CN110079551B

CN110079551B - 一种环状rna表达载体及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN110079551B
Application number: CN201910267364.9A
Authority: CN
Inventors: 贺俊波; 邹翠云; 江福能; 张蓓; 钟惟德; 朱建国
Original assignee: Guangzhou Huiyuanyuan Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guangzhou Huiyuanyuan Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2039-04-03
Also published as: CN110079551A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达环状RNA的载体及其应用。本发明的环状RNA表达的载体，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述环状RNA表达载体具有上游成环序列(SEQ ID NO：2)、下游成环序列(SEQ ID NO：3)和环状RNA编码序列插入酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ。本发明还提供所述环状RNA表达载体的构建方法和所述环状RNA表达载体的应用方法。本发明载体普遍适用于各种环状RNA的表达，表达效率高、稳定，并且能够将任意较长的DNA序列无缝环化成其编码的环状RNA，还可以将目标环状RNA的表达框插入细胞的染色体中，构建稳定细胞株。

Description

一种环状RNA表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达环状RNA的载体及其构建方法和应用。

背景技术

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类封闭环状的非编码RNA分子，不受RNA外切酶影响，表达稳定，不易降解。circRNA早在20世纪80年代即有研究报道，但由于其表达丰度低，文献报道较少，一直被认为是RNA转录剪切的罕见错误而被忽视。直到2012年开始有研究者开始大批量鉴定circRNA，从古生菌、线虫、小鼠和人类细胞鉴定出大量circRNA，揭示circRNA大量存在于真核转录组中，是细胞基因表达的一个普遍现象。

近几年研究证实或推测circRNA的功能主要有：(1)充当ceRNA或miRNA海绵(miRNAsponge)，通过MRE(microRNA response element)竞争性结合miRNA，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平，例如circHIPK3能够特异地结合miR-30a-3p，使mir-30a-3p不能抑制其靶基因；(2)通过碱基互补配对直接调控其它RNA表达，例如ciRS-7/CDR1as能与CDR1mRNA互补配对，从而增强CDR1mRNA的稳定性；(3)与蛋白质结合，例如circHIPK3能与Ago2蛋白紧密结合；(4)作为翻译的模板指导蛋白质的合成，例如人头骨瘤细胞U2OS中，circRNA具有翻译功能，尽管其翻译效率非常低；(5)与RNA聚合酶II(RNApolymerase II，Pol II)相互作用，顺式作用调控宿主转录活性，例如circEIF3J和circPAIP2通过与U1snRNP和PolⅡ形成复合体，结合到其宿主基因的启动子区域调控基因表达。

已有研究表明circRNA在中脑发育、帕金森病、阿尔兹海默病、糖尿病性视网膜病变和肿瘤发生中发挥重要作用。circRNA也是RNA领域最新的研究热点。

circRNA表达载体是研究circRNA功能机制必不可少的工具。现有技术方案一的内容：以基因组DNA为模板，以环状RNA编码序列为中心，扩增其上下游很长(1000bp左右)的一段序列，然后插入到普通的表达载体上，从而实现过表达该环状RNA的目的；现有技术方案一的缺点是：1)环状RNA形成率无法保证，环状RNA的形成率往往不到该序列线性RNA的10％，对后继研究造成影响，2)PCR扩增片段长，难度大，周期长。

现有技术方案二的内容：目前大部分商业化的环状RNA过表达载体，通过将某个环状RNA上下游成环序列框架连接到一般的商业过表达载体上，中间添加一些克隆位点，达到方便快速表达不同环状RNA的目的；现有技术方案二的缺点是环状RNA基因片段两端必须加入酶切位点，才能保证环状RNA基因能够连接到载体上，所加入的酶切位点序列会自动环化进环状RNA中，所表达出来的环状RNA会多出酶切位点的序列，可能会改变原环状RNA的功能。因此这种方法不能准确地表达环状RNA。

