CN110218702B - 靶向cd138和cd19的免疫细胞组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶向CD138和CD19的免疫细胞组合及其应用。具体地，本发明公开了靶向CD138的CAR‑T细胞和靶向CD19的CAR‑T细胞的免疫细胞组合，所述的免疫细胞组合可以用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂。本发明还提供了包含所述免疫细胞组合的药物组合物和制剂。
Description
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，更具体地涉及靶向CD138和CD19的免疫细胞组合及其应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(MM)是一种非常严重的恶性浆细胞病，肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞。其特征为骨髓浆细胞异常增生并且伴有单克隆免疫球蛋白或M蛋白过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高血钙症、贫血、肾脏损害。每100000人中就有5人患MM，总人数大约占血液瘤的10％，是第二大血液瘤。传统的治疗方式有自体干细胞移植，然而这种治疗形式缺陷严重，高剂量使用会造成高的发病率和死亡率，而且容易造成移植物抗宿主病。另外还有应用免疫调节药物的，比如来那度胺、萨利多安和泊马度胺，还有一些蛋白酶体抑制剂，比如硼替佐米、卡非佐米。但是治疗效果并不明显，MM还是很容易复发，新的治疗方法需要被发现和应用。
嵌合抗原受体(CAR)是依据识别肿瘤表面相关抗原或特异性抗原而对肿瘤细胞进行有效杀伤的技术。CAR的scFv可以使T细胞识别肿瘤细胞，CD3ζ的ITAM序列可以对T细胞进行有效的激活，提高杀伤功能。第一代CAR-T细胞胞内只有CD3ζ，仅具有部分持续性和杀伤能力。二代CAR在一代CAR的基础上多了一个共刺激分子，比如OX40(CD134)、CD28、4-1BB(CD137)、CD27，在治疗B-ALL中，针对CD19抗原的二代CAR已经到了临床1期，完全缓解率高达88％。三代CAR有两个共刺激分子串连，一般是CD28和CD137两个分子共存。在体外，三代CAR比二代CAR释放更多的有利细胞因子，对某些靶点效果更好。
CD138(syndecan-1)在MM细胞系和病人样本中都是高表达的，并且在检测的306位患者中，CD138百分之百表达，但是T细胞和B细胞上不表达CD138抗原。另外，CD138促进骨髓瘤细胞的生长、增殖以及肿瘤相关的血管新生，加上肿瘤细胞表面高表达的原因，使得CD138成为一个非常有潜力的靶点。关于针对CD138的一代CAR在体外已经证明是非常成功的。中国人民解放军总医院曾使用针对CD138靶点的4-1BBζ二代CAR对5位MM患者进行治疗，取得显著成果。
目前，本领域利用CAR治疗MM的细胞免疫疗法还有很多不足，还存在复发率高、安全性低等问题。因此，本领域迫切需要开发特异性好、疗效稳定、副作用小的治疗MM的细胞免疫疗法。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向CD138和CD19的免疫细胞组合及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种免疫细胞组合的用途，所述的免疫细胞组合包括靶向CD138的CAR-T细胞和靶向CD19的CAR-T细胞，并且，所述的免疫细胞组合用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂。
在另一优选例中，所述肿瘤为血液肿瘤，较佳地为多发性骨髓瘤。
在另一优选例中，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为(3-8)：1，较佳地为(4-6)：1，更佳地为5:1。
在另一优选例中，所述的靶向CD138的CAR-T细胞的细胞膜上表达有结构如下式I所示的第一CAR：
L1-scFv1-H1-TM1-C1-CD3ζ (I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L1为任选的信号肽序列；
scFv1为靶向CD138的抗原结合结构域；
H1为任选的铰链区；
TM1为跨膜结构域；
C1为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述的scFv1的结构如下式A所示：
VL1－VH1(A)
其中，VL1为抗CD138抗体轻链可变区；VH1为抗CD138抗体重链可变区；“－”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述的scFv1的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述靶向CD19的CAR-T细胞的细胞膜上表达有结构如下式II所示的第二CAR：
L2-scFv2-H2-TM2-C2-CD3ζ(II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L2为任选的信号肽序列；
scFv2为靶向CD19的抗原结合结构域；
H2为任选的铰链区；
TM2为跨膜结构域；
C2为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在另一优选例中，所述的scFv2的结构如下式B所示：
VL2－VH2(B)
其中，VL2为抗CD19抗体轻链可变区；VH2为抗CD19抗体重链可变区；“－”为连接肽或肽键。
在另一优选例中，所述的scFv2的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述的L1,L2各自独立地为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的L1为GM-CSF信号肽。
在另一优选例中，所述的L2为GM-CSF信号肽。
在另一优选例中，所述的H1,H2各自独立地为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。
在另一优选例中，所述的H1为IgG4 Fc。
在另一优选例中，所述的H2为IgG4 Fc。
在另一优选例中，所述的TM1,TM2各自独立地为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。
在另一优选例中，所述的TM1为CD28来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述的TM2为CD28来源的跨膜区。
在另一优选例中，所述的C1,C2各自独立地为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。
