CN111793642B - 一种用于高效稳定过表达长链非编码rna的克隆载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于高效稳定过表达长链非编码RNA的克隆载体及其应用。本发明的克隆载体是含有IRDR‑L‑IRDR‑R盒的双链环状质粒，IRDR‑L‑IRDR盒包括IRDR‑L序列、CMV启动子、BGH poly(A)序列、IRDR‑R序列、PKG启动子和筛选基因序列。本发明的克隆载体使外源的lncRNA稳定表达，且保持原有的长度，有效的保持其功能特性，更真实地反应其功能。

Description

一种用于高效稳定过表达长链非编码RNA的克隆载体及其 应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于高效稳定过表达长链非编码RNA的克隆载体及其应用。

背景技术

在基因组学时代，基因功能研究是其重要的遗传学分支。在细胞或动物水平，利用过表达载体人为上调目的基因的表达是研究基因功能的重要手段之一。目前根据基因在细胞过表达的时效性可以将细胞分为瞬转株或稳转株。稳转株是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定表达蛋白的细胞株。瞬转株中外源基因和宿主细胞基因组DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。外源基因游离在细胞中会被降解并且不能传给后代，随着时间和分裂次数的增加，外源过表达效率会逐渐下降。相比瞬转株而言，稳转株在很大程度上方便实验研究和降低频繁转染的成本。当前常用的长链非编码RNA(lncRNAs)过表达稳定系构建的方法主要有两种，一种是基于病毒整合的原理病毒基因组通过转录，逆转录的过程整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外源基因，该种方法需要人工制备慢病毒，因而操作繁琐，感染效率依赖于病毒的滴度，且存在安全隐患，转染后根据载体上的带有的标记基因如荧光素基因或者嘌呤霉素抗性基因进行荧光筛选或者嘌呤霉素筛选，从制备慢病毒到获得稳定株一般需要2～3周左右的时间；另一种方法是利用pcDNA3.1质粒构建过表达载体，这种方法不需要采用慢病毒包装方法，但是基于技术的限制，以随机整合的形式把载体序列及目的序列插入基因组中，整合效率低，对于转染效率低的细胞来说会导致转染失败。转染之后使用遗传霉素(G418)筛选稳定转染细胞，G418发挥作用时间长，起效慢，整个过程一般经过4～6周左右的筛选才能获得稳转株，时间成本极高；第三种方法是CRISPRa，CRISPRa也可以通过gRNA识别并靶向基因组中的目的位置，激活该区域中的任何增强子从而促进基因的表达。

由于慢病毒载体上带有病毒包装、基因组整合必需的调控元件，例如5’-UTR、3’-UTR以及一些顺式调控元件和反式作用因子等，表达出来的mRNA的3’端会带有侧翼序列，这些侧翼序列一般包括载体序列以及一些抗性基因等。由于蛋白编码基因有终止密码子的存在，慢病毒载体对于蛋白编码基因的正常转录，翻译没有影响，可以维持氨基酸序列的正常，使功能正常发挥。但是值得一提的是，与过表达蛋白编码基因不一样，lncRNAs没有下一步的翻译过程，转录出来后直接发生折叠并发挥后续的生物学功能。使用慢病毒整合的方法来过表达lncRNAs的时候，过表达得到的lncRNAs会带有侧翼序列，这些不正确的序列会影响lncRNAs的二级结构，从而影响其与DNA/RNA/蛋白的相互作用，从而影响其生物学功能。lncRNAs功能的发挥依赖于其正常转录及转录后修饰，在人为体外过表达的时候，为了保证其转录的正常，在构建过表达载体的时候需要注意加上一个终止信号。终止子位于待转录基因的下游，并且通常接在3’调节元件例如多腺苷酸化或poly(A)信号后。终止子在RNA加工中也起着重要作用。目前常用的真核细胞表达质粒主要是用于转录出mRNA，常用的转录终止子有BGH，同时包含有AAUAAA基序促进聚腺苷酸化和转录终止。使用pcDNA3.1载体来过表达lncRNAs的时候，载体上有Bovine growth hormone(BGH)序列，在过表达产物的3’端加上poly(A)信号，可以使过表达产物正常终止，这样过表达的产物能保持自身的长度。但是这种方法过表达效率低，给实验带来很大的困难。

