CN104946669B - 稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用。一种稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.17所示。该全长感染性克隆成功制备出携带绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒。本发明成功获得的稳定携带绿色荧光蛋白基因的重组乙型脑炎病毒，在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆 及制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒及制备方法和应用，应用包括在解析脑神经环路、乙型脑炎病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选中的应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一,而神经网络是大脑行使功能的基础，神经网络的正常连接，使得机体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，尚无有效手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。

乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其基因组为单股正链RNA，长度约为12kb。基因组编码的多聚蛋白可切割成3个结构蛋白(C、prM、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型脑炎病毒具有广泛的宿主范围，包括：人、猪、鼠、猴、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟类等，能够进入神经系统而引起脑炎。给人类的健康和农业生产带来了巨大损失。目前，有预防该病毒感染的疫苗，对于保障人类的健康和提高农业生产的效率发挥了重要作用。但是，目前还没有有效的药物来特异的治疗该病毒感染引起的疾病。另外，乙型脑炎病毒感染脑神经系统的特性使其成为具备解析神经环路的能力。但是目前尚无能够稳定携带绿色荧光蛋白基因的JEV。而本发明通过一系列的遗传学筛选及反向的多途径分析，获得了能够稳定携带绿色荧光蛋白基因的重组JEV。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了具有稳定表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。将在神经环路标记、抗原表位分析、药物筛选平台的建立、药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种稳定携带绿色荧光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Pr otein，EGFP)基因的乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)全长感染性克隆，其序列为SEQ ID NO：17所示。

本发明的目的在于提供了一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的制备方法，方法简单，易行。

本发明的目的在于提供了一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆应用，该全长感染性克隆可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在药物抑制乙型脑炎病毒作用机制的分析、乙型脑炎病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

为了实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

(1)构建稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆:

以携带有EGFP的JEV全长感染性克隆质粒pJEFL-EGFP为模板(序列为SEQ ID NO:10)，使用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示引物扩增片段SEQ ID NO:11；使用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示引物扩增片段SEQ ID NO:14；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段。

使用XhoI+SacI酶切，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:14片段插入到pJEFL-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEFL-EGFP-N15K，其序列为SEQ ID NO:17所示。

稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的应用，包括以下应用：

(1)稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆(pJEFL-EGFP-N15K)制备病毒的能力：

用KpnI酶切pJEFL-EGFP-N15K，回收被酶切的产物，使用MEGAscript T7Transcription Kit分别体外转录酶切后的pJEFL-EGFP成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RNA的细胞作为对照组，通过Olympus倒置荧光显微镜观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达情况。本发明的全长感染性克隆成功制备稳定表达EGFP的重组JEV。。

(2)pJEFL-EGFP-N15K制备的重组JEV在研究脑神经环路平台中的应用：

取0.3μl重组JEV病毒定位注射到鼠嗅球，分别在感染后5天和7.5天后麻醉动物，用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。

所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猴、豚鼠、人、大鼠、蝙蝠、猪、马、牛、羊、兔、鸡、鸭和鸟等动物的神经环路标记。

(3)pJEFL-EGFP-N15K制备的重组JEV在分析抗原表位和抗乙型脑炎病毒药物(抗体药)筛选中的应用：

在6孔细胞培养板中接种8×10⁵BHK21细胞/孔，在37℃,5％(v/v)CO₂培养条件下，汇合度达到90％时。将50μl重组JEVP0代病毒液与50μl乙型脑炎病毒的抗体混合，37℃吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明制备了稳定表达EGFP的乙型脑炎病毒，其具有可视化的特点，便于开展相关的研究。目前国内外还没有用于稳定表达绿色荧光蛋白的重组乙型脑炎病毒，本发明填补了该空白。

2.本发明对于开展JEV的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值；

3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。JEV能够感染人和鼠等动物的神经细胞，具有作为神经环路标记的潜力。本发明不仅能够用于鼠等非灵长类动物，而且还能用于非人灵长类动物的脑科学研究。

附图说明

图1为一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图。

A：一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的构建示意图；

B：一种携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆的RNA转染BHK21细胞后的荧光表达情况。

C：一种携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒的产生的plaque形态不稳定；

D：一种携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒的携带EGFP在扩增的过程中发生丢失。

图2为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒的筛选示意图。

A：筛选流程；

B：筛选获得的稳定表达EGFP的重组JEV的plaque形态特征；

C：筛选的稳定表达EGFP的JEV重组病毒的全基因组测序分析导致稳定携带EGFP的原因。

图3为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。

A：未感染病毒的细胞；

B：稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒感染BHK21细胞产生的细胞病变；

C：稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒感染BHK21细胞表达荧光蛋白。

图4为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒的稳定性检测

A：一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒的产生的plaque形态稳定；

B：一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒的在增殖的过程中携带的EGFP基因稳定；

C：一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒体外表达EGFP的检测；

D：一种稳定携带EGFP的JEV重组病毒体内稳定表达EGFP的检测。

图5为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒解析鼠脑神经环路的示意图。

A：在感染后5天稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒标记鼠VPM和皮层区域；

B：在感染后7.5天稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒标记鼠VPM和皮层区域。

图6为一种稳定携带EGFP基因的JEV用于抗原表位分析和抑制乙型脑炎病毒的抗体药的作用示意图。

A：不含抗体而含有稳定携带EGFP基因的JEV的对照孔；

B：1:10稀释的抗体对稳定携带EGFP基因的JEV的抑制作用；

C：1:100稀释的抗体对稳定携带EGFP基因的JEV的抑制作用；

D：不含抗体和病毒的对照孔。

图7为一种稳定携带EGFP基因的JEV的生物学特征的分析。

A：适应性突变N15K对于保持稳定性的能力；

B：稳定携带EGFP的JEV的RNA转染细胞后的病毒生长特性；

C：稳定携带EGFP的JEV以感染复数为0.1感染细胞后的病毒生长特性。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术。

实施例1：携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

将C38-EagI-EGFP-XhoI-FMDV2A基因插入到乙型脑炎病毒的5’UTR和capsid基因之间(图1A),具体过程包括如下几个方面：

①以JEV全长感染性克隆质粒pJEFL(Zhao Z.et al.,J Gen Virol.2005,86(8):2209-2220.)为模板，使用Takara Primerstar Polymerase扩增C38片段为SEQ ID NO:1所示,DNA片段SEQ ID NO:1的引物：SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃20s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

②以pEGFP-C1质粒为模板，扩增EGFP片段为SEQ ID NO:4所示,DNA片段SEQ IDNO:4的引物：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃60s，72℃10min，16℃10min，30个循环；

③以JEV全长感染性克隆质粒为模板，扩增C-prM-E片段为SEQ ID NO:7所示,DNA片段SEQ ID NO:7的引物：SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；按常规方式检测回收扩增出的DN A片段；

PCR的反应体系均为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃2.5min，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用PmeI+SacI酶切pJEFL，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:1,SEQID NO:4和SEQ ID NO:7片段插入到pJEFL，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEFL-EGFP，其序列为SEQ IDNO:10所示。

实施例2：pJEFL-EGFP成功制备出表达EGFP的JEV，其步骤是：

用KpnI酶切pJEFL-EGFP,使用浓度为1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，并使用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收被酶切的产物，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定DNA的浓度，使用浓度为1％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，并于-20℃保存备用；使用MEGAscript T7Transcription Kit分别体外转录酶切后的pJEFL-EGFP,成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，并同时设置未转染RN A的细胞作为对照组，通过倒置荧光显微镜(Olympus)观察实验组和对照组的细胞状态和荧光表达。

未转染pJEFL-EGFP RNA的细胞，无细胞病变发生(图1B)，使用蓝色激发荧光，可见明显的绿色(图1B)，表明重组病毒可以表达携带的外源基因绿色荧光蛋白。以上数据表明携带EGFP基因的重组乙型脑炎病毒全长感染性克隆具有制备乙型脑炎病毒及表达外源基因的能力，按常规方法搜集制备重组JEV病毒。