在另一优选例中，所述的C1为CD28来源的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述的C2为CD28来源的共刺激信号分子与CD137来源的共刺激信号分子的组合。
在本发明的第三方面，提供了一种免疫细胞组合，所述的免疫细胞组合包括靶向CD138的CAR-T细胞和靶向CD19的CAR-T细胞。
在另一优选例中，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为(3-8)：1，较佳地为(4-6)：1，更佳地为5:1。
在另一优选例中，所述的免疫细胞组合用于预防和/或治疗肿瘤。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物或制剂，所述的药物组合物或制剂包括本发明第二方面的所述的免疫细胞组合和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂为注射剂。
在本发明的第四方面，提供了一种预防和/或治疗肿瘤的方法，包括步骤：
给需要的对象施用本发明第二方面的所述的免疫细胞组合或本发明第三方面的所述的药物组合物或制剂。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了CAR的构建。其中，图1A显示了CD138-CAR和hCD19-CAR的结构以及慢病毒载体的结构，CD138-CAR序列依次为信号肽、scFv、Fc、CD28以及CD3ζ。其中，hCD19-CAR为三代CAR(增加4-1BB)。图1B显示了CD138-CAR和hCD19-CAR的阳性率检测结果。图1C显示了CAR的MFI检测结果。其中，分别进行了三次平行实验。图1D显示了WB检测CD3融合蛋白的表达。图1E显示了CAR表型的检测结果，显示CAR-T细胞中CD4细胞和CD8细胞的阳性率。
图2显示了CD138-T细胞对CD138阳性的MM细胞的高毒性。其中，图2A和图2B分别显示了CD138-T细胞对8226(A)和U266(B)的杀伤，采用CFSE/7-AAD的检测方式，效靶比分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1。图2C和图2D分别显示了LDH释放方式检测的验证CD138-T对8226(C)和U266(D)的毒性的结果。每组进行三次平行实验。
图3显示了hCD19-T细胞对CD19阳性的细胞的高毒性。其中，图3A和图3B分别显示了hCD19-T细胞对MAVER-1(A)和JeKo-1(B)的杀伤，采用CFSE/7-AAD的检测方式，效靶比分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1。图3C和图3D分别显示了采用LDH释放方式检测的验证hCD19-T对MAVER-1(C)和JeKo-1(D)的毒性的结果。每组进行三次平行实验。
图4显示了CD138-T细胞和hCD19-T细胞对肿瘤细胞的特异性验证。其中，图4A和图4B分别显示了CD138-T细胞对K562-CD138(A)和K562(C)细胞的杀伤，将细胞共孵育18小时，然后检测肿瘤细胞死亡率。图4C和图4D分别显示了hCD19-T细胞对K562-CD19(B)和K562(D)细胞的杀伤，将细胞共孵育18小时，然后检测肿瘤细胞死亡率。每组杀伤均做三个平行组。
图5显示了CAR-T细胞对肿瘤杀伤上清中颗粒酶B和干扰素γ的检测。效应细胞和靶细胞(4×105)共孵育18h后，进行检测。CD138-T细胞和靶细胞共孵育后检测颗粒酶B(图5A)and IFN-γ(图5C)的释放量。hCD19-T细胞和靶细胞共孵育后检测颗粒酶B(图5B)andIFN-γ(图5D)的释放量。每组检测均做三个平行组。
图6显示了在小鼠体内联合应用CD138-T和hCD19-T细胞杀伤MM细胞。图6A显示了各实验组的小鼠生存期，将5-6周龄的雌性NCG小鼠皮下注射RPMI8226(5×106)细胞，然后被随机分到4组里，组1回输PBS，组2回输UNT细胞，组3回输CD138-T细胞，组4回输CD138-T细胞和hCD19-T细胞，并记录小鼠生存期。图6B显示了各实验组的小鼠肿瘤体积，每周测量小鼠肿瘤2-3次。图6C显示了各实验组的小鼠体重，每周称量小鼠体重2-3次。
图7显示MM和MCL高表达相应的抗原。图7A显示染上带FITC荧光的抗体后，检测8226和U266表面CD138的表达。图7B显示染上带PE-CY5荧光的抗体后，检测MCL表面CD19抗原的表达。
图8显示构建K562-CD138和K562-CD19稳定细胞株。图8A显示分别检测K562-CD138和K562-CD19细胞表面CD138和CD19抗原的表达。图8B显示检测K562细胞表面CD138和CD19抗原的表达。
图9显示了检测回输的CAR-T细胞的阳性率的结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现靶向CD138和CD19的免疫细胞组合可以用于治疗多发性骨肉瘤。实验表明，本发明构建的CD138-CAR和CD19-CAR具有极高的毒性和特异性，杀伤过程中还释放大量的颗粒酶B和IFN-γ，尤其是CD138-T细胞对MM细胞系的杀伤能力极强。小鼠肿瘤模型实验中，CD138-T和hCD19-T细胞联合作用取得了非常好的治疗效果，有一只小鼠的到完全缓解，联合治疗组小鼠生存期也明显长于其他组中的小鼠。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明提供了两种CAR，分别是靶向CD138的CAR和靶向CD19的CAR。
本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。
在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD138或CD19的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28、4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。
如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别CD138或CD19的抗体，较佳地为单链抗体。
对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
本发明的CAR中的胞内结构域包括CD28、4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。
载体
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。
制剂
