CN104328140A - 一种高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒 - Google Patents

Abstract

本发明为一种高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，公开一种经改造的可用于治疗膀胱癌的复制缺陷腺病毒。本发明通过将RGD序列整合入腺病毒纤毛区改变腺病毒嗜性，使其对低表达腺病毒受体的膀胱癌嗜性提高，解决了腺病毒载体对腺病毒受体低表达膀胱癌感染能力低的问题。并在该改造嗜性的腺病毒中由膀胱上皮特异性UPII启动子控制自杀基因TK的表达，构建成选择性表达腺病毒。本发明可解决现有技术存在的腺病毒的CAR受体依赖性问题、解决现有技术中存在的腺病毒的靶向性问题，并可提高治疗效果。

Description

一种高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒

技术领域

本发明涉及一种经改造的可用于治疗肿瘤的病毒，确切讲本发明涉及一种可用于治疗膀胱癌的腺病毒。 

背景技术

在我国，膀胱癌在泌尿系统肿瘤中占第一位，在经济、社会发展中造成了严重的损失，危害十分严重。传统的放、化疗存在抗肿瘤能力低、杀伤指数过小、副作用大等缺点。治疗效果远远不能令人满意。因此，探索新的治疗理念、策略和途径，提高膀胱肿瘤的治疗效果，显得十分迫切。 

腺病毒是理想的肿瘤基因治疗和生物治疗载体。腺病毒载体由于具有易于制备高滴度病毒、可感染分裂期和非分裂期细胞以及不整合到宿主基因组等优点而成为一种常用基因治疗载体。腺病毒曾于1950年首次作为治疗宫颈癌的药物进行临床试验,主要依据它在体外能感染宫颈癌来源的ＨｅＬａ细胞及其他上皮细胞,但并未取得理想的效果，参见：Alemany R: Cancer selective adenoviruses. Mol Aspects Med. 2007；28: 42-58.。 

现有技术中目前以下五方面的障碍影响了腺病毒载体在治疗肿瘤中的实际应用：①腺病毒的CAR受体(Coxsackie Adenovirus Receptor, CAR)依赖性，腺病毒进入细胞需要细胞表面有特异性的受体CAR的表达、而在肿瘤细胞，尤其是很多恶性膀胱肿瘤中CAR的表达缺失，导致腺病毒在肿瘤细胞中的转染效率低，溶瘤效果差。②腺病毒的靶向性问题，由于腺病毒自身缺乏选择性裂解肿瘤细胞的能力，副作用较大。③溶瘤腺病毒复制能力低，通过复制裂解肿瘤的溶瘤效果差。④安全性问题。⑤给药困难，静脉注射病毒会被机体免疫系统清除，肿瘤局部难以达到有效病毒数量。参见：Fukazawa T1, Matsuoka J, Yamatsuji T, Maeda Y, Durbin ML, Naomoto Y.Adenovirus-mediated cancer gene therapy and virotherapy (Review).Int J Mol Med. 2010 Jan;25(1):3-10.很多腺病毒都是通过瘤内直接注射的方式给药，这样才能使病毒直接对瘤细胞进行杀灭和自身复制，但操作不便，作用局限。有研究试图通过静脉注射的方式给药以期达到系统治疗的效果。但难以克服免疫系统对病毒清除作用而难以达到足够的治疗浓度,从而造成对相当一部分实体瘤的治疗给药困难。 

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，腺病毒的靶向性好，具有在肿瘤细胞中的转染效率高，溶瘤效果好，给药安全性高的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒。 

本发明的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒是将RGD序列整合入腺病毒纤毛区，并在该改造嗜性的腺病毒中由膀胱组织特异性UPII启动子控制自杀基因TK的表达，构建成选择性表达腺病毒,以达到在肿瘤细胞中实现特异性的自杀基因表达产物为胸苷激酶,该产物使药物丙氧鸟苷(GCV)磷酸化，磷酸化丙氧鸟苷(GP)掺入到细胞DNA中，引起DNA损伤导致细胞凋亡。从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的。本发明的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒是通过自杀基因TK的表达诱导DNA毒性产物磷酸化丙氧鸟苷(GP)的产生。 

本发明的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，是将RGD序列整合入腺病毒纤毛区。纤毛区为病毒接触宿主部位，决定宿主嗜性。RGD肽( Arg- Gly- Asp peptid) 是存在于细胞外基质成分纤维连接蛋白( Fn) 的细胞粘附域内的细胞粘附最小活性单位, 对细胞表面的整合素具有高亲和性, 可诱导细胞内吞作用。在本发明中, 通过将 RGD肽导入腺病毒纤毛头节区, 制备具有整合素靶向性的纤毛突变型腺病毒, 使其通过与细胞表面整合素结合, 实现对 Adv抵抗性细胞的感染。 

本发明实施例中是将RGD序列插入到腺病毒骨架pAdEasy-1质粒的30218- 30219位点之间，所用的腺病毒为Ad5。 

本发明的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒的一种制备方法是以pAdEasy-1质粒为模板，以SEQ ID No.2（P1）和SEQ ID No.3（P2）为引物进行扩增，得到扩增产物RGD1；以pAdEasy-1质粒为模板，以SEQ ID No.4（P3）和SEQ ID No.5（P4）为引物进行扩增，得到扩增产物RGD2；将RGD1和RGD2分别胶回收后按体积比1:1混合作为模板，用SEQ ID No.2（P1）和SEQ ID No.5（P4）为引物进行扩增得到RGD-HI；将RGD-HI电泳后切取MARKER中6k附近条带，胶回收，SPE1和pac1切后回收得到6233bp片段；SPE1和pac1酶切pAdEasy-1，回收27249bp条带，将回收的部分与RGD-HI连接，获得pAd-RGD质粒；将TK基因、人UPII启动子有序定向连接到腺病毒穿梭质粒，构建得到pS- UPII-TK。见说明书附图7. 

本发明的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒可在膀胱癌生物治疗中应用。

本发明相对现有技术的优点在于： 

腺病毒载体虽能运载目的基因表达与宿主细胞,但必须依赖腺病毒受体CAR进入细胞,但肿瘤细胞中CAR的表达往往是缺失的,本发明通过改造腺病毒载体达到了不通过CAR而直接进入细胞的能力,提高了该载体在肿瘤细胞中的感染效率，解决了现有技术存在的腺病毒的CAR受体依赖性问题。

本发明在改造嗜性的腺病毒中由膀胱组织特异性UPII启动子控制自杀基因TK的表达，构建成选择性表达腺病毒,以达到在肿瘤细胞中实现特异性的自杀基因表达产物为胸苷激酶,该产物使药物丙氧鸟苷(GCV)磷酸化，磷酸化丙氧鸟苷(GP)掺入到细胞DNA中，引起DNA损伤导致细胞凋亡。从而达到靶向杀伤肿瘤细胞的目的。本发明通过UPII启动子驱动自杀基因表达通过毒性产物诱导肿瘤细胞凋亡,微弱表达即可裂解大量靶细胞,提高了治疗效果，解决了现有技术中腺病毒的靶向性问题。 

TK基因是编码胸苷激酶的基因， HSV-TK／GCV系统治疗恶性肿瘤是研究最广泛的自杀基因治疗方法之一。通过载体携带胸苷激酶基因(TK基因)，进入肿瘤细胞并表达产生胸苷激酶，胸苷激酶活化后，使抗病毒药物丙氧鸟苷(GCV)磷酸化，磷酸化丙氧鸟苷(GP)掺入到细胞DNA中，引起足够的DNA损伤导致细胞凋亡。从而达到治疗癌症的目的。因此，细胞增殖越快，则GCV对其作用越明显，见^：Guan H, Williams JF, Ricciardi RP. Induction of neuronal and tumor-related genes by adenovirus type 12 TK. J Virol. 2009 Jan;83(2):651-61. 。此外，GP可以通过细胞膜到达临近细胞，导致临近细胞的凋亡发挥旁观者效应（bystander）而扩大对肿瘤细胞的杀伤效应，见：Itamochi H, Kigawa J, Kanamori Y, Oishi T, Bartholomeusz C, Nahta R, Esteva FJ, Sneige N, Terakawa N and Ueno NT: Adenovirus type 5 TK gene therapy for ovarian clear cell carcinoma: a potential treatment strategy. Mol Cancer Ther. 6: 2007；227-35.，解决了现有技术中存在的复制裂解肿瘤的溶瘤效果差的问题。 

本发明很好地解决了膀胱癌病毒治疗的安全性问题：本发明通过病毒介导TK基因在肿瘤细胞的表达杀伤肿瘤细胞，其表达产物诱导细胞凋亡需要药物GCV诱导，可以通过控制GCV的给药时间和剂量控制毒性产物磷酸化丙氧鸟苷(GP)的产生量，的确保了可控性和安全性；通过UPII启动子控制腺病毒靶向性在膀胱癌细胞内表达；该病毒为缺陷病毒，自身无复制能力，只能作为载体运载目的基因到达靶细胞而不能自我复制。 

本发明的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒在用于治疗膀胱肿瘤时，因病变器官特殊条件，使其可能直接通过尿道给药，进行膀胱灌注，这又可解决现有技术所存在的给药不便的问题。 

以下是与本发明相关的前期工作已发表的相关论文： 

1）Degui Wang, Zhiping Wang, Junqiang Tian, Xiangdong He, Wasim H. Chowdhury, Xiangbo Zhang, Shigang Li, Ronald Rodriguez. Prostate Stem Cell Antigen Enhancer and Uroplakin II Promoter Based Tissue Specific Vector Target Bladder Cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations.Urol Oncol. 2010 Mar-Apr;28(2):164-9. PMID: 18440837；

2）溶瘤病毒治疗肿瘤研究进展，国际肿瘤学杂志, 2006，33（3）：198-200。王德贵,田迎霞，王志平（1/3）；

3）Xiang-dong HE, Zhi-ping WANG, Hai-yan WEI, Qin ZHOU, De-gui WANG, Jun-qiang TIAN, Sheng-jun FU，Ronald RODRIGUEZ. Construction of urothelium–specific recombinant adenovirus and its inhibition in bladder cancer cell，accepted by Urologia International. 2008.；

