CN109897114B

CN109897114B - 具有自杀基因开关的靶向cd47的工程化免疫细胞

Info

Publication number: CN109897114B
Application number: CN201711295475.8A
Authority: CN
Inventors: 曹卫; 何佳平; 刘丽萍; 马安云
Original assignee: Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
Current assignee: Genxi Biotechnology Shanghai Co ltd
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN109897114A

Abstract

本发明提供了一种具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞。具体地，本发明提供了一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞，并且所述细胞的CAR结构中包含细胞自杀元件。本发明对CAR结构中的CD47 scFv的亲和力作出了优化并选择合适的CAR‑T细胞输注方式，从而使其对正常组织的毒性降低到人体可接受水平。同时在确保CD47 CAR‑T细胞的活性的基础上，添加细胞自杀元件，用于控制CAR‑T细胞的活性和CRS等相关毒性，增强安全性。

Description

具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞

技术领域

本发明涉及免疫治疗领域，具体地涉及具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞，更具体地涉及一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发、增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起T细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。CAR-T细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。但是在实体肿瘤治疗中，研究人员发现在小鼠中注射meso-cart 能够约束肿瘤的生长，但是不能治疗肿瘤。这可能是由于肿瘤微环境中负调控因子的上调导致cart功能的减退，如在肿瘤微环境中，T细胞表面 PD-1(programmed deathprotein-1)表达上调限制了T细胞的功能。

B细胞淋巴瘤患者的外周血及生发中心样B细胞中CD47的表达水平都明显高于正常B细胞。同时，研究还发现不同病理组织学类型的非霍奇金淋巴瘤(NHL) 中CD47均有表达，如弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)、滤泡细胞性淋巴瘤(FL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、套细胞性淋巴瘤(FCL)等。

CD47是治疗肿瘤的一个潜在靶点，目前研究主要集中在使用靶向CD47的抗体来进行肿瘤治疗，CD47抗体治疗是通过DC细胞和CD8+T发挥肿瘤杀伤效应的。DC细胞通过CD47抗体和亲吞噬分子协同作用，吞噬肿瘤细胞，并提呈肿瘤相关抗原给CD8+T，进而发挥CD8+T对肿瘤的特异性杀伤作用。

CD47作为细胞表面分子，在肿瘤细胞上高表达，因此可以设计靶向CD47的免疫嵌合受体T细胞(CAR-T)，对肿瘤进行治疗。在CD47CAR设计过程中，需要平衡CAR对抗原的亲和力，筛选出适当亲和力，CAR对正常组织的杀伤毒性在人体可接受的水平。选择合适的CAR-T细胞输注方式对减弱CD47 CAR-T的毒性会有帮助。

与抗体治疗相比，CAR-T细胞治疗的优势有：抗体的作用只是短暂的，停药后抗体阻断效果就会消失；有效抗体研发困难；抗体药物昂贵；抗体阻断CD47 信号后，肿瘤细胞被吞噬细胞识别杀死，在一些肿瘤负荷较高的病人中，没有足够的吞噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬，达不到治疗效果，而CAR-T细胞靶向肿瘤细胞表面CD47分子，被激活后直接对肿瘤细胞进行杀伤，不依赖于其他细胞。

目前，本领域还没有成熟的靶向CD47的CAR-T细胞，本领域迫切需要开发靶向CD47的CAR-T细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞，更具体地在于提供一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用。

本发明的另一目的在于对CD47 CAR-T的scFv亲和力进行优化，并加入安全开关来控制CD47 CAR-T的毒性。

在本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的 CAR靶向CD47，并且所述的CAR包含细胞自杀元件和/或蛋白标签。

在另一优选例中，所述的CAR的结构选自下组的结构：

(i)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-K-A；

(ii)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-A-K；

(iii)K-A-L-scFv-H-TM-C-CD3ζ；和

(iv)A-K-L-scFv-H-TM-C-CD3ζ；

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为靶向CD47的抗体单链可变区序列；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

