CN116462770A - Cd19的人源化抗体和一种表达双特异性嵌合抗原受体的car-t细胞及其应用 - Google Patents

Cd19的人源化抗体和一种表达双特异性嵌合抗原受体的car-t细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向CD19和CD22的双特异CAR‑T细胞人源化抗体。具体地，本发明提供了两种高亲和力的抗CD19人源化抗体。通过与全人源CD22scFv组合成抗CD19和CD22双靶嵌合抗原受体CD22/KQ‑1‑1和CD22/KQ‑1‑2。该结构包含人源化的抗CD19的抗原结合域，全人源的抗CD22的抗原结合域，跨膜区及胞内信号结构域。本发明使用人源化抗体降低了免疫原性，同时双靶点可以有效避免复发的免疫逃逸现象。

Description

CD19的人源化抗体和一种表达双特异性嵌合抗原受体的CAR- T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及靶向CD19 CAR-T细胞人源化抗体。
背景技术
近年来，嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)在癌症治疗领域取得了重大突破，特别是在血液系统恶性肿瘤中已取得了显著成果。但是，临床研究显示仍有很高比例血液肿瘤患者出现难治或复发，即实现持久缓解任然是一个巨大的挑战。其中，CAR-T细胞增殖水平和其在血液中存在的持续时间可能是治疗缓解持续时间长短的决定性因素之一。
有研究表明，具有人源化或全人源化抗体单链可变区片段(scFvs)的CAR或有望绕过潜在的宿主抗CAR免疫原性并保留抗肿瘤活性。另外，同时靶向多个肿瘤细胞抗原已被提出作为一种治疗策略，以降低抗原表达下调或抗原阴性克隆逃逸介导的复发风险。
因此，对抗抗原的抗体人源化和设计能同时靶向多个抗原靶点的CAR结构十分有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向CD19和CD22的双特异性CAR。
在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体从N端到C端包含：
(i)靶向CD19和CD22的抗原结合结构域，
(ii)跨膜结构域，
(iii)至少一个共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。
在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有下式I所示结构：
S-scFv1-L-scFv2-H-TM-C-CD3ζ(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
S为任选的信号肽序列；
L为无或柔性接头；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
scFv1和scFv2中一个为靶向CD19的抗原结合结构域，另一个为靶向CD22的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述scFv1为靶向CD22的抗原结合结构域，所述scFv2为靶向CD19的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述的scFv1和scFv2为单链抗体可变区片段(scFv)。
在另一优选例中，所述的scFv1为全人源的单链抗体可变区片段；scFv2优选地为人源化的单链抗体可变区片段。
在另一优选例中，所述靶向CD22的抗原结合结构域具有抗CD22抗体的重链可变区和轻链可变区。
在另一优选例中，所述靶向CD22的抗原结合结构域的结构如下式A或式B所示：
VH1-VL1(A)；VL1-VH1(B)
式中，VH1为抗CD22抗体重链可变区；VL1为抗CD22抗体轻链可变区；“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述靶向CS1的抗原结合结构域的结构如式A所示。
在另一优选例中，所述的VH1和VL1通过柔性接头(或连接肽)相连，所述的柔性接头(或连接肽)为1-4个连续的GGGS所示的序列，较佳地2-4个，更佳地3-4个。
在另一优选例中，所述的抗CD22抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述抗CD22抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在另一优选例中，所述靶向CD22的抗原结合结构域序列选自下组：
1)如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；
2)将SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，且具有与1)所述序列相同的CD22结合功能的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域具有抗CD19抗体的重链可变区和轻链可变区。
在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域的结构如下式C或式D所示：
VL2-VH2(C)；VH2-VL2(D)
式中，VL2为抗CD19抗体轻链可变区；VH2为抗CD19抗体重链可变区；“-”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域的结构如式C所示。
在另一优选例中，所述的VL2和VH2通过柔性接头(或连接肽)相连，所述的柔性接头(或连接肽)为1-4个连续的GGGGS所示的序列，较佳地2-4个，更佳地3-4个。
在另一优选例中，所述抗CD19抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或3所示，所述抗CD19抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述靶向CD19的抗原结合结构域序列选自下组：
1)如SEQ ID NO.4或5所示的氨基酸序列；
2)将SEQ ID NO:4或5所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，且具有与1)所述序列相同的CD19结合功能的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述柔性接头S的序列包含2-6个，较佳地为3-4个连续的GGGGS所示的序列。
在另一优选例中，所述的S为选自下组的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的S的信号肽为CD8。
