CN107058359B - 一种抗呼吸道合胞病毒药物的高通量筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组RSV反基因组质粒rRSV‑EGFP，其序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了由上述质粒经拯救获得的重组RSV以及其在筛选抗RSV药物中的应用。本发明筛选抗RSV药物的高通量筛选方法，包括：接种宿主细胞，加入重组RSV和待筛选药物；检测GFP荧光强度；评价待筛选药物的抗RSV效果。本发明利用表达绿色荧光蛋白的重组RSV与宿主细胞和待筛选化合物相互作用，由于绿色荧光蛋白的表达水平与病毒复制水平密切相关可以通过检查荧光强度分析化合物的抗病毒作用，进而建立针对RSV的高通量药物筛选模型，进行大规模的药物筛选，为抗RSV药物的研发奠定基础。

Description

一种抗呼吸道合胞病毒药物的高通量筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医学领域。更具体地，涉及一种基于重组病毒的抗呼吸道合胞病毒药物的高通量筛选方法的建立和应用。

背景技术

呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus，RSV)是在世界范围内引起5岁以下儿童和婴儿严重呼吸道疾病和毛细支气管炎的最常见的病毒性病原体之一。RSV引起的季节性感染通常持续1-2周，在大多数健康的成年人身上表现为轻微的类似感冒的症状。然而，对于弱势群体—婴儿、老年人和免疫力低下的人，RSV感染易导致严重的下呼吸道感染。据估计，2005年全球约有3.38亿5岁以下儿童发生了RSV感染。其中，约有340万人为严重的下呼吸道感染需要住院治疗，至少有66,000人死亡。严重的RSV感染同样困扰着老年人，在美国每年RSV感染会导致约177,000名老年人住院，约有11,000人死亡。据估计，每年住院费用超过10亿美元。持续缺乏任何特定的治疗或安全有效疫苗减少全球RSV感染的发病率和死亡率。

目前还没有授权的疫苗可以预防RSV，用于治疗RSV的药物也仅有利巴韦林和帕利珠单抗，然而帕利珠单抗是一种昂贵的人源化单克隆抗体，仅能用作预防性治疗，利巴韦林是一种核苷抗代谢物，有严重毒性，存在致畸作用。因此，我们迫切需要开发新的抗RSV药物。

高通量筛选(High Throughput Screening，HTS)技术以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式结合自动化操作系统，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，可以实现对高容量化合物样品库的筛选。高通量筛选在微板中进行操作，样品用量一般在微克级别，节省了化合物样品，降低了成本；运用自动化操作系统，减少了工作人员的劳动量，提高了筛选的准确性；依赖于数量庞大的化合物样品库，实现了大规模的药物筛选，充分利用了药物资源，提高了新的药物发现的概率。

高通量筛选系统由化合物样品库，自动化操作系统，检测系统和数据处理系统四个部分组成，运用所建立的高通量筛选模型，可以微量、快速、灵敏和准确的进行药物筛选。目前，高通量筛选模型已经成为开发抗病毒药物的主要方式，迄今为止已有很多高通量筛选模型用于抗病毒药物筛选，并取得了一定的成效。

因此，提供一种抗呼吸道合胞病毒药物的高通量筛选方法对于预防和治疗RSV具有重要意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于反向遗传学构建的重组RSV反基因组质粒rRSV-GFP及其经拯救获得的重组病毒。

本发明的另一个目的在于提供一种简便、快速、准确、便于操作的抗呼吸道合胞病毒药物的高通量筛选方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了一种基于反向遗传学构建的重组RSV反基因组质粒rRSV-EGFP，其序列如SEQ ID No.1所示，全长为19543bp。

进一步地，所述重组质粒rRSV-EGFP是将重组序列装入到pBRAT载体中获得的；其中，所述重组序列是在RSV反基因组的5′端侧翼插入T7启动子序列，3′端侧翼插入丁型肝炎核酶(HDV ribozyme,δ)序列和T7终止子，在G和F基因之间插入绿色荧光蛋白(GreenFluorescent Protein，GFP)基因，并删除了SH基因的非编码区186-297之间112个碱基；所述pBRAT载体是将合成的linker ClaⅠ-PmeⅠ-XhoⅠ-AsuⅡ-XmaⅠ-NheⅠ-MluⅠ-NruⅠ插入pBR322载体中，即得。