现有技术方案三的内容：根据环状RNA的剪接原则，在某个环状RNA上下游成环序列之间添加EcoNⅠ(酶切产物的粘性末端只有一个碱基)和PmlⅠ(酶切产物是平末端)的识别序列，用EcoNⅠ和PmlⅠ双酶切环状RNA表达载体，线型环状RNA表达载体的两端正好是剪接位点，利用重组的方式将目标环状RNA的编码序列连接到环状RNA表达载体中，实现环状RNA的无缝环化；现有技术方案三的缺点EcoNⅠ和PmlⅠ不是常用的限制性内切酶，活性较低，价格较高。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种环状RNA表达载体及其构建方法和应用方法，该载体普遍适用于各种环状RNA的表达，表达效率高、稳定，克隆经济、简便，并且能够将绝大多数较长的DNA序列无缝环化成其编码的环状RNA。

本发明提供一种适用于表达环状RNA的载体。

本发明还提供所述表达环状RNA的载体的构建方法。

本发明还提供所述环状RNA表达载体的应用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种表达环状RNA的载体，其脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步的，所述表达环状RNA的载体具有上游成环序列、下游成环序列和环状RNA编码序列插入酶切位点；其中，上游成环序列如SEQ ID NO：2所示，下游成环序列如SEQ IDNO：3所示，所述环状RNA插入酶切位点为BamHⅠ和PstⅠ。

本发明所述表达环状RNA的载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

(S1)根据环状RNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本原理，设计出适用于环状RNA表达的上、下游成环序列，然后在上、下游成环序列之间添加两个克隆位点，并且在序列两端增加克隆位点，便于构建到载体中；人工合成此用于表达环状RNA的序列。

(S2)双酶切S1合成的用于表达环状RNA的序列和过量表达载体；所述过量表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-puro或pLVO6；

(S3)将上述酶切产物在琼脂糖凝胶中电泳，用DNA回收试剂盒回收目的片段；

(S4)将S3回收的DNA片段水浴连接；

(S5)连接产物转化感受态细胞；

(S6)单克隆扩大培养后提取质粒，测序检测，确认得到表达环状RNA的载体。

本发明还提供了利用所述环状RNA表达载体构建环状RNA过量表达稳定细胞株的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用5′端具有5′-TTTTTTTTTATACTTCAG-3′序列的上游引物和5′端具有5′-GGACTCCTTGCTTCTTAC-3′序列的下游引物(上下游引物3′端的序列跟据需要扩增的环状RNA的编码序列确定，如PCR扩增cicrRNA.19142和cicrRNA434的编码序列使用的引物的完整序列是不一样的)通过PCR扩增目标环状RNA的编码序列，或者合成5′端增加5′-TTTTTTTTTATACTTCAG-3′序列和3′端增加5′-GTAAGAAGCAAGGAGTCC-3′序列的目标环状RNA的编码序列(例如SEQ ID NO：15所示的cicrRNA.19142的编码序列和SEQ ID NO：16所示的cicrRNA434的编码序列)。

