CN107400679A

CN107400679A - 基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用

Info

Publication number: CN107400679A
Application number: CN201710606285.7A
Authority: CN
Inventors: 尹东; 胡开顺; 陈恒星; 李瑜
Original assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date: 2017-07-24
Filing date: 2017-07-24
Publication date: 2017-11-28

Abstract

本发明公开一系列基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用。该质粒载体是含有IRDR‑L‑IRDR‑R盒的双链环状质粒，所述IRDR‑L‑IRDR‑R盒包括IRDR‑L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列ccdB、attR2序列、筛选基因序列和IRDR‑R序列；所述的标签为HA标签、Myc标签、Flag标签或V5标签。本发明的质粒载体带有Sleeping Beauty转座子末端反向重复序列和Gateway Cassette序列，基于转座酶的方法能快速高效构建过表达稳定系，且带有各种不同的标签序列Tag和带有筛选基因GFP，能满足常规的在真核细胞中表达目的基因的需要。

Description

基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，本发明涉及到运用Gateway克隆技术构建质粒载体，该一系列质粒载体带有不同的标签序列和筛选基因GFP，通过转座子系统将目的基因整合到细胞基因组，实现基因的转移。特别涉及一种基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用

背景技术

过表达稳定细胞株是指外源DNA整合到宿主细胞基因组中，可使宿主细胞长期表达目的基因，与瞬转株相比，稳定细胞株能够很大程度上的方便实验研究和降低实验成本。因此，构建基因过表达稳定株在基因功能与机制的研究中被广泛应用。目前构建稳定细胞株主要是通过病毒包装、感染目的细胞的方式来实现的，这种方法耗时长，通常需要两个星期左右。此外，由于所插入的目的基因片段大小受到病毒质粒自身大小的限制，通常目的基因片段大小不能超过3Kb，并且操作人员有感染病毒的潜在安全隐患。与此同时，过表达质粒载体通常采用插入到多克隆位点的方法构建，这种方法不仅效率较低，并且消耗时间长，极大地影响了科研人员的实验进程。

转座子(Transposon)最早是由McClintock于20世纪50年代在研究玉米籽粒的颜色变异中发现的一类不依靠同源重组而能在基因组内和基因组间发生位置改变的DNA序列，因此也被称为跳跃基因或者可移动元件。DNA转座子是其中一种转座机制类型，目前使用较为广泛的DNA转座子类型是Sleeping Beauty转座子。首个有活性的Sleeping Beauty转座子是通过对鱼类基因组中多个失活的Tc1/mariner转座子进行分子重建产生的，该转座子能够插入到AT二碱基区域，并具有插入至内含子中的倾向。此后，为了进一步提高Sleeping Beauty的转座活性，研究人员通过对Sleeping Beauty转座酶基因氨基酸突变的方法对其酶活性进行了广泛的筛选，最终获得了活性增加100倍的Sleeping Beauty突变体(SB100X))。经过改良后的Sleeping Beauty转座子采用“剪切-粘贴”的转座机制，具体的说是：在细胞中，转座酶SB100X识别Sleeping Beauty转座子两端特异的反向重复序列(ITRS)，并将转座子序列切出，然后通过DNA攻击的方式插入新的基因组位置。这种Sleeping Beauty转座子的优点是：构建稳定株不需要包装病毒，大大的缩短了稳定株构建的时间，避免了包装病毒过程中所产生的生物安全问题；同时插入的目的片段大小不受限制；稳定重组效率高。

Gateway克隆技术是由Invitrogen公司开发的一项基因克隆新技术，该技术利用位点特异性重组反应：BP反应和LR反应，并利用大肠杆菌自杀基因ccdB，极大地提高了克隆的效率，同时大大的缩短了构建质粒的时间。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一系列基于转座酶快速建立过表达稳定系的质粒载体。

本发明的另一目的在于满足常规的在真核细胞中表达目的基因的需要，本发明提供的一系列质粒载体中带有Flag、HA、V5或Myc标签序列，这些标签序列的存在使目的基因的Western、免疫荧光、ELISA等的检测通过Flag、HA、V5或Myc抗体即可进行，节省了购买抗体或自行制备抗体的费用和时间，对于进行IP或co-IP也带来了很大的便利。同时本发明提供的一系列质粒载体分为带有筛选基因GFP和不带筛选基因GFP两类，方便流式实验筛选出阳性细胞，同时也可以验证质粒转染的效率。