本发明提供了一种含有本发明免疫细胞组合以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的制剂或药物组合物。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/ml，更优地1×104-1×107个细胞/ml。
在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。
治疗性应用
本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD138或CD19，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。
因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-T细胞。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括抗CD138scFv或抗CD19scFv、铰链和跨膜区、CD28和/或4-1BB、和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。
本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。
除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明提供了一种包含CD138-CAR T细胞和CD19-CART细胞的免疫细胞组合，二者具有协同效果。
(b)本发明的免疫细胞组合对MM细胞系的杀伤能力极强，具有非常好的治疗效果，可以显著延长小鼠生存期
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料和方法
1.细胞系和细胞培养
人套细胞淋巴瘤MAVER-1和JeKo-1、多发性骨髓瘤RPMI8226和U266、以及K562细胞均购自ATCC。RPMI8226、U266、MAVER-1、JeKo-1和K562细胞均在RPMI1640培养基中进行培养，HEK293T在DMEM培养基中进行培养。健康人外周血T细胞培养在TexMACSTMGMP培养基中进行培养，并且所有细胞都是在含有5％CO2、37℃的环境进行培养。
2.CD138-CAR和hCD19-CAR construction
CD138-CAR构建的是二代CAR，hCD19-CAR构建的是三代CAR，构建方法采用常规CAR构建方法，具体地，是将CD138 scFv构建到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro上，后面是跨膜的Fc序列，接下来是共刺激因子CD28胞内区序列，然后是CD3ζ序列，所形成的就是二代CAR；同样，将hCD19 scFv构建到慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro上，后面是跨膜的Fc序列，接下来依次是CD28胞内区序列，CD137胞内区序列，CD3ζ序列。
3.慢病毒和转染T细胞
慢病毒的制备在采用本领域常规构建方法。CAR-T细胞的构建过程是，将抽取的健康人外周血加以处理，分离出T细胞，放于24孔板中培养，每孔种植1×106个T细胞，体系为1毫升培养基，然后每孔加入10ul anti-CD3/CD28 beads(Miltenyi biotec)，beads和T细胞比例大约为3：1。激活48h后将T细胞转移到48孔板中，用浓缩后的病毒上清(MOI＝5)转染T细胞，每孔种植1×106个激活后的T细胞，终体系为100ul，转染15小时后去除上清，加入培养基进行培养，转染后的细胞分别为CD138-T和hCD19-T细胞。T细胞从激活、转染到以后的培养都是在TexMACSTMGMP medium(Miltenyi biotec)培养基中进行的，整个T细胞培养过程都要加IL-2，浓度为40IU/ml。转染效率在FACSCalibur(BD Biosciences)上进行检测。
4.流式细胞术和蛋白质免疫印迹
RPMI8226、U266、JeKo-1、MAVER-1、K562细胞被收集起来，离心弃掉上清，然后用PH7.4的磷酸缓冲液(PBS)重悬洗一遍，染上相应抗体。RPMI8226、U266分别染FITC荧光的CD138抗体(BD)，JeKo-1、MAVER-1染带PE-cy5荧光的CD19抗体。T细胞被转染后培养72h染带APC荧光的Fc抗体(BD)，然后检测阳性率，T细胞并且分别染带FITC荧光的CD4抗体(BD)和带FITC荧光的CD8抗体(BD)检测表型。K562细胞被检测本底的CD138和CD19抗原的表达量，构建后表达CD138(K562-CD138)和CD19(K562-CD19)抗原的K562细胞分别染CD138和CD19抗体，所有细胞染上抗体后都是37℃孵育20-25min，用PBS清洗三遍后，在FACSCalibur(BDBiosciences)机器检测分析。
取适量转染后的CAR-T细胞和UNT细胞，提取总蛋白后做蛋白质免疫印迹，一抗为小鼠来源的anti-CD3ζ抗体(BD)，二抗为带HRP山羊抗小鼠的抗体(Solarbio)。
5.K562-CD138和K562-CD19细胞的构建
为了验证本发明所构建的CAR-T杀伤的靶点针对性，将CD138抗原和CD19抗原分别构建到K562细胞上，使K562细胞正常表达CD138和CD19抗原分子，构建方式采用本领域常规构建方法。在NCBI上查找相应的CD138和CD19抗原序列，应用SignaIP 4.1Server软件和Uniprot软件进行处理，然后插入到pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP载体上，包装成慢病毒，对K562细胞进行转染6h，之后进行培养。然后染上相应抗体后在FACSAriaTMIII Cell Sorter(BD Biosciences)上分选，直至阳性率基本达到百分之百。
6.体外杀伤
在体外杀伤的CD138-T效应细胞对应的靶细胞是MM细胞系RPMI8226、U226和构建的K562-CD138细胞，hCD19-T效应细胞对应的靶细胞是套细胞淋巴瘤MAVER-1、JeKo-1和构建的K562-CD19细胞。转染后的T细胞和未转染的T细胞(UNT)对靶细胞的杀伤采用了两种方式，一种是CSFE/7-AAD流式检测方式，具体来讲就是取靶细胞于15ml离心管中，PBS重悬，加微量CSFE(carboxyfluorescein diacetatesuccinimidyl ester)于37℃孵育10min，取靶细胞4×105个于24孔板中，再加入相应数量的T细胞，混匀，终体系为1.5ml。效应细胞和靶细胞共培养18h，然后去除上清，PBS重悬后每组加入1ul 7-AAD(7-aminoactinomycin D；BDPharmingen)，然后在FACSCalibur(BD Biosciences)机器上进行检测。CSFE阳性细胞群为靶细胞，该群里边7-AAD阳性的细胞群所占比例即为靶细胞的死亡率。