(2)用BamHⅠ和PstⅠ双酶切本发明的环状RNA表达载体；

(3)将上述酶切产物在琼脂糖凝胶中电泳，用DNA回收试剂盒回收8660bp的DNA片段；

(4)用Vazymer的ClonExpress及相关产品或者Clontech的

系列产品通过重组将目标环状RNA的编码序列连接到线型环状RNA表达载体中；

(5)连接产物转化感受态细胞；

(6)单克隆扩大培养后提取质粒，测序检测，确认得到目标环状RNA表达质粒；

(7)用上述环状RNA表达质粒与包装质粒共转染293T细胞；

(8)收集病毒液；

(9)用病毒液感染目的细胞；

(10)用嘌呤霉素筛选上述细胞，获得环状RNA过量表达稳定细胞株。

本发明有益效果：

(1)能够将绝大多数较长的DNA序列表达成其编码的环状RNA。现有技术无法实现这一效果的技术难点在于有些环状RNA无法表达，很多环状RNA表达载体表达成功率只有80％～90％，本发明载体的上游环化序列和下游环化序列含有4个ALU重复序列(上游2个，下游2个)、剪接供体编码序列(GTAAGAAGCAAGGAG)和剪接受体编码序列(TTTTTTTTTTATACTTCAG)，这些ALU重复序列编码的RNA通过碱基互补配对稳定地结合在一起，从而使剪接供体序列和剪接受体序列靠近，内切核酸酶和RNA连接酶作用于剪接供体序列和剪接受体序列，将插入片段编码的RNA的首尾连接在一起，这对于实现将绝大多数较长的DNA序列表达成其编码的环状RNA的效果有主要作用。

(2)用本发明提供的环状RNA表达载体和本发明提供的构建方法构建的环状RNA表达质粒能够准确地表达无缝环化的环状RNA，本发明载体上游环化序列和下游环化序列,以及构建环状RNA过量表达稳定细胞株的方法对于实现该效果有主要作用，即表达的环状RNA是上、下游成环序列之间的DNA序列的编码产物，不会在拼接位点插入多余的核苷酸，也不会删除编码产物中的核苷酸，因为通过重组将目标环状RNA的编码序列连接到线型环状RNA表达载体中后，酶切产生的粘性末端的序列不会保留在载体中。

(3)即使目标环状RNA的编码序列中有BamHⅠ或者PstⅠ的识别位点，也能够通过重组把目标环状RNA的编码序列连接到本发明提供的环状RNA表达载体中。

(4)用本发明提供的环状RNA表达载体和应用方法能够经济、高效地构建环状RNA表达质粒。

(5)本发明提供的环状RNA表达载体可以将目标环状RNA的表达框插入细胞的染色体中，构建稳定细胞株，也可以用于瞬时转染。

附图说明

图1是本发明的环状RNA表达载体整体结构图；其中，上游成环序列SEQ ID NO：2即Front circular frame，下游成环序列SEQ ID NO：3即Back circular frame。

图2是本发明的环状RNA表达载体用BamHⅠ和ApaⅠ酶切鉴定图；

图3是本发明的环状RNA表达载体的过表达效果图，pLVCRE和以其构建的环状RNA表达质粒包装的慢病毒分别感染细胞，qPCR鉴定环状RNA的表达水平，两个环状RNA分别过量表达1029倍和5716倍。

图4是cicrRNA.19142的定量PCR产物的电泳图；

图5是cicrRNA434的定量PCR产物的电泳图；

图6是pLVCRE-cicrRNA.19142表达的cicrRNA.19142的测序结果；

图7是pLVCRE-cicrRNA434表达的cicrRNA434的测序结果；

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

主要材料如下：

293T细胞、MC3T3-E1细胞和PC3细胞由本公司保存，裸小鼠购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

主要试剂如下：

pLVO6载体购自广州博垚生物科技有限公司，EcoRⅠ、NotⅠ、ApaⅠ、BamHⅠ和PstⅠ酶购自NEB(北京)有限公司，TransStart KD Plus DNA Polymerase、2.5mM dNTPs、Trans5αChemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司，T4DNA Ligase和TurboFect试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,ClonExpressⅡOne Step CloningKit和HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京诺唯赞生物科技有限公司,HiPure Gel Pure DNA Mini Kit、HiPure Plasmid Midi EF Kits和HiPure TissueDNA Mini Kit购自广州欣研生物科技有限公司，2×Power Taq PCR MasterMix和高纯总RNA快速提取试剂盒(离心柱型)购自北京百泰克生物技术有限公司，

qPCR SYBRGreen Master Mix(No Rox)购自上海翊圣生物科技有限公司，MEM培养基购自GIBCO公司，引物由广州探真生物科技有限公司合成，长DNA片段由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。

