CN113227379A - 多功能多靶向嵌合抗原受体（car）系统及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗人体中癌症的组合物和方法。本发明包括并涉及给予经基因修饰的T细胞以表达CAR系统，其中所述CAR系统包含多核苷酸，所述多核苷酸利用靶向肿瘤特异性抗原的多个抗体或利用膜结合细胞因子编码多个信号传导模块，以进一步增强免疫细胞的存活和增值。多重共刺激信号传导结构的毒性比使用CD28信号传导结构域的传统CAR‑T结构的毒性更小。具有靶向不同肿瘤特异性抗原的多个抗体的CAR系统可以同时靶向不同的癌细胞群。

Description

多功能多靶向嵌合抗原受体（CAR）系统及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月4日提交的美国临时申请号 62/714,687的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

T细胞是一种淋巴细胞，在细胞介导的免疫中发挥着核心作用。它们通过存在于细胞表面上的T细胞受体，与诸如B细胞和自然杀手细胞(NK细胞)之类的其他淋巴细胞区分开来。这些细胞一旦被活化，就会迅速增殖并分泌出调节免疫应答的细胞因子。记忆T细胞是T细胞的一个亚群，可长期持续存在并对其关联抗原做出应答，从而为免疫系统提供针对过去的感染和/或肿瘤细胞的“记忆”。

T细胞可以被基因工程化以在其表面上生成特殊受体，即嵌合抗原受体(CAR)。将T细胞特异性地重定向至所需的肿瘤相关抗原 (TAA)的CAR(Eshhar Z等人，1993)被工程化成仅在接触TAA 时才活化T细胞以进行存活、连续杀伤、和细胞因子生成(Savoldo B等人，2011)。CAR T细胞的过继转移可以在一些患者中实现持久的完全应答；成功的结果与CAR T细胞的植入和长期持续存在相关(Porter DL等人，2015)。通过使CAR T细胞长期存在而进行的长期免疫监视，可能是过继性细胞疗法(ACT)实现持久应答的关键所在。记忆T细胞亚群似乎是沿着以寿命和效应功能的交互潜力表征的分化梯度而存在的。事实上，衍生自鼠类和非人灵长类动物模型的中央细胞(TCM)或原初(TN)T细胞亚群的过继转移的效应CD8+T细胞具有增加的治疗潜力。因此，对应于未成熟分化状态的T细胞亚群因其提供卓越的临床实用性的潜力而引起了广泛关注 (Berger C等人，2008；Hinrichs CS等人，2011)。

T记忆干细胞(TSCM)是到目前为止鉴定出的分化程度最低的记忆T细胞亚群，可以在特定的体外培养条件下产生(例如，IL-7、 IL-15、或靶向代谢或发育途径的小分子)(Cieri N等人，2013； Gattinoni L等人，2011；Sabatino M等人，2016)。该记忆亚群具有最高的自我恢复能力和治疗潜力。由于TSCM在缺少抗原驱动的刺激下具有卓越的持久性，因此抗原一旦在免疫应答中被清除，TSCM 就被指出是T细胞记忆的原代前体(Lugli E等人2013)。此外，输注产品中CD8+CD45RA+CCR7+TSCM样细胞的频率只与CD19特异性CAR T细胞的扩增相关((Xu Y等人2014)。因为TSCM仅占外周血单核细胞(PBMC)的一小部分(2-3％)，所以用于生产适于人类应用的TSCM的策略至关重要且正在开发中。

所给予的内源性T细胞独立于原初或引入的免疫受体，通过共同的细胞因子受体γ链接收促生存信号，诸如，由IL-2和IL-7介导的那些信号。所述共同的γ链(γc)(或CD132)又称为白介素2 受体亚基γ或IL-2RG，是至少六个不同的白介素受体(即：IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21受体)的受体复合体所共有的细胞因子受体亚基。γc糖蛋白是在大多数淋巴细胞(白细胞)群上表达的I型细胞因子受体家族成员，并且其基因被发现存在于哺乳动物的X染色体上。该蛋白位于骨髓中未成熟造血细胞上。该蛋白的一端位于细胞外，在此与细胞因子结合，并且该蛋白的另一端位于细胞内部，在此将信号传递至细胞核。共有的γ链与其他蛋白结合，从而指导造血细胞形成淋巴细胞(一种白细胞)。受体还会指导淋巴细胞亚型(即：T细胞、B细胞、和自然杀伤细胞)的生长和成熟。这些细胞可杀伤病毒、制造抗体，并帮助调节整个免疫系统。

白介素7(IL-7)是I型糖蛋白，其预计会形成一个具有疏水核心的四-α-螺旋结构。它主要由基质细胞产生，并通过由IL-7Rα和共同的γ链/IL-2Rγ构成的受体复合体发挥作用。IL-7信号传导对于建立和维持正常的免疫系统功能而言至关重要。它是小鼠和人T 细胞发育和体内稳态增殖、小鼠B细胞发育、以及CD4+和CD8+记忆T细胞的生成所必需的。IL-7Rα缺陷小鼠的胸腺细胞数量减少， T细胞和B细胞发育受损，并且缺少γ-δT细胞，所述γ-δT细胞是存在于富含上皮细胞的组织中的一小部分T细胞。T细胞的存活对 IL-7的需求部分地归因于IL-7能够诱导抗凋亡Bcl-2、Bcl-xL、和 Mcl-1蛋白的表达。另外，IL-7在调节TCRγ、TCRβ、和免疫球蛋白重链基因座处的V(D)J重组中发挥着重要作用。IL-15是一种促存活细胞因子，是维持长寿CD8+记忆T细胞的体内稳态((Zhang X 等人，1998)、抑制活化诱导的细胞死亡(AICD)(Marks-Konczalik J等人，2000)、增强体内抗肿瘤活性(KlebanoffCA等人，2004)、以及逆转T细胞能量(Teague RM等人，2006)所必需的。IL15在肿瘤微环境中的高表达与CD3+T细胞浸润的增加相关，这与提高结肠直肠癌患者的存活率有关。此外，IL-15是生成参与免疫监视并阻碍肿瘤生长的先天样T细胞所必需的(Dadi S等人，2016)。

迄今为止的临床试验表明，嵌合抗原受体(CAR)T细胞在耐受标准化疗的恶性血液病中前景广阔。最值得注意的是，CD19特异性 CAR(CD19-CAR)T细胞疗法取得了显著的成果，包括长期缓解B 细胞恶性肿瘤(Kochenderfer JN等人，2010；Kalos M等人，2011；Porter DL等人，2011；Grupp SA等人，2013；Kochenderfer JN等人， 2013；Maude SL等人，2014)。

迄今为止，目前工作的重点集中于在各种B细胞恶性肿瘤中具有功效的CAR T细胞上。在使用CD19-CAR的B-ALL中，虽然初始缓解率普遍约为90％，但这些大多数在一年内复发。这种复发至少部分是由于抗原逃逸所致。因此，靶向单一抗原存在免疫逃逸的风险，而这一风险尤其是在肿瘤异质性更高的实体瘤中，可以通过靶向多个所需抗原来克服。所以，需要改进基于嵌合抗原受体的疗法，使其能够更有效、更安全且更高效地靶向诸如B细胞相关的恶性肿瘤(ALL、CLL和NHL)、多发性骨髓瘤、AML、淋巴瘤以及许多其他实体瘤等各种癌症。

发明内容

在本发明的一个方面，一种CAR系统的多功能/多靶向模块结构包含编码两个或更多个靶向多个肿瘤特异性抗原的CAR的多个基因，以便同时靶向不同的癌细胞群。在本发明的另一个方面，一种 CAR系统的多功能/多靶向模块结构包含编码靶向肿瘤特异性抗原的CAR的一个基因，和编码包含膜结合细胞因子/细胞因子受体的共刺激分子的另一个基因，以便进一步增强癌症靶向免疫细胞的存活和增殖。在本发明的另一个方面，一种用于提高工程化T细胞的记忆的持久性和潜力并利用白介素自分泌环信号传导的方法，其包括：使用慢病毒系统，利用连接至第二代CAR胞内信号传导结构域的 IL-7、IL-15、IL-12、IL-2、IL22或IL17的重组膜结合变体的共表达，对T细胞进行工程化。

在本发明的另一个方面，一种多功能/信号传导模块CAR系统的分离的多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因，其中所述第一多肽包含五个或更多以下各项：(i)信号肽， (ii)结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)ICOS的共刺激结构域，以及(vi)CD3ζ信号传导结构域；并且所述第二多肽包含五个或更多个以下各项：(i)信号肽，(ii)结合蛋白，(iii) 铰链区，(iv)跨膜结构域；其中所述结合蛋白中的至少一个与癌细胞上的抗原结合。在本发明的另一个方面，第一和第二多肽都是共刺激分子。在本发明的又一个方面，通过将第一基因和第二基因与 2A肽基因连接，使所述第一和所述第二多肽以相同或相似的水平共表达。在一些实施例中，所述铰链区是可选的。

在本发明的另一个方面，多功能/信号传导模块CAR系统的所述第一多肽的结合蛋白可以是抗原识别结构域，而所述第二多肽的结合蛋白可以是免疫调节细胞因子或细胞因子受体。在本发明的另一个方面，第一和第二多肽都是共刺激分子。

在本发明的另一个方面，多功能/信号传导模块CAR系统的所述第一多肽的结合蛋白可以是免疫调节细胞因子或细胞因子受体，并且所述第二多肽的结合蛋白可以是抗原识别结构域，其中所述第二多肽是CAR。在本发明的又一个方面，第一和第二多肽都是共刺激分子。

在本发明的另一个方面，所述第一多肽和所述第二多肽的结合蛋白都可以是抗原识别结构域。在本发明的又一个方面，第一和第二共刺激分子可以是CAR。

在本发明的另一个方面，免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域可以连接至跨膜结构域和共刺激结构域，以形成共刺激分子。

在本发明的再一个方面，可以使用慢病毒表达多功能CAR系统。

在本发明的再一个方面，所述载体进一步包含含有诱导型自杀基因的多核苷酸。

在本发明的又一个方面，在双共刺激分子CAR-T细胞中，一个共刺激分子含有靶向于选自以下各项的靶标的抗原识别结构域： Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、Claudin8、NY-ESO-1、CD19、 CD20、CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白(MPL)、CD30、CD32、 CD20、CD70、CD79b、CD99、CD123、CD138、CD179b、CD200R、 CD276、CD324、Fc受体样5(FcRH5)、CD171、CS-1(信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C型凝集素样分子1(CLL-1)、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、B细胞成熟抗原 (BCMA)、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肿瘤相关糖蛋白(TAG)-72、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、B7-H3 (CD276)、B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2)、白介素11受体亚基α(IL11Ra)、间皮素、前列腺干细胞抗原(PSCA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis Y、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、免疫球蛋白Fc 区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2(ERBB2，Her2)、粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经小粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变型延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、黑素细胞蛋白gpl00、 bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2(EphA2)、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂(Fucosyl GM1)、唾液酸Lewis a(sLea)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、 TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体(TSHR)、T细胞受体(TCR)-β1恒定链、TCR β2恒定链、TCRγ-δ、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、 CXORF61蛋白、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、多唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原(NY-BR-1)、uroplakin-2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1 (HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、 G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6家族成员K(LY6K)、嗅觉受体家族51亚家族E成员2(OR51E2)、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白(TARP)、威尔姆氏瘤抗原1蛋白(WTl)、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒(HPV)E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV1)-Tax、卡波西肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白(KSHV)K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)编码的糖蛋白350(EBB gp350)、HIV1包膜糖蛋白 gp120、多重自动基因工程(MAGE)-Al、易位Ets白血病病毒(ETV) 蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员(XAGE)1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-l) /半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶 (hTERT)、δ样3(DLL3)、滋养层细胞表明抗原2(TROP2)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、甲胎蛋白 (AFP)、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc 禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras 同源家族成员C(RhoC)、酪蛋白相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素 P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS 或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、 PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、 X断电2(SSX2)、晚期糖基化终产物的受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RUl)、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2(muthsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体 1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样 2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、FITC、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CC趋化因子受体4(CCR4)、神经节苷脂GD3、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族成员6(SLAMF6)、 SLAMF4、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、和绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)；而另一个共刺激分子可以含有另一个抗原识别结构域，或含有选自膜结合IL-7、IL-21、IL-15、IL-12、 IL-2、IL-17TGFb受体和IL15Ra sushi结构域的免疫调节细胞因子/ 细胞因子受体。在本发明的再一个方面，可以使用双共刺激分子 CAR-T细胞治疗淋巴瘤、白血病以及源自肺、乳腺、前列腺、结肠、肾脏、卵巢、头颈、肝脏、胰腺、胆管和大脑的各种实体瘤。