在另一优选例中，所述的S包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的H为选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。
在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8、CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
在另一优选例中，所述的TM包括CD8来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述的TM包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
在另一优选例中，所述的C包括4-1BB来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述的C包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的CD3ζ包含如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。
在另一优选例中，所述核酸分子为分离的。
在另一优选例中，所述核酸分子的5’端还包含启动子序列，较佳地为EF-1α启动子。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。
在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。
在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。
在另一优选例中，所述慢病毒载体中包含启动子，较佳地，所述启动子选自下组：EF-1α、CMV启动子、或其组合。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的CAR。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括真核细胞和原核细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞包括大肠杆菌。
在本发明的第五方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述的免疫细胞表达有如本发明第一方面所述的CAR。
在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在另一优选例中，所述细胞包括T细胞、NK细胞。
在另一优选例中，所述细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞，较佳地为CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞中CAR与细胞自杀元件共表达。
在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第五方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，较佳地1×104-1×107个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的药物组合物还包含抗肿瘤的第二活性成分，较佳地包括第二抗体、或化疗剂。
在另一优选例中，所述的化疗剂选自下组：多西他赛、卡铂、或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第五方面所述的免疫细胞、或如本发明第六方面所述的制剂的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。
在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。
在另一优选例中，所述的肿瘤为CD19和/或CD22阳性肿瘤。
在另一优选例中，所述的CD19和/或CD22阳性肿瘤包括复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、复发/难治性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和大B细胞淋巴瘤(LBCL)。
在本发明的第八方面，提供了一种用于制备如本发明第四方面所述的宿主细胞或如本发明第五方面所述的工程化的免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的如本发明第二方面所述的核酸分子、或如本发明第三方面所述的载体。
在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化的免疫细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供待改造的免疫细胞；和
(b)将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入所述免疫细胞内，从而获得所述工程化的免疫细胞。
在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞为CAR-T细胞或CAR-NK细胞。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。
在本发明的第十方面，提供了一种体外抑制肿瘤细胞的方法，包括步骤：
将肿瘤细胞与如本发明第三方面所述的载体、如本发明第五方面所述的免疫细胞、或如本发明第六方面所述的制剂接触，从而抑制所述肿瘤细胞。
在本发明的第十一方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的如本发明第三方面所述的载体、如本发明第五方面所述的免疫细胞、或如本发明第六方面所述的制剂。
在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述的肿瘤包括复发/难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)、复发/难治性急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和大B细胞淋巴瘤(LBCL)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为本发明双特异CAR的结构CD22/KQ-1-1(图1A)和CD22/KQ-1-2(图1B)
图2为本发明的慢病毒表达载体质粒结构CD22/KQ-1-1(图2A)和CD22/KQ-1-2(图2B)
图3A为本发明的CD19 CAR的表达效率；图3B为本发明的CD22 CAR的表达效率。