本发明所述重组质粒的制备包括以下步骤：

1)将合成的linker ClaⅠ-PmeⅠ-XhoⅠ-AsuⅡ-XmaⅠ-NheⅠ-MluⅠ-NruⅠ插入pBR322载体，将其改造为pBRAT载体；

2)将NheⅠLMluⅠ合成片段连接到载体pMD18-T中得pMD18-T-L质粒；取A1(PmeⅠNS1NS2NPMSHXhoⅠ)合成片段、pBR322B载体，PmeⅠ和XhoⅠ酶切，连接，得到pBR322B-RSV A1质粒；取A2(SacISHGAsuⅡ)合成片段、pBR322B载体，SacI和AsuⅡ酶切，连接，得到pBR322B-RSV A2质粒。

3)本发明采用分段克隆的方法来构建rRSV-EGFP质粒，即取pMD18-T-L质粒、pBRAT载体，NheI和MluI酶切，连接，得到pBRAT-L质粒，取AsuIIGEGFPFM2LNheⅠ合成质粒、pBRAT-L质粒，AsuII和NheI酶切，连接，得到pBRAT-GEGFPFM2L质粒，取pBR322B-RSV A1质粒、pBRAT-GEGFPFM2L质粒，PmeI和XhoI酶切，连接，得到pBRAT-RSV-EGFPΔA2质粒，取pBR322-RSV A2和pBRAT-RSV-EGFPΔA2质粒，SacI和AsuII酶切，连接，得到rRSV-EGFP质粒。

采用相似或相同的制备原理，重组序列也可以装入到其他的表达载体中或修改的表达载体中，表达载体的修改方式不限于本申请例举的方法。

采用本发明原理构建重组质粒的方法，插入绿色荧光蛋白基因以外的其他报告基因，如荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型碱性磷酸酶等活荧光蛋白家族中的成员，实现通过检测报告蛋白的表达量来评价抗RSV药物的，也属于本发明的保护范围。

本发明构建的携带EGFP重组质粒是在以RSV Long株为母本的基础上进行改造构建的，推动了反向遗传学在RSV上的应用，另外，利用此重组质粒可用于拯救RSV重组病毒，并可进一步将重组病毒用于抗RSV药物的高通量筛选中，具有灵敏直观的优势。

本发明还提供了由上述重组质粒经拯救获得重组RSV。

本发明进一步提供了上述重组RSV在筛选抗RSV药物中的应用。

本发明利用上述重组RSV病毒筛选抗RSV药物的高通量筛选方法，包括以下步骤：接种宿主细胞，加入重组RSV和待筛选药物；检测GFP荧光强度；评价待筛选药物的抗RSV效果。

基于rRSV-EGFP的高通量筛选模型有很多优点：第一，操作非常简单，高效，很适合自动化的筛选以便广泛的筛选化合物的；第二，与基于细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)等传统的方法相比，基于rRSV-EGFP的高通量筛选模型的数据更客观、准确和稳定，避免了实验人员的主观影响；第三，绿色荧光蛋白的发光过程不需要任何其他辅助因素，可直接产生绿色荧光，且GFP的表达量与病毒在细胞中的复制量相统一，对细胞的生长和病毒的复制几乎没有影响。

进一步地，所述宿主细胞包括实验组宿主细胞、细胞对照组宿主细胞、病毒对照组宿主细胞和阳性对照组宿主细胞。

所述宿主细胞为HEp-2细胞或vero细胞；优选地，为HEp-2细胞。

利用荧光强度抑制率评价待筛选的药物的抗RSV效果，公式如下：

抑制率＝(病毒对照组荧光强度-实验组荧光强度)/(病毒对照组荧光强度-细胞对照组荧光强度)×100％

其中，所述细胞对照组既不加重组RSV也不加待筛选药物；病毒对照组只加重组RSV，不加待筛选药物；实验组既加重组RSV又加待筛选化合物；另外同时设立阳性对照组，加重组RSV和对重组RSV明确有抑制作用的化合物。所述病毒对照组、阳性对照组与实验组加入重组RSV的量相同。所述荧光强度是指绿色荧光蛋白(GFP)的荧光信号(RFU)。抑制率越大则表明待筛选药物抗RSV作用越强，可以对比阳性对照组和实验组的抑制率，确定待筛选药物对RSV的抑制作用。