4）金伟伟,何向东,王志平,王德贵,魏海燕,周钦,田俊强. 膀胱上皮特异性重组腺病毒的构建及其对膀胱癌细胞的抑制作用.现代泌尿生殖肿瘤杂志, 2 0 1 0, 6(2): 173-177；

另，本发明得到2011年国家自然基金地区项目资助(基于组织特异性调控元件和HSV-tk的靶向性缺陷腺病毒治疗膀胱癌的研究，811602870)。

附图说明

附图1. UPII启动子在膀胱癌细胞T24, BIU87, 5637和非膀胱癌细胞中的活性比较。图中T24、BIU87、5637为膀胱癌细胞，启动子驱动报告基因luc的活性明显较高，而在人胃癌细胞系 (BGC823);人前列腺癌细胞系细胞（PC3, LANCap）中启动子驱动报告基因luc的活性较低。说明UPII启动子具有膀胱癌特异性。 

附图2 病毒RGDAd-UPII-TK（左侧）和RGDAd-UPII-Null（右侧）感染T24细胞后目的蛋白HSV-tk的表达。RGDAd-UPII-TK（左侧）和RGDAd-UPII-Null（右侧）感染T24细胞后，通过western-blot检测tk的表达，以actin表达为内参照，感染RGDAd-UPII-TK（左侧）的T24细胞裂解液中检测到tk蛋白的表达，RGDAd-UPII-Null（右侧）感染T24细胞后检测不到TK表达。 

附图3. 体外实验裂解膀胱癌细胞T24。 膀胱癌细胞T24分别感染RGDAd-UPII-TK（治疗）和RGDAd-UPII-Null（对照）.RGDAd-UPII-TK感染细胞后在体系中加入GCV（0.02 μg/ml）培养12小时后细胞大量凋亡，而感染对照病毒RGDAd-UPII-NULL的细胞加入GCV后细胞未出现大量凋亡。说明了本发明的RGDAd-UPII-TK能够靶向性杀伤膀胱癌细胞。 

附图4. MTT法检测抑制肿瘤效果. RGDAd-UPII-TK感染细胞后在体系中加入GCV培养12小时后细胞大量凋亡，而感染对照病毒RGDAd-UPII-NULL的细胞加入GCV后细胞未出现大量凋亡。MTT检测治疗后细胞存活量。以上结果说明了RGDAd-UPII-TK能够靶向性杀伤膀胱癌细胞。 

附图5. 裸鼠接种瘤治疗后瘤体大小示意。建立T24荷瘤小鼠动物模型，通过重组腺病毒瘤体内直接注射方法感染腺病毒，连续3次，隔日注射，每次注射剂量为2×10⁸，总剂量为6×10⁸. 病毒注射同时开始注射GCV,每天一次，每次60mg/kg/d，连续注射一周。注射完成后继续饲养2周，测量计算瘤体体积、测量瘤体直径，取得瘤体组织称量瘤重。结果说明了在体内实验中，腺病毒RGDAd-UPII-TK联合GCV可以抑制小鼠接种膀胱肿瘤的生长，瘤体重量明显较对照小，而感染对照病毒RGDAd-UPII-NULL对接种肿瘤无明显抑制。 

附图6. 裸鼠接种瘤治疗后瘤体重量统计。为附图5中瘤体体积统计结果。 

附图7 所构建病毒穿梭质粒图谱。 图示UPII启动子和TK定向有序位置。 

    附图8 RGD 改造示意图。 

附图9RDG经改造后测序结果（插入RGD序列已突出显示），显示证明RGD已经成功插入Adeasy5病毒骨架纤毛区。 

改造后序列中：SEQ ID No. 8为 RGD改造后pAdEasy–RGD 27241-30244 序列，SEQ ID No.9为 Up2 PROMOTER附序列 

上序列中突出显示部分系扩增插入的部分。

具体实施方式

1)  改造腺病毒纤毛区序列 

采用基因工程的方法，将RGD序列整合入腺病毒HI环区骨架质粒获得pRGDAd。通过设计入突变序列的重叠PCR(overlapping PCR).获得插入RGD序列的片段。引物如下：

SEQ ID No 2 P1: 5’ CTGACTCTTAAGGACTAGTTTCGCGC 3’

SEQ ID No 3 P2: 5’ GATCTCCACGAGTTGTGTCTCCTGT 3’

SEQ ID No 4 P3: 5’AACT CGTGGAGATCCAAGTGCATACTC  3’

SEQ ID No 5 P4：5’ACGTAGGATCCATGCATGTTAATTAA 3’以pAdEasy-1质粒为模板，P1、P2为引物，克隆出27241-30218的碱基， 将腺病毒HI loop上游2979bp产物，命名为RGD1。

以pAdEasy-1质粒为模板，P3、P4为引物，克隆30219-33480， HI loop下游3283bp产物，命名为RGD2，PCR条件同上。 

将RGD1和RGD2分别胶回收，并按体积比1:1混合作为为模板，再以P1、P4 为引物PCR扩增, 扩增产物命名为RGD-HI。 

  

PCR产物电泳后切取MARKER中6k附近条带，胶回收，用SPE1和pac1切后回收得到6233bp片段，再用SPE1和pac1酶切pAdEasy-1，回收27249bp条带，与RGD-HI连接，获得pAd-RGD质粒。测序鉴定产物序列。测序鉴定结果见附图9。测序结果显示RGD插入成功。 

2)  腺病毒穿梭质粒和骨架载体的构建和鉴定 

UPⅡ是在尿路上皮发现的特异性存在的糖蛋白，为了分离UPⅡ启动子，本发明采用PCR技术，以膀胱癌细胞T24细胞DNA为模板，扩增出启动子序列。

Uroplaquing II Promoter（UP II）引物 

（P4）5’ accggtcaggcttcaccccagacc 3’

（P5）5’ gatgctgggctgggaggtggaatag 3’

。

3)  构建腺病毒载体 

分别将克隆出的TK基因人UPII启动子有序定向连接到腺病毒穿梭质粒，构建所得穿梭质粒图谱见附图7. 分别构建pS- UPII-TK和用于进行对照的pS－UPII－Luc； pS-UPII-Null（Null为随机序列，包装成病毒后作为对照）。通过同源重组原理获得腺病毒质粒RGDAd-UPII-TK、RGDAd-UPII－Luc；RGDAd-UPII-Null。

)  基因转染和病毒包装及表达产物确定： 

采用转染试剂Lipofectin 2000转染质粒到293细胞包装腺病毒。培养细胞获得病毒，连续传代3次，观察获得的上清是否具有感染力。常规方法收集扩增病毒，氯化铯超速离心获得重组腺病毒。感染T24细胞,24小时候裂解细胞, 通过western-blot检测自杀基因TK的表达产物蛋白，以actin表达为内参照，感染RGDAd-UPII-TK（左侧）的T24细胞裂解液中检测到tk蛋白的表达，RGDAd-UPII-Null（右侧）感染T24细胞后检测不到tk表达(附图2)。最终得到的重组腺病毒序列见SEQ ID No 1。

5)  重组腺病毒肿瘤杀伤效应检测： 

选择膀胱癌细胞(T24，BIU87，5637);和人胃癌细胞系 (BGC823);人前列腺癌细胞系细胞（PC3, LANCap）；人正常尿路上皮细胞（NHU）。将上述获得的重组腺病毒分别感染膀胱肿瘤细胞和非膀胱肿瘤细胞。结果如附图1所示，携带有报告基因luc的RGDAd-UPII－Luc在膀胱肿瘤内Luc活性高于正常尿路上皮细胞和其他肿瘤细胞，说明GDAd- UPII－Luc能够使目的基因在膀胱癌细胞中特异性高效表达。图2示RGDAd-UPII-TK感染后膀胱癌细胞系T24中有TK表达。说明RGDAd-UPII-TK能够在膀胱癌细胞中表达TK基因。通过细胞实验观察RGDAd-UPII-TK(治疗组)和RGDAd- UPII-Null（对照组）体外溶瘤效应，结果见图3，RGDAd-UPII-TK感染细胞后在体系中加入GCV培养12小时后细胞大量凋亡，而感染对照病毒RGDAd-UPII-NULL的细胞加入GCV（0.02 μg/ml）后细胞未出现大量凋亡。MTT结果如图4。以上结果说明了RGDAd-UPII-TK能够靶向性杀伤膀胱癌细胞。

6)  重组腺病毒体内杀伤效应和特异性检测： 

在膀胱癌细胞株中选择T24细胞，采用裸鼠背部注射肿瘤细胞的方法建立荷瘤裸鼠模型，通过重组腺病毒瘤体内直接注射方法感染腺病毒，连续3次，隔日注射，每次注射剂量为2×10⁸，总剂量为6×10⁸. 病毒注射同时开始注射GCV,每天一次，每次60mg/kg/d，连续注射一周。注射完成后继续饲养2周，测量计算瘤体体积、测量瘤体直径，取得瘤体组织称量瘤重。结果如附图5,瘤体重量统计如附图6。结果说明了在体内实验中，腺病毒RGDAd-UPII-TK联合GCV可以抑制小鼠接种膀胱肿瘤的生长，瘤体重量明显较对照小，而感染对照病毒RGDAd-UPII-NULL对接种肿瘤无明显抑制。

 

<110>  兰州大学

<120>  一种高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒

<160>  

 