图4为CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤实验
图5为细胞因子IL-2(图5A)，TNF-α(图5B)和IFN-γ(图5C)释放检测
图6为CAR-T在老鼠体内的抗肿瘤实验的示意图(图6A)，生存曲线图(图6B)和生物发光成像(图6C)。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地获得了同时靶向CD19和CD22的双特异CAR-T细胞人源化抗体。具体地，本发明提供了两种高亲和力的抗CD19人源化抗体与全人源CD22 scFv组合得到的抗CD19和CD22双靶嵌合抗原受体。该结构包含人源化的抗CD19的抗原结合域，全人源的抗CD22的抗原结合域，跨膜区及胞内信号结构域。本发明使用人源化抗体降低了免疫原性，同时双靶点可以有效避免复发的免疫逃逸现象。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
应理解，本文中氨基酸名称采用国际通用的单英文字母标识，与其相对应的氨基酸名称三英文字母简写分别是：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、I1e(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、Ser(S)、Thr(T)、Trp(W)、Tyr(Y)、Val(V)。
CD19
CD19是B细胞表达的一种CD分子(即白细胞分化抗原)，属于Ig超家族。除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞与FDC都会表达该分子。它是参与B细胞增殖、分化、活化及抗体产生的重要膜抗原，还可促进BCR的信号转导。
CD22
CD22蛋白是I型跨膜蛋白，分子量为140kDa，是唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素家族的重要成员。CD22普遍存在于正常B细胞和B细胞恶性肿瘤中。CD22主要表达于成熟B细胞，是具有调控B细胞激活作用的细胞表面粘附分子。CD22分子是B细胞表面抑制性辅助受体之一，它与B细胞的发展、分化和功能有着密切的关系。
嵌合抗原受体(CAR)
如本文所用，“嵌合抗原受体(CAR)”是一种融合蛋白，其包含能够结合抗原的胞外结构域、与胞外结构域衍生自不同多肽的跨膜结构域，以及至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合受体”、“T-body”或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能够结合抗原的胞外结构域”是指能够结合某一抗原的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”是指已知的作为传递信号以激活或抑制细胞内生物过程的结构域起作用的任何寡肽或多肽。
具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。
如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。较佳地，接头为柔性接头，例如，所述接头为(G4S)n，其中n为1-4。
本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD19或CD22的抗体，较佳地为单链抗体。
在本发明中，本发明的scFv还包括其保守性变异体，指与本发明scFv的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。
在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。
对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。
载体
本发明还提供了编码本发明CAR序列的DNA构建物。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，纽约)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在使用非病毒递送系统的情况下，示例性地使用基因组编辑技术来完成本发明，例如CRISPR-Cas9、ZFN或TALEN。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
DNA构建物进一步包含信号肽编码序列。优选地，该信号肽序列连接在抗原结合结构域的核酸序列上游。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞。转导的T细胞可以诱导CAR介导的T细胞反应。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞经基因修饰以表达本发明的CAR，并且将CAR-T细胞输注给需要的受体。输注的细胞能够杀死受体体内的肿瘤细胞。与抗体疗法不同，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗CD19 scFv、抗CD22 scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可被治疗的适应疾病包括CD19相关的癌症或肿瘤，例如CD19和/或CD22阳性肿瘤或癌症。CD19和/或CD22相关的癌症或肿瘤可以包括实体瘤，特别是肝细胞癌、黑素瘤、卵巢癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌或其组合。
用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述的激活和扩增的细胞可用于治疗和预防在免疫受损的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR修饰的T细胞用于CCL的治疗。在某些实施方案中，本发明的细胞用于治疗有患CCL风险的患者。因此，本发明提供治疗或预防CCL的方法，包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明的人源CD19抗体可以延长CAR-T细胞存续时间，降低由CD19抗原抗体产生的免疫反应，提升CD19-CAR-T的疗效。
(b)本发明的靶向CD19人源化抗体能够高特异性地结合CD19抗原，具有较高的亲和力和生物活性，以及低的免疫原性，结构稳定，成药性良好，对CD19阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤效果。
(c)双靶点19/22-CART可以杀伤CD22单阳性，CD19单阳性和CD22/CD19双阳性的肿瘤细胞，扩大了CART细胞的治疗范围，提升双靶点19/22-CAR-T的治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1质粒构建
