CN111440772A - 抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用 - Google Patents

抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用。所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞(细胞模型Ⅰ)、包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞(细胞模型Ⅱ)。细胞模型的构建方法包括HPV环状DNA的制备、质控检测、游离HPV扩增检测和拷贝数的绝对定量检测。所述应用为通过检测药物施用后对模型细胞的直接抗增殖作用以及对HPV基因组DNA复制的抑制作用，筛选具有抗1型和11型人乳头瘤病毒活性的药物。该细胞模型所组成的体系可用于筛选人乳头瘤病毒(HPV)皮肤低危型(1型)及粘膜低危型(11型)的治疗药物，应用前景广阔。

Description

抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞生物学和抗病毒领域，具体地说，涉及一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用。
背景技术
低危型HPV感染在临床上可分为典型病损、无明显皮损的亚临床感染(SPI，Subclinical HPV infection)和潜伏感染(LPI，Latent HPV infection)，其中SPI是HPV感染的主要临床表现形式。SPI是指肉眼观察无异常，醋酸白试验阳性，组织病理有鳞状上皮非典型性增生，见挖空细胞或可疑挖空细胞，同时HPV DNA检测呈阳性(病毒DNA以低拷贝状态存在于基底细胞层中)的一种临床HPV感染阶段，可持续存在或进一步发展为典型疣，也是增殖疣治疗后复发的主要原因之一，消除SPI能有效降低复发率。临床常见的增殖性疣包括寻常疣、趾疣、扁平疣和尖锐湿疣，其中Ⅰ型HPV病毒(HPV1)按照感染部位及危害程度分类属于皮肤低危型，是引起寻常疣、趾疣、扁平疣的主要亚型之一，而11型HPV病毒(HPV11)感染部位为粘膜细胞，属于粘膜低危型，是引起生殖器疣的主要亚型之一。以寻常疣为代表的增殖性皮肤疣和以尖锐湿疣为代表的粘膜生殖器疣是临床皮肤性病科非常常见的疾病类型，由于目前尚无专门针对HPV病毒的抗病毒药物，消除SPI不仅能够预防SPI向典型疣的转归，也是降低治疗后复发的重要措施。
临床SPI阶段HPV只是在基底层细胞以低拷贝(102-104个/万细胞)的形式进行基因组复制，在发展为典型疣的过程中，会随着细胞的逐级分化而进入营养性增殖期和后续病毒包装释放的阶段。由于HPV的种属特异性及高度依赖分化过程的病毒复制周期，目前尚无便捷有效的体内模型用于筛选抗HPV药物。
早期研究做过很多关于HPV1和HPV11感染的体外模型构建方面的尝试，包括①临床取材获取含有皮肤HPV1和生殖器HPV11的病毒体感染角质形成细胞；②构建携带HPV1或HPV11基因组DNA的质粒转染上皮细胞；③构建HPV11基因组DNA，环化后转染上皮角质形成细胞。上述模型及其建立过程存在的问题和不足：①临床取材并分离病毒颗粒操作比较繁琐，临床取材多伴有多种亚型复合感染的情况，HPV基因组背景不明确，影响因素复杂，并不适用于R&D阶段抗病毒药物的大规模筛选。②构建含有基因组DNA的质粒将会引入外源基因片段，并不能真正模拟天然病毒DNA在细胞内的复制。③皮肤低危型HPV1，可引起以寻常疣为代表的皮肤增殖疣，该病是目前临床治疗非常棘手的一类由低危型HPV引起的病毒性皮肤病，长期以来缺乏有效的模型用于筛选抗皮肤低危型HPV感染的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV1模型细胞(细胞模型Ⅰ-HaCaT[HPV1])；或者所述药物筛选模型为包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV11模型细胞(细胞模型Ⅱ-HaCaT[HPV11])。该细胞模型所组成的体系可用于筛选人乳头瘤病毒(HPV)皮肤低危型(1型)及粘膜低危型(11型)的治疗药物。
其中，所述报告基因可以是抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(Neo)。
携带报告基因的质粒可以是pRP-Neo。其中，质粒pRP-Neo是以pRP为出发载体，通过Gateway技术用新霉素抗性基因替换出发载体上的ccdB-cmR序列得到的。具体地，插入片段位置为804bp-1598bp。pRP-Neo序列如SEQ ID NO:31所示。
优选地，HPV1环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1；HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。
第二方面，本发明提供抗人乳头瘤病毒药物筛选模型的构建方法，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞(优选脂质体转染法)，经G418筛选得到存活的阳性细胞克隆，传代后作为抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，分别命名为HPV1模型细胞、HPV11模型细胞。
前述方法包括以下步骤：
(1)在六孔板中培养HaCaT细胞，待细胞密度达8×105-10×105个/孔，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞；
(2)转染24h后，更换新鲜完全培养基继续培养24h，转染细胞经消化按1：10稀释后采用终浓度为450-550μg/mL(优选500μg/mL)的G418进行筛选，10-16天(优选14天)后，更换为不含G418的完全培养基进行细胞培养，存活的阳性细胞克隆进行传代培养；
其中，所述完全培养基为90％DMEM高糖培养基+10％FBS。其中，％表示体积百分数。
优选地，步骤(1)中HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。
HPV1环状DNA、HPV11环状DNA的构建方法如下：
1)人工合成HPV1全基因组DNA，通过BamHⅠ位点克隆入pGS1载体，得到质粒pGS1-HPV1，将质粒pGS1-HPV1、pBR322-HPV11(pBR322-HPV11质粒购自ATCC)分别用BamHⅠ酶切，胶回收7.82Kb或7.93Kb处条带；将胶回收线性化HPV1或HPV11采用T4连接酶进行片段自连，分别得到连接产物HPV1环状DNA、HPV11环状DNA；
2)将步骤1)所得连接产物浓缩纯化后进行酶切鉴定(质控)；
前述方法步骤1)中，酶切体系为：pGS1-HPV1、pBR322-HPV11质粒DNA 2-5μg，BamHⅠ1μL，10×Cutsmart buffer 5μL，ddH2O补齐至50μL；酶切条件：37℃水浴酶切1h。
前述方法步骤1)中，连接体系为：线性化HPV1或HPV11终浓度5-10ng/μL，10×连接酶缓冲液30μL，T4连接酶终浓度0.02-0.1Weiss Unit/μL，ddH2O补齐至300μL；连接条件为：15-18℃水浴连接15-20h。