<210>  1

<211>  33476

<212>  DNA

<213>  高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒

<400> 

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tctcagcagc tgttggatct gcgccagcag gtttctgccc tgaaggcttc ctcccctccc    4200

aatgcggttt aaaacataaa taaaaaacca gactctgttt ggatttggat caagcaagtg    4260

tcttgctgtc tttatttagg ggttttgcgc gcgcggtagg cccgggacca gcggtctcgg    4320

tcgttgaggg tcctgtgtat tttttccagg acgtggtaaa ggtgactctg gatgttcaga    4380

tacatgggca taagcccgtc tctggggtgg aggtagcacc actgcagagc ttcatgctgc    4440

ggggtggtgt tgtagatgat ccagtcgtag caggagcgct gggcgtggtg cctaaaaatg    4500

tctttcagta gcaagctgat tgccaggggc aggcccttgg tgtaagtgtt tacaaagcgg    4560

ttaagctggg atgggtgcat acgtggggat atgagatgca tcttggactg tatttttagg    4620

ttggctatgt tcccagccat atccctccgg ggattcatgt tgtgcagaac caccagcaca    4680

gtgtatccgg tgcacttggg aaatttgtca tgtagcttag aaggaaatgc gtggaagaac    4740

ttggagacgc ccttgtgacc tccaagattt tccatgcatt cgtccataat gatggcaatg    4800

ggcccacggg cggcggcctg ggcgaagata tttctgggat cactaacgtc atagttgtgt    4860

tccaggatga gatcgtcata ggccattttt acaaagcgcg ggcggagggt gccagactgc    4920

ggtataatgg ttccatccgg cccaggggcg tagttaccct cacagatttg catttcccac    4980

gctttgagtt cagatggggg gatcatgtct acctgcgggg cgatgaagaa aacggtttcc    5040

ggggtagggg agatcagctg ggaagaaagc aggttcctga gcagctgcga cttaccgcag    5100

ccggtgggcc cgtaaatcac acctattacc ggctgcaact ggtagttaag agagctgcag    5160

ctgccgtcat ccctgagcag gggggccact tcgttaagca tgtccctgac tcgcatgttt    5220

tccctgacca aatccgccag aaggcgctcg ccgcccagcg atagcagttc ttgcaaggaa    5280

gcaaagtttt tcaacggttt gagaccgtcc gccgtaggca tgcttttgag cgtttgacca    5340

agcagttcca ggcggtccca cagctcggtc acctgctcta cggcatctcg atccagcata    5400

tctcctcgtt tcgcgggttg gggcggcttt cgctgtacgg cagtagtcgg tgctcgtcca    5460

gacgggccag ggtcatgtct ttccacgggc gcagggtcct cgtcagcgta gtctgggtca    5520

cggtgaaggg gtgcgctccg ggctgcgcgc tggccagggt gcgcttgagg ctggtcctgc    5580

tggtgctgaa gcgctgccgg tcttcgccct gcgcgtcggc caggtagcat ttgaccatgg    5640

tgtcatagtc cagcccctcc gcggcgtggc ccttggcgcg cagcttgccc ttggaggagg    5700

cgccgcacga ggggcagtgc agacttttga gggcgtagag cttgggcgcg agaaataccg    5760

attccgggga gtaggcatcc gcgccgcagg ccccgcagac ggtctcgcat tccacgagcc    5820

aggtgagctc tggccgttcg gggtcaaaaa ccaggtttcc cccatgcttt ttgatgcgtt    5880

tcttacctct ggtttccatg agccggtgtc cacgctcggt gacgaaaagg ctgtccgtgt    5940

ccccgtatac agacttgaga ggcctgtcct cgagcggtgt tccgcggtcc tcctcgtata    6000

gaaactcgga ccactctgag acaaaggctc gcgtccaggc cagcacgaag gaggctaagt    6060

gggaggggta gcggtcgttg tccactaggg ggtccactcg ctccagggtg tgaagacaca    6120

tgtcgccctc ttcggcatca aggaaggtga ttggtttgta ggtgtaggcc acgtgaccgg    6180

gtgttcctga aggggggcta taaaaggggg tgggggcgcg ttcgtcctca ctctcttccg    6240

catcgctgtc tgcgagggcc agctgttggg gtgagtactc cctctgaaaa gcgggcatga    6300

cttctgcgct aagattgtca gtttccaaaa acgaggagga tttgatattc acctggcccg    6360

cggtgatgcc tttgagggtg gccgcatcca tctggtcaga aaagacaatc tttttgttgt    6420

caagcttggt ggcaaacgac ccgtagaggg cgttggacag caacttggcg atggagcgca    6480

gggtttggtt tttgtcgcga tcggcgcgct ccttggccgc gatgtttagc tgcacgtatt    6540

cgcgcgcaac gcaccgccat tcgggaaaga cggtggtgcg ctcgtcgggc accaggtgca    6600

cgcgccaacc gcggttgtgc agggtgacaa ggtcaacgct ggtggctacc tctccgcgta    6660

ggcgctcgtt ggtccagcag aggcggccgc ccttgcgcga gcagaatggc ggtagggggt    6720

ctagctgcgt ctcgtccggg gggtctgcgt ccacggtaaa gaccccgggc agcaggcgcg    6780

cgtcgaagta gtctatcttg catccttgca agtctagcgc ctgctgccat gcgcgggcgg    6840

caagcgcgcg ctcgtatggg ttgagtgggg gaccccatgg catggggtgg gtgagcgcgg    6900

aggcgtacat gccgcaaatg tcgtaaacgt agaggggctc tctgagtatt ccaagatatg    6960

tagggtagca tcttccaccg cggatgctgg cgcgcacgta atcgtatagt tcgtgcgagg    7020

gagcgaggag gtcgggaccg aggttgctac gggcgggctg ctctgctcgg aagactatct    7080

gcctgaagat ggcatgtgag ttggatgata tggttggacg ctggaagacg ttgaagctgg    7140

cgtctgtgag acctaccgcg tcacgcacga aggaggcgta ggagtcgcgc agcttgttga    7200

ccagctcggc ggtgacctgc acgtctaggg cgcagtagtc cagggtttcc ttgatgatgt    7260

catacttatc ctgtcccttt tttttccaca gctcgcggtt gaggacaaac tcttcgcggt    7320

ctttccagta ctcttggatc ggaaacccgt cggcctccga acggtaagag cctagcatgt    7380

agaactggtt gacggcctgg taggcgcagc atcccttttc tacgggtagc gcgtatgcct    7440

gcgcggcctt ccggagcgag gtgtgggtga gcgcaaaggt gtccctgacc atgactttga    7500

ggtactggta tttgaagtca gtgtcgtcgc atccgccctg ctcccagagc aaaaagtccg    7560

tgcgcttttt ggaacgcgga tttggcaggg cgaaggtgac atcgttgaag agtatctttc    7620

ccgcgcgagg cataaagttg cgtgtgatgc ggaagggtcc cggcacctcg gaacggttgt    7680

taattacctg ggcggcgagc acgatctcgt caaagccgtt gatgttgtgg cccacaatgt    7740

aaagttccaa gaagcgcggg atgcccttga tggaaggcaa ttttttaagt tcctcgtagg    7800

tgagctcttc aggggagctg agcccgtgct ctgaaagggc ccagtctgca agatgagggt    7860

tggaagcgac gaatgagctc cacaggtcac gggccattag catttgcagg tggtcgcgaa    7920

aggtcctaaa ctggcgacct atggccattt tttctggggt gatgcagtag aaggtaagcg    7980

ggtcttgttc ccagcggtcc catccaaggt tcgcggctag gtctcgcgcg gcagtcacta    8040

gaggctcatc tccgccgaac ttcatgacca gcatgaaggg cacgagctgc ttcccaaagg    8100

cccccatcca agtataggtc tctacatcgt aggtgacaaa gagacgctcg gtgcgaggat    8160

gcgagccgat cgggaagaac tggatctccc gccaccaatt ggaggagtgg ctattgatgt    8220

ggtgaaagta gaagtccctg cgacgggccg aacactcgtg ctggcttttg taaaaacgtg    8280

cgcagtactg gcagcggtgc acgggctgta catcctgcac gaggttgacc tgacgaccgc    8340

gcacaaggaa gcagagtggg aatttgagcc cctcgcctgg cgggtttggc tggtggtctt    8400

ctacttcggc tgcttgtcct tgaccgtctg gctgctcgag gggagttacg gtggatcgga    8460

ccaccacgcc gcgcgagccc aaagtccaga tgtccgcgcg cggcggtcgg agcttgatga    8520

caacatcgcg cagatgggag ctgtccatgg tctggagctc ccgcggcgtc aggtcaggcg    8580

ggagctcctg caggtttacc tcgcatagac gggtcagggc gcgggctaga tccaggtgat    8640

acctaatttc caggggctgg ttggtggcgg cgtcgatggc ttgcaagagg ccgcatcccc    8700

gcggcgcgac tacggtaccg cgcggcgggc ggtgggccgc gggggtgtcc ttggatgatg    8760

catctaaaag cggtgacgcg ggcgagcccc cggaggtagg gggggctccg gacccgccgg    8820

gagagggggc aggggcacgt cggcgccgcg cgcgggcagg agctggtgct gcgcgcgtag    8880

gttgctggcg aacgcgacga cgcggcggtt gatctcctga atctggcgcc tctgcgtgaa    8940

gacgacgggc ccggtgagct tgaacctgaa agagagttcg acagaatcaa tttcggtgtc    9000

gttgacggcg gcctggcgca aaatctcctg cacgtctcct gagttgtctt gataggcgat    9060

ctcggccatg aactgctcga tctcttcctc ctggagatct ccgcgtccgg ctcgctccac    9120

ggtggcggcg aggtcgttgg aaatgcgggc catgagctgc gagaaggcgt tgaggcctcc    9180

ctcgttccag acgcggctgt agaccacgcc cccttcggca tcgcgggcgc gcatgaccac    9240

ctgcgcgaga ttgagctcca cgtgccgggc gaagacggcg tagtttcgca ggcgctgaaa    9300

gaggtagttg agggtggtgg cggtgtgttc tgccacgaag aagtacataa cccagcgtcg    9360

caacgtggat tcgttgatat cccccaaggc ctcaaggcgc tccatggcct cgtagaagtc    9420

cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg cgccgacacg gttaactcct cctccagaag    9480