但是利用pJEFL-EGFP制备的重组JEV病毒传代的过程中产生的plaque的形态特征不稳定(图1C)，另外，传代的过程中其携带的EGFP基因也会逐渐发生丢失(图1D)，表明pJEFL-EGFP的不稳定性。

实施例3：稳定携带EGFP的pJEFL-EGFP的筛选，其步骤是：

将实施例2制备的P0代病毒进行plaque assay，根据斑点的形态挑去小斑点感染含有BHK21细胞的12孔板，然后每天观察细胞的病变和EGFP的表达情况，待细胞病变明显的时候收集上清再次进行plaque assay，同样进行细胞病变和EGFP表达情况的观察，待细胞病变明显的时候收集上清再次进行plaque assay，连续采用上述方法，直至所观察的plaque的形态均一且为小斑点的时候即停止上述实验，收集病毒液体于-80度保存(图3A和3B)。

接下来，采用RNeasy kits(Qiagen)提取病毒基因组，分节段进行全基因组扩增后进行测序，明确病毒稳定携带EGFP的原因是由于在capsid基因的第45个碱基由T变为G,从而导致位于capsid的第15个氨基酸的由天冬酰胺变(缩写为Asn，N)为赖氨酸(缩写为Lys，K)。

实施例4：稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其构建方法如下：

以携带有EGFP的JEV全长感染性克隆质粒pJEFL-EGFP为模板(序列为SEQ ID NO:10)，,使用Takara Primerstar Polymerase扩增片段SEQ ID NO:11,其为引物SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；使用Takara Primerstar Polymerase扩增片段SEQ ID NO:14,其引物为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；

PCR的反应体系为50μl：5×Reaction Buffer：10μl，10mM dNTPs：1μl，10μMForward Primer：2.5μl，10μM Reverse Primer：2.5μl，Template DNA：0.5μl，DNAPolymerase：0.5μl，Nuclease-Free Water：33μl。扩增条件为：98℃60s，98℃10s，55℃15s，72℃2.5min，72℃10min，16℃10min，30个循环；

使用XhoI+SacI酶切pJEFL-EGFP，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:11和SEQ ID NO.14片段插入到经XhoI+SacI酶切的pJEFL-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEFL-EGFP-N15K，其序列为SEQ ID NO.17所示，即为一种稳定携带EGFP基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆。

利用实施例2所述的方法，利用pJEFL-EGFP-N15K可制得稳定携带EGFP的重组JEV病毒(以下简称为重组JEV病毒)，用于以下实施例。

实施例5：pJEFL-EGFP-N15K稳定性分析，其步骤是：

用KpnI酶切pJEFL-EGFP-N15K；使用MEGAscript T7Transcription Kit分别体外转录酶切后的pJEFL-EGFP-N15K成为RNA，并转染BHK21细胞，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，通过倒置荧光显微镜观察细胞状态和荧光表达,收集病毒上清作为P0,然后在BHK21细胞上进行传代,收集每代的病毒液,一方面进行plaque assay检测plaque的形态和均一性(图4A),另一方面,抽提病毒的RNA后进行RT-PCR,分析EGFP在病毒传代过程中的稳定性(图4B)以及该病毒体外感染BHK21细胞后表达荧光的能力(图4C)，另外在鼠脑内分析其荧光和病毒蛋白分布的情况(图4D)。

图4A：pJEFL-EGFP-N15K在增殖后产生的不同代数的病毒产生的plaque形态均一，表明不同代数的病毒具有一致的特性，表明病毒具有稳定的特征；

图4B：抽提不同代数的病毒的RNA，然后进行RT-PCR,扩增的区域包含EGFP基因，结构显示不同代数间的RT-PCR产物的大小一致，表明随着病毒的增殖，病毒一直稳定的携带EGFP基因；

图4C：重组JEV病毒在体外感染BHK21细胞，可见EGFP的表达，表明稳定携带EGFP的重组JEV病毒具有在体外表达EGFP的能力；

图4D：重组JEV病毒K在体内感染鼠脑，可见EGFP的表达，另外，通过免疫组化分析病毒蛋白的表达分布，发现绿色荧光蛋白的分布与病毒蛋白的分布一致，从而表明稳定携带EGFP的重组JEV病毒具有在体内稳定表达EGFP的能力。

实施例6：pJEFL-EGFP-N15K制备得到的重组JEV在解析脑神经环路中的应用，其步骤是：

取0.3μl重组JEV病毒定位注射到鼠嗅球，分别在感染后5天和7.5天麻醉动物，用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。在重组JEV病毒注射到嗅球的一个点之后，可见明显的荧光呈环状的标记，表明重组JEV病毒能够在鼠脑内产生病毒，且该病毒具有表达绿色荧光蛋白的能力(图5A和5B),进一步分析与VPM相连接的脑区，可见在鼠脑皮层(图5A和5B)均有绿色荧光蛋白的表达，表明重组的病毒能够在神经网络中运输，具有标记脑神经环路的能力,另外，表达的EGFP和病毒编码的E蛋白的定位一致，也表明该病毒具有体内的稳定性。

实施例7：pJEFL-EGFP-N15K制备得到的重组JEV在分析抗原表位和筛选抗JEV药物(抗体药)中的应用，其步骤是：

在6孔细胞培养板中接种8×10⁵BHK21细胞/孔，在37℃,5％(v/v)CO₂培养条件下，汇合度达到90％时。将50μl重组JEV病毒P0代病毒液与50μl JEV的E蛋白多克隆抗体(浓度分别为1：10和1：100稀释)混合，37℃吸附30min，然后将该混合液加入各孔，37℃吸附1h；吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，分别加入用含2％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％(v/v)CO₂的培养箱中培养72h，使用荧光显微镜观察。

乙型脑炎病毒感染细胞是通过病毒表面的配体(抗原)与细胞表面的受体结合而引导病毒进入细胞，一蛋白配体与细胞表面受体类似物结合之后则无法引导病毒进入细胞，针对病毒抗原的抗体具有类似细胞表面受体的性质，病毒抗原能够通过特定的表位与抗体结合。基于此原理，该实施例将表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎病毒分别与不同含量的抗体体外孵育，然后再感染细胞，检测其荧光的表达。在不含抗体而含有重组乙型脑炎病毒的对照孔，荧光分布于整个视野(图6A)。而当与抗体体外孵育后再感染BHK21细胞，则严重的影响了病毒进入细胞的能力(图6B和6C)，只含有抗体而未感染病毒的细胞组未见细胞病变和绿色荧光蛋白(图6D)。该实施例表明该重组病毒的配体与其对应的抗体通过特定抗原表位的结合而抑制病毒进入细胞，一方面提示该病毒能够用于分析抗原表位；另一方面提示该重组病毒能够用于筛选抗乙型脑炎病毒药物(如抗体药)。

实施例8：为一种稳定携带EGFP基因的JEV的生物学特征，其步骤是：

①等量野生型JEV的RNA，pJEFL-EGFP的RNA和pJEFL-EGFP-N15K的RNA转染BHK21细胞，6h后覆盖含有培养基的琼脂，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，4-5天后，加入含有中性红和培养基的琼脂，24h后观察斑点的形成情况，并进行记数，同时计算出每μg RNA产生病毒的能力(图7A)；

②将等量野生型JEV的RNA，pJEFL-EGFP的RNA和pJEFL-EGFP-N15K的RNA转染BHK21细胞，4天后观察EGFP的表达情况，发现JE-EGFP-N15K表达EGFP的能力显著强于JE-EGFP表达EGFP的能力(图7A)；

③将等量野生型JEV的RNA和pJEFL-EGFP-N15K的RNA转染BHK21细胞，每天收集病毒上清，然后才用plaque assay的方法确定病毒滴度，从而绘制病毒RNA产生病毒的动力学特征(图7B)，一方面，表明JEFL-EGFP-N15K病毒的复制能力比野生型JEV低，其在转染RNA后第6天才达到峰值，而野生型JEV在转染RNA后3天即达到峰值；另一方面，野生型JEV的RNA转染后第4天，病毒的滴度显著下降，表明大量的病毒杀死了细胞，而pJEFL-EGFP-N15K直到转染RNA后第7天才出现下降的趋势，说明JEFL-EGFP-N15K的毒性比野生型JEV小。