该质粒载体包括Sleeping Beauty转座子元件(ITRS)，强启动子CAG驱动的ccdB基因元件，ccdB基因元件两侧分别含有重组位点attR1和attR2，在重组位点attR1的上游带有不同标签序列。同时该系列质粒载体分为带有筛选基因GFP和不带筛选基因GFP两类。通过Gateway LR反应生成含带有Sleeping Beauty转座子作用元件(ITRS)，不同标签序列和筛选基因GFP的质粒载体。同时采用该系统能够很好地将目的基因整合到受体基因组中，实现基因的转移。

本发明提供以pSM1.1-HA-Puro-GFP为基础，构建用于基因功能与机制研究的一系列质粒载体。本方法融合了转座子和Gateway克隆技术的优点，可简单高效地用于构建过表达稳定株。

本发明的另一目的在于提供上述质粒载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一系列基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，是含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR-R序列。

所述的IRDR-L序列为SEQ ID NO.1中自5′端第8877位～9103位碱基的反向互补序列；所述的IRDR-R序列为SEQ ID NO.1中自5′端第5731位～5958位碱基。

所述的启动子为CAG启动子，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1位～1132位碱基。

所述的标签序列为HA标签序列、Myc标签序列、Flag标签序列或V5标签序列。

所述的HA标签序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1172位～1201位碱基。

所述的Myc标签序列为SEQ ID NO.2所示。

所述的Flag标签序列为SEQ ID NO.3所示。

所述的V5标签序列为SEQ ID NO.4所示。

所述的attR1序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1211位～1335位碱基；所述的attR2序列为SEQ ID NO.1中自5′端第2791位～2915位碱基的反向互补序列。

所述的反向选择性标记基因序列是指自杀基因ccdB，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第2445位～2750位碱基。

所述的筛选基因为抗性与荧光筛选基因，或抗性筛选基因。

所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第3464位～4063位碱基。

所述的荧光筛选基因是指绿色荧光蛋白(GFP)基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第4704位～5438位碱基。

本发明首先构建载有Sleeping Beauty转座子作用元件，Gateway cassette-终止子片段，HA标签Tag和GFP筛选基因的pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒载体，随后以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，通过改动标签序列Tag，改造构建分别载有Flag标签序列，Myc标签序列的两个Tag标签序列的质粒pSM1.1-Flag-Puro-GFP和pSM1.1-Myc-Puro-GFP。随后分别以它们三个质粒为模板，构建了去掉筛选基因GFP的质粒，分别是pSM1.1-Flag-Puro，pSM1.1-HA-Puro和pSM1.1-Myc-Puro。最后以pSM1.1-Flag-Puro为模板，通过改动标签序列Tag，改造构建载有V5标签序列的pSM1.1-V5-Puro。该系列质粒的发明将使得构建稳定株和质粒载体更加高效便利，同时满足各种常规的在真核细胞中表达目的基因的需要。构建7个质粒载体测序结果见序列表。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-HA-Puro-GFP，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

所述pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒载体，以pLenti PGK Puro DEST质粒，pCAGIG质粒，pT2/Onc质粒为模板，采用如下引物对进行扩增：

F1(SEQ ID NO.5)和R1(SEQ ID NO.6)，F2(SEQ ID NO.7)和R2(SEQ ID NO.8)，F3(SEQ ID NO.9)和R3(SEQ ID NO.10)，F4(SEQ ID NO.11)和R4(SEQ ID NO.12)，F5(SEQ IDNO.13)和R5(SEQ ID NO.14)，F6(SEQ ID NO.15)和R6(SEQ ID NO.16)，F7(SEQ ID NO.17)和R7(SEQ ID NO.18)。