另一种杀伤是检测肿瘤细胞的LDH释放量，用到时试剂盒是CytoToxNon-Radioactive Cytotoxicity Assay(Promega；USA)，整个过程严格遵照生产商的指导说明。将每组杀伤上清各取50ul置于96孔板中，每孔再加入50ul CytoTox/>reagent，反应半小时后每孔各加入50ul stop solution，反应1h后在酶标仪读数，吸收波长为490nm，同时测定靶细胞自然死亡的数值、效应细胞自然死亡的数值和靶细胞完全死亡的数值。每组的杀伤效率如下公式：
每组杀伤效率(％)＝(实验组数值－效应细胞自然死亡数值－靶细胞自然死亡率数值)/(靶细胞完全死亡数值－靶细胞自然死亡数值)×100％
7.IFN-γ和颗粒酶B的检测
T细胞对肿瘤杀伤时会释放一些细胞因子，IFN-γ和颗粒酶B就是主要的两种。为了从侧面检测T细胞对靶细胞的杀伤，检测了UNT细胞和CD138-T细胞的IFN-γ和颗粒酶B的释放量。设定0.25:1和0.5:1的效靶比两组，靶细胞为4×105个，体系为1.5ml，共培养18h，然后用流式细胞小球微阵列术(CBA)的方式进行检测，所用到的试剂有IFN-γKit(人IFN-γFlex Set；BD)和颗粒酶B Kit(人颗粒酶B Flex Set；BD)。具体讲就是每组各取50ul上清，加入细胞因子捕获微球室温孵育1h，然后加入相应的细胞因子抗体，室温孵育2h，漂洗缓冲液洗两次，然后在流式机器(NovoCyte；ACEA)上进行检测，数据用软件FCAP Array v3处理，各做三个平行组实验。
8.体内实验
为了检测CAR-T细胞在体内是否仍然有效果，本次试验以小鼠为模型。采购5-6周龄的NODPrkdcem26Cd52 Il2rgem26Cd22Nju小鼠(购自南京大学模式动物研究中心，NCG)24只，每只背部右侧皮下注射5×106个RPMI8226细胞，体系为70ul PBS加30ul matrigel(BDBiosciences)，共100ul。待瘤长到50mm3，开始治疗，小鼠被随机分成4组，每组6只：(i)每只小鼠注射100ul PBS；(ii)每只小鼠注射1×107个未转染的T细胞(UNT)(100ul)；(iii)每只小鼠注射1×107个CD138-T细胞(100ul)；(iiii)每只小鼠注射1×107个CD138-T细胞(100ul)加2×106个hCD19-T细胞(50ul)。CAR-T细胞的注射方式都采用尾静脉注射，治疗分为三次，肿瘤种下后第7、9、13天分别回输一次。每周测量小鼠体重和瘤大小2-3次，瘤的体积计算公式如下：4π/3×(肿瘤长度/2)×(肿瘤宽度/2)2。
整个动物实验过程严格遵照动物保护制度和苏州大学实验动物管理条例。待小鼠快要死亡时或者肿瘤直径达到15mm，人性化地给予小鼠安乐死。
9.数据分析
体外数据是用软件GraphPad Prism 5和Social Sciences 23.0(SPSS Inc.,USA)来进行处理的，每组都至少进行了三次重复试验，用Student’s t test分析，P值小于0.05被认为有效果。小鼠生存曲线用KaplanMeier方法来处理，生存数据分析用log-rank(Mantel-Cox)分析，P值小于0.05被认为是有效的。
实施例1
骨髓瘤细胞系表面CD138抗原的检测和淋巴瘤细胞系表面CD19抗原的检测
首先检测了MM细胞系RPMI8226和U266细胞表面CD138抗原的表达，以及作为辅助细胞的CD19抗原高表达的MAVER-1和JeKo-1细胞
结果如图7所示，RPMI8226和U266细胞都高表达CD138抗原(图7A)。此外，MAVER-1和JeKo-1细胞都高表达CD19抗原，CD19抗原表达率如图7B所示。
实施例2
CD138和hCD19特异性CAR-T细胞的构建和表达
CD138-CAR构建的是二代CAR，hCD19-CAR构建的是三代CAR(图1A)，CD138和hCD19的cDNA包含重链和轻链，前面含有信号肽序列(MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP)，后面是Fc序列和共刺激因子序列、CD3ζ，然后将该序列构建到带有嘌呤霉素序列的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopPuro载体上(图1A)。具体构建方案见材料和方法。
将构建好的CD138-CAR和hCD19-CAR转染到激活后的健康人T细胞内，CD138-T细胞的表达率为65％-85％，hCD19-T细胞的表达率为70％-85％(图1B)。并且CD138-T细胞和hCD19-T细胞的平均荧光强度都非常高(图1C)。转染后的T细胞中CD4+、CD8+的T细胞的阳性率的情况如图1E所示。
为了确认CAR确实转到了T细胞体内，并且得到表达，进行Western Bloting来检测CD3ζ融合蛋白的表达(图1D)。T细胞本身的内源化的CD3ζ大约为15kD，二聚体为30kDa，CD138-T和hCD19-T CD3ζ外源融合蛋白清晰地在胶片上显现出来。
实施例3
CD138-T细胞增加对MM细胞系的杀伤
为了检测相对于未转染的T细胞(UNT)，CD138-T细胞是否能够提高对MM细胞的杀伤，用CSFE/7-AAD染色的方式进行了相应的检测。靶细胞为CD138高表达的MM细胞系RPMI8226和U266细胞(图7)，应用的效靶比都比较低，分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1，杀伤时间为18小时。
结果如图2A和2B所示，对于靶细胞RPMI8226，相对于UNT，CD138-T细胞很明显地提高了杀伤能力(5.4±2.8％vs 25.7±1.9％for E:T＝0.25:1P＝0.0001,9.2±1.1％vs39.4±3.1％for E:T＝0.5:1P＝0.0001,13.9±2.3％vs 51.5±4.1％for E:T＝1:1P＝0.0001,26.3±2.0％vs 54.5±6.1％for E:T＝2:1P＝0.001)(图2A)。同样的，CD138-T细胞对CD138高表达的U266细胞的杀伤能力也非常大，而UNT细胞在0.25:1的效靶比中几乎对U266细胞没有杀伤能力，效靶比为2:1时，杀伤率也仅为28％，其他效靶比例时CD138-T的杀伤能力更是远远地高于UNT(4.7±3.8％vs 15.2±4.9％for E:T＝0.25:1P＝0.04,7.3±3.4％vs 27.3±6.5％for E:T＝0.5:1p＝0.009,12.3±1.5％vs 43.7±3.2％for E:T＝1:1p＝0.0007,28.0±1.5％vs 57.9±7.5％for E:T＝2:1p＝0.002)(图2B)。
为了进一步确认CD138-T细胞对MM的高杀伤能力，用另一种杀伤方式进行验证，即乳酸脱氢酶(LDH)释放分析法，杀伤时间同样是18个小时，效靶比为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1。