进一步地，所述荧光强度检测的激发波长为470-481nm，发射波长为515-525nm；优选地，激发波长479nm，发射波长517nm。

进一步地，所述病毒加入后24-72h检测荧光强度；优选地，为48h。

进一步地，所述96孔板中，宿主细胞感染重组RSV剂量为100-10000pfu/孔；优选地，宿主细胞感染重组RSV病毒剂量为3000pfu/孔。

进一步地，所述96孔板中，宿主细胞的接种密度为0.5×10⁴-4×10⁴细胞/孔；优选地，为2×10⁴细胞/孔。

为了优化高通量筛选方法中GFP的检测条件，本发明对GFP的检测波长、检测时间、病毒感染剂量、病毒感染剂量、细胞密度进行了优化。结果显示：对于检测波长：当激发波长为470-481nm，发射波长为515-525nm，检测病毒量与荧光强度间的线性关系较好；而激发波长为479nm，发射波长为517nm荧光强度值较高，因此，确定了检测的激发波长为479nm，发射波长为517nm。对于检测时间：在感染后48h，GFP表达水平较高，72h时荧光强度有所下降，因此确定检测时间为感染后48h。对于病毒感染剂量：随着RSV浓度的增高细胞活性呈现下降的趋势，然而在100-10000pfu细胞活性维持在80％以上，结合病毒感染剂量优化结果，确定病毒感染剂量为3000pfu/孔。对于细胞密度：当细胞密度为2×10⁴细胞/孔时能够检测到最大信号强度，且各细胞密度对照组间无显著性差异，因此，确定细胞用量为2×10⁴细胞/孔。

在本发明中，待筛选药物可以是人工合成的化合物，也可以是从天然产物中分离纯化的化合物，可以是单个化合物，也可以是由单个化合物组成的混合化合物。初筛后，将阳性的混合化合物样品拆分为单个化合物，进行再次筛选。

本发明的有益效果如下：

1、本发明利用表达绿色荧光蛋白的重组RSV病毒与宿主细胞和待筛选化合物相互作用，由于绿色荧光蛋白的表达水平与病毒复制水平密切相关可以通过检查荧光强度分析化合物的抗病毒作用，进而建立针对RSV的高通量药物筛选模型，进行大规模的药物筛选，为抗RSV药物的研发奠定基础。

2、本发明方法操作简便，能够更快速、准确的反映病毒状况，便于高通量操作；

3、本发明方法是在96孔板中进行操作，能够同时对多个化合物进行筛选，且数据更客观、准确和稳定，避免了实验人员的主观影响；

4、本发明GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物及其他辅助因子，且对细胞毒性较小。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出载体pBRAT的酶切鉴定电泳图，其中M代表分子量标记物。

图2示出重组rRSV-EGFP质粒的酶切鉴定电泳图，其中M代表分子量标记物；1：AsuⅡ，NheⅠ；2：PmeⅠ，XhoⅠ；3：AsuⅡ，SacⅠ；4：EcoRⅤ；5：SpeⅠ；6：AflⅡ；7：MluⅠ。

图3示出质粒共转染BHK-T7/9细胞后显微镜下观察荧光表达情况；1：实验组；2：阳性对照组；3：阴性对照组mock。

图4示出盲传至宿主细胞HEp-2细胞后显微镜下观察荧光表达情况；1：实验组；2：阴性对照组mock。

图5示出荧光显微镜观察rRSV-EGFP连续传代后荧光表达情况；p1-p8：第一到第八代。

图6示出利用免疫酶法检测连续传代后重组病毒的空斑形成单位(PFU/mL)

图7示出为不同激发波长和发射波长检测的结果，其中，pfu/孔为96孔板每个孔中的病毒数单位；检测的激发波长与发射波长分别为：a：487、509；b：485、511；c：483、513；d：481、515；e：479、517；f：470、525。