K为任选的细胞自杀元件；

A为任选的蛋白标签。

在另一优选例中，所述的CAR具有下式I结构：

L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-K-A (I)。

在另一优选例中，所述的scFv(靶向CD47的抗体)为鼠源、人源、人源和鼠源嵌合、或者全人源化的抗体。

在另一优选例中，所述的A为选自下组的一种或多种蛋白标签：

绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、Δ CD20、或其组合。

在另一优选例中，所述GFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3的508-746位氨基酸所示。

在另一优选例中，所述的元件A与元件K通过P2A连接。

在另一优选例中，所述的元件K或A与CD3ζ或L通过P2A连接。

在另一优选例中，所述的P2A序列如SEQ ID NO.:3的489-507位氨基酸所示。

在另一优选例中，所述的L-scFv-H-TM-C-CD3ζ与A、K的相对位置可以自由排列；

在另一优选例中，所述的细胞自杀元件的结构如下式II所示：

B-D-F (II)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

B为自杀基因诱导元件；

D为柔性接头；

F为自杀基因。

在另一优选例中，所述的细胞自杀元件包含iCasp9。

在另一优选例中，所述的自杀基因为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的编码基因(Caspase9基因)。

在另一优选例中，所述的B为FKBP12-F36V结构域。

在另一优选例中，所述的FKBP12-F36V结构域包含FKBP结构域，且FKBP结构域的第36位氨基酸由苯丙氨酸突变为缬氨酸。

在另一优选例中，所述D的序列如SEQ ID NO.:3的876-880位氨基酸所示 (Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)。

在另一优选例中，所述的L为选自下组的蛋白的信号肽：CD8、GM-CSF、CD4、 CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的L为CD8来源的信号肽。

在另一优选例中，所述的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3的第23-262位所示。

在另一优选例中，所述自杀基因元件的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3的769-1168位氨基酸所示。

在另一优选例中，所述的H为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H为CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3 epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、 CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，TM包括CD8来源的跨膜区，和/或CD28来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、 CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、 ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，C包括4-1BB来源的共刺激信号分子，和/或CD28来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1、3、4所示。

其中，SEQ ID NO:1所示的序列表示结构为CD47scFv-CD8-CD137-CD3Z的 CAR(即元件A和元件K为无的靶向CD47的CAR)的氨基酸序列；SEQ ID NO:2所示的序列表示编码结构为CD47scFv-CD8-CD137-CD3Z的CAR的核苷酸序列；SEQ ID NO:3所示的序列表示结构为CD47BBZ-GFP-ICASP9的CAR(即元件A为GFP标签和元件K为ICASP9自杀元件的CAR)的氨基酸序列；SEQ ID NO:4所示的序列表示结构为CD47scFv-CD28-CD3Z的CAR(即元件A和元件K为无的靶向CD47的CAR)的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体(CAR)。

在另一优选例中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的核酸分子或表达本发明第一方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述细胞为T细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞或NK细胞，较佳地为(i) 嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞为T 细胞或NK细胞，并且所述的免疫细胞细胞具有以下特征：

(a)所述细胞表达靶向CD47的CAR或外源TCR，且

(b)所述的CAR或TCR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、或其组合。

在另一优选例中，所述的CAR或TCR结构中包含蛋白标签，所述的蛋白标签选自下组：

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞选自下组：

(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)；

(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或

(iii)外源T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。

在另一优选例中，提供了一种嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)，所述CAR-T 细胞具有以下特征：

(a)所述细胞表达靶向CD47的CAR，且

(b)所述的CAR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、或其组合。

(a)所述细胞表达靶向CD47的CAR，且

(b)所述的CAR的N端信号肽与scFv之间有多重复Flag(序列DYKDDDDK，SEQ IDNO.:5)、多重复C-myc(序列EQKLISEEDL，SEQ ID NO.:6)、或其组合；