前述方法步骤2)中，HPV1环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV1环状DNA30-100ng，KpnⅠ1μL，10×M buffer 2μL，ddH2O补齐至20μL。
HPV11环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV11环状DNA 30-100ng，HindⅢ1μL，10×Mbuffer 2μL，ddH2O补齐至20μL。
其中，Cutsmart buffer、M buffer分别来自NEB公司的BamHⅠ限制性内切酶试剂盒和TaKaRa公司的HindⅢ限制性内切酶试剂盒。
第三方面，本发明提供用于检测所述药物筛选模型或按照上述方法构建得到的药物筛选模型中游离病毒DNA扩增的方法，所述方法包括：
A、分别提取HPV1、HPV11模型细胞中的基因组DNA，进行DpnⅠ或MboⅠ酶切；
B、根据HPV1、HPV11全基因组DNA序列分别设计引物，对上述酶切产物进行分段PCR扩增；
用于扩增HPV1的引物包括：SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4，SEQ ID NO:5-6，SEQID NO:7-8，SEQ ID NO:9-10，SEQ ID NO:11-12；
用于扩增HPV11的引物包括：SEQ ID NO:13-14，SEQ ID NO:15-16，SEQ ID NO:17-18，SEQ ID NO:19-20，SEQ ID NO:21-22，SEQ ID NO:23-24；
C、扩增产物进行电泳检测，结果满足以下条件时，则判定模型细胞发生了游离病毒DNA的扩增：
HPV1模型细胞：引物SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4，SEQ ID NO:5-6，SEQ ID NO:7-8，SEQ ID NO:9-10和SEQ ID NO:11-12对应的DpnⅠ酶切产物均有目的条带扩增，且MboⅠ酶切产物无目的条带扩增；
HPV11模型细胞：引物SEQ ID NO:13-14，SEQ ID NO:15-16，SEQ ID NO:17-18，SEQID NO:19-20，SEQ ID NO:21-22和SEQ ID NO:23-24对应的DpnⅠ酶切产物均有目的条带扩增，引物SEQ ID NO:15-16、SEQ ID NO:17-18和SEQ ID NO:21-22对应的MboⅠ酶切产物无条带扩增，SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:19-20和SEQ ID NO:23-24对应的MboⅠ酶切产物有条带扩增。
第四方面，本发明提供所述药物筛选模型或按照上述方法构建得到的药物筛选模型中HPV1或HPV11拷贝数的绝对定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
(a)携带HPV1或HPV11全基因组DNA的质粒标准品的制备；
(b)HaCaT细胞基因组DNA的提取；
(c)待测HPV1模型细胞或HPV11模型细胞基因组DNA的提取；
(d)定量PCR检测。
定量PCR检测使用的引物为(SEQ ID NO:25-30)：
HPV1上游引物序列为5′-gtaggcacaccaagtggctct-3′，下游引物序列为5′-actggtttctccagcaaatgcca-3′；
HPV11上游引物序列为5′-atgtgcctcctcccaaccct-3′，下游引物序列为5′-tggatgtcccacagcaaggagt-3′；
内参β-actin上游引物序列为5′-tcctgtggcatccacgaaac-3′，下游引物序列为5′-tctgcatcctgtcggcaatg-3′。
第五方面，本发明提供所述药物筛选模型或按照上述方法构建得到的药物筛选模型在筛选抗人乳头瘤病毒药物中的应用。将待检测药物施用于所述模型中，能够抑制模型细胞增殖和HPV复制的药物为具有抗人乳头瘤病毒作用的药物。
第六方面，本发明提供与所述药物筛选模型及其构建方法相配套的质控试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO:1-24所示的引物。
第七方面，本发明提供所述药物筛选模型或按照上述方法构建得到的药物筛选模型中HPV1或HPV11拷贝数的定量检测试剂盒，所述试剂盒包括如SEQ ID NO:25-30所示的引物，pGS1-HPV1质粒(HPV1的定量标准品)以及pBR322-HPV11质粒(HPV11的定量标准品)。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明首次将HPV1质粒进行人工合成，通过优化模型构建方法以及建立模型鉴定方法，得到了能以环状游离态扩增、基因背景纯净的HPV1感染的体外细胞模型HaCaT[HPV1]。该模型与本发明中构建的HPV11感染的HaCaT[HPV11]细胞模型组合应用，可用于大规模筛选抗皮肤及粘膜低危型HPV感染的药物。该模型具有以下特点：
(一)利用细胞模型Ⅰ-HaCaT[HPV1]和细胞模型Ⅱ-HaCaT[HPV11]，可以实现体外快速筛选抑制皮肤低危型(1型)及粘膜低危型(11型)HPV病毒感染的药物，将待检测药物施用于所述模型中，能够抑制模型细胞增殖和HPV复制的药物为具有抗人乳头瘤病毒作用的药物，从而解决初发亚临床感染向典型疣转归以及表面病灶清除后，亚临床感染持续存在诱导复发的临床问题。
(二)模型构建过程中使用的HPV1或HPV11基因组DNA序列明确，通过优化连接反应体系及纯化体系，引入鉴定流程，从而得到更加纯净的环状HPV单体。
(三)通过脂质体转染至人角质形成细胞中，背景纯净且转染效率较高，与特别构建的小分子量G418抗性表达质粒pRP-Neo按照优化比例共转后进行筛选，该制备方法大幅提高模型细胞群体的比重。该两种模型可分别实现持续性地HPV1和HPV11的游离态低拷贝复制(约7×103-10×103个/万细胞)。
(四)通过引入模型细胞中游离环状HPV扩增的检测流程，确保所构建得到的模型能够真实模拟临床低危型HPV感染特性。
(五)本发明该模型细胞增殖加快，可模拟临床HPV感染的SPI特征，并且可以进行传代冻融，所建立的一套与模型应用相关的HPV基因组DNA拷贝数定量检测方法，形成一种便捷的1型或11型HPV感染皮肤病治疗药物的体外筛选系统。
附图说明
图1为本发明实施例1中环状HPV1、环状HPV11及pRP-Neo质粒图谱。A：环状HPV1基因组DNA图谱；B：环状HPV11基因组DNA图谱；C：pRP-Neo质粒图谱。
图2为本发明实施例1中环状HPV的鉴定图谱。A：环状HPV1及HPV1经KpnⅠ酶切后的电泳检测图谱。B：环状HPV11及HPV11经KpnⅠ酶切后的电泳检测图谱。其中实心箭头所示为环状HPV，空心箭头所示为环状HPV酶切后产生的线性HPV。