在本发明的再一个方面，所述工程化细胞包含CAR基因和编码膜结合IL-7而没有共刺激信号2的另一个基因；其中所述CAR基因和膜结合IL-7基因通过2A肽基因连接。

在本发明的另一个方面，通过转导包含编码含有IL-7的共刺激分子或IL-7受体的胞外结构域的多核苷酸的慢病毒载体，可以将T 细胞工程化成同时具有来自膜结合IL-7(mbIL-7)的内源性自分泌环信号传导和共刺激信号传导。

在本发明的另一个方面，一种用于刺激对人体中的靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述人体给予有效量的工程化细胞，所述工程化细胞经基因修饰以表达第一 CAR和第二CAR，其中所述第一CAR包含CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、包含ICOS的共刺激信号传导区、和CD3ζ信号传导结构域，并且其中所述第二CAR包含免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域以及跨膜结构域。

在本发明的另一个方面，一种用于刺激对人体中的靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述人体给予有效量的工程化细胞，所述工程化细胞经基因修饰以表达第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含CD19抗原结合结构域和跨膜结构域，并且其中所述第二多肽包含免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域以及跨膜结构域。所述免疫调节细胞因子可以是IL-7。所述CD19抗原结合结构域可以与表达CD19的癌细胞特异性结合。

在本发明的另一个方面，还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。

在本发明的另一个方面，还提供了包含本发明的表达载体的工程化细胞。在一些实施例中，第一抗原识别结构域与CD19结合；并且第二抗原识别结构域与CD20或CD22结合。在一些实施例中，第一抗原识别结构域与BCMA结合；并且第二抗原识别结构域与 CD38、CD138、或CS 1结合。在一些实施例中，第一抗原识别结构域与CD123结合；并且第二抗原识别结构域与CD33或CLL1结合。在一些实施例中，第一抗原识别结构域与PSCA结合；并且第二抗原识别结构域与PSMA结合。

在本发明的另一个方面，包含本发明的载体的工程化细胞是T 细胞或NK细胞。在一些实施例中，所述工程化细胞通过基因敲除包含PD-1、TIM3、或LAG3的失活基因。在一些实施例中，所述工程化NK细胞是NKT细胞或NK-92细胞。

在本发明的另一个方面，一种多核苷酸包含编码本发明的共刺激分子的序列，所述多核苷酸包含编码scFv或VHH纳米抗体的序列。

在本发明的另一个方面，还提供了一种包含本发明的细胞的药物组合物。

在本发明的另一个方面，一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给予治疗有效量的本发明的细胞。在一些实施例中，所述癌症是血癌。在一些实施例中，所述癌症是淋巴瘤。

在本发明的另一个方面，一种单一CAR或CAR系统的多肽，所述多肽包含选自SEQID NO：20、30、32、36、38、40、42、44、 46、48、50、52、54和56中的序列。

在本发明的另一个方面，一种编码单一CAR或CAR系统的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自SEQ ID NO：6、29、31、35、37、 39、41、43、45、47、49、51、53和55中的序列。

在本发明的另一个方面，表达载体包含6、29、31、35、37、39、 41、43、45、47、49、51、53或55的多核苷酸序列。

在本发明的另一个方面，一种工程化细胞包含表达载体。

在本发明的另一个方面，一种组合物包含所述工程化细胞。

在本发明的另一个方面，一种药物组合物包含所述工程化细胞和药学上可接受的载剂。

在本发明的再一个方面，一种用于治疗B细胞淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL) 的方法包括：向需要其的患者给予治疗有效量的表达SEQ ID NO： 30或SEQ ID NO：32的多肽的工程化细胞。

在本发明的再一个方面，一种用于治疗B细胞淋巴瘤(NHL) 和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的方法包括：向需要其的患者给予治疗有效量的表达SEQ ID NO：38或SEQ IDNO：44的多肽的工程化细胞。

在本发明的再一个方面，一种用于治疗B细胞淋巴瘤(NHL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(CLL) 的方法包括：向需要其的患者给予治疗有效量的表达多肽的工程化细胞，所述多肽具有选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、和SEQ ID NO：48中的序列。

在本发明的再一个方面，一种用于治疗霍奇金淋巴瘤、全身间变性大细胞淋巴瘤、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(pcALCL)和表达CD30的蕈样肉芽肿(MF)的方法包括：向需要其的患者给予治疗有效量的表达SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56的多肽的工程化细胞。

附图说明

附图示出了示例性实施例。本文公开的实施例和附图旨在被视为说明性的而非限制性的。

图1A显示了抗CD-19单信号单一CAR结构CAR-1-CD19。图 1B显示了抗CD-20单信号单一CAR结构CAR-1-CD20。图1C显示了抗CD-22单信号单一CAR结构CAR-1-CD22-L-H。图1D显示了抗CD-22单信号单一CAR结构CAR-1-CD22-H-L。图1E显示了抗 CD-30单信号单一CAR结构CAR-1-CD30。图1F显示了抗EpCAM 单信号单一CAR结构CAR-1-EpCAM。图1G显示了抗B7H4单信号单一CAR结构CAR-1-B7H4。

图2A显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗CD19双信号单靶标CAR结构/系统。图2B显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗 CD20双信号单靶标CAR结构/系统。图2C显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗CD22双信号单靶标CAR结构/系统。图2D显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗CD30双信号单靶标CAR结构/系统。图2E显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗EpCAM双信号单靶标CAR结构/系统。图2F显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗B7H4双信号单靶标CAR结构/系统。图2G显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗MUC1双信号单靶标CAR结构/系统。图2H显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗CS1双信号单靶标CAR结构/系统。图2I显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗CLDN双信号单靶标 CAR结构/系统。图2J显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗GPC3 双信号单靶标CAR结构/系统。图2K显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗间皮素双信号单靶标CAR结构/系统。图2L显示了具有共表达膜结合细胞因子的抗BCMA双信号单靶标CAR结构/系统。

图3显示了具有mbIL7的CAR-T的慢病毒构建体，其中合成针对人CD19编码scFv的慢病毒转移质粒，并将其与ICOS跨膜结构域和胞内结构域及CD3ζ一起插入框架中，以产生第二代CAR。膜结合(mb)IL-7是使用通过CD8铰链区连接至CD8跨膜结构域的 IL7的胞外结构域生成的，所述CD8跨膜结构域被插入T2A下游以形成质粒PC035。

图4显示了CD19 CAR-mbIL7的体内细胞杀伤测定。对单信号CD19 CAR-T细胞和Raji细胞进行6轮共培养之后，靶细胞失去杀伤活性，然而，CD19 CAR-mbIL7 T细胞杀伤靶细胞的活性仍然非常高，与最初几轮共培养时的活性一样，这表明CD19 CAR-mbIL7在维持较长时间的靶杀伤活性方面比CD19 CAR优越。

图5显示了对淋巴瘤模型中CD19-mbIL-7的体内研究。

具体实施方式

以下结合意图为示例性和说明性而非限制范围的系统、组合物和方法，对实施例及其各方面进行描述和说明。

定义

如本文使用的，术语“包括”或“包含”用于指对实施例有用的组合物、方法及其一个或多个相应的组件，但无论是否有用，都可以包括未指定的元素。本领域人员将理解的是，一般而言，本文使用的术语一般旨在作为“开放性”术语(例如，术语“包括”应被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包含”应被解释为“包含但不限于”，等等)。

除非另有说明，否则术语“一个”、“一种”、“所述”以及在描述本申请的某个特定实施例的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中) 使用的类似指代可以被诠释为同时涵盖单数形式和复数形式。本文列举的数值范围仅旨在用作分别引用该范围内的每个单独数值的速记方法。除非另有说明，否则，每个单独的数值均如被本文单独列举一样被并入本说明书中。除非本文另有说明或者除非与上下文明显相矛盾，否则，本文所描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。除非另有说明，否则，针对本文某些实施例提供的任何及所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅旨在更好地说明本申请，并非对本申请的范围构成限制。缩写词“e.g.”(例如)源自于拉丁文“exempli gratia”，并在本文用于指示非限制性示例。因此，缩写词“e.g.”与“for example”(例如)一词同义。说明书中的语言不应被解释为指示实施本申请所必需的任何未被要求保护的元素。

如本文使用的，术语“约”是指诸如量、持续时间等可测量的值，并且涵盖指定值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％或±0.1％的变化。

如本文使用的，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。本发明中的抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)、以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999.引自：Using Antibodies:A Laboratory Manual(抗体的使用：实验室手册),冷泉港实验室出版社,纽约: Harlow等人,1989,引自：Antibodies:A Laboratory Manual(抗体：实验室手册),冷泉港实验室出版社,纽约:Houston等人,1988, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国科学院院报》)85:5879 5883；Bird等人,1988,Science(《科学》)242:423-426)。

如本文使用的，术语“抗原”或“Ag”被定义为引起免疫应答的分子。该免疫应答可以涉及抗体产生、或特异性免疫活性细胞、或者二者。技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解，任何DNA(包括核苷酸序列或编码引起免疫应答的蛋白的部分核苷酸序列)因此编码本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不必仅由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列，以引起所需的免疫应答。而且，技术人员将理解，抗原根本不必由“基因”基因编码。很明显，抗原可以通过合成产生或者可以从生物样品中衍生。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

如本文使用的，术语“抗肿瘤效应”是指可以通过以下方式表现的生物学作用：肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的延长、或与癌性病症相关联的各种生理学症状的改善。“抗肿瘤效应”也可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤的第一位置发生的能力来表现。

如本文使用的，术语“自体的”的意思是指衍生自同一个体的任何物质，起随后被再引入之该个体中。

“同种异体的”是指衍生自同一物种的不同动物中的移植物。

“异种的”是指衍生自不同物种的某个动物中的移植物。

如本文使用的，术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和时空生长表征的疾病。癌症细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体而的其他部分。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。

如本文使用的，术语“癌细胞抗原”或“肿瘤相关抗原”被定义为选自以下各项的癌症生物标志物：Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、 Claudin 8、NY-ESO-1、CD19、CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白(MPL)、CD30、CD32、CD20、CD70、CD79b、CD99、CD123、 CD138、CD179b、CD200R、CD276、CD324、Fc受体样5(FcRH5)、 CD171、CS-1(信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C 型凝集素样分子1(CLL-1)、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III (EGFRviii)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原 A2(HLA-A2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、 FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肿瘤相关糖蛋白(TAG)-72、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、B7-H3(CD276)、B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2)、白介素11受体亚基α(IL11Ra)、间皮素、前列腺干细胞抗原(PSCA)、血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体β (PDGFR-β)、蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、免疫球蛋白Fc区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2(ERBB2)、粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经小粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变型延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、黑素细胞蛋白gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2(EphA2)、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂(Fucosyl GM1)、唾液酸Lewis a(sLea)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体 (TSHR)、T细胞受体(TCR)-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、 G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、CXORF61蛋白、CD97、 CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、多唾液酸、胎盘特异性1 (PLAC1)、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原(NY-BR-1)、 uroplakin-2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6家族成员K(LY6K)、嗅觉受体家族51亚家族E成员2(OR51E2)、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白(TARP)、威尔姆氏瘤抗原1蛋白(WTl)、癌症-睾丸抗原 NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒 (HPV)E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV1)-Tax、卡波西肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白(KSHV)K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)编码的糖蛋白350(EBB gp350)、HIV1包膜糖蛋白gp120、多重自动基因工程(MAGE)-Al、易位Ets白血病病毒(ETV)蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员(XAGE)1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-l) /半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶 (hTERT)、δ样3(DLL3)、滋养层细胞表明抗原2(TROP2)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、甲胎蛋白 (AFP)、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc 禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras 同源家族成员C(RhoC)、酪蛋白相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素 P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS 或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、 PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、 X断电2(SSX2)、晚期糖基化终产物的受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RUl)、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体 1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f (CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样 2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、 Fc受体样5(FCRL5)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、FITC、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CC趋化因子受体4(CCR4)、神经节苷脂 GD3、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族成员6(SLAMF6)、SLAMF4、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、和绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)。

“编码”是指多核苷酸中核苷酸的特定序列的内在特性。诸如基因、cDNA、或mRNA作为模板用于合成生物过程中具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性的其他聚合物和大分子。因此，如果对应于某个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，该基因则会对该蛋白质进行编码。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链，和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链二者，都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

“同源的”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个被比较的序列中的某个位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的某个位置被腺嘌呤占据，那么这两个分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是通过使这两个序列共有的匹配或同源位置数除以所比较的位置数再乘以100确定的。例如，如果两个序列中有十分之六的位置是匹配或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。一般，在比对两个序列以获得最大同源性时进行比较。

如本文使用的，术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如， APC、树突细胞、B细胞和其他免疫细胞)上特异性结合T细胞上的关联共刺激分子从而提供信号的分子，由此除了通过例如将 TCR/CD3复合体与负载有肽的MHC分子结合而提供的初级信号之外，还提供了介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1 (CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、 CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、 3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。除此之外，共刺激配体还涵盖尤其是与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，所述共刺激分子诸如但不限于CD27,CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、 ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7 LIGHT、NKG2C、 B7-H3、以及与CD83特异性结合的配体。