由于lncRNAs没有终止密码子，故在载体上加上一个终止信号对lncRNAs的表达及正常发挥作用有着非常重要的意义，尤其对于那些功能区域在3’区，并且长度较短的lncRNAs。但是基于慢病毒整合的原理，若在LTR区域中间出现终止信号，将极大影响病毒基因组的整合以及病毒的产生过程，所以一般在慢病毒载体上不会采用这个原件，这同时也是慢病毒质粒不适合于长链非编码RNA的表达的重要原因。

近年来，一种称为“睡美人(Sleeping Beauty,SB)”的转座系统逐渐进入研究人员的视野，SB转座子是Tc1/mariner家族的成员。该系统采用“剪切粘贴”的转座机制，由转座酶识别靶目标序列两端特异的反向重复序列(IRDR)，将靶目标序列整合至宿主基因组DNA中。使用转座技术构建基因过表达稳定株具有操作简单、实验周期短、效率高等明显优势。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于高效稳定过表达长链非编码RNA(lncRNAs)的克隆载体。该克隆载体基于转座子原理可快速建立过表达稳定系。

本发明的另一目的在于提供上述克隆载体在构建过表达稳定株中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于高效稳定过表达lncRNAs的克隆载体，含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述的IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、CMV启动子、BGH poly(A)序列、IRDR-R序列、PKG启动子和筛选基因序列。

所述的克隆载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的克隆载体的目的基因为长链非编码RNA的核苷酸序列。

所述的IRDR-L序列为SEQ ID NO.1中自5′端第6927位～7153位碱基的反向互补序列。

所述的IRDR-R序列为SEQ ID NO.1中自5′端第3781位～4008位碱基。

所述的CMV启动子的序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1位～588位碱基。

所述的BGH poly(A)序列为SEQ ID NO.1中自5′端第797位～1022位碱基。

所述的PKG启动子的序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1105位～1503位碱基。

所述的筛选基因包括抗性筛选基因和荧光筛选基因。

所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1514位～2113位碱基。

所述的荧光筛选基因是指绿色荧光蛋白(GFP)基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第2754位～3488位碱基。

上述克隆载体在构建过表达稳定株中的应用。

此外，本发明还提供了采用上述克隆载体建立lncRNA过表达稳定株的方法，包括以下步骤：

(1)设计引物，以目的基因的cDNA全长序列为模板扩增目的基因；

(2)将目的基因和克隆载体通过限制性内切酶内切产生粘性末端，连接，转化，得到过表达载体；

(3)将过表达载体与转座酶质粒SB100×共转染宿主细胞，使用嘌呤霉素筛选，得到过表达稳定株。

本发明的思路是：在带有转座元件的质粒载体上引入了BGH poly(A)序列，利用转座酶技术构建高效稳定过表达lncRNAs的克隆载体，提供了一种快速、经济的过表达lncRNAs的新方法，从而更方便研究其功能。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

本发明基于转座酶系统，CMV启动子介导的lncRNAs克隆载体ELECTS，目的基因3’端带有BGH poly(A)序列，侧翼为SB的反向重复序列(IRDR-L/R)，同时由PKG序列介导嘌呤霉素抗性基因表达。使用本发明的克隆载体，lncRNAs可被SB识别，从而整合到基因组上，使目的片段稳定表达，lncRNAs不带有侧翼序列，保持原有的长度，有效的其功能特性，更真实地反应其功能，为lncRNAs的功能研究提供便利。

附图说明

图1是克隆载体ELECTS的结构示意图。

图2是通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方法检测ELECTS-HOTAIRM1和PCDH-HOTAIRM1过表达稳定株中lncRNAs HOTAIRM1的表达水平结果图。

图3是PCDH与ELECTS质粒过表达机制示意图；其中，A是PCDH过表达机制示意图，B是ELECTS载体过表达机制示意图。

图4是通过Northern Blot的方法检测过表达的lncRNA HOTAIRM1的长度结果图。

图5是分别用ELECTS-HOTAIRM1和PCDH-HOTAIRM1过表达的HepG2细胞的克隆形成实验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。

本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。

本发明实施例中所述的克隆载体ELECTS结构示意图，如图1所示。

肝癌细胞系HepG2和人胚胎肾细胞HEK293T购买于American Type CultureCollection(ATCC)。

实施例1

本实施例以lncRNAs HOTAIRM1(Gene Bank登录号：NR_038366.1)为目标基因，以肝癌细胞HepG2为模型，构建了ELECTS-HOTAIRM1稳定过表达的HepG2细胞，并验证过表达效率，基因长度以及肿瘤学功能。

