アガロースゲルによる
電気泳動に続いて、ＤＮＡをナイロン膜（ゼータプロー
ブ、バイオラド社）に移した。フィルターをプレハイブ
リッド化およびα（”Ｐ）ｄ　Ｘ　Ｔ　Ｐ　”　ｓで標
識したＨＬ−６０からのＩＣＡＭ　　ｃＤＮＡを用いて
の標準手法に従ってランダムプライミングによりハイブ
リッド化した。ノウサーンプロット２０μｇの全ＤＮＡ
または６μｇのポリ　（Ａ）”　ＲＮＡを用いて行なっ
た。
ＲＮＡは変性し１％アガローズーホルムアルデヒドゲル
により電気泳動し、ゼータプローブに電気移動させた。
各フィルターをプレハイブリッド化し３！Ｐ標識オリゴ
ヌクレオチドプローブ（前述の）ＨＬ−６０ｃＤＮＡプ
ローブを用いて前述したようにしてハイブリッド化した
（Ｓｔａｕｔｏｎ、　Ｄ、！、等、ＥｍｂｏＪ、６　：
３６９５−３７０１　（１９８７））。
３ｋｂ　　ｃＤＮＡプローブおよびＢａｓ＋Ｈ１とＥｃ
ｏＲｌで消化した遺伝子ＤＮＡを用いたサウサーンプロ
ットはそれぞれが単一遺伝子を示しまたコード化情報の
殆どが８ｋｂ内に存在することを示す２０および８ｋｂ
の単一主要ハイブリッド化性フラグメントを示した。３
種の細胞系のプロットにおいては、制限フラグメント多
形性の証拠はなかった。
実施例２０ ＩＣＡＭ−１遺伝子の発現 “発現ベクター゛は、（適当な転写性および／またはほ
ん訳性コントロール配列の存在に基づき）ベクターにク
ローニングされるＤＮＡ　（またはｃＤＮＡ）を発現し
得、それによってポリペプチドまたはたん白質を産生し
得るベクターである。
クローニングした配列の発現は発現ベクターを適当なホ
スト細胞に組み込んだときに起る。原核細胞発現ベクタ
ーを用いる場合は、適切なホスト細胞はクローニングし
た配列を発現し得る任意の原核細胞であろう。同様に、
真核発現ベクターを用いる場合、適切なホスト細胞はク
ローニングした配列を発現し得る任意の真核細胞である
。重要なことは、真核ＤＮＡは介在配列を含み得るので
、またそのような配゛列は原核細胞中では正確に加工で
きないので、原核ゲノム発現ベクターライブラリーを産
生ずるためには、Ｉ　ＣＡＭ−１を発現し得る細胞から
のｃＤＮＡを用いることが好ましい。
ｃＤＮＡを調製する方法およびゲノムライブラリーを産
生ずる方法はＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｊ、等により開示さ
れている（　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：
Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ＋　コールド　ス
プリング　ハーバ−ブレ入社、コールド　スプリング　
ハーバ−１ＮＹ（１９８２））。
上述の発現ベクター遺伝子ライブラリーを用いてホスト
細胞のバンクを作る（その各々はライブラリーの１員を
含む）０発現ベクターはホスト細胞に任意の種々の手段
（即ち、形質転換、トランスフエフシラン、原形質体融
合、エレクトロボーレーション等）によって組み込み得
る。発現ベクター含有細胞のバンクはクローン的に増殖
させ、その各員は個々にアッセイして（イムノアッセイ
を用いて）これらが抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体に結合し得る
たん白質を産生ずるかどうかを測定する。
抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質を産生ずる
細胞の発現ベクターはさらに分析してこれらのベクター
が全ｆ　ＣＡＭ−Ｉ遺伝子を発現（または含有）するか
どうか、Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子のフラグメントのみを発
現（または含有）するかどうかあるいは生成物が免疫学
的にＩ　ＣＡＭ−１に関係したとしてもＩＣＡＭ−１で
はない遺伝子を発現（または含有）するかどうかを決定
する。そのような分析は任意の都合の良い方法で行なっ
てよいけれども、好ましいのは発現ベクターにクローニ
ングされるＤＮＡまたはｃＤＮＡのヌクレオチド配列を
決定することである。そのようなヌクレオチド配列を検
査してＩ　ＣＡＭ−１のトリプシン消化フラグメント（
第５表）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードし得るかどうかを決定する。
Ｉ　ＣＡＭ−１遺伝子をコードするＤＮＡまたはｃＤＮ
Ａ分子を含む発現ベクターは、か（して、（ｉ）抗Ｉ　
ＣＡＭ−１抗体に結合し得るたん白質の発現を行なう能
力；および（ｉｉ）　　ＩＣＡＭ−１のトリプシンフラ
グメントの各々をコードし得るヌクレオチド配列の存在
によって認識し得る。そのような発現ベクターのクロー
ニングＤＮＡ分子は発現ベクターから取り出して純粋な
形で単離できる。
実施例２１ 精製Ｉ　ＣＡＭ−１の機能活性 細胞中では、ＩＣＡＭ−４は細胞膜と会合した表面たん
白質として通常は機能する。従って、精製ＩＣＡＭ−１
の機能は分子を人工脂質膜（リポソームまたはベシクル
）中にたん白質を洗浄剤可溶化脂質中に溶解し次いで洗
浄剤を透析により除去することによって再構成させたの
ち試験した。
ＪＹ細胞から精製し洗浄剤オクチルグリコシド中に上述
のようにして溶出したｒ　ＣＡ　Ｍ　−１をベシクル中
に再構成し、ＩＣＡＭ−１含有ベシクルをガラスカバー
スリップまたはプラスチック培養ウェルに融合させてた
ん白質に結合する細胞の検出をできるようにした。
平坦膜およびプラスチック結合ベシクルの調製ベシクル
はＧａｙ等の方法により調製した〔Ｊ。
Ｉｍｍｕｎａ１、　　１３６：２０２６　（１９８６）
〕、即ち、たまごホスファチジルクロリンとコレステロ
ールをクロロホルム中に溶解し７：２のモル比で混合し
た。脂質混合物をチッ素ガス流下に回転させながら薄膜
に乾燥させ、次いで１時間で凍結乾燥させてすべての痕
跡量のクロロホルムを除去した。脂質膜を１％オクチル
グリコシド１０．１４ＭＮａＣＲ／　２０　ｍＭ　）リ
ス、（ｐＨ７，２）中にホスファチジルクロリン最＃濃
度０．１ｍＭに溶解した。
約ｌＯμｇの精製ＩＣＡＭ−１またはコントロール膜糖
たん白質としてのヒトグリコホリン（シグマケミカル社
、セントルイス、ＭＯ）を溶解脂質の各ｒｎ１に加えた
。たん白質−脂質−洗浄剤溶液を２００容量の２０ｍＭ
）リス１０．１４Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，２の３回交換
およびＨＢＳＳの１回交換に対して４℃で透析した。
平坦膜はＢｒ１ａｎ等の方法により調製した（Ｐｒｏｃ
。
Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　８１　：６１５
９　（１９８４）　）。
ガラスカバースリップ（直径１１ｆｉ）を１７×洗浄剤
（Ｌｉｎｂｒｏ　）の１：６希釈液中で１５分間煮沸し
、−夜蒸留水中で洗浄し、７０％エタノール中に浸し、
風乾させた。ＩＣＡＭ−１またはグリコホリンのいずれ
かを含有するベシクル懸濁液の８０μ！小滴を２４ウエ
ルクルスタープレートのウェル底部に入れ、上記で調製
したガラスカバースリップを静かに頂部に浮かした。室
温での２０〜３０分のインキュベーション後、各ウェル
をＨＢＳＳで満し、カバースリップをひっくり返して平
坦面を上向きにした。次いでウェルをＨＢＳＳで十分洗
浄して未結合ベシクルを除去した。平坦膜表面は全く空
気にさらさなかった。
ガラス表面に融合させた平坦膜による実験途中で、Ｉ　
ＣＡＭ−１を含むベシクルはマルチウェル組織培養プレ
ートのプラスチック表面に直接結合し、特異的細胞結合
により明らかなような機能活性を保持していることが判
明した。そのようなベシクルは以後１プラスチック結合
ベシクル（ＰＢＶ）と称する。というのは、プラスチッ
クに結合した脂質ベシクルの性質を測定するのではない
からである。プラスチック結合ベシクルは３０μ！のベ
シクル懸濁液を直接９６ウ工ル組織培養トレイ（ファル
コン社）中のウェル底部に加え次いで平坦膜について述
べたようにしてインキュベーションおよび洗浄を行うこ
とによって調製した。
春１１目しＬ乙竺工 平坦膜またはプラスチック結合ベシクルを用いた細胞粘
着アッセイの両方を本質的に同じ方法で行ったが、ＰＢ
Ｖアッセイの細胞数および容量は平坦膜アッセイで用い
たものの１１５に減じた。
正常コントロールおよびＬＦＡ−１を発現できない白血
球粘着欠損（ＬＡＤ）患者（Ａｎｄｅｒｓｏｎ。
Ｄ、　Ｃ，等、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、１５２　
：　６６８　（１９８５）：］からのＴリンパ球を、１
Ｍｇ／ｍｌのコンカナバリ：／　−Ａ　（Ｃｏｎ−Ａ　
）を含む末梢血単核細胞１１ＰＭ［−１６４０＋２０％
ＦＣ３中で５Ｘ１０’細胞／ｍＡで３日間培養すること
によって調製した。次いで、細胞をＲＰＭ（で２回；５
ｒｎＭメチルーアルファーｂ−マノフィラノシドで１回
洗浄して残留レクチンを細胞表面から除去した。細胞を
ｌｎｇ／ｍ（ｌの組換えＩＬ−２を含むＲＰＭＩ／２０
％ＦＣ３中で増殖させ、培養開始後１０および２２日の
間で使用した。
平坦膜またはＰＢＶに結合する細胞を検出するため、Ｃ
ａｎ　Ａ芽球、Ｔ−リンパ＠５ＫＷ−３、ＥＢＶ形質転
換Ｂ−リンパ腫様細胞系ＪＹ（ＬＦＡ−１陽性）および
ＬＦＡ−１欠損リンパ腫様細胞系（ＢＢＮ）（患者１由
来、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、　Ｔ、Ａ、等、Ｊ、Ｂｘｐｅｒ
、Ｍｅｄ、　　　１６０：１９０１−１９１８（１９８
６））を１　ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣ３
中のｌＸｌ０’細胞を１００μＣｉのＮａ”　ＣｒＯ２
で３７℃、１時間インキュベートし、次いでＲＰＭＩ−
１６４０で４回洗浄し未結合標識を除去することによっ
て放射性標識させた。モノクローナル抗体ブロッキング
試験においては、細胞またはプラスチック結合ベシクル
はＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＦＣ３中の２０μｇ／ｍ
βの精製抗体で４℃にて３０分間前処理し、次いで４回
洗浄して未結合抗体を除去した。細胞結合に関しての２
価イオンの効果の実験においては、細胞をＣａ”　、Ｍ
ｇ”を含まないＨＢＳＳ＋１０％透析ＦＣ３で１回洗浄
し、ＣａＣｒとＭｇＣ’　ｊ２を決められた濃度に加え
た。すべての実験において、細胞および平坦膜またはＰ
ＢＶは適当な温度（４℃、２２℃または３７℃）で適当
なアッセイバッファー中で予備平衡させた。
精製ＩＣＡＭ　　１に結合する細胞を測定するために、
５ＩＯｒ標識細抱（平坦膜アッセイでの５×１０’ＥＢ