主要设备如下：

A100型全触控屏PCR仪(杭州朗基科学仪器有限公司)、EPS 300电泳仪(上海天能科技有限公司)、Tanon 1600全自动数码凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)、Nano-300微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)、MK-20干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)、SW-CJ医用型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)、H1650-W台式微量高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、H1850R台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)。

实施例一：环状RNA表达载体构建

(1)、根据环状RNA的形成机制和真核生物RNA剪接的基本原理，设计出适用于环状RNA表达的上、下游成环序列(上游成环序列如SEQ ID NO：2所示，下游成环序列如SEQ IDNO：3所示)，根据pLVO6载体的序列信息，在上、下游成环序列之间添加两个克隆位点BamHⅠ和PstⅠ，从而得到完整的实现circRNA过量表达的DNA序列，如SEQ ID NO：4所示。

(2)、将上述合成的实现circRNA过量表达的DNA序列一端添加EcoRⅠ的识别序列及保护序列CCG，另一端添加NotⅠ的识别序列及保护序列AAATAT，人工合成此序列。

(3)、用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切上述步骤(2)中合成的序列和pLVO6载体，反应体系如下：

(4)、用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit分别回收178 bp和8494 bp的酶切产物，具体步骤按照试剂盒使用操作手册进行。

(5)、把上述酶切后的合成序列连接到pLVO6载体中，反应体系如下：

(6)、取10μL上述连接反应体系转化到Trans5α感受态大肠杆菌中，并平铺在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养12h。

(7)、挑取7个单菌落分别于20μL灭菌超纯水中打散混匀，利用pLVCRE-F(序列如SEQ ID NO：5所示)和pLVCRE-R(序列如SEQ ID NO：6所示)进行菌落PCR鉴定阳性克隆，反应体系如下：

PCR反应条件如下：

(8)、PCR产物用含溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

(9)、阳性菌落扩大培养，委托广州艾基生物技术有限公司提取质粒并且测序验证。

(10)、扩大培养含有环状RNA表达载体pLVCRE的菌体，用HiPure Plasmid EF MidiKit中量提取环状RNA表达载体pLVCRE，用Nano-300微量分光光度计检测pLVCRE载体的浓度。

(11)用BamHⅠ和ApaⅠ双酶切鉴定提取的pLVCRE载体，反应体系如下：

37℃水浴1小时。以含溴化乙锭(EB)的0.7％琼脂糖凝胶电泳检测pLVCRE载体和酶切产物。酶切鉴定图如图2所示。pLVCRE载体被BamHⅠ和ApaⅠ剪切成7425bp和1248bp的两个片段，酶切产物大小与理论大小相符。

实施例二：pLVCRE-cicrRNA.19142质粒的构建

(1)、用HiPure Tissue DNA Mini Kit提取小鼠肌肉细胞的DNA。

(2)、以小鼠肌肉细胞的DNA为模板，利用cicrRNA.19142-F(序列如SEQ ID NO：7所示)和cicrRNA.19142-R(序列如SEQ ID NO：8所示)进行PCR扩增cicrRNA.19142的编码序列(如SEQ ID NO：15所示)。

反应体系如下：

PCR反应条件如下：

(3)、PCR产物以含溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳检测，切出目的条带处的凝胶。

(4)、用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit回收凝胶块中的PCR产物。

(5)、用NheⅠ和AgeⅠ双酶切pLVCRE载体，反应体系如下：

(6)、酶切产物以含溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳检测，切出线型pLVCRE载体处的凝胶。

(7)、用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit回收凝胶块中的线型pLVCRE载体。

(8)、用

ⅡOne Step Cloning Kit将回收的PCR产物连接到pLVCRE载体中，反应体系如下：

37℃反应30min，即置于冰上冷却5min。

(9)、取10μL上述连接反应体系转化到Trans5α感受态大肠杆菌中，并平铺在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，于37℃培养箱倒置培养12h。

