CN114573711A - 一种TanCAR的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种TanCAR，在第3代CAR骨架的基础上构建而成，由识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分、跨膜部分及细胞内信号转导部分三部分组成。TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分由具有核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列的IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的EphA2scFv序列组成，其IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端，EphA2scFv序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，其两段序列由GGGS linker进行连接。其构建方法由合成第三代CAR分子的基因及构建第三代CAR骨架载体、构建新型IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)CAR载体及构建新型IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)‑EphA2scFv‑TanCAR载体三个步骤组成。经研究表明，基于TanCAR制备T细胞能够用于肿瘤中细胞免疫治疗。

Description

一种TanCAR的构建及其应用
技术领域
本发明属于CART治疗技术领域，具体涉及一种TanCAR的构建及其应用。
背景技术
恶性肿瘤严重危及人类的生命健康。目前对恶性肿瘤的常规治疗仍为手术及放、化疗，这种常规治疗对极大多数肿瘤的疗效仍不十分理想，对与极大多数化疗药物而言，其治疗指数依然很低，即其治疗剂量与毒性剂量较为接近。故这种治疗手段通常伴有明显的毒性作用。因此，研究选择性杀灭肿瘤细胞的方法主要依赖于肿瘤细胞的特异性标记，目前肿瘤的靶向性治疗已经成为研究的热点。近年来，随着生物技术的迅速发展，CAR-T(Chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)疗法已经成为一种非常有前途的癌症治疗方法，特别是针对非实体瘤的血液系统肿瘤，取得了非常好的临床治疗效果，目前作为针对B淋巴细胞恶性肿瘤治疗的CAR-T药物已经获得美国FDA及中国SFDA的批准上市。但是，目前CAR-T治疗过程还存在一些问题，特别是针对实体瘤的治疗效果欠佳，因此，如何提高CAR-T针对实体瘤的治疗效果(如针对恶性胶质母细胞瘤的CAR-T治疗效果)，同时降低CAR-T在治疗过程中所存在的副作用，是该领域所面临的巨大的挑战。
用于胶质母细胞瘤治疗的CAR-T细胞所针对的靶抗原主要包括白介素13受体α2(IL13Rα2)、人类表皮生长因子受体2(HER2)、表皮生长因子变异III(EGFRvIII)和促红细胞生成素肝细胞受体A2(EphA2)等。其中，由于IL13Rα2在大约50％-80％的神经胶质瘤中过表达，而在正常脑组织中几乎不表达，因此，IL13Rα2是目前最理想的用于治疗胶质母细胞瘤的靶点。到目前为止，针对IL13Rα2设计的CAR有两种，其中IL13Rα2scFv CAR针对靶抗原是IL13Rα2scFv，而IL13 CAR针对靶抗原的是IL13Rα2的配体IL13。然而，考虑到IL13Rα2scFvCAR中的scFv具有一定的免疫原性以及IL13和scFv对IL13Rα2存在竞争性结合的两方面因素，与IL13Rα2scFv CAR相比，IL13 CAR在应用中更具有优势。正如我们所知，IL13有两个受体，一个是IL13Rα2，另一个是IL13Rα1。尽管IL13对神经胶质瘤细胞高表达的IL13Rα2的亲和力高于其对体细胞中正常表达的IL13Rα1的亲和力，但IL13 CAR仍然存在IL13和IL13Rα1结合后所致的脱靶毒性，因此，其特异性有待提高。
发明内容
针对上述IL13 CAR存在的缺陷，为提高CART在肿瘤的特异性，本发明的目的在于，提供一种新的TanCAR。
本发明另一个目的在于，提供上述TanCAR的构建方法。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种TanCAR，其特征在于，在第三代CAR骨架基础上，TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分将具有核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体核酸序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv核酸序列组成，其中，IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端，EphA2scFv序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，两段序列由GGGS linker的核酸序列间隔。
所说的核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体氨基酸序列为：
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGGACATGCTGGACGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTAAGGAGGGACAGTTCAAC。
所说的蛋白序列表中NO1所示的氨基酸序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)蛋白序列为：
SPGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN。
所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv核酸序列为：
TTCGAACAGGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTACAACCAGGTGGCTCCCTCAGGCTCAGCTGCGCCGCATCAGGATTTACTTTCAGCTCTTATACTATGAGTTGGGTTAGACAAGCCCCTGGGCAAGCCCTCGAATGGATGGGAACAATCTCGTCCGGAGGCACATATACCTACTACCCCGACTCCGTCAAAGGTCGGTTTACGATCAGCCGTGACAACGCCAAAAATTCCCTGTACCTACAAATGAACTCTCTAAGAGCTGAAGATACTGCAGTCTATTATTGCGCCAGAGAAGCTATCTTCACTTACTGGGGACGTGGTACGTTAGTGACAGTCTCATCGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATTCAGCTAACTCAAAGTCCATCGTCGCTATCAGCCAGCGTAGGAGACAGAGTCACAATCACGTGCAAAGCGAGCCAAGACATCAATAACTATCTTTCATGGTATCAACAGAAACCTGGCCAAGCACCGCGTTTACTTATATACAGAGCAAATCGGTTGGTAGACGGTGTCCCCGACAGATTCTCTGGTTCAGGTTACGGGACGGACTTTACCTTAACAATTAATAACATCGAGAGTGAAGATGCGGCTTACTATTTCTGCCTGAAATACGACGTGTTCCCATATACATTTGGTCAGGGTACTAAGGTTGAGATTAAAGCTAGC。
所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv蛋白序列为：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIK。
具体地，TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分也可以是所说的核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列在识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列在识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端；两个序列之间可以是任何一种linker。
进一步地，构建TanCAR的骨架可以为任何一种CAR骨架。
上述的TanCAR的构建方法，其特征在于，由下述步骤组成：
(1)第三代CAR分子的基因合成及第三代CAR骨架载体的构建
根据GeneBank数据库中检索到各片段的基因序列，从华大基因公司合成含有21个氨基酸(Amino acid，aa)的人CD8α信号肽linker(1th aa到21th aa)及Igκ信号肽linker(1th aa到21th aa)两种不同前导肽的CAR分子；合成人CD8α Hinge区域(138thaa到182thaa)；合成人CD28跨膜区及其细胞内活化基序片段(153th aa到220th aa)；合成人CD134细胞内活化基序片段(242th aa到277th aa)；合成人CD3ζ细胞内活化基序片段(52thaa到165th aa)，其中在信号肽与CD8αHinge区域中间插入SfuI-MluI-NheI多克隆位点(Multiple Cloning Site，MCS)以及Flag标签，克隆载体为pUC57-CAR，合成序列经华大基因测序正确无误后置于-20℃保存。
(2)IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)CAR载体构建
首先从NCBI上查询IL13序列合成引物并克隆其胞外段，以IL 13保外段为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，利用设计好的突变体引物进行过聚合酶链式反应(PCR)获得PCR产物，将PCR产物进行回收产物加“A”，与pGEMT-easy载体连接，转化、培养及质粒提取后，进行酶切鉴定和测序，获得pGEMT/IL13-E13K R109K；而后再以pGEMT/IL13-E13K R109K质粒为模板进行再次PCR，酶切鉴定和测序，获得pGEMT/IL13-E13K R66D S69D R109K。pGEMT/IL13E13K R66D S69D R109K质粒用Sfu I和Nhe I切下片段连入pUC57-CAR中，酶切鉴定成功后，命名为pUC57-IL13(E13K R66D S69D R109K)CAR。
(3)IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR载体的构建
根据EphA2 4H5单克隆抗体轻重链的氨基酸序列对应其核苷酸序列，并根据第三代CAR骨架载体的特点，设计优化酶切位点，并在轻重链之间加入3个GGGS linker的核苷酸序列。从华大基因公司合成具有特异性酶切位点的EphA2 scFv核酸片段，并将其与pGEMT-easy载体连接，转化、培养及质粒提取后，进行酶切鉴定和测序，获得pGEMT/EphA2 scFv；将pGEMT/EphA2 scFv质粒用Sfu I和Nhe I切下片段连入pUC57-IL13(E13K R66D S69DR109K)CAR中，酶切鉴定成功后，命名为pUC57-IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR。
根据申请人的实验表明，所述的TanCAR能够用于肿瘤细胞免疫治疗。
将TanCAR慢病毒载体制备成携带TanCAR的慢病毒，然后将该慢病毒感染人外周血分离的T细胞，从而获得相应的TanCAR-T免疫细胞，并将该TanCAR-T免疫细胞用于体内、外的肿瘤治疗。或者
将TanCAR制备成携带TanCAR的真核表达载体，导入T细胞或NK细胞用于体内、外的肿瘤治疗；
所述体内、外的肿瘤是恶性脑胶质瘤或高表达IL13Rα2或EphA2的肿瘤。