“共刺激分子”或“共刺激受体”是指T细胞上的关联结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导通过T细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA、 Toll配体受体。共刺激分子还包括非天然工程化蛋白。

如本文使用的，“共刺激信号”是指与初级信号诸如TCR/CD3连接组合导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调的信号。

对于术语“刺激”，意指通过将刺激分子(例如，TCR/CD3复合体)与其关联配体结合来诱导初次应答，从而介导信号传导事件，诸如但不限于经由TCR/CD3复合体的信号传导。刺激可以介导某些分子的表达改变，诸如下调TGF-B、和/或重组细胞骨架结构等。

如本文使用的，“刺激分子”意指T细胞上与抗原呈递细胞上存在的同源刺激配体特异性结合的分子。

如本文使用的，“刺激配体”意指一种配体，当其存在于抗原呈递细胞(例如，APC、树突细胞、B细胞等等)上时，可以与T细胞上的同源结合配偶体(本文又称为“刺激分子”)特异性结合，从而通过T细胞介导初次应答(包括但不限于活化、开始免疫应答、增殖等等)。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且除此之外涵盖负载有肽的MHC I类分子、抗CD3抗体、超激动剂抗CD28抗体、和超激动剂抗CD2抗体。

“载体”是物质组合物，其包括分离的核酸，并且可以用于递送分离的核酸至细胞内部。众多载体在本领域是已知的，包括但不限于现行多核苷酸、与离子或两亲性化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应当诠释为包括便于将核酸移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等、病毒载体的实例包括但不限于慢病毒、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。非病毒载体的实例包括但不限于CRISPR载系统统、睡美人转座子系统等等。

如本文使用的，“活化”是指T细胞受到充分刺激而诱导可检测的细胞增殖的状态。活化还可以和诱导的细胞因子产生以及可检测的效应功能相关联。除其他内容外，术语“活化的T细胞”是指正在进行细胞分裂的T细胞。

如本文使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，而可以包含蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目不受限制。多肽包括任何的肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包含两个或更多个通过肽键彼此连接的氨基酸。如本文使用的，该术语是指短链和长链二者，短链在本领域中通常还被称为例如肽、寡肽和寡聚物，长链在本领域中一般还被称为蛋白质，蛋白质类型众多；“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或其组合。

术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”全文可互换使用，并且包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如， mRNA)、使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物(例如，肽核酸和非天然村子的核苷酸类似物)、及其杂合体。核酸分子可以说单链的或双链的。术语“基因”是指编码具有某一功能的分子的 DNA或RNA序列。

术语“结合蛋白”包括天然蛋白结合结构域(诸如细胞因子、细胞因子受体)、抗体片段(诸如Fab、scFv、双抗体、可变结构域衍生的结合体、VHH纳米抗体)、替代支架衍生的蛋白结合结构域(诸如Fn3变体、锚定蛋白重复变体、centyrin变体、高亲和性多聚体(avimer)、亲合体或识别特异性抗原的任何其他蛋白质。

“信号肽”本发明的共刺激分子或CAR可以包含信号肽，使得当共刺激分子或CAR在细胞(诸如T细胞)内表达时，初生蛋白被定向至内质网并随后定向至细胞表面，在此进行表达。信号肽的核心可以含有一长段有形成单个α螺旋倾向的疏水性氨基酸。信号肽可以以一小段带正电荷的氨基酸开始，这有助于增强多肽在易位期间的适当拓扑。在信号肽的末端，通常有一段由信号肽酶识别和切割的氨基酸。信号肽酶可以在易位期间或之后进行切割，以生成游离的信号肽和成熟的蛋白质。然后，游离信号肽被特异性蛋白酶消化。信号肽可以位于分子的氨基末端。

本发明提供了用于治疗其他疾病中的癌症的组合物和方法。癌症可以是恶性血液肿瘤、实体瘤、原发性肿瘤或转移性肿瘤。

在一个实施例中，本发明的一种分离的多核苷酸包含：编码第一多肽的第一基因，其中所述第一多肽包含第一抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、ICOS的共刺激信号传导区、和CD3-ζ信号传导结构域；和编码第二多肽的第二基因，其中所述第二多肽包含第二抗原结合结构域、铰链结构域和跨膜结构域；其中所述第一和第二抗原结合结构域与癌细胞上不同的抗原结合。在优选实施例中，所述多核苷酸进一步包含编码2A肽以连接两个基因的第三核酸。在优选实施例中，所述第一和第二基因进一步包含编码信号肽的核酸序列。

在另一个实施例中，本发明的一种分离的多核苷酸包含：编码第一多肽的第一基因，其中所述第一多肽包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、ICOS的共刺激信号传导区、和CD3-ζ信号传导结构域；和编码第二多肽的第二基因，其中所述第二多肽包含细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域、铰链结构域和跨膜结构域。在优选实施例中，所述多核苷酸进一步包含编码2A肽以连接两个基因的第三核酸。在优选实施例中，所述第一和第二基因进一步包含编码信号肽的核酸序列。

在再一个实施例中，本发明的一种分离的多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因，其中所述第一多肽包含细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域、铰链结构域、跨膜结构域、ICOS的共刺激信号传导区、和CD3-ζ信号传导结构域；并且其中所述第二多肽包含抗原结合结构域、铰链结构域和跨膜结构域。在优选实施例中，所述多核苷酸进一步包含编码2A肽以连接两个基因的第三核酸。在优选实施例中，所述第一和第二基因进一步包含编码信号肽的核酸序列。

在另一个实施例中，以上多核苷酸与诱导型自杀基因连接。

在再一个实施例中，所述诱导型自杀基因通过编码2A肽的核酸序列与以上多核苷酸连接。

在一些实施例中，所述第一多肽含有靶向于选自以下各项的靶标的抗原识别结构域：Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、Claudin 8、 NY-ESO-1、CD19、CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白(MPL)、 CD30、CD32、CD20、CD70、CD79b、CD99、CD123、CD138、CD179b、CD200R、CD276、CD324、Fc受体样5(FcRH5)、CD171、CS-1 (信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C型凝集素样分子1(CLL-1)、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、 B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肿瘤相关糖蛋白(TAG)-72、CD38、 CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、B7-H3 (CD276)、B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2)、白介素11受体亚基α(IL11Ra)、间皮素、前列腺干细胞抗原(PSCA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、免疫球蛋白Fc 区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2(ERBB2)、粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经小粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变型延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、黑素细胞蛋白gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2(EphA2)、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂(Fucosyl GM1)、唾液酸Lewis a(sLea)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体 (TSHR)、T细胞受体(TCR)-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、 G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、CXORF61蛋白、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、多唾液酸、胎盘特异性1 (PLAC1)、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原(NY-BR-1)、 uroplakin-2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6家族成员K(LY6K)、嗅觉受体家族51亚家族E成员2(OR51E2)、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白(TARP)、威尔姆氏瘤抗原1蛋白(WTl)、癌症-睾丸抗原 NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒 (HPV)E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV1)-Tax、卡波西肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白(KSHV)K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)编码的糖蛋白350(EBB gp350)、HIV1包膜糖蛋白gp120、多重自动基因工程(MAGE)-Al、易位Ets白血病病毒(ETV)蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员(XAGE)1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-l) /半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶 (hTERT)、δ样3(DLL3)、滋养层细胞表明抗原2(TROP2)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、甲胎蛋白 (AFP)、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc 禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras 同源家族成员C(RhoC)、酪蛋白相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素 P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS 或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、 PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、 X断电2(SSX2)、晚期糖基化终产物的受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RUl)、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体 1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f (CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样 2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、 Fc受体样5(FCRL5)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、FITC、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CC趋化因子受体4(CCR4)、神经节苷脂 GD3、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族成员6(SLAMF6)、SLAMF4、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、和绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)；并且所述第二多肽含有选自膜结合IL-7、IL-21、IL-15、IL-12、IL-2、和IL-17中的细胞因子，或选自TGFb受体和IL15Ra sushi结构域中的细胞因子受体的胞外结构域，用于治疗淋巴瘤、白血病和起源于肺部、乳腺、前列腺、结肠、肾脏、卵巢、头颈、肝脏、胰腺、胆管和大脑的各种实体瘤。

在一些实施例中，所述第二多肽含有靶向于选自以下各项的靶标的抗原识别结构域：Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、Claudin 8、 NY-ESO-1、CD19、CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白(MPL)、 CD30、CD32、CD20、CD70、CD79b、CD99、CD123、CD138、CD179b、CD200R、CD276、CD324、Fc受体样5(FcRH5)、CD171、CS-1 (信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C型凝集素样分子1(CLL-1)、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、 B细胞成熟抗原(BCMA)、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肿瘤相关糖蛋白(TAG)-72、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、B7-H3 (CD276)、B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2)、白介素11受体亚基α(IL11Ra)、间皮素、前列腺干细胞抗原(PSCA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、LewisY、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、免疫球蛋白Fc 区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2(ERBB2)、粘蛋白1(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经小粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变型延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、黑素细胞蛋白gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2(EphA2)、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂(Fucosyl GM1)、唾液酸Lewis a(sLea)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体 (TSHR)、T细胞受体(TCR)-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、 G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、CXORF61蛋白、CD97、 CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、多唾液酸、胎盘特异性1 (PLAC1)、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原(NY-BR-1)、 uroplakin-2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6家族成员K(LY6K)、嗅觉受体家族51亚家族E成员2(OR51E2)、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白(TARP)、威尔姆氏瘤抗原1蛋白(WTl)、癌症-睾丸抗原 NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒 (HPV)E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV1)-Tax、卡波西肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白(KSHV)K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)编码的糖蛋白350(EBB gp350)、HIV1包膜糖蛋白gp120、多重自动基因工程(MAGE)-Al、易位Ets白血病病毒(ETV)蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员(XAGE)1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-l) /半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶 (hTERT)、δ样3(DLL3)、滋养层细胞表明抗原2(TROP2)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、甲胎蛋白 (AFP)、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc 禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras 同源家族成员C(RhoC)、酪蛋白相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素 P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS 或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、 PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、 X断电2(SSX2)、晚期糖基化终产物的受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RUl)、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体 1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f (CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样 2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、 Fc受体样5(FCRL5)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、FITC、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CC趋化因子受体4(CCR4)、神经节苷脂 GD3、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族成员6(SLAMF6)、SLAMF4、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、和绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)；并且所述第一多肽含有选自膜结合IL-7、IL-21、IL-15、IL-12、IL-2、和IL-17中的细胞因子，或选自TGFb受体和IL15Ra sushi结构域中的细胞因子受体的胞外结构域，用于治疗淋巴瘤、白血病和起源于肺部、乳腺、前列腺、结肠、肾脏、卵巢、头颈、肝脏、胰腺、胆管和大脑的各种实体瘤。

在一些实施例中，所述工程化细胞是T细胞(CD4和CD8 T细胞)或NK细胞(NKT和NK92细胞)。

在一些实施例中，可以使用包含编码双CAR的多核苷酸的工程化细胞治疗B细胞淋巴瘤和白血病，其中一个CAR含有靶向CD19 的抗原识别结构域；并且另一个CAR含有靶向CD20或CD22的抗原识别结构域。

在一些实施例中，可以使用包含编码双CAR的多核苷酸的工程化细胞治疗多发性骨髓瘤，其中一个CAR含有靶向BCMA的抗原识别结构域；并且另一个CAR含有靶向CD38、CD138或CS1的抗原识别结构域。

在一些实施例中，可以使用包含编码双CAR的多核苷酸的工程化细胞治疗髓样白血病，其中一个CAR含有靶向CD123的抗原识别结构域；并且另一个CAR含有靶向CD33和CLL1的抗原识别结构域。

在一些实施例中，可以使用包含编码双CAR的多核苷酸的工程化细胞前列腺癌，其中一个CAR含有靶向PSCA的抗原识别结构域；并且另一个CAR含有靶向PSMA的抗原识别结构域。

在一些实施例中，抗原结合结构域是scFv或VHH纳米抗体。

在一些实施例中，所述工程化细胞通过基因敲除方法包含PD-1、 TIM3、或LAG3的失活基因。

在一些实施例中，所述工程化细胞是工程化T细胞或工程化NK 细胞。

在一些实施例中，所述工程化T细胞是CD4 T细胞或CD8 T细胞。

在一些实施例中，所述工程化NK细胞是NKT细胞或NK-92细胞。

在一些实施例中，所述分离的多核苷酸包含选自SEQ ID NO：6、 29、31、35、37、39、41、43、45、47、49、和51中的序列。在一些实施例中，相比于选自SEQ ID NO：6、29、31、35、37、39、41、 43、45、47、49、和51中的序列，所述多核苷酸具有至少80％、90％、 95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些实施例中，所述分离的多核苷酸编码具有选自SEQ ID NO：20、30、32、36、38、40、42、44、46、48、50、和52中的序列的多肽。在一些实施例中，相比于选自SEQ ID NO：20、30、 32、36、38、40、42、44、46、48、50、和52中的序列，所述多肽具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