acggatgagc tcggcgacag tgtcgcgcac ctcgcgctca aaggctacag gggcctcttc    9540

ttcttcttca atctcctctt ccataagggc ctccccttct tcttcttctg gcggcggtgg    9600

gggagggggg acacggcggc gacgacggcg caccgggagg cggtcgacaa agcgctcgat    9660

catctccccg cggcgacggc gcatggtctc ggtgacggcg cggccgttct cgcgggggcg    9720

cagttggaag acgccgcccg tcatgtcccg gttatgggtt ggcggggggc tgccatgcgg    9780

cagggatacg gcgctaacga tgcatctcaa caattgttgt gtaggtactc cgccgccgag    9840

ggacctgagc gagtccgcat cgaccggatc ggaaaacctc tcgagaaagg cgtctaacca    9900

gtcacagtcg caaggtaggc tgagcaccgt ggcgggcggc agcgggcggc ggtcggggtt    9960

gtttctggcg gaggtgctgc tgatgatgta attaaagtag gcggtcttga gacggcggat   10020

ggtcgacaga agcaccatgt ccttgggtcc ggcctgctga atgcgcaggc ggtcggccat   10080

gccccaggct tcgttttgac atcggcgcag gtctttgtag tagtcttgca tgagcctttc   10140

taccggcact tcttcttctc cttcctcttg tcctgcatct cttgcatcta tcgctgcggc   10200

ggcggcggag tttggccgta ggtggcgccc tcttcctccc atgcgtgtga ccccgaagcc   10260

cctcatcggc tgaagcaggg ctaggtcggc gacaacgcgc tcggctaata tggcctgctg   10320

cacctgcgtg agggtagact ggaagtcatc catgtccaca aagcggtggt atgcgcccgt   10380

gttgatggtg taagtgcagt tggccataac ggaccagtta acggtctggt gacccggctg   10440

cgagagctcg gtgtacctga gacgcgagta agccctcgag tcaaatacgt agtcgttgca   10500

agtccgcacc aggtactggt atcccaccaa aaagtgcggc ggcggctggc ggtagagggg   10560

ccagcgtagg gtggccgggg ctccgggggc gagatcttcc aacataaggc gatgatatcc   10620

gtagatgtac ctggacatcc aggtgatgcc ggcggcggtg gtggaggcgc gcggaaagtc   10680

gcggacgcgg ttccagatgt tgcgcagcgg caaaaagtgc tccatggtcg ggacgctctg   10740

gccggtcagg cgcgcgcaat cgttgacgct ctagcgtgca aaaggagagc ctgtaagcgg   10800

gcactcttcc gtggtctggt ggataaattc gcaagggtat catggcggac gaccggggtt   10860

cgagccccgt atccggccgt ccgccgtgat ccatgcggtt accgcccgcg tgtcgaaccc   10920

aggtgtgcga cgtcagacaa cgggggagtg ctccttttgg cttccttcca ggcgcggcgg   10980

ctgctgcgct agcttttttg gccactggcc gcgcgcagcg taagcggtta ggctggaaag   11040

cgaaagcatt aagtggctcg ctccctgtag ccggagggtt attttccaag ggttgagtcg   11100

cgggaccccc ggttcgagtc tcggaccggc cggactgcgg cgaacggggg tttgcctccc   11160

cgtcatgcaa gaccccgctt gcaaattcct ccggaaacag ggacgagccc cttttttgct   11220

tttcccagat gcatccggtg ctgcggcaga tgcgcccccc tcctcagcag cggcaagagc   11280

aagagcagcg gcagacatgc agggcaccct cccctcctcc taccgcgtca ggaggggcga   11340

catccgcggt tgacgcggca gcagatggtg attacgaacc cccgcggcgc cgggcccggc   11400

actacctgga cttggaggag ggcgagggcc tggcgcggct aggagcgccc tctcctgagc   11460

ggcacccaag ggtgcagctg aagcgtgata cgcgtgaggc gtacgtgccg cggcagaacc   11520

tgtttcgcga ccgcgaggga gaggagcccg aggagatgcg ggatcgaaag ttccacgcag   11580

ggcgcgagct gcggcatggc ctgaatcgcg agcggttgct gcgcgaggag gactttgagc   11640

ccgacgcgcg aaccgggatt agtcccgcgc gcgcacacgt ggcggccgcc gacctggtaa   11700

ccgcatacga gcagacggtg aaccaggaga ttaactttca aaaaagcttt aacaaccacg   11760

tgcgtacgct tgtggcgcgc gaggaggtgg ctataggact gatgcatctg tgggactttg   11820

taagcgcgct ggagcaaaac ccaaatagca agccgctcat ggcgcagctg ttccttatag   11880

tgcagcacag cagggacaac gaggcattca gggatgcgct gctaaacata gtagagcccg   11940

agggccgctg gctgctcgat ttgataaaca tcctgcagag catagtggtg caggagcgca   12000

gcttgagcct ggctgacaag gtggccgcca tcaactattc catgcttagc ctgggcaagt   12060

tttacgcccg caagatatac catacccctt acgttcccat agacaaggag gtaaagatcg   12120

aggggttcta catgcgcatg gcgctgaagg tgcttacctt gagcgacgac ctgggcgttt   12180

atcgcaacga gcgcatccac aaggccgtga gcgtgagccg gcggcgcgag ctcagcgacc   12240

gcgagctgat gcacagcctg caaagggccc tggctggcac gggcagcggc gatagagagg   12300

ccgagtccta ctttgacgcg ggcgctgacc tgcgctgggc cccaagccga cgcgccctgg   12360

aggcagctgg ggccggacct gggctggcgg tggcacccgc gcgcgctggc aacgtcggcg   12420

gcgtggagga atatgacgag gacgatgagt acgagccaga ggacggcgag tactaagcgg   12480

tgatgtttct gatcagatga tgcaagacgc aacggacccg gcggtgcggg cggcgctgca   12540

gagccagccg tccggcctta actccacgga cgactggcgc caggtcatgg accgcatcat   12600

gtcgctgact gcgcgcaatc ctgacgcgtt ccggcagcag ccgcaggcca accggctctc   12660

cgcaattctg gaagcggtgg tcccggcgcg cgcaaacccc acgcacgaga aggtgctggc   12720

gatcgtaaac gcgctggccg aaaacagggc catccggccc gacgaggccg gcctggtcta   12780

cgacgcgctg cttcagcgcg tggctcgtta caacagcggc aacgtgcaga ccaacctgga   12840

ccggctggtg ggggatgtgc gcgaggccgt ggcgcagcgt gagcgcgcgc agcagcaggg   12900

caacctgggc tccatggttg cactaaacgc cttcctgagt acacagcccg ccaacgtgcc   12960

gcggggacag gaggactaca ccaactttgt gagcgcactg cggctaatgg tgactgagac   13020

accgcaaagt gaggtgtacc agtctgggcc agactatttt ttccagacca gtagacaagg   13080

cctgcagacc gtaaacctga gccaggcttt caaaaacttg caggggctgt ggggggtgcg   13140

ggctcccaca ggcgaccgcg cgaccgtgtc tagcttgctg acgcccaact cgcgcctgtt   13200

gctgctgcta atagcgccct tcacggacag tggcagcgtg tcccgggaca catacctagg   13260

tcacttgctg acactgtacc gcgaggccat aggtcaggcg catgtggacg agcatacttt   13320

ccaggagatt acaagtgtca gccgcgcgct ggggcaggag gacacgggca gcctggaggc   13380

aaccctaaac tacctgctga ccaaccggcg gcagaagatc ccctcgttgc acagtttaaa   13440

cagcgaggag gagcgcattt tgcgctacgt gcagcagagc gtgagcctta acctgatgcg   13500

cgacggggta acgcccagcg tggcgctgga catgaccgcg cgcaacatgg aaccgggcat   13560

gtatgcctca aaccggccgt ttatcaaccg cctaatggac tacttgcatc gcgcggccgc   13620

cgtgaacccc gagtatttca ccaatgccat cttgaacccg cactggctac cgccccctgg   13680

tttctacacc gggggattcg aggtgcccga gggtaacgat ggattcctct gggacgacat   13740

agacgacagc gtgttttccc cgcaaccgca gaccctgcta gagttgcaac agcgcgagca   13800

ggcagaggcg gcgctgcgaa aggaaagctt ccgcaggcca agcagcttgt ccgatctagg   13860

cgctgcggcc ccgcggtcag atgctagtag cccatttcca agcttgatag ggtctcttac   13920

cagcactcgc accacccgcc cgcgcctgct gggcgaggag gagtacctaa acaactcgct   13980

gctgcagccg cagcgcgaaa aaaacctgcc tccggcattt cccaacaacg ggatagagag   14040

cctagtggac aagatgagta gatggaagac gtacgcgcag gagcacaggg acgtgccagg   14100

cccgcgcccg cccacccgtc gtcaaaggca cgaccgtcag cggggtctgg tgtgggagga   14160

cgatgactcg gcagacgaca gcagcgtcct ggatttggga gggagtggca acccgtttgc   14220

gcaccttcgc cccaggctgg ggagaatgtt ttaaaaaaaa aaaagcatga tgcaaaataa   14280

aaaactcacc aaggccatgg caccgagcgt tggttttctt gtattcccct tagtatgcgg   14340

cgcgcggcga tgtatgagga aggtcctcct ccctcctacg agagtgtggt gagcgcggcg   14400

ccagtggcgg cggcgctggg ttctcccttc gatgctcccc tggacccgcc gtttgtgcct   14460

ccgcggtacc tgcggcctac cggggggaga aacagcatcc gttactctga gttggcaccc   14520

ctattcgaca ccacccgtgt gtacctggtg gacaacaagt caacggatgt ggcatccctg   14580

aactaccaga acgaccacag caactttctg accacggtca ttcaaaacaa tgactacagc   14640

ccgggggagg caagcacaca gaccatcaat cttgacgacc ggtcgcactg gggcggcgac   14700

ctgaaaacca tcctgcatac caacatgcca aatgtgaacg agttcatgtt taccaataag   14760

tttaaggcgc gggtgatggt gtcgcgcttg cctactaagg acaatcaggt ggagctgaaa   14820

tacgagtggg tggagttcac gctgcccgag ggcaactact ccgagaccat gaccatagac   14880

cttatgaaca acgcgatcgt ggagcactac ttgaaagtgg gcagacagaa cggggttctg   14940

gaaagcgaca tcggggtaaa gtttgacacc cgcaacttca gactggggtt tgaccccgtc   15000

actggtcttg tcatgcctgg ggtatataca aacgaagcct tccatccaga catcattttg   15060