设计如图1所示的CAR结构，利用靶向CD19和CD22双靶点CAR进行验证。分别使用鼠源的FMC63筛选得到的两个高亲和力的人源化CD19 scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5)，将其与来自抗体M971的全人源的CD22 scFv(氨基酸序列如SEQ ID NO.8)进行组合。通过酶切连接、转化并挑单克隆，获得载体编号分别为CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2。CAR结构元件还包含氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的跨膜结构域；氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示的共刺激结构域；氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示的激活结构域。双靶向CAR为氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的CD22/KQ-1-1和氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的CD22/KQ-1-2。
实验例2制备慢病毒及感染T淋巴细胞
本实施例包装慢病毒采用HD转染试剂(Promega)试剂盒，具体为用含有10％FBS的DMEM培养基培养293T细胞至最佳状态，慢病毒3代包装系统的包装质粒和表达质粒按比例加入到15mL离心管中。然后加入3倍体积的/>HD转染试剂。混匀室温静置15min后加入到准备好的293T细胞中。并于48h和72h后收集细胞上清，纯化病毒和冻存备用。
实验例3CAR-T细胞感染效率及表型的检测
利用免疫磁珠法分离T细胞：复苏PBMC，加入5倍体积的X-VIVO 15重悬细胞。然后300g，离心10min。去上清，按照一定比例悬浮细胞，同时加入相应体积的CD3磁珠，混匀后静置在4℃15min。清洗细胞和重悬细胞后，用MACS柱子进行分离。阳性分离得到的细胞即为T细胞。用含有10％ FBS的X-VIVO 15培养基培养。同时，加入激活剂TransAct激活48h后加入一定感染复数(MOI)慢病毒。感染5天后检测CAR阳性率，检测方法为流式检测，抗体为：APCanti-human CD19 Antibody(biolegend),APC anti-human CD22Antibody(biolegend)。
结果：如图3所示，双特异性的CAR-T细胞CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2的CD19 CAR阳性率分别是49.8％和70.7％。他们CD22 CAR阳性率分别是67.2％和68.2％。证明CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2结构的质粒包装的慢病毒能有效地感染T细胞。
实验例4双靶点CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤实验
首先，收集肿瘤细胞(Raji靶细胞)，用PBS缓冲液将细胞洗涤一次，1000rpm离心3min。弃上清，以含1％ FBS的X-VIVOTM 15重悬细胞，计数，最终将细胞稀释到2e5/ml浓度；然后，收集CAR-T细胞(效应细胞)，用PBS缓冲液将细胞洗涤一次，1000rpm 3min离心，弃上清，1％ FBS的X-VIVO 15重悬细胞，计数，将细胞分别稀释为4e5/mL、2e5个/mL、1e5个/mL、0.5e5/mL浓度,效靶比分别为4:1、2:1、1:1、0.5:1(根据CAR-T阳性细胞来计算)；准备好细胞后，分别取50uL靶细胞和50uLCAR-T细胞1:1混合加入96孔板中，37℃、5％ CO2共同培养18小时。共孵育18h后，每孔分别加入100ul ONE-GloTM luciferase Assay System检测底物。混匀并静置5分钟后放入TECAN酶标仪上检测荧光(波长560nm)。
结果：如图4所示，双特异性的CAR-T细胞CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2跟对照双CAR-T细胞CD19/CD22 positive control以及相应对照的单靶CAR-T细胞在不同效靶比下有相同的杀伤趋势，证明CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2结构的CAR-T细胞能有效的杀伤肿瘤靶细胞。
实验例5双靶点CAR-T细胞与靶细胞K562-WT,Raji和Nalm6共孵育时细胞因子IL-2,TNF-α和IFN-γ释放检测。
首先收集CAR-T细胞和靶细胞，用稀释缓冲液将细胞洗涤一次，1000rpm离心3min，弃上清，以含1％ FBS的X-VIVOTM 15重悬细胞，计数。最终将细胞稀释到1e6个/ml浓度备用；然后，将100uL靶细胞和100uL CAR-T细胞1:1混合加入96孔板中，37℃、5％ CO2共同培养20-24小时后；1000rpm离心5min，收集上清。使用人TH1/TH2细胞因子CBA分析试剂盒(BD)检测细胞因子。
结果：如图5A(IL-2)、图5B(TNF-α)和图5C(IFN-γ)所示。从图中可以看出，CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2结构的CAR-T细胞被靶细胞Raji和Nalm6刺激时释放出大量的细胞因子IL-2,TNF-α和IFN-γ。特别是与Raji细胞作用是，释放的细胞因子TNF-α和IFN-γ明显高于其他对照CAR-T细胞。
实验例6双靶点CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤实验
首先准备小鼠(6-8周)，每组5只。通过尾静脉对每只小鼠注射1e6Raji-luciferase细胞。3天后注射CAR-T细胞，注射细胞数目为5e6。体内实验流程如6-1所示。实验组包含CD22/KQ-1-1,CD22/KQ-1-2,CD19/22P ctrl(阳性对照)(CD19为FMC63,CD22为M971，来源于本领域CD19-CD22双特异性CAR-T(Dai H,et al.J Hematol Oncol.2020))，NT(没有转导CAR的T细胞)和PBS。