(c)所述的CAR结构中包含细胞自杀元件，所述的细胞自杀元件包含选自下组的自杀基因开关：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、 EGFRt、或其组合。

(d)所述细胞中的PD-1基因表达是被沉默的。

在另一优选例中，所述的CAR如权利要求1所述。

在另一优选例中，所述“PD1基因表达是被沉默的”指PD1基因不表达或低表达。

在另一优选例中，所述“低表达”指所述CAR()-T细胞PD1基因的表达量G1 与正常T细胞PD1基因的表达量G0的比值，即G1/G0≤0.5，较佳地G1/G0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。

在本发明的第五方面，提供了一种制备工程化免疫细胞的方法，所述的工程化免疫细胞表达本发明第一方面所述的CAR，包括以下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：沉默所述T细胞或NK细胞的PD1 基因的表达。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达所述的CAR 或外源TCR，所述的CAR或TCR结构中包含细胞自杀元件，并且使得所述的T细胞或 NK细胞中PD1基因的表达沉默，从而获得所述的免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括将表达所述CAR的表达盒导入所述T细胞。

在另一优选例中，所述的表达盒位于病毒载体上。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞 /ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面所述的细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、睾丸癌、结直肠癌、尿路肿瘤、甲状腺癌、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：卵巢癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、子宫内膜癌、或其组合。

在本发明的第八方面，提供了一种用于制备本发明第四方面所述细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的本发明第二方面所述的核酸分子、或本发明第三方面所述的载体。

在本发明的第九方面，提供了一种本发明第四方面所述细胞、或本发明第六方面所述的制剂的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明第四方面所述的细胞、或本发明第六方面所述的制剂。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的各种不同结构的CAR。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞。具体地，本发明提供了一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞，并且所述细胞的CAR结构中包含细胞自杀元件。本发明对CAR结构中的CD47scFv的亲和力作出了优化并选择合适的CAR-T细胞输注方式，从而使其对正常组织的毒性降低到人体可接受水平。同时在确保CD47 CAR-T细胞的活性的基础上，添加细胞自杀元件，用于控制CAR-T细胞的活性和CRS等相关毒性，增强安全性。

本发明以CAR-T细胞为例，代表性地对本发明的工程化的免疫细胞进行详细说明。本发明的工程化的免疫细胞不限于上下文所述的CAR-T细胞，本发明的工程化的免疫细胞具有与上下文所述的CAR-T细胞相同或类似的技术特征和有益效果。具体地，当免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR时，NK细胞等同于T细胞 (或T细胞可替换NK细胞)；当免疫细胞为T细胞时，TCR等同于CAR(或CAR可替换为TCR)。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条 H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和 VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1， CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

CD47

CD47是Ig超家族成员，由一个胞外氨基端Ig样可变结构域(配体结合区)、 5个疏水跨膜片段和一个羧基端胞内尾区。CD47广泛表达于不同组织细胞表面，如造血细胞(红细胞、淋巴细胞、血小板等)，非造血细胞(胎盘、肝、脑细胞等)及肿瘤细胞。CD47在白血病干细胞中存在高表达，如AML、慢性髓系白血病急变期和T细胞急性淋巴白血病等，在多种肿瘤组织中均发现CD47的表达，包括多发性骨髓瘤、膀胱癌、直肠癌、黑色素瘤等。正常组织虽有CD47表达，但表达水平却显著低于肿瘤组织。

CD47作为自我信号，肿瘤细胞通过抗吞噬信号的表达，逃避了巨噬细胞的吞噬。在淋巴细胞中，CD47与其特异性配体SIRPα相结合形成CD7-SIRPα信号复合体，能够发出抗吞噬信号，抑制吞噬细胞的吞噬，造成免疫系统见识漏洞，促进肿瘤的发展。

自杀基因开关

为进一步控制CAR-T细胞非肿瘤靶向和细胞因子释放综合征等不良，本发明中的CART细胞皆带有自杀基因开关，在外源性药物的作用下，可以有效清除体内的CAR-T细胞，阻断未知的或不可控的远期毒性，以保证患者的安全。