图3为本发明实施例1中游离HPV病毒DNA扩增的检测。A：HaCaT[HPV1]中游离HPV1分段PCR产物电泳图谱；B：HaCaT[HPV11]中游离HPV11分段PCR产物电泳图谱。HPV1Δ1-Δ6(均包含GATC序列)DpnⅠ酶切组均有目的条带扩增(A中箭头所示)，且MboⅠ酶切组无目的条带扩增，HPV11Δ1-Δ6DpnⅠ酶切组均有目的条带扩增(B中箭头所示)，Δ2、Δ3、Δ5(均含GATC序列)MboⅠ酶切产物无条带扩增，Δ1、Δ4、Δ6(不含GATC序列)MboⅠ酶切产物有条带扩增。
图4为本发明实施例2中P4和P5代HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞中HPV基因组的拷贝数检测结果。A：HPV1拷贝数的log10对数-Ct值的标准曲线，B：HPV11拷贝数的log10对数-Ct值的标准曲线，C：DNA含量的log2对数-Ct值的标准曲线，D：根据标准曲线计算的HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞中HPV基因组的拷贝数结果。
图5为本发明实施例2中HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]的细胞增殖计数结果。A：HaCaT[HPV1]与HaCaT[Neo]的生长计数结果比较；B：HaCaT[HPV11]与HaCaT[Neo]的生长计数结果比较。
图6为本发明实施例3中HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞应用于检测rhIFN-α1b的抗增殖作用。A：不同活性单位的rhIFN-α1b对HaCaT[HPV1]模型细胞的直接抗增殖作用；B：不同活性单位的rhIFN-α1b对HaCaT[HPV11]模型细胞的直接抗增殖作用。
图7为本发明实施例2中HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞应用于检测rhIFN-α1b的抗HPV复制作用。A：不同活性单位的rhIFN-α1b对HPV1复制的抑制作用；B：不同活性单位的rhIFN-α1b对HPV11复制的抑制作用。
图8为本发明实施例4中环状HPV制备反应体系及反应条件参数优化实验结果；其中，实心箭头所示为环状HPV，空心箭头所示为二聚体。图中编号1-9对应参数见表5，编号10为浓缩纯化后产物。
具体实施方式
本发明针对目前缺乏简捷有效的治疗低危型HPV感染的药物体外筛选模型，提供一种可体外传代培养的细胞模型，以及其制备方法和应用。该模型由细胞模型Ⅰ-HaCaT[HPV1]、细胞模型Ⅱ-HaCaT[HPV11]组成。
本发明所采用的技术方案之一是：一种抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选组合模型，该模型由细胞模型Ⅰ、细胞模型Ⅱ组成。其中细胞模型Ⅰ为HPV1环状DNA与pRP-Neo质粒共转染经G418筛选所得的HaCaT[HPV1]细胞模型；细胞模型Ⅱ为HPV11环状DNA与pRP-Neo质粒共转染经G418筛选所得的HaCaT[HPV11]细胞模型。本发明提供了一种1型和11型HPV药物筛选模型的建立方法，所述的建立方法包括以下步骤：(1)将环状HPV与pRP-Neo质粒共转入HaCaT细胞；(2)转染24h后，更换新鲜完全培养基继续培养24h，将转染细胞重新消化按1：10消化铺板后采用终浓度为500μg/mL的G418进行筛选，14天后，更换为不含G418的完全培养基进行常规培养，存活阳性细胞克隆长满后进行传代培养。
其中步骤(1)所述转染方法为本领域常规地脂质体细胞转染方法，所述HaCaT细胞较佳的转染密度为8×105-10×105个/孔，所述共转染体系较佳地组合为环状HPV：pRP-Neo质粒2：1-4：1。步骤(2)所述传代培养方法为本领域常规的传代培养方法，完全培养基组分为90％DMEM高糖培养基+10％FBS。
本发明所采用的技术方案之二是：本发明中用于构建模型细胞时所采用的一种环状HPV制备和质控检测的方法，所述检测方法较佳地包括以下步骤：(1)通过BamHⅠ将HPV1或HPV11全基因组片段从克隆载体上切下来，胶回收试剂盒进行线性片段回收后，通过T4连接酶体系进行片段自连；(2)将步骤(1)所得连接产物纯化后进行酶切鉴定。所述模型细胞为本发明所述的一种抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选模型。
其中步骤(1)所述BamHⅠ较佳的酶切体系为载体DNA 2-5μg，BamHⅠ1μL，10×Cutsmart buffer 5μL，ddH2O补充至50μL，总反应体系个数较佳地选择15个，使得酶切总量为30-75μg，37℃水浴酶切1h。所述胶回收较佳地采用6％-8％低熔点琼脂糖凝胶进行片段回收。所述T4酶较佳地连接体系为线性HPV终浓度5-10ng/μL，10×ligase buffer 30μL，T4连接酶终浓度0.02-0.1Weiss Unit/μL，ddH2O补齐至300μL，总反映体系个数较佳地选择6个，使得总连接量为9-18μg。连接条件较佳地设置为水浴15-18℃，连接时间较佳地设置为15-20h。步骤(2)酶切鉴定较佳地采用KpnⅠ(HPV1)或HindⅢ(HPV11)限制性内切酶，其中环状HPV1酶切鉴定较佳地体系设置为纯化HPV130-100ng，KpnⅠ1μL，10×M buffer 2μL，ddH2O补齐至20μL。酶切后大小为7815bp的纯化产物为正确的环状HPV1，酶切后出现4619bp和3202bp两个片段的纯化产物为线性HPV1(图2，A)。环状HPV11酶切鉴定较佳地体系设置为纯化HPV11 30-100ng，HindⅢ1μL，10×M buffer 2μL，H2O补齐至20μL。酶切后大小为7931bp的纯化产物为正确的环状HPV11，酶切后出现2561bp和5415bp两个片段的纯化产物为线性HPV11(图2，B)。
本发明所采用的技术方案之三是：本发明中用于检测模型细胞中HPV1、HPV11游离病毒DNA扩增的方法，所述检测方法较佳地包括以下步骤：提取模型细胞中的基因组DNA，进行DpnⅠ或MboⅠ酶切，产物根据HPV1、HPV11全基因组DNA序列进行分段PCR扩增及电泳检测，结果满足：(1)HPV1Δ1-Δ6(均包含GATC序列)DpnⅠ酶切组均有目的条带扩增，且MboⅠ酶切组无目的条带扩增(图3，A)；(2)HPV11Δ1-Δ6DpnⅠ酶切组均有目的条带扩增，Δ2、Δ3、Δ5(均含GATC序列)MboⅠ酶切产物无条带扩增，Δ1、Δ4、Δ6(不含GATC序列)MboⅠ酶切产物有条带扩增(图3，B)，上述两个条件时，模型细胞被认为发生了游离病毒DNA的扩增。所述模型细胞为本发明所述的一种抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选模型。
本发明所采用的技术方案之四是：模型细胞中HPV1或HPV11拷贝数的绝对定量检测方法，所述检测方法包括以下步骤：(1)定量标准品的制备；(2)细胞内基因组DNA的提取；(3)待测样品的制备；(4)定量PCR检测。其中所述的细胞模型为本发明所述的一种抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选模型。