本发明所述pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

第一步：以pLenti PGK Puro DEST质粒为模板，以F1和R1为引物，PCR扩增质粒的Gateway cassette-终止子片段，以pLenti PGK Puro DEST质粒为模板，以F2和R2为引物，PCR扩增质粒的PGK Promoter和Puro抗性基因的融合片段，胶回收上述PCR产物片段，然后，以Gateway cassette-终止子片段和PGK Promoter和Puro抗性基因的融合片段为模板，进行第一轮重组融合PCR反应，胶回收所得片段。

第二步：以pCAGIG质粒为模板，以F3和R3为引物，PCR反向扩增全长质粒。胶回收上述PCR产物后，与第一步所得片段共同作为模板，进行第二轮重组融合PCR反应，胶回收所得片段后，以F4和R4为引物，PCR反向扩增全长质粒。胶回收上述PCR产物。

第三步：以pT2/Onc质粒为模板，分别以F5，R5和F6，R6为引物，PCR扩增质粒的Sleeping Beauty的反向末端重复序列IRDR-L和IRDR-R。胶回收上述PCR产物片段后，以PCR扩增质粒的反向末端重复序列IRDR-L和第二步所得片段共同作为模板，进行第三轮重组融合PCR反应，胶回收所得片段后，以F7和R7为引物，PCR反向扩增全长质粒。胶回收上述PCR产物。

第四步：以PCR扩增质粒的反向末端重复序列IRDR-R和第三步所得片段共同作为模板，进行第四轮重组融合PCR反应，构建成pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-HA-Puro质粒载体，以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，采用如下引物对进行扩增：

Degfp-F(SEQ ID NO.19)和Degfp-R(SEQ ID NO.20)。

本发明所述pSM1.1-HA-Puro质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，以Degfp-F和Degfp-R为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-HA-Puro质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-Myc-Puro-GFP质粒载体，以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，采用如下引物对进行扩增：

F8(SEQ ID NO.21)和R8(SEQ ID NO.22)。

本发明所述pSM1.1-Myc-Puro-GFP质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，以F8和R8为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-Myc-Puro-GFP质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-Myc-Puro质粒载体，以pSM1.1-Myc-Puro-GFP为模板，采用如下引物对进行扩增：

Degfp-F(SEQ ID NO.19)和Degfp-R(SEQ ID NO.20)。

本发明所述pSM1.1-Myc-Puro质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-Myc-Puro-GFP为模板，以Degfp-F和Degfp-R为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-Myc-Puro质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-Flag-Puro-GFP质粒载体，以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，采用如下引物对进行扩增：

F9(SEQ ID NO.23)和R9(SEQ ID NO.24)。

本发明所述pSM1.1-Flag-Puro-GFP质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，以F9和R9为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-Flag-Puro-GFP质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-Flag-Puro质粒载体，以pSM1.1-Flag-Puro-GFP为模板，采用如下引物对进行扩增：

Degfp-F(SEQ ID NO.19)和Degfp-R(SEQ ID NO.20)。

本发明所述pSM1.1-Flag-Puro质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-Flag-Puro-GFP为模板，以Degfp-F和Degfp-R为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-Flag-Puro质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

本发明一系列质粒中的pSM1.1-V5-Puro质粒载体，以pSM1.1-Flag-Puro为模板，采用如下引物对进行扩增：

F10(SEQ ID NO.25)和R10(SEQ ID NO.26)。

本发明所述pSM1.1-V5-Puro质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-Flag-Puro为模板，以F10和R10为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-V5-Puro质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。

所述的质粒载体在快速构建过表达稳定株中的应用。

本发明的机理是：本发明的质粒载体将Gateway克隆与转座子技术融合，在构建细胞稳定株具有试验周期短、使用安全和插入目的基因片段大小不受限制等明显优势，节省科研人员大量的时间，因而对于提高科学研究效率是一个有力的工具。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)采用Sleeping Beauty转座子方法，构建稳定株的时间短，插入的目的片段大小不受影响，稳定重组效率高；同时不用包装病毒，避免了包装病毒过程中所产生的生物安全问题。

(2)采用Gateway克隆技术，过表达质粒载体构建时间短，阳性率高；

(3)本发明的质粒载体带有Sleeping Beauty转座子末端反向重复序列和GatewayCassette序列，基于转座酶的方法能快速高效的构建过表达稳定系。

