CN113462721B - 质粒、干细胞及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种TALEN/TALENickase介导的非病毒基因打靶质粒，N端融合异亮氨酸拉链的TRAIL表达框整合的iPSCs干细胞及其应用。所述质粒的序列如SEQ ID NO.1所示，所述质粒与基因编辑工具TALEN联合可实现治疗基因TRAIL的定点整合，规避病毒载体随机整合带来的风险，确保治疗基因表达的持续性和高水平。本发明以定点整合TRAIL的iPSCs作为MSCs的来源，克服了组织来源的MSCs的局限性，可源源不断获得，具有适用性和经济价值。TRAIL‑iMSCs可持续性表达TRAIL，对多种肿瘤细胞都具有诱导凋亡的效果，表现出抗肿瘤的应用潜力。

Description

质粒、干细胞及应用

技术领域

本发明涉及一种TALEN/TALENickase介导的非病毒基因质粒，将N端融合异亮氨酸拉链(isoleucine zipper)的TRAIL表达框架整合的iPSCs干细胞及其应用。

背景技术

基于间充质干细胞(Mesenchymal stem/stromal cells,MSCs)对肿瘤微环境的趋向性和低免疫原性，天然MSCs和基因修饰的MSCs都被广泛用于肿瘤的治疗研究与应用。现有的大量研究表明利用病毒载体基因转导的MSCs靶向治疗癌症是有效的。然而，成体器官组织来源的MSCs在体外连续传代后的多能性和增殖能力丧失、治疗基因的非持续性表达或表达不足、病毒基因组插入的潜在风险，都严重阻碍了其临床应用。我们的策略规避了病毒的风险和原代MSCs的局限，设计构建了TRAIL定点整合的人诱导多能干细胞，并制备了具有抑瘤效果的TRAIL-MSCs治疗剂。本策略具备为不同病人个体化需求提供来源无限、质量稳定、同质性高、相对可控的TRAIL整合间充质干细胞的优势，可实现产业化制备，具有临床应用和市场前景广阔的特点。

近些年来，癌症治疗的临床前研究和临床实验都对以细胞为基础的治疗策略抱有极大的热情。其中，间充质干细胞(MSCs)由于具有对原位及转移肿瘤的趋向性及低免疫原性等优点而成为一种用于向恶性肿瘤细胞输送抗癌基因/药物的优秀细胞载体，被广泛用于体外和体内癌症模型和临床试验^[1-2]。大量研究表明基因修饰的MSCs通过携带自杀基因、抗癌基因或溶瘤腺病毒等靶向治疗癌症是一种有效的策略^[3]。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF超家族成员之一，其可通过激活特异性受体(DR4/DR5)选择性地优先诱导肿瘤细胞发生凋亡，而对正常细胞无毒性作用，因此是一种具有潜力的抗癌分子^[4-5]。现有大量研究证明TRAIL工程化的MSCs能够靶向肿瘤微环境，并在多种癌症中有效发挥抗癌活性。病毒载体是一种最常用的的基因治疗载体，被广泛应用于癌症治疗的临床试验中，越来越多的研究表明利用病毒载体将治疗基因TRAIL装载到MSCs是有效的^[6-7]。但这些研究显示，治疗基因存在非持续性表达或表达不足的缺陷。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是由成体细胞通过重编程技术诱导获得的多能干细胞，能够的在体外大量培养扩增，并可通过定向诱导分化持续产生大量的不同类型细胞用于临床研究和治疗^[9-10]。因此，iPSCs逐渐成为获得MSCs的最佳来源。iPSC衍生的MSCs具有iPSC相似的优势：(1)可从自体皮肤成纤维细胞或各种组织来源的细胞诱导而成，避免了异体移植产生的免疫排斥、疾病传染、伦理等相关问题；(2)iPSC从原理上来说可以无限传代，故其衍生的MSCs同样可以源源不断的获得；(3)理论上由单个iPSC细胞克隆衍生的MSCs，其同质性更高。基于以上特点，iPSC可作为满足病人个体化需求的无限MSCs来源，解决临床使用中间充质干细胞来源有限、质量不稳定、同质性不高的障碍。

基于iPSCs衍生MSCs已用于多项临床试验，包括移植物抗宿主病(GvHD)，严重肢体缺血(CLI)和骨关节炎以及COVID-19重症监护病房(ICU)患者等，证实了iPSCs衍生MSCs是安全且耐受性良好的^[11]。揭示了iPSCs衍生MSCs具有广阔的应用范围和市场前景，目前没有基因修饰的iPSCs衍生MSCs近入临床试验的相关报道。

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发明内容

本发明提供了一种TALEN/TALENickase介导的非病毒基因质粒，将N端融合异亮氨酸拉链(isoleucine zipper)的TRAIL表达框架整合的iPSCs干细胞及其应用