其中步骤(1)HPV1的定量标准品是pGS1-HPV1质粒，浓度为428ng/μL，按照公式1μL浓度为C(ng/μL)的质粒拷贝数＝(10-9)×C×NA/Mn，其中NA阿伏伽德罗常数，Mn是质粒的摩尔质量，1μL浓度为428ng/μL的pGS1-HPV1质粒的拷贝数为3.98×1010。HPV11的定量标准品是pBR322-HPV11质粒，按照上述公式计算1μL浓度为558ng/μL的pBR322-HPV11质粒拷贝数为4.48×1010。用于定量检测时，每孔较佳地将定量标准品质粒与20-50ng HaCaT基因组DNA进行混合。内参β-actin的定量标准品是HaCaT细胞基因组DNA，浓度为50ng/μL。步骤(2)基因组DNA提取采用市售基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP304-02)。步骤(3)待测样品较佳的上样量为20-50ng/孔。步骤(4)定量PCR检测引物较佳的选择靶向HPV1或HPV11L1的特异性引物序列，其中较佳的HPV1上游引物序列为gtaggcacaccaagtggctct，下游引物序列为actggtttctccagcaaatgcca，较佳的HPV11上游引物序列为atgtgcctcctcccaaccct，下游引物序列为tggatgtcccacagcaaggagt，较佳的β-actin上游引物序列为tcctgtggcatccacgaaac，下游引物序列为tctgcatcctgtcggcaatg。较佳地根据Ct值-拷贝数(log10)绘制HPV1或HPV11的标准曲线，根据Ct值-基因组DNA量(log2)绘制β-actin的标准曲线，计算每个反应孔中的细胞数(万个)＝待测基因组DNA量(ng)/66。
本发明所采用的技术方案之五是：本发明构建的模型细胞的应用，通过检测药物施用后对模型细胞的直接抗增殖作用以及对HPV基因组DNA复制的抑制作用，筛选具有抗1型和11型人乳头瘤病毒活性的药物。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 1型和11型HPV抑制剂筛选模型的建立
a.环状HPV构建
人工合成pGS1-HPV1质粒(HPV1全基因组DNA序列参照NC_001356，通过BamHⅠ位点克隆入pGS1载体)，pBR322-HPV11质粒(HPV11全基因组DNA序列参照M14119，通过BamHⅠ位点克隆入pBR322载体)购自ATCC，pRP-Neo质粒为合成所得(pRP-Neo是以pRP为出发载体，通过Gateway技术用新霉素抗性基因替换出发载体上的ccdB-cmR序列得到的，插入片段的具体位置为804bp-1598bp，pRP-Neo序列如SEQ ID NO:31所示)。质粒进行大量扩增抽提后，将pGS1-HPV1与pBR322-HPV11分别用BamHⅠ酶切，胶回收7.82Kb(HPV1)或7.93Kb(HPV11)处条带。将胶回收线性化HPV1或HPV11进行环化反应，反应体系见表1。
表1
线性HPV终浓度 1.5μg
10×连接缓冲液 30μL
T4连接酶终浓度 12Weiss Unit
ddH<sub>2</sub>O 补齐至300μL
反应条件：15-18℃，连接15-20h。
b.环状HPV纯化及鉴定
采用大量DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，货号DP205-02)，纯化后用水洗脱。对纯化产物分别进行KpnⅠ(环状HPV1纯化产物)或HindⅢ(环状HPV11纯化产物)酶切鉴定，其中环状HPV1酶切后正确条带为7815bp(图2，A中空心箭头所示)，环状HPV11酶切后正确条带7931bp(图2，B中空心箭头所示)。
c.细胞转染及G418筛选
人永生化表皮细胞HaCaT购自中国典型培养物保藏中心细胞库，HaCaT细胞进行常规培养(完全培养基成分：90％DMEM高糖培养基+10％FBS)，铺六孔板，铺板密度为5×105个/孔，培养过夜。更换新鲜完全培养基待细胞密度为8×105个/孔进行细胞转染，环状HPV1、环状HPV11及pRP-Neo质粒图谱见图1，转染体系见表2。
表2
Figure BDA0002427056370000091
37℃，5％二氧化碳条件培养24h后，更换为新鲜完全培养基，继续培养24h。取出培养六孔板，将对应转染孔消化后各自转入T75培养瓶进行过夜培养。后更换为含500μg/mLG418的完全培养基筛选14天，直至空白对照组细胞完全死亡。更换为不含G418的完全培养基进行培养，直至长满，作为P0代，所得筛选细胞分别记为HaCaT[Neo]、HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]。
实施例2 1型和11型HPV抑制剂筛选模型的可靠性验证
a.HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞中游离HPV扩增的检测
分别收集1×10^6个HaCaT[HPV1]与HaCaT[HPV11]细胞，提取细胞内的基因组DNA，分别进行DpnⅠ或MboⅠ酶切，酶切产物进行分段PCR扩增，目的片段位置及引物序列见表3。
表3
Figure BDA0002427056370000092
Figure BDA0002427056370000101
扩增产物于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，电泳图谱见图3(A和B)。在上述扩增产物中，Δ1-Δ6分别覆盖了HPV1和HPV11的全部基因组序列，其中包含整合到细胞基因组中容易发生丢失的E1、E2区域，从图中可见，所有片段均能被扩增出来，表明HPV基因组并没有发生整合，而是以游离态形式存在于细胞核中。DpnⅠ特异性切除大肠杆菌中发生甲基化的HPV DNA链，而真核细胞中扩增的HPV DNA不会发生甲基化，因此不能被DpnⅠ识别，但能够被MboⅠ识别并切割。若HPV基因组DNA不能被DpnⅠ切割，但能被MboⅠ切割，则说明HPV在HaCaT细胞中发生了扩增。综上，图3表明HPV1和HPV11在HaCaT细胞中发生了游离态的扩增，符合临床HPV1及HPV11的感染特性。
b.HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞中HPV的拷贝数检测
取P4和P5代HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞各106个提取基因组DNA，qPCR检测HPV的拷贝数变化，引物序列及反应体系、反应程序见表4。
表4
Figure BDA0002427056370000102
Figure BDA0002427056370000111
图4(A和B)显示在设定拷贝数范围内，HPV1与HPV11拷贝数的log10对数与Ct值之间线性良好，R2分别为0.9927和0.9916。图4中C显示在设定浓度范围内，HaCaT细胞DNA量的log2对数与Ct值间呈良好线性关系，R2为0.9967，待测样品上样量较佳地控制在20-50ng时，Ct值可落在上述标准曲线的线性范围内。图4中D结果显示，P4和P5代HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞中HPV的拷贝数约为7×103-10×103个/万细胞，HPV的复制较为稳定，监测P1-P7代内HPV拷贝数的变化显示，随着传代增加，细胞内HPV的拷贝稳定中略有增加，说明模型细胞中HPV基因组可在其中维持较为稳定的低拷贝状态，类似临床HPV1和HPV11在SPI阶段皮肤基底层的复制状态。