④在感染复数(MOI)为0.1的情况下，将野生型JEV和pJEFL-EGFP-N15K制备的重组JEV感染BHK21，每天收集病毒上清，然后才用plaque assay的方法确定病毒滴度，从而绘制病毒在BHK21上的生长动力特征(图7C)，一方面，表明在相同的感染复数的条件下，野生型病毒在感染后第2天即可达到峰值，而后病毒的滴度显著下降；另一方面，JEFL-EGFP-N15K在感染后第3天才达到峰值，但是该峰值显著低于野生型JEV,在感染后第4天才开始出现少许的降低，表明pJEFL-EGFP-N15K的复制能力和毒力低于野生型JEV。

最后，还需要注意的是，上述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，并且以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院武汉物理与数学研究所

<120> 稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

<130> 稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆及制备方法和应用

<160> 17

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 184

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcgagagatt agtgcagttt aaacagtttt ttagaacgga agataaccat gactaaaaaa 60

ccaggagggc ccggtaaaaa ccgggctatc aatatgctga aacgcggcct accccgcgta 120

ttcccactag tgggagtgaa gagggtagta atgagcttgt tgcggccgat ggtgagcaag 180

ggcg 184

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgagagatt agtgcagttt 20

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<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcccttgct caccatcggc cgcaacaagc tcattact 38

<210> 4

<211> 760

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagctc 720

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<212> DNA

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<400> 6

ctcccgccag cttgagaagg tcaaaattca acagctgctc gagcttgtac agctcgtcc 59

<210> 7

<211> 2187

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg ccaatgacta aaaaaccagg 60

agggcccggt aaaaaccggg ctatcaatat gctgaaacgc ggcctacccc gcgtattccc 120

actagtggga gtgaagaggg tagtaatgag cttgttggac ggcagagggc cagtacgttt 180

cgtgctggct cttatcacgt tcttcaagtt tacagcatta gccccgacca aggcgctttt 240

aggccgatgg aaagcagtgg aaaagagtgt agcaatgaaa catctcacta gtttcaaacg 300

agaacttgga acactcattg acgccgtgaa caagcggggc agaaagcaaa acaaaagagg 360

aggaaatgaa ggctcaatca tgtggctcgc gagcttggca gttgtcatag cttgtgcagg 420

agccatgaag ttgtcaaatt tccaggggaa gcttttgatg accattaaca acacggacat 480

tgcagacgtt atcgtgattc ccacctcaaa aggagagaac agatgctggg tccgggcaat 540

cgacgtcggc tacatgtgtg aggacactat cacgtacgaa tgtcctaagc ttaccatggg 600

caatgatcca gaggatgtgg attgctggtg tgacaaccaa gaagtctacg tccaatatgg 660

acggtgcacg cggaccaggc attccaagcg aagcaggaga tccgtgtcgg tccaaacaca 720

tggggagagt tcactagtga ataaaaaaga ggcttggctg gattcaacga aagccacacg 780

atatctcatg aaaactgaga actggatcat aaggaatcct ggctatgctt tcctggcggc 840

ggtacttggc tggatgcttg gcagtaacaa cggtcaacgc gtggtattca ccatcctcct 900

gctgctggtc gctccggctt acagttttaa ttgtctggga atgggcaatc gtgacttcat 960

agaaggagcc agtggagcca cttgggtgga cttggtgcta gaaggagata gctgcttgac 1020

aattatggca aacgacaaac caacattgga cgtccgcatg atcaacatcg aagctagcca 1080

acttgctgag gtcagaagtt actgttatca tgcttcagtc actgacatct cgacggtggc 1140

tcggtgcccc acgactggag aagcccacaa cgagaagcga gctgatagta gctatgtgtg 1200

caaacaaggc ttcactgatc gtgggtgggg caacggatgt ggacttttcg ggaagggaag 1260

cattgacaca tgtgcaaaat tctcctgcac cagtaaagcg attgggagaa caatccagcc 1320

agaaaacatc aaatacgaag ttggcatttt tgtgcatgga accaccactt cggaaaacca 1380

tgggaattat tcagcgcaag ttggggcgtc ccaggcggca aagtttacag taacacccaa 1440

tgctccttcg ataaccctca aacttggtga ctacggagaa gtcacactgg actgtgagcc 1500

aaggagtgga ctgaacactg aagcgtttta cgtcatgacc gtggggtcaa agtcatttct 1560

ggtccatagg gaatggtttc atgacctcgc tctcccctgg acgtcccctt cgagcacagc 1620

gtggagaaac agagaactcc tcatggagtt tgaagaggcg cacgccacaa aacagtccgt 1680

tgttgctctt gggtcacagg aaggaggcct ccatcaggcg ttggcaggag ccatcgtggt 1740

ggagtactca agctcagtga agttaacatc aggccacctg aaatgtaggc tgaaaatgga 1800

caaactggct ctgaaaggca caacctatgg catgtgcaca gaaaaattct cgttcgcgaa 1860

aaatccggcg gacactggtc acggaacagt tgtcattgaa ctctcctact ctgggagtga 1920

tggcccctgc aaaattccga ttgtctccgt tgcgagcctc aatgacatga cccccgttgg 1980

gcggctggtg acagtgaacc ccttcgtcgc gacttccagt gccaattcaa aggtgctggt 2040

cgagatggaa ccccccttcg gagactccta catcgtagtt ggaaggggag acaagcagat 2100

caaccaccat tggcacaaag ctggaagcac gctgggcaaa gccttttcaa caactttgaa 2160

gggagctcag agactggcag cgttggg 2187

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg ccaatgacta aaaaaccag 59

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccaacgctg ccagtctctg 20

<210> 10

<211> 16116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgc ggccgatggt gagcaagggc gaggagctgt 240

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 300

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 360

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 420

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 480

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 540

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 600

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 660

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 720

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 780

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 840

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 900

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agctcgagca gctgttgaat tttgaccttc 960

tcaagctggc gggagacgtc gagtccaacc ctgggccaat gactaaaaaa ccaggagggc 1020

ccggtaaaaa ccgggctatc aatatgctga aacgcggcct accccgcgta ttcccactag 1080

tgggagtgaa gagggtagta atgagcttgt tggacggcag agggccagta cgtttcgtgc 1140

tggctcttat cacgttcttc aagtttacag cattagcccc gaccaaggcg cttttaggcc 1200

gatggaaagc agtggaaaag agtgtagcaa tgaaacatct cactagtttc aaacgagaac 1260

ttggaacact cattgacgcc gtgaacaagc ggggcagaaa gcaaaacaaa agaggaggaa 1320

atgaaggctc aatcatgtgg ctcgcgagct tggcagttgt catagcttgt gcaggagcca 1380

tgaagttgtc aaatttccag gggaagcttt tgatgaccat taacaacacg gacattgcag 1440

acgttatcgt gattcccacc tcaaaaggag agaacagatg ctgggtccgg gcaatcgacg 1500

tcggctacat gtgtgaggac actatcacgt acgaatgtcc taagcttacc atgggcaatg 1560

atccagagga tgtggattgc tggtgtgaca accaagaagt ctacgtccaa tatggacggt 1620

gcacgcggac caggcattcc aagcgaagca ggagatccgt gtcggtccaa acacatgggg 1680

agagttcact agtgaataaa aaagaggctt ggctggattc aacgaaagcc acacgatatc 1740

tcatgaaaac tgagaactgg atcataagga atcctggcta tgctttcctg gcggcggtac 1800

ttggctggat gcttggcagt aacaacggtc aacgcgtggt attcaccatc ctcctgctgc 1860

tggtcgctcc ggcttacagt tttaattgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag 1920

gagccagtgg agccacttgg gtggacttgg tgctagaagg agatagctgc ttgacaatta 1980

tggcaaacga caaaccaaca ttggacgtcc gcatgatcaa catcgaagct agccaacttg 2040

ctgaggtcag aagttactgt tatcatgctt cagtcactga catctcgacg gtggctcggt 2100

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aaggcttcac tgatcgtggg tggggcaacg gatgtggact tttcgggaag ggaagcattg 2220

acacatgtgc aaaattctcc tgcaccagta aagcgattgg gagaacaatc cagccagaaa 2280

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attattcagc gcaagttggg gcgtcccagg cggcaaagtt tacagtaaca cccaatgctc 2400

cttcgataac cctcaaactt ggtgactacg gagaagtcac actggactgt gagccaagga 2460

gtggactgaa cactgaagcg ttttacgtca tgaccgtggg gtcaaagtca tttctggtcc 2520

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gaaacagaga actcctcatg gagtttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg 2640