本发明的TanCAR制成TanCAR-T免疫细胞，所述新型TanCAR在第3代CAR的骨架基础上，TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分包括IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列和EphA2 scFv序列，并以GGGS linker连接。肿瘤细胞模型为恶性胶质母细胞瘤，携带四个突变氨基酸的突变体IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv TanCAR-T对正常细胞细胞表面所表达的IL13Rα1的亲和力大大降低了，但对肿瘤细胞表面高表达的IL13Rα2的结合特异性有明显提高。因此，基于该TanCAR的TanCAR-T在U87细胞系有很好的特异性和细胞杀伤活性，不仅提高了其对恶性脑质瘤的杀伤特异性，同时也降低了其毒副作用，而且可以防止肿瘤抗原的逃逸，在作为恶性胶质母细胞瘤的细胞免疫治疗中具有重要的意义。申请人通过比较发现该基于TanCAR的TanCAR-T具有高肿瘤特异性，低抗原免疫逃逸性，可作为免疫细胞用于脑肿瘤的基因治疗以及其他肿瘤的CAR-T治疗。
附图说明
图1是不同前导肽第三代CAR示意图。
图2是肿瘤特异性启动子的质粒鉴别图。
图3是CD8+T细胞系的IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR对恶性脑胶质瘤的杀伤性检测图。
图4是IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR的CD8+T在恶性脑胶质瘤动物模型中的抗肿瘤活性评估。
图5是恶性脑胶质瘤组织Ki67及CD3免疫组化染色图。
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种TanCAR，在第三代CAR骨架基础上构建而成，TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分由核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体核酸序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv核酸序列组成，其中，IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端，EphA2scFv序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，两段序列由GGGS linker的核酸序列间隔。
上述TanCAR的构建方法，步骤如下：
1、第三代CAR分子的基因合成及第三代CAR骨架载体的构建
根据GeneBank数据库中检索到各片段的基因序列，从华大基因公司合成含有21个氨基酸(Amino acid,aa)的人CD8α信号肽linker(1th aa到21th aa)及Igκ信号肽linker(1th aa到21th aa)两种不同前导肽的CAR分子；合成人CD8αHinge区域(138thaa到182thaa)；合成人CD28跨膜区及其细胞内活化基序片段(153th aa到220th aa)；合成人CD134细胞内活化基序片段(242th aa到277th aa)；合成人CD3ζ细胞内活化基序片段(52thaa到165th aa)，其中在信号肽与CD8αHinge区域中间插入SfuI-MluI-NheI多克隆位点(Multiple Cloning Site,MCS)以及Flag标签，克隆载体为pUC57-CAR，合成序列经华大基因测序正确无误后放于-20℃保存。其骨架结构如图1所示：
2、IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)CAR载体构建
首先从NCBI上查询IL13序列合成引物并克隆其胞外段。然后设计四对针对IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物如表1所示：
表1：用于IL13扩增及定点突变引物表
Figure BDA0003531290880000071
Figure BDA0003531290880000081
以IL 13胞外段为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，利用设计好的突变体引物进行过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增：
PCR体积为：5μl 10×PCR buffer、1μl P1、1μl P2、0.5μl LA Taq、1μl GenomicDNA、1μl 10mM dNTPs、40.5μl三蒸水。
聚合酶链式反应扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟，反应循环次数为30次。
将PCR产物进行回收产物加“A”，聚合酶链式反应产物经浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收。并与pGEMT-easy载体经T4连接酶14.5℃连接过夜；
连接条件是：2μl的酶切纯化片段，1μl 10×T4的连接酶缓冲液，1μl的酶切载体，0.5μl的T4连接酶，5.5μl的三蒸水。
然后转化感受态细胞DH5α并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，进行酶切鉴定和测序，获得pGEMT/IL13-E13K R109K；而后再以pGEMT/IL13-E13K R109K质粒为模板进行次PCR，酶切鉴定和测序，获得阳性克隆命名为pGEMT/IL13-E13K R66D S69D R109K。将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。获得IL13-E13K R66D S69D R109K突变体的核苷酸序列如下：
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGGACATGCTGGACGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTAAGGAGGGACAGTTCAAC。
氨基酸序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)蛋白序列为：
SPGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN。
将pGEMT/IL13 E13K R66D S69D R109K质粒用Sfu I和Nhe I切下片段连入pUC57-CAR骨架载体，转化、培养及质粒提取后，酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pUC57-IL13(E13KR66D S69D R109K)CAR。将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。
3、IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR载体的构建
根据EphA2 4H5单克隆抗体轻重链的氨基酸序列对应其核苷酸序列，并根据第三代CAR骨架载体的特点，设计优化酶切位点，并在轻重链之间加入3个GGGS linker的核苷酸序列。该核苷酸序列如下：
TTCGAACAGGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTACAACCAGGTGGCTCCCTCAGGCTCAGCTGCGCCGCATCAGGATTTACTTTCAGCTCTTATACTATGAGTTGGGTTAGACAAGCCCCTGGGCAAGCCCTCGAATGGATGGGAACAATCTCGTCCGGAGGCACATATACCTACTACCCCGACTCCGTCAAAGGTCGGTTTACGATCAGCCGTGACAACGCCAAAAATTCCCTGTACCTACAAATGAACTCTCTAAGAGCTGAAGATACTGCAGTCTATTATTGCGCCAGAGAAGCTATCTTCACTTACTGGGGACGTGGTACGTTAGTGACAGTCTCATCGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATTCAGCTAACTCAAAGTCCATCGTCGCTATCAGCCAGCGTAGGAGACAGAGTCACAATCACGTGCAAAGCGAGCCAAGACATCAATAACTATCTTTCATGGTATCAACAGAAACCTGGCCAAGCACCGCGTTTACTTATATACAGAGCAAATCGGTTGGTAGACGGTGTCCCCGACAGATTCTCTGGTTCAGGTTACGGGACGGACTTTACCTTAACAATTAATAACATCGAGAGTGAAGATGCGGCTTACTATTTCTGCCTGAAATACGACGTGTTCCCATATACATTTGGTCAGGGTACTAAGGTTGAGATTAAAGCTAGC。
蛋白序列为：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIK。
从华大基因公司合成具有特异性酶切位点的EphA2 scFv核酸片段，并将其并与pGEMT-easy载体经T4连接酶14.5℃连接过夜；
连接条件是：2μl的酶切纯化片段，1μl 10×T4的连接酶缓冲液，1μl的酶切载体，0.5μl的T4连接酶，5.5μl的三蒸水。
然后转化感受态细胞DH5α并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。16～24小时后，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，进行酶切鉴定和测序，获得pGEMT/EphA2 scFv。将pGEMT/EphA2scFv质粒用Sfu I和Nhe I切下片段连入pUC57-IL13(E13K R66D S69D R109K)CAR中，转化、培养及质粒提取后，获得载体命名为pUC57-IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR。然后将其连入慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puromycin，XhoI和XbaI酶切鉴定，获得阳性克隆命名为pLenti-IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR慢病毒载体。如pLenti-IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR酶切鉴定示意图如图2所示，其中，M代表DNA分子量，1代表质粒DNA。将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。
当然，本实施例中，TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分也可以是所说的核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列在识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列在识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端；两个序列之间可以是任何一种linker。
所构建TanCAR的骨架可以为任何一种CAR骨架。
4、基于T细胞系的IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR-T对恶性脑胶质瘤的杀伤性检测
将Lentiviral辅助病毒包装质粒与目的质粒通过磷酸钙转染法共转染至包装质粒HEK 293T。转染后48h，收集细胞上清，将细胞上清液1500rpm，离心5分钟，并用0.22μm的滤膜过滤。过滤后的细胞上清液继续感染293T细胞进行病毒扩增。收集每管8mL病毒上清后，利用Beckman超速离心机，4℃，216000rpm，2h，离心结束后弃上清，每管加入50μL的含有2％血清的培养基，重悬混匀，而后分装于EP管中，获得IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR慢病毒。通过Ficoll淋巴细胞分离液，制备成PBMC细胞悬液。采用磁珠分选法获得T细胞。利用IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR慢病毒感染人原代T细胞并进行筛选，获得将IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR的T细胞。
将IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR的T细胞与U87/THP-1细胞系细胞按不同比例(E：效应细胞CD8+T细胞，T：靶细胞U87/THP-1细胞系)共孵育24h后，离心96孔板400g，5min，转移100μL细胞上清液到一个新的96孔板中，加入现配的乳酸脱氢酶LDH反应buffer，室温温和的振荡30分钟。预热酶标仪，在490nm吸光度下读数。
CTL杀伤率(％)＝(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100。
IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR T细胞对恶性脑胶质瘤的杀伤性检测如图3所示，实验结果表明，相比对照组表达IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2scFv-TanCAR的T细胞与U87细胞共孵育的上清中，LDH的含量明显提高，说明IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR T细胞对恶性脑胶质瘤细胞具有明显的细胞毒性，并且，E：T＝20：1效果最佳(图3.A)。在正常细胞对照组，LDH的含量没有明显升高(图3.B)，说明IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR对恶性脑胶质瘤细胞的具有良好的特异性。
5、IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR-T细胞在恶性脑胶质瘤动物模型的体内实验检测
将1x106带有eGFP和LUC标记的恶性脑胶质瘤细胞，皮下注射在裸鼠的右后肢形成荷瘤模型。注射后第5天后，当肿瘤体积约为30-50mm3时，将小鼠随机分为5个实验组。
第一组(n＝3)为未处理组，瘤内注射PBS。
第二组(n＝3)，注射2×106个非NT(非慢病感染的对照T细胞组)T细胞。
而第三、四、五组(每组n＝3只小鼠)分别注射2×106个IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)CAR T细胞、EphA2 scFv CAR T细胞以及IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR T细胞。
然后间隔5天后再次注射。通过小动物活体成像系统每周进行小鼠活体肿瘤生长的检测。同时，每3天利用游标卡尺测量肿瘤的体积(图4)。在25天后对小鼠进行了安乐死。对剥离的肿瘤组织进行了病理切片和免疫组织化学染色。HE结果显示经过IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR T细胞治疗的肿瘤组织出现了大量的坏死区域。通过CD3抗体和Ki67抗体组化染色显示，相比对照组，肿瘤细胞的增殖率较低，人CD3+T细胞的大量积累(棕色颗粒)(图5)。
结果显示，IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR T细胞能够高效、高选择性地杀死恶性脑胶质瘤，并具有减少抗原逃逸和降低靶向细胞毒性。
核苷酸或氨基酸序列表
<110>陕西师范大学
<120>一种TanCAR的构建及其应用
<160>
<210>1
<211>342
<212>碱基序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体氨基酸序列
<213>DNA
<220>
<400>
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGGACATGCTGGACGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTAAGGAGGGACAGTTCAAC
<210>2
<211>114
<212>氨基酸序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)蛋白序列
<213>DNA
<220>
<400>
SPGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN
<210>3
<211>723
<212>碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv核酸序列
<213>DNA
<220>
<400>
TTCGAACAGGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTACAACCAGGTGGCTCCCTCAGGCTCAGCTGCGCCGCATCAGGATTTACTTTCAGCTCTTATACTATGAGTTGGGTTAGACAAGCCCCTGGGCAAGCCCTCGAATGGATGGGAACAATCTCGTCCGGAGGCACATATACCTACTACCCCGACTCCGTCAAAGGTCGGTTTACGATCAGCCGTGACAACGCCAAAAATTCCCTGTACCTACAAATGAACTCTCTAAGAGCTGAAGATACTGCAGTCTATTATTGCGCCAGAGAAGCTATCTTCACTTACTGGGGACGTGGTACGTTAGTGACAGTCTCATCGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATTCAGCTAACTCAAAGTCCATCGTCGCTATCAGCCAGCGTAGGAGACAGAGTCACAATCACGTGCAAAGCGAGCCAAGACATCAATAACTATCTTTCATGGTATCAACAGAAACCTGGCCAAGCACCGCGTTTACTTATATACAGAGCAAATCGGTTGGTAGACGGTGTCCCCGACAGATTCTCTGGTTCAGGTTACGGGACGGACTTTACCTTAACAATTAATAACATCGAGAGTGAAGATGCGGCTTACTATTTCTGCCTGAAATACGACGTGTTCCCATATACATTTGGTCAGGGTACTAAGGTTGAGATTAAAGCTAGC