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种质粒，所述质粒的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述质粒以人rDNA转录区5468位点上下游+4533至+6064全长1531bp的一段序列作为同源臂序列，左侧同源臂(LHA)长度为935bp，右侧同源臂(RHA)为596bp；两同源臂之间包含一个两侧有一对loxP序列的无启动子的筛选基因NEO表达框。

一种构建质粒的方法，所述质粒是以非病毒的人核糖体DNA(hrDNA)靶向载体为骨架，将CMV启动子驱动的ILZ-TRAIL(AA.114-281)表达框插入到骨架的限制性酶切位点，构建得到。

优选的，所述非病毒的人核糖体DNA靶向载体为mini-pHrneo。

已公开的学位论文(刘博.人iPSCs核糖体基因区IL24基因打靶及其分化MSCs的抗肿瘤研究[D].长沙：中南大学，2017：19-25)中公开过非病毒的人核糖体DNA(hrDNA)靶向载体mini-pHrneo的具体结构。

本发明采用这个骨架的原因是，此载体明显缩短了同源臂，相比于其他的非病毒载体。由此，将得到合适大小的质粒，比一般的质粒小，由此提高打靶效率。但质粒也不能过小，否则打靶难度增加。

所述限制性酶切位点可以为BamH1、Nhe1、Xba1等常规限制性酶对应的酶切位点，如图18所示。

优选的，其他的TRAIL变体也可实现构建rDNA区的定点整合，例如TRAIL变体如IZ-TRAIL,TNC-TRAIL,HSA-TRAIL,PEG-TRAIL,Fc-sc-TRAIL等N端融合的形式，有助于提高TRAIL的稳定性和杀伤能力。TRAIL的受体高亲和变体如具有DR4高亲和力的含单氨基酸突变S159R的TRAIL变体、具有DR5高亲和力的含氨基酸突变D269H的TRAIL变体等。以上TRAIL变体都可用本发明的技术路线实现在rDNA区的定点整合，具有一定的抑瘤效果。

但ILZ-TRAIL(AA.114-281)抑瘤效果强于sTRAIL(AA.114-281)，原因是：

ILZ的融合可以促进并稳定TRAIL三聚体化，提高对肿瘤细胞的毒性。而且本发明也通过多次试验证明了这一点。

一种人诱导多潜能干细胞TRAIL-iPSCs，所述干细胞TRAIL-iPSCs的保藏号为CCTCC NO:2021120，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年5月12日，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学。

一种构建上述干细胞TRAIL-iPSCs的方法，用上述质粒对iPSCs(诱导多能干细胞)进行单细胞核转，得到。

一种定向分化细胞，所述定向分化细胞由干细胞TRAIL-iPSCs定向分化得到。

优选的，所述定向分化细胞可以是多种类型的细胞，比如内皮细胞、淋巴细胞、干细胞等，且分化后的细胞都可以分泌TRAIL，发挥肿瘤细胞的抑制作用。

一种人诱导多潜能干细胞衍生的间充质干细胞TRAIL-iMSCs，所述干细胞TRAIL-iMSCs的保藏号为CCTCC NO:2021121，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年5月12日，保藏地址为中国湖北省武汉市武汉大学。

一种构建上述干细胞TRAIL-iMSCs的方法，用干细胞TRAIL-iPSCs克隆定向分化得到。

优选的，采用Stem Cell公司的STEMdiff^TMMesenchymal Progenitor Kit(Catalog#05240)将干细胞TRAIL-iPSC克隆定向分化成干细胞TRAIL-iMSCs。

本发明还提供了如上述的质粒、如上述的干细胞TRAIL-iPSCs、如上述的定向分化细胞或如上述的干细胞TRAIL-iMSCs在制备治疗肿瘤的药物或者试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物或者试剂盒，所述药物或者试剂盒含有上述的质粒、上述的干细胞TRAIL-iPSCs、上述的定向分化细胞或上述的干细胞TRAIL-iMSCs。

下面对本发明做进一步的解释：

现有制备工程化的MSCs的策略主要有以下缺点：

1.目前制备工程化的TRAIL-MSCs都是利用病毒载体：当使用病毒载体时，潜在的免疫反应和非预期的基因组整合事件应当被严格考虑。

病毒载体介导的随机整合策略存在潜在的免疫反应和非预期的基因组整合事件的风险，整合基因TRAIL的表达存在不稳定/不足的缺陷：病毒载体介导治疗基因随机整合到基因组中，治疗基因的表达可能会受到位置效应的影响，导致非持续性表达或表达不足；病毒基因组随机插入到其他内源性基因位点有可能破坏内源基因表达或者激活原来不表达的有害基因。以上都严重阻碍了工程化的TRAIL-MSCs的临床应用进展。