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actcaagctc agtgaagtta acatcaggcc acctgaaatg taggctgaaa atggacaaac 2760

tggctctgaa aggcacaacc tatggcatgt gcacagaaaa attctcgttc gcgaaaaatc 2820

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cctgcaaaat tccgattgtc tccgttgcga gcctcaatga catgaccccc gttgggcggc 2940

tggtgacagt gaaccccttc gtcgcgactt ccagtgccaa ttcaaaggtg ctggtcgaga 3000

tggaaccccc cttcggagac tcctacatcg tagttggaag gggagacaag cagatcaacc 3060

accattggca caaagctgga agcacgctgg gcaaagcctt ttcaacaact ttgaagggag 3120

ctcagagact ggcagcgttg ggtgacacag cctgggactt tggctccatt ggaggggtct 3180

tcaactccat aggaaaagcc gttcaccaag tgtttggtgg tgccttcaga acactctttg 3240

ggggaatgtc ttggatcaca caagggctaa tgggtgccct actactctgg atgggcgtca 3300

acgcacgaga ccgatcaatt gctttggcct tcttagccac aggaggtgtg ctcgtgttct 3360

tagcgaccaa tgtgcatgct gacactggat gtgccattga catcacaaga aaagagatga 3420

ggtgtggaag tggcatcttc gtgcacaacg acgtggaagc ctgggtggat aggtataaat 3480

atttgccaga aacgcccaga tccctagcga agatcgtcca caaagcgcac aaggaaggcg 3540

tgtgcggagt cagatctgtc actagactgg agcatcaaat gtgggaagcc gtacgggatg 3600

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tcgtagatgg acctgagaca aaggaatgcc ctgatgagca cagagcttgg aacagcatgc 3840

aaatcgaaga cttcggcttt ggcatcacat caacccgtgt gtggctgaag attagagagg 3900

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tccatagtga cttgtcgtac tggattgaga gtcgctacaa cgacacatgg aaacttgaga 4020

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acaatcggag ggaagggtat aagacacaaa accagggacc ttgggacgag aatggcatag 4200

tcttggactt tgactattgc ccagggacaa aagtcaccat tacagaggat tgtggcaaga 4260

gaggcccttc ggtcagaacc actactgaca gtggaaagtt gatcactgac tggtgctgtc 4320

gcagttgctc ccttccgccc ctacgattcc ggacagaaaa tggctgctgg tacggaatgg 4380

aaatcagacc tgttaggcat gatgaaacaa cactcgtcag atcacaggtt gatgctttta 4440

atggtgaaat ggttgaccct tttcagctgg gccttctggt gatgtttctg gccacccagg 4500

aggtccttcg caagaggtgg acggccagat tgaccattcc tgcggttttg ggggccttac 4560

ttgtgctgat gcttgggggc atcacttaca ctgatttggc gaggtatgtg gtgctagtcg 4620

ctgctgcttt cgcagaggcc aacagtggag gagacgtcct gcaccttgct ttgattgccg 4680

tttttaagat ccaaccagca tttttagtga tgaacatgct tagcacgaga tggacgaacc 4740

aagaaaacgt ggttctggtc ctaggggctg cctttttcca attggcctca gtagatctgc 4800

aaataggagt tcacggaatc ctgaatgccg ccgctatagc atggatgatt gtccgggcga 4860

tcaccttccc cacaacctcc tccgtcacca tgccagtctt agcgcttcta accccgggaa 4920

tgagggctct atacctagat acttacagaa tcatcctcct cgtcataggg atttgctctc 4980

tgctgcaaga gaggaaaaag accatggcaa aaaagaaagg agctgtactc ttgggcttag 5040

cgctcacatc cactggatgg ttttcgccca ccactatagc tgccggacta atggtctgca 5100

acccaaacaa gaagagaggg tggccagcta ctgagttttt gtcggcagtt ggattgatgt 5160

ttgccatcgt aggtggtttg gcagagttgg atattgaatc catgtcaata cccttcatgc 5220

tggcaggtct catggcagtg tcctacgtgg tgtcaggaaa agcaacagat atgtggcttg 5280

aacgggccgc cgacatcagc tgggagatgg atgctgcaat cacaggaagc agtcggaggc 5340

tggatgtgaa gctggatgaa gacggagatt ttcacttgat tgatgatccc ggtgttccat 5400

ggaaggtctg ggtcctgcgc atgtcttgca ttggcttagc cgccctcacg ccttgggcca 5460

ttgttcccgc cgcttttggt tattggctca ctttaaaaac aacaaaaaga ggaggcgtgt 5520

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gcattatggc tagagggatt cttggcactt accaggccgg cgtcggagtc atgtacgaga 5640

atgttttcca cacactatgg cacacaacta gaggagcagc cattatgagt ggagaaggaa 5700

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ggtttgatcg aaaatggaat ggaacagatg acgtgcaagt gatcgtggta gaaccgggga 5820

aggctgcagt aaacatccag acaaaaccag gggtgtttcg gactcccttc ggggaggttg 5880

gggctgttag tctggattac ccgcgaggaa catccggctc acccattctg gattccaatg 5940

gagacatcat aggcctgtac ggcaatggag ttgagcttgg cgatggttca tacgtcagcg 6000

ccatcgtgca gggtgaccgt caggaggaac cagtcccaga agcttacacc ccaaacatgt 6060

tgagaaagag acagatgact gtactagatt tgcaccctgg ttcagggaaa accaggaaaa 6120

ttctgccaca aataattaag gacgctatcc agcagcgcct aagaacagct gtgttggcac 6180

cgacgcgggt ggtagcagca gaaatggcag aagctttgag agggctccca gtacgatatc 6240

aaacttcagc agtgcagaga gagcaccaag ggaatgaaat agtggatgtg atgtgccacg 6300

ccactctgac ccatagactg atgtcaccga acagagtgcc caactacaac ctatttgtca 6360

tggatgaagc tcatttcacc gacccagcca gtatagctgc acgaggatac attgctacca 6420

aggtggaatt aggggaggca gcagccatct ttatgacagc gaccccgcct ggaaccacgg 6480

atccttttcc tgactcaaat gccccaatcc atgatttgca agatgagata ccagacaggg 6540

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caagcgtaaa aatggggaat gagattgcaa tgtgcctcca aagagcgggg aaaaaggtca 6660

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tcgactgtag aaagagcgtg aagcctacca tcttagaaga gggagaaggc agagtcatcc 6840

tcggaaaccc atcccccata accagtgcaa gcgcagctca acggaggggc agggtaggca 6900

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tagtgctcac gctagctacc ttcttcctgt gggcggcaga ggttcctgga accaagatag 7680

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agaggtcaca gacagataac caactggcgg tgtttctcat ctgtgtcttg accgtggttg 7800

gagtggtggc agcaaacgag tacgggatgc tagaaaaaac caaagcagac ctcaagagca 7860

tgtttggcgg aaagacgcag gcatcaggac tgactggatt gccaagcatg gcactggacc 7920

tgcgtccagc cacagcttgg gcactgtatg gggggagcac agtcgtgcta acccctcttc 7980

tgaagcacct gatcacgtcg gaatacgtca ccacatcgct agcctcaatt aactcacaag 8040

ctggctcatt atttgtcttg ccacgaggcg tgccttttac cgacctagac ttgaccgttg 8100

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taaaagttct ttgcccctac atgcccaagg ttatagaaaa aatggaagtt ctgcagcgcc 9180

gcttcggagg tgggctagtg cgtctccccc tgtcccgcaa ctccaatcac gagatgtatt 9240

gggttagtgg agccgctggc aatgtggtgc acgctgtgaa catgaccagc caggtactac 9300

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agagaatcca gaagcttaaa gaagaattcg ccacaacgtg gcacaaagac cctgagcatc 9480