图8示出不同时间点RSV与GFP之间的剂量-效应关系曲线。

图9示出病毒感染量对细胞活性的影响。

图10示为细胞密度与检测结果的关系，其中，细胞/孔为96孔板每个孔中的细胞数单位。

图11示为化合物P13与GFP表达量的关系。

图12示出利巴韦林与GFP表达量的关系。

图13示出高通量筛选模型Z’因子检测统计图

图14示出SP100107化合物库2000个化合物初筛阳性结果。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1 rRSV-EGFP质粒的构建

1、将合成的linker ClaⅠ-PmeⅠ-XhoⅠ-AsuⅡ-XmaⅠ-NheⅠ-MluⅠ-NruⅠ插入pBR322载体，将其改造为pBRAT载体，将改造后的载体利用XhoⅠ和NotⅠ进行酶切鉴定，于3466bp处得到目的条带(图1)，即载体片段。

2、将NheⅠLMluⅠ合成片段连接到载体pMD18-T中得pMD18-T-L质粒；取A1(PmeⅠNS1NS2NPMSHXhoⅠ)合成片段、pBR322B载体，PmeⅠ和XhoⅠ酶切，连接，得到pBR322B-RSV A1质粒；取A2(SacISHGAsuⅡ)合成片段、pBR322B载体，SacI和AsuⅡ酶切，连接，得到pBR322B-RSV A2质粒。

3、反基因组rRSV-EGFP质粒构建

取pMD18-T-L质粒、pBRAT载体，NheI和MluI酶切，连接，得到pBRAT-L质粒，取AsuIIGEGFPFM2LNheI合成质粒、pBRAT-L质粒，AsuII和NheI酶切，连接，得到pBRAT-GEGFPFM2L质粒，取pBR322B-RSV A1质粒、pBRAT-GEGFPFM2L质粒，PmeI和XhoI酶切过夜，连接，得到pBRAT-RSV-EGFPΔA2质粒，取pBR322-RSV A2质粒和pBRAT-RSV-EGFPΔA2质粒，SacI和AsuII酶切，连接，得到rRSV-EGFP质粒，将获得的rRSV-EGFP质粒用AsuⅡ，NheⅠ(1)；PmeⅠ，XhoⅠ(2)；AsuⅡ，SacⅠ(3)；EcoRⅤ(4)；SpeⅠ(5)；AflⅡ(6)；MluⅠ(7)多组酶进行酶切鉴定，分别在相应位置得到目的条带(图2)。

实施例2 重组病毒的拯救

将BHK T7/9细胞接种在6孔板，24h后，转染所述rRSV-EGFP质粒和四种辅助蛋白质粒(pCDNA3.1-N,P,L,M2-1)至宿主细胞(BHK T7/9)于37℃下培养(实验组)，与此同时设立阳性对照组和阴性对照组mock，其中阳性对照组转染RSV微型复制子pBR322B-RSV-EGFP和四种辅助蛋白质粒(pCDNA3.1-N,P,L,M2-1)，阴性对照组mock只转染四种辅助蛋白质粒(pCDNA3.1-N,P,L,M2-1)，转染96小时盲传至宿主细胞HEp-2继续放置于37℃下培养，转染(图3)和盲传(图4)后每天在显微镜下观察荧光表达情况，根据细胞出现的荧光可以判断实验组已成功拯救出重组病毒。

实施例3 重组病毒稳定性鉴定

利用荧光显微镜观察rRSV-EGFP连续传代后荧光表达情况(图5)和利用免疫酶法检测连续传代后重组病毒的空斑形成单位(PFU/mL)(图6)，从连续传代的荧光表达情况可以看出拯救出的重组病毒是稳定的，免疫酶法检测的结果显示拯救出的重组病毒的量在连续传3代后趋于稳定(P<0.05)。

实施例4 检测条件的优化

1.确定合适的检测波长：

96孔板中培养HEp-2细胞，感染3倍梯度稀释的RSV(30000-0pfu)，于感染后24h检测GFP表达水平，如图7所示，检测的激发波长与发射波长分别为：a：487、509；b：485、511；c：483、513；d：481、515；e：479、517；f：470、525，用d、e、f三组波长检测病毒量与荧光强度间的线性关系较好，e组的荧光强度值较高，确定检测的激发波长为479nm，发射波长为517nm。