(10)、挑取两个单菌落测序验证。

(11)、扩大培养含有pLVCRE-cicrRNA.19142质粒的菌体，用HiPure Plasmid EFMidi Kit中量提取pLVCRE-cicrRNA.19142质粒，用Nano-300微量分光光度计检测pLVCRE载体的浓度，并且以含溴化乙锭(EB)的0.7％琼脂糖凝胶电泳检测pLVCRE载体的超螺旋率。

(12)、类似地，利用cicrRNA434-F(序列如SEQ ID NO：9所示)和cicrRNA434-R(序列如SEQ ID NO：10所示)进行PCR扩增人7号染色体中434bp的序列(NC_000007.14，100023455-100023888，具体序列如SEQ ID NO：16所示)，用相同的方法构建pLVCRE-cicrRNA434质粒。

实施例三：包装和稳定细胞株的构建

(1)、转染前24h，用胰酶消化对数生长期的293T细胞，传代到10cm细胞培养皿中，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h后细胞密度达70％～80％时即可用于转染。

(2)、将细胞培养基更换为无血清培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养。

(3)、向一灭菌离心管中加入9μg pLVCRE-cicrRNA.19142质粒、3μg PPACK-H1-GAG质粒、3μg PPACK-HI-REV质粒、3μg PVSV-G质粒和0.6mL Opti-MEM培养液，混均，室温放置5min。向另一灭菌离心管中加入36μL TurboFect试剂和0.6mL Opti-MEM培养液，混匀，室温放置5min。

(3)、把稀释后的TurboFect试剂缓慢加入稀释后的DNA溶液中，轻轻地颠倒混匀，静置20min。

(4)、将TurboFect和DNA混合物加到293T细胞中,混匀，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

(5)、培养6小时后吸去含有转染混和物的培养基，每皿细胞中加入含10％血清的细胞培养基10mL，于37℃、5％CO₂培养箱内继续培养。

(6)、转染24、48小时后，分别用15mL离心管收集培养液，室温下离心3000rpm，5分钟，上清液用0.45μm过滤器过滤到15mL离心管中。

(7)、每30mL过滤后的病毒初始液加入病毒浓缩液7.5mL。

(8)、每20～30min混合一次，共进行3-5次。

(9)、4℃放置12h。4℃、4000×g离心20min。

(10)、吸弃上清，静置离心管2min，吸走残余液体，加入适量空白DMEM混匀分装至1.5mL离心管中。

(11)、转染前一天，MC3T3-E1细胞铺6孔板铺至80％左右的密度。

(12)、每孔加入2mL pLVCRE-cicrRNA.19142病毒浓缩液和1μg Polybrene。另取pLVCRE空载体对照病毒感染做对照细胞系。

(13)、放回培养箱37℃、5％CO₂培养12小时左右，换成完全培养基继续培养。

(14)、感染48小时后观察荧光情况，加入puromycin使其终浓度为2ug/mLpuromycin进行稳定细胞株筛选。

(15)、类似地，用同样方法制备pLVCRE-cicrRNA434病毒浓缩液，用pLVCRE-cicrRNA434病毒浓缩液感染PC3细胞获得稳定细胞株，同时用pLVCRE空载体构建对照细胞系。

实施例四：qPCR和测序检测

(1)、用高纯总RNA快速提取试剂盒提取细胞的总RNA，用Nano-300微量分光光度计检测总RNA的浓度。

(2)、用HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)除去总RNA中的微量DNA，实验体系如下：

(3)、向上述反应体系中加入5μL HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNAwiper)中的5×qRT SuperMixⅡ，50℃反应15min，85℃处理2min，将RNA逆转录成cDNA。

(4)、以cDNA为模板，用cicrRNA.19142-qF(序列如SEQ ID NO：11所示)和cicrRNA.19142-qR引物(序列如SEQ ID NO：12所示)进行定量PCR检测cicrRNA.19142的表达水平，cicrRNA.19142过量表达了1029倍(如图3所示)，定量PCR产物的电泳图如图4所示；同时用cicrRNA434-qF(序列如SEQ ID NO：13所示)和cicrRNA434-qR引物(序列如SEQ IDNO：14所示)进行定量PCR检测cicrRNA434的表达水平，cicrRNA434过量表达了5716倍(如图3所示)，定量PCR产物的电泳图如图5所示。反应体系如下：