Ｖ形質転換体；　Ｐ　Ｂ　Ｖ　７７　セイ’７：（７）
　ｌＸ１０’ＥＢＶ形質転換体または５ＫＷ−３細胞、
２　Ｘ　１０’　Ｃｏｎ−Ａ芽球）を平坦膜またはＰＢ
Ｖ上で２５Ｘｇで２分間遠心し、次いで４℃、２２℃ま
たは３７℃で１時間インキュベーションした。
インキュベーション後、未結合細胞を適当な温度での予
備平衡させたバッファーによる充填、吸弓の８回のサイ
クルによって除去した。結合細胞はウェル内容物の０．
　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ／　１％トリトンＸ−１００による
可）容化およびガンマ−カウンターでの計数によって定
量した。％細胞結合は結合細胞からのｃｐｍを入力細胞
のｃｐｍで割ることによって決定した。平坦膜アッセイ
においては、人力ｃｐｍはカバースリップの表面積を培
養ウェルの表面積と比較した比に対して集めた。
これらのアッセイにおいて、ＥＢＶ形貿転換Ｂ−リンパ
腫細胞、５ＫＷ−３Ｔ−ＩＪンパ腫細胞、およびＣｏｎ
−ＡＴリンパ芽球は人工膜中のＩＣＡＭ−１に特異的に
結合した（第１１図および第１２図）。結合は、細胞が
等価の量の他のヒト細胞表面糖たん白質グリコホリンを
含んだコントロールの平坦膜またはベシクルに極めて貧
弱にしか結合しなかったことから特異的であった。さら
にまた、ＬＦＡ−１陽性ＥＢＶ形質転換体およびＣａｎ
　Ａ芽球も結合したが、それらのＬＦＡ−１陰性等価物
は何ら有意の程度に結合せず、結合が細胞上のＬＦＡ−
１の存在に依存していることを示した。
細胞結合の特異性および細胞ＬＦＡ−１への依存性の両
方はモノクローナル抗体のブロッキング試験において確
認した（第１３図）。ＪＹ細胞の結合はＩ　ＣＡＭ−１
含有ＰＢＶを抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体ＲＲ
Ｉ／１前処理したとき９７％まで抑制できた。同じ抗体
による細胞の前処理は殆んど効果がなかった。逆に、抗
ＬＦＡ−モノクローナル抗体Ｒ３１／１　Ｂは９６％ま
で結合を抑制したがＰＢＶでな（細胞を前処理したとき
はわずかであった。ＬＦＡ−３と反応性のコントロール
抗体ＴＳ２／９　（異なるリンパ球表面抗原）は細胞ま
たはＰＢＶのいずれを前処理したときも有意の抑制効果
はなかった。この実験は人工膜の若干量の不純物のない
Ｉ　ＣＡＭ−１自体が観察された細胞粘着を媒介してい
ることおよび粘着は結合性細胞上のＬＦＡ−１に依存し
ていることを示している。
人工膜中のＩ　ＣＡＭ−１への細胞の結合はまたＬＦＡ
−１依存性粘着系の２つの他の特性：温度依存性と２価
カチオンの必要性を示した。第１４図に示すように、Ｃ
ｏｎ−Ａ芽球はＰＢＶ中のＩＣＡＭ−１に３７℃で最も
効果的に、２２℃で部分的に、４℃で極めて貧弱に結合
した。第１５図に示すように、結合は完全に２価カチオ
ンの存在に依存している。住理掌上の濃度においては、
Ｍ　ｇ　２”は単独で最高の細胞結合を示したが、Ｃａ
”の単独は極めて低レベルの結合を示した。しかしなが
ら、ｃ”と組合せた通常濃度の１／１０のＭ　ｇ　”　
”は相乗効果を有し最高の結合を示した。
要約すれば、人工膜中に含有させた精製ＩＣＡＭ−１に
対する細胞結合の特異性、モノクローナル抗体による特
異的抑制、および温度および２価カチオンの必要性はＩ
　ＣＡＭ−１がＬＦＡ−１依存性の粘着系の特異的リガ
ントであることを示している。
実施例２２ アレルギーおよび毒性バッチ試験反応におけるＩ　ＣＡ
Ｍ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 ５人の正常人の皮ふ生検をそのＩ　ＣＡＭ−１およびＨ
ＬＡ−ＤＲ発現について行った。ある血管中の内皮細胞
は通常Ｉ　ＣＡＭ−１を発現するけれども、正常度ふか
らのケラチン細胞にはＩＣＡＭ−１は発現しないことが
判った。正常度ふ生検からの任意ケラチン細胞上のＨＬ
Ａ−ＤＲの染色は観察されなかった。ＩＣＡＭ−１とク
ラス■抗原の発現動力学をアレルギー性および毒性成ふ
傷害の生検の細胞において検討した。検討した６人の対
象者の半分がハブテンの適用後４時間でｉｃＡ？１−１
を発現したケラチン細胞を有していることが判った（第
１０表）。ハブテンへの露出時間によりケラチン細胞上
にＩ　ＣＡＭ−１を発現する人の割合が増大し、また４
８時間までにケラチン細胞当りより多くのＩ　ＣＡＭ−
１発現を示す染色強度も増大した。事実、この時点で、
すべての生検のケラチン細胞の部分がＩ　ＣＡＭ−１に
対して陽性に染色した。７２時間（ハプテン除去後２４
時間）で、８人の対象者の７人がケラチン細胞にＩＣＡ
Ｍ−１を発現しており、１人の対象者のｒＣＡ’Ｍ−１
発現は４８〜７２時間の間に弱くなった。
第１０表 アレルギーパッチ試験生検からのケラチン細胞上のＩ　
ＣＡＭ−１およびＨＬＡ−ＤＲの誘起の動力学 正常皮ふ　　　　５０００ ４ ４８″ ２ １サンプルは少なくとも小群のケラチン細胞が染色した
場合に陽性とみなした。
ゝすべでのパンチはこの時点で除去した。
組織学上、ハプテンの適用後４時間で採取した生検から
のケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１の染色像は通常小群
生状であった。４８時間後、ＩＣＡＭ　−１はケラチン
ｍ胞の大部分の表面上に発現し、傷害の中心および周辺
間に差異はなかった。染色強度はケラチン細胞が爪角質
層に近づいたとき減少した。これは傷害の中心および周
辺から採られた生検において見い出された。また、この
時間でも、パッチ試験は陽性であった（湿潤、紅斑、小
胞）。
異なるハプテンを感受性個々人に適用してもＩＣＡＭ−
１発現における差異は見られなかった。ケラチン細胞以
外にも、Ｉ　ＣＡＭ−１は傷害部位でいくつかの単核細
胞および内皮細胞上にも発現した。
アレルギー皮ふ傷害のケラチン細胞上でのＨＬＡ−ＤＲ
の発現はＩ　ＣＡＭ−１の発現よりも頻度は小さかった
。検討した対象者のうち、ハプテン適用後２４時間まで
にＨＬＡ−ＤＲに陽性に染色したケラチン細胞による傷
害を有するものはなかった。事実、わずかに４人の生検
サンプルがＨＬＡ−ＤＲを発現したケラチン細胞を有す
るに過ぎず、ＨＬＡ−ＤＲに陽性でＩ　ＣＡＭ−１に陽
性でないケラチン細胞を有する生検はなかった（第１０
表）。
アレルギーパッチ試験傷害と対照的に、はず油またはラ
ウリル硫酸ナトリウムで誘発させた毒性パッチ試験傷害
は試験のすべての時点でその表面にＩ　ＣＡＭ−１を殆
んど示さないケラチン細胞を有していた（第１１表）。
実際に、パンチ適用後４８時間で、これはアレルギー性
バッチ試験対象者における最適の時点であるが、１４人
の毒性バッチ試験対象者のうちの１人が傷害中にＩＣＡ
Ｍ−１を発現するケラチン細胞を有していた。また、ア
レルギー性バンチ試験生槍と対照的に、毒性パッチ試験
傷害のケラチン細胞上に）ＩＬＡ−ＤＲは発現しなかっ
た。
これらのデータはＩ　ＣＡＭ−１が免疫系炎症中で発現
し毒性系炎症では発現しないことを示しており、かくし
て、ＩＣＡＭ−１の発現は、疾患が免疫抑制治療剤の拒
絶または尿毒性によるのがどうかの判断が難しい腎移植
患者における急性腎疾患のような免疫系および毒性系炎
症を区別するのに使用できる。腎生検およびＩ　ＣＡＭ
−１発現の向上の評価が免疫系拒絶と非免疫系毒性反応
の区別を可能にするであろう。
第１１表 毒性バッチ試験生検からのケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ
−１およびＨＬＡ−ＤＲの誘起動力学４　　　　　４０
００ ８　　　　　３１”０Ｏ ２４３１００ ４８’１４１００ １サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色され
た場合陽性とみなした。
ゝすべでのバッチはこの時点で除去した。
実施例２３ 良性成ふ病中のＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 種々のタイプの炎症性成ふ病を有する患者からの傷害の
皮ふ生検からの細胞をそのＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−Ｄ
Ｒの発現について検討した。アレルバー性接触湿疹、天
庖疹、および扁平苔宿の生検中のケラチン細胞の１部は
Ｉ　ＣＡＭ−１を発現した。扁平苔層は４８時間アレル
ギー性バッチ試験生検で見られた結果と同等か幾分強い
像により最も強く染色を示した（第１２表）。アレルギ
ー性パッチ試験の結果と同様に、最も強いＩＣＡＭ１染
色は高単核細胞浸潤部位で見られた。さらにまた、試験
した１１の扁平苔唐生検のうちの８つはケラチン細胞上
でＨＬＡ−ＤＲ全発現ついて陽性であった。
発疹とじんま疹を有する患者の皮ふ生検からのケラチン
細胞上のＩ　ＣＡＭ−１の発現は少なかった。これらの
疾患を有する試験した７人の患者のうち４人のみが傷害
部位でＩ　ＣＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有して
いた。ＨＬＡ−ＤＲ全発現１人の患者においてのみであ
り、これはＩＣＡＭ＝１と関連していた。
試験した良性炎症皮ふ病のすべてからの内皮細胞および
単核細胞浸潤の部分は変化度合で１．ＣＡＭ−１を発現
していた。
第１２表 良性成ふ病からのケラチン細胞上の ＩＣＡＭ、−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 診　断　　生横数　ＩＣ靜−１）ＩＬＡ−ＯＲＩＣＡＭ
−１とのみ　　のみ　　ＨＬＡ−ＤＲ 扁平苔廖　１１３０８ 天庖癒　２２０　０ 発　　　　疹　　　　３　　２　　　０　　　　０１サ
ンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色された場
合陽性とみなした。
実施例２４ 乾廚皮ふ病のケラチン細胞上でのＩ　ＣＡＭ−１発現 乾徊を有する５例の患者からの皮ふ生検中のＩ　ＣＡＭ
−１発現をＰＵＶＡ治療の開始前および治療途中で周期
的に検討した。生検は組織学によって確認した古典的軟
石を有する５例の患者から得た。生検はＰＵＶＡ治療の
前および指示された時間中に連続的に採取した。ＰＵＶ
Ａは週に３〜４回投与した。生検は５例の患者の乾層斑
の周辺から採取し、生検以外に、これら患者の４人の臨
床的に正常な皮ふからも採取した。
各新鮮皮ふ生検試料を凍結し、液体チッ素中に保存した
。６ミクロンの保存切片を一夜室温で風乾し、アセトン
中で１０分間固定し、直ちに染色しまたはアルミニウム
ホイルで包み染色するまで一８０℃で保存した。
染色は次の方法で作った。切片をモノクローナル抗体で
インキュベートし、ジアミノベンジジン１１．０□、基
質を用いて３段階イムノパーオキシダーゼ法により染色