本发明中所用自杀基因开关可以为单纯疱疹病毒胸苷激酶(the herpes symplexvirus thymidine kinase，HSV-TK)、可诱导的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(induciblecaspase 9,iCasp9)、CD20、突变型人胸苷酸激酶(mutated human thymidylate kinase，mTMPK)等。比较而言，HSV-TK、iCasp9和CD20对 T细胞的清除能力等同，但是iCasp9和CD20的清除较迅速，HSV-TK清除速度较慢。

iCasp9自杀基因开关包含FKBP12-F36V结构域，可通过柔性Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO.:3的876-880位)连接半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9，后者不含募集结构域。FKBP12-F36V包含一个FKBP结构域，在第36个氨基酸残基位点上苯丙氨酸替代了缬氨酸。它具有高选择性和亚纳摩尔亲和力，能够结合二聚合成配基，如其他惰性小分子AP1903。当加入小分子后，能够促使其二聚话，从而诱导细胞的凋亡，而对未携带自杀基因的正常细胞无效用。

诱导安全开关caspase9(iCasp9)使用人的caspase9融合FK506结合蛋白 (FKBP)，使其可以用化学诱导剂(AP1903/Rimiducid，Bellicum Pharmaceutical) 诱导形成二聚体，导致表达融合蛋白的细胞凋亡。

CD47虽然在肿瘤细胞中高表达，在正常器官如造血细胞(红细胞、淋巴细胞、血小板等)和非造血细胞(胎盘、肝、脑细胞等)也均有表达，CD47 CAR-T 细胞在体内会攻击造血细胞以及一些器官如肝脏和脑，造成贫血或者器官衰竭。

如何控制CD47 CAR-T细胞的安全性一直都是急需解决的问题。在CAR-T细胞上加入安全开关，是目前来看用于终止CAR-T活性最安全的方式。在CAR-T细胞产生严重毒性(CRS/神经毒性)或者在病人达到长期持续缓解后，可诱导的 iCasp9安全开关控制CAR-T细胞清除。

嵌合抗原受体(CAR)

CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者 FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶向肿瘤抗原的特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括 0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向CD47的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28/4-1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single-chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别肿瘤高表达抗原CD47的抗体，较佳地为单链抗体。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括CD28/4-1BB的信号传导结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

本发明的CAR中，还包含一细胞自杀元件，且CAR的基本结构和细胞自杀元件，各自独立地发挥功能，互不干扰。

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-T细胞。本发明的CAR-T细胞表达靶向CD47的CAR，并且所述的CAR结构中包含细胞自杀元件。

具体地，本发明提供了一种靶向CD47的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。其中 CAR由信号肽、scFv、铰链、跨膜区、共刺激区、激活信号区。CD47在很多肿瘤细胞中高表达，肿瘤细胞中高表达CD47用于逃避巨噬细胞吞噬。本发明设计靶向CD47的CAR-T可以对CD47阳性细胞进行杀伤，可用于治疗CD47阳性的肿瘤，尤其是应用于实体瘤的治疗。为了防止CD47CAR-T细胞对正常组织的杀伤作用，对CD47scFv的亲和力作出优化并选择合适的CAR-T细胞输注方式，使得对正常组织的毒性降低到人体可接受水平。同时为进一步确保CD47 CAR-T细胞的活性进行调控安全性，在CD47 CAR-T细胞上加入安全开关，用于控制CAR-T细胞的活性和CRS等相关毒性。

嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于治疗CD47高表达的肿瘤，如B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌等。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

外源T细胞抗原受体

如本文所用，外源T细胞抗原受体(T cell receptor,TCR)为通过基因转移技术从肿瘤反应性T细胞中克隆出TCR的α链和β链，通过基因工程的手段，以慢病毒或逆转录病毒为载体，外源性转入到T细胞内的TCR。