我们的策略是利用基因编辑工具TALEN和同源重组法，制备rDNA位点定点整合TRAIL的细胞，规避病毒风险，TRAIL可持续稳定高表达。

2.目前临床试验中使用的MSCs均为成体组织来源(骨髓、脂肪)或脐带来源：

即使是符合ISCT(International Society for Cellular Therapy)所规定的最低鉴定标准的MSCs，在表型和功能上也常常表现出明显的批次间差异，这些差异基于供体、组织来源、培养条件和传代条件，甚至在同一细胞群中也可观察到明显的异质性，这就使得实验/结果的可重复性受到挑战，评估标准难以统一；另外侵入性的获取手段(脐带来源除外)也会使MSCs用于临床转化的潜力大打折扣。

我们的策略是将rDNA位点定点整合TRAIL的hiPSCs定向诱导分化成TRAIL-iMSC，这种衍生的MSCs具有均一度好、质量稳定、产量无限的优点。

3.N端融合异亮氨酸拉链(isoleucine zipper，ILZ)的TRAIL蛋白已在多个报道中被证实了其抗肿瘤的功能(详见参考文献13-16)，ILZ的融合可以促进并稳定TRAIL三聚体化，提高细胞毒性。目前的研究均为病毒介导的ILZ-TRAIL治疗(详见对比文件17-19)或病毒介导的ILZ-TRAIL转导MSCs的抗肿瘤研究(详见对比文件20-22)。同样地，无法避免病毒载体和原代MSCs的局限。

我们的策略是将这种N端融合异亮氨酸拉链的TRAIL蛋白表达框以定点整合的方式靶入治疗细胞，克服如上所述的缺点。

为了实现TRAIL在MSCs中安全、稳定、有效的表达，我们构建了TALEN/TALENickase介导的非病毒基因靶向系统，在本发明中可高效地将N端融合异亮氨酸拉链(isoleucinezipper)的TRAIL表达框架整合到人iPSCs的核糖体DNA(rDNA)位点。随后，在获得定点整合的TRAIL-iPSCs后，可以通过定向分化获得大量的治疗性TRAIL-MSCs。

综合以上研究进展和现有技术障碍，本发明提供了一种制备标准化、规范化且质量稳定、相对可控的治疗级TRAIL-MSCs的方法及细胞制剂，这将具有广阔的应用前景和市场价值。

本发明规避了病毒转导组织来源MSCs带来的风险、克服了客观存在的局限性，利用基因编辑技术实现了TRAIL基因在hiPSCs的rDNA区精准添加，通过定向诱导TRAIL-iPSCs向TRAIL-iMSCs分化，可获得源源不断的均一性好，TRAIL表达稳定的MSCs，具有临床使用价值和大规模生产的前景。

本发明的具体思路和流程如图5所示，具体如下：

(1)构建rDNA区打靶载体mini-pHrneo-ILZ-TRAIL

rDNA区打靶载体mini-pHrneo-ILZ-TRAIL，以人rDNA转录区5468位点上下游+4533至+6064全长1531bp的一段序列作为同源臂序列，左侧同源臂(LHA)长度为935bp，右侧同源臂(RHA)为596bp。载体两同源臂之间包含一个两侧有一对loxP序列的无启动子的筛选基因NEO表达框和CMV启动子驱动的ILZ-TRAIL(AA.114-281)表达框。最终产物经由Sanger测序确定，无突变产生。

载体主要元件如图1所示。

(2)iPSCs的培养与打靶

人iPSCs接种在预先铺被了Matrigel的孔板中，用Stem Cell公司的mTeSR1维持日常培养。用于核转打靶的iPSCs应选择代次低，形态好的。

mini-pHrneo-ILZ-TRAIL联合TALEN/TALENickase打靶rDNA区特定位点，打靶示意图如图4所示。

(3)PCR鉴定：鉴定出ILZ-TRAIL定点整合的hiPSCs克隆

核转后的hiPSCs经过一段时间的G418筛选后，只细胞克隆长到合适大小，采用机械法将单克隆挑出，这些细胞克隆称为G418抗性克隆。首先设计合适引物，对这些克隆的gDNA进行PCR鉴定，对PCR产物进行测序，进一步证实ILZ-TRAIL在rDNA区的定点整合。对获得的TRAIL-iPSCs克隆进行体外扩增和核型鉴定。

(4)定向分化成TRAIL-iMSCs

按照Stem Cell公司的STEMdiff^TMMesenchymal Progenitor Kit(Catalog#05240)使用说明，可将TRAIL-iPSC克隆定向分化成TRAIL-iMSCs，观察其形态，并鉴定。