<210>4
<211>237
<212>碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv蛋白序列
<213>DNA
<220>
<400>
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIK
<210>5
<211>20
<212>IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 SfuI for
<213>DNA
<220>
<400>
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCC
<210>6
<211>20
<212>IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 NheI reverse
<213>DNA
<220>
<400>
GTTGAACTGTCCCTCGCGAA
<210>7
<211>55
<212>IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 SfuI E13Kfor
<213>DNA
<220>
<400>
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGAGCTGG
<210>8
<211>36
<212>IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 NheIR109Kreverse
<213>DNA
<220>
<400>
GTTGAACTGTCCCTCCTTAAAAAGTTTCTTTAAATG
<210>9
<211>48
<212>IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 R66D S69D
for
<213>DNA
<220>
<400>
GCCATCGAGAAGACCCAGGACATGCTGGACGGATTCTGCCCGCACAAG
<210>10
<211>48
<212>IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 R66D S69D
reverse
<213>DNA
<220>
<400>
CTTGTGCGGGCAGAATCCGTCCAGCATGTCCTGGGTCTTCTCGATGGC
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 陕西师范大学
<120>一种TanCAR的构建及其应用
<160>
<210> 1
<211> 342
<212> 碱基序列中IL13（E13K.R66D.S69D.R109K）突变体氨基酸序列
<213> DNA
<220>
<400>
tccccaggccctgtgcctccctctacagccctcaggAagctcattgaggagctggtcaacatcacccagaaccagaaggctccgctctgcaatggcagcatggtatggagcatcaacctgacagctggcatgtactgtgcagccctggaatccctgatcaacgtgtcaggctgcagtgccatcgagaagacccagGACatgctgGAcggattctgcccgcacaaggtctcagctgggcagttttccagcttgcatgtccgagacaccaaaatcgaggtggcccagtttgtaaaggacctgctcttacatttaaagaaactttttaaggagggacagttcaac
<210> 2
<211> 114
<212> 氨基酸序列中IL13（E13K.R66D.S69D.R109K）蛋白序列
<213> DNA
<220>
<400>
SPGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN
<210> 3
<211> 723
<212> 碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv核酸序列
<213> DNA
<220>
<400>
TTCGAACAGGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTACAACCAGGTGGCTCCCTCAGGCTCAGCTGCGCCGCATCAGGATTTACTTTCAGCTCTTATACTATGAGTTGGGTTAGACAAGCCCCTGGGCAAGCCCTCGAATGGATGGGAACAATCTCGTCCGGAGGCACATATACCTACTACCCCGACTCCGTCAAAGGTCGGTTTACGATCAGCCGTGACAACGCCAAAAATTCCCTGTACCTACAAATGAACTCTCTAAGAGCTGAAGATACTGCAGTCTATTATTGCGCCAGAGAAGCTATCTTCACTTACTGGGGACGTGGTACGTTAGTGACAGTCTCATCGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATTCAGCTAACTCAAAGTCCATCGTCGCTATCAGCCAGCGTAGGAGACAGAGTCACAATCACGTGCAAAGCGAGCCAAGACATCAATAACTATCTTTCATGGTATCAACAGAAACCTGGCCAAGCACCGCGTTTACTTATATACAGAGCAAATCGGTTGGTAGACGGTGTCCCCGACAGATTCTCTGGTTCAGGTTACGGGACGGACTTTACCTTAACAATTAATAACATCGAGAGTGAAGATGCGGCTTACTATTTCTGCCTGAAATACGACGTGTTCCCATATACATTTGGTCAGGGTACTAAGGTTGAGATTAAAGCTAGC