结果如图2C和2D所示，CD138-T细胞确实大大提高了对RPMI8226和U266细胞的杀伤能力，效靶比为0.25:1时，UNT细胞对RPMI8226和U266细胞的杀伤率仅为7％和2.5％，而CD138-T细胞对他们的杀伤率为45％和32％，其他效靶比也是实验组远远高于对照组(图2C和图2D)。LDH杀伤分析方式中，实验组中靶细胞死亡率比用流式分析方法高20％左右，而对照组中靶细胞死亡率变化不大。
综上来看，转载有CD138CAR的T细胞明显地提高了对MM细胞的毒性。
实施例4
hCD19-T细胞增加了对表达CD19抗原分子的细胞的杀伤
由于表达CD19抗原的MM细胞少到几乎检测不到，没有办法用CD19+MM细胞做为靶细胞，来检测本发明构建的人源化CD19-T细胞是否对表达CD19抗原的细胞具有显著的杀伤能力，所以以两株CD19抗原高表达的细胞系来验证hCD19-T细胞的的功能，具体为套细胞淋巴瘤MAVER-1和JeKo-1，MAVER-1和JeKo-1的CD19抗原表达率分别为94％和80％(图7)。采用CSFE/7-AAD染色的方法来进行验证，杀伤时间为18小时，同样设了四组，效靶比分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1。
结果如图3A和3B所示，hCD19-T细胞对两种靶细胞的杀伤率远远超过了UNT细胞。对于靶细胞MAVER-1来说，hCD19对它的杀伤率在70％-85％之间，即便是最低效靶比，实验组也达到了70％，而对照组UNT对之杀伤率不到10％(6.7±2.3％vs 70.7±4.9％for E:T＝0.25:1p＝0.003,11.2±3.4％vs 71.8±9.4％for E:T＝0.5:1p＝0.0003,16.2±3.8％vs 81.6±3.2％for E:T＝1:1p＝0.0001,35.2±6.4％vs 82.5±1.5％for E:T＝2:1p＝0.0002)(图3A)。对于靶细胞JeKo-1来说，hCD19-T细胞杀伤效果也是非常明显的。由于JeKo-1细胞CD19抗原分子表达率少于MAVER-1细胞，hCD19-T细胞对它的杀伤效率稍低于MAVER-1细胞，在60％-75％之间。效靶比为0.25:1时，hCD19-T细胞对JeKo-1细胞的杀伤率是UNT的6倍，其他效靶比时，实验组也是远远高于对照组(9.25±1.6％vs 60±14.3％forE:T＝0.25:1p＝0.004,16.4±2.2％vs 71.5±11.8％for E:T＝0.5:1p＝0.001,19.8±1.3％vs 76.9±1.2％for E:T＝1:1p＝0.0001,31.8±3.4％vs 76.0±3.1％for E:T＝2:1p＝0.0001)(图3B)。
同样，采用LDH释放分析法再次验证hCD19-T细胞对表达CD19抗原分子细胞的杀伤能力。效靶比依然为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1，杀伤时间18个小时。
结果如图3C和3D所示，对两种靶细胞MAVER-1和JeKo-1的杀伤，LDH释放分析方法和流式检测分析方法结果基本一致(图3C和图3D)。两种不同的检测方法都有力地证明了hCD19-T细胞对表达CD19抗原分子的细胞有着很强的杀伤能力。
实施例5
CD138 CAR和hCD19 CAR分别对CD138和CD19抗原阳性的细胞具有特异性
为了验证CD138-T细胞和hCD19-T细胞分别对CD138和CD19抗原表达的细胞的杀伤具有特异性，换言之，T细胞转了CAR并不是对所有细胞都具有如此高的杀伤能力。为了验证这一点，选择CD138抗原和CD19抗原皆为阴性的K562细胞(图8B)，以K562细胞为母体，构建了表达CD138抗原(K562-CD138)和CD19(K562-CD19)抗原的K562两种细胞，用CD138-T细胞和hCD19-T细胞对以上构建的两种细胞分别进行杀伤，同时也对不构建任何分子的K562细胞进行杀伤，杀伤时间为18个小时，效靶比分别为0.25:1、0.5:1、1:1和2:1，采用LDH释放检测的方法来分析。构建的K562-CD138细胞和K562-CD19阳性率都为96％(图8A)。
结果如图4所示，CD138-T细胞对K562-CD138的杀伤远远高于UNT细胞对K562-CD138的杀伤，，效靶比为0.25:1时，CD138-T是UNT的5倍，效靶比为2:1时，CD138-T比UNT高40％(图4A)。而对于杀伤靶细胞K562，CD138-T和UNT的结果差不多，在四个效靶比中都没有显著性差异，效靶比为2:1时，二者的杀伤率也仅为35％左右，和UNT对K562-CD138的杀伤率几乎一致(图4C)。再看hCD19-T对K562-CD19的杀伤情况，实验组的杀伤能力要远远高于对照组，效靶比最低时，hCD19-T细胞对K562-CD19的杀伤率是UNT细胞的四倍多，随着效靶比的提升，两组始终保持着显著性差异(图4B)。类似CD138-T对K562的杀伤情况，hCD19-T细胞和UNT细胞对K562的杀伤区别很小，各个效靶比中，二者没有显著性差异，K562最高死亡率低于40％(图4D)。
综合来看，本发明构建的CD138-T对CD138抗原阳性的细胞具有特异性，CD138-T细胞对表达CD138抗原的细胞具有极高的识别和杀伤能力，而对于CD138抗原阴性的细胞基本没有杀伤力。结论类似，hCD19-T只是识别和杀伤表达CD19抗原的细胞，对CD19抗原阴性的细胞没有作用，说明本发明构建的两个CAR-T细胞具有非常强的特异性。
实施例6
CAR-T细胞作用靶细胞后释放高剂量的颗粒酶B和IFN-γ
T细胞对肿瘤的毒性通过两种方式起作用(1)释放穿孔素和颗粒酶(2)通过Fas/FasL或TNF/TNFL信号通路激活死亡受体。CAR-T细胞除了通过识别TAA起杀伤作用外，CAR-T释放的IFN-γ和肿瘤表面的IFN-γR相互作用也对肿瘤细胞具有毒性。另外CAR-T细胞比T细胞释放更多的IFN-γ。由此可看，颗粒酶B和IFN-γ对肿瘤细胞具有毒性，为了进一步证明本发明的可行性，检测了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤是否释放颗粒酶B和IFN-γ。不同效靶比下，将CAR-T细胞和肿瘤细胞共培养18小时，取上清进行检测。