した［５ｔｅｉｎ、　Ｈ，等、八ｄｖ、　（：ａｎｃｅ
ｒＲｅｓ、　　４２　：　６７−１４７、（１９８４）
３．へん桃腺およびリンパ節を抗ＩＣＡＭ−１およびＨ
ＬＡ−ＤＲ染色用の陽性コントロールとして用いた。−
次抗体の不存在下で染色した組織は陰性コントロールで
あった。
ＨＬＡ−ＤＲに対するモノクローナル抗体をＢｅｃｔｏ
ｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（カリホルニア州マウンテン
ヒニー）から購入した。抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル
抗体はＲ６−５−Ｄ６であった。パーオキシダーゼ接合
ウサギ抗マウスＩｇおよびパーオキシダーゼ接合ブタ抗
ウサギＩｇはスウェーデン、コペンハーゲンのＤＡＫＡ
ＰＡＴＴＳより購入した。ジアミノベンジジン−テトラ
ヒドロクロリドはシグマ社（セントルイス）より得た。
試験の結果は数種の血管の内皮細胞が戻患および正常皮
ふの両方でＩＣＡＭ−１を発現していることを示したが
、染色強度およびＩＣＡＭ−１を発現する血管の数は乾
癖皮ふ病変内で増大した。
さらに、５例の患者からの未治療乾癖皮ふ病変のケラチ
ン細胞中のＩＣＡＭ−１の発現像はわずかに小群の細胞
染色から多数のケラチン細胞が染色されているまでに変
化した。ＰＵＶＡ治療の途中では、２例の患者（患者２
と３）のＩＣＡＭ−１発現は臨床的軽快に先行しである
いは同時に著しい低減を示した。患者１．４および５は
、それぞれ、臨床的軽快あるいは悪化に相関してＰ　Ｕ
ＶＡ治療中にＩ　ＣＡＭ−１発現を減少あるいは増大さ
せた。ＰＵＶＡＵＶ前後の正常皮ふからのケラチン細胞
上ではＩ　ＣＡＭ−１発現はなかった。このことはＰＵ
ＶＡは正常皮ふからのケラチン細胞上にＩＣＡＭ−１を
誘起しないことを示している。
注目すべきことは単核細胞浸潤密度はケラチン細胞上の
ＩＣＡＭ−１発現量と相関していることであった。この
ことはＩ　ＣＡＭ−１発現も弱まったときＰＵＶＡＵＶ
中の傷害中の単核細胞の数も減少することおよびケラセ
ン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現がより顕著になったとき
ＰＵＶＡＵＶ中の単核細胞の数が増大することの両方に
関係している。内皮細胞および皮ふ単核細胞もまたＩ　
ＣＡＭ−１陽性である。臨床的に正常な皮ふにおいては
、Ｉ　ＣＡＭ−１発現はケラチン細胞の標識化なしで内
皮細胞に確認された。
ケラチン細胞上のＨＬＡ−ＤＲの発現は可変的であった
、。Ｉ　ＣＡＭ−１陽性でないＨＬＡ−ＤＲ陽性生検は
存在しなかった。
要約すれば、これらの結果は、治療前では、Ｉ　ＣＡＭ
−１発現はケラチン細胞上で高く、単核細胞浸潤密度と
相関していることを示している。
ＰＵＶＡＵＶ中は、Ｉ　ＣＡＭ−１染色の著しい減少が
臨床的改善と平行して見られる。組織学的には、皮ふ浸
潤は消失していた。臨床的悪化が治療中に見られる場合
には、ケラチン細胞上のＩＣＡＭ−１の発現並びに皮ふ
浸潤密度も増大した。臨床的軽快が治療中に見られたと
きは、ケラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１染色の同時の減
少並びに皮ふ浸潤の減少があった。即ち、ケラチン細胞
上のＩＣＡＭ−１の発現は皮ふの単核細胞浸潤密度に相
応していた。これらのデータはＰＵＶＡ治療に対する臨
床的応答は単核細胞のよりおだやかな下降と平行してケ
ラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現の促進された減少を
もたらすことを示している。このことはケラチン細胞上
のＩ　ＣＡＭ−１発現が皮ふ浸潤の開始および持続に応
答性であること、およびＰＵＶＡ治療がＩ　ＣＡＭ−１
を下方調整し皮ふ浸潤および炎症応答を緩和しているこ
とを示している。データはまたＰＵＶＡＵＶ中のケラチ
ン細胞上のＨＬＡ−ＤＲが発現が変化性であったことも
示している。
乾震傷害のケラセン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現は傷害
臨床上の厳正さおよび皮ふ浸潤の大きさと相関している
。即ち、Ｉ　ＣＡＭ−１は乾磨において中心的役割を発
揮し、その発現の抑制および／またはその単核細胞上で
のＣＤ１８コンブｖツクスとの相互作用の抑制は本病変
の有効な治療となるであろう。さらにまた、ケラチン細
胞上の［ＣＡＭ−１発現をモニターすることは乾揖の診
断、予防、および治療経過を評価するための有効な手段
となるであろう。
第１３表 ＰＵＶＡＵＶ中および治療前の乾肘皮傷害および臨床的
に正常な皮ふのセラチン細胞によるＩ　ＣＡＭ−１発現 １日 １週 ２！！ ＋ ÷ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋＋ 十＋ ＋ ＋＋＋ ＋ ＋ ７週 １０週 （＋） （＋＋）（÷）＋＋＋ 強陽性ケラチン細胞 明らかな陽性ケラチン細胞 弱陽性ケラチン細胞 極めてわずかな拡散陽性ケラチン細胞 陽性染色なし 臨床的軽快 ０　　〃　悪化 実施例２５ 悪性成ふ病中のＩ　ＣＡＭ−１とＨＬＡ−ＤＲの発現 良性成ふ状態の病変とは異なり、悪性成ふ傷害からのケ
ラチン細胞上のＩ　ＣＡＭ−１の発現は変化に富んでい
た（第１４表）。試験した皮ふＴ〜細胞リンパ腫２３例
のうち、Ｉ　ＣＡＭ−１１４性ケラチン細胞は１４例の
みにおいて同定された。菌状息肉腫病変の生検からのケ
ラチン細胞では、病気の進行がより前の段階に進むにつ
れてそのＩＣＡＭ１発現を消化する傾向にあった。しか
しながら、Ｉ　ＣＡＭ−１発現は皮ふＴ細胞リンパ腫病
変の殆んどからの変化割合の単核細胞浸潤上に見られた
。
試験した残りのリンパ腫のうちでは、８つのうち４つが
ｌ　ＣＡＭ−１を発現したケラチン細胞を有していた。
試験した悪性成ふ病を有する２９人の患者のうち、５例
はＩ　ＣＡＭ−１を発現することなしにＨＬＡ−ＤＲを
発現したケラチン細胞を有していた（第１４表）。
第１４表 悪性成ふ病からのケラチン細胞上の Ｉ　ＣＡＭ−１およびＨＬ　Ａ　−Ｄ　Ｒの発現ＣＴＣ
ＬＪＦＩ ＣＴＣＬ、？ＩＦＩＩ−１１１ ＣＴＣＬ、５Ｓ ＣＴＣＬ、ラーヅ細胞 ＢＣＬ 皮ふ白血病 凰各サンプルは少なくともケラチン細胞の小群が染色さ
れた場合陽性とみなした。
実施例２６ ヒト末梢血単核細胞の増殖上の抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の
効果 ヒト末梢血単核細胞を抗原またはマイトジェンの存在お
よび認識より誘起させ増殖させる。マイトジェン、コン
カナバリンＡまたはＴ細胞結合性抗体ＯＫ　Ｔ　ｓのよ
うなある種の分子は末梢血単核細胞の非特異的増殖を引
き起こす。
ヒト末梢血単核細胞はこれらが特異的抗原を認識し得る
細胞の細部体群（５ｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　）から
なる点で不均質である。特定の特異抗原を認識し得る末
梢血単核細胞がその抗原に出会った場合、単核細胞の上
記細部体群の増殖は誘起される。破傷風トキソイドおよ
びキーホールリンベットヘモシアニンは末梢単核細胞の
細部体群により認識される抗原の例であるが感応化した
個体中のすべての末梢単核細胞によって認識されるもの
ではない。
細胞−細胞粘着を必要とすることが知られている系中で
のヒト末梢血単核細胞の増殖的応答を抑１１１ｊｌする
抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６の
能力を試験した。
末梢血単核細胞をフイコールーベーグ（Ｆｉｃｏｌｌ−
Ｐａｑｕａ−、ファルマシア社）勾配で製造者が推奨す
るようにして精製した。界面を集めたのち、細胞をＲＰ
Ｍ１１６４０培地で３回洗浄し平底９６ウエルマイクロ
タイタープレート中で１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグル
タミンおよびジェンタマイシン（５０μｇ／ｍ１）を加
えたＲＰＭ１１６４０培地中で工Ｏｈ細胞／　ｍ　ｉｔ
の濃度で培養した。
抗原、Ｔ−細胞マイトジェン、コンカナバリンへのいず
れか（０，２５ｕｇ／　＋ｙ１）；Ｔ−細胞結合性抗体
ＯＫＴ、（０，００１μｇ／ｎ＋ｊり；キーホールリン
ペットヘモシアニン（１０ｇ／ｍＡ）または破傷風トキ
ソイド（供給源からの１：１００希釈物）を上記のよう
にして培養した細胞中に抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体（Ｒ６−
５−Ｄ６；最終濃度５ｇ／　ｍｌの存在または不存在下
に加えた。細胞はアッセイが終了する前の３．５日（コ
ンカナバリンＡ試験）、２．５日（ＯＫＴ３試験）、ま
たは５．５日（キーホーフレリンペットヘモシアニンお
よび破傷風トキソイド試験）で培養した。アッセイ終了
前１８時間で、２．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを培養物
に加えた。細胞増殖を末梢血単核細胞によるＤＮＡへの
チミジンの取り込みを測定することによってアッセイし
た。取り込まれたチミジンを集め液体シンチレーション
カウンター中で計数した（Ｍｅｒｌｕｚｚｉ等、Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏ１、　　１３９　：　１６６−１６８　（
１９８７））。これらの実験の結果は第１６図（コンカ
ナバリンＡ試験）、第１７図（ＯＫＴｓ試験）、第１８
図（キーホールリンベットヘモシアニン試験）、および
第１９図（破傷風トキソイド試験）に示す。
抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体は単核細胞中の非特異Ｔ−細胞マ
イトジエン、ＣｏｎＡＨ非特異的Ｔ−細胞会合抗原、０
ＫＴ−３；および特異抗原、キーホールリンペットヘモ
シアニンおよび破傷風トキソイドに対する増殖的応答を
抑制することが判明した。
抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体による抑制は抗ＬＦＡ−１抗体の
抑制効果と匹敵し、Ｉ　ＣＡＭ−１はＬＦＡ−１の官能
性リガントであることおよびＩＣＡＭ−１のアンタゴニ
ストは特異的防御系応答を抑制するであろうことを示唆
している。
実施例２７ 混合リンパ球反応についての抗Ｉ　ＣＡＭ−１の効果 前述したように、ＩＣＡＭ−１はり、ＦＡ−１依存性細
胞粘着より媒介された免疫応答中の有効な細胞相互作用
のために必要である。免疫応答または炎症疾患中のＩ　
ＣＡＭ−１の誘起は白血球の相互または内皮細胞との相
互作用を可能にする。
２例の無関係の個人からのリンパ球を各互いの存在下で