(4)带有各种不同的标签序列Tag和带有筛选基因GFP，满足常规的在真核细胞中表达目的基因的需要。

附图说明

图1是本发明系列质粒载体的结构示意图；其中，克隆质粒pSM1.1-HA-Puro-GFP，pSM1.1-HA-Puro，pSM1.1-Myc-Puro-GFP，pSM1.1-Myc-Puro，pSM1.1-Flag-Puro-GFP，pSM1.1-Flag-Puro，pSM1.1-V5-Puro载体结构的示意图。

图2是本发明pSM1.1-HA-Puro-GFP载体的构建示意图。

图3是本发明pSM1.1-HA-Puro载体的构建示意图。

图4是本发明pSM1.1-Flag-Puro-GFP载体的构建示意图。

图5是本发明pSM1.1-HA-Puro-GFP高效表达外源基因；其中，(A)为从cDNA中扩增出FBXW7基因的琼脂糖电泳图；(B)Gateway分子克隆中，BP反应挑4个单克隆，进行菌落验证的琼脂糖电泳图；(C)Gateway分子克隆中，LB反应挑5个单克隆，进行菌落验证的琼脂糖电泳图；(D)pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP质粒转染到HeLa细胞后，通过荧光显微镜，观察转染效率；(E)Western Blot实验验证pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒是否表达。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

pT2/Onc质粒是是常规市售产品，文献出处为：Cancer gene discovery in solidtumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse.Collier LS,Carlson CM,Ravimohan S,Dupuy AJ,Largaespada DA Nature.2005Jul 14.436(7048):272-6.

克隆质粒pSM1.1-HA-Puro-GFP，pSM1.1-HA-Puro，pSM1.1-Myc-Puro-GFP，pSM1.1-Myc-Puro，pSM1.1-Flag-Puro-GFP，pSM1.1-Flag-Puro，pSM1.1-V5-Puro载体结构的示意图，如图1所示。

实施例1：

本实施例用于研究pSM1.1系列载体的构建方案，由于pSM1.1一系列载体构建方法基本一致，现选取pSM1.1-HA-Puro-GFP，pSM1.1-HA-Puro，pSM1.1-Flag-Puro-GFP这三种质粒载体的构建方案来代表pSM1.1系列载体的构建方法。

1.1 pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒构建

第一步：以pLenti PGK Puro DEST质粒为模板，以F1和R1为引物，PCR扩增质粒的Gateway cassette-终止子片段，以pLenti PGK Puro DEST质粒为模板，以F2和R2为引物，PCR扩增质粒的PGK Promoter和Puro抗性基因的融合片段，胶回收上述PCR产物片段，然后，以Gateway cassette-终止子片段和PGK Promoter和Puro抗性基因的融合片段为模板，进行一轮重组融合PCR反应，胶回收所得片段。

第二步：以pCAGIG质粒为模板，以F3和R3，PCR反向扩增全长质粒。胶回收上述PCR产物后，与第一步所得片段共同作为模板，进行第二轮重组融合PCR反应，胶回收所得片段后，以F4和R4，PCR反向扩增全长质粒。胶回收上述PCR产物。

第三步：以pT2/Onc质粒为模板，分别以F5，R5和F6，R6为引物，PCR扩增质粒的Sleeping Beauty的反向末端重复序列IRDR-L和IRDR-R。胶回收上述PCR产物片段后，以PCR扩增质粒的反向末端重复序列IRDR-L和第二步所得片段共同作为模板，进行第三轮重组融合PCR反应，胶回收所得片段后，以F7和R7，PCR反向扩增全长质粒。胶回收上述PCR产物。

第四步：以PCR扩增质粒的反向末端重复序列IRDR-R和第三步所得片段共同作为模板，进行第四轮重组融合PCR反应，构建成pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒(核苷酸序列如SEQID NO.1)，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。pSM1.1-HA-Puro-GFP质粒的构建示意图，如图2所示。

1.2 pSM1.1-HA-Puro质粒构建

所述的pSM1.1-HA-Puro质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，以Degfp-F和Degfp-R为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-HA-Puro质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。pSM1.1-HA-Puro载体的构建示意图，如图3所示。