结果如图5所示，CD138-T细胞和靶细胞RPMI8226、U266分别共培养18个小时后释放的颗粒酶B明显远远高于对照组UNT细胞(e.g.,6097.8±212.6pg/ml vs 95.6±6.4pg/ml,p＝0.008at the ratio of 0.5:1toward RPMI8226；3284.6±325.8pg/ml vs 22.9±13.6pg/ml,p＝0.0001at the ratio of 0.5:1 toward U266)(图5A)，同时，起杀伤作用的IFN-γ也是CD138-T细胞释放的比UNT细胞释放的量要多的多(e.g.,1633.9±67.5pg/mlvs 15.8±9.0pg/ml,p＝0.0001 at the ratio of 0.5:1 toward RPMI8226；1104.8±69.7pg/ml vs 8.69±5.5pg/ml,p＝0.0001at the ratio of 0.5:1 toward U266)(图5C)。转了hCD19CAR的T细胞的杀伤能力是远远高于UNT细胞的，检测颗粒酶B后发现hCD19-T细胞释放的量远高于UNT细胞(e.g.,4202.5±403.3pg/ml vs 41.7±3.4pg/ml,p＝0.0001at the ratio of 0.5:1toward MAVER-1；4578.4±309.1pg/ml vs 33.2±3.8pg/ml,p＝0.0001 at the ratio of 0.5:1 toward JeKo-1)(图5B)，hCD19-T细胞对靶细胞的杀伤也促进了IFN-γ的释放(e.g.,562.8±120.6pg/ml vs 5.1±4.4pg/ml,p＝0.025atthe ratio of 0.25:1 toward MAVER-1；419.3±17.9pg/ml vs 5.27±0.8pg/ml,p＝0.0001at the ratio of 0.25:1toward JeKo-1)(图5D)。以上结果充分地说明了CAR-T细胞和肿瘤细胞的共培养释放了大量的颗粒酶B和IFN-γ，这些细胞因子反过来促进了肿瘤细胞的死亡。
实施例7
小鼠模型中治疗MM
为了验证实施例2构建的CD138CAR和hCD19CAR在体内是否依然能够发挥作用，选择模式生物NCG小鼠，皮下种植RPMI8226MM细胞，一周后尾静脉输入用做对照的PBS、UNT细胞以及实验组CAR-T细胞，观察小鼠的生存时间。
由于需要大量的T细胞，三次T细胞的转染效率都不是很高，CD138-T的阳性率分别为30.6％、35.5％和46.1％，hCD19-T细胞的阳性率分别为35.9％、44.2％和63.4％(图9)。
结果如图6所示，即便是T细胞的转染效率比较低，实验组的效果依然明显优于对照组。CD138-T组(单CD138-CAR组)和CD138-T与hCD19-T联合组(双CAR组)的小鼠生存期明显高于CD19-T组(单CD19-CAR组)、PBS组和未转染的T细胞组。双CAR组小鼠中有一只完全缓解，最终瘤消失，要好于单CD138-CAR组。单CD19-CAR组的生存期与未转染的T细胞组无显著区别。应用log-rank(Mantel-Cox)text分析，单CD138-CAR组和T细胞组之间的p值小于0.0102，具有统计学差异；双CAR组和单CD19-CAR组和T细胞组相比，p值小于0.0006，具有极大的统计学差异；双CAR组和单CD138-CAR组相比，p值小于0.0102，具有统计学差异。PBS组中小鼠生存期的中值为24.6天，T细胞组中小鼠生存期中值为26.2天，单CD19-CAR组为26.8天，单CD138-CAR组为35.4天，双CAR组更长，有一只小鼠到实验结束仍存活(图6A)。
从小鼠体内瘤的生长情况来看，前期单CD138-CAR组和双CAR组的瘤明显被抑制了，而单CD19-CAR组、PBS组和T细胞组的瘤却肆无忌惮地生长。后期该情况也比较明显，比如单CD138-CAR组在第25天就比T细胞组瘤生长慢(306.8±84.7mm3vs503.0±97.8mm3,p＝0.0095)，双CAR组在21天要比T细胞组的瘤小很多(111.4±59.0mm3vs473.7±195.0mm3,p＝0.0014)(图6B)。并且，双CAR组的肿瘤是要比单CAR组的肿瘤生长的慢，说明输入双CAR比单CAR效果更好，CD19-CAR和CD138-CAR的组合具有协同作用。同时，对于小鼠体重的变化，几组小鼠体重之间没有太大区别(图6C)。
讨论
MM是一种以异常的免疫球蛋白不断积累为特点的血液瘤，这种血液瘤中异常的浆细胞肆意增殖，导致各器官的衰竭。传统的治疗上，主要针对点是将恶性PCs消灭而延长患者的生存期。无论是放疗还是化疗，都有各自的缺陷，目前虽说对MM的治疗取得了不错的效果，但是病人复发的频率非常高，经常造成病人复发后死亡，自体干细胞移植外加一些辅助性抗体药物的治疗，也只能使1/3的患者完全缓解。各种治疗方式都有其不可忽视的局限性，有的副作用特别明显，而且持续时间很长，所以新的治疗方法需要被应用。过继性治疗是一种新颖的治疗方式，通过T细胞过继转移来识别恶性肿瘤的TSA和TAA，这种诱人的治疗方式应该引起大家的重视。
CAR-T治疗方式是近年新出现的免疫治疗方式，是肿瘤治疗方式中的佼佼者。CAR-T的scFv识别TAA不依赖于MHC，并且识别的分子多样化。诺华公司的CAR-T项目中的CTL019是针对血液系统肿瘤表面抗原CD19的来工作的，在临床上取得了显著的成果，有望成为首个上市的基因治疗产品。本发明应用CAR-T技术来解决MM的普遍性问题，并在临床外取得良好效果。本发明选择的是双CAR-T联合作用，其中一个重要的靶点是CD138，CD138在MM细胞系上和病人骨髓浆细胞中都是高表达的，CD38虽然也是MM的一个非常好的Marker，在MM上高表达，但是T、B细胞也高表达CD38，使MM细胞、T细胞、B细胞难以区分开来。CD138是骨髓瘤细胞生长增殖的相关靶点，并且能够促进肿瘤血管新生，所以CD138是一个非常好的靶点。临床试验中用放射免疫治疗物的成功应用，比如I-131抗-CD138mAb，就至少能说明CD138是一个很有潜力的靶点，尤其是针对那些难治的和复发的MM。Jagannath S et al.用抗体偶联药物BT062针对CD138抗原治疗MM，应用到临床二期的实验就足以说明CD138是一个令人憧憬的靶点。
另外，本发明将CD19作为另一个靶点，来构建CD138-T杀伤CD138+的肿瘤细胞，而hCD19-T杀伤CD138-CD19+的MM干细胞。CAR-T细胞构建好之后，本发明首先是在体外检测两种CAR-T的毒性，CD138-T细胞容易检测，但是MM中CD19+的细胞所占比例非常少，很难通过常规手段检测出来，Pei Lin et al.通过流式手段检测了上百位MM患者的骨髓穿刺液，发现只有大约1％的患者MM是CD19阳性的。Ritu Gupta et al.检测了103位MM患者的骨髓穿刺液，发现有3.7％的患者MM是CD19阳性的。基于此，所以无法让hCD19-T细胞直接作用于MM，本发明用几种CD19+的肿瘤细胞来模拟CD19+的MM干细胞，比如MAVER-1和JeKo-1，证明hCD19-T细胞对CD19+的肿瘤细胞具有很强的毒性。本发明构建的CD138-CAR为二代CAR，hCD19-CAR为三代CAR，现在普遍应用的都是二代CAR和三代CAR，三代的并不一定就比二代的好，很多小鼠体内实验证明和二代CAR比起来，三代CAR并没有什么优势，甚至比二代CAR略差。这种现象的原因目前还不是很清楚，有报道说可能是三代CAR两个共刺激因子增加了激活诱导的细胞死亡(AICD)，减弱了三代CAR的抗肿瘤能力。