外源TCR修饰的T细胞能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞，并通过优化TCR与肿瘤性特异性抗原的亲和力，可以提高T细胞与肿瘤的亲和力，提高抗肿瘤效果。

表达盒

如本文所用，“表达盒”或“本发明表达盒”是指表达本发明CAR结构的表达盒，所述表达盒包含编码所述CAR的核酸序列。

在一个实施方式中，所述表达盒还包括启动子。

在一个实施方式中，所述表达盒还包括终止子。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、 5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子 -1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔 (Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等， 2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂 (例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明核酸构建物的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物CD47，协同激活T细胞，引起T细胞免疫应答，并且转导的T细胞具有自杀基因开关，能够诱导CAR-T细胞清除，从而提高治疗的安全性。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达本发明核酸构建物的 T细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本发明的核酸构建物，得到ACTC1基因被抑制的CAR-T细胞，且CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，靶向CD47的CAR-T细胞引起抗表达CD47的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括靶向CD47的scFv、铰链和跨膜区、和4-1BB/CD28和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌、。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰 (即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/ 或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA 或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者 (对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。 T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将 T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明经修饰的T细胞(如，CAR-T20细胞)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明CAR结构中的CD47scFv的亲和力作出优化并选择合适的CAR-T细胞输注方式，使其对正常组织的毒性降低到人体可接受水平。

(b)本发明在确保CD47 CAR-T细胞的活性的基础上，添加细胞自杀元件，用于控制CAR-T细胞的活性和CRS等相关毒性，增强了安全性。

(c)本发明的CAR-T细胞的CAR结构中同时包含CAR基本结构和细胞自杀元件，上述结构各自独立地发挥功能，互不干扰。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本发明首先从供体血液中分离和扩增T细胞，设计CD47CAR的结构和选择合适亲和力的CD47scFv，构建CD47CAR和iCasp9基因慢病毒包装质粒，并包装慢病毒表达载体，通过慢病毒表达载体感染激活后的T细胞，感染后检测T细胞CAR 阳性率。对制备好的CAR-T细胞进行检测与功能验证。CAR-T细胞在体外与肿瘤细胞共培养，检测细胞因子IFNγ、IL2和IL6释放，以及CAR-T细胞刺激后CD137 表达情况。同时也进行体内药效学实验，检测肿瘤负荷小鼠输入CAR-T细胞后，肿瘤消褪情况。同时对比加药诱导前后CAR-T细胞的增殖以及功能活性的变化。

实施例1从供体血液中分离PBMC和扩增T细胞

从脐带血中分离单核细胞，使用Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)进行密度梯度离心，并富集T细胞(EasySep human T cell enrichment kit，Stemcell Technologies)，使用偶联anti-CD3/anti-CD28的磁珠激活培养和扩增T细胞；培养基使用X-vivo15(5％FBS，2mM L-glutamine，1mM丙酮酸钠，300IU/ml rhIL2)；所有细胞均置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。

实施例2细胞培养

人卵巢癌肿瘤细胞系A1847和SKOV-3；胰腺癌细胞BxPC3和PANC-1； BxPC3-ffluc细胞系使用fireflyluciferase的慢病毒感染BxPC3细胞筛选后得到，以上细胞均使用RPMI1640培养基培养；293T(ATCC-CRL3216)使用DMEM培养基培养。所有培养基均添加10％(v/v)胎牛血清和100U/ml的青霉素和链霉素， 2mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠。

实施例3CAR结构设计与转导

设计并构建靶向CD47的CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞稳定表达CAR基因。 CAR为人工设计的氨基酸序列，包括依次连接的信号肽、scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号区。