c.HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞的增殖特性
取HaCaT[Neo](对照)、HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞，按照10^4个/孔的密度进行12孔板铺板(复孔数为3)，隔天开始每天收集对应孔细胞，使用流式细胞仪进行绝对计数，连续记录5-7天。由图5(A和B)可知，HPV1及HPV11转染细胞均表现出一定的增殖优势，类似临床SPI阶段HPV1和HPV11感染引起的鳞状细胞非典型增生。
实施例3 1型和11型HPV抑制剂筛选模型的应用
a.HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞应用于检测rhIFN-α1b(重组人α1b型干扰素)的抗增殖作用
取HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞铺96孔板，每孔细胞数为5000个/100μL，设置空白组、对照组、101、102、103、104、105、106IU/mL浓度梯度组，24h、48h和72h三个检测时间点，铺板2h待细胞贴壁后进行对应浓度的rhIFN-α1b干预，按照预定检测时间进行MTT检测。图6(A和B)结果显示，rhIFN-α1b对HaCaT[HPV1]的直接抗增殖作用强于HaCaT[HPV11]，且呈浓度依赖性，但并未显示时间依赖性。
b.HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞应用于检测rhIFN-α1b的抗HPV复制作用
取HaCaT[HPV1]和HaCaT[HPV11]细胞铺六孔板，每孔细胞数为5×105个/2mL，设置空白组、101、102、103、104、105IU/mL浓度梯度组，铺板2h待细胞贴壁后进行对应浓度的rhIFN-α1b干预，作用24h后，收集细胞提取基因组DNA，qPCR检测不同处理组中HPV的相对丰度。由图7(A和B)可知，rhIFN-α1b可有效抑制HPV1和HPV11的复制，且抑制作用呈浓度依赖性。
本发明提供的抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选组合模型，HPV1和HPV11基因组DNA序列明确，细胞背景纯净，可进行冻存和复苏，并且可以在体外进行一定次数的传代培养，而不依赖临床样本的获得，为及时开展抗病毒药物的筛选提供便利。其中所述的HPV1为皮肤低危型HPV的代表，所述HPV11为粘膜低危型HPV的代表，该细胞模型可发生HPV病毒DNA的游离态低拷贝复制，表现出一定的细胞增生，模拟临床低危型HPV的SPI状态，是一种快速筛选皮肤HPV1和粘膜HPV11感染治疗药物的良好模型。
本发明提供的抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选组合模型的制备方法，包括HPV环状DNA的制备、质控检测、游离HPV扩增检测和拷贝数的绝对定量检测，通过优化连接反应体系及纯化体系，引入鉴定流程，从而得到纯度更高的环状HPV单体，通过模型细胞中游离HPV的扩增检测及拷贝数的绝对定量方法体系的建立，提高了模型的可靠性以及实际应用的可行性。
本发明提供上述抗人乳头瘤病毒1型和11型的药物体外筛选组合模型的应用，所述应用为通过检测药物施用后对模型细胞的直接抗增殖作用以及对HPV基因组DNA复制的抑制作用，筛选具有抗1型和11型人乳头瘤病毒活性的药物。
实施例4环状HPV制备反应体系及反应条件参数优化实验
本发明用于转染所需的环状HPV需满足以下两个条件：①环状HPV单体占主导，②浓度尽可能高。根据DNA重组特性，即如果反应中DNA浓度低，则配对的两个末端同一DNA分子的机会较大，质粒DNA重新环化将卓有成效。DNA浓度高时，连接反应的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体，本发明进行了如下反应体系及反应条件摸索，包括温度、时间、模板终浓度、酶终浓度，反应总体积。通过反应条件①和②比对，确定20μL相比10μL反应体系更有利于环状HPV生成；通过反应条件③④与①②对比，显示16℃、15-18h相比25℃、1h连接条件大幅减少二聚体的生成，酶终浓度0.02Weiss Unit/μL相比0.005Weiss Unit/μL更有利于线性HPV向环状转化；通过反应条件⑤⑥⑦比较，显示模板终浓度增加到10ng/μL，或酶终浓度提高到0.05Weiss Unit/μL对最终产物中环状HPV占比影响差异不大，此情况下为节约连接酶用量，建议0.02Weiss Unit/μL；通过反应条件⑧和⑦结果对比，增加反应体积更有利于提高环状HPV占比；通过条件⑧⑨对比，反应体积300μL与200μL均对连接结果影响不大，考虑到最终环状HPV产量，建议选择300μL反应体积。通过上述条件摸索确定了最佳连接反应体系和条件：即线性化HPV1或HPV11终浓度5-10ng/μL、T4连接酶终浓度0.02-0.1Weiss Unit/μL、反应体积300μL为最佳反应体系，15-18℃水浴连接16h为最佳反应条件(表5)。
表5
参数 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨
线性HPV终浓度(ng/μL) 5 5 5 5 5 10 5 5 5
T4DNA Ligase终浓度(Weiss U/μL) 0.3 0.3 0.005 0.02 0.05 0.05 0.02 0.02 0.04
总体积(μL) 10 20 50 50 50 50 50 200 300
连接温度(℃) 25 25 15-18 15-18 15-18 15-18 15-18 15-18 15-18
连接时间 60min 60min 16h 16h 16h 16h 16h 16h 16h
环状HPV制备反应体系及反应条件参数优化实验结果见图8。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京三元基因药业股份有限公司
<120> 抗人乳头瘤病毒药物筛选模型及其构建方法及应用
<130> KHP191117080.8
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtctggaga gacaatttgg tgtttgg 27
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcttctcgc ctgaggactg 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccctggaat tgttccacaa gca 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaccacggg tggatcccaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
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<400> 5