本发明采用两种方式检测了CAR-T细胞对肿瘤细胞的毒性，一种方法是CSFE/7-AAD的检测方式，另一种方法是检测靶细胞死亡释放的LDH的量。从结果来看，低效靶比的杀伤效率都已经非常高了，1:1的效靶比在共培养18h之后检测，肿瘤细胞的死亡率能够达到70％-80％，当效靶比再提高后，杀伤效率基本不会再增加，从数据上来看，效靶比2:1时肿瘤细胞的死亡率甚至比效靶比为1:1时还要低一些，这种原因是因为LDH的操作方式和计算方式造成的，随着效靶比的增加，只放效应细胞的组别增加的OD值比效靶组增加的多，导致计算时会出现误差。这种误差的出现并不能影响CAR-T细胞对肿瘤细胞的高毒性的证实，LDH的检测方式和CSFE/7-AAD的检测方式结果类似，随着效靶比的增加，肿瘤细胞的死亡率成阶梯状增加。两种不同的检测方式从都能有力地证明本发明所构建的CAR-T细胞的成功性。
本发明转染的T细胞比UNT细胞对肿瘤细胞的毒性大得多，转染的T细胞的阳性率也挺高的。目前普遍接受的是，CD8+T细胞对肿瘤的杀伤是最关键的，CD4+T细胞对CD8+T细胞起辅助作用。嵌合免疫受体激活的T淋巴细胞行使杀伤能力主要通过两种途径，一种是释放穿孔素和颗粒酶，另一种是通过死亡受体的激活，比如Fas/FasL或TNF/TNF-R。CD8+T细胞对肿瘤的作用主要是通过这两种方式。CD4+的T细胞对肿瘤细胞的毒性主要是通过穿孔素和颗粒酶途径，而死亡受体介导的途径只是辅助功能。从结果来看，转染后的CD8+和CD4+T细胞都表达CAR，而且没有出现self ablation和fratricidal death的情况。细胞因子颗粒酶B和IFN-γ的释放量也能够从侧面反映出CAR-T细胞对肿瘤细胞的作用程度，本发明检测了CAR-T细胞和UNT细胞分别同肿瘤细胞作用后的细胞因子释放量，实验组比对照组高出很多很多。
CAR-T近年取得快速地发展，有些是针对的血液瘤，有些是针对的实体瘤，总体来说血液瘤取得的成就远远高出了实体瘤。治疗实体瘤很复杂，血液瘤内部环境相对实体瘤来说还比较温和。不过无论是治疗哪种肿瘤，都会产生一些不可避免的负面效应，比如细胞因子综合征，细胞因子综合征是由大量的细胞因子在短时间内被释放造成的，主要表现是恶心、发烧、低血压、皮疹、器官衰竭等。目前控制CRS的手段主要是用抗IL-6受体的抗体，比如妥珠单抗，虽然如此，依然掩盖不了CAR-T技术的光芒。本发明在小鼠体内进行了CAR-T细胞的杀伤性实验，从结果来看还是很令人满意的。第二次注射CAR-T细胞当天，单CAR组和双CAR组的小鼠出现了严重的CRS，小鼠集体出现食欲不振、精神萎靡、鼠毛蓬乱的现象，体重严重下降，这种现象大约持续3-4天，逐渐恢复正常，而PBS组和UNT组无任何异常现象出现。由于注射小鼠需要的T细胞比较多，本发明转染时加入了较多的T细胞，而病毒的量较少，导致三次T细胞的转染效率都不是很高，CD138-T的阳性率分别为30.6％、35.5％和46.1％，hCD19-T细胞的阳性率分别为35.9％、44.2％和63.4％，三次转染效率远低于体外实验时CAR-T细胞的转染效率。倘若体内实验CAR-T细胞转染效率也如之前一般，体内实验结果可能会更好，实验组小鼠生存期会延长。单CD19-CAR组、UNT组小鼠生存期和PBS组相比没有显著性差异，而且生存期中值基本一致，这和体外结果相似，就是UNT细胞对肿瘤细胞毒性很小甚至没有毒性。由于大多数MM细胞为CD19阴性，单CD19-CAR组并没有明显的治疗效果。双CAR组和单CD138-CAR组相比肿瘤生长更缓慢，双CAR组有一只小鼠症状完全缓解，而且生存中值高于单CAR组很多，说明hCD19-T细胞与hCD138-T细胞的组合有协同效果比单独应用hCD138-T细胞或hCD19-T细胞的效果更好。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 博生吉医药科技（苏州）有限公司
<120> 靶向CD138和CD19的免疫细胞组合及其应用
<130> P2017-1780
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagctgaccc agtcccccct gacactgagc gtgaccattg gccagcctgc ttccctgtcc 60
tgcaagtcca gccagagcct cctggactcc gacggcaaga cctacctgaa ctggctcctc 120
cagagacctg gccagagccc caagaggctg atctccctgg tgtccaagct cgacagcgga 180
gtgcccgaca ggttcacagg atccggctcc ggcaccgact tcaccctcaa gatctccaga 240
gtcgaggccg aggacctggg cgtgtactac tgttggcagg gcacccacct gccctggacc 300
tttggaggcg gcaccaagct ggagatcaag ggcggcggcg gatccggagg aggaggaagc 360
ggaggcggcg gaagccaggt gcagctgcaa caatccggcc ctgagctggt gaagaccggc 420
gcttccgtga agattagctg caagggatcc ggctactcct tctccggcta ttacatgcac 480
tgggtgaagc agagccacgg caagaggctg gagtggatcg gctacatctc cggctacaac 540
ggcgacacca ggtacaacca gaagttcagg ggcaaggcca cctttatcgt ggacatcagc 600
agcaggaccg cctacatgca gctgaacagc ctgaccagcg aggactccgc cgtgtactat 660
tgcgccaggg gcggctatta cggctacgtc gactactggg gccagggaac caccgtcacc 720
gtgtcc 726
<210> 2
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caggtgcagc tgcaggagtc aggaccagga ctggtgaagc ctagcgagac actgagcctg 60
acttgcacag tgtccggcgt gtctctgcca gactacggcg tgtcttggat caggcagcca 120
ccaggaaagg gactcgagtg gatcggagtg atttggggca gcgagaccac ctactacagc 180
tctagcctga agagccgggt gaccatcagc aaggacaaca gcaagaacca ggtgtccctg 240
aagctgtcta gcgtgacagc cgccgatacc gccgtgtact attgcgccaa gcactactac 300