1.1 ELECTS-HOTAIRM1和PCDH-HOTAIRM1克隆载体的构建

(1)设计HOTAIRM1克隆引物序列HOTAIRM1-F和HOTAIRM1-R，交由艾基生物公司合成，引物序列如下：

HOTAIRM1-F：5′-CTAGCTAGCACCaaaagtttgccggcttccgcagtgat-3′；

HOTAIRM1-R：5′-ATTTGCGGCCGCcaattttaatacatttattaag-3′。

其中，下划线代表的是引入的用于连接到载体上的酶切位点。

(2)以cDNA文库为模板，使用HOTAIRM1克隆引物作为PCR引物，扩增HOTAIRM1基因，使用Qiagen PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，得到Nhe Ⅰ-HOTAIRM1-Not Ⅰ PCR产物。

(3)Nhe Ⅰ-HOTAIRM1-Not Ⅰ PCR产物使用Thermo公司的限制性内切酶Nhe Ⅰ和NotⅠ线性化，产生粘性末端。

(4)使用Thermo公司的限制性内切酶Nhe Ⅰ和Not Ⅰ将克隆载体ELECTS和PCDH线性化，产生粘性末端。

(5)利用Thermo公司的T4 DNA连接酶将酶切后的Nhe Ⅰ-HOTAIRM1-Not Ⅰ PCR产物分别与酶切后的ELECTS和PCDH连接，转化(Stbl3感受态细胞)，将该过表达载体命名为ELECTS-HOTAIRM1和PCDH-HOTAIRM1。

1.2 PCDH-HOTAIRM1慢病毒的制备

(1)准备HEK293T细胞，用100mm培养皿培养，待细胞传代两到三次后，铺板，每天更换一次DMEM培养基，保证细胞的活性状态。细胞长到95％以上为宜(一个细胞紧挨着一个细胞)。

(2)转染前一小时更换新鲜无双抗的培养基。

(3)配制转染体系：1.2mL的Opti-MEMI减血清培养基中加入目的基因的质粒和包装质粒psPAX、PMD2.G(一般psPAX:PMD2.G:目的质粒＝2：1：2)，制备质粒混合液，总量1μg的质粒加入6～10μg的PEI。

(4)室温静置15min～20min。

(5)将静置后的混合液温柔加到步骤(2)的培养基中，并在感染6～8h后换液。

(6)在转染后24h、36h、48h、60h各收一次病毒液(培养基上清)。

(7)将收集的病毒液在4℃下，2000rpm离心5min去除细胞碎片，再用0.45μm滤头过滤。

(8)按比例每20mL的病毒液加5.5mL的44％PEG8000、2mL的4M NaCl，混匀4℃过夜。

(9)第二天在4℃下，4000rpm离心15min。每20mL上清浓缩得到的沉淀用150μL的1×PBS吹打混匀，50μL分管保存，-80℃保存。

1.3 HOTAIRM1稳定过表达HepG2细胞的构建

1.3.1 ELECTS-HOTAIRM1稳转株构建

(1)选取生长状态良好的HepG2细胞，用胰酶消化并计数，吸取50万个细胞种板至6孔板中。

(2)第二天待细胞完全贴壁后，使用Promega公司的Viafect转染试剂共转染2μgELECTS-HOTAIRM1和200ng SB100×转座酶质粒于HepG2细胞中，转染后36小时，使用含有终浓度为1μg/mL嘌呤霉素的含有10％胎牛血清的DMEM培养基筛选稳定株，筛选周期约为4天左右。

(3)扩大培养后，收取细胞，提取RNA，实时荧光定量PCR检测ELECTS-HOTAIRM1过表达稳定株中lncRNAs HOTAIRM1的表达水平，

HOTAIRM1-qF：5′-CCCACCGTTCAATGAAAG-3′；

HOTAIRM1-qR：5′-CAGCAGCGACGACAAGTAAA-3′；

Actin-qF：5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3′；

Actin-qR：5′-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT-3′。

结果如图2所示，该细胞系稳定过表达HOTAIRM1。

1.3.2 PCDH-HOTAIRM1稳转株构建

(1)选取生长状态良好的HepG2细胞，用胰酶消化并计数，吸取50万个细胞种板至6孔板中。

(2)第二天待细胞完全贴壁后，加入100μL步骤1.2制备的PCDH-HOTAIRM1病毒液以及2μL polybrene试剂，转染后36小时，使用含有终浓度为1μg/mL嘌呤霉素的含有10％胎牛血清的DMEM培养基筛选稳定株，筛选周期约为5天左右。