此外，本实施例构建的靶向CD47的CAR-T细胞稳定表达iCasp9基因。iCasp9 基因为人工设计的氨基酸序列，包括人FK506结合蛋白F36V突变体 (FKBP-F36V)、人caspase 9蛋白(CASP9，GenBank number，NM001229)，其中人caspase 9蛋白内源凋亡和募集结构域缺失，FKBP-F36V与CASP9通过 Ser-Gly-Gly-Gly-Ser连接形成FKBP-F36V-SGGGS-CASP9。

CAR和iCasp9基因表达的载体可以是DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子或其他基因转移系统。本实施例中利用慢病毒载体作为CAR和iCasp9的表达载体。

将CD47 CAR基因、GFP、iCasp9基因通过T2A连接形成CD47 CAR-P2A-GFP-P2A-iCasp9(简称CD47CAR，其序列如SEQ ID NO.:3所示)，将CD47 CAR-P2A-GFP-P2A-iCasp9克隆至FUW慢病毒载体骨架中，置于EF1α的启动子下，形成Fuw-EF1α-CD47 CAR-P2A-GFP-P2A-iCasp9转移载体，将Fuw-EF1α- CD47 CAR-P2A-GFP-P2A-iCasp9质粒、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，Plasmid #12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，Plasmid#12260)三质粒按一定比例使用Lipofectamine3000转入293T中制备慢病毒表达载体；在48h和72h收集病毒上清，超离进行浓缩(Merck Millipore)；浓缩后的病毒即可用于感染T细胞。

结果显示，成功制备包含CD47 CAR和iCasp9的慢病毒载体。

实施例4CAR-T细胞制备

分离纯化的原代T细胞在激活三天后，使用实施例3制备的CD47 CAR和 iCasp9共表达的慢病毒载体进行感染，转移至细胞培养瓶，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养。感染后第3天和7天使用proteinL(Thermo Fisher Scientific)检测T细胞的CAR阳性率，每隔2-3天更换一半培养基。

结果显示，成功制备包含自杀基因且靶向CD47的CAR-T细胞。

实施例5CAR-T细胞因子释放检测

将实施例4制备的CAR-T细胞与肿瘤细胞(BxPC3)1：1混合，置于RPMI培养基中，各细胞密度配制为1X10⁶/ml，CAR-T细胞与肿瘤细胞各100ul，置于96孔板中，共培养过夜，收集上清，离心后取上清检测细胞因子IFN-γ与IL2的释放水平，采用Elisa试剂盒(Biolegend)进行检测。

结果显示相对对照组T细胞，CD47CAR-T细胞在CD47阳性肿瘤细胞刺激后，分泌大量细胞因子IFNγ和IL2。

实施例6CAR-T细胞体外杀伤

采用实时无标记细胞分析技术(Real Time Cellular Analysis，RTCA)，在无需任何标记的情况下，可实现动态检测免疫细胞杀伤检测及最佳效靶比评估。RTCA技术基于电阻抗原理，针对贴壁细胞生物学表性进行检测，而对于加入孔内的悬浮细胞，因其不与检测板底面电极接触或近视微弱接触，所以不会引起电阻抗变化。因此，CAR-T细胞介导的单层癌细胞杀伤可直接利用RTCA技术进行定量监测。CD47 CAR-T与不同来源的肿瘤细胞按照E:T＝10:1比例共培养，靶细胞包括卵巢癌细胞A1847和SKOV-3，胰腺癌细胞BxPC3和PANC-1。通过连续检测CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤，分析得出CAR-T细胞对肿瘤的瞬时杀伤以及长时程杀伤能力。

结果显示CD47 CAR-T对不同来源的CD47阳性肿瘤细胞，在长时程(大于20 小时)作用下有显著杀伤效果。

实施例7 CD47CAR-T细胞在体内增殖实验

选取6-12周大的NOD-Prkdc^scid IL2rg^null(NPG)小鼠，将实施例4制备的人CD47CAR-T细胞静脉注射进小鼠，5x10⁶个细胞/鼠；注射后第0天取血进行CD3 染色，检测小鼠体内T细胞；检测结束后，三天后取血进行CD3染色，检测小鼠体内人T细胞比例；