培養したときは、芽球形質転換およびリンパ球の細胞増
殖が観察される。１つの集団の白血球を第２集団の白血
球の存在へのこの応答は混合リンパ球反応（ＭＬＲ）と
して公知であり、リンパ球のマイトジェンの添加に対す
る応答と同類である（Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　　Ｔｈｅ　５
ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｅｌｆ−ＮｏｎｓｅｌｆＤｉｓ
ｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、　Ｋｌｅｉｎ、　Ｊ、　Ｊｏ
ｈｎ　Ｇ１１ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ社、ＮＹ　（１９８
２）　、ｐｐ　４５３−４５８）。
抗Ｉ　ＣＡＭモノクローナル抗体のヒトＭＬＲに対する
効果について試験した。これらの実験は次のようにして
行った。末梢血を正常な健康ドナーから静脈穿刺により
採取した。血液をヘパリン化チューブに集め、室温でＰ
ｕｎｋ’ｓ　Ｇ　（Ｇ１８００社）平衡塩溶液（Ｂ　Ｓ
　Ｓ）で１：１に希釈した。血液混合物（２０ｍ６）を
１５１１ＩＮのＰｉｃｏｌｌ／１ｌｙｐａｑｕｅ密度勾
配（ファルマシア社、密度１．０７８、室温〉上に層化
し、ｔ　ｏ　ｏ　ｏ　Ｘｇで２０分間遠心した。
次いで界面を集め、Ｐｕｎｋ’ｓ　Ｇ中で３回洗浄した
。
細胞をヘラシトメーター上で計数し、０．５％のジエン
タマイシ、ｌ　　ｍＭ　Ｌ−グルタミン（ＧｒＢＣＯ社
）および５％加熱不活化（５６℃、３０分）ヒトＡＢ血
清（フローラボラトリーズ社）とを含むＲＰＭＩ−１６
４０培地（Ｇ１８００社）（以下、ＲＰＭＩ培地と呼ぶ
）中に再懸濁させた。
マウス抗−ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５−０６）をこの実験
で用いた。すべてのモノクローナル抗体（ジャックソン
イムノリサーチラボラトリーズ社、ボストン、ＭＡによ
り腹水から調製された）を精製ＩｇＧ調製物として用い
た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）はリンプロ（Ｌｉｎｂ
ｒｏ　）丸底マイクロタイタープレート（Ｒ７６−０１
３−０６）中で６．２５Ｘ１０’細胞／１１１で培地中
で培養した。
別々のドナーからのスチミュレーター細胞をｉｏｏ。
Ｒで照射し、レスボンダー細胞と同じ濃度で培養した。
培養当りの総容量は０．２ｍｊ！であった。コントロー
ルはレスボンダー細胞単独およびスチミュレーター細胞
単独を含んでいた。培養プレートを３７℃で５％ＣＯ！
−湿潤空気雰囲気中で５日間インキュベーとした。各ウ
ェルを０．５μＣｉのトリチウム化チミジンＭＨＴ）　
　にューイングランドニエクレア社）で培養の最後の１
８時間脈動させた。ある場合には、２経路（ｔｗｏ−ｗ
ａｙ）　ＭＬＲを行った。そのプロトコールは第２ドナ
ー細胞を照射により不活化しなかった以外は同じであっ
た。
細胞をガラス繊維フィルター上に自動化マルチプルサン
プルハーベスタ（５ｋａｔｒｏｎ社、ノルウェー）を用
いて採取し、水およびメタノールですすいだ。フィルタ
ーをオーブン乾燥させ、アクアゾル中でベツグマン（Ｌ
Ｓ−３８０１）液体シンチレーションカウンターで計数
した。結果は６例の個々の培養物について平均ＣＰＭ士
標準誤差として示している。
第１５表は精製抗ＩＣＡＭ−１モノクローナｌし抗体が
２０　ｎｇ、／　ｍ　（ｌで明らかな有意の抑制でもっ
て投与量依存の形でＭＬＲを抑制していた。精製マウス
＋ｇＧは殆んどあるいは全く抑制効果を示さなかった。
抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体によるＭＬＲの抑
制は抗体を培養の最初の２４時間以内で加えたとき生じ
る（第１６表）第１５表 １経路（ｏｎｅ−ｉｖａｙ）リンパ球反応についての抗
Ｉ　ＣＡＭ−１抗体の効果 ４４５４±１４３ ＋ １４８　±　１７ ＋ ＋ ＋　　　ｍｌｇＧ（１０，０μｇ）　　　３６，８８２
±１．８２３（１４χ）４　　　ｍｌｇＧ（０，４μｇ
）　　　３５．５００±１．３８３（１７χ）→ ＋　　　Ｒ６−５−０６（０，４μｇ）　　１６．１４
２±８５８　（６２χ）ａレスボンダー細胞（６，２５
Ｘ　１０’　／　ｍｊ２）トスチミエレーター細胞（６
，２５Ｘ１０’／ｍｌ１、１００ＯＲでの照射） ０最終濃度（μｇ／１１１ｇ）でのＩ　ＣＡＭ−１に対
する精製モノクローナル抗体（Ｒ６−５Ｄ６）または精
製マウスＩ　ｇＧ　（ｍＩ　ｇＧ）５〜６個の培養物の
平均士標準誤差、（）内の数はＭＬＲの％抑制を示す 第１６表 培地　２０５４±１４　４７６±１３２　２４７±７５
＋　　培地　　１８９±１６　　　ｎｄ＠ｎｄ＋　−培
地　１，８６０±６１５　　　ｎｄ　　　　ｎ、ｄルス
ボンダー細胞（６，２５Ｘ　Ｉ　Ｏ５／　ｍｅ）ｂスチ
ミュレーター細胞（６，２５Ｘ１０’／ｍｊり Ｃ培養培地またはＩ　ＣＡＭ−１に対する精製モノクロ
ーナル抗体（Ｒ６−５−０６）　、１０μｇ、／ｍｊ＋
で日Ｏで２４時間間隔で加えた。
４〜６個の培養物の平均値上標準誤差 ’　ｎｄ−測定せず ２％抑制 要約すれば、Ｉ　ＣＡＭ−１に対する抗体のＭＬＲを抑
制する能力はＩ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体が急性
移植拒絶に治療的利用性を有していることを示している
。Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体はまたＬＦＡ−１
／ＩＣＡＭ−１調整細胞−細胞相互作用に依存する関連
免疫媒介不整における治療的利用性を有している。
上記の実験はＩ　ＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗
体の添加が反応の最初２４時間中に加えたときに混合リ
ンパ球反応（ＭＬＲ）を抑制することを示している。さ
らにまた、ＩＣＡＭ−１はインビトロ培養中のヒト末梢
血単核細胞について状態向上なる。
さらにまた、Ｉ　ＣＡＭ−１は静止ヒト末梢血リンパ球
または単核細胞上には発現しないことが見い出された。
Ｉ　ＣＡＭ−１は単独培養細胞または混合リンパ球反応
での無関係ドナー細胞との共培養細胞の単核細胞上で、
通常のフローサイトメトリック分析を用いることにより
状態向上される。
単核細胞上でのこのＩ　ＣＡＭ−１の状態向上は炎症の
指示剤として、特に、Ｉ　ＣＡＭ−１が急性または慢性
炎症を有するヒトの新鮮単核細胞上で発現する場合に使
用できる。
活性化単核細胞に対するｔ　ＣＡＭ−１の特異性および
Ｉ　ＣＡＭ−１に対する抗体のＭＬＲを抑制する能力は
Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体が急性移植拒絶およ
び細胞−細胞相互作用を必要とする関連免疫媒介不整に
おける診断上および治療上の潜在力を有し得ることを示
している。
実施例２８ 抗ＩＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ−１抗体の混合投与の相
乗効果 実施例２７で示したように、ＭＬＲは抗ＩＣＡＭ−１抗
体によって抑制される。ＭＬＲはまた抗ＬＦＡ−１抗体
によっても抑制できる。抗ＩＣＡＭ−１および抗ＬＦＡ
−１抗体の組合せ投与が促進されたあるいは相乗的効果
ををするかどうかを決定するために、ＭＬＲアッセイ　
（実施例２７に記載したようにして行った）を２つの抗
体の種々の濃度の存在下で行った。
このＭＬＲアッセイは抗ＩＣＡＭ−１＋抗ＬＦＡ−１の
組合せが、抗体単独では劇的にＭＬＲを抑制しない濃度
において、ＭＬＲ応答を抑制するのに著しい効力がある
ことを示した（第１７表）。
この結果は抗ＩＣＡＭ−１抗体（またはそのフラグメン
ト）と抗ＬＦＡ−１抗体くまたはそのフラグメント）を
共投与することを含む治療が改善された抗炎症治療を与
える能力を有することを示している。そのような改善さ
れた治療は治療上有効である他の方法よりもより低い抗
体投与量の投与を可能にし、また高濃度の個々の抗体が
抗イデオタイブ応答を誘起するような場合に重要性を示
す。
第１７表 混合リンパ球反応において抗ＩＣＡＭ−１と（Ｒ３，１
）抗ＬＦＡ−１との各種投与量での効果 抗−ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５−０６） 抗−ＬＦＡ−１０，００４，０２，１，５２，５０，０
０？　　　３１　５４　６９　　７００．０００８　　
　１　　　　７　　２８　４Ｂ　　６２　　７１０．０
０４　　　０　　　１３　　３０　５０　６４　　７２
０．０２　　　２９　　　３８　　６４　７５　８４　
　　Ｂ２Ｏ，１９２，５９０９１９２９２９２ 実施例２９ ＭＬＲにおける抗Ｉ　ＣＡＭ−１と他の免疫抑制剤との
次善投与量での混合投与の付加的効果実施例２８で示す
ように、ＭＬＲは抗ＩＣＡＭ−１抗体と抗ＬＦＡ−１抗
体の組合せによって抑制される。抗Ｉ　ＣＡＭ−１と他
の免疫抑制剤〔デキサメタソン、アゼチオビリン、シク
ロスポリンＡまたはステロイド（例えば、プレドニソン
等の）のような〕との混合投与も改善された効果を有す
るかどうかを見るために、ＭＬＲアッセイを、実施例２
７のプロトコールによるようにして、他の免疫抑制剤と
組合せたＲ６−５−Ｄ６の次善濃度（即ち、薬剤を単独
で対象物に対して投与する最適濃度よりも低いであろう
濃度）を用いて行った。
データはＲ６−５−０６の抑制効果が次善投与量のデキ
サメタソン（第１８表）、アゼチオビリン（第１９表）
およびシクロスポリンＡ（第２０表）の抑制効果を少な
くとも付加されていることを示している。このことは抗
Ｉ　ＣＡＭ−１が公知の免疫抑制剤の必要投与量の低減
、即ち、その有毒副作用の低減において有効であり得る
ことを意味する。抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体（またはそのフ
ラグメント）を用いてそのような免疫抑制を得るのに、
この抗体（またはそのフラグメント）と単一の追加の免
疫抑制剤または２種以上の追加の免疫抑制剤の組合せと
の投与を行うことが可能である。
第１８表 ヒトＭＬＲでの抗Ｉ　ＣＡＭ−１と デキサメタソンの効果 第１９表 ヒトＭＬＲでの抗Ｉ　ＣＡＭ−１と アゼチオビリンの効果 培地　　　　　　　　　　　　　　１５６スチミエレー
ダー（Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１０ルスｆンダー　　（Ｒ）　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　４．４６１ＲｘＳ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