在一些实施例中，可以利用慢病毒载体转导T细胞，以便在存在或不存在膜结合细胞因子/细胞因子受体融合蛋白的情况下表达多信号传导嵌合抗原受体(CAR)系统，其中所述慢病毒载体包含编码选自多肽A和多肽B中的多个多肽的分离的多核苷酸，其中多肽 A包含五个或更多个以下各项：(i)信号肽，(ii)第一结合蛋白， (iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)ICOS的共刺激结构域，和 (vi)衍生自CD3ζ信号传导结构域的TCR亚基，及其组合；并且其中多肽B包含五个或更多个以下各项：(i)信号肽，(ii)第一结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，及其组合。在一些实施例中，铰链区是可选的。

在一些实施例中，载体是选自腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体中的病毒载体。在一些其他实施例中，载体是选自 CRISPR载体系统和睡美人转座子系统中的非病毒载体。

在一些实施例中，可以使用2A肽基因(包括T2A、P2A、E2A、或F2A)将编码所述多个多肽亚基的基因连接到单个载体构建体中。

在本发明的再一个实施例中，工程化免疫细胞包含编码工程化膜结合细胞因子或细胞因子受体的分离的多核苷酸分子，其中所述工程化膜结合细胞因子或细胞因子受体包含(i)单肽，(ii)免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域，(iii)铰链结构域，(iv)跨膜结构域，(v)ICOS的共刺激结构域和(vi)CD3-ζ信号传导结构域。

在一些实施例中，细胞因子是IL-7，其中从基于膜结合IL-7 (mbIL-7)的共刺激分子中生成共刺激信号的工程化T细胞具有长期持久性和卓越的体内抗肿瘤活性，但不会发生畸变T细胞增殖。具有基于mbIL-7的共刺激分子与CAR的组合表达的T细胞保留了 TSCM样表型的记忆潜力。

在再一个实施例中，工程化免疫细胞包含多核苷酸，所述多核苷酸包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因，其中所述第一多肽包含(i)信号肽，(ii)结合蛋白，(iii)铰链区， (iv)跨膜结构域，(v)ICOS的共刺激信号传导结构域和(vi)CD3 ζ信号传导结构域；并且所述第二多肽包含(i)信号肽，(ii)免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域，(iii)铰链区，(iv) 跨膜结构域；其中结合蛋白与癌细胞上的抗原结合；其中所述第一基因和第二基因通过编码2A肽的基因连接。

在优选实施例中，本发明提供了一种单载体，所述单载体表达两个嵌合抗原受体(CAR)，或各自包含胞外和胞内结构域的一个 CAR和一个其他共刺激分子。CAR的胞外结构域包含靶特异性结合元素，其又以其它方式被称为抗原结合部分。所述其他共刺激分子的胞外结构域包含免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域。胞内结构域或胞质结构域包含共刺激信号传导区和Z链部分。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是细胞表面分子，而不是淋巴细胞对初级抗原进行高效应答所必需的受体或其配体。在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或者在CAR的胞质结构域和跨膜结构域之间，可以包含铰链结构域。如本文使用的，术语“铰链结构域”一般意指用于将跨膜结构域连接至胞外结构域或多肽链中的胞质结构域的任何寡肽或多肽。一个铰链结构域可以包含300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，并且最优选25至50个氨基酸。铰链区(“H”)可以是单个或多个 H1(SEQ ID NO：16)。

跨膜结构域可以衍生自天然来源或合成来源。在天然来源的情况下，该结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白(即至少包含其一个或多个跨膜区)，诸如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、 CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。优选实施例的跨膜区可以衍生自序列为SEQ ID NO：17或28的人源。另选地，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将包含主要为疏水性的残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。可选地，长度优选在2个和10个氨基酸之间的寡肽或多肽短接头可以在跨膜结构域和CAR的胞质信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的接头。

胞质结构域或本发明的CAR的胞内信号传导结构域负责活化其中已放置CAR的免疫细胞的至少一个正常的“效应功能”。术语“效应功能”是指细胞的专门功能。T细胞的效应功能例如可以是溶细胞活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并对细胞进行定向以执行专门功能的蛋白部分。虽然通常可以采用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，此类截短部分只要转导效应功能信号，就可以替代完整链使用。因此，术语“胞内信号传导结构域”意图包含胞内信号传导结构域的足以转导效应功能信号的截短部分。

初级胞质信号传导序列以刺激性的方式，或抑制性的方式调节 TCR复合体的初次活化。以刺激性的方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。

含有在本发明中具有特定用途的初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、和CD66d中的那些。特别优选的是，本发明的CAR中的胞质信号传导分子包含衍生自CD3ζ中的胞质信号传导序列。

在优选实施例中，CAR的胞质结构域可以设计成包含与在本发明的CAR的上下文中有用的任何其他所需的胞质结构域组合的CD3 ζ链(CD3-ζ)信号传导结构域。例如，CAR的胞质结构域或任何其他共刺激分子可以包含CD3Z链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR部分。共刺激分子是细胞表面分子，而非淋巴细胞对抗原进行高效应答所必需的初级抗原受体或其配体。此类分子的实例包括CD27、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、和与 CD83特异性结合的配体等等。优选的是，本发明的CAR或共刺激分子中的共刺激信号传导元素是ICOS。并且，特别优选的是，胞质结构域包括ICOS/CD3-ζ的组合。

在一个实施例中，多重共刺激信号CAR结构具有靶向肿瘤特异性抗原CD19的抗原结合结构域和靶向包括CD20和CD22的另一个肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域。在另一个实施例中，多重共刺激信号CAR结构含有膜结合细胞因子和靶向肿瘤特异性抗原的抗体，所述肿瘤特异性抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、EpCAM、 MUC-1、CS2、CLDN 18.2、GPC3、间皮素、BCMA和B7H4。在一个实施例中，CAR结构的膜结合细胞因子是mbIL-7。

在另一个实施例中，多重共刺激信号CAR T细胞进一步含有诱导型自杀基因。

用于和单载体进行多基因共表达的策略包括：使用多个启动子、融合蛋白、基因之间的蛋白水解切割位点、内部核糖体进入位点、和“自切割”2A肽。2A肽是长度为18-22个氨基酸(aa)的病毒寡肽，其在真核细胞中翻译期间介导多肽的“切割”。名称“2A”是指病毒基因组的特异性区域，并且不同的病毒2A一般以其所源自的病毒病名。首先发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，在此之后还鉴定出了 E2A(马鼻炎病毒),P2A(猪捷申病毒-1 2A)、和T2A(明脉扁刺蛾β四体病毒2A)。最近发现的2A介导的“自切割”机制是核糖体跳过2A的C末端处的甘氨酰脯氨酰肽键的信息。(Donnelly,M.L. 等人，2001)。

合成编码新CAR系统的DNA，并将其克隆到慢病毒载体中。这些载体质粒将在质量控制下在293个T细胞中被制成成熟慢病毒颗粒，并且T细胞或诸如从患者的PBMC中分离的NK或NKT细胞之类的其他免疫细胞将和含有我们的新CAR结构的慢病毒一起转导。转导的免疫细胞将在生物反应器中生长并扩增约10天，以达到治疗数目。在质量控制放行后，这些表达CAR的免疫细胞将被转导回患者中，以用于医疗用途。

组合物、配方和给予方法

还提供了细胞、细胞群、和含有所述细胞和细胞群的组合物(包含药物和治疗组合物)，所述细胞和细胞群诸如通过所提供的的方法生成的细胞和细胞群。还提供了用于向受试者(例如，患者)给予所述细胞和组合物的方法，例如治疗方法。

组合物和制剂

还提供了包含供给予的细胞的组合物，所述组合物包括药物组合物和制剂，诸如，包括以给定剂量或其一部分给予的细胞数的单位剂型组合物。药物组合物和制剂一般包括一种或多种可选的药学上可接受的载剂或赋形剂。在一些实施例中，所述组合物包含至少一种额外的治疗药剂。

术语“药物制剂”是指这样一种配制剂，其形式允许其中含有的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含有对将给予制剂的受试者有着不可接受的毒性的额外组分。

“药学上可接受的载剂”是指药物制剂中的一种成分，而不是对受试者无毒的活性成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面，载剂的选择部分地是由特定细胞和/或给予方法决定的。相应地，存在各种合适的制剂。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠、和氯化苯甲烃铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。所述防腐剂或其混合物的存在的量通常是组合物总重量的约0.0001％至约2％。例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)第16版，Osol,A. 编辑(1980)中对载剂进行了介绍。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对接受者一般是无毒的，并且包括但不限于：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸类；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；氯化苯甲烃铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊酚；和间甲酚)；低分子量(小于约 10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(例如，锌蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面，缓冲剂包含在组合物中。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾、和各种其他酸类和盐类。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物的存在的量通常是组合物总重量的约0.001％至约4％。用于制备可给予的药物组合物的方法是公知的。例如，在Remington:The Science and Practiceof Pharmacy(《雷明顿：药学的科学和实践》), Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中，更详细地介绍了示例性方法。

制剂可以包含水溶液。制剂或组合物还可以含有可有效用于正在使用所述细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种的活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些，其中各自的活性不会对彼此产生不良影响。此类活性成分以有效用于预期用途的数量以组合的形式适当地存在。因此，在一些实施例中，所述药物组合物进一步包含其他药物活性药剂或药物，诸如化疗药剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、和/ 或长春新碱。

在一些实施例中，所述药物组合物以对治疗或预防疾病或病症有效的量，诸如治疗有效量或预防有效量，含有所述细胞。在一些实施例中，通过定期评估接受治疗的受试者，对治疗或预防功效进行监控。可以通过单次推注给予所述细胞，通过多次推注给予所述细胞，或通过连续输注给予所述细胞进行，递送所需的剂量。

可以使用标准给予技术、制剂、和/或设备，给予所述细胞和组合物。给予的所述细胞可以是自体的或异源的。例如，可以从一名受试者获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其给予至同一受试者或相容的不同受试者。可以经由局部注射，包括导管给予、全身注射、局部注射、静脉注射或肠胃外给予，给予衍生自外周血的免疫应答细胞或其后代(例如，衍生自体内、离体或体外)。在给予治疗组合物(例如，含有经基因修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，一般以可注射的单位剂量形式(溶液、悬浮液、乳液)配制所述治疗组合物。

制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌内、鼻内、颊部、舌下或栓剂给予的那些制剂。在一些实施例中，肠胃外给予细胞群。如本文使用的，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、引道、和腹膜内给予。在一些实施例中，通过静脉内、腹膜内、或皮下注射，使用外周全身递送向受试者给予所述细胞。

在一些实施例中，以无菌液体配制剂的形式，例如等渗水溶液、悬浮液、乳剂、分散液、或粘性组合物(在一些方面可以将其缓冲至选定的pH)，提供组合物。液体配制剂常常比凝胶、其他粘性组合物、和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更便于尤其是通过注射给予。在另一方面，可以在合适的粘度范围内配制粘性组合物，以便延长与特定组织的接触砂时间。液体或粘性组合物可以包含载剂，所述载剂可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和其适当的混合物的溶剂或分散介质。

通过将所述细胞掺入溶剂，诸如与适当的载剂、稀释剂、或赋形剂(诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等等)的混合物中，可以制备可注射的无菌溶液。所述组合物可以含有辅助物质，诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝剂或增粘添加剂、防腐剂、矫味剂、和/或着色剂，取决于给予途径和所需的配制剂。在一些方面，可以查询标准文本来制备合适的配制剂。

可以加入各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可以确保预防微生物的作用。通过使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝和明胶，约可以延长对可注射的药物形式的吸收。

将用于体内给予的制剂一般是无菌的。例如通过无菌滤膜的过滤，可以轻松实现无菌性。

给予方法和细胞在过继细胞疗法中的用途

提供了给予所述细胞、群和组合物的方法，以及此类细胞、群和组合物用于治疗或预防疾病、病症和失调(包括癌症)的用途。在一些实施例中，向患有例如经由过继细胞疗法治疗(诸如过继T 细胞疗法)的特定疾病或病症的受试者或患者给予所述细胞、群和组合物。在一些实施例中，向受试者，诸如患有所述疾病或病症或存在患上所述疾病或病症的风险的受试者，给予通过所提供的方法制备的细胞和组合物，诸如孵育和/或处理步骤之后的工程化组合物和最终生产组合物。在一些方面，所述方法由此诸如通过减小表达由工程化T细胞识别的抗原的癌症中的肿瘤负荷，治疗例如减轻所述疾病或病症的一种或多种症状。