2.确定合适的检测时间和病毒感染剂量：

96孔板中培养HEp-2细胞，感染3倍梯度稀释的RSV(30000-0pfu)，分别于感染后24h、48h和72h检测GFP表达水平，如图8所示，在感染后48h，GFP表达水平较高，确定检测时间为感染后48h。并利用MTS法对感染后48h的细胞活性进行了检测，如图9所示，随着RSV浓度的增高细胞活性呈现下降的趋势，然而在100-10000pfu细胞活性维持在80％以上，且病毒量与荧光强度有很强的相关性，确定病毒感染剂量为3000pfu/孔。

3.确定合适的细胞用量：

在上述实验的基础上，分别按0.5×10⁴细胞/孔、1.0×10⁴细胞/孔、2×10⁴细胞/孔和4×10⁴细胞/孔的密度将HEp-2细胞接种到96孔板中，用3000pfu/孔的RSV感染HEp-2细胞，同时设立相应的细胞对照，感染后48h，检测GFP表达水平。如图10所示，当细胞密度为2×10⁴细胞/孔时能够检测到最大信号强度(P<0.01)，因此确定细胞用量为2×10⁴细胞/孔。

实施例5 系统验证

96孔板中，按2×10⁴细胞/孔接种细胞，24h后取化合物P13或利巴韦林进行10倍梯度稀释至10^-4-10²μM加到细胞中，之后加入3000pfu/孔的RSV，同时设立相应剂量DMSO对照组，细胞对照及病毒对照，感染后48h检测EGFP表达水平。当化合物P13浓度为1M时，与DMSO对照组相比，EGFP表达水平显著下降(如图11，P<0.05)；当P13浓度达到100μM时，EGFP表达量几乎完全被抑制。当利巴韦林浓度为10^-2μM时，与空白对照组相比，EGFP表达水平显著下降(如图12，P<0.05)；当利巴韦林浓度达到100μM时，EGFP表达量几乎完全被抑制。

同时，在加入化合物P13或利巴韦林48h后，我们利用MTS法对细胞活性进行了检测，结果表明在所有实验剂量组中，细胞活性均保持在80％以上，表明阳性化合物对RSV的抑制作用并不是由细胞毒性引起的，且DMSO溶剂对EGFP的表达没有明显的影响。基于这些结果，我们认为此系统能够正确反映阳性化合物对RSV的抑制作用，能够用于筛选抗RSV药物。

实施例6 高通量筛选模型Z’因子检测

96孔板中，按2×10⁴细胞/孔接种细胞，24h后用3000pfu/孔的RSV感染HEp-2细胞，作为病毒感染组(48个孔)，HEp-2细胞只加入维持液，作为细胞对照组(48个孔)，感染后48h检测EGFP表达水平，结果如图13所示，从图中可以看出，病毒感染组和细胞对照组的相对荧光强度均稳定分布在一定范围内。计算Z’因子，变异系数(％CV)、信噪比(S/N)和信背比(S/B)。Z’＝1-(3×病毒感染对照组标准偏差+3×细胞对照组标准偏差)/(病毒感染对照组平均值-细胞对照组平均值)，Z’在0.5～1.0之间符合高通量筛选的要求。S/B＝病毒感染对照组平均值/细胞对照组平均值(推荐标准：>3)；S/N＝(病毒感染对照组平均值-细胞对照组平均值)/((细胞对照组标准偏差)2+(病毒感染对照组标准偏差)2)1/2(推荐标准：>10)。％CV＝病毒感染对照组标准偏差/病毒感染组平均值(推荐标准：<20)。如表1所示，根据公式计算，抗RSV药物高通量筛选模型Z’＝0.85(n＝48)，符合高通量筛选模型的可接受标准，其他各项参数也均符合高通量筛选的统计学要求，因此，利用GFP标记的重组RSV建立的抗RSV药物筛选模型符合高通量筛选要求，可以应用于大规模筛选实验。