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ccaccatggc catgactgac accaccccgt ttggacagca aagagttttc aaggagaaag 9660

ttgacacgaa ggctcctgag ccaccagctg gagccaagga agtgctcaac gagaccacca 9720

actggctgtg ggcctacttg tcacgggaaa aaagaccccg cttgtgcacc aaggaagaat 9780

tcataaagaa agtcaatagc aacgcggctc ttggagcagt gttcgctgaa cagaatcaat 9840

ggagcacggc gcgtgaggct gtggatgacc cgcggttttg ggagatggtt gatgaagaga 9900

gggaaaacca tctgcgagga gagtgtcaca catgtatcta taacatgatg ggaaaaagag 9960

agaagaagcc tggagagttt ggaaaagcta aaggaagcag ggccatttgg ttcatgtggc 10020

ttggagcacg gtatctagag tttgaagctt tggggttcct gaatgaagac cattggctga 10080

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ccaggatggc gatcagcgga gacgactgtg tcgtcaagcc gctggacgac agattcgcca 10620

cggccctcca cttcctcaac gcaatgtcaa aggtcagaaa ggacatccag gaatggaagc 10680

cttcgcatgg ctggcacgac tggcagcaag ttcccttctg ctctaaccat tttcaggaga 10740

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caaatgcgat ttgctcagca gtgccagtgg attgggtgcc cacgggcagg acatcctggt 10980

cgatacactc gaaaggagag tggatgacca cagaagacat gctgcaggtc tggaacagag 11040

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ttccgtacgt gggaaagcgt gaggacatct ggtgtggcag cctcatcgga acgcgatcca 11160

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aagaaaatta tgttgactac atgacctcac tcaggagata cgaagacgtc ttgatccagg 11280

aagacagggt catctagtgt gatttaaggt agaaaagtag actatgtaaa taatgtaaat 11340

gagaaaatgc atgcatatgg agtcaggcca gcaaaagctg ccaccggata ctgggtagac 11400

ggtgctgcct gcgtctcagt cccaggagga ctgggttaac aaatctgaca acagaaagtg 11460

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atcaaacagc atattgacac ctgggaatag actgggagat cttctgctct atctcaacat 11820

cagctactag gcacagagcg ccgaagtatg tagctggtgg tgagtaagaa cacaggatct 11880

ggtacccatc gatgataagc tgtcaaacat gagaatccgt aatcatggtc atagctgttt 11940

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 12000

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 12060

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 12120

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt 12180

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 12240

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 12300

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 12360

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 12420

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 12480

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 12540

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 12600

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 12660

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 12720

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 12780

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 12840

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 12900

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 12960

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 13020

ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 13080

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 13140

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 13200

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 13260

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 13320

cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 13380

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 13440

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 13500

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 13560

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 13620

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 13680

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 13740

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct tcaagaattg acagtaagac 13800

gggtaagcct gttgatgata ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct 13860

gtcacgggat aatccgaagt ggtcagactg gaaaatcaga gggcaggaac tgcagaacag 13920

caaaaagtca gatagcacca catagcagac ccgccataaa acgccctgag aagcccgtga 13980

cgggcttttc ttgtattatg ggtagtttcc ttgcatgaat ccataaaagg cgcctgtagt 14040

gccatttacc cccattcact gccagagccg tgagcgcagc gaactgaatg tcacgaaaaa 14100

gacagcgact caggtgcctg atggtcggag acaaaaggaa tattcagcga tttgcccgag 14160

cttgcgaggg tgctacttaa gcctttaggg ttttaaggtc tgttttgtag aggagcaaac 14220

agcgtttgcg acatcctttt gtaatactgc ggaactgact aaagtagtga gttatacaca 14280

gggctgggat ctattctttt tatctttttt tattctttct ttattctata aattataacc 14340

acttgaatat aaacaaaaaa aacacacaaa ggtctagcgg aatttacaga gggtctagca 14400

gaatttacaa gttttccagc aaaggtctag cagaatttac agatacccac aactcaaagg 14460

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ctagaccaat tgagatgtat gtctgaatta gttgttttca aagcaaatga actagcgatt 14580

agtcgctatg acttaacgga gcatgaaacc aagctaattt tatgctgtgt ggcactactc 14640

aaccccacga ttgaaaaccc tacaaggaaa gaacggacgg tatcgttcac ttataaccaa 14700

tacgctcaga tgatgaacat cagtagggaa aatgcttatg gtgtattagc taaagcaacc 14760

agagagctga tgacgagaac tgtggaaatc aggaatcctt tggttaaagg ctttgagatt 14820

ttccagtgga caaactatgc caagttctca agcgaaaaat tagaattagt ttttagtgaa 14880

gagatattgc cttatctttt ccagttaaaa aaattcataa aatataatct ggaacatgtt 14940

aagtcttttg aaaacaaata ctctatgagg atttatgagt ggttattaaa agaactaaca 15000

caaaagaaaa ctcacaaggc aaatatagag attagccttg atgaatttaa gttcatgtta 15060

atgcttgaaa ataactacca tgagtttaaa aggcttaacc aatgggtttt gaaaccaata 15120

agtaaagatt taaacactta cagcaatatg aaattggtgg ttgataagcg aggccgcccg 15180

actgatacgt tgattttcca agttgaacta gatagacaaa tggatctcgt aaccgaactt 15240

gagaacaacc agataaaaat gaatggtgac aaaataccaa caaccattac atcagattcc 15300

tacctacgta acggactaag aaaaacacta cacgatgctt taactgcaaa aattcagctc 15360

accagttttg aggcaaaatt tttgagtgac atgcaaagta agcatgatct caatggttcg 15420

ttctcatggc tcacgcaaaa acaacgaacc acactagaga acatactggc taaatacgga 15480

aggatctgag gttcttatgg ctcttgtatc tatcagtgaa gcatcaagac taacaaacaa 15540

aagtagaaca actgttcacc gttacatatc aaagggaaaa ctgtccatat gcacagatga 15600

aaacggtgta aaaaagatag atacatcaga gcttttacga gtttttggtg cattcaaagc 15660

tgttcaccat gaacagatcg acaatgtaac agatgaacag catgtaacac ctaatagaac 15720

aggtgaaacc agtaaaacaa agcaactaga acatgaaatt gaacacctga gacaacttgt 15780

tacagctcaa cagtcacaca tagacagcct gaaacaggcg atgctgctta tcgaatcaaa 15840

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ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 16020

ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc 16080

atgcctgcag gtcgacggta atacgactca ctatag 16116

<210> 11

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

catggacgag ctgtacaagc tcgagcagct gttgaatttt gaccttctca agctggcggg 60

agacgtcgag tccaaccctg ggccaatgac taaaaaacca ggagggcccg gtaaaaaccg 120

ggctatcaag atgctgaaac 140

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

catggacgag ctgtacaagc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtttcagcat cttgatagcc c 21