(3)扩大培养后，收取细胞，提取RNA，实时荧光定量PCR(引物同1.3.1)检测PCDH-HOTAIRM1过表达稳定株中lncRNAs HOTAIRM1的表达水平，如图2所示，该细胞系稳定过表达HOTAIRM1。因此，两种载体均能过表达HOTAIRM1，而ELECTS呈现出更高的过表达效率。

PCDH与ELECTS-HOTAIRM1过表达机制见图3。PCDH与包装质粒共转染到HEK293T细胞后，先包装成病毒颗粒，病毒感染了宿主细胞之后，通过逆转录和转录的方式整合到宿主细胞基因组上，完成外源基因稳定整合的过程。ELECTS与转座酶质粒共转染到宿主细胞里面，利用转座酶稳定整合到基因组DNA上。

1.4 Northern Blot的方法检测过表达的lncRNAs的长度

(1)大量培养HOTAIRM1稳定过表达的HepG2细胞，提取RNA。

(2)Northern Blot检测，使用DIG Northern Starter Kit(Roche AppliedScience)试剂盒检测过表达的HOTAIRM1的长度。

Northern Blot结果提示HOTAIRM1的长度与内源的长度一致，如图4所示。以上结果证明本发明的克隆载体ELECTS能快速地构建lncRNAs过表达稳定株，并且lncRNAs不带有侧翼序列，保持原有的长度。而用PCDH载体过表达得到的外源HOTAIRM1的长度比内源HOTAIRM1的长度多大约2Kb。

1.5克隆形成实验验证外源过表达的HOTAIRM1的功能

(1)分别取步骤1.3得到的500个稳定过表达ELECTS-HOTAIRM1和PCDH-HOTAIRM1的HepG2细胞种至六孔板中。分别以载体ELECTS和PCDH转染HepG2细胞获得的细胞株作为对照。

(2)待长成肉眼可见的细胞克隆集落，用4％多聚甲醛固定，并用0.5％结晶紫染色。

根据克隆形成结果提示，如图5，使用ELECTS克隆载体过表达的HOTAIRM1能有效的保持自身的促进细胞增殖功能特性，更真实地反应其功能，而用PCDH载体使过表达的HOTAIRM1促细胞增殖的功能消失。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 一种用于高效稳定过表达长链非编码RNA的克隆载体及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7227

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 克隆载体的核苷酸序列

<220>

<222> (1)..(588)

<223> CMV启动子

<220>

<222> (797)..(1022)

<223> BGH poly(A)

<220>

<222> (1105)..(1503)

<223> PKG启动子

<220>

<222> (1514)..(2113)

<223> 嘌呤霉素抗性基因

<220>

<222> (2754)..(3488)

<223> 绿色荧光蛋白基因

<220>

<222> (3781)..(4088)

<223> IRDR-R

<220>

<222> (6927)..(7153)

<223> IRDR-L

<400> 1

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240

atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300

cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc tggctaacta 600

gagaacccac tgcttactgg cttatcgaaa ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660

ctggctagcg tttaaactta agcttggtac cgagctcgga tccactagtc cagtgtggtg 720

gaattctgca gatatccagc acagtggcgg ccgctcgagt ctagagggcc cgtttaaacc 780

cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 840

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 900

attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 960

agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg 1020

gcacgcgtgc atgcgcttta gcagccccgc tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct 1080

ggcctcgcac acattccaca tccaccggta ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc 1140

ccttcgcgcc accttctact cctcccctag tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg 1200

cgtcgtgcag gacgtgacaa atggaagtag cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca 1260

gcaccgctga gcaatggaag cgggtaggcc tttggggcag cggccaatag cagctttgct 1320

ccttcgcttt ctgggctcag aggctgggaa ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg 1380

ggctcagggg cggggcgggc gcccgaaggt cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc 1440

aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca 1500

gcccaagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 1560

ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 1620

cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 1680

cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 1740

gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 1800

cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca 1860

ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 1920

caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 1980

gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 2040

caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 2100

gcccggtgcc tgacgcccgc cccacgaccc gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc 2160

ccatgcatcc aattccgccc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag 2220

gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga 2280

gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg 2340

ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt 2400

gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca 2460

ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc 2520

agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat 2580

tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc 2640

ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa 2700

ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa tatggccaca accatggtga 2760

gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg 2820

taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc 2880

tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga 2940

ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg 3000

acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg 3060

acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc 3120

gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg 3180

agtacaacta caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca 3240

aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact 3300

accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga 3360

gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg 3420

agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag agatctcgag 3480

ctcgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 3540

atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac 3600

aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 3660

aagtaaaacc tctacaaatg tggtacttaa gagggatcga taaggatcta gcttgtggaa 3720

ggctactcga aatgtttgac ccaagttaaa caatttaaag gcaatgctac caaatactaa 3780

ttgagtgtat gtaaacttct gacccactgg gaatgtgatg aaagaaataa aagctgaaat 3840

gaatcattct ctctactatt attctgatat ttcacattct taaaataaag tggtgatcct 3900

aactgaccta agacagggaa tttttactag gattaaatgt caggaattgt gaaaaagtga 3960

gtttaaatgt atttggctaa ggtgtatgta aacttccgac ttcaactgta tagggatcct 4020

ctagctagag tcgacctcga gggggggccc ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg 4080

gttaatttcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 4140

gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 4200

atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 4260

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 4320

tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 4380

agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 4440

aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 4500

gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 4560

tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 4620

cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 4680

ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 4740

cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 4800

atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 4860

agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 4920

gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 4980

gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 5040

tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 5100

agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 5160

gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 5220

aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 5280

aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 5340

ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 5400

gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 5460

aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 5520

ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 5580

tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 5640

ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 5700

cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 5760

agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 5820

gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 5880

gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 5940

acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 6000

acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 6060

agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 6120

aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 6180

gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 6240

tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt 6300

ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt 6360

cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct 6420

ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg 6480

tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga 6540

gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc 6600

ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga 6660

gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta caatttccat 6720

tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 6780

cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 6840

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgagcgcg cgtaatacga ctcactatag 6900

ggcgaattgg agctcggatc cctatacagt tgaagtcgga agtttacata cacttaagtt 6960

ggagtcatta aaactcgttt ttcaactact ccacaaattt cttgttaaca aacaatagtt 7020

ttggcaagtc agttaggaca tctactttgt gcatgacaca agtcattttt ccaacaattg 7080

tttacagaca gattatttca cttataattc actgtatcac aattccagtg ggtcagaagt 7140

ttacatacac taagttgact gtgcctttaa acagcttgga aaattccaga aaatgatgtc 7200

atggctttag aagcttgatg gcgcgcc 7227

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOTAIRM1-F

<400> 2

ctagctagca ccaaaagttt gccggcttcc gcagtgat 38

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOTAIRM1-R

<400> 3

atttgcggcc gccaatttta atacatttat taag 34

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOTAIRM1-qF

<400> 4

cccaccgttc aatgaaag 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HOTAIRM1-qR

<400> 5

cagcagcgac gacaagtaaa 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-qF

<400> 6

tcgtgcgtga cattaaggag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Actin-qR

<400> 7

gtcaggcagc tcgtagctct 20

Claims (3)

1.一种用于高效稳定过表达lncRNAs 的克隆载体，其特征在于：

所述的克隆载体，含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述的IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、CMV启动子、BGH poly(A)序列、IRDR-R序列、PKG启动子和筛选基因序列；

所述的克隆载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的克隆载体的目的基因为lncRNAs HOTAIRM1；

所述的IRDR-L序列为SEQ ID NO.1中自5′端第6927位～7153位碱基的反向互补序列；

所述的IRDR-R序列为SEQ ID NO.1中自5′端第3781位～4008位碱基；

所述的CMV启动子的序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1位～588位碱基；

所述的BGH poly(A)序列为SEQ ID NO.1中自5′端第797位～1022位碱基；

所述的PKG启动子的序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1105位～1503位碱基；

所述的筛选基因包括抗性筛选基因和荧光筛选基因；

所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素抗性基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1514位～2113位碱基；

所述的荧光筛选基因是指绿色荧光蛋白基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第2754位～3488位碱基。

2.权利要求1所述的克隆载体在构建过表达稳定株中的应用。

3.权利要求1所述的克隆载体建立lncRNAs过表达稳定株的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）设计引物，以目的基因的cDNA全长序列为模板扩增目的基因；

（2）将目的基因和克隆载体通过限制性内切酶内切产生粘性末端，连接，转化，得到过表达载体；

（3）将过表达载体与转座酶质粒SB100×共转染宿主细胞，使用嘌呤霉素筛选，得到过表达稳定株。

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