表1 高通量筛选模型各参数统计表

实施例7 SP100107化合物库筛选

采用本发明构建的筛选模型进行小规模的药物筛选，初筛2000个化合物，筛选浓度为10μM。96孔板中，按2×10⁴细胞/孔接种细胞，用3000pfu/孔的RSV感染HEp-2细胞同时取化合物1μl加到HEp-2细胞中，感染48h后检测绿色荧光蛋白的表达量。计算抑制率。抑制率＝(病毒感染对照组-实验组)/(病毒感染对照组-细胞阴性对照组)×100％。选择抑制率大于50％的化合物作为初筛得到的阳性化合物，包括硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤等(如表2)，阳性率为1.65％(部分结果如图14)。

表2 部分阳性化合物的分子式和结构式

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京交通大学

<120> 一种抗呼吸道合胞病毒药物的高通量筛选方法和应用

<130> JLC17I0140EA

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19543

<212> DNA

<213> 质粒rRSV-EGFP

<400> 1

gtttaaacta atacgactca ctatagggac gggaaaaaat gcgtacaaca aacttgcgta 60

aaccaaaaaa atggggcaaa taagaatttg ataagtacca cttaaattta actcccttgg 120

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gctttatgtg aatttgaaaa catagtaaca tcaaaaaaag tcataatacc aacataccta 3780

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agtcacacta agcaaggatc aactgagtgg tataaataat attgcattta gtaactgaat 8040

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agtctatgga taaaagtata gataccttat cagaaataag tggagctgca gagttggaca 8460

gaacagaaga gtatgctctt ggtgtagttg gagtgctaga gagttatata ggatcaataa 8520

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gtgatgatat caaaaaactg agagacaatg aagagctaaa ttcacccaag ataagagtgt 8640

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tgttaaaaag attgccagca gacgtattga agaaaaccat caaaaacaca ttggatatcc 8760

acaagagcat aaccatcaac aacccaaaag aattaactgt tagtgataca aatgaccatg 8820

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tacacaaaat taaacaacat attaacacag tatcgatcaa atgaggttaa aaaccatggg 9840

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attttacaat tctttcctga aagtcttaca agatatggtg atctagaact acaaaaaata 11160

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tcaagaacca aaaatttcat catgcctaag aaagctgata aagagtctat tgatgcaaat 15300

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ttgtcaaaac taaagagtgt tgttagtgga gatatactat catattctat agctggacgg 15420

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ctgtattaac gaagcgctgg cattgaccct gagtgatttt tctctggtcc cgccgcatcc 16920

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aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 17700

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 17760

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 17820

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 17880

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 17940

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 18000

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 18060

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 18120

gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 18180

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 18240

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 18300

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 18360

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 18420

gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 18480

tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 18540

gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 18600

agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 18660

tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 18720

agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc 18780

gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 18840

catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 18900

ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 18960

atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 19020

tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg cgccacatag 19080

cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 19140

cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 19200

atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa 19260

aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta 19320

ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 19380

aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 19440

aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 19500

tcaagaattc tcatgtttga cagcttatca tcgatttttt gtt 19543

Claims (15)

1.一种重组RSV反基因组质粒rRSV-EGFP，其特征在于：所述质粒rRSV-EGFP的序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述的重组RSV反基因组质粒rRSV-EGFP经拯救获得的重组RSV。

3.一种如权利要求2所述的重组RSV在筛选抗RSV药物中的应用。

4.一种利用权利要求2所述的重组RSV筛选抗RSV药物的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：在96孔板中接种宿主细胞，加入重组RSV和待筛选药物；检测GFP荧光强度；评价待筛选药物的抗RSV效果。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述荧光强度检测波长激发波长为470-481 nm，发射波长为515-525 nm。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光强度检测波长为激发波长479nm，发射波长517 nm。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测GFP荧光强度是在加入重组RSV24-72h。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测GFP荧光强度是在加入重组RSV48h。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述96孔板中，宿主细胞感染重组RSV剂量为100 - 10000 pfu/孔。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述96孔板中，宿主细胞感染重组RSV剂量为3000 pfu/孔。

11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述96孔板中，宿主细胞的接种密度为0.5×10⁴-4×10⁴细胞/孔。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述96孔板中，宿主细胞的接种密度为2×10⁴细胞/孔。

13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞包括实验组宿主细胞、细胞对照组宿主细胞、病毒对照组宿主细胞和阳性对照组宿主细胞。

14.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为HEp-2细胞或vero细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为HEp-2细胞。