反应条件如下：

(5)、用含溴化乙锭(EB)的2％琼脂糖凝胶电泳检测定量PCR产物，切出定量PCR产物处的凝胶。

(7)、用HiPure Gel Pure DNA Mini Kit回收凝胶块中的定量PCR产物。

(8)委托广州艾基生物技术有限公司测序检测定量PCR产物的序列。测序结果如图6、图7所示，cicrRNA.19142和cicrRNA434都无缝环化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广州辉园苑医药科技有限公司

<120> 一种环状RNA表达载体及其构建方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8673

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60

acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120

cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180

attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240

ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300

gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360

tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420

ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 480

cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 540

ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 600

agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 660

ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 720

ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 780

ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 840

aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaacaaa 900

agtaagacca ccgcacagca agcggccact gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 960

ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 1020

agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 1080

agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 1140

gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 1200

gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 1260

ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 1320

gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 1380

taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 1440

caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 1500

tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 1560

aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 1620

aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 1680

gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 1740

aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg 1800

gttaactttt aaaagaaaag gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga 1860

cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aattcaaaat 1920

tttatcgata ctagtgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt 1980

cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 2040

ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 2100

taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 2160

acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 2220

gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 2280

agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca 2340

atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca 2400

atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg 2460

ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc 2520

tctggctaac tagagaaccc actgcttact ggcttatcga aattaatacg actcactata 2580

gggagaccca agctggaatt cagacgtcag tatacacgcg tcagagtaca gacggggttt 2640

caccatgttg gccaggctgg actttttttt tttatacttc aggatccgct agactgcagt 2700

aagaagcaag gagtccagcc tggccaacat ggtgaaacct tgtctgtact ctgacgcgtg 2760

tatactgacg tctgcggccg cgaaggatct gcgatcgctc cggtgcccgt cagtgggcag 2820

agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaacgggtg 2880

cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt 2940

ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc 3000

gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac 3060

gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc 3120

ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga 3180

gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag actcagccgg ctctccacgc 3240

tttgcctgac cctgcttgct caactctacg tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt 3300

acagatccaa gctgtgaccg gcgcctacgc tagacgccac catggagagc gacgagagcg 3360

gcctgcccgc catggagatc gagtgccgca tcaccggcac cctgaacggc gtggagttcg 3420

agctggtggg cggcggagag ggcaccccca agcagggccg catgaccaac aagatgaaga 3480

gcaccaaagg cgccctgacc ttcagcccct acctgctgag ccacgtgatg ggctacggct 3540

tctaccactt cggcacctac cccagcggct acgagaaccc cttcctgcac gccatcaaca 3600

acggcggcta caccaacacc cgcatcgaga agtacgagga cggcggcgtg ctgcacgtga 3660

gcttcagcta ccgctacgag gccggccgcg tgatcggcga cttcaaggtg gtgggcaccg 3720

gcttccccga ggacagcgtg atcttcaccg acaagatcat ccgcagcaac gccaccgtgg 3780

agcacctgca ccccatgggc gataacgtgc tggtgggcag cttcgcccgc accttcagcc 3840

tgcgcgacgg cggctactac agcttcgtgg tggacagcca catgcacttc aagagcgcca 3900

tccaccccag catcctccag aacgggggcc ccatgttcgc cttccgccgc gtggaggagc 3960

tgcacagcaa caccgagctg ggcatcgtgg agtaccagca cgccttcaag acccccatcg 4020

ccttcgccag atcccgcgct cagtcgtcca attctgccgt ggacggcacc gccggacccg 4080

gctccaccgg atctcgcgag ggcagaggaa gcctgctaac atgcggtgac gtggaggaga 4140

atcccggccc tatgaccgag tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc 4200