ctgccaggat gcggggtgga cttcacccac agccgcctga gcaacttgtt gggcatccgc   15120

aagcggcaac ccttccagga gggctttagg atcacctacg atgatctgga gggtggtaac   15180

attcccgcac tgttggatgt ggacgcctac caggcgagct tgaaagatga caccgaacag   15240

ggcgggggtg gcgcaggcgg cagcaacagc agtggcagcg gcgcggaaga gaactccaac   15300

gcggcagccg cggcaatgca gccggtggag gacatgaacg atcatgccat tcgcggcgac   15360

acctttgcca cacgggctga ggagaagcgc gctgaggccg aagcagcggc cgaagctgcc   15420

gcccccgctg cgcaacccga ggtcgagaag cctcagaaga aaccggtgat caaacccctg   15480

acagaggaca gcaagaaacg cagttacaac ctaataagca atgacagcac cttcacccag   15540

taccgcagct ggtaccttgc atacaactac ggcgaccctc agaccggaat ccgctcatgg   15600

accctgcttt gcactcctga cgtaacctgc ggctcggagc aggtctactg gtcgttgcca   15660

gacatgatgc aagaccccgt gaccttccgc tccacgcgcc agatcagcaa ctttccggtg   15720

gtgggcgccg agctgttgcc cgtgcactcc aagagcttct acaacgacca ggccgtctac   15780

tcccaactca tccgccagtt tacctctctg acccacgtgt tcaatcgctt tcccgagaac   15840

cagattttgg cgcgcccgcc agcccccacc atcaccaccg tcagtgaaaa cgttcctgct   15900

ctcacagatc acgggacgct accgctgcgc aacagcatcg gaggagtcca gcgagtgacc   15960

attactgacg ccagacgccg cacctgcccc tacgtttaca aggccctggg catagtctcg   16020

ccgcgcgtcc tatcgagccg cactttttga gcaagcatgt ccatccttat atcgcccagc   16080

aataacacag gctggggcct gcgcttccca agcaagatgt ttggcggggc caagaagcgc   16140

tccgaccaac acccagtgcg cgtgcgcggg cactaccgcg cgccctgggg cgcgcacaaa   16200

cgcggccgca ctgggcgcac caccgtcgat gacgccatcg acgcggtggt ggaggaggcg   16260

cgcaactaca cgcccacgcc gccaccagtg tccacagtgg acgcggccat tcagaccgtg   16320

gtgcgcggag cccggcgcta tgctaaaatg aagagacggc ggaggcgcgt agcacgtcgc   16380

caccgccgcc gacccggcac tgccgcccaa cgcgcggcgg cggccctgct taaccgcgca   16440

cgtcgcaccg gccgacgggc ggccatgcgg gccgctcgaa ggctggccgc gggtattgtc   16500

actgtgcccc ccaggtccag gcgacgagcg gccgccgcag cagccgcggc cattagtgct   16560

atgactcagg gtcgcagggg caacgtgtat tgggtgcgcg actcggttag cggcctgcgc   16620

gtgcccgtgc gcacccgccc cccgcgcaac tagattgcaa gaaaaaacta cttagactcg   16680

tactgttgta tgtatccagc ggcggcggcg cgcaacgaag ctatgtccaa gcgcaaaatc   16740

aaagaagaga tgctccaggt catcgcgccg gagatctatg gccccccgaa gaaggaagag   16800

caggattaca agccccgaaa gctaaagcgg gtcaaaaaga aaaagaaaga tgatgatgat   16860

gaacttgacg acgaggtgga actgctgcac gctaccgcgc ccaggcgacg ggtacagtgg   16920

aaaggtcgac gcgtaaaacg tgttttgcga cccggcacca ccgtagtctt tacgcccggt   16980

gagcgctcca cccgcaccta caagcgcgtg tatgatgagg tgtacggcga cgaggacctg   17040

cttgagcagg ccaacgagcg cctcggggag tttgcctacg gaaagcggca taaggacatg   17100

ctggcgttgc cgctggacga gggcaaccca acacctagcc taaagcccgt aacactgcag   17160

caggtgctgc ccgcgcttgc accgtccgaa gaaaagcgcg gcctaaagcg cgagtctggt   17220

gacttggcac ccaccgtgca gctgatggta cccaagcgcc agcgactgga agatgtcttg   17280

gaaaaaatga ccgtggaacc tgggctggag cccgaggtcc gcgtgcggcc aatcaagcag   17340

gtggcgccgg gactgggcgt gcagaccgtg gacgttcaga tacccactac cagtagcacc   17400

agtattgcca ccgccacaga gggcatggag acacaaacgt ccccggttgc ctcagcggtg   17460

gcggatgccg cggtgcaggc ggtcgctgcg gccgcgtcca agacctctac ggaggtgcaa   17520

acggacccgt ggatgtttcg cgtttcagcc ccccggcgcc cgcgccgttc gaggaagtac   17580

ggcgccgcca gcgcgctact gcccgaatat gccctacatc cttccattgc gcctaccccc   17640

ggctatcgtg gctacaccta ccgccccaga agacgagcaa ctacccgacg ccgaaccacc   17700

actggaaccc gccgccgccg tcgccgtcgc cagcccgtgc tggccccgat ttccgtgcgc   17760

agggtggctc gcgaaggagg caggaccctg gtgctgccaa cagcgcgcta ccaccccagc   17820

atcgtttaaa agccggtctt tgtggttctt gcagatatgg ccctcacctg ccgcctccgt   17880

ttcccggtgc cgggattccg aggaagaatg caccgtagga ggggcatggc cggccacggc   17940

ctgacgggcg gcatgcgtcg tgcgcaccac cggcggcggc gcgcgtcgca ccgtcgcatg   18000

cgcggcggta tcctgcccct ccttattcca ctgatcgccg cggcgattgg cgccgtgccc   18060

ggaattgcat ccgtggcctt gcaggcgcag agacactgat taaaaacaag ttgcatgtgg   18120

aaaaatcaaa ataaaaagtc tggactctca cgctcgcttg gtcctgtaac tattttgtag   18180

aatggaagac atcaactttg cgtctctggc cccgcgacac ggctcgcgcc cgttcatggg   18240

aaactggcaa gatatcggca ccagcaatat gagcggtggc gccttcagct ggggctcgct   18300

gtggagcggc attaaaaatt tcggttccac cgttaagaac tatggcagca aggcctggaa   18360

cagcagcaca ggccagatgc tgagggataa gttgaaagag caaaatttcc aacaaaaggt   18420

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aaataagatt aacagtaagc ttgatccccg ccctcccgta gaggagcctc caccggccgt   18540

ggagacagtg tctccagagg ggcgtggcga aaagcgtccg cgccccgaca gggaagaaac   18600

tctggtgacg caaatagacg agcctccctc gtacgaggag gcactaaagc aaggcctgcc   18660

caccacccgt cccatcgcgc ccatggctac cggagtgctg ggccagcaca cacccgtaac   18720

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cgttgttgta acccgtccta gccgcgcgtc cctgcgccgc gccgccagcg gtccgcgatc   18840

gttgcggccc gtagccagtg gcaactggca aagcacactg aacagcatcg tgggtctggg   18900

ggtgcaatcc ctgaagcgcc gacgatgctt ctgatagcta acgtgtcgta tgtgtgtcat   18960

gtatgcgtcc atgtcgccgc cagaggagct gctgagccgc cgcgcgcccg ctttccaaga   19020

tggctacccc ttcgatgatg ccgcagtggt cttacatgca catctcgggc caggacgcct   19080

cggagtacct gagccccggg ctggtgcagt ttgcccgcgc caccgagacg tacttcagcc   19140

tgaataacaa gtttagaaac cccacggtgg cgcctacgca cgacgtgacc acagaccggt   19200

cccagcgttt gacgctgcgg ttcatccctg tggaccgtga ggatactgcg tactcgtaca   19260

aggcgcggtt caccctagct gtgggtgata accgtgtgct ggacatggct tccacgtact   19320

ttgacatccg cggcgtgctg gacaggggcc ctacttttaa gccctactct ggcactgcct   19380

acaacgccct ggctcccaag ggtgccccaa atccttgcga atgggatgaa gctgctactg   19440

ctcttgaaat aaacctagaa gaagaggacg atgacaacga agacgaagta gacgagcaag   19500

ctgagcagca aaaaactcac gtatttgggc aggcgcctta ttctggtata aatattacaa   19560

aggagggtat tcaaataggt gtcgaaggtc aaacacctaa atatgccgat aaaacatttc   19620

aacctgaacc tcaaatagga gaatctcagt ggtacgaaac agaaattaat catgcagctg   19680

ggagagtcct aaaaaagact accccaatga aaccatgtta cggttcatat gcaaaaccca   19740

caaatgaaaa tggagggcaa ggcattcttg taaagcaaca aaatggaaag ctagaaagtc   19800

aagtggaaat gcaatttttc tcaactactg aggcagccgc aggcaatggt gataacttga   19860

ctcctaaagt ggtattgtac agtgaagatg tagatataga aaccccagac actcatattt   19920

cttacatgcc cactattaag gaaggtaact cacgagaact aatgggccaa caatctatgc   19980

ccaacaggcc taattacatt gcttttaggg acaattttat tggtctaatg tattacaaca   20040

gcacgggtaa tatgggtgtt ctggcgggcc aagcatcgca gttgaatgct gttgtagatt   20100

tgcaagacag aaacacagag ctttcatacc agcttttgct tgattccatt ggtgatagaa   20160

ccaggtactt ttctatgtgg aatcaggctg ttgacagcta tgatccagat gttagaatta   20220

ttgaaaatca tggaactgaa gatgaacttc caaattactg ctttccactg ggaggtgtga   20280

ttaatacaga gactcttacc aaggtaaaac ctaaaacagg tcaggaaaat ggatgggaaa   20340

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aaatcaatct aaatgccaac ctgtggagaa atttcctgta ctccaacata gcgctgtatt   20460

tgcccgacaa gctaaagtac agtccttcca acgtaaaaat ttctgataac ccaaacacct   20520

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gagcacgctg gtcccttgac tatatggaca acgtcaaccc atttaaccac caccgcaatg   20640

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acgagtggaa cttcaggaag gatgttaaca tggttctgca gagctcccta ggaaatgacc   20820