<210> 4
<211> 237
<212> 碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv蛋白序列
<213> DNA
<220>
<400> QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIK
<210> 5
<211> 20
<212> IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 SfuI for
<213> DNA
<220>
<400>
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCC
<210> 6
<211> 20
<212> IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 NheI reverse
<213> DNA
<220>
<400>
GTTGAACTGTCCCTCGCGAA
<210> 7
<211> 55
<212> IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 SfuI E13K for
<213> DNA
<220>
<400>
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGAGCTGG
<210> 8
<211> 36
<212> IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 NheI R109Kreverse
<213> DNA
<220>
<400>
GTTGAACTGTCCCTCCTTAAAAAGTTTCTTTAAATG
<210> 9
<211> 48
<212> IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 R66D S69D for
<213> DNA
<220>
<400>
GCCATCGAGAAGACCCAGGACATGCTGGACGGATTCTGCCCGCACAAG
<210> 10
<211> 48
<212> IL-13的E13K.R66D.S69D.R109K定点突变位点的引物h IL13 R66D S69Dreverse
<213> DNA
<220>
<400>
CTTGTGCGGGCAGAATCCGTCCAGCATGTCCTGGGTCTTCTCGATGGC

Claims (10)

1.一种TanCAR，其特征在于，在第三代CAR骨架的基础上构建而成，由识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分、跨膜部分及细胞内信号转导部分三部分组成。TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分由具有核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列的IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列与具有核苷酸序列表中NO2所示的EphA2 scFv序列组成，其IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端，EphA2 scFv序列位于识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，两段序列由GGGS linker的核酸序列间隔。
2.如权利要求1所述的TanCAR，其特征在于，所说的核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)突变体氨基酸序列为：
TCCCCAGGCCCTGTGCCTCCCTCTACAGCCCTCAGGAAGCTCATTGAGGAGCTGGTCAACATCACCCAGAACCAGAAGGCTCCGCTCTGCAATGGCAGCATGGTATGGAGCATCAACCTGACAGCTGGCATGTACTGTGCAGCCCTGGAATCCCTGATCAACGTGTCAGGCTGCAGTGCCATCGAGAAGACCCAGGACATGCTGGACGGATTCTGCCCGCACAAGGTCTCAGCTGGGCAGTTTTCCAGCTTGCATGTCCGAGACACCAAAATCGAGGTGGCCCAGTTTGTAAAGGACCTGCTCTTACATTTAAAGAAACTTTTTAAGGAGGGACAGTTCAAC。
3.如权利要求1所述的TanCAR，其特征在于，所说的蛋白序列表中NO1所示的氨基酸序列中IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)蛋白序列为：
SPGPVPPSTALRKLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQDMLDGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFKEGQFN。
4.如权利要求1所述的TanCAR，其特征在于，所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv核酸序列为：
TTCGAACAGGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGTGGCCTGGTACAACCAGGTGGCTCCCTCAGGCTCAGCTGCGCCGCATCAGGATTTACTTTCAGCTCTTATACTATGAGTTGGGTTAGACAAGCCCCTGGGCAAGCCCTCGAATGGATGGGAACAATCTCGTCCGGAGGCACATATACCTACTACCCCGACTCCGTCAAAGGTCGGTTTACGATCAGCCGTGACAACGCCAAAAATTCCCTGTACCTACAAATGAACTCTCTAAGAGCTGAAGATACTGCAGTCTATTATTGCGCCAGAGAAGCTATCTTCACTTACTGGGGACGTGGTACGTTAGTGACAGTCTCATCGGGCGGTGGCGGTTCTGGTGGCGGTGGCTCCGGCGGTGGCGGTTCTGACATTCAGCTAACTCAAAGTCCATCGTCGCTATCAGCCAGCGTAGGAGACAGAGTCACAATCACGTGCAAAGCGAGCCAAGACATCAATAACTATCTTTCATGGTATCAACAGAAACCTGGCCAAGCACCGCGTTTACTTATATACAGAGCAAATCGGTTGGTAGACGGTGTCCCCGACAGATTCTCTGGTTCAGGTTACGGGACGGACTTTACCTTAACAATTAATAACATCGAGAGTGAAGATGCGGCTTACTATTTCTGCCTGAAATACGACGTGTTCCCATATACATTTGGTCAGGGTACTAAGGTTGAGATTAAAGCTAGC。
5.如权利要求1所述的TanCAR，其特征在于，所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列中优化酶切位点以及增添linker的EphA2 scFv蛋白序列为：
QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGQALEWMGTISSGGTYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREAIFTYWGRGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLSWYQQKPGQAPRLLIYRANRLVDGVPDRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLKYDVFPYTFGQGTKVEIK。
6.如权利要求1所述的TanCAR，其特征在于，TanCAR中识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分也可以是所说的核苷酸序列表中NO1所示的碱基序列在识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的3’端，所说的核苷酸序列表中NO2所示的碱基序列在识别靶细胞表面靶分子的胞外段部分的5’端；两个序列之间可以是任何一种linker。
7.如权利要求1所述的TanCAR，其特征在于，构建TanCAR的骨架可以为任何一种CAR骨架。
8.一种TanCAR的构建方法，其特征在于，由下述步骤组成：
(1)第三代CAR分子的基因合成及第三代CAR骨架载体的构建
根据GeneBank数据库中检索到各片段的基因序列，从华大基因公司合成含有21个氨基酸(Amino acid，aa)的人CD8α信号肽linker(1th aa到21th aa)及Igκ信号肽linker(1thaa到21th aa)两种不同前导肽的CAR分子；合成人CD8α Hinge区域(138thaa到182thaa)；合成人CD28跨膜区及其细胞内活化基序片段(153th aa到220th aa)；合成人CD134细胞内活化基序片段(242th aa到277th aa)；合成人CD3ζ细胞内活化基序片段(52th aa到165thaa),其中在信号肽与CD8αHinge区域中间插入SfuI-MluI-NheI多克隆位点以及Flag标签，克隆载体为pUC57-CAR，合成序列经华大基因测序正确无误后置于-20℃保存；
(2)IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)CAR载体构建
首先从NCBI上查询IL13序列合成引物并克隆其胞外段，以IL 13保外段为模板，采用dNTP及DNA聚合酶，利用设计好的突变体引物进行过聚合酶链式反应(PCR)获得PCR产物，将PCR产物进行回收产物加“A”，与pGEMT-easy载体连接，转化、培养及质粒提取后，进行酶切鉴定和测序，获得pGEMT/IL13-E13K R109K；而后再以pGEMT/IL13-E13K R109K质粒为模板进行再次PCR，酶切鉴定和测序，获得pGEMT/IL13-E13K R66D S69D R109K；pGEMT/IL13E13K R66D S69D R109K质粒用Sfu I和Nhe I切下片段连入pUC57-CAR中，酶切鉴定成功后，命名为pUC57-IL13(E13K R66D S69D R109K)CAR；
(3)IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR载体的构建
根据EphA2 4H5单克隆抗体轻重链的氨基酸序列对应其核苷酸序列，并根据第三代CAR骨架载体的特点，设计优化酶切位点，并在轻重链之间加入3个GGGS linker的核苷酸序列；从华大基因公司合成具有特异性酶切位点的EphA2 scFv核酸片段，并将其与pGEMT-easy载体连接，转化、培养及质粒提取后，进行酶切鉴定和测序，获得pGEMT/EphA2 scFv；将pGEMT/EphA2 scFv质粒用Sfu I和Nhe I切下片段连入pUC57-IL13(E13K R66D S69D R109K)CAR中，酶切鉴定成功后，命名为pUC57-IL13(E13K.R66D.S69D.R109K)-EphA2 scFv-TanCAR。
9.权利要求1至7其中之一所述的基于TanCAR所制备的TanCAR-T细胞在肿瘤细胞免疫疗法中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将TanCAR制备成携带TanCAR的慢病毒，然后将该慢病毒感染人外周血分离的T细胞，从而获得相应的TanCAR-T细胞，并将该TanCAR-T细胞用于体内、外的肿瘤治疗；或者
将TanCAR制备成携带TanCAR的真核表达载体，导入T细胞或NK细胞用于体内、外的肿瘤治疗；
所述体内、外的肿瘤是恶性脑胶质瘤或高表达IL13Rα2或EphA2的肿瘤。
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