用于给予用于过继细胞疗法的细胞的方法是公知的，并且可以与所提供的方法和组合物结合使用。例如，如在属于Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238、属于Rosenberg的美国专利号 4,690,915、Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol《自然评论临床肿瘤学》.8(10):577-85)中，介绍了过继T细胞疗法方法。例如，请参见 Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.(《自然—生物技术》)31(10): 928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun(《生物化学与生物物理学研究通讯》)438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoS ONE(《公共科学图书馆·综合》)8(4):e61338。

如本文使用的，“受试者”是诸如人或其他动物之类的哺乳动物，并且通常是人。在一些实施例个，向其给予细胞、细胞群或组合物的受试者(例如患者)是哺乳动物，通常是诸如人之类的灵长类动物。在一些实施例中，灵长类动物是猴子或猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、承认和老年受试者。在一些实施例中，受试者是非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物。

如本文使用的，“治疗(treatment)”(及其语法变形，诸如“treat”或“treating”)是指完全或部分减轻或减少疾病或病症或失调、或症状、不良影响或结果、或与之相关的表型。理想的治疗效果包括但不限于：预防疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接的病理结果、预防转移、降低疾病进展速率、减轻或缓和疾病状态、和缓解和改善预后。这些术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的影响。

如本文使用的，“延迟疾病发展”意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定、抑制和/或延缓疾病(诸如癌症)的发展。该延迟可以具有不同的时间长度，具体取决于病史和/或正在接受治疗的个体。对本领域技术人员显而易见的是，充分或显著的延迟实际上可以涵盖预防，亦即个体不会患上疾病。例如，可以延迟晚期癌症，诸如转移的发展。

如本文使用的，“预防”包括针对某一疾病在可能易患所述疾病但尚未被诊断出患有所述疾病的患者中的发生或复发提供预防。在一些实施例中，使用所提供的细胞和组合物延迟疾病的发展，或减缓疾病的进展。

如本文使用的，“抑制”某种功能或活性是与除感兴趣的病症或参数之外的其他相同病症相比，或者另选地，与另一种病症相比，降低了功能或活性。例如，与在不存在抑制肿瘤生长的细胞的情况下的生长速率相比，所述细胞降低了肿瘤的生长速率。

在给予的环境下，某种药剂(例如药物制剂、细胞或组合物) 的“有效量”是指在必要的剂量/数量和持续时间下，有效用于获得所需结果(诸如治疗或预防结果)的量。

某种药剂(例如药物制剂或细胞)的“治疗有效量”是指在必要的剂量和持续时间下，有效用于获得所需治疗结果(诸如用于治疗疾病、病症或失调、和/或治疗的药代动力学或药效学作用)的量。治疗有效量可以随根据受试者的疾病状态、年龄、性别、和体重，以及所给予的细胞群之类的因素而发生变化。在一些实施例中，所提供的方法包括以有效量，例如治疗有效量，给予所述细胞和/或组合物。

“预防有效量”是指在所必需的剂量和持续时间下，有效用于实现所需的预防结果的量。通常，但并非必需地，由于预防剂量是在疾病的早期阶段用于受试者中，因此，预防有效量将少于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的背景下，预防有效量在一些方面将比治疗有效量更高。

在一些实施例中，通过自体转移进行细胞疗法，例如过继T细胞疗法，在自体转移中，从要接受细胞疗法的受试者、或从源自此类受试者的样品中，分离和/或以其他方式制备细胞。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者，例如患者，并且在分离和处理之后，向同一受试者给予所述细胞。

在一些实施例中，通过同种异体转移进行细胞疗法，例如过继T 细胞疗法，在同种异体转移中，从除了要接受细胞疗法的受试者或最终接受细胞疗法的受试者(例如第一受试者)中，分离和/或以其他方式制备细胞。意外的受试者、或从源自此类受试者的样品中制备细胞。在此类实施例中，然后向相同物种的不同受试者(例如第二受试者)给予所述细胞。在一些实施例中，所述第一和第二受试者在基因上是相同的。在一些实施例中，所述第一和第二受试者在基因上是相似的。在一些实施例中，所述第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。

在一些实施例中，在给予细胞或含有所述细胞的组合物之前，已使用靶向疾病或病症(例如肿瘤)的治疗药剂对受试者进行了治疗。在一些方面，所述受试者难以用另一种治疗药剂治疗或对另一种治疗药剂没反应。在一些实施例中，例如在利用另一种治疗干预(包括化疗、辐射、和/或造血干细胞移植(HSCT)，例如同种异体 HSCT)进行治疗之后，所述受试者患上持续性或反复性疾病。在一些实施例中，尽管受试者已经变得耐受另一种疗法，但所述给予有效治疗了所述受试者。

在一些实施例中，受试者对另一种治疗药剂有反应，并且利用该治疗药剂的治疗降低了疾病负荷。在一些方面，受试者最初对治疗药剂有反应，但随着时间的推移，表现出疾病或病症复发。在一些实施例中，受试者没有复发。在一些此类实施例中，受试者被确定为存在复发风险，诸如存在高复发风险，并且因此以预防的方式给予所述细胞，例如以便降低复发的可能性或预防复发。

在一些方面，受试者没有接受利用另一种治疗药剂的预先治疗。

利用所提供的组合物、细胞、方法和用途治疗的疾病、病症或失调为肿瘤，包括实体瘤、恶性血液病、黑色素瘤、以及传染性疾病，诸如感染某种病毒或其他病原体，例如HIV、HCV、HBV、CMV 和寄生虫病。在一些实施例中，所述疾病或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、赘生物、或其他增殖性疾病或失调。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL))、非霍奇金淋巴瘤、急性髓样白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、脑癌、卵巢癌、上皮细胞癌、肾细胞癌、胰腺腺癌、霍奇金淋巴瘤、子宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、和/或间皮瘤。

在一些实施例中，与疾病或失调相关联的抗原选自： Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、Claudin 8、NY-ESO-1、CD19、 CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白(MPL)、CD30、CD32、CD20、 CD70、CD79b、CD99、CD123、CD138、CD179b、CD200R、CD276、 CD324、Fc受体样5(FcRH5)、CD171、CS-1(信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C型凝集素样分子1(CLL-1)、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III(EGFRviii)、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、 Tn抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肿瘤相关糖蛋白(TAG)-72、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、B7-H3(CD276)、 B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2(IL-13Ra2)、白介素11受体亚基α(IL11Ra)、间皮素、前列腺干细胞抗原(PSCA)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis Y、CD24、血小板衍生生长因子受体β(PDGFR-β)、蛋白酶丝氨酸21(PRSS21)、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、免疫球蛋白Fc区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2(ERBB2)、粘蛋白1 (MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经小粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变型延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、潜伏膜蛋白2(LMP2)、黑素细胞蛋白gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2(EphA2)、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂(Fucosyl GM1)、唾液酸Lewis a(sLea)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7(TEM7R)、claudin 6(CLDN6)、促甲状腺激素受体 (TSHR)、T细胞受体(TCR)-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、 G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、CXORF61蛋白、CD97、 CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、多唾液酸、胎盘特异性1 (PLAC1)、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原(NY-BR-1)、 uroplakin-2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6家族成语K(LY6K)、嗅觉受体家族51亚家族E成员2(OR51E2)、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白(TARP)、威尔姆氏瘤抗原1蛋白(WTl)、癌症-睾丸抗原 NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒 (HPV)E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV1)-Tax、卡波西肉瘤相关炮疱疹病毒糖蛋白(KSHV)K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)编码的糖蛋白350(EBB gp350)、HIV1包膜糖蛋白gp120、多重自动基因工程(MAGE)-Al、易位Ets白血病病毒(ETV) 蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员(XAGE)1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1(PCTA-l) /半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶 (hTERT)、δ样3(DLL3)、滋养层细胞表明抗原2(TROP2)、蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)、鸟苷酸环化酶C(GCC)、甲胎蛋白(AFP)、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc 禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras 同源家族成员C(RhoC)、酪蛋白相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素P4501B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS 或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、 PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、 X断电2(SSX2)、晚期糖基化终产物的受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RUl)、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体 1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样 2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)、 Fc受体样5(FCRL5)、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、FITC、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体(FSHR)、绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)、CC趋化因子受体4(CCR4)、神经节苷脂 GD3、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族成员6(SLAMF6)、 SLAMF4、促黄体素受体(LHR)、促卵泡激素受体受体(FSHR)、和绒毛膜促性腺激素受体(CGHR)和/或生物素化分子、和/或由HIV、 HCV、HBV或其他病原体表达的分子。

在一些实施例中，以所需剂量给予细胞，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数目的细胞或细胞类型、和/或所需的细胞类型比率。因此，在一些实施例中，细胞的剂量是基于细胞总数(或每千克体重的数量)和单个群体或亚型的所需比率，诸如CD4+与CD8+的比率。在一些实施例中，细胞的剂量是基于单个群体中的所需细胞总数(或每千克体重的数目)，或单个细胞类型的所需细胞总数。在一些实施例中，剂量基于以下这些特征的组合，诸如所需细胞总数、所需比率和单个群体中的所需细胞总数。

在一些实施例中，以所需细胞总剂量(诸如T细胞的所需剂量) 或在其容许差范围内，给予细胞的群体或亚型，诸如CD8+和CD4+T 细胞。在一些方面，所需剂量是细胞的所需数目，或向其给予细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数目，例如每千克细胞数。在一些方面，所需剂量等于或大于最小细胞数或每单位体重的最小细胞数。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞之中，单个群体或亚型以等于或接近例如在此类比率的某个容许差或误差的范围内的所需输出比(诸如CD4+/CD8+比)的方式存在。

在一些实施例中，以等于细胞的一个或多个单个群体或亚型的所需剂量(诸如，CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)或在其容许差范围内的方式，给予细胞。在一些方面，所需剂量是所述亚型或群体的细胞的所需数目，或向其给予细胞的受试者的每单位体重的此类细胞的所需数目(例如，每千克细胞数)。在一些方面，所需剂量等于或高于所述群体或亚型的细胞的最小数目，或者所述群体或亚型的细胞的每单位体重的最小数目。

因此，在一些实施例中，剂量基于细胞总数的所需固定剂量和所需比率，和/或基于一个或多个(例如每一个)单个亚型或亚群的所需固定剂量。因此，在一些实施例中，剂量基于T细胞的所需固定或最小剂量和CD4+/CD8+细胞的所需比率，和/或基于CD4+和 CD8+细胞的所需固定或最小剂量。

在某些实施例中，以约100万至约1,000亿个细胞的范围，诸如，例如100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2,500 万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200 亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞、或由任两个前述值定义的范围)，诸如约1,000万至约1,000亿个细胞(例如，约2,000 万个细胞、约3,000万个细胞、约4,000万个细胞、约6,000万个细胞、约7,000万个细胞、约8,000万个细胞、约9,000万个细胞、约 100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞、或由任两个前述值定义的范围)，以及在一些情况下，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约 2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)，或以这些范围之间的任何值，向受试者给予细胞或单个亚型细胞群。

在一些实施例中，总细胞的剂量和/或单个细胞亚群的剂量在等于每千克体重等于或约10⁴个细胞和等于或约10⁹个细胞之间的范围内，诸如在每千克体重10⁵和10⁶个细胞之间，例如，至少、或至少约、或等于或约每千克体重1×10⁵个细胞、每千克体重1.5×10⁵个细胞、每千克体重2×10⁵个细胞、或每千克体重1×10⁶个细胞。例如，在一些实施例中，以等于每千克(kg)体重等于或约10⁴个和等于或约10⁹个T细胞之间或在其特定误差范围内，诸如在每千克体重10⁵个T细胞和10⁶个T细胞之间，例如，至少、或至少约、或等于或约每千克体重1×10⁵个T细胞、1.5×10⁵个T细胞、2×10⁵个T细胞、或1×10⁶个T细胞，给予细胞。

在一些实施例中，以等于每千克(kg)体重等于或约10⁴个和等于或约10⁹个CD4+和/或CD8+细胞之间或在其特定误差范围内，诸如在每千克体重10⁵个CD4+和/或CD8+细胞和10⁶个CD4+和/或 CD8+细胞之间，例如，至少、或至少约、或等于或约每千克体重1×10⁵个CD4+和/或CD8+细胞、1.5×10⁵个CD4+和/或CD8+T细胞、2×10⁵个CD4+和/或CD8+细胞、或1×10⁶个CD4+和/或CD8+细胞，给予细胞。

在一些实施例中，以等于、大于、和/或至少约1×10⁶、约2.5×10⁶、约5×10⁶、约7.5×10⁶、或约9×10⁶个CD4+细胞，和/或至少约1×10⁶、约2.5×10⁶、约5×10⁶、约7.5×10⁶、或约9×10⁶个CD8+细胞，和/或至少约1×10⁶、约2.5×10⁶、约5×10⁶、约7.5×10⁶、或约9×10⁶个T 细胞，或在其特定误差范围内，给予细胞。在一些实施例中，以等于在约10⁸和10¹²个T细胞之间之间或在约10¹⁰和10¹¹个T细胞之间，在约10⁸和10¹²个CD4+细胞之间或在约10¹⁰和10¹¹个CD4+细胞之间，和/或在约10⁸和10¹²个CD8+细胞之间或在约10¹⁰和10¹¹个CD8+细胞之间，或在其特定误差范围内，给予细胞。