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<210> 6
<211> 20
<212> DNA
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<400> 6
caggcactgg tgtctgagca 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
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<400> 7
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<210> 8
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<212> DNA
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<210> 9
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gtaggcacac caagtggctc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgccaaactt atctggtcgt gct 23
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tttccggtac ctcataagac tcctgat 27
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atgcctccac gtctgcaaca 20
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ccgtccacta acaacaccct gt 22
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agccactaga gggtgcagtt ct 22
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
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tgaaccgttt tcggtccctc 20
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<400> 23
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<210> 29
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<212> DNA
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<400> 29
tcctgtggca tccacgaaac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tctgcatcct gtcggcaatg 20
<210> 31
<211> 3895
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caactttgta tagaaaagtt gaatgagtct tcggacctcg cgggggccgc ttaagcggtg 60
gttagggttt gtctgacgcg gggggagggg gaaggaacga aacactctca ttcggaggcg 120
gctcggggtt tggtcttggt ggccacgggc acgcagaaga gcgccgcgat cctcttaagc 180
acccccccgc cctccgtgga ggcgggggtt tggtcggcgg gtggtaactg gcgggccgct 240
gactcgggcg ggtcgcgcgc cccagagtgt gaccttttcg gtctgctcgc agacccccgg 300
gcggcgccgc cgcggcggcg acgggctcgc tgggtcctag gctccacggg gaccgtatac 360
gtggacaggc tctggagcat ccgcacgact gcggtgatat taccggagac cttctgcggg 420
acgagccggg tcacgcggct gacgcggagc gtccgttggg cgacaaacac caggacgggg 480
cacaggtaca ctatcttgtc acccggaggc gcgagggact gcaggagctt cagggagtgg 540
cgcagctgct tcatccccgt ggcccgttgc tcgcgtttgc tggcggtgtc cccggaagaa 600
atatatttgc atgtctttag ttctatgatg acacaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg 660
gcgaattcga acacgcagat gcagtcgggg cggcgcggtc ccaggtccac ttcgcatatt 720
aaggtgacgc gtgtggcctc gaacaccgag cgaccctgca gcgacccgct taacaagttt 780
gtacaaaaaa gcaggctgcc accatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 840
ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 900
atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 960
tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 1020
cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 1080
tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 1140
tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 1200
tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 1260
tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 1320
ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 1380
tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 1440