结果显示，注射CAR-T后第0天，小鼠体内未检测到T细胞(CD3阳性细胞)；注射CAR-T三天后，小鼠体内T细胞比例增长至1.5％(平均值)，相对第0天CAR-T 细胞在小鼠体内有增殖显著。

实施例8体内药效研究

选取6-12周大的NOD-Prkdc^scid IL2rg^null(NPG)小鼠，一组小鼠腹腔注射 2×10⁵个BxPC3细胞和200uL DPBS/鼠，另一组注射2×10⁵个BxPC3细胞和5x10⁶ CD47 CAR-T细胞/鼠；CAR-T处理后每间隔4天评估小鼠肿瘤负荷，测量小鼠肿瘤体积；实验结束后处死小鼠，取小鼠体内肿瘤组织，拍照以及测量肿瘤质量。

结果显示，注射CD47 CAR-T组小鼠，肿瘤的体积和重量显著小于对照组，说明注射CD47 CAR-T组小鼠肿瘤生长显著被抑制。

实施例9CD47 CAR-T细胞诱导凋亡实验

药物诱导的细胞体外增殖实验：分别向CFSE标记的CD47CAR-T、T细胞向培养基中加入10nM的AP1903，测定不同时间细胞的数目，计算药物诱导细胞死亡的速率来检测CAR-T的增殖。

体内功能实验：使用FFLuc标记CD47 CAR-T细胞，用于标记体内T细胞的活性。向小鼠注射5x10⁶T细胞或FFLuc-CAR-T细胞，并腹腔注射AP20187(50 mg/mouse)，分别在Day3/5/8/14/35腹腔注射3mg d-luciferin，使用Xenogen IVIS Imaging System拍照，计算得出光子量/s/cm²/球面角度值(p/s/cm²/sr)。

结果显示体外加入诱导药物后，带自杀开关的CD47CAR-T细胞迅速被清除，半小时内清除效率达到90％。小鼠体内注射诱导药物后，第二天小鼠体内CAR-T 细胞已经被完全清除。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 亘喜生物科技（上海）有限公司

<120> 具有自杀基因开关的靶向CD47的工程化免疫细胞

<130> P2017-1609

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp

20 25 30

Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp

50 55 60

Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 2

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagagg tgcagctggt ggagtctggg ggagacttag tgaagcctgg agggtccctg 120

aaactctcct gtgcagcctc tggattcact ttcagtggct atggcatgtc ttgggttcgc 180

cagactccag acaagaggct ggagtgggtc gcaaccatta ctagtggtgg tacttacacc 240

tactatccag acagtgtgaa ggggcgattc accatctcca gagacaatgc caagaacacc 300

ctgtacctgc aaatagacag tctgaagtct gaggatacag ccatatattt ctgtgcaaga 360

tccctcgcgg gaaatgctat ggactactgg ggtcaaggga ccagcgtcac cgtctcctca 420

ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct ggtggcggtg gttctgatat tgtgatgact 480

cagtctccag ccaccctgtc tgtgactcca ggagatagag tctctctttc ctgcagggcc 540

agccagacta ttagcgacta cttacactgg tatcaacaaa aatcacatga gtctccaagg 600

cttctcatca aatttgcttc ccaatccatt tctggaatcc cctccaggtt cagtggcagt 660

ggatcaggct cagatttcac tctcagtatc aacagtgtgg aacctgaaga tgttggagtg 720

tattactgtc aaaatggtca cggctttcct cggacgttcg gtggagggac caagctggaa 780

ataaaaacca ccacccccgc cccccgcccc cccacccccg cccccaccat cgccagccag 840

cccctgagcc tgcgccccga ggcctgccgc cccgccgccg gcggcgccgt gcacacccgc 900

ggcctggact tcgcctgcga catctacatc tgggcccccc tggccggcac ctgcggcgtg 960

ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac tgcaagcgcg gccgcaagaa gctgctgtac 1020