在一些实施例中，在等于多个细胞群或亚型(诸如CD4+和CD8+ 细胞或亚型)的所需输出比或在其容许范围内，给予细胞。在一些方面，所需比率可以是特定比率，或者可以是比率范围。例如，在一些实施例中，所需比率(例如CD4+/CD8+细胞比)在等于或约5:1 和等于或约5:1之间(或大于约1:5和小于约5:1)，或在等于或约 1:3和等于或约3:1之间(或大于约1:3和小于约3:1)，诸如在等于或约2:1和等于或约1:5之间(或大于约1:5和小于约2:1)，诸如等于或约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、 1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、 1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、 1:4、1:4.5、或1:5.在一些方面，容许差在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％的范围内，包括这些范围之间的任何值。

为了预防或治疗疾病，合适的剂量可以取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程序或病程，给予细胞是为了预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的病例及其对细胞的反应、以及主治医生的判断。在一些实施例中，一次或在一系列治疗中，适当地向受试者给予所述组合物和细胞。

可以通过任何合适的手段给予细胞，例如，通过推注输注、通过注射，例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、会阴下注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射、或后近巩膜递送。在一些实施例中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予，并且如果需要局部治疗，则通过病灶内给予。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施例中，通过单次推注给予所述细胞来给予给定剂量。在一些实施例中，它是通过例如在不超过3天的一段时间内多次推注给予所述细胞而给予的，或者通过连续输注给予所述细胞而给予的。

在一些实施例中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，例如与另一种治疗干预措施，诸如抗体或工程化细胞或受体或药剂(诸如细胞毒性或治疗药剂)，一起同时或以任何顺序依次给予。在一些实施例中，将细胞与一种或多种额外治疗药剂一起共同给予，或者结合另一种治疗干预措施同时或以任何顺序依次共同给予。在一些背景下，以在时间上足够接近的方式，将细胞与另一种疗法一起共同给予，使得所述细胞群增强一种或多种额外治疗药剂的作用，反之亦然。在一些实施例中，在一种或多种额外治疗药剂之前给予细胞。在一些实施例中，在一种或多种额外治疗药剂之后给予细胞。在一些实施例中，一种或多种额外药剂包括细胞因子，诸如IL-2，例如以增强持续性。在一些实施例中，所述方法包括给予化疗药剂。

在一些实施例中，在给予细胞之后，例如通过许多已知方法中的任一个测量工程化细胞群的生物活性。待评估参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的体内(例如通过成像)或离体 (例如通过ELISA或流式细胞术)特异性结合。在某些实施例中，可以使用本领域中已知的任何合适的方法测量工程化细胞破坏靶细胞的能力，诸如Kochenderfer等人,J.Immunotherapy(《免疫疗法杂志》),32(7):689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods (《免疫学方法杂志》),285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定法。在某些实施例中，通过测定一种或多种细胞因子(诸如，CD107a、 IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌，测量细胞的生物活性。在一些方面，通过测定临床结果，诸如肿瘤负荷或负载的减少，对生物活性进行测量。

在某些实施例中，以任意数量的方式进一步修饰工程化细胞，从而提高其治疗或预防功效。例如，通过群表达的工程化CAR或 TCR可以通过接头直接或间接与靶向部分缀合。化合物(例如CAR 或TCR)与靶向部分的缀合的实践在本领域中是已知的。举例来说，请参见Wadwa等人,J.Drug Targeting(《药物靶向杂志》)3:111 (1995)，和美国专利号5,087,616。

给药时间表或方案

在一些实施例中，提供了重复剂量方法，其中先给出细胞的第一剂量，随后是一次或多次第二连续剂量。细胞的多次剂量的时间和大小被设计成当在过继治疗方法中向受试者给予时，用于提高抗原表达T细胞(诸如，表达CAR的T细胞)的功效和/或活性和/或功能。在一些实施例中，重复给药降低了可能会在上调抗原表达(诸如表达CAR的)T细胞上的抑制性免疫分子(诸如PD-1和/或PD-L1) 时出现的下调或抑制活性。所述方法涉及先给予第一剂量，随后一般以不同剂量之间的特定时间框架给予一次或多次连续剂量。

在过继细胞疗法的背景下，给予给定的“剂量”涵盖以单一组合物和/或单次不间断给予，例如单次注射或连续输注，给予给定数量或数目的细胞，并且还涵盖在不超过3天的指定时间段内，以分次剂量，给予在多个单独的组合物或输注物中提供的给定数量或数目的细胞。因此，在一些背景下，第一或连续剂量是在单个时间点给出或开始的单次或连续给予的指定细胞数目。然而，在一些背景下，第一或连续剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注给予，诸如每天一次持续三天或两天，或通过在一天时间内的多次输注。

因此，在一些方面，第一剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施例中，连续剂量的细胞以单一药物组合物给予。

在一些实施例中，第一剂量的细胞以总体含有第一剂量的细胞的多个组合物给予。在一些实施例中，连续剂量的细胞以总体含有连续剂量的细胞的多个组合物给予。在一些方面，可以在不超过3 天的时间段内以多个组合物给予额外的连续剂量。

术语“分次剂量”是指分开的剂量，使其在超过一天的时间内给予。这种类型的给药涵盖在本方法中，并且被认为是单剂量。

因此，在一些方面，第一剂量和/或连续剂量可以以分次剂量给予。例如，在一些实施例中，可以在2天或3天内向受试者给予该剂量。分次给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量，并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施例中，第一剂量的33％可以在第一天给予，而在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施例中，分次剂量的延续不超过3天。

关于在先剂量，诸如第一剂量，术语“连续剂量”是指在在先(例如，第一)剂量之后向受试者给予的剂量，而在其间没有向受试者给予任何间插剂量。尽管如此，该术语不涵盖在单一分次剂量内包括的一系列输注或注射中的第二、第三和/或其他注射或输注。因此，除非另有说明，否则，在一天、两天或三天的时间内的第二次输注不被认为是本文所用的“连续”剂量。同样，在分次剂量内的一系列多次剂量中的第二、第三和其他剂量也不被认为是“连续”剂量意义的上下文中的“间插”剂量。因此，除非另有说明，否则，即使在受试者在第一剂量开始之后接受第二次或后续细胞注射或输注，只要在第一或在先剂量开始后的三天时间内进行第二次或后续注射或输注，在第一或在先剂量开始后在超过3天的一定时间段给予的剂量就被认为是“连续”剂量。

因此，除非另有说明，否则，在最长3天的时间段内多次给予相同细胞即被视为单剂量，并且在初始给予后3天内给予细胞不被认为是连续剂量，并且不被认为是用于确定第二剂量是否与第一剂量“连续”的间插剂量。

在一些实施例中，在一些方面，使用与关于第一剂量和第一连续剂量之间的时间安排相同的时间安排指导，例如通过给予第一和多个连续剂量，提供多个连续剂量，其中每个连续剂量在受试者的细胞中的抑制性免疫分子(诸如PD-1和/或PD-L1)自给予第一剂量后已得到上调的时间段内提供。本领域技术人员在其能力范围内能够根据经验，诸如，通过评估来自外周血或其他体液的抗原表达(例如表达CAR的)细胞中的PD-1和/或PD-L1的水平，确定何时提供连续剂量。

在一些实施例中，第一剂量和第一连续剂量之间、或第一连续剂量和多个连续剂量之间的时间安排使得在超过约5天、6天、7天、 8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17 天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26 天、27天、28天或更多天的时间段内，给予每个连续剂量。在一些实施例中，在给予第一或在先剂量之后，在少于约28天的时间段内给予连续剂量。额外的一次或多次多个额外连续剂量又被称为后续剂量或后续连续剂量。

细胞的第一剂量和/或一次或多次连续剂量的大小一般被设计成用于改善功效和/或降低毒性风险。在一些方面，第一剂量或任何连续剂量的用量和大小是上文所述的任何剂量或数量。在一些实施例中，第一剂量或任何连续剂量中的细胞数在约0.5×10⁶个细胞/kg受试者体重和5×10⁶个细胞/kg之间、在约0.75×10⁶个细胞/kg和3×10⁶个细胞/kg之间或在约1×10⁶个细胞/kg和2×10⁶个细胞/kg之间,每个都包括端点。

如本文使用的，“第一剂量”用于描述给予连续或后续剂量之前的给定剂量的时间安排。该术语并不一定暗示受试者之前从未接受过一定剂量的细胞疗法，或者甚至受试者之前没有接受过一定剂量的相同细胞或表达相同重组受体或靶向相同抗原的细胞。

在一些实施例中，与由第一剂量的细胞表达的受体例如CAR一样，由连续剂量中的细胞表达的受体(例如CAR)含有至少一个免疫反应性表位。在一些方面，由连续剂量中给予的细胞表达的受体例如CAR与由第一剂量表达的受体例如CAR相同，或者与由第一剂量中给予的细胞表达的受体例如CAR基本上相同。

由以各种剂量向受试者给予的细胞表达的重组受体，诸如CAR，一般识别在正在治疗的疾病或病症或其细胞中表达的、与所述疾病或病症或其细胞相关联的、和/或特异性于所述疾病或病症或其细胞的分子，或与所述分析特异性结合。在特异性结合所述分子例如抗原时，受体一般将免疫刺激信号诸如ITAM转导的信号递送至细胞中，从而促进靶向于所述疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施例中，第一剂量中的细胞表达CAR，所述CAR特异性结合至由疾病或病症的细胞或组织表达的或与疾病或病症相关联的抗原。

表1.针对CAR结构/系统的多核苷酸和CAR结构域鉴定的代表性序列

表2.针对由CAR结构/系统的多核苷酸和CAR结构域编码的蛋白/肽鉴定的代表性序列

表3.CAR和mbIL-7的表达水平

工作实例:

实例1.单信号单一CAR的制备

CAR主链序列编码包含从N末端到C末端的CAR主链多肽：化学合成CD8铰链结构域、ICOS跨膜结构域、ICOS胞质结构域和 CD3ζ胞质结构域，并将其克隆至预修饰的慢病毒转移载体下游，并以可操作的方式将其连接到组成型hEF1a启动子。SP1(gm-sp)的 DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：1和15；H1(铰链1)的DNA 序列和肽序列分别为SEQ ID NO：2和16；TM1的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：3和17(表1和2)。得到的CAR1主链载体被命名为pAC_C01。载体中的EcoRI位点允许通过不依赖序列和连接的克隆方法(SLIC)，将核酸序列插入到pAC_C01载体上游，并将其可操作地连接到CAR-1主链序列(FIG1A-1G)的CD8铰链结构域，所述核酸序列包括Kozak序列，所述Kozak序列可操作地连接到编码GM-CSF信号肽的核酸序列，所述GM-CSF信号肽融合到人源化抗CD19(#Ab01)、人源化抗CD20(#Ab02)、人源化抗 CD22(L-H和H-L两种形式，分别为#Ab03和##Ab04)、人源化抗CD30(#Ab05)、人源化抗EpCAM(#Ab06)和人源化抗B7H4 (#Ab07)片段的scFv的N末端。单信号单一CAR结构的多核苷酸分别被命名为CAR-1-CD19(SEQ ID NO：29)、CAR-1-CD20(SEQ ID NO：37)、CAR-1-CD22(L/H)(SEQ ID NO：39)、CAR-1-CD22 (H/L)(SEQ ID NO：41)、CAR-1-CD30(SEQ ID NO：53)、CAR-1-EpCAM、和CAR-1-B7H4(表1)。表2显示了由表1的多核苷酸编码的多肽。单信号单一CAR的载体构建体分别被命名为 pCAR-1-CD19、pCAR-1-CD20、pCAR-1-CD22(L/H)、pCAR-1-CD22 (H/L)、pCAR-1-CD30、pCAR-1-EpCAM、和pCAR-1-B7H4。