1.3 pSM1.1-Flag-Puro-GFP质粒构建

以pSM1.1-HA-Puro-GFP为模板，以F9和R9为引物，PCR反向扩增质粒，胶回收上述PCR产物后，PCR产物进行末端平滑化及5′磷酸(P)化处理，自身连接成环，构建成pSM1.1-Flag-Puro-GFP质粒，质粒转化至大肠杆菌DB3.1，进行扩增。pSM1.1-Flag-Puro-GFP载体的构建示意图，如图3所示。

实施例2：

pSM1.1-HA-Puro-GFP是发明人构建成功的原始质粒，其余系列载体质粒均由此原始质粒通过只改动标签序列和筛选基因GFP，其他质粒元件不变，从而改造成含不同标签序列与是否含有筛选基因GFP的一系列质粒载体。本实例用于研究这个原始质粒pSM1.1-HA-Puro-GFP表达外源基因实施方案。

1.1 pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP质粒构建

以HeLa细胞的cDNA为模板，F11和R11为引物，PCR扩增出FBXW7基因(Gene Bank登录号：NM_001349798.1)，跑胶确定FBXW7基因被特异性扩增出来(图5A)，回收PCR产物，回收的PCR产物通过BP反应，重组到pDONR221入门载体上，转化到超级感受态菌OmniMAX2-T1中，涂Kana⁺平板，挑单克隆使用M13正反向引物(M13-F和M13-R)进行菌落验证(图5B)。将菌落验证对的重组菌使用碧云天的小规模提取试剂盒(D0003))进行质粒提取，构建成pDONR221-FBXW7入门克隆。然后通过LR反应，重组到pSM1.1-HA-Puro-GFP表达载体上，转化到超级感受态菌OmniMAX2-T1中，涂Amp⁺平板，挑单克隆使用pSM1.1-F、pSM1.1-R正反向引物进行菌落验证(图5C)。将菌落验证对的菌种送去测序，进一步验证质粒。构建成pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP表达质粒。

所用引物序列：

F11(SEQ ID NO.27)和R11(SEQ ID NO.28)；

M13-F(SEQ ID NO.29)和M13-R(SEQ ID NO.30)。

1.2 pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP质粒转化，挑单克隆进行菌落验证，大规模提取质粒

质粒转化采用热击法，将pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP质粒约1μL加入到50μL的商品化的超级感受态菌OmniMAX2-T1当中，轻轻吹打混匀，在冰上静置30min，42摄氏度水浴热击90s，再加入250μL的LB培养基，37摄氏度200rpm摇菌摇上1h，将全部菌液涂到含氨苄抗生素的LB平板上，37℃的条件下培养14h，挑取单克隆，使用pSM1.1-F和pSM1.1-R作为引物进行菌落验证鉴定，把验证正确的菌种保存。构建的重组质粒命名为pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP。

所用引物序列：

pSM1.1-F(SEQ ID NO.31)和pSM1.1-R(SEQ ID NO.32)。

取200μL上述重组菌到250L的LB培养基中，37摄氏度，200rpm摇菌摇上14h后，使用biotool的大规模提取试剂盒(B22213))提取质粒，得到质粒浓度为950ng/μL，500μL体系。

1.3质粒电转染，Western Blot实验验证

吸取300μL Opti-MEM分装入1.5mL的EP管中，加入10μg提取好的pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP质粒和2μg转座酶质粒SB100X，取10⁶对数生长期的HeLa细胞，加入300μLOpti-MEM重悬细胞，然后将细胞悬液加入到预先与质粒混匀的300μL Opti-MEM中，柔和混匀后，将细胞和质粒的混合液转移至电转杯中，以250V，950uF的条件在Bio-Rad Genepulsar II进行电击，电击后将混合液吸取到6cm皿中，加入4mL培养基培养24h后，第二天加入puromycin至2μg/mL进行筛选，3天后进行Western Blot实验。通过GFP荧光可以观察质粒转染的效率(图5D)。