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ccatggccca caacaccgcc tccacgcttg aggccatgct tagaaacgac accaacgacc   20940

agtcctttaa cgactatctc tccgccgcca acatgctcta ccctataccc gccaacgcta   21000

ccaacgtgcc catatccatc ccctcccgca actgggcggc tttccgcggc tgggccttca   21060

cgcgccttaa gactaaggaa accccatcac tgggctcggg ctacgaccct tattacacct   21120

actctggctc tataccctac ctagatggaa ccttttacct caaccacacc tttaagaagg   21180

tggccattac ctttgactct tctgtcagct ggcctggcaa tgaccgcctg cttaccccca   21240

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tctatatccc agagagctac aaggaccgca tgtactcctt ctttagaaac ttccagccca   21420

tgagccgtca ggtggtggat gatactaaat acaaggacta ccaacaggtg ggcatcctac   21480

accaacacaa caactctgga tttgttggct accttgcccc caccatgcgc gaaggacagg   21540

cctaccctgc taacttcccc tatccgctta taggcaagac cgcagttgac agcattaccc   21600

agaaaaagtt tctttgcgat cgcacccttt ggcgcatccc attctccagt aactttatgt   21660

ccatgggcgc actcacagac ctgggccaaa accttctcta cgccaactcc gcccacgcgc   21720

tagacatgac ttttgaggtg gatcccatgg acgagcccac ccttctttat gttttgtttg   21780

aagtctttga cgtggtccgt gtgcaccagc cgcaccgcgg cgtcatcgaa accgtgtacc   21840

tgcgcacgcc cttctcggcc ggcaacgcca caacataaag aagcaagcaa catcaacaac   21900

agctgccgcc atgggctcca gtgagcagga actgaaagcc attgtcaaag atcttggttg   21960

tgggccatat tttttgggca cctatgacaa gcgctttcca ggctttgttt ctccacacaa   22020

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ccagcgactc aagcaggttt accagtttga gtacgagtca ctcctgcgcc gtagcgccat   22200

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caactcggcc gcctgtggac tattctgctg catgtttctc cacgcctttg ccaactggcc   22320

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atgcttttat ttgtacactc tcgggtgatt atttaccccc acccttgccg tctgcgccgt   22620

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cttgaagtcg cagttggggc ctccgccctg cgcgcgcgag ttgcgataca cagggttgca   22860

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cagatccgcg tccaggtcct ccgcgttgct cagggcgaac ggagtcaact ttggtagctg   22980

ccttcccaaa aagggcgcgt gcccaggctt tgagttgcac tcgcaccgta gtggcatcaa   23040

aaggtgaccg tgcccggtct gggcgttagg atacagcgcc tgcataaaag ccttgatctg   23100

cttaaaagcc acctgagcct ttgcgccttc agagaagaac atgccgcaag acttgccgga   23160

aaactgattg gccggacagg ccgcgtcgtg cacgcagcac cttgcgtcgg tgttggagat   23220

ctgcaccaca tttcggcccc accggttctt cacgatcttg gccttgctag actgctcctt   23280

cagcgcgcgc tgcccgtttt cgctcgtcac atccatttca atcacgtgct ccttatttat   23340

cataatgctt ccgtgtagac acttaagctc gccttcgatc tcagcgcagc ggtgcagcca   23400

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cgcgcgcgca gcctccatgc ccttctccca cgcagacacg atcggcacac tcagcgggtt   23700

catcaccgta atttcacttt ccgcttcgct gggctcttcc tcttcctctt gcgtccgcat   23760

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caccgatgcc gccaacgcgc ctaccacctt ccccgtcgag gcacccccgc ttgaggagga   24360

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catacctgat atcgcctcgc tcaacgaagt gccaaaaatc tttgagggtc ttggacgcga   24900

cgagaagcgc gcggcaaacg ctctgcaaca ggaaaacagc gaaaatgaaa gtcactctgg   24960

agtgttggtg gaactcgagg gtgacaacgc gcgcctagcc gtactaaaac gcagcatcga   25020

ggtcacccac tttgcctacc cggcacttaa cctacccccc aaggtcatga gcacagtcat   25080

gagtgagctg atcgtgcgcc gtgcgcagcc cctggagagg gatgcaaatt tgcaagaaca   25140

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cgagcctgcc gacttggagg agcgacgcaa actaatgatg gccgcagtgc tcgttaccgt   25260

ggagcttgag tgcatgcagc ggttctttgc tgacccggag atgcagcgca agctagagga   25320

aacattgcac tacacctttc gacagggcta cgtacgccag gcctgcaaga tctccaacgt   25380

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ccttcgcaaa tttgtacctg aggactacca cgcccacgag attaggttct acgaagacca   26160

atcccgcccg cctaatgcgg agcttaccgc ctgcgtcatt acccagggcc acattcttgg   26220

ccaattgcaa gccatcaaca aagcccgcca agagtttctg ctacgaaagg gacggggggt   26280

ttacttggac ccccagtccg gcgaggagct caacccaatc cccccgccgc cgcagcccta   26340

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gctttcttct ctaccatcac ggcgtggcct tcccccgtaa catcctgcat tactaccgtc   26880

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aacaggattt ttcccactct gtatgctata tttcaacaga gcaggggcca agaacaagag   27120

ctgaaaataa aaaacaggtc tctgcgatcc ctcacccgca gctgcctgta tcacaaaagc   27180

gaagatcagc ttcggcgcac gctggaagac gcggaggctc tcttcagtaa atactgcgcg   27240

ctgactctta aggactagtt tcgcgccctt tctcaaattt aagcgcgaaa actacgtcat   27300

ctccagcggc cacacccggc gccagcacct gttgtcagcg ccattatgag caaggaaatt   27360

cccacgccct acatgtggag ttaccagcca caaatgggac ttgcggctgg agctgcccaa   27420

gactactcaa cccgaataaa ctacatgagc gcgggacccc acatgatatc ccgggtcaac   27480

ggaatacgcg cccaccgaaa ccgaattctc ctggaacagg cggctattac caccacacct   27540

cgtaataacc ttaatccccg tagttggccc gctgccctgg tgtaccagga aagtcccgct   27600

cccaccactg tggtacttcc cagagacgcc caggccgaag ttcagatgac taactcaggg   27660

gcgcagcttg cgggcggctt tcgtcacagg gtgcggtcgc ccgggcaggg tataactcac   27720

ctgacaatca gagggcgagg tattcagctc aacgacgagt cggtgagctc ctcgcttggt   27780

ctccgtccgg acgggacatt tcagatcggc ggcgccggcc gctcttcatt cacgcctcgt   27840

caggcaatcc taactctgca gacctcgtcc tctgagccgc gctctggagg cattggaact   27900

ctgcaattta ttgaggagtt tgtgccatcg gtctacttta accccttctc gggacctccc   27960

ggccactatc cggatcaatt tattcctaac tttgacgcgg taaaggactc ggcggacggc   28020

tacgactgaa tgttaagtgg agaggcagag caactgcgcc tgaaacacct ggtccactgt   28080

cgccgccaca agtgctttgc ccgcgactcc ggtgagtttt gctactttga attgcccgag   28140

gatcatatcg agggcccggc gcacggcgtc cggcttaccg cccagggaga gcttgcccgt   28200

agcctgattc gggagtttac ccagcgcccc ctgctagttg agcgggacag gggaccctgt   28260

gttctcactg tgatttgcaa ctgtcctaac cctggattac atcaagatcc tctagttaat   28320

gtcaggtcgc ctaagtcgat taactagagt acccggggat cttattccct ttaactaata   28380

aaaaaaaata ataaagcatc acttacttaa aatcagttag caaatttctg tccagtttat   28440

tcagcagcac ctccttgccc tcctcccagc tctggtattg cagcttcctc ctggctgcaa   28500

actttctcca caatctaaat ggaatgtcag tttcctcctg ttcctgtcca tccgcaccca   28560

ctatcttcat gttgttgcag atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg   28620

tgtatccata tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg   28680

tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac   28740

ctctagttac ctccaatggc atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg   28800

aggccggcaa ccttacctcc caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca   28860

agtcaaacat aaacctggaa atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg   28920

tggctgccgc cgcacctcta atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc   28980

cgctaaccgt gcacgactcc aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag   29040

aaggaaagct agccctgcaa acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta   29100

ctatcactgc ctcaccccct ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag   29160

agcccattta tacacaaaat ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa   29220

cagacgacct aaacactttg accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt   29280

ccttgcaaac taaagttact ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta   29340

atgtagcagg aggactaagg attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt   29400

atccgtttga tgctcaaaac caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa   29460

actcagccca caacttggat attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa   29520

acaattccaa aaagcttgag gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta   29580

cagccatagc cattaatgca ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca   29640

caaatcccct caaaacaaaa attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg   29700

ttcctaaact aggaactggc cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca   29760

aaaataatga taagctaact ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa   29820

atgcagagaa agatgctaaa ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg   29880

ctacagtttc agttttggct gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa   29940

gtgctcatct tattataaga tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg   30000

acccagaata ttggaacttt agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg   30060

ctgttggatt tatgcctaac ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa   30120

gtaacattgt cagtcaagtt tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacca   30180