atcttcaagc agcccttcat gcgccccgtg cagaccaccc aggaggagga cggctgcagc 1080

tgccgcttcc ccgaggagga ggagggcggc tgcgagctgc gcgtgaagtt cagccgcagc 1140

gccgacgccc ccgcctacaa gcagggccag aaccagctgt acaacgagct gaacctgggc 1200

cgccgcgagg agtacgacgt gctggacaag cgccgcggcc gcgaccccga gatgggcggc 1260

aagccccgcc gcaagaaccc ccaggagggc ctgtacaacg agctgcagaa ggacaagatg 1320

gccgaggcct acagcgagat cggcatgaag ggcgagcgcc gccgcggcaa gggccacgac 1380

ggcctgtacc agggcctgag caccgccacc aaggacacct acgacgccct gcacatgcag 1440

gccctgcccc cccgctaa 1458

<210> 3

<211> 1168

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp

20 25 30

Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp

50 55 60

Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys

485 490 495

Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Ser Lys Gly

500 505 510

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Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp

530 535 540

Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys

545 550 555 560

Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val

565 570 575

Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe

580 585 590

Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe

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Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu

625 630 635 640

Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His

645 650 655

Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn

660 665 670

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675 680 685

His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro

690 695 700

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725 730 735

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835 840 845

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Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Gly Gly Gly Ser

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Gly Val Asp Gly Phe Gly Asp Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly

885 890 895

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900 905 910

Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr

915 920 925

Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser

930 935 940

Ser Leu His Phe Met Val Glu Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys

945 950 955 960

Met Val Leu Ala Leu Leu Glu Leu Ala Gln Gln Asp His Gly Ala Leu

965 970 975

Asp Cys Cys Val Val Val Ile Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His

980 985 990

Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser

995 1000 1005

Val Glu Lys Ile Val Asn Ile Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser

1010 1015 1020

Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly

1025 1030 1035

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1055 1060 1065

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1070 1075 1080

Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser Thr Phe Pro

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Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu Asp

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Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys

1130 1135 1140

Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys

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Lys Leu Phe Phe Lys Thr Ser Gly Ser Gly

1160 1165

<210> 4

<211> 481

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp

20 25 30

Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp

50 55 60

Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

85 90 95

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Ile Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Leu Ala Gly Asn Ala Met Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr

145 150 155 160

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu

165 170 175

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln

180 185 190

Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Phe Ala Ser Gln

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Val Gly Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Gly Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly

245 250 255

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu

260 265 270

Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His

275 280 285

Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val

290 295 300

Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr

305 310 315 320

Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu

325 330 335

His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg

340 345 350

Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

355 360 365

Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

Claims

1.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述的CAR靶向CD47，并且所述的CAR包含细胞自杀元件和蛋白标签，所述的CAR的结构选自下组的结构：

(ii)L-scFv-H-TM-C-CD3ζ-A-K；

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L为任选的信号肽序列；

scFv为靶向CD47的抗体单链可变区序列；

H为任选的铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

K为细胞自杀元件；

A为蛋白标签；

所述的蛋白标签选自下组：绿色荧光蛋白(GFP)、NGFR截断体(NGFRt)、EGFR截断体(EGFRt)、ΔCD19、ΔCD20、或其组合，所述的细胞自杀元件选自下组：HSV-TK、iCasp9、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、EGFRt、或其组合；

并且所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体(CAR)。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求2所述的核酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞含有权利要求3所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求2所述的核酸分子或表达权利要求1所述的CAR，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞，所述细胞中的PD-1基因表达是被沉默的。

5.一种制备工程化免疫细胞的方法，其特征在于，所述的工程化免疫细胞表达权利要求1所述的CAR，包括以下步骤：将权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的载体转导入T细胞或NK细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞，并且所述的方法还包括步骤：沉默所述T细胞或NK细胞的PD1基因的表达。

6.一种权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3所述的载体、或权利要求4所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。