取100μL RIPA裂解液裂解筛选后的细胞和阴性对照组的HeLa细胞，冰上裂解30min后，4度离心20min，取上清，通过Bradford方法测蛋白浓度。蛋白样品经10％的SDS-PAGE胶电泳后，通过350mA，2h方法将蛋白样品转印到PVDF膜上。转膜后，5％的脱脂奶粉，室温封闭1h，FBXW7一抗抗体稀释液(Bethyl，A301-720A，1:1000)，HA一抗抗体稀释液(CST，3724，1:1000)，Cyclin E一抗抗体稀释液(CST，20808，1:1000)，GAPDH一抗抗体稀释液(CST，2118，1:1000)4度孵育过夜。过夜孵育完后，PBST洗涤膜3次，每次10min。再室温孵育二抗(1:15000)1h，PBST洗涤膜3次。加入显色液，曝光。

结果显示：pSM1.1-HA-FBXW7-Puro-GFP质粒成功表达大小约90kDa HA-FBXW7融合蛋白(图5E)，表明构建在pSM1.1-HA-Puro-GFP载体上的FBXW7基因能在HeLa细胞中成功表达。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学孙逸仙纪念医院

<120> 基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体及其应用

<130> 1

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9194

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSM1.1-HA-Puro-GFP的核苷酸序列

<220>

<221> CAG启动子

<222> (1)..(1132)

<220>

<221> HA标签序列

<222> (1172)..(1201)

<220>

<221> attR1

<222> (1211)..(1335)

<220>

<221> 自杀基因ccdB

<222> (2445)..(2750)

<220>

<221> attR2的反向互补序列

<222> (2791)..(2915)

<220>

<221> 嘌呤霉素（puromycin）抗性基因

<222> (3464)..(4063)

<220>

<221> 绿色荧光蛋白（GFP）基因

<222> (4704)..(5438)

<220>

<221> IRDR-R

<222> (5731)..(5958)

<220>

<221> IRDR-L的反向互补序列

<222> (8877)..(9103)

<400> 1

ggccgctcta gcccctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360

agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 420

ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 480

gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 540

cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 600

ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 660

agtcgctgcg ttgccttcgc cccgtgcccc gctccgcgcc gcctcgcgcc gcccgccccg 720

gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg gacggccctt ctcctccggg 780

ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt ctgtggctgc gtgaaagcct 840

tgaggggctc cgggagggcc ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc 900

gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 960

ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 1020

agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 1080

ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattgatt aattcgagcg aacgcgtggt 1140

accgaagccg ctagcgctac cggtcgccac catgtaccca tacgatgttc cagattacgc 1200

tgaattgatc acaagtttgt acaaaaaagc tgaacgagaa acgtaaaatg atataaatat 1260

caatatatta aattagattt tgcataaaaa acagactaca taatactgta aaacacaaca 1320

tatccagtca ctatggcggc cgcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1380

tcgtataatg tgtggatttt gagttaggat ccgtcgagat tttcaggagc taaggaagct 1440

aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa 1500

gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg 1560

gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt 1620

attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc aatgaaagac 1680

ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact 1740

gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata 1800

tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt 1860

gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac 1920

gtggcaaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa 1980

ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc 2040

catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgtg atgagtggca gggcggggcg 2100