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gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaac ccagctttct tgtacaaagt 1620
ggtgatggcc ggccgcttcg agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc 1680
acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta 1740
tttgtaacca ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg 1800
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ggtagcggcc gcggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 1920
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1980
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2040
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2100
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 2160
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 2220
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gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2700
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 2760
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 2820
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 2880
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 2940
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 3000
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 3060
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 3120
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 3180
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 3240
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 3300
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 3360
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 3420
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 3480
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 3540
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 3600
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 3660
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 3720
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 3780
cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 3840
taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtcg gcgcgccgcg gccgc 3895

Claims (10)

1.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，其特征在于，所述药物筛选模型为包含HPV1环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV1模型细胞；或者所述药物筛选模型为包含HPV11环状DNA与携带报告基因质粒的HaCaT细胞，命名为HPV11模型细胞。
2.根据权利要求1所述的药物筛选模型，其特征在于，所述报告基因为抗生素抗性基因，优选新霉素抗性基因。
3.根据权利要求2所述的药物筛选模型，其特征在于，携带报告基因的质粒为pRP-Neo；其中，质粒pRP-Neo是以pRP为出发载体，通过Gateway技术用新霉素抗性基因替换出发载体上的ccdB-cmR序列得到的；
优选地，HPV1环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1；HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。
4.抗人乳头瘤病毒药物筛选模型的构建方法，其特征在于，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞，经G418筛选得到存活的阳性细胞克隆，传代后作为抗人乳头瘤病毒药物筛选模型，分别命名为HPV1模型细胞、HPV11模型细胞；
其中，质粒pRP-Neo的定义同权利要求3中所述。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在六孔板中培养HaCaT细胞，待细胞密度达8×105-10×105个/孔，用HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo共转染HaCaT细胞；
(2)转染24h后，更换新鲜完全培养基继续培养24h，转染细胞经消化按1：10稀释后采用终浓度为450-550μg/mL的G418进行筛选，10-16天后，更换为不含G418的完全培养基进行细胞培养，存活的阳性细胞克隆进行传代培养；
其中，所述完全培养基为90％DMEM高糖培养基+10％FBS；
优选地，步骤(1)中HPV1环状DNA或HPV11环状DNA与质粒pRP-Neo的摩尔比为2：1-4：1。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，HPV1环状DNA、HPV11环状DNA的构建方法如下：