结果：如图6B和6C所示，在第17天时，PBS组，即未注射T细胞小鼠全部死亡。NT组有明显的肿瘤细胞生长，双靶CAR-T组CD22/KQ-1-1、CD22/KQ-1-2和双靶CAR-T对照组CD19/22P Ctrl有效的在体内控制了肿瘤细胞的扩增，证明双靶CAR-T在小鼠体内非常有效。在第45天时，为了进一步验证双靶CAR-T在体内的长期持续性，重新注射1e6 Raji-luciferase细胞。PBS组在D42重新注射1e6 Raji-luciferase细胞到新NOG小鼠中。在D45天，未注射T细胞，在D52天有明显肿瘤扩增，且在D65天小鼠全部死亡。NT组和CD19/22P Ctrl组有明显肿瘤扩增，且到第65天时，分别有3只小鼠死亡。CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2结构的CAR-T组没有明显的肿瘤细胞扩增，证明双靶CD22/KQ-1-1和CD22/KQ-1-2结构的CAR-T在体内比NT组和CD19/22P Ctrl组更持久有效。
本发明的序列：
SEQ ID NO.1：CD19 VL1
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.2：CD19 VH4
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLNSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.3：CD19 VH3
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.4：KQ-1-1(CD19 VL1+CD19 VH4)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLNSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.5：KQ-1-2(CD19 VL1+CD19 VH3)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.6：CD22 m971 VH
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS
SEQ ID NO.7：CD22 m971 VL
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.8：CD22(m971 VH+m971 VL)
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO.9：CD22/KQ-1-1
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIKEAAAKEAAAKEAAAKDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTISKDNSKNQVSLKLNSVTAADTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.10：CD22/KQ-1-2
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SEQ ID NO.11：跨膜结构域；
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO.12：共刺激结构域；
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELR
SEQ ID NO.13：CD3ζ激活结构域。
VKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.14：信号肽
MALPVTALLLPLALLLHAARP
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体从N端到C端包含：
(i)靶向CD19和CD22的抗原结合结构域，
(ii)跨膜结构域，
(iii)至少一个共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体具有下式I所示结构：
S-scFv1-L-scFv2-H-TM-C-CD3ζ(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
S为任选的信号肽序列；
L为无或柔性接头；
H为任选的铰链区；
TM为跨膜结构域；
C为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
scFv1和scFv2中一个为靶向CD19的抗原结合结构域，另一个为靶向CD22的抗原结合结构域。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD22的抗原结合结构域序列选自下组：
1)如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；
2)将SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，且具有与1)所述序列相同的CD22结合功能的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向CD19的抗原结合结构域序列选自下组：
1)如SEQ ID NO.4或5所示的氨基酸序列；
2)将SEQ ID NO:4或5所示的氨基酸序列经过至少一个(如1-20个、较佳地1-15个、更佳地1-10个、更佳地1-8个、更佳地1-3个、最佳地1或2个)氨基酸残基的取代、缺失、修饰和/或添加而形成的，且具有与1)所述序列相同的CD19结合功能的氨基酸序列。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。
6.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有如权利要求6所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求5所述的核酸分子或表达如权利要求1所述的CAR。
8.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞表达有如权利要求1所述的CAR。
9.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体、或如权利要求8所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
10.一种如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的载体、或如权利要求8所述的免疫细胞、或如权利要求9所述的制剂的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。
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