taaacgcgtg gatccggctt actaaaagcc agataacagt atgcgtattt gcgcgctgat 2160

ttttgcggta taagaatata tactgatatg tatacccgaa gtatgtcaaa aagaggtatg 2220

ctatgaagca gcgtattaca gtgacagttg acagcgacag ctatcagttg ctcaaggcat 2280

atatgatgtc aatatctccg gtctggtaag cacaaccatg cagaatgaag cccgtcgtct 2340

gcgtgccgaa cgctggaaag cggaaaatca ggaagggatg gctgaggtcg cccggtttat 2400

tgaaatgaac ggctcttttg ctgacgagaa caggggctgg tgaaatgcag tttaaggttt 2460

acacctataa aagagagagc cgttatcgtc tgtttgtgga tgtacagagt gatattattg 2520

acacgcccgg gcgacggatg gtgatccccc tggccagtgc acgtctgctg tcagataaag 2580

tctcccgtga actttacccg gtggtgcata tcggggatga aagctggcgc atgatgacca 2640

ccgatatggc cagtgtgccg gtctccgtta tcggggaaga agtggctgat ctcagccacc 2700

gcgaaaatga catcaaaaac gccattaacc tgatgttctg gggaatataa atgtcaggct 2760

cccttataca cagccagtct gcaggtcgac catagtgact ggatatgttg tgttttacag 2820

tattatgtag tctgtttttt atgcaaaatc taatttaata tattgatatt tatatcattt 2880

tacgtttctc gttcagcttt cttgtacaaa gtggttgatc tcgaggagtt aacgaattct 2940

accgggtagg ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta gcagccccgc 3000

tgggcacttg gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca tccaccggta 3060

ggcgccaacc ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc accttctact cctcccctag 3120

tcaggaagtt cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa atggaagtag 3180

cacgtctcac tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag cgggtaggcc 3240

tttggggcag cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag aggctgggaa 3300

ggggtgggtc cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc gcccgaaggt 3360

cctccggagg cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct 3420

cttcctcatc tccgggcctt tcgacctgca gcccaagctt accatgaccg agtacaagcc 3480

cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc 3540

gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt 3600

caccgagctg caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt 3660

cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc 3720

ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca 3780

gcaacagatg gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc 3840

caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc 3900

cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg 3960

caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga 4020

aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgacgcccgc cccacgaccc 4080

gcagcgcccg accgaaagga gcgcacgacc ccatgcatcc aattccgccc ccccccccta 4140

acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 4200

ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 4260

cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 4320

tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 4380

gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 4440

aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 4500

aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 4560

taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 4620

cgaggttaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac 4680

acgatgataa tatggccaca accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 4740

tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 4800

agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 4860

agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 4920

gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 4980

acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 5040

tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 5100

aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 5160

tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 5220

aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 5280

ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 5340

acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 5400

gcatggacga gctgtacaag agatctcgag ctcgatgagt ttggacaaac cacaactaga 5460

atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 5520

attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt 5580

cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtacttaa 5640

gagggatcga taaggatcta gcttgtggaa ggctactcga aatgtttgac ccaagttaaa 5700

caatttaaag gcaatgctac caaatactaa ttgagtgtat gtaaacttct gacccactgg 5760

gaatgtgatg aaagaaataa aagctgaaat gaatcattct ctctactatt attctgatat 5820

ttcacattct taaaataaag tggtgatcct aactgaccta agacagggaa tttttactag 5880

gattaaatgt caggaattgt gaaaaagtga gtttaaatgt atttggctaa ggtgtatgta 5940

aacttccgac ttcaactgta tagggatcct ctagctagag tcgacctcga gggggggccc 6000

ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggcgt aatcatggtc 6060

atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg 6120

aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt 6180

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg 6240

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga 6300

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 6360

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 6420

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 6480

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 6540

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 6600

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 6660

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 6720

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 6780

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 6840

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 6900

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 6960

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 7020

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 7080

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 7140

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 7200

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 7260

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 7320

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 7380

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 7440

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 7500

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 7560

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 7620

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 7680

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 7740

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 7800

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 7860

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 7920

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 7980

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 8040

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 8100

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 8160

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgcgccctg 8220

tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc 8280

cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg 8340

ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg 8400

gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg 8460

atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt 8520

ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt 8580

gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt 8640

taacaaaata ttaacgctta caatttccat tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa 8700

gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca 8760

aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc 8820

agtgagcgcg cgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctcggatc cctatacagt 8880

tgaagtcgga agtttacata cacttaagtt ggagtcatta aaactcgttt ttcaactact 8940

ccacaaattt cttgttaaca aacaatagtt ttggcaagtc agttaggaca tctactttgt 9000

gcatgacaca agtcattttt ccaacaattg tttacagaca gattatttca cttataattc 9060

actgtatcac aattccagtg ggtcagaagt ttacatacac taagttgact gtgcctttaa 9120

acagcttgga aaattccaga aaatgatgtc atggctttag aagcttgata tccatggaat 9180

tcactagtgc gcgc 9194

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Myc标签序列

<400> 2

atggaacaaa aactcatctc agaagaggat ctg 33

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Flag标签序列

<400> 3

atggactaca aggacgacga tgacaag 27

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> V5标签序列

<400> 4

atggcaggca agccaatccc taaccctctg ctgggcctgg acagcacc 48

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F1

<400> 5

aatagtaatc aattacgggg tacccatacg atgttccaga ttacg 45

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1

<400> 6

gctttcttgt acaaagtggt gggtagggga ggcgcttttc 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F2