ttacactaaa cggtacacag gaaacaggag acacaactcc aagtgcatac tctatgtcat   30240

tttcatggga ctggtctggc cacaactaca ttaatgaaat atttgccaca tcctcttaca   30300

ctttttcata cattgcccaa gaataaagaa tcgtttgtgt tatgtttcaa cgtgtttatt   30360

tttcaattgc agaaaatttc aagtcatttt tcattcagta gtatagcccc accaccacat   30420

agcttataca gatcaccgta ccttaatcaa actcacagaa ccctagtatt caacctgcca   30480

cctccctccc aacacacaga gtacacagtc ctttctcccc ggctggcctt aaaaagcatc   30540

atatcatggg taacagacat attcttaggt gttatattcc acacggtttc ctgtcgagcc   30600

aaacgctcat cagtgatatt aataaactcc ccgggcagct cacttaagtt catgtcgctg   30660

tccagctgct gagccacagg ctgctgtcca acttgcggtt gcttaacggg cggcgaagga   30720

gaagtccacg cctacatggg ggtagagtca taatcgtgca tcaggatagg gcggtggtgc   30780

tgcagcagcg cgcgaataaa ctgctgccgc cgccgctccg tcctgcagga atacaacatg   30840

gcagtggtct cctcagcgat gattcgcacc gcccgcagca taaggcgcct tgtcctccgg   30900

gcacagcagc gcaccctgat ctcacttaaa tcagcacagt aactgcagca cagcaccaca   30960

atattgttca aaatcccaca gtgcaaggcg ctgtatccaa agctcatggc ggggaccaca   31020

gaacccacgt ggccatcata ccacaagcgc aggtagatta agtggcgacc cctcataaac   31080

acgctggaca taaacattac ctcttttggc atgttgtaat tcaccacctc ccggtaccat   31140

ataaacctct gattaaacat ggcgccatcc accaccatcc taaaccagct ggccaaaacc   31200

tgcccgccgg ctatacactg cagggaaccg ggactggaac aatgacagtg gagagcccag   31260

gactcgtaac catggatcat catgctcgtc atgatatcaa tgttggcaca acacaggcac   31320

acgtgcatac acttcctcag gattacaagc tcctcccgcg ttagaaccat atcccaggga   31380

acaacccatt cctgaatcag cgtaaatccc acactgcagg gaagacctcg cacgtaactc   31440

acgttgtgca ttgtcaaagt gttacattcg ggcagcagcg gatgatcctc cagtatggta   31500

gcgcgggttt ctgtctcaaa aggaggtaga cgatccctac tgtacggagt gcgccgagac   31560

aaccgagatc gtgttggtcg tagtgtcatg ccaaatggaa cgccggacgt agtcatattt   31620

cctgaagcaa aaccaggtgc gggcgtgaca aacagatctg cgtctccggt ctcgccgctt   31680

agatcgctct gtgtagtagt tgtagtatat ccactctctc aaagcatcca ggcgccccct   31740

ggcttcgggt tctatgtaaa ctccttcatg cgccgctgcc ctgataacat ccaccaccgc   31800

agaataagcc acacccagcc aacctacaca ttcgttctgc gagtcacaca cgggaggagc   31860

gggaagagct ggaagaacca tgtttttttt ttattccaaa agattatcca aaacctcaaa   31920

atgaagatct attaagtgaa cgcgctcccc tccggtggcg tggtcaaact ctacagccaa   31980

agaacagata atggcatttg taagatgttg cacaatggct tccaaaaggc aaacggccct   32040

cacgtccaag tggacgtaaa ggctaaaccc ttcagggtga atctcctcta taaacattcc   32100

agcaccttca accatgccca aataattctc atctcgccac cttctcaata tatctctaag   32160

caaatcccga atattaagtc cggccattgt aaaaatctgc tccagagcgc cctccacctt   32220

cagcctcaag cagcgaatca tgattgcaaa aattcaggtt cctcacagac ctgtataaga   32280

ttcaaaagcg gaacattaac aaaaataccg cgatcccgta ggtcccttcg cagggccagc   32340

tgaacataat cgtgcaggtc tgcacggacc agcgcggcca cttccccgcc aggaaccatg   32400

acaaaagaac ccacactgat tatgacacgc atactcggag ctatgctaac cagcgtagcc   32460

ccgatgtaag cttgttgcat gggcggcgat ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca   32520

ggcaaagcct cgcgcaaaaa agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag   32580

gtaagctccg gaaccaccac agaaaaagac accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt   32640

ttctgcataa acacaaaata aaataacaaa aaaacattta aacattagaa gcctgtctta   32700

caacaggaaa aacaaccctt ataagcataa gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt   32760

aaaaaaactg gtcaccgtga ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag   32820

tcataatgta agactcggta aacacatcag gttgattcac atcggtcagt gctaaaaagc   32880

gaccgaaata gcccggggga atacataccc gcaggcgtag agacaacatt acagccccca   32940

taggaggtat aacaaaatta ataggagaga aaaacacata aacacctgaa aaaccctcct   33000

gcctaggcaa aatagcaccc tcccgctcca gaacaacata cagcgcttcc acagcggcag   33060

ccataacagt cagccttacc agtaaaaaag aaaacctatt aaaaaaacac cactcgacac   33120

ggcaccagct caatcagtca cagtgtaaaa aagggccaag tgcagagcga gtatatatag   33180

gactaaaaaa tgacgtaacg gttaaagtcc acaaaaaaca cccagaaaac cgcacgcgaa   33240

cctacgccca gaaacgaaag ccaaaaaacc cacaacttcc tcaaatcgtc acttccgttt   33300

tcccacgtta cgtcacttcc cattttaaga aaactacaat tcccaacaca tacaagttac   33360

tccgccctaa aacctacgtc acccgccccg ttcccacgcc ccgcgccacg tcacaaactc   33420

caccccctca ttatcatatt ggcttcaatc caaaataagg tatattattg atgatg       33476

 

<210>  2

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列（引物P1）

<400> 

ctgactctta aggactagtt tcgcgc                                           26

 

<210>  3

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列（引物P2）

<400> 

gatctccacg agttgtgtct cctgt                                            25

 

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列（引物P3）

<400>

aactcgtgga gatccaagtg catactc                                          27

 

<210>  5

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列（引物P3）

<400>

acgtaggatc catgcatgtt aattaa                                           26

 

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列（引物P4）

<400>

accggtcagg cttcacccca gacc                                             24

 

<210>  7

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列（引物P5）

<400>

gatgctgggc tgggaggtgg aatag                                            25

 

<210>  8

<211>  6270

<212>  DNA

<213>  RGD改造后pAdEasy–RGD 27241-30244 序列

<400>

ctgactctta aggactagtt tcgcgccctt tctcaaattt aagcgcgaaa actacgtcat      60

 ctccagcggc cacacccggc gccagcacct gttgtcagcg ccattatgag caaggaaatt     120

 cccacgccct acatgtggag ttaccagcca caaatgggac ttgcggctgg agctgcccaa     180

 gactactcaa cccgaataaa ctacatgagc gcgggacccc acatgatatc ccgggtcaac     240

 ggaatacgcg cccaccgaaa ccgaattctc ctggaacagg cggctattac caccacacct     300

 cgtaataacc ttaatccccg tagttggccc gctgccctgg tgtaccagga aagtcccgct     360

 cccaccactg tggtacttcc cagagacgcc caggccgaag ttcagatgac taactcaggg     420

 gcgcagcttg cgggcggctt tcgtcacagg gtgcggtcgc ccgggcaggg tataactcac     480

 ctgacaatca gagggcgagg tattcagctc aacgacgagt cggtgagctc ctcgcttggt     540

 ctccgtccgg acgggacatt tcagatcggc ggcgccggcc gctcttcatt cacgcctcgt     600

 caggcaatcc taactctgca gacctcgtcc tctgagccgc gctctggagg cattggaact     660

 ctgcaattta ttgaggagtt tgtgccatcg gtctacttta accccttctc gggacctccc     720

 ggccactatc cggatcaatt tattcctaac tttgacgcgg taaaggactc ggcggacggc     780

 tacgactgaa tgttaagtgg agaggcagag caactgcgcc tgaaacacct ggtccactgt     840

 cgccgccaca agtgctttgc ccgcgactcc ggtgagtttt gctactttga attgcccgag     900

 gatcatatcg agggcccggc gcacggcgtc cggcttaccg cccagggaga gcttgcccgt     960

 agcctgattc gggagtttac ccagcgcccc ctgctagttg agcgggacag gggaccctgt    1020

 gttctcactg tgatttgcaa ctgtcctaac cctggattac atcaagatcc tctagttaat    1080

 gtcaggtcgc ctaagtcgat taactagagt acccggggat cttattccct ttaactaata    1140

 aaaaaaaata ataaagcatc acttacttaa aatcagttag caaatttctg tccagtttat    1200

 tcagcagcac ctccttgccc tcctcccagc tctggtattg cagcttcctc ctggctgcaa    1260

 actttctcca caatctaaat ggaatgtcag tttcctcctg ttcctgtcca tccgcaccca    1320

 ctatcttcat gttgttgcag atgaagcgcg caagaccgtc tgaagatacc ttcaaccccg    1380

 tgtatccata tgacacggaa accggtcctc caactgtgcc ttttcttact cctccctttg    1440

 tatcccccaa tgggtttcaa gagagtcccc ctggggtact ctctttgcgc ctatccgaac    1500

 ctctagttac ctccaatggc atgcttgcgc tcaaaatggg caacggcctc tctctggacg    1560

 aggccggcaa ccttacctcc caaaatgtaa ccactgtgag cccacctctc aaaaaaacca    1620

 agtcaaacat aaacctggaa atatctgcac ccctcacagt tacctcagaa gccctaactg    1680

 tggctgccgc cgcacctcta atggtcgcgg gcaacacact caccatgcaa tcacaggccc    1740

 cgctaaccgt gcacgactcc aaacttagca ttgccaccca aggacccctc acagtgtcag    1800

 aaggaaagct agccctgcaa acatcaggcc ccctcaccac caccgatagc agtaccctta    1860

 ctatcactgc ctcaccccct ctaactactg ccactggtag cttgggcatt gacttgaaag    1920

 agcccattta tacacaaaat ggaaaactag gactaaagta cggggctcct ttgcatgtaa    1980

 cagacgacct aaacactttg accgtagcaa ctggtccagg tgtgactatt aataatactt    2040

 ccttgcaaac taaagttact ggagccttgg gttttgattc acaaggcaat atgcaactta    2100

 atgtagcagg aggactaagg attgattctc aaaacagacg ccttatactt gatgttagtt    2160

 atccgtttga tgctcaaaac caactaaatc taagactagg acagggccct ctttttataa    2220

 actcagccca caacttggat attaactaca acaaaggcct ttacttgttt acagcttcaa    2280

 acaattccaa aaagcttgag gttaacctaa gcactgccaa ggggttgatg tttgacgcta    2340

 cagccatagc cattaatgca ggagatgggc ttgaatttgg ttcacctaat gcaccaaaca    2400

 caaatcccct caaaacaaaa attggccatg gcctagaatt tgattcaaac aaggctatgg    2460

 ttcctaaact aggaactggc cttagttttg acagcacagg tgccattaca gtaggaaaca    2520

 aaaataatga taagctaact ttgtggacca caccagctcc atctcctaac tgtagactaa    2580

 atgcagagaa agatgctaaa ctcactttgg tcttaacaaa atgtggcagt caaatacttg    2640

 ctacagtttc agttttggct gttaaaggca gtttggctcc aatatctgga acagttcaaa    2700

 gtgctcatct tattataaga tttgacgaaa atggagtgct actaaacaat tccttcctgg    2760

 acccagaata ttggaacttt agaaatggag atcttactga aggcacagcc tatacaaacg    2820

 ctgttggatt tatgcctaac ctatcagctt atccaaaatc tcacggtaaa actgccaaaa    2880

 gtaacattgt cagtcaagtt tacttaaacg gagacaaaac taaacctgta acactaacca    2940

 ttacactaaa cggtacacag gaaacaggag acacaactcg tggagatcca agtgcatact    3000

 ctatgtcatt ttcatgggac tggtctggcc acaactacat taatgaaata tttgccacat    3060

 cctcttacac tttttcatac attgcccaag aataaagaat cgtttgtgtt atgtttcaac    3120

 gtgtttattt ttcaattgca gaaaatttca agtcattttt cattcagtag tatagcccca    3180

 ccaccacata gcttatacag atcaccgtac cttaatcaaa ctcacagaac cctagtattc    3240

 aacctgccac ctccctccca acacacagag tacacagtcc tttctccccg gctggcctta    3300

 aaaagcatca tatcatgggt aacagacata ttcttaggtg ttatattcca cacggtttcc    3360

 tgtcgagcca aacgctcatc agtgatatta ataaactccc cgggcagctc acttaagttc    3420

 atgtcgctgt ccagctgctg agccacaggc tgctgtccaa cttgcggttg cttaacgggc    3480

 ggcgaaggag aagtccacgc ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg    3540