<210> 14

<211> 2110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gggctatcaa gatgctgaaa cgcggcctac cccgcgtatt cccactagtg ggagtgaaga 60

gggtagtaat gagcttgttg gacggcagag ggccagtacg tttcgtgctg gctcttatca 120

cgttcttcaa gtttacagca ttagccccga ccaaggcgct tttaggccga tggaaagcag 180

tggaaaagag tgtagcaatg aaacatctca ctagtttcaa acgagaactt ggaacactca 240

ttgacgccgt gaacaagcgg ggcagaaagc aaaacaaaag aggaggaaat gaaggctcaa 300

tcatgtggct cgcgagcttg gcagttgtca tagcttgtgc aggagccatg aagttgtcaa 360

atttccaggg gaagcttttg atgaccatta acaacacgga cattgcagac gttatcgtga 420

ttcccacctc aaaaggagag aacagatgct gggtccgggc aatcgacgtc ggctacatgt 480

gtgaggacac tatcacgtac gaatgtccta agcttaccat gggcaatgat ccagaggatg 540

tggattgctg gtgtgacaac caagaagtct acgtccaata tggacggtgc acgcggacca 600

ggcattccaa gcgaagcagg agatccgtgt cggtccaaac acatggggag agttcactag 660

tgaataaaaa agaggcttgg ctggattcaa cgaaagccac acgatatctc atgaaaactg 720

agaactggat cataaggaat cctggctatg ctttcctggc ggcggtactt ggctggatgc 780

ttggcagtaa caacggtcaa cgcgtggtat tcaccatcct cctgctgctg gtcgctccgg 840

cttacagttt taattgtctg ggaatgggca atcgtgactt catagaagga gccagtggag 900

ccacttgggt ggacttggtg ctagaaggag atagctgctt gacaattatg gcaaacgaca 960

aaccaacatt ggacgtccgc atgatcaaca tcgaagctag ccaacttgct gaggtcagaa 1020

gttactgtta tcatgcttca gtcactgaca tctcgacggt ggctcggtgc cccacgactg 1080

gagaagccca caacgagaag cgagctgata gtagctatgt gtgcaaacaa ggcttcactg 1140

atcgtgggtg gggcaacgga tgtggacttt tcgggaaggg aagcattgac acatgtgcaa 1200

aattctcctg caccagtaaa gcgattggga gaacaatcca gccagaaaac atcaaatacg 1260

aagttggcat ttttgtgcat ggaaccacca cttcggaaaa ccatgggaat tattcagcgc 1320

aagttggggc gtcccaggcg gcaaagttta cagtaacacc caatgctcct tcgataaccc 1380

tcaaacttgg tgactacgga gaagtcacac tggactgtga gccaaggagt ggactgaaca 1440

ctgaagcgtt ttacgtcatg accgtggggt caaagtcatt tctggtccat agggaatggt 1500

ttcatgacct cgctctcccc tggacgtccc cttcgagcac agcgtggaga aacagagaac 1560

tcctcatgga gtttgaagag gcgcacgcca caaaacagtc cgttgttgct cttgggtcac 1620

aggaaggagg cctccatcag gcgttggcag gagccatcgt ggtggagtac tcaagctcag 1680

tgaagttaac atcaggccac ctgaaatgta ggctgaaaat ggacaaactg gctctgaaag 1740

gcacaaccta tggcatgtgc acagaaaaat tctcgttcgc gaaaaatccg gcggacactg 1800

gtcacggaac agttgtcatt gaactctcct actctgggag tgatggcccc tgcaaaattc 1860

cgattgtctc cgttgcgagc ctcaatgaca tgacccccgt tgggcggctg gtgacagtga 1920

accccttcgt cgcgacttcc agtgccaatt caaaggtgct ggtcgagatg gaacccccct 1980

tcggagactc ctacatcgta gttggaaggg gagacaagca gatcaaccac cattggcaca 2040

aagctggaag cacgctgggc aaagcctttt caacaacttt gaagggagct cagagactgg 2100

cagcgttggg 2110

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gggctatcaa gatgctgaaa c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccaacgctg ccagtctctg 20

<210> 17

<211> 16116

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt 60

gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg 120

gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccgcgtattc ccactagtgg 180

gagtgaagag ggtagtaatg agcttgttgc ggccgatggt gagcaagggc gaggagctgt 240

tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 300

gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 360

gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 420

tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 480

tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 540

cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 600

tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagat ggagtacaac tacaacagcc 660

acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 720

gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 780

tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 840

gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 900

ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agctcgagca gctgttgaat tttgaccttc 960

tcaagctggc gggagacgtc gagtccaacc ctgggccaat gactaaaaaa ccaggagggc 1020

ccggtaaaaa ccgggctatc aagatgctga aacgcggcct accccgcgta ttcccactag 1080

tgggagtgaa gagggtagta atgagcttgt tggacggcag agggccagta cgtttcgtgc 1140

tggctcttat cacgttcttc aagtttacag cattagcccc gaccaaggcg cttttaggcc 1200

gatggaaagc agtggaaaag agtgtagcaa tgaaacatct cactagtttc aaacgagaac 1260

ttggaacact cattgacgcc gtgaacaagc ggggcagaaa gcaaaacaaa agaggaggaa 1320

atgaaggctc aatcatgtgg ctcgcgagct tggcagttgt catagcttgt gcaggagcca 1380

tgaagttgtc aaatttccag gggaagcttt tgatgaccat taacaacacg gacattgcag 1440

acgttatcgt gattcccacc tcaaaaggag agaacagatg ctgggtccgg gcaatcgacg 1500

tcggctacat gtgtgaggac actatcacgt acgaatgtcc taagcttacc atgggcaatg 1560

atccagagga tgtggattgc tggtgtgaca accaagaagt ctacgtccaa tatggacggt 1620

gcacgcggac caggcattcc aagcgaagca ggagatccgt gtcggtccaa acacatgggg 1680

agagttcact agtgaataaa aaagaggctt ggctggattc aacgaaagcc acacgatatc 1740

tcatgaaaac tgagaactgg atcataagga atcctggcta tgctttcctg gcggcggtac 1800

ttggctggat gcttggcagt aacaacggtc aacgcgtggt attcaccatc ctcctgctgc 1860

tggtcgctcc ggcttacagt tttaattgtc tgggaatggg caatcgtgac ttcatagaag 1920

gagccagtgg agccacttgg gtggacttgg tgctagaagg agatagctgc ttgacaatta 1980

tggcaaacga caaaccaaca ttggacgtcc gcatgatcaa catcgaagct agccaacttg 2040

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acacatgtgc aaaattctcc tgcaccagta aagcgattgg gagaacaatc cagccagaaa 2280

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gaaacagaga actcctcatg gagtttgaag aggcgcacgc cacaaaacag tccgttgttg 2640

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tggtgacagt gaaccccttc gtcgcgactt ccagtgccaa ttcaaaggtg ctggtcgaga 3000

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tcaactccat aggaaaagcc gttcaccaag tgtttggtgg tgccttcaga acactctttg 3240

ggggaatgtc ttggatcaca caagggctaa tgggtgccct actactctgg atgggcgtca 3300

acgcacgaga ccgatcaatt gctttggcct tcttagccac aggaggtgtg ctcgtgttct 3360

tagcgaccaa tgtgcatgct gacactggat gtgccattga catcacaaga aaagagatga 3420

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agagcactga cgagtgtgat ggagcgatca taggtacggc tgtcaaagga catgtggcag 3960

tccatagtga cttgtcgtac tggattgaga gtcgctacaa cgacacatgg aaacttgaga 4020

gggcagtctt tggagaggtt aaatcttgca cttggccaga gacacacacc ctatggggag 4080

atggtgttga ggaaagtgaa ctcatcattc cgcataccat agccggacca aaaagcaagc 4140

acaatcggag ggaagggtat aagacacaaa accagggacc ttgggacgag aatggcatag 4200

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aaatcagacc tgttaggcat gatgaaacaa cactcgtcag atcacaggtt gatgctttta 4440

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ttgtgctgat gcttgggggc atcacttaca ctgatttggc gaggtatgtg gtgctagtcg 4620

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tttttaagat ccaaccagca tttttagtga tgaacatgct tagcacgaga tggacgaacc 4740

aagaaaacgt ggttctggtc ctaggggctg cctttttcca attggcctca gtagatctgc 4800

aaataggagt tcacggaatc ctgaatgccg ccgctatagc atggatgatt gtccgggcga 4860

tcaccttccc cacaacctcc tccgtcacca tgccagtctt agcgcttcta accccgggaa 4920

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tggatgtgaa gctggatgaa gacggagatt ttcacttgat tgatgatccc ggtgttccat 5400

ggaaggtctg ggtcctgcgc atgtcttgca ttggcttagc cgccctcacg ccttgggcca 5460

ttgttcccgc cgcttttggt tattggctca ctttaaaaac aacaaaaaga ggaggcgtgt 5520

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gagacatcat aggcctgtac ggcaatggag ttgagcttgg cgatggttca tacgtcagcg 6000

ccatcgtgca gggtgaccgt caggaggaac cagtcccaga agcttacacc ccaaacatgt 6060

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aggtggaatt aggggaggca gcagccatct ttatgacagc gaccccgcct ggaaccacgg 6480