tacggcggca gctacgccat ggactattgg ggacagggca cactggtgac agtgtctagc 360
ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct ggaggaggag gaagcggagg aggaggatct 420
gagatcgtga tgacccagag cccagccaca ctgtctctgt ctccaggcga gagagccaca 480
ctgagttgca gagccagcca ggacatcagc aagtacctga attggtacca gcagaagccc 540
ggacaggccc ctagactgct gatctaccac accagcagac tgcacagcgg cattccagct 600
agattcagcg gcagcggaag cggcacagat tacaccctga ccatcagctc tctgcagccc 660
gaggacttcg ccgtgtactt ttgccagcag ggcaacaccc tgccctacac ctttggacag 720
ggcaccaagc tggagatcaa g 741
Claims (18)
1.一种免疫细胞组合的用途，其特征在于，所述的免疫细胞组合包括靶向CD138的CAR-T细胞和靶向CD19的CAR-T细胞，并且，所述的免疫细胞组合用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物或制剂，所述肿瘤为多发性骨髓瘤，
其中，所述的靶向CD138的CAR-T细胞的细胞膜上表达有结构如下式I所示的第一CAR：
L1-scFv1-H1-TM1-C1-CD3ζ(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L1为无或信号肽序列；
scFv1为靶向CD138的抗原结合结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
H1为无或铰链区；
TM1为跨膜结构域；
C1为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
并且，所述靶向CD19的CAR-T细胞的细胞膜上表达有结构如下式II所示的第二CAR：
L2-scFv2-H2-TM2-C2-CD3ζ(II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L2为无或信号肽序列；
scFv2为靶向CD19的抗原结合结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
H2为无或铰链区；
TM2为跨膜结构域；
C2为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的L1为GM-CSF信号肽。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的L2为GM-CSF信号肽。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的H1为IgG4 Fc。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的H2为IgG4 Fc。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TM1为CD28来源的跨膜区。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TM2为CD28来源的跨膜区。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的C1为CD28来源的共刺激信号分子。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的C2为CD28来源的共刺激信号分子与CD137来源的共刺激信号分子的组合。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为(3-8)：1。
11.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为为(4-6)：1。
12.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为5:1。
13.一种免疫细胞组合，其特征在于，所述的免疫细胞组合包括靶向CD138的CAR-T细胞和靶向CD19的CAR-T细胞，
其中，所述的靶向CD138的CAR-T细胞的细胞膜上表达有结构如下式I所示的第一CAR：
L1-scFv1-H1-TM1-C1-CD3ζ(I)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L1为无或信号肽序列；
scFv1为靶向CD138的抗原结合结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
H1为无或铰链区；
TM1为跨膜结构域；
C1为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；
并且，所述靶向CD19的CAR-T细胞的细胞膜上表达有结构如下式II所示的第二CAR：
L2-scFv2-H2-TM2-C2-CD3ζ(II)
式中，
各“-”独立地为连接肽或肽键；
L2为无或信号肽序列；
scFv2为靶向CD19的抗原结合结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
H2为无或铰链区；
TM2为跨膜结构域；
C2为共刺激信号分子；
CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
14.如权利要求13所述的免疫细胞组合，其特征在于，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为(3-8)：1。
15.如权利要求13所述的免疫细胞组合，其特征在于，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为(4-6)：1。
16.如权利要求13所述的免疫细胞组合，其特征在于，所述的免疫细胞组合中，靶向CD138的CAR-T细胞与靶向CD19的CAR-T细胞的数量比值为5:1。
17.一种药物组合物或制剂，其特征在于，所述的药物组合物或制剂包括权利要求13所述的免疫细胞组合和药学上可接受的载体。
18.如权利要求17所述的药物组合物或制剂，其特征在于，所述的药物组合物或制剂为液态制剂。
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