ccagggccgt acgcaccctc gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg 4260

tcgatccgga ccgccacatc gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg 4320

tcgggctcga catcggcaag gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga 4380

ccacgccgga gagcgtcgaa gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg 4440

agttgagcgg ttcccggctg gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc 4500

ggcccaagga gcccgcgtgg ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca 4560

agggtctggg cagcgccgtc gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc 4620

ccgccttcct ggagacctcc gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca 4680

ccgtcaccgc cgacgtcgag gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc 4740

ccggtgcctg aaatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta 4800

actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta 4860

ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 4920

atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg 4980

caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt 5040

tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 5100

gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc 5160

cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc 5220

cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc 5280

ttccgcgtct ccgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc 5340

ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca ctttttaaaa 5400

gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gataagatct gctttttgct 5460

tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg 5520

aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt 5580

ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc 5640

tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc aaagaaatga 5700

atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 5760

agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 5820

aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta actccgccca 5880

tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt 5940

ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag 6000

gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag accaaattcg taatcatgtc atagctgttt 6060

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 6120

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 6180

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 6240

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 6300

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 6360

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 6420

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 6480

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 6540

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 6600

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 6660

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 6720

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 6780

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 6840

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 6900

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 6960

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 7020

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 7080

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 7140

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 7200

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 7260

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 7320

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 7380

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 7440

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 7500

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 7560

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 7620

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 7680

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 7740

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 7800

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 7860

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 7920

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 7980

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 8040

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 8100

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 8160

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 8220

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc 8280

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 8340

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 8400

cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 8460

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc 8520

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 8580

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 8640

cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg 8673

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agacgtcagt atacacgcgt cagagtacag acggggtttc accatgttgg ccaggctgga 60

cttttttttt ttatacttca g 81

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaagaagca aggagtccag cctggccaac atggtgaaac cttgtctgta ctctgacgcg 60

tgtatactga cgtct 75

<210> 4

<211> 172

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agacgtcagt atacacgcgt cagagtacag acggggtttc accatgttgg ccaggctgga 60

cttttttttt ttatacttca ggatccgcta gactgcagta agaagcaagg agtccagcct 120

ggccaacatg gtgaaacctt gtctgtactc tgacgcgtgt atactgacgt ct 172

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caagctggaa ttcagacgtc ag 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatgtgcgct ctgcccact 19

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttttttttta tacttcaggc gtattctgca ctctaaaggc ga 42

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggactccttg cttcttacct ttagacaatg cagtgtatca tttttgg 47

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttttttttta tacttcagca taaaggtgag cacagaccct 40

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggactccttg cttcttaccg gcctcctctc cactatcgg 39

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aacaaaactg tccgctttat tgg 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cttctggtgt gggtttgtcc t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctgcggcca gaaataaaca c 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgtgattca gcagtcatca tt 22

<210> 16

<211> 919

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcgtattctg cactctaaag gcgagctaag tgaggacagg cacaagcaat atgaggagtt 60