实例2.双信号单一CAR的制备

第二CAR主链序列编码包含从N末端到C末端的多肽：化学合成经修饰的CD8铰链结构域、CD137跨膜结构域、CD137胞质结构域和CD3e胞质结构域，并将其克隆至pAC_C01中，并命名为 pAC_C0102。SP1(gm-sp)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO： 1和15；SP2的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：11和25； H1(铰链1)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：2和16；H2(铰链2)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：13和27；TM2的 DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：14和28；T2A的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：7和21(表1和2)。信号1结构 (TM1+ICOS+CD3ζ)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：6 和20。载体中的BamHI位点允许将编码T2A肽、IL-7信号肽、IL-7 胞外片段的合成核酸序列，插入到pCAR-1-CAR-2载体上游，并将其可操作地连接到CAR-2主链序列的CD137跨膜结构域(图 2A-2G)。双信号单一CAR结构的多核苷酸分别被命名为 CAR-1-CD19/CAR-2-IL-7(SEQ ID NO：31)、 CAR-1-CD20/CAR-2-IL-7(SEQ ID NO：43)、CAR-1-CD22(L/H) /CAR-2-IL-7(SEQ ID NO：45)、CAR-1-CD22(H/L)/CAR-2-IL-7 (SEQ ID NO：47)、CAR-1-CD30/CAR-2-IL-7(SEQ ID NO：55)、CAR-1-EpCAM/CAR-2-IL-7、和CAR-1-B7H4/CAR-2-IL-7(表1)。表2显示了由表1的多核苷酸编码的多肽。双信号单一CAR的载体构建体分别被命名为pCAR-1-CD19/CAR-2-IL-7、 pCAR-1-CD20/CAR-2-IL-7、pCAR-1-CD22(L/H)/CAR-2-IL-7、 pCAR-1-CD22(H/L)/CAR-2-IL-7、CAR-1-CD30/CAR-2-IL-7、 pCAR-1-EpCAM/CAR-2-IL-7、和pCAR-1-B7H4/CAR-2-IL-7。

实例3.双信号双靶向CAR的制备

第二CAR主链序列编码包含从N末端到C末端的多肽：化学合成经修饰的CD8铰链结构域、CD137跨膜结构域、CD137胞质结构域和CD3e胞质结构域，并通过SLIC将其克隆至pCAR-1-CD19中，并命名为pCAR-1-CD19/CAR-2。SP1(gm-sp)的DNA序列和肽序列分别为SEQID NO：1和15；SP3的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：33和34、H1(铰链1)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：2和16；H2(铰链2)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO： 13和27；TM2的DNA序列和肽序列为SEQ ID NO：14和28；T2A 的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：7和21。信号1结构 (TM1+ICOS+CD3ζ)的DNA序列和肽序列分别为SEQ ID NO：6 和20。载体中的ACC65I位点允许将编码T2A肽的核酸序列，编码 CD8信号肽的合成核酸序列插入到pCAR-1-CD19/CAR-2载体上游，并将其可操作地连接到CAR-2主链序列的CD8铰链结构域，所述CD8信号肽融合到人源化抗CD20、人源化抗CD22的scFv的N末端(图3A-3C)。双信号双CAR结构的多核苷酸分别被命名为 CAR-1-CD19/CAR-2-CD20(SEQ ID NO：35)、 CAR-1-CD19/CAR-2-CD22(L/H)(SEQ ID NO：49)、和 CAR-1-CD19/CAR-2-CD22(H/L)(SEQ ID NO：51)(表1)。表2 显示了由表1的多核苷酸编码的多肽。双信号双CAR的载体构建体分别被命名为pCAR-1-CD19/CAR-2-CD20、 pCAR-1-CD19/CAR-2-CD22(L/H)、和 pCAR-1-CD19/CAR-2-CD22(H/L)。

实例2.慢病毒构建体和慢病毒的生产

合成针对人CD19编码scFv的第三代慢病毒转移质粒，并将其与ICOS跨膜结构域和胞内结构域及CD3ζ一起插入框架中，以形成第二代CAR。膜结合(mb)IL-7是使用通过CD8铰链区连接至CD8 跨膜结构域的IL7的胞外结构域生成的，所述CD8跨膜结构域被插入T2A下游以形成质粒PC035(图3)。为了生产用于转导T细胞的慢病毒，用编码CD19 CAR-mIL7的PC035和包装质粒PC026、 PC027、PC028一起转染293个T细胞。在浓缩和纯化之后，通过 p24级的ELISA测量，测量慢病毒的物理滴度。通过这一程序可以获得2x108个TU。

实例3.T细胞上的CD19 CAR-mbIL7的表达

使用编码CD19 CAR-mIL7的慢病毒转导来自供体的T细胞。 24小时后，使用蛋白L、CD19蛋白和抗IL7抗体，通过流式细胞仪分别检测CD19CAR和膜结合(mb)IL7的阳性。表达水平在表3 中示出。

实例4.CD19 CAR-mbIL7的体内靶细胞杀伤测定。

将CD19 CAR-mbIL7转导的T细胞与Raji细胞一起共培养(E/T 比＝1/3)3天，使用Promega细胞活力试剂盒测量靶细胞杀伤情况。测量完细胞杀伤之后，将CD19 CAR-mbIL7转导的T细胞从共培养体系中分离出来，并与新鲜的Raji细胞再混合(E/T比＝1/3)，并继续培养3天，以进行下一轮细胞杀伤测量。重复这些程序，直到T 细胞丧失对靶细胞的杀伤活性。结果在图4中示出。

实例7.CD20-CAR的细胞毒性测定

将用CFSE预标记的靶细胞(K562、Raji细胞或Nalm-6细胞) 接种于96孔板中的5x10⁴个槽/孔中，并在OpTmizer^TM CTS^TM完全 T细胞扩增基础培养基中，与效应细胞(CAR-CD20转导的T细胞或未转导的T细胞作为对照)一起，以不同的E:T比共孵育4小时。基于流式细胞术的细胞毒性测定是通过以下方式建立的：选出CFSE 阳性群，并且使用Annexin在APC通道上并使用PI在PE通道上进行检测。试验结果表明，CD20-CAR的细胞毒性对CD20阳性细胞呈特异性(图6)，并且在Raji和Nalm-6两个共培养体系中，以10:1 的E/T比达到了大于80％的靶细胞杀伤率。

实例8.CD22-CAR的细胞毒性测定。

将用CFSE预标记的靶细胞(K562、Raji细胞或Nalm-6细胞) 接种于96孔板中的5x10⁴个槽/孔中，并在OpTmizer^TM CTS^TM完全 T细胞扩增基础培养基中，与效应细胞(CAR-CD22转导的T细胞或未转导的T细胞作为对照)一起，以不同的E:T比共孵育4小时。基于流式细胞术的细胞毒性测定是通过以下方式建立的：选出CFSE 阳性群，并且使用Annexin在APC通道上并使用PI在PE通道上进行检测。试验结果表明，CD22-CAR的细胞毒性对CD22阳性细胞呈特异性(图7)，并且在Nalm-6共培养体系中达到了60％的细胞杀伤活性，在Raji共培养体系中达到了40％的细胞杀伤活性。

实例9.双信号CAR的细胞毒性测定

将用CFSE预标记的靶细胞(Raji细胞或Nalm-6细胞)接种于 96孔板中的5x10⁴个槽/孔中，并在OpTmizer^TM CTS^TM完全T细胞扩增基础培养基中，与效应细胞(CAR-CD19/CD20转导的T细胞、 CAR-CD19/CD22和CAR-19-mbIL-7转导的T细胞)一起，以不同的E:T比共孵育4小时。基于流式细胞术的细胞毒性测定是通过以下方式建立的：选出CFSE阳性群，并且使用Annexin在APC通道上并使用PI在PE通道上进行检测。CAR-19-20和CAR-19-22以10:1 的E/T比获得了80％的细胞杀伤率。Car-19-mbIL-17在Raji共培养测定(数据未示出)中，以10:1的E/T比达到了90％的细胞杀伤活性。

实例10.细胞因子生产量化.

将靶细胞(Raji和Nalm-6细胞)接种于96孔板中的5x10⁴个槽/孔中，并与效应细胞一起，以不同的E:T比共孵育4小时和24 小时。通过TR-FRET方法测量培养上清液中的细胞因子浓度(INFγ和IL-2)。在Raji和Nalm-6两个共培养体系中，所有CAR-T细胞都产生了大量的INFγ，而不是IL-2。INFγ的释放被发现与E/T比和靶向细胞杀伤有关。

实例11.CAR-CD19转导后的T细胞分化.

从健康供体中获取PBMC，并分离T细胞，根据制造商 (Invitrogen)的建议，使用戴诺磁珠ClinExVivo CD3/CD28对T细胞进行活化。在第2天，用慢病毒以1.5的感染复数(MOI)转导活化的T细胞。在补充有IL-2(50U/ml)和IL-15(1ng/ml)的完全T 细胞培养基中扩增所有T细胞。在第12天，通过磁力去除戴诺磁珠，然后再体外测定中进一步分析转导的T细胞。通过对CD45RO和 CCR7进行双重染色，评估T细胞亚型分布。在T细胞中进行CAR-CD19转导之后，CD4和CD8两种T细胞亚型中的效应记忆T 细胞群(CCR7-CD45RO+)大幅增加。

实例5.淋巴瘤模型中CD19 CAR-mbIL7的体内研究

将一百万个Raji-GFP-Luc细胞(购自Biocytogen)注射到免疫缺陷型B-NDG(NOD-Prkdcscid IL2rgtm1/Bcgen)小鼠的尾静脉中。在注射Raji-GFP-Luc后的第6天，通过腹膜内注射150mg/kg萤光素来测量肿瘤植入，并在10分钟后，在In Vivo-Xtreme成像系统(Bruker)上成像180秒。将图像重叠在30秒X射线图像上，并将每只小鼠的生物发光信号通量表达为平均辐射率(每球面度每平方厘米每秒的光子数，P/S)。在基于均布的P/S值随机分组后第6天，经由尾部静脉注射，向小鼠给予5×108个CAR T细胞(每千克CD19- CARmbIL7(高剂量)、CD19单CAR)，或5×107个CD19-CAR mbIL7(低剂量)。在治疗后第7、14、28、35、42天进行成像，以建立CAR T细胞对肿瘤生长和肿瘤根除的动力学。

每组疾病的进展和消退的代表性图像在图5中示出。到第15天，对照组中所有动物都因肿瘤快速生长死亡。在给予CD19单CAR T 细胞的动物中出现短期效应(约2周)，并在3周治疗后，肿瘤最终进展，并且在第42天，4/6的动物因肿瘤进展死亡。然而， CD19-mbIL-7剂量较低的CAR治疗在3周治疗后开始产生效果，并大幅减缓了肿瘤生长。到第42天，6只动物中仅一只因肿瘤负荷死亡。有趣的是，与相同剂量的单CD19 CAR T细胞相比，CD19-mbIL-7 的高剂量治疗在2周后产生效果，并使肿瘤生长大大衰退。在高剂量CD19-mbIL-7组中，4/6的动物显示出肿瘤消除。这一组具有高功效的人T细胞，可能会导致荷瘤小鼠产生GVHD效应，并造成非肿瘤过度生长引起的动物死亡。当在人类患者中给予人T细胞时，将不会发生这种现象。尽管为了清晰理解起见通过图示和实例的方式在某种程度上对以上本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员显而易见的是，可进行某些改变和修改。因此，描述和实例不应被解释为限制所公开的本发明的范围。

本文通过标识引文引用的所有的出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容特此通过引用以其整体并入本文。

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Claims (39)

1.一种分离的多核苷酸，其包含编码第一多肽的第一基因和编码第二多肽的第二基因，其中所述第一多肽包含五个或更多以下各项：(i)信号肽，(ii)结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域，(v)ICOS的共刺激信号传导结构域，以及(vi)TCR CD3ζ信号传导结构域；

并且所述第二多肽包含四个或更多以下各项：(i)信号肽，(ii)结合蛋白，(iii)铰链区，(iv)跨膜结构域；其中所述结合蛋白中的至少一个与癌细胞上的抗原结合。

2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一多肽的所述结合蛋白是抗原识别结构域，并且所述第二多肽的所述结合蛋白是免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域，其中所述第一多肽与癌细胞上的抗原结合。

3.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一多肽的所述结合蛋白是免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域，并且所述第二多肽的所述结合蛋白是抗原识别结构域，其中所述第二多肽与癌细胞上的抗原结合。

4.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一多肽的所述结合蛋白包含第一抗原识别结构域，并且所述第二多肽的所述结合蛋白包含第二抗原识别结构域，其中所述第一和第二抗原识别结构域与癌细胞上的不同抗原结合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含编码2A肽的第三基因；其中所述第一基因和所述第二基因通过所述第三基因连接。