４．２２４ＲＸＳ　　　　　　　　　Ｒ６−５−０６（
８）　　　　　　　　２６，２２４ＲｘＳ　　　　　　
　　　Ｄｅｘ　　（５０）　　　　　　　　　　　１４
　１５８ＲｘＳ　　　　　　Ｒ６−５−０６（８）＋Ｄ
ｅｘ（５０）　　　　７，７５９３ ９ ７ Ｄｅｘ：デキサメタソン 培地 ス子ミニレータ−（Ｓ） レスポンダ−（Ｒ） Ｘ５ ＲｘＳ　　　　　　　　　Ｒ６−５−０６（８）ＲＸＳ
　　　　　　　　　アゼチオピリンＲｘＳ　　　　　Ｒ
６−５−Ｄ６（８）＋ｙアゼチオピリン１）８ ７４ ３．４１９ ４９．５７０ ４４　３７４ ４２．７１０ ３４．２４６ 第２０表 ヒトＭＬＲでの抗Ｉ　ＣＡＭ−１と シクロスポリンＡの効果 培地　　　　　　　　　　　　　　　８７スチミユレー
ター（Ｓ）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２０６レスポングー　　（Ｒ）　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９８７ＲＸＳ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　３１．６４０ＲｘＳ　　　　　　　　　　Ｒ６−
５−０６（８）　　　　　　　　　２６．２８２　　　
　１７ＲｘＳ　　　　　　　　　　ＣｙＡ　　（１０）
　　　　　　　　　　　２３，６１７　　　　２５Ｒｘ
Ｓ　　　　　　Ｒ６−５−０６（８）＋ＣｙＡ（１０）
　　　１９．２０４　　　　３９実施例３０ 移植した同種異系臓器の拒絶を抑制するのにおける抗Ｉ
　ＣＡＭ−１抗体の効果 同種異系移植臓器の拒絶を抑制するのにおける抗Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１抗体の効果を示すために、カニクイザルにＣｏ
５１ｍ１等の方法（ＴｒａｎｓｐｌａｎＬ、Ｐｒｏｃ。
Ｌ３：４９９−５０３　（１９８１））に従って同種異
系の腎臓を移植した、ただし、麻酔薬としてバリウム（
ｖａｌｉｕｍ　）　とケタミンを用いる修正を加えた。
即ち、腎臓移植を本質的に次のようにして行った。異型
腎アログラフトを３〜５１１１ｇのカニクイザルに、バ
リウムとケタミンによる麻酔の誘起後、本質的にＭａｒ
ｑｕｅｔにより開示されたようにして行った（Ｍａｒｑ
ｕｅｔ等、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｉｍａｔｏｌｏｇｙ、
　Ｐａｒｔ■、Ｂａ５ｅ１．　Ｋａｒｇｅｒ、　ｐ、　
　１２５　（１９７２）　）。
大動脈または大静脈のバッチ上のドナー腎臓の末端−側
面アナストモーシス（ａｎａｓｔｐｍｏｓｅｓ　）を７
−０ブロレン（Ｐｒｏｆａｎｅ　）縫合線を用いて構築
した。ドナー尿管をスパチュラ処理し外のう的方法によ
ってブラッグ−中に埋め込んだ（Ｔａｇｕｃｈｉ、　Ｙ
。
等、Ｄａｕｓｓｅｔ等編、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｔ
ｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、。
バルチモア、ウィリアムス　アンド　ゥィルキンス、ｐ
３９３　（１９６８））、腎機能をｌａ間毎にまたは２
週間毎の血清クリアチニン測定によって評価した。さら
に、頻ばんなアログラフト生検をｍ織病理学検査用に採
取し、完全解剖をすべての死んだ受容体で行った。殆ん
どの受容体において、両側性腎摘出を移植時に行い、そ
の後の尿毒症列をアログラフト生存の終点とみなした。
いくつかの受容体においては、片側の生腎摘出と対何尿
管ライゲーションを移植時点で行った。アログラフト拒
絶が生じたとき、回加尿管上のライゲーチュアを除去し
、正常腎機能の再生と受容動物の免疫学的モニターを続
ける機会を得た。
モノクローナル抗体Ｒ６−５−Ｄ６を１２日間毎日投与
したが、移出前２日から１〜２■／贈／日の投与量で開
始した。クレアチニンの血清量を周期的に試験して拒絶
をモニターした。同種異系腎の免疫系拒絶に対する抗Ｉ
　ＣＡＭ−１抗体の効果は第２１表に示す。
第２１表 カニクイザルの予防的プロトコールにおける腎アログラ
フト生存を延長するのにおけるＲ６−５−０６の活性 対照１ 〃　２ 〃　３ 〃　４ ＃　５ 〃　６ １５ １９ １７ ２５ ２３ ２７ ７ ｌ１ １．０ １．０ １．０ １．５ １．０ ２．０ ０．５ ０．５ Ｍ　１　０　　　　　　　　　０．５ ２ １サルは移植前２日から１２日間毎日Ｒ６−５Ｄ６が投
与された。
ゝ死因はわからなかった。潜在的マラリャの証拠があっ
た。
Ｃ腎梗塞死 １９８８年８月１５でまだ生存中 上記の結果はＲ６−５−Ｄ６が同種異系移植を受は入れ
たサルの寿命延長に有効であることを示している。
実施例３１ 移植臓器の急性拒絶を抑制するのにおける抗ＩＣＡＭ−
１抗体の効果 抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体が移植拒絶の急性モデルにおいて
有効であることを示すために、Ｒ６−５−Ｄ６を治療中
のまたは急性腎拒絶モデルにおいても試験した。このモ
デルにおいて、サル腎臓を移植しく実施例３０のプロト
コールを用いて）、１５■／　ｋｇのシクロスポリンＡ
（ＣｙＡ）を筋注で組織周辺的に安定な腎機能が得られ
るまで投与した。
次に、ＣｙＡ投与量を血液クレアチニン値の上昇で示さ
れるような拒絶が生じるまで２．５■／ｋｇ増分量で２
週間毎に低減した。この時点で、Ｒ６−５−Ｄ６は１０
日投与し、生存時間をモニターした０重要なことは、こ
のプロトコールにおいては、ＣｙＡの投与量が急性拒絶
状態が生ずると同時に変化しないので次善のま−である
ということに留意することである。このモデルにおいて
は、抗体援助を有しない組織学的対照（Ｎ＝５）は拒絶
状態の開始から５〜１４日間生存する。これまで、６匹
の動物をこのプロトコールにおいてＲ６−５−Ｄ６を用
いて試験したく第２２表）、これら動物の２匹はまだ生
存している（Ｒ６−５−Ｄ６の投与後にｌ１２：３１日
間、およびｌ５：４７日間）、２匹の動物はＲ６−５−
Ｄ６治療開始後３８日および５５日間生き、２匹の動物
は急性拒絶以外の原因で死亡した（−匹はｃｙ、ａ、毒
性で死亡し、−匹は麻酔下でＲ６−５−０６を投与して
いる間に死亡した）、このモデルはＲ６−５−Ｄ６を最
初から用いた臨床状態とより密接に近似している。
第２２表 カニクイデルでの治療プロトコールでの腎アログラフト
生存を延長するのにおけるＲ６−５−Ｄ６の活性 対照０ ２４ ２１ ３ ９ １２ １４−９８ １ ４ １ ２ ７− ８ ｄ ５ 　１１ 〉３１１ サルは拒絶開始後１０日間毎日１〜２■／ｋｇのＲ６−
５−Ｄ６を投与された。
クレアチニン値がＣｙＡ投与量の低減の結果として増大
しＲ６−５−Ｄ６治療を開始した５匹の動物は援助治療
を用いなかった以外は前述の治療プロトコールを用いて
試験した。
生存／後治療の日数はクレアチニン値が上昇し始めたす
ぐからの日数を示す。
４麻酔中に死亡、クレアチニン値は低かった。
″ＣｙＡ毒性による死亡。クレアチニン値は低かった。
’　　１９８８年８月１５日でまだ生存している。
実施例３２ ＩＣＡＭ−１の末端切取り誘導体の遺伝子構築および発
現 天然状態において、Ｉ　ＣＡＭ−　１は５つの免疫グロ
ブリン様ドメインの細胞外領域トランスメンブランドメ
インおよび細胞質ドメインを含有する細胞膜結合たん白
質である。望ましいのはＩＣＡＭ−１から分泌した可溶
物を発現できる点でトランスメンブランドメインおよび
／または細胞質ドメインを欠落するＩ　ＣＡＭ−１の官
能性誘導体を構築することであったー。これらの官能性
誘導体はＩＣＡＭ−１遺伝子のオリゴヌクレオチド関連
変異誘発およびその後の変異遺伝子による投入後のサル
細胞中での発現により構築した。
アミノ酸置換右よび／または末端切取り（Ｔｒｕｎｃａ
ｔｅｄ　）誘導体を与えるＩＣＡＭ−１遺伝子の突然変
異はにｕｎｋｅｌ，　Ｔ．　　の方法により発生させた
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，　Ａｃａｄ，　Ｓｃｉ．（Ｕ．
Ｓ，Ａ．）　　８　２　：４８ｇ−４９２　（１９８５
））。上記のようにして調製したＩＣＡＭ−Ｉ　ＣＤＮ
Ａを制限エンドヌクリアーゼＳａｌｔおよびＫｐＪで消
化し、得られた１．８　ｋｂ　ＤＮＡフラグメントをプ
ラスミドベクターＣＤＭ８にサブクローン化した（Ｓｅ
ｅｄ，　Ｂ，等、Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ，＾ｃａｄ，　
Ｓｃｉ．　　（Ｕ，Ｓ，Ａ．）　　８　４　：　３３６
５−３３６９　　（１９８７）］。次１ご、巳，　Ｃｏ
ｌｉ（ＢＷ３　１　３／Ｐ　３）のｄｕｔ−　、ｕ匹−
株をｐＣＤｌ。８Ｃと表示する上記構築物で形質転換し
た。単一ストランドウラシル含有鋳型を形質転換体から
ヘルパーファージＲ４０８　　（ストレータジーンＲ）
で感染させることによって救援（ｒｅｓｃｕｅ）　　し
た。
次いで、変異体ＩＣＡＭ−４　ｃＤＮＡを不整合ベース
を存するオリゴヌクレオチドとの第２ストランド合成お
よび引き続＜」゛宿主（ＭＣ１０６１／Ｐ３）の得られ
たヘテロ二本鎖体による形質転換を開始するごとによっ
て産性させた。変異体を上記変異オリゴヌクレオチドを
導入した新たに創生したエンドヌクレアーゼ制限サイト
についてスクリーニングすることによって単離した。変
異体Ｉ　ＣＡＭ−またん白質は標準ＤＥＡＥーデキスト
ラン法（　Ｓｅｌｄｅｎ．　Ｒ，Ｆ．等ｓ　Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｂｉｏｌｏｇｙ　（＾ｕｓｅｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．等編集
）、９、２．１−９．２．６　　（１９８？＞）を用い
て真核発現ペクタ−Ｃ０ＭＢ中で上記変異体ＤＮＡによ
るＣｏｓ−７細胞の移入によって発現させた。
トランスメンブランドメインおよび細胞質ドメインを欠
落するが５つの免疫グロブリン様ドメインのすべてを含
有するＩ　ＣＡＭ−　１の末端切取り官能性誘導体を調
製した。３０ｂｐ変異体オリゴヌクレオチド（　ＣＴＣ
　ＴＣＣ　ＣＣＣ　ＣＧＧ　ＴＴＣ　ＴＡＧ　ＡＴＴＧ
ＴＣ　ＡＴＣ　ＡＴＣ　）を用いて位置４５２および４
５３のアミノ酸チロシン（Ｙ）およびグルタミン酸（Ｅ
）　のコドンを、それぞれ、フニニルアラニン（Ｆ）お
よびほん訳停止コドン（ＴＡＧ）に形質転換した。変異
体はその特異的Ｘｂａｌ制限サイトにより単離し、Ｙ４
Ｓ２Ｅ／ＦＳＴＡＧと表示した。
変異体たん白質を発現させるために、ＣＯ８細胞に３種
の変異体サブクローン（＃２、＃７および＃８）を移入