1)人工合成HPV1全基因组DNA，通过BamH Ⅰ位点克隆入pGS1载体，得到质粒pGS1-HPV1，将质粒pGS1-HPV1、pBR322-HPV11分别用BamH Ⅰ酶切，胶回收7.82Kb或7.93Kb条带；将胶回收线性化HPV1或HPV11采用T4连接酶进行片段自连，分别得到连接产物HPV1环状DNA、HPV11环状DNA；
2)将步骤1)所得连接产物浓缩纯化后进行酶切鉴定；
步骤1)中，酶切体系为：pGS1-HPV1、pBR322-HPV11质粒DNA 2-5μg，BamH Ⅰ1μL，10×Cutsmart buffer 5μL，ddH2O补齐至50μL；酶切条件：37℃水浴酶切1h；
步骤1)中，连接体系为：线性化HPV1或HPV11终浓度5-10ng/μL，10×连接酶缓冲液30μL，T4连接酶终浓度0.02-0.1 Weiss Unit/μL，ddH2O补齐至300μL；连接条件为：15-18℃水浴连接15-20h；
步骤2)中，HPV1环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV1环状DNA 30-100ng，Kpn Ⅰ1μL，10×Mbuffer 2μL，ddH2O补齐至20μL；
HPV11环状DNA的酶切鉴定体系为：HPV11环状DNA 30-100ng，HindⅢ 1μL，10×Mbuffer 2μL，ddH2O补齐至20μL。
7.用于检测权利要求1-3任一项所述药物筛选模型或按照权利要求4-6任一项所述方法构建得到的药物筛选模型中游离病毒DNA扩增的方法，其特征在于，所述方法包括：
A、分别提取HPV1、HPV11模型细胞中的基因组DNA，进行Dpn Ⅰ或Mbo Ⅰ酶切；
B、根据HPV1、HPV11全基因组DNA序列分别设计引物，对上述酶切产物进行分段PCR扩增；
用于扩增HPV1的引物包括：SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4，SEQ ID NO:5-6，SEQ IDNO:7-8，SEQ ID NO:9-10，SEQ ID NO:11-12；
用于扩增HPV11的引物包括：SEQ ID NO:13-14，SEQ ID NO:15-16，SEQ ID NO:17-18，SEQ ID NO:19-20，SEQ ID NO:21-22，SEQ ID NO:23-24；
C、扩增产物进行电泳检测，结果满足以下条件时，则判定模型细胞发生了游离病毒DNA的扩增：
HPV1模型细胞：引物SEQ ID NO:1-2，SEQ ID NO:3-4，SEQ ID NO:5-6，SEQ ID NO:7-8，SEQ ID NO:9-10和SEQ ID NO:11-12对应的Dpn Ⅰ酶切产物均有目的条带扩增，且Mbo Ⅰ酶切产物无目的条带扩增；
HPV11模型细胞：引物SEQ ID NO:13-14，SEQ ID NO:15-16，SEQ ID NO:17-18，SEQ IDNO:19-20，SEQ ID NO:21-22和SEQ ID NO:23-24对应的Dpn Ⅰ酶切产物均有目的条带扩增，引物SEQ ID NO:15-16、SEQ ID NO:17-18和SEQ ID NO:21-22对应的Mbo Ⅰ酶切产物无条带扩增，SEQ ID NO:13-14、SEQ ID NO:19-20和SEQ ID NO:23-24对应的Mbo Ⅰ酶切产物有条带扩增。
8.权利要求1-3任一项所述药物筛选模型或按照权利要求4-6任一项所述方法构建得到的药物筛选模型中HPV1或HPV11拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)携带HPV1或HPV11全基因组DNA的质粒标准品的制备；
(b)HaCaT细胞基因组DNA的提取；
(c)待测HPV1模型细胞或HPV11模型细胞基因组DNA的提取；
(d)定量PCR检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，定量PCR检测使用的引物为：
HPV1上游引物序列为5′-gtaggcacaccaagtggctct-3′，下游引物序列为5′-actggtttctccagcaaatgcca-3′；
HPV11上游引物序列为5′-atgtgcctcctcccaaccct-3′，下游引物序列为5′-tggatgtcccacagcaaggagt-3′；
内参β-actin上游引物序列为5′-tcctgtggcatccacgaaac-3′，下游引物序列为5′-tctgcatcctgtcggcaatg-3′。
10.权利要求1-3任一项所述药物筛选模型或按照权利要求4-6任一项所述方法构建得到的药物筛选模型在筛选抗人乳头瘤病毒药物中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116286982A (zh) * 2022-09-09 2023-06-23 广州凯普医药科技有限公司 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109266617A (zh) * 2018-10-09 2019-01-25 中国医科大学附属盛京医院 一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109266617A (zh) * 2018-10-09 2019-01-25 中国医科大学附属盛京医院 一种人乳头瘤病毒16型全基因组感染性细胞模型

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOYA ZHANG ET AL.: "Human gene expression microarray analysis of the HPV 6bE7-HaCaT stable cell line", 《GENE》 *
GANGADHARA SAILAJA ET AL.: "Many different papillomaviruses have low transcriptional activity in spite of strong epithelial specific enhancers", 《JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY》 *
孙洋: "HPV11.HaCaT重组细胞作为体外药效学模型的完整性和应用性研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士）医药卫生科技辑》 *
查锦芬等: "人乳头瘤病毒16型体外感染HaCaT细胞的研究", 《广东医学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116286982A (zh) * 2022-09-09 2023-06-23 广州凯普医药科技有限公司 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用
CN116286982B (zh) * 2022-09-09 2024-01-30 广州凯普医药科技有限公司 一种hpv基因分型检测阳性参考品及其制备方法和应用

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