6.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一多肽包含靶向于选自以下各项的靶标的结合蛋白：Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、Claudin 8、NY-ESO-1、CD19、CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白MPL、CD30、CD32、CD20、CD70、CD79b、CD99、CD123、CD138、CD179b、CD200R、CD276、CD324、Fc受体样5FcRH5、CD171、CS-1(信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C型凝集素样分子1CLL-1、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III EGFRviii、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2 HLA-A2、B细胞成熟抗原BCMA、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原PSMA、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1ROR1、FMS样酪氨酸激酶3FLT3、成纤维细胞活化蛋白FAP、肿瘤相关糖蛋白TAG-72、CD38、CD44v6、癌胚抗原CEA、上皮细胞粘附分子EpCAM、B7-H3(CD276)、B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2IL-13Ra2、白介素11受体亚基αIL11Ra、间皮素、前列腺干细胞抗原PSCA、血管内皮生长因子受体2VEGFR2、Lewis Y、CD24、血小板衍生生长因子受体βPDGFR-β、蛋白酶丝氨酸21PRSS21、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4SSEA-4、CD20、免疫球蛋白Fc区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2ERBB2、粘蛋白1MUC1、表皮生长因子受体EGFR、神经小粘附分子NCAM、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶PAP、突变型延伸因子2ELF2M、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I IGF-I受体、碳酸酐酶IX CAIX、潜伏膜蛋白2LMP2、黑素细胞蛋白gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2 EphA2、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂Fucosyl GM1、唾液酸Lewis a sLea、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5TGS5、高分子量黑色素瘤相关抗原HMWMAA、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7TEM7R、claudin 6CLDN6、促甲状腺激素受体TSHR、T细胞受体TCR-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、G蛋白偶联受体C类5组成员D GPRC5D、CXORF61蛋白、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶ALK、多唾液酸、胎盘特异性1PLAC1、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原NY-BR-1、uroplakin-2UPK2、甲型肝炎病毒细胞受体1HAVCR1、肾上腺素受体β3ADRB3、泛连接蛋白3PANX3、G蛋白偶联受体20GPR20、淋巴细胞抗原6家族成员K LY6K、嗅觉受体家族51亚家族E成员2OR51E2、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白TARP、威尔姆氏瘤抗原1蛋白WTl、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒HPV E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒HTLV1-Tax、卡波西肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白KSHV K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒EBV编码的糖蛋白350EBB gp350、HIV1包膜糖蛋白gp120、多重自动基因工程MAGE-Al、易位Ets白血病病毒ETV蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员XAGE1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1PCTA-l/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶hTERT、δ样3DLL3、滋养层细胞表明抗原2TROP2、蛋白酪氨酸激酶7PTK7、鸟苷酸环化酶C GCC、甲胎蛋白AFP、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V NA17、配对盒蛋白Pax-3 PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras同源家族成员C RhoC、酪蛋白相关蛋白2TRP-2、细胞色素P4501B1 CYP1B1、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原SART3、PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶LCK、A激酶锚定蛋白4AKAP-4、滑膜肉瘤、X断电2SSX2、晚期糖基化终产物的受体RAGE-1、肾遍在蛋白1RUl、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1LAIR1、IgA受体的Fc片段FCAR、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2LILRA2、CD300分子样家族成员f CD300LF、C型凝集素结构域家族12成员A CLEC12A、骨髓基质细胞抗原2BST2、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2EMR2、淋巴细胞抗原75LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、Fc受体样5FCRL5、免疫球蛋白λ样多肽1IGLL1、FITC、促黄体素受体LHR、促卵泡激素受体FSHR、绒毛膜促性腺激素受体CGHR、CC趋化因子受体4CCR4、神经节苷脂GD3、信号传导淋巴细胞活化分子SLAM家族成员6SLAMF6、SLAMF4、促黄体素受体LHR、促卵泡激素受体FSHR、和绒毛膜促性腺激素受体CGHR；并且所述第二多肽包含选自IL-7、IL-21、IL-15IL-12、IL-2、IL-17、IL15Ra sushi结构域、和TGFb受体中的胞外结构域。

7.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第二多肽包含靶向于选自以下各项的靶标的结合蛋白：Methothelin、Muc 16、Claudin 18.2、Claudin 8、NY-ESO-1、CD19、CD22、CD23、骨髓增生性白血病蛋白MPL、CD30、CD32、CD20、CD70、CD79b、CD99、CD123、CD138、CD179b、CD200R、CD276、CD324、Fc受体样5FcRH5、CD171、CS-1(信号传导淋巴细胞活化分子家族7、SLAMF7)、C型凝集素样分子1CLL-1、CD33、钙粘蛋白1、钙粘蛋白6、钙粘蛋白16、钙粘蛋白17、钙粘蛋白19、表皮生长因子受体变体III EGFRviii、神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、人白细胞抗原A2 HLA-A2、B细胞成熟抗原BCMA、Tn抗原、前列腺特异性膜抗原PSMA、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1ROR1、FMS样酪氨酸激酶3FLT3、成纤维细胞活化蛋白FAP、肿瘤相关糖蛋白TAG-72、CD38、CD44v6、癌胚抗原CEA、上皮细胞粘附分子EpCAM、B7-H3(CD276)、B7-H4、KIT、白介素13受体亚基α-2IL-13Ra2、白介素11受体亚基αIL11Ra、间皮素、前列腺干细胞抗原PSCA、血管内皮生长因子受体2VEGFR2、Lewis Y、CD24、血小板衍生生长因子受体βPDGFR-β、蛋白酶丝氨酸21PRSS21、唾液酸糖脂阶段特异性胚胎抗原4SSEA-4、CD20、免疫球蛋白Fc区、组织因子、叶酸受体α、表皮生长因子受体2ERBB2、粘蛋白1MUC1、表皮生长因子受体EGFR、神经小粘附分子NCAM、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶PAP、突变型延伸因子2ELF2M、肝配蛋白B2、胰岛素样生长因子I IGF-I受体、碳酸酐酶IX CAIX、潜伏膜蛋白2LMP2、黑素细胞蛋白gpl00、bcr-abl、酪氨酸酶、生促红素肝细胞癌A2 EphA2、盐藻糖基化单唾液酸化神经节苷脂Fucosyl GM1、唾液酸Lewis a sLea、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5TGS5、高分子量黑色素瘤相关抗原HMWMAA、邻乙酰基GD2神经节苷脂、叶酸受体β、TEM1/CD248、肿瘤内皮标记相关物7TEM7R、claudin 6CLDN6、促甲状腺激素受体TSHR、T细胞受体TCR-β1恒定链、TCRβ2恒定链、TCRγ-δ、G蛋白偶联受体C类5组成员D GPRC5D、CXORF61蛋白、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶ALK、多唾液酸、胎盘特异性1PLAC1、糖类抗原GloboH、乳腺癌粉化抗原NY-BR-1、uroplakin-2UPK2、甲型肝炎病毒细胞受体1HAVCR1、肾上腺素受体β3ADRB3、泛连接蛋白3PANX3、G蛋白偶联受体20GPR20、淋巴细胞抗原6家族成员K LY6K、嗅觉受体家族51亚家族E成员2OR51E2、T细胞受体γ链交替阅读框蛋白TARP、威尔姆氏瘤抗原1蛋白WTl、癌症-睾丸抗原NY-ESO-1、癌症-睾丸抗原LAGE-la、豆荚蛋白、人乳头瘤病毒HPV E6、HPV E7、人嗜T淋巴细胞病毒HTLV1-Tax、卡波西肉瘤相关疱疹病毒糖蛋白KSHV K8.1蛋白、爱泼斯坦-巴尔病毒EBV编码的糖蛋白350EBB gp350、HIV1包膜糖蛋白gp120、多重自动基因工程MAGE-Al、易位Ets白血病病毒ETV蛋白6-AML、精子蛋白17、X抗原家族成员XAGE1、跨膜酪氨酸蛋白激酶受体Tie 2、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-1、黑色素瘤癌症-睾丸抗原MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原1PCTA-l/半乳凝素8、MelanA/MARTl、Ras突变体、人端粒酶逆转录酶hTERT、δ样3DLL3、滋养层细胞表明抗原2TROP2、蛋白酪氨酸激酶7PTK7、鸟苷酸环化酶C GCC、甲胎蛋白AFP、肉瘤易位断点、黑色素瘤凋亡抑制剂ML-IAP、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、N-乙酰基葡萄糖胺基转移酶V NA17、配对盒蛋白Pax-3PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白Bl、v-myc禽骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤衍生同源物MYCN、Ras同源家族成员C RhoC、酪蛋白相关蛋白2TRP-2、细胞色素P4501B1 CYP1B1、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节样因子)、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原SART3、PAX5、前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶LCK、A激酶锚定蛋白4AKAP-4、滑膜肉瘤、X断电2SSX2、晚期糖基化终产物的受体RAGE-1、肾遍在蛋白1RUl、RU2、肠道羧基酯酶、突变型热激蛋白70-2muthsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1LAIR1、IgA受体的Fc片段FCAR、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2LILRA2、CD300分子样家族成员f CD300LF、C型凝集素结构域家族12成员A CLEC12A、骨髓基质细胞抗原2BST2、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2EMR2、淋巴细胞抗原75LY75、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3、Fc受体样5FCRL5、免疫球蛋白λ样多肽1IGLL1、FITC、促黄体素受体LHR、促卵泡激素受体FSHR、绒毛膜促性腺激素受体CGHR、CC趋化因子受体4CCR4、神经节苷脂GD3、信号传导淋巴细胞活化分子SLAM家族成员6SLAMF6、SLAMF4、促黄体素受体LHR、促卵泡激素受体FSHR、和绒毛膜促性腺激素受体CGHR；并且所述第一多肽包含选自IL-7、IL-21、IL-15IL-12、IL-2、IL-17、IL15Ra sushi结构域、和TGFb受体中的胞外结构域。

8.一种多肽，其包含由权利要求1所述的第一基因编码的肽。

9.一种多肽，其包含由权利要求1所述的第二基因编码的肽。

10.根据权利要求2-4中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述抗原识别结构域是scFv或VHH纳米抗体。

11.一种包含权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸的表达载体。

12.一种表达载体，其包含权利要求11中任一项所述的多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中所述第一结合蛋白与CD19结合；并且所述第二结合蛋白与CD20或CD22结合。

14.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中所述第一结合蛋白与BCMA结合；并且所述第二结合蛋白与CD38、CD138、或CS-1结合。

15.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中所述第一结合蛋白与CD123结合；并且所述第二结合蛋白与CD33或CLL1结合。

16.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中所述第一结合蛋白与PSCA结合；并且所述第二结合蛋白与PSMA结合。

17.根据权利要求12所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞是T细胞或NK细胞。

18.根据权利要求12所述的工程化细胞，其通过基因敲除方法包含PD-1、TIM3、或LAG3的失活基因。

19.根据权利要求17所述的工程化细胞，其中所述T细胞是CD4T细胞或CD8 T细胞。

20.根据权利要求19所述的工程化细胞，其中所述NK细胞是NKT细胞或NK-92细胞。

21.一种药物组合物，其包含权利要求12-20中任一项所述的细胞和药学上可接受的载剂。

22.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向需要其的受试者给予治疗有效量的权利要求12所述的细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述癌症是血癌。

24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述癌症是淋巴瘤。

25.一种用于刺激对人体中的靶细胞群或组织的T细胞介导的免疫应答的方法，所述方法包括向所述人体给予有效量的工程化细胞，所述工程化细胞经基因修饰以表达第一多肽和第二多肽，其中所述第一多肽包含CD19抗原结合结构域、跨膜结构域、4-1BB或ICOS的共刺激信号传导区、和CD3ζ信号传导结构域，并且其中所述第二多肽包含免疫调节细胞因子或细胞因子受体的胞外结构域、跨膜结构域。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述CD19抗原结合结构域与表达CD19的癌细胞特异性结合。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述第二多肽包含IL7、跨膜结构域。

28.一种编码嵌合抗原受体CAR、或编码包含选自SEQ ID NO：6、29、31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53和55中的序列的CAR系统的多核苷酸序列。

29.一种CAR或CAR系统，其包含具有选自SEQ ID NO：20、30、32、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56中的序列的多肽。

30.一种表达SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：32的多肽的工程化细胞。

31.一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的受试者给予治疗有效量的权利要求30所述的细胞，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤NHL、急性成淋巴细胞性白血病ALL或慢性淋巴细胞性白血病CLL。

32.一种表达SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：44的多肽的工程化细胞。

33.一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的受试者给予治疗有效量的权利要求32所述的细胞，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤NHL或慢性淋巴细胞性白血病CLL。

34.一种表达具有选自SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：46、和SEQ ID NO：48中的序列的多肽的工程化细胞。

35.一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的受试者给予治疗有效量的权利要求34所述的细胞，其中所述癌症是B细胞淋巴瘤NHL、急性成淋巴细胞性白血病ALL或慢性淋巴细胞性白血病CLL。

36.一种表达SEQ ID NO：54或SEQ ID NO：56的多肽的工程化细胞。

37.一种用于治疗癌症的方法，其包括向需要其的受试者给予治疗有效量的权利要求36所述的细胞，其中所述癌症是霍奇金淋巴瘤、全身间变性大细胞淋巴瘤、原发皮肤间变性大细胞淋巴瘤pcALCL或表达CD30的蕈样肉芽肿MF。

38.根据权利要求1所述的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：6、29、31、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53和55中的序列。

39.一种由权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽，其包含选自SEQ ID NO：20、30、32、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54和56中的序列。

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