した。これら３種の変異体サブクローンによる移入の３
日後、培養上清および細胞溶解物を抗ＩＣＡＭ−１モノ
クローナル抗体ＲＲ１／１による免疫沈降および５ＤＳ
−ＰＡＧＥによって分析した。ＩＣＡＭ−１は変異体サ
ブクローン＃２および＃８を移入した細胞の培養上清か
らは沈降したがこれら細胞の清浄剤溶解物からは沈降し
なかった。培養上清中に見い出されるＩＣＡＭ−１の分
子量はＩＣＡＭ−１の膜体に比し約５ｋｄ低下していた
が、これは変異体ＤＮＡから予想した大きさに一致する
。即ち、このＩＣＡＭ　　１の官能性誘導体は可溶性た
ん白質として分泌している。これに対し、ＩＣＡＭ−１
は対照の天然ＩＣＡＭ−１を移入した細胞の培養上清か
らは免疫沈降せず、Ｉ　ＣＡＭ−１の膜体はＣＯ８細胞
からは発現しなかったことを示していた。さらにまた、
ＩＣＡＭ−１は陰性対照の偽移入細胞からの培養上清ま
たは細胞溶解物からは免疫沈降してこなかった。
移入細胞から分泌した末端切取りＩＣＡＭ−１をＩ　Ｃ
ＡＭ−１特異性抗体（Ｒ６−５−Ｄ６）によるイムノア
フィニティクロマトグラフによって精製し、細胞結合ア
ッセイでの官能活性について試験した。清浄剤オクチル
グルコサイドの存在下での精製後、天然Ｉ　ＣＡＭ−１
または末端切取り型分泌体を含有する調製物を０．２５
％オクチルグルコサイドの最終濃度に希釈した（清浄剤
の臨界ミセル濃度以下の濃度）。Ｉ　ＣＡＭ−１のこれ
ら調製物をプラスチック９６−ウェルプレート（Ｎｕｎ
ｃ社）の表面に結合させて固相に結合したＩ　ＣＡＭ−
１を調製した。未結合物を洗い出したのち、表面上にＬ
ＦＡ−１を含有する５ＫＷ−３細胞の約７５〜８０％お
よび約８３〜８５％が、それぞれ、ＩＣＡＭ−１の天然
体および末端切取り体に特異的に結合した。これらのデ
ータは分泌型の末端切取り可溶性Ｉ　ＣＡＭ−１官能性
誘導体が免疫学的反応性および天然Ｉ　ＣＡＭ−１の特
徴であるＩＣＡ？１−１依存性粘着を仲介する能力の両
方を保持していることを示している。
細胞質ドメインのみを欠落するＩ　ＣＡＭ−１の官能性
誘導体を同様な方法で調製した。２５ｂｐオリゴヌクレ
オチド（ＴＣＡＧＣＡＣＧ　ＴＡＣＣＴＣＴＡＧＡＡＣ
ＣＧＣＣＡ　）を用いてアミノ酸４７６（Ｙ）のコドン
をＴＡＧはん訳停止コドンに変えた。この変異体はＹ”
ｂ／ＴＡＧと表示した。この変異体を移入したＣｏｓ細
胞の免疫沈降分析および５ＤＳ−ＰＡＧＥは陰性Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１よりも約３　ｋｄ小さい分子量を有するＩ　Ｃ
ＡＭ−１の膜結合体を検出した。上記変異体移入Ｃｏｓ
細胞の間接免疫螢光分析はＬＰＳ刺激ヒト内皮細胞上に
発現した天然Ｉ　ＣＡＭ−１と同様な点状染色像を示し
た。また、上記変異体ＤＮＡを移入した細胞は天然ＩＣ
ＡＭ−Ｉ　ＤＮＡを移入したＣｏｓ細胞と同じような形
でプラスチック表面上の精製ＬＦＡ−１に特異的に結果
した（第２３表）。
第２３表 Ｉ　ＣＡＭ−１発現性細胞またはＩ　ＣＡＭ−１官能性
誘導体のＬＦＡ−１結合活性 偽　　　　　　　　　　　０　　　　　　　０天然ＩＣ
Ａ？Ｉ−１２００ Ｙ４′ｈ／ＴＡＧ　　　　　　　　　２０　　　　　　
、　０実施例３３ Ｉ　ＣＡ　Ｍ　−１官能性ドメインのマフピングＩ　Ｃ
ＡＭ−１の研究はその分子が７つのドメインを有するこ
とを見い出した。これらドメインのうちの５つは細胞外
であり（ドメイン５は細胞表面に最も近く、ドメイン１
は細胞表面がら最も遠い）、１つのドメインはトランス
メンブランドメインであり、１つのドメインは細胞質で
ある（即ち、細胞内に存在する）。どのドメインがＩＣ
ＡＭ−ｉのり、ＦＡ−１に結合する能力に貢献するかを
みるために、エピトープマツピング（地図作製）試験を
用いた。そのような試験を行うためには異なる欠落変異
体を作製し、そのＬＦＡ−１を結合する能力について特
徴決定した。別に、Ｉ　ＣＡＭ−１のＬＦＡ−１に結合
する能力を干渉することが知られている抗ＩＣＡＭ抗体
を用いた試験を行った。かかる抗体の適当な例にはＲＲ
１／１（Ｒｏｔｈｌｅｉｎ、　Ｒ，等、Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏＬ　　１３７　：　１２７０１２７４　（１９８６
）　）、Ｒ６，５（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ。
Ｔ、Ａ、等、米国特許出願第０７／２５０，４４６号）
、Ｌ　Ｂ　−２（Ｃ１ａｒｋ、　Ｅ、Ａ、等、Ｌｅｕｋ
ｏｃｙｔｅ　Ｔｙｐｉｎｇ　１（Ａ、　Ｂｅｒｎａｒｄ
等編集）　ＳＳｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ　。
３３９−３４６　＜１９８４））　、またはＣＬ２０３
（５ｔａｕｎｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、等、Ｃｅ１１．　５６
　：　８４９−８５３　（１９８９））がある。
Ｉ　ＣＡＭ−１の欠落変異体は種々の任意の方法によっ
て調製できる。しかしながら、そのような変異体は部位
特異的変異誘発によりまたは他の組換え手段（特定のた
ん白質領域をコードする配列を欠落させたＩ　ＣＡＭ−
１発現性遺伝子配列を構築することによるような）によ
り産生させるのが好ましい。そのような変異体を産生ず
るのに適する手順は当該技術において周知である。その
ような手順を用いて、３つのＩ　ＣＡＭ−１欠落変異体
を調製した。第１の変異体はアミノ酸残基Ｆ１８５〜Ｐ
２８４を欠落する（即ち、ドメイン３の欠落）。
第２の変異体はアミノ酸残基Ｐ２８４〜Ｒ４５１を欠落
する（即ち、ドメイン４および５の欠落）。
第３の変異体はＹ４７６より後のアミノ酸残基を欠落す
る（即ち、細胞質ドメインの欠落）。そのような試験の
結果はドメイン１．２および３が抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体
およびＬＦＡ−１とのＩＣＡＭ−１相互作用中に主とし
て含まれていることを示す。
実施例３４ ＬＦＡ−１結合に対してのＩ　ＣＡＭ−１変異の効果 Ｉ　ＣＡＭ−１がＬＦＡ−１に反応し結合する能力はＩ
　ＣＡＭ−１分子のドメイン１中に存在するＩＣＡＭ・
−１アミノ酸残基によって仲介される〈第８．９および
１０図）、シかしながら、そのような反応はＩ　ＣＡＭ
−１のドメイン２および３中に存在するアミノ酸の貢献
によって促進される。
即ち、本発明の好ましい官能性誘導体の内には、ｉ　Ｃ
ＡＭ−１のドメイン１．２および３を含有するＩ　ＣＡ
Ｍ−１分子の可溶性はフラグメントが存在する。より好
ましいのはＩ　ＣＡＭ−１のドメイン１および２を含を
するＩ　ＣＡＭ−１分子の可溶性フラグメントである。
最も好ましいのはＩＣＡＭ−１のドメイン１を含有する
Ｉ　ＣＡＭ−１の可溶性フラグメントである。第１１Ｃ
ＡＭ−１ドメイン内の幾つかのアミノ酸残基はＩ　ＣＡ
Ｍ−１とＬＦＡ−１の反応中に含まれている。これらア
ミノ酸の他のアミノ酸による置換はＩ　ＣＡＭ−１のＬ
ＦＡ−１に結合する能力を変化させる。これらのアミノ
酸残基およびその置換体を第２５図に示す。第２５図は
得られた変異体Ｉ　ＣＡＭ−１分子のＬＦＡ−１に結合
する能力についてのそのような変異の効果を示す、第２
３〜２５図においては、各残基はアミノ酸の１文字コー
ドについて記載し、次いでＩＣＡＭ−１分子中のその残
基の位置を示している。即ち、例えばＥ９０”はＩ　Ｃ
ＡＭ−１の位置９０でのグルタミン酸残基を称す。同様
に、”Ｅ９０Ｖ’は位置９０のグルタミン酸残基と位置
９１のバリン残基とからなるジペプチドを示す。置換配
列はスラッシュ（“／“）マークの右に示されている。
Ｉ　ＣＡＭ−１の■４、Ｒ１３、Ｃ２７、Ｃ５８および
Ｄ６０Ｓ６１残基はＬＦＡ１結合中に含まれる。
これらアミノ酸の置換はＩ　ＣＡＭ−１のＬＦＡ−１へ
の結合能力を変化させる。例えば、■４のＧによる置換
はＬＦＡ−１により少なくしか結合しない変異体Ｉ　Ｃ
ＡＭ−１分子の形成をもたらす（第２５図）。ＩＯＡ、
Ｍ−１のＲ１３残基のＥによる置換は実質的に小さいＬ
ＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子の形成を与え
る（第２５図）。
Ｉ　ＣＡＭ−１のＣ５８残基のＨによる置換は実質的に
通常のＬＦＡ−１への結合能力を有する変異体分子を与
える（第２５図）。Ｉ　ＣＡＭ−１のＤ６０Ｓ残基のＫ
Ｌによる置換は実質的に小さいＬＦＡ−１への結合能力
を有する変異体分子を与える（第２５図）。
第２ドメイン中のグリコジル化部位もまたＬＦＡ−１結
合中に含まれる（第２３図）。Ｎ１０３のＫによるまた
はＡ１５５ＮのＳＶによる置換はＬＦＡ−１を実質的に
結合し得ない変異体ＩＣＡＭ−１分子の形成をもたらす
。対照的に、グリコジル化部位Ｎ１７５のＡによる置換
はその変異体ＩＣＡＭ−１のＬＦＡ−１結合能に実質的
に影響しないようであった。
第３ＩＣＡＭ−１ドメインの変異はＩＣＡＭ−１−ＬＦ
Ａ−１，結合性を認知し得る種変化させないようであっ
た（第２４図）。
実施例３５ 増大した生物学的半減アフィニティとクリアランス能力
を有するＩＣＡＭ−１の多量体形ＩＣＡＭ−１のドメイ
ン１と２をその免疫グロブリン長鎖のヒンジ領域に結合
させたキメラ分子を構築する。好ましい構築物はＩＣＡ
Ｍ−１ドメイン２のＣ末端をヒンジ領域対しての丁度Ｎ
−末端の免疫グロブリン長鎖のセグメントに結合させて
、ヒンジ領域により付与されたセグメントフレキシビリ
ティを可能にする。ＩＣＡＭ−１ドメイン１と２はかく
して抗体のＦａｂフラグメントを置換するであろう。Ｉ
ｇＧ類の長鎖への結合および動物細胞の生成はキメラ分
子の産生をもたらすであろう。ＩｇＡまたはＩｇＭに由
来する長鎖を含有する分子の生成は２〜１２個のＩＣＡ
Ｍ−１分子を含有するより高多量体の分子の産生をもた
らすであろう。ＩＣＡＭ−１長鎖キメラ分子を産生ずる
動物細胞中での丁鎖遺伝子の共発現は４〜６ケのＩＣＡ
Ｍ−１分子を含有するＩｇＡ分子と約１０ケのＩＣＡＭ
−１分子を含有するＩｇＭのケースとを主として与える
ＩｇＡとＩｇＭ多量体の適当な集合体を与えるであろう
。これらのキメラ分子は幾つかの利点を有する。第１は
、Ｉｇ分子を循環系中で長く滞在するよう設計し、これ
により生物学的半減期を改善できる。
さらにまた、これら加工分子の多量体性は、治療情状の
いかんによって、これら分子がより高い結合活性によっ
てライノウィルス並びに細胞表面ＬＦＡ−１と反応でき
るようにし、かくして有効投与量を与えるべき投与に必
要な組換えたん白質の量を大いに低減させる。ＩｇＡお
よびＩｇＭは鼻におけるような粘膜部位の分泌物中に通
常存在する高グリコジル化分子である。その高親水性は
粘膜中で結合する微生物およびウィルスを保持するのを
助長して細胞への結合を防止しまた上皮細胞膜バリヤー