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cgtggagcag tggatacgaa tggatcacag aatatgcggg aaaaaccgtg tggtttgtgg 6600

caagcgtaaa aatggggaat gagattgcaa tgtgcctcca aagagcgggg aaaaaggtca 6660

tccaactcaa ccgcaagtcc tatgacacag aatacccaaa atgtaagaat ggagactggg 6720

attttgtcat caccaccgac atctctgaaa tgggggccaa cttcggtgcg agcagggtca 6780

tcgactgtag aaagagcgtg aagcctacca tcttagaaga gggagaaggc agagtcatcc 6840

tcggaaaccc atcccccata accagtgcaa gcgcagctca acggaggggc agggtaggca 6900

gaaaccccaa ccaggttgga gatgaatacc actatggggg ggccaccagt gaagatgaca 6960

gtaatctagc ccattggaca gaggcaaaga tcatgttaga caacatacac atgcccaatg 7020

gactggtggc ccagctctat ggaccagaga gggaaaaggc cttcacaatg gatggcgaat 7080

accgtctcag aggtgaagaa aagaaaaact tcttagagct gcttaggacg gctgacctcc 7140

cggtgtggct ggcctacaag gtggcgtcca atggcattca gtacaccgac agaaagtggt 7200

gttttgatgg gccgcgcacg aatgccatac tggaggacaa caccgaggta gagatagtca 7260

cccggatggg tgagaggaaa atcctcaagc cgagatggct tgatgcaaga gtttatgcag 7320

atcaccaagc cctcaagtgg ttcaaagact tcgcagcagg aaagagatca gccgttagct 7380

tcatagaggt gctcggtcgt atgcctgagc atttcatggg aaagacgcgg gaagctttag 7440

acaccatgta cttggttgca acggctgaga aaggtgggaa agcacaccga atggctctcg 7500

aagagctgcc agatgcactg gaaaccatta cacttattgt tgctatcact gtgatgacag 7560

gaggattctt tctactcatg atgcagcgaa agggtatagg gaagatgggt cttggtgctc 7620

tagtgctcac gctagctacc ttcttcctgt gggcggcaga ggttcctgga accaagatag 7680

cagggaccct gctgatcgcc ctgctgctta tggtggttct catcccagaa ccggaaaaac 7740

agaggtcaca gacagataac caactggcgg tgtttctcat ctgtgtcttg accgtggttg 7800

gagtggtggc agcaaacgag tacgggatgc tagaaaaaac caaagcagac ctcaagagca 7860

tgtttggcgg aaagacgcag gcatcaggac tgactggatt gccaagcatg gcactggacc 7920

tgcgtccagc cacagcttgg gcactgtatg gggggagcac agtcgtgcta acccctcttc 7980

tgaagcacct gatcacgtcg gaatacgtca ccacatcgct agcctcaatt aactcacaag 8040

ctggctcatt atttgtcttg ccacgaggcg tgccttttac cgacctagac ttgaccgttg 8100

gcctcgtctt ccttggctgt tggggtcaaa tcaccctcac aacgtttttg acagccatgg 8160

ttctggcgac acttcactat gggtacatgc tccctggatg gcaagcagaa gcactcaggg 8220

ctgcccagag aaggacagcg gctggaataa tgaagaatgc cgttgttgac ggaatggtcg 8280

ccactgatgt gcctgaactg gaaaggacca ctcctctgat gcaaaagaaa gtcggacagg 8340

tgctcctcat aggggtaagc gtggcagcgt tcctcgtcaa ccccaatgtc accactgtga 8400

gagaagcagg ggtgttggtg acggcggcta cgctcacttt gtgggacaat ggagccagtg 8460

ccgtttggaa ttccaccact gccacgggac tctgccatgt aatgcgaggt agctacctgg 8520

ctggaggctc cattgcttgg actctcatca agaacgctga caagccctcc ttgaaaaggg 8580

gaaggcctgg gggcaggacg ctaggggagc agtggaagga aaaactaaat gccatgagca 8640

gagaagagtt ttttaaatac cggagagagg ccataatcga ggtggaccgc actgaagcac 8700

gcagggctag acgtgaaaat aacatagtgg gaggacatcc ggtttcgcga ggctcagcaa 8760

aactccgttg gctcgtggag aaaggatttg tctcgccaat aggaaaagtc attgatctag 8820

ggtgtgggcg tggaggatgg agctactacg cagcaaccct gaagaaggtc caggaagtca 8880

gaggatacac gaaaggtggg gcgggacatg aagaaccgat gctcatgcag agctacggct 8940

ggaacctggt ctccctgaag agtggagtgg acgtgtttta caaaccttca gagcccagtg 9000

acactctgtt ctgcgacata ggggaatcct ccccaagtcc agaagtagaa gaacaacgca 9060

cattacgcgt cctagagatg acatctgact ggttgcaccg aggacctaga gagttctgca 9120

taaaagttct ttgcccctac atgcccaagg ttatagaaaa aatggaagtt ctgcagcgcc 9180

gcttcggagg tgggctagtg cgtctccccc tgtcccgcaa ctccaatcac gagatgtatt 9240

gggttagtgg agccgctggc aatgtggtgc acgctgtgaa catgaccagc caggtactac 9300

tggggcgaat ggatcgcaca gtgtggagag ggccaaagta tgaggaagat gtcaacctag 9360

ggagcggaac aagagccgtg ggaaagggag aagtccatag caatcaggag aaaatcaaga 9420

agagaatcca gaagcttaaa gaagaattcg ccacaacgtg gcacaaagac cctgagcatc 9480

cataccgcac ttggacatac cacggaagct atgaagtgaa ggctactggc tcagctagct 9540

ctctcgtcaa cggagtggtg aagctcatga gcaaaccttg ggacgccatt gccaacgtca 9600

ccaccatggc catgactgac accaccccgt ttggacagca aagagttttc aaggagaaag 9660

ttgacacgaa ggctcctgag ccaccagctg gagccaagga agtgctcaac gagaccacca 9720

actggctgtg ggcctacttg tcacgggaaa aaagaccccg cttgtgcacc aaggaagaat 9780

tcataaagaa agtcaatagc aacgcggctc ttggagcagt gttcgctgaa cagaatcaat 9840

ggagcacggc gcgtgaggct gtggatgacc cgcggttttg ggagatggtt gatgaagaga 9900

gggaaaacca tctgcgagga gagtgtcaca catgtatcta taacatgatg ggaaaaagag 9960

agaagaagcc tggagagttt ggaaaagcta aaggaagcag ggccatttgg ttcatgtggc 10020

ttggagcacg gtatctagag tttgaagctt tggggttcct gaatgaagac cattggctga 10080

gccgagagaa ttcaggaggt ggagtggaag gctcaggcgt ccaaaagctg ggatacatcc 10140

tccgtgacat agcaggaaag caaggaggga aaatgtacgc tgatgatacc gccgggtggg 10200

acactagaat taccagaact gatttagaaa atgaagctaa ggtgctggag cttctagatg 10260

gtgaacaccg catgctcgcc cgagccataa ttgaattgac ttacaggcac aaagtggtca 10320

aggtcatgag acctgcagca gaaggaaaga ccgtgatgga cgtgatatca agagaagatc 10380

aaagggggag tggacaggtg gtcacttatg ctcttaacac tttcacgaac atcgctgtcc 10440

agctcgtcag gctgatggag gctgaggggg tcattggacc acaacacttg gaacagctac 10500

ctagaaaaaa caagatagct gtcaggacct ggctctttga gaatggagag gagagagtga 10560

ccaggatggc gatcagcgga gacgactgtg tcgtcaagcc gctggacgac agattcgcca 10620

cggccctcca cttcctcaac gcaatgtcaa aggtcagaaa ggacatccag gaatggaagc 10680

cttcgcatgg ctggcacgac tggcagcaag ttcccttctg ctctaaccat tttcaggaga 10740

ttgtgatgaa agatggaagg agtatcgttg tcccgtgcag aggacaggat gagctgatag 10800

gcagggctcg catctcccca ggagctggat ggaatgtgaa ggacacagct tgtctggcca 10860

aagcatatgc acagatgtgg ctactcctat acttccatcg tagggacttg cgtctcatgg 10920

caaatgcgat ttgctcagca gtgccagtgg attgggtgcc cacgggcagg acatcctggt 10980

cgatacactc gaaaggagag tggatgacca cagaagacat gctgcaggtc tggaacagag 11040

tctggattga agaaaatgaa tggatgatgg acaagactcc aatcacaagc tggacagacg 11100

ttccgtacgt gggaaagcgt gaggacatct ggtgtggcag cctcatcgga acgcgatcca 11160

gagcaacctg ggctgagaac atctacgcgg cgataaacca ggttagagct gtcattggga 11220

aagaaaatta tgttgactac atgacctcac tcaggagata cgaagacgtc ttgatccagg 11280

aagacagggt catctagtgt gatttaaggt agaaaagtag actatgtaaa taatgtaaat 11340

gagaaaatgc atgcatatgg agtcaggcca gcaaaagctg ccaccggata ctgggtagac 11400

ggtgctgcct gcgtctcagt cccaggagga ctgggttaac aaatctgaca acagaaagtg 11460

agaaagccct cagaaccgtc tcggaagcag gtccctgctc actggaagtt gaaggaccaa 11520