 cggtggtgct gcagcagcgc gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa    3600

 tacaacatgg cagtggtctc ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt    3660

 gtcctccggg cacagcagcg caccctgatc tcacttaaat cagcacagta actgcagcac    3720

 agcaccacaa tattgttcaa aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg    3780

 gggaccacag aacccacgtg gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc    3840

 ctcataaaca cgctggacat aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc    3900

 cggtaccata taaacctctg attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg    3960

 gccaaaacct gcccgccggc tatacactgc agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg    4020

 agagcccagg actcgtaacc atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa    4080

 cacaggcaca cgtgcataca cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt tagaaccata    4140

 tcccagggaa caacccattc ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc    4200

 acgtaactca cgttgtgcat tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc    4260

 agtatggtag cgcgggtttc tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact gtacggagtg    4320

 cgccgagaca accgagatcg tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta    4380

 gtcatatttc ctgaagcaaa accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc gtctccggtc    4440

 tcgccgctta gatcgctctg tgtagtagtt gtagtatatc cactctctca aagcatccag    4500

 gcgccccctg gcttcgggtt ctatgtaaac tccttcatgc gccgctgccc tgataacatc    4560

 caccaccgca gaataagcca cacccagcca acctacacat tcgttctgcg agtcacacac    4620

 gggaggagcg ggaagagctg gaagaaccat gttttttttt tattccaaaa gattatccaa    4680

 aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac gcgctcccct ccggtggcgt ggtcaaactc    4740

 tacagccaaa gaacagataa tggcatttgt aagatgttgc acaatggctt ccaaaaggca    4800

 aacggccctc acgtccaagt ggacgtaaag gctaaaccct tcagggtgaa tctcctctat    4860

 aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa ataattctca tctcgccacc ttctcaatat    4920

 atctctaagc aaatcccgaa tattaagtcc ggccattgta aaaatctgct ccagagcgcc    4980

 ctccaccttc agcctcaagc agcgaatcat gattgcaaaa attcaggttc ctcacagacc    5040

 tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca aaaataccgc gatcccgtag gtcccttcgc    5100

 agggccagct gaacataatc gtgcaggtct gcacggacca gcgcggccac ttccccgcca    5160

 ggaaccatga caaaagaacc cacactgatt atgacacgca tactcggagc tatgctaacc    5220

 agcgtagccc cgatgtaagc ttgttgcatg ggcggcgata taaaatgcaa ggtgctgctc    5280

 aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa gaaagcacat cgtagtcatg ctcatgcaga    5340

 taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca gaaaaagaca ccatttttct ctcaaacatg    5400

 tctgcgggtt tctgcataaa cacaaaataa aataacaaaa aaacatttaa acattagaag    5460

 cctgtcttac aacaggaaaa acaaccctta taagcataag acggactacg gccatgccgg    5520

 cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat taaaaagcac caccgacagc tcctcggtca    5580

 tgtccggagt cataatgtaa gactcggtaa acacatcagg ttgattcaca tcggtcagtg    5640

 ctaaaaagcg accgaaatag cccgggggaa tacatacccg caggcgtaga gacaacatta    5700

 cagcccccat aggaggtata acaaaattaa taggagagaa aaacacataa acacctgaaa    5760

 aaccctcctg cctaggcaaa atagcaccct cccgctccag aacaacatac agcgcttcca    5820

 cagcggcagc cataacagtc agccttacca gtaaaaaaga aaacctatta aaaaaacacc    5880

 actcgacacg gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa agggccaagt gcagagcgag    5940

 tatatatagg actaaaaaat gacgtaacgg ttaaagtcca caaaaaacac ccagaaaacc    6000

 gcacgcgaac ctacgcccag aaacgaaagc caaaaaaccc acaacttcct caaatcgtca    6060

 cttccgtttt cccacgttac gtcacttccc attttaagaa aactacaatt cccaacacat    6120

 acaagttact ccgccctaaa acctacgtca cccgccccgt tcccacgccc cgcgccacgt    6180

 cacaaactcc accccctcat tatcatattg gcttcaatcc aaaataaggt atattattga    6240

 tgatgttaat taacatgcat ggatcctacg                                     6270

 

<210>  9

<211>  1819

<212>  DNA

<213>  Up2 PROMOTER序列

<400>

ccggtcaggc ttcaccccag acccactgca tgactgcatg agaagctgca tcttaacaag      60

atccctggta attcatacgc atattaaatt tggagatgca ctggcgtaag accctcctac     120

tctctgctta ggcccatgag ttcttccttt actgtcattc tccactcacc ccaaactttg     180

agcctaccct tcccaccttg gcggtaagga cacaacctcc ctcacattcc taccaggacc     240

ctaagcttcc ctgggactga ggaagataga atagttcgtg gagcaaacag atatacagca     300

acagtctctg tacagctctc aggcttctgg aagttctaca gcctctcccg acaaagtatt     360

ccactttcca caagtaactc tatgtgtctg agtctcagtt tccacttttc tctctctctc     420

tctctctcaa ctttctgaga cagagtttca cttagtcgcc caggctggag tgcaggggca     480

caatctcggc tcactgcaac ctccacctcc tgggttcaag tgtttctcct gtctcagcct     540

cccgagtagc tgggattaca ggcacacacc accgcgttag tttttgtatt tttggtagag     600

atggtgtttc gccatattgg ccaggctgat ctcgaactcc tgacctcagg tgatccgccc     660

acctcggcct cccaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc accacgcccg gctgatctct     720

tttctatttt aatagagatc aaactctctg tgttgcctag gctggtcttg aactcctggc     780

ctcgagtgat cctcccacct tggcctccca aagtgttgag attacaggca tgagccactg     840

tgcctggcct cagttctact acaaaaggaa gccagtacca gctaccaccc agggtggctg     900

tagggctaca atggagcaca cagaacccct acccagggcc cggaagaagc cccgactcct     960

ctcccctccc tctgcccaga actcctccgc ttctttctga tgtagcccag ggccggagga    1020

ggcagtcagg gaagttctgt ctctttttca tgttatctta cgaggtctct tttctccatt    1080

ctcagtccaa caaatggttg ctgcccaagg ctgactgtgc ccacccccaa cccctgctgg    1140

ccagggtcaa tgtctgtctc tctggtctct ccagaagtct tccatggcca ccttcgtccc    1200

caccctccag aggaatctga aaccgcatgt gctccctggc ccccacagcc cctgcctctc    1260

ccagagcagc agtacctaag cctcagtgca ctccaagaat tgaaaccctc agtctgctgc    1320

ccctccccac cagaatgttt ctctcccatt cttacccact caaggccctt tcagtagccc    1380

cttggagtat tctcttccta catatcaggg caacttccaa actcatcacc cttctgaggg    1440

gtgggggaaa gacccccacc acatcggggg agcagtcctc caaggactgg ccagtctcca    1500

gatgcccgtg cacacaggaa cactgcctta tgcacgggag tcccagaaga aggggtgatt    1560

tctttcccca ccttagttac accatcaaga cccagccagg gcatcccccc tcctggcctg    1620

agggccagct ccccatcctg aaaaacctgt ctgctctccc cacccctttg aggctatagg    1680

gcccaagggg caggttggac tggattcccc tccagcccct cccgccccca ggacaaaatc    1740

agccacccca ggggcagggc ctcacttgcc tcaggaaccc cagcctgcca gcacctattc    1800

cacctcccag cccagcatc                                                                1819

Claims (6)

1.一种高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，其特征在于RGD序列整合入腺病毒，并在该腺病毒载体中由膀胱组织特异性UPII启动子控制自杀基因TK的特异性表达。

2.根据权利要求1所述的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，其特征在于将RGD序列整合入腺病毒纤毛区。

3.根据权利要求2所述的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，其特征在于RGD序列插入到腺病毒骨架pAdEasy-1质粒的30218- 30219位点之间。

4.根据权利要求3所述的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，其特征在于所用的腺病毒为Ad5。

5.根据权利要求4所述的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒，其特征在于其基因序列为SEQ ID No.1。

6.权利要求5所述的高嗜性膀胱癌靶向性肿瘤杀伤腺病毒制备方法，其特征在于以pAdEasy-1质粒为模板，SEQ ID No.2和SEQ ID No.3为引物进行扩增，得到扩增产物RGD1；以pAdEasy-1质粒为模板，SEQ ID No.4和SEQ ID No.5为引物进行扩增，得到扩增产物RGD2；将RGD1和RGD2分别胶回收后按体积比1:1混合作为模板，再用SEQ ID No.2和SEQ ID No.5为引物进行扩增得到RGD-HI；将RGD-HI电泳后切取MARKER中6k附近条带，胶回收，SPE1和pac1切后回收得到6233bp片段；SPE1和pac1酶切pAdEasy-1，回收27249bp条带，将回收的部分与RGD-HI连接，获得pAd-RGD质粒；将TK基因、人UPII启动子有序定向连接到腺病毒穿梭质粒多克隆位点，构建得到RP- UPII-TK，经同源重组得到RGDAd-UPII-TK质粒，再用转染试剂Lipofectin 2000转染RGDAd-UPII-TK质粒到293细胞包装腺病毒，培养细胞获得所需病毒。