の交差を防止する。即ち、これらの分子は増大した治療
効力ををする。ＩｇＭと特にＩｇＡとは粘膜環境で安定
でありＩＣＡＭ−１構築物の安定性を増大させる。その
ようなＩＣＡＭ−１官能性誘導体を血液流中に投与する
場合、この誘導体も生物学的半減期を増大する。ＩｇＡ
は補体を固定せず、従って、それが有害である用途にお
いて理想的であろう。ＩｇＧのＨＩＭキメラを望む場合
には、補体への結合並びにＦｃレセプターとの反応中に
含まれる領域を変異させることが可能であろう。
実施例３６ ＩＣＡＭ−１変異体の発現 オリゴヌクレオチド特異性変異誘発 １、８　ｋｂ　Ｓａｌ　１−Ｋｐｍ　１７ラグメント中
のＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡのコード領域を発現ペクタ−Ｃ
０ＭＢ中にサブクローニングした（　５ｅｅｄ、　Ｂｏ
等、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　　（口、Ｓ、
＾、＞　　　８４：３３６５　〜３３６９　（１９８７
）］。Ｋｕｎｋｅ１、　Ｔ、　の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔ１、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　　（Ｕ、Ｓ、Ａ、）’
８２　：　４８８−４９２　（１９８５））および５ｔ
ａｕｎｔｏｎ　Ｄｏ等の変法（５ｔａｕｎｔｏｎ　Ｄ、
日０等、Ｃｅ１１５２：９２５−９３３　（１９８８）
）に従って、この構築物（ｐｃＤ１、８）を用いてオリ
ゴヌクレオチド特異性変異誘発で使用する単一ストラン
ドウラシル含有鋳型を調製した。
要すルニ、Ｂ、　Ｃｏ１１株Ｘ５１２７をｐｃＤｌ８で
形質転換した。単一コロニーを１３μｇ／ｍｆ！のアン
ピシリンと８μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する
１　ｍｌのルリア　ブロス（ＬＢ）培地（Ｏｉｆｃｏ社
）中で近飽和まで増殖させた。１００μｌの培養物をＲ
４０８へルバーファージ（Ｓ　ｔｒａ　ｔｅｇｅｎｅ社
）で１０の感染多重度（Ｍｏｌ）で感染させ、アンピシ
リンとテトラサイクリンを含む１０ｍ６のＬＢ培地を３
７℃で１６時間培養で加えた。１０．０００ｒｐｍで１
分間の遠心および上清の０．２２μｍ濾過の後、ファー
ジ懸濁液をＥ。
Ｃｏ１ｔ　ＢＷ３１３／　Ｐ　３を感染し、次いで、こ
れをアンピシリンおよびテトラサイクリンを加えたＬＢ
寒天（Ｄｉｆｃｏ社）プレート上に塗布した。コロニー
を採取し、アンピシリンとテトラサイクリンを含む１　
ｍｌのＬＢ培地中で近飽和に増殖させ、ヘルパーファー
ジでＭＯＩ　１０で感染させた。次いで、培養容量を２
５０１１１１に増大させ、細胞を一夜培養した。単一ス
トランドＤＮＡを標準のファージ抽出により単離した。
変異体オリゴヌクレオチドをリン酸化し、第２ストラン
ド合成反応にｐｃＤ１、８鋳型と共に用いたＣ　５ｔａ
ｕｎｔｏｎ　Ｄ、Ｅ、等、Ｃｅ１１５２：９２５−９３
３　（１９８８））。
移ニーと ＣＯＳ細胞を１６〜２４時間で５０％の集密性となるよ
うに１０ａｍの組織培養プレート中にシード付けした。
次いで、ＣＯ８細胞をＴＢＳで１度洗浄し、１０％のＮ
ｕ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ社）、５１１ｇ／
ａｌｌのクロロキーネ（ｃｈ１ｏｒｏｑｕ４ｎｅ　）、
３μｇの変異プラスミドおよび２００μｇ／ｌｅｌのＤ
ＥＡＥ−デキストラン　サルフェートを含有する４　ａ
ｌｌのＲＰＭＩで４時間培養した。細胞をその後１０％
のＤＭＳＯ／ＰＢＳ次いでＰＢＳで洗浄し、培養培地中
で１６時間培養した。培養培地を新鮮培地で入れ替え、
４８時間で、後移入ＣＯＳ細胞をトリプシン／　Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　（Ｇｔｂｃｏ社）処理により懸濁し、ＨＲＶ
結合用の２．１０ｃｍプレート並びに２４ウ工ル組織培
養プレート中に細分した。７２時間で、細胞を１０ロブ
レートから５　ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＨＢＳＳで採集し、Ｌ
ＦＡ−１コーテイングプラスチツクへの粘着および免疫
螢光分析用に加工した。
ＬＦＡ−１およびＨＲＶ　　’− ＬＦＡ−１を５ＫＷ−３からＴＳ　２／４　ＬＦＡ−１
ｍＡｂセファローズ上でイムノアフィニティクロマトグ
ラフにより精製し、２ＩＩＩＭのＭｇＣ１１゜および１
％のオクチルグルコシドの存在下にｐＨ１１，５で溶出
させた。ＬＦＡ−１（１０μｇ／２００μＡ　／　５　
ｃｍプレート）を微生物学的ベトリ皿に２１１ＩＭの門
ｇＣ１ｔを含むＰＢＳ　（リン酸塩緩衝塩水）中でオク
チルグルコシドを０．１％に希釈し４℃で一夜インキユ
ベートすることによって結合させた。各プレートを１％
ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）でブロックし、２１Ｉ
ＩＭのＭｇＣβ２．０．２％ＢＳＡ、０．０２５％のア
ザイド、および５０μｇ／ｌｌ１１のジェンタマイシン
を含有するＰＢＳ中で保存した。
５％ＦＣ３（ウシ胎児血清）、２＋ｎＭのＭｇＣＪ　、
、０、０２５％のアザイドを含有するＰＢＳ　（バッフ
ァー）中の５ＩＣｒ標識ＣＯＳ細胞をＬＦＡ−１コーテ
イングマイクロタイタープレート中で５μｇ／ｍｌのＲ
ＲＩ／１およびＲ６，５の存在または不存在下に２５℃
、１時間インキュベートした。粘着してない細胞をバッ
ファーで３回洗浄することにより除去した。粘着細胞は
ＥＤＴＡの添加により１０ｍＭに溶出し、Ｔ−計算した
。
血−玉 ＲＲＩ／１、Ｒ６，５、ＬＢ−２、またはＣＬ２０３の
ような抗Ｉ　ＣＡＭ−１抗体は同定されている。これら
抗体がＩ　ＣＡＭ−１機能を抑制し得るならば、これら
の抗体はＩ　ＣＡＭ−１分子の特定の部位（これがまた
Ｉ　ＣＡＭ−１機能に重要である）に結合し得なければ
ならない。即ち、前述のＩＣＡ？１−１の欠落変異体を
調製し、上記の抗ＩＣＡＭ−１抗体が上記欠落体に結合
し得る程度を測定することによって、欠落ドメインが機
能上重要であるかどうかを見ることができる。
Ｉ　ＣＡＭ−１は複合膜たん白質であり、その細胞外ド
メインは５つのＩｇａＣ−ドメインからなるものと予測
される。ＬＦＡ−１を結合するのに含まれるドメインを
同定するには、ドメイン３、およびドメイン４と５　（
カルボキシル末端）をオリゴヌクレオチド特異性変異誘
発により欠落させ、ＣＯＳ細胞中で発現後官能的に試験
した。さらに、全細胞質ドメインを欠落させてＩ　ＣＡ
Ｍ−１反応へのその潜在的影響を確認した。期待したよ
うに、細胞質ドメイン欠落体、Ｙ４７６／’″はＲＲＩ
／１、Ｒ６，５、ＬＢ−２およびＣＬ２０３の反応性の
喪失を示さないのに対し、ドメイン３の欠落体Ｆ１８４
−Ｒ４５１はＣＬ２０３反応性の減少および喪失をもた
らした（第２０図）。即ち、ＣＬ２０３エピトープはド
メイン４中に存在するようであるが、ＲＲＩ／１．、Ｒ
６，５およびＬＢ−２は２ケのアミノ末端ドメイン中に
存在するようである。
３つの欠落変異体はすべてＬＦＡ−１に対し野生型レベ
ルの粘着性を示した（第２１図）。ドメイン１２および
３中の予測β−ターンでのアミノ酸置換体も調製しＣＯ
Ｓ細胞中での発現後機能性試験した。Ｒ６，５エピトー
プはドメイン２の配列ＥＩＩＩＧＧＡに局在化しまたド
メインｌ中にＲ３９を含み得るが、ＲＲＩ／１とＬＢ−
２は共にドメインｌのＲ１３に依存している（第２２図
）。
さらに、ＲＲ１／１結合性は配列Ｄ７１ＧＯ３中での変
異により減少した。Ｎ１０３およびＮ１６３のＮ−結合
グリコシル化部位を削減する変異はＲＲＩ／１、Ｒ６，
５とＬＢ−２、ＬＦＡ−ＩＨＲＶ結合性を減少させた。
これらの変異はＩ　ＣＡＭ−１ダイマーを発生させるよ
うな加工を行うようである。
ドメイン２または３の他の変異は変化型ＬＦＡ−１粘着
をもたらさなかった（第２３および２４図）。ドメイン
１のアミノ酸、Ｒ１３とＤ６０の両方はＬＦＡ−１と結
合することによって含まれる（第２５図）。
即ち、ＬＦＡ−１およびＨＲＶ結合性はＩＣＡＭ−１の
アミノ末端１末端ドメインの機能であるようである。第
２６図はＩ　ＣＡＭ−１末端ドメインの配列を示す。
本発明をその特定の実施Ｌｉ様について説明して来たが
、更なる修正が可能であることは理解し得ることであり
、本出願は、一般に、本発明の原理に従いかつ本発明が
関係する技術内での公知または慣用的実施に含まれるよ
うなまた特許請求するような本質的な特徴に適用し得る
ような本明細書の記載からの回避を包含するすべての変
形、用途または適用を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
第１図は正常細胞とＬＦＡ−１欠損細胞間の粘着を図式
的に示す。 第２図は正常細胞／正常細胞粘着過程を図式的に示す。 第３図は５０ｎｇ／ｍＡ’のＰＭＡの不存在（×）また
は存在（○）下の細胞凝集の動力学を示す。 第４図はＬＦＡ−１−細胞とＬＦＡ−１“細胞間の凝集
を示す。図中に示すようにカルポキシフルオレスセイン
ジアセテート標識ＥＢＶ−形質転換細胞（１０’　）を
１０５未標識同元細胞（黒枠）またはＪＹ細胞（白枠）
とＰＭＡの存在下に混合した。１゜５時間後、凝集物中
または遊離の標識細胞を実施例２の定量アッセイを用い
て計数した。 凝集物中の標識細胞の％を示す。２つの内の１つの代表
的な試験を示している。 第５図はＪＹ細胞からのＩ　ＣＡＭ−１とＬＦＡ−１の
免疫沈降を示す、ＪＹ細胞のトリトンＸ−１００溶解物
（レーン１および２）または対照溶解バッファー（レー
ン３および４）をＩ　ＣＡＭ−１に結合し得る抗体（レ
ーン１および３）またはＬＦＡ−１に結合し得る抗体（
レーン２および４）で免疫沈降させた。パネルＡは還元
条件下での結果を示し、パネルＢは非還元条件下で得ら
れた結果を示す。分子量標準物はレーンＳに示した。 第６図はヒト皮ふ繊維芽細胞上のＩ　ＣＡＭ−１発現に
対してのＩＬ−１とガンマ−インターフェロンの効果の
動力学を示す。ヒト皮ふ繊維芽細胞は８Ｘ１０’細胞１
０．３２ｃｎｌウエルの密度に増殖させた。Ｉ　Ｌ−１
（１０ｐ／　ｍｊ！、黒丸）または組換エガンマーイン
ターフェロン（１０μ／ｍｊ２、白画角）を加え、図中
に示した時間で、４℃に冷却し間接結合アッセイを実施
した。標準偏差は１０％を越えなかった。 第７図はＩ　ＣＡＭ−１へのＩＬ−１とガンマ−インタ
ーフェロン効果の濃度依存性を示す。ヒト皮ふ繊維芽細
胞は８Ｘ１０’細胞１０．３２ｃｎｌ／ウエルの密度に
増殖させた。ＩＬ’−２（白丸）、組換えヒトＩＬ−１
（白画角）、組換マウスＩＬ−１（黒画角）および組換
えべータインターフェロン（白三角）を図中に示した稀