<400> 7

gaaaagcgcc tcccctaccc accactttgt acaagaaagc 40

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R2

<400> 8

tccccgaaaa gtgccacctg tcaggcaccg ggcttgcg 38

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F3

<400> 9

caggtggcac ttttcgggg 19

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R3

<400> 10

ccccgtaatt gattactatt aataactagt c 31

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F4

<400> 11

atatcaagct tctaaagcca tgacat 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R4

<400> 12

ccctatagtg agtcgtatta cgcg 24

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F5

<400> 13

taatacgact cactataggg cagttgaagt cggaagttta cataca 46

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R5

<400> 14

tggctttaga agcttgatat ttagtgtatg taaacttctg acccactg 48

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F6

<400> 15

cccaagttaa acaatttaaa ttgagtgtat gtaaacttct gaccca 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R6

<400> 16

cagcttttgt tccctttagt cagttgaagt cggaagttta cataca 46

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F7

<400> 17

actaaaggga acaaaagctg ggt 23

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R7

<400> 18

tttaaattgt ttaacttggg tcaaaca 27

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Degfp-F

<400> 19

tccaattccg cccccccccc cta 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Degfp-R

<400> 20

gagatctcga gctcgatgag ttt 23

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F8

<400> 21

gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg gaattgatca caagtttgta 50

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R8

<400> 22

catggtggcg accggtagcg 20

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F9

<400> 23

gactacaagg acgacgatga caaggaattg atcacaagtt tgta 44

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R9

<400> 24

catggtggcg accggtagcg 20

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F10

<400> 25

gcaggcaagc caatccctaa ccctctgctg ggcctggaca gcacc 45

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R10

<400> 26

catggtggcg accggtagcg 20

<210> 27

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> F11

<400> 27

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccatgaat caggaactgc tctctgt 57

<210> 28

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R11

<400> 28

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta gtatcacttc atgtccacat caaagt 56

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M13-F

<400> 29

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> M13-R

<400> 30

caggaaacag ctatgacc 18

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSM1.1-F

<400> 31

ctggttattg tgctgtctca tc 22

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pSM1.1-R

<400> 32

gccacttgtg tagcgccaag tg 22

Claims

1.基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的质粒载体是含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、启动子、标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR-R序列；

2.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的IRDR-L序列为SEQ ID NO.1中自5′端第8877位～9103位碱基的反向互补序列；

所述的IRDR-R序列为SEQ ID NO.1中自5′端第5731位～5958位碱基。

3.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的启动子为CAG启动子。

4.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的HA标签序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1172位～1201位碱基；

所述的Myc标签序列为SEQ ID NO.2所示；

所述的Flag标签序列为SEQ ID NO.3所示；

所述的V5标签序列为SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的attR1序列为SEQ ID NO.1中自5′端第1211位～1335位碱基；

所述的attR2序列为SEQ ID NO.1中自5′端第2791位～2915位碱基的反向互补序列。

6.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的反向选择性标记基因序列是指自杀基因ccdB。

7.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的筛选基因为抗性与荧光筛选基因，或抗性筛选基因。

8.根据权利要求1所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素抗性基因；

所述的荧光筛选基因是指绿色荧光蛋白基因。

9.根据权利要求8所述的基于转座酶建立过表达稳定系的质粒载体，其特征在于：

所述的嘌呤霉素抗性基因的序列为SEQ ID NO.1中自5′端第3464位～4063位碱基；

所述的绿色荧光蛋白基因的序列为SEQ ID NO.1中自5′端第4704位～5438位碱基。

10.权利要求1～9任一项所述的质粒载体在快速构建过表达稳定株中的应用。