tgcaatgtct taccagaagc tgctggcgaa ctctcagtcc ttagcggacc ttttggatga 120

aaatatgccc gatcttcctc aggacaaacc cacaccagaa gagcatgggc ccggaatcga 180

catatttaca cccggcaaac ctggagagta tgacttagaa ggtggcattt gggaagatga 240

agacgctcgg aatttttatg aaaacctcat cgatttgaaa gcatttgttc cagccatctt 300

gttcaaagac aatgaaaaaa gtcagaacaa agattctaac aaagatgatt ccaaagaggc 360

aaaagaacca aaggataata aggaggcatc aagtcctgat gatttggaac ttgagttgga 420

gaatttagaa attaatgatg atacattgga gttagaaggt gcagatgaag ctgaagatct 480

tacaaagaaa cttcttgatg aacaagaaca agaagatgaa gaagccagca ctggatctca 540

tctcaaactc atagtagatg ctttcctcca gcagctgccc aactgtgtca accgagacct 600

aatcgacaag gcagccatgg atttttgcat gaacatgaac acaaaggcaa acaggaagaa 660

gttggtgcgg gcactcttca tagttcctag gcagaggttg gatttgctac cattttatgc 720

aagattggtt gctaccttgc acccctgcat gtctgatgta gcagaggatc tttgttccat 780

gctgaggggg gatttcagat ttcatgttcg aaaaaaggac cagatcaaca ttgaaacaaa 840

gaacaaaact gtccgcttta ttggagagct aaccaagttt aagatgttca ccaaaaatga 900

tacactgcat tgtctaaag 919

<210> 16

<211> 434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cataaaggtg agcacagacc ctgtttggat caagtcagtt cctggagcct gaatgatgac 60

tgctgaatca cgggaagcca cgggtctgtc cccacaggct gcacaggaga aggatggtat 120

cgtaatagtg aaggtggaag aggaagatga ggaagaccac atgtgggggc aggattccac 180

cctacaggac acgcctcctc cagacccaga gatattccgc caacgcttca ggcgcttctg 240

ttaccagaac acttttgggc cccgagaggc tctcagtcgg ctgaaggaac tttgtcatca 300

gtggctgcgg ccagaaataa acaccaagga acagatcctg gagcttctgg tgctagagca 360

gtttctttcc atcctgccca aggagctcca ggtctggctg caggaatacc gccccgatag 420

tggagaggag gccg 434

Claims

1.一种表达环状RNA的载体，其特征在于，所述的表达环状RNA的载体的脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述表达环状RNA的载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(S1)设计出适用于环状RNA表达的上、下游成环序列，所述上游成环序列如SEQ ID NO:2所示，所述下游成环序列如SEQ ID NO:3所示，然后在上、下游成环序列之间添加两个克隆位点BamHⅠ和PstⅠ，并且在序列两端增加克隆位点，为EcoRⅠ的识别序列和NotⅠ的识别序列；人工合成此用于表达环状RNA的序列；

(S2)双酶切(S1)合成的用于表达环状RNA的序列和过量表达载体，所述过量表达载体为pCDH-CMV-MCS-EF1-puro或pLVO6；

(S3)回收(S2)的酶切产物；

(S4)将(S3)回收的DNA片段连接；

(S5)将(S4)的连接产物转化感受态细胞；

3.利用权利要求1所述表达环状RNA的载体，或者权利要求2所述方法构建的环状RNA表达载体构建环状RNA过量表达稳定细胞株的方法，其特征在于，所述构建环状RNA过量表达稳定细胞株的方法包括以下步骤：

(1)通过PCR扩增目标环状RNA的编码序列，采用的是5′端具有5′-TTTTTTTTTATACTTCAG-3′序列的上游引物和5′端具有5′-GGACTCCTTGCTTCTTAC-3′序列的下游引物；或者合成目标环状RNA的编码序列，该编码序列为5′端增加5′-TTTTTTTTTATACTTCAG-3′序列和3′端增加5′-GTAAGAAGCAAGGAGTCC-3′序列的目标环状RNA的编码序列；

(2)双酶切权利要求1所述表达环状RNA的载体，或者权利要求2所述方法构建的环状RNA表达载体；

(3)回收酶切产物中的线型环状RNA表达载体；

(4)将步骤(1)的目标环状RNA的编码序列连接到步骤(3)的线型环状RNA表达载体中；

(5)将步骤(4)的连接产物转化感受态细胞；

(7)用步骤(6)的环状RNA表达质粒与包装质粒共转染293T细胞；

(8)收集步骤(7)的病毒液；

(9)用步骤(8)的病毒液感染目的细胞；

(10)用嘌呤霉素筛选步骤(9)的细胞，获得环状RNA过量表达稳定细胞株。