釈率で４時間（Ｉ　Ｌ−１＞または１６時間（ベータお
よびガンマ−インターフェロン）インキュベートした。 示した結果は４回測定の平均を示し、標準偏差は１０％
を越えなかった。 第８図はＩ　ＣＡＭ−１ｃＤＭＡのヌクレオチドおよび
アミノ酸配列を示す。第１ＡＴＧは位置５８にある。Ｉ
ＣＡＭ−１トリプシンペプチドに相当する翻訳配列はア
ンダーラインを施しである。 疎水性推定シグナルペプチドおよびトランスメンブラン
配列は肉太アンダーラインを施している。 Ｎ−結合グリコシル化部位は囲っている。位置２９７６
のポリアデニリル化シグナルＡＡＴＡＡＡはオーバーラ
インを施している。図示した配列はＨＬ−６０ｃＤＮＡ
クローン用である。内皮細胞ｃＤＮＡはその長さの大部
分に亘ってシーケンシングし小さな差異のみを示した。 第９図はＩ　ＣＡＭ−１相同ドメインおよび免疫グロブ
リン超遺伝子群への相関を示す。（Ａ）５つの相同ドメ
インの配列（Ｄ＋−ｓ　）　　：列んだ２以上の同じ残
基は囲っている。ＮＣＡＭドメインに２回以上含まれる
残基、およびセラ）ＣｚおよびＣＩのドメイン中に含ま
れる残基はＩ　ＣＡＭ−１内部繰返しによって配列して
いる。Ｉ　ＣＡＭ−１のドメイン中の予想βストランド
の位置は棒線および配列上の小文字でマークしており、
また免疫グロブリンＣドメイン中のβ−ストランドの公
知の位置は棒線および配列下の大文字でマークしている
。ＩＣＡＭ−１ドメイン内の推定ジスルフィド架橋の位
置はＳ−８によって記している。ＩＣＡＭ−１に相同性
のたん白質ドメインの（Ｂ−Ｄ）配列：各たん白質はＦ
ＡＳＴＰプログラムを用いてＮＢＲＦデータベースを調
査することによって先ず配列する。各たん白質配列はＭ
ＡＧ、ＮＣＡＮ、Ｔ細胞レセプターαサブユニット■ド
メイン、ＩｇＭμ鎖およびα−１−Ｂ−塘たん白質であ
る。 第１０図はＩ　ＣＡＭ−１とＭＡＧの二次構造の比較図
である。 第１１図は平坦膜中でＩＣＡＭ−１に結合しているＬＦ
Ａ−１陽性ＥＢＶ−形質転換Ｂ−リンパ芽球腫（ｌｙｍ
ｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｃｌ　）細胞を示す。 第１２図はプラスチック結合ベシクル中のＩｃＡＭ−１
に結合しているＬＦＡ−１陽性Ｔ−ＩＪンバ芽球および
Ｔ−ＩＪンバ球を示す。 第１３図はプラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１
に結合しているＪＹＢ−ＩＪンバ芽球腫の細胞またはベ
シクルのモノクローナル抗体による前処理による結合抑
制を示す。 第１４図はプラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１
へのＴ−リンパ芽球の結合に対しての温度の効果を示す
。 第１５図はプラスチック結合ベシクル中の［ＣＡＭ−１
へのＴ−ＩＪンパ芽球の結合における二価のカチオンの
必要性を示す。 第１６図は末梢血液単核細胞がＴ−細胞会合抗原０ＫＴ
３の認識に応答して増殖する能力に没ぼす抗粘着性抗体
の効果を示す。“０ＫＴ３″は抗原の添加を示す。 第１７図は、末梢血液単核細胞が、非特異的Ｔ−細胞分
裂促進物質である、コンカナバリンＡの認識に応答して
増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体の効果を示す。Ｃ０
ＮＡ″はコンカナバリンＡの添加を示す。 第１８図は、末梢血液単核細胞が、鍵穴カサガイヘモシ
アニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙ
ａｎｉｎ　）抗原の認識に応答して増殖する能力に及ぼ
す抗粘着性抗体の効果を示す。“ＫＬＨ”は、鍵穴カサ
ガイヘモシアニンの、細胞への添加を示している。 第１９図は末梢血液単核細胞が、破傷風菌トキソイド抗
原の認識に応答して増殖する能力に及ぼす抗粘着性抗体
の効果を示す。“、八〇Ｎ”は破傷風菌トキソイド抗原
の、細胞への添加を示す。 第２０図はＩＣＡＭ−１欠落変異体へのモノクローナル
抗体ＲＲＩ／１、Ｒ６，５、ＬＢ２、およびＣＬ２０３
の結合を示す。 第２１図はＩＣＡＭ−１欠落変異体のＬＦＡ−１への結
合を示す。 第２２図は抗Ｉ　ＣＡＭ−１モノクロ一ナル抗体ＲＲ１
／１、Ｒ６，５、ＬＢ２、およびＣＬ２０３により認識
したエピトープを示す。 第２３図はＬＦＡ−１へのＩ　ＣＡＭ−１ドメイン２変
異体の結合能力を示す。 第２４図はＬＦＡ−１へのＩ　ＣＡＭ−１ドメイン３変
異体の結合能力を示す。 第２５図はＬＦＡ−１へのＩＣＡＭ−１ドメイン１の結
合能力を示す。 第２６図はＩＣＡＭアミ、ノ末端ドメインの配列を示す
。 時間（分） ２　　３　　　４ ＥＢＶ形質転換Ｂ−細胞 蔵置の浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、２゜ ＦＩＧ、　６゜ ＦＩＧ サイト力イン濃度　（ｎｇ／ｍｌｌ ＦＩＧ、１１゜ ＦＩＧ、　１３゜ ＦＩＧ、１２゜ 陽性ＥＢＶ−形賃′ｈ候Ｅ　−１）ンバ芽琢狸Ｘ田胞Ｆ
ＩＧ、１４ １度０Ｃ プラスチック結合ベシクル中のＩＣＡＭ−１へのＴ−リ
ンパ芽球の結合における２価カチオン必要性ＦＩＧ、　
２０ ＩＣＡＭ−１欠落変異体へのＭａｂ結合性ＦＩＧ、　２
１ １ＣＡＭ−１欠落変異体のＬＦＡ−１への結合性ＩＣＡ
Ｍ ｌドメイン２変異体のＬＦＡ−１への結合性”／、野性
型結合 ＩＣＡＭ−１ドメイン３変異体のＬＦＡ−１への結合性
３、補正をする者 事件との関係 出 願 人 ４、代 理 人

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、ＩＣＡＭ−１の可溶性官能性誘導体。 ２、ＩＣＡＭ−１のフラグメント、または該フラグメン
    トの変異体、アナログまたは化学誘導体である請求項１
    記載のＩＣＡＭ−１の官能性誘導体。 ３、ＩＣＡＭ−１の細胞質ドメインを欠落する請求項２
    記載のＩＣＡＭ−１の官能性誘導体。 ４、ＩＣＡＭ−１のトランスメンブランドメインを欠落
    する請求項２または３記載のＩＣＡＭ−１の官能性誘導
    体。 ５、ドメイン１、ドメイン１と２、またはドメイン１、
    ２および３を含有する請求項２記載のＩＣＡＭ−１の官
    能性誘導体。 ６、特異的または非特異的防御系の応答に由来する炎症
    の治療用の薬剤組成物の調製に用いる請求項１〜５のい
    ずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の可溶性官能性誘導体。 ７、移行にＬＦＡ−１群の官能性１員を必要とする造血
    腫瘍細胞の転移抑制用の薬剤組成物の調製に用いる請求
    項１〜５のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１の可溶性官
    能性誘導体。 ８、ＬＦＡ−１発現性腫瘍細胞の増殖抑制用の薬剤組成
    物を調製するのに用いる請求項１〜５のいずれか１項記
    載のＩＣＡＭ−１の毒素由来可溶性官能性誘導体。 ９、特異的防御系の応答に由来する炎症の治療用の好ま
    しくはデキサメタソン、アゼチオピリンおよびシクロス
    ポリンＡから選ばれる免疫抑制剤と一緒に用いて薬剤組
    成物を調製するのに用い、さらに、ＩＣＡＭ−１に結合
    し得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメン
    ト、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およ
    びＩＣＡＭ−１の非免疫グロプリンアンタゴニストから
    選ばれることを特徴とする抗炎症剤。 １０、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１
    の可溶性官能性誘導体である請求項９記載の抗炎症剤。 １１、ＬＦＡ−１に結合し得る抗体、ＬＦＡ−１に結合
    し得る抗体の官能性誘導体およびＬＦＡ−１の非免疫グ
    ロプリンアンタゴニストから選ばれる第２薬剤と一緒に
    用いて特異的防御系の応答に由来する炎症の治療用の薬
    剤組成物の調製に用い、さらに、ＩＣＡＭ−１に結合し
    得る抗体、ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体フラグメント
    、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体およびＩ
    ＣＡＭ−１の非免疫グロプリンアンタゴニストから選ば
    れることを特徴とする抗炎症剤。 １２、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１
    の可溶性官能性誘導体を含む抗炎症剤。 １３、ａ）ＩＣＡＭ−１に結合し得る抗体、ＩＣＡＭ−
    １に結合し得る抗体フラグメント、ＩＣＡＭ−−１又は
    ＩＣＡＭ−１の官能性誘導体、およびＩＣＡＭ−１の非
    免疫グロプリンアンタゴニストからなる群から選ばれた
    抗炎症剤；および ｂ）デキサメタゾン、アゼチオピリンおよびシクロスポ
    リンＡからなる群から選ばれた少なくとも１つの免疫抑
    制剤； とを含む薬剤組成物。 １４、ａ）請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＣＡＭ
    −１の可溶性官能性誘導体、および ｂ）通常の担体または賦形剤、 を含む薬剤組成物。 １５、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１
    の可溶性官能性誘導体を発現し得る組換えＤＮＡ分子。 １６、請求項１〜５のいずれか１項記載のＩＣＡＭ−１
    の可溶性官能性誘導体をコードする組換えべクターによ
    り形質転換された宿主微生物を上記誘導体を発現し培養
    培地中に分泌させる条件下で培養し、しかる後、上記誘
    導体を単離することを特徴とするＩＣＡＭ−１の可溶性
    官能性誘導体の調製方法。 １７、ＬＦＡ−１群分子の１員を発現する腫瘍細胞を有
    する懸念のある対象体のかかる細胞の存在および位置を
    診断する方法において、 ａ）上記対象体の組織サンプルを請求項１〜５のいずれ
    か１項記載のＩＣＡＭ−１の検出可能に標識した可溶性
    官能性誘導体を含有する組成物の存在下にインキュベー
    トすること、および ｂ）上記組織サンプル中に存在するＬＦＡ−１群分子の
    １員に結合している上記結合性リガントを検出すること
    、 を特徴とする上記方法。
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