cgtcaggcca caaatttgtg ccactccgct ggggagtgcg gcctgcgcag ccccaggagg 11580

actgggttac caaagccgtt gaggccccca cggcccaagc ctcgtctagg atgcaataga 11640

cgaggtgtaa ggactagagg ttagaggaga ccccgtggaa acaacaacat gcggcccaag 11700

ccccctcgaa gctgtagagg aggtggaagg actagaggtt agaggagacc ccgcatttgc 11760

atcaaacagc atattgacac ctgggaatag actgggagat cttctgctct atctcaacat 11820

cagctactag gcacagagcg ccgaagtatg tagctggtgg tgagtaagaa cacaggatct 11880

ggtacccatc gatgataagc tgtcaaacat gagaatccgt aatcatggtc atagctgttt 11940

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 12000

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 12060

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 12120

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt 12180

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 12240

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 12300

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 12360

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 12420

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 12480

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 12540

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 12600

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 12660

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 12720

accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 12780

ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 12840

gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 12900

agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 12960

ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 13020

ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 13080

gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 13140

ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 13200

tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 13260

tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 13320

cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 13380

tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 13440

gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 13500

tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 13560

ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 13620

attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 13680

cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 13740

taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct tcaagaattg acagtaagac 13800

gggtaagcct gttgatgata ccgctgcctt actgggtgca ttagccagtc tgaatgacct 13860

gtcacgggat aatccgaagt ggtcagactg gaaaatcaga gggcaggaac tgcagaacag 13920

caaaaagtca gatagcacca catagcagac ccgccataaa acgccctgag aagcccgtga 13980

cgggcttttc ttgtattatg ggtagtttcc ttgcatgaat ccataaaagg cgcctgtagt 14040

gccatttacc cccattcact gccagagccg tgagcgcagc gaactgaatg tcacgaaaaa 14100

gacagcgact caggtgcctg atggtcggag acaaaaggaa tattcagcga tttgcccgag 14160

cttgcgaggg tgctacttaa gcctttaggg ttttaaggtc tgttttgtag aggagcaaac 14220

agcgtttgcg acatcctttt gtaatactgc ggaactgact aaagtagtga gttatacaca 14280

gggctgggat ctattctttt tatctttttt tattctttct ttattctata aattataacc 14340

acttgaatat aaacaaaaaa aacacacaaa ggtctagcgg aatttacaga gggtctagca 14400

gaatttacaa gttttccagc aaaggtctag cagaatttac agatacccac aactcaaagg 14460

aaaaggacta gtaattatca ttgactagcc catctcaatt ggtatagtga ttaaaatcac 14520

ctagaccaat tgagatgtat gtctgaatta gttgttttca aagcaaatga actagcgatt 14580

agtcgctatg acttaacgga gcatgaaacc aagctaattt tatgctgtgt ggcactactc 14640

aaccccacga ttgaaaaccc tacaaggaaa gaacggacgg tatcgttcac ttataaccaa 14700

tacgctcaga tgatgaacat cagtagggaa aatgcttatg gtgtattagc taaagcaacc 14760

agagagctga tgacgagaac tgtggaaatc aggaatcctt tggttaaagg ctttgagatt 14820

ttccagtgga caaactatgc caagttctca agcgaaaaat tagaattagt ttttagtgaa 14880

gagatattgc cttatctttt ccagttaaaa aaattcataa aatataatct ggaacatgtt 14940

aagtcttttg aaaacaaata ctctatgagg atttatgagt ggttattaaa agaactaaca 15000

caaaagaaaa ctcacaaggc aaatatagag attagccttg atgaatttaa gttcatgtta 15060

atgcttgaaa ataactacca tgagtttaaa aggcttaacc aatgggtttt gaaaccaata 15120

agtaaagatt taaacactta cagcaatatg aaattggtgg ttgataagcg aggccgcccg 15180

actgatacgt tgattttcca agttgaacta gatagacaaa tggatctcgt aaccgaactt 15240

gagaacaacc agataaaaat gaatggtgac aaaataccaa caaccattac atcagattcc 15300

tacctacgta acggactaag aaaaacacta cacgatgctt taactgcaaa aattcagctc 15360

accagttttg aggcaaaatt tttgagtgac atgcaaagta agcatgatct caatggttcg 15420

ttctcatggc tcacgcaaaa acaacgaacc acactagaga acatactggc taaatacgga 15480

aggatctgag gttcttatgg ctcttgtatc tatcagtgaa gcatcaagac taacaaacaa 15540

aagtagaaca actgttcacc gttacatatc aaagggaaaa ctgtccatat gcacagatga 15600

aaacggtgta aaaaagatag atacatcaga gcttttacga gtttttggtg cattcaaagc 15660

tgttcaccat gaacagatcg acaatgtaac agatgaacag catgtaacac ctaatagaac 15720

aggtgaaacc agtaaaacaa agcaactaga acatgaaatt gaacacctga gacaacttgt 15780

tacagctcaa cagtcacaca tagacagcct gaaacaggcg atgctgctta tcgaatcaaa 15840

gctgccgaca acacgggagc cagtgacgcc tcccgtgggg aaaaaatcat ggcaattctg 15900

gaagaaatag cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg 15960

ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg 16020

ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg ccaagcttgc 16080

atgcctgcag gtcgacggta atacgactca ctatag 16116

Claims (6)

1.一种稳定携带绿色荧光蛋白基因的乙型脑炎病毒全长感染性克隆，其序列为SEQ IDNO.17所示。

2.权利要求1所述的全长感染性克隆制备的重组病毒。

3.权利要求1所述的全长感染性克隆的制备方法，包括：

以携带有EGFP的JEV全长感染性克隆质粒pJEFL-EGFP为模板，使用SEQ ID NO:12和SEQID NO:13所示引物扩增片段SEQ ID NO:11；使用SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示引物扩增片段SEQ ID NO：14；按常规方式检测回收扩增出的DNA片段；

所述的pJEFL-EGFP序列为SEQ ID NO：10所示；

使用XhoI+SacI酶切，然后采用Vazyme同源重组试剂盒将SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14片段插入到pJEFL-EGFP，将重组产物转化感受态HB101，PCR鉴定为阳性的克隆进行培养并抽提质粒进行测序，测序正确的克隆命名为pJEFL-EGFP-N15K，其序列为SEQ ID NO:17所示。

4.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求2所述的重组病毒在制备研究脑神经环路药物中的应用。

5.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求2所述的重组病毒在制备筛选抗乙型脑炎病毒药物的试剂中的应用。

6.权利要求1所述的全长感染性克隆或权利要求2所述的重组病毒在制备研究乙型脑炎病毒抗原表位药物中的应用。