(5)TRAIL-iPSCs、TRAIL-iMSCs的TRAIL蛋白表达水平

取TRAIL-iPSCs和TRAIL-iMSCs的细胞裂解液进行WB，检测TRAIL在裂解液中的表达水平。

(6)诱导多种肿瘤细胞发生凋亡

将肿瘤细胞与iMSCs或TRAIL-iMSCs混合共培养72h后，流式检测肿瘤细胞的凋亡情况。

本发明的有益效果为：

(1)本发明利用基因编辑工具TALEN实现治疗基因TRAIL的定点整合，规避病毒载体随机整合带来的风险，确保治疗基因表达的持续性和高水平。

(2)本发明以定点整合TRAIL的iPSCs作为MSCs的来源，克服了组织来源的MSCs的局限性，可源源不断获得，具有适用性和经济价值。

(3)TRAIL-iMSCs可持续性表达TRAIL，对多种肿瘤细胞都具有诱导凋亡的效果，表现出抗肿瘤的应用潜力。

(4)通过前期数据验证，rDNA打靶载体在基因编辑工具TALEN/TALENickase的协助下对iPSCs进行基因打靶，打靶效率高于之前报道其他位点的打靶效率，具有高效的优点^[12]。

(5)将打靶后的TRAIL-iMSCs进行多次传代，并经核型检测和干细胞标志物的检测，表明rDNA区打靶不仅能稳定遗传，而且不会改变干细胞的生物学特性，具有稳定安全的优点。

(6)本发明rDNA区定点整合的TRAIL-iMSCs表达水平高于病毒整合的TRAIL-MSCs。一方面，现有技术(Sun,X.Y.,et al.,MSC(TRAIL)-mediated HepG2 cell death indirect and indirect co-cultures.Anticancer Res,2011.31(11):p.3705-12.)利用质粒瞬转MSCs，MSCs-sTRAIL的TRAIL分泌水平仅比未转染MSCs的高约3倍，而本发明涉及的TRAIL-iMSCs的TRAIL分泌量比BMSCs高约5倍(如图16所示)。在别的研究中利用腺病毒转导的TRAIL-MSCs，其TRAIL表达水平会随着时间的推移而逐渐降低(Park,S.A.,et al.,Combination treatment with VPA and MSCs-TRAIL could increase anti-tumoreffects against intracranial glioma.Oncology reports,2021.45(3):p.869-878.)。而本发明所采用非病毒定点整合策略所获得的TRAIL-iMSCs在体外连续传代也不会影响细胞表达TRAIL蛋白(如图15所示)。另一方面，本申请也通过多次试验验证了这一点。

附图说明

图1为载体mini-pHrneo-ILZ-sTRAIL和mini-pHrneo-flTRAIL载体主要元件示意图；

图2为mini-pHrneo-ILZ-sTRAIL与mini-pHrneo-flTRAIL转染HEK293T细胞之后细胞上清中TRAIL蛋白表达检测；

图3为正常培养的hiPSCs；

图4为rDNA区打靶示意图；

图5为本发明方案的流程图；

图6为PCR的循环条件图；

图7为PCR鉴定ILZ-TRAIL定点整合的hiPSCs克隆；

图8为PCR产物的测序鉴定；

图9为Southern Blotting鉴定TRAIL-iPSCs；

图10为TRAIL-iPSCs(左)和hiPSCs(右)核型鉴定；

图11为iMSCs和TRAIL-iMSCs细胞形态图；

图12为TRAIL-iMSC表面标记流式分析结果；

图13为iMSC多谱系分化潜能鉴定；

图14为TRAIL-iPSCs的蛋白表达检测；

图15为不同代次TRAIL-iMSCs的蛋白表达检测；

图16为ELISA检测细胞培养上清中的TRAIL表达水平；

图17为TRAIL-iMSCs诱导A375、A549、MCF-7和HepG2细胞的凋亡；

图18为Mini-pHrneo载体的限制性多克隆位点图。

具体实施方式

实施例1

(1)rDNA区打靶质粒mini-pHrneo-ILZ-TRAIL与mini-pHrneo-flTRAIL的构建

因为TRAIL需要被水解至血液循环中与其受体结合才能激活靶细胞的信道转导途径，故而本发明希望选择一种比全长膜型TRAIL更易分泌至细胞外的TRAIL变体。在本发明中选择的TRAIL变体是ILZ-TRAIL(AA.114-281)。

本发明以已公开的学位论文(刘博.人iPSCs核糖体基因区IL24基因打靶及其分化MSCs的抗肿瘤研究[D].长沙：中南大学，2017：19-25)中提及的非病毒的人核糖体DNA(hrDNA)靶向载体mini-pHrneo为骨架，该质粒以人rDNA转录区5468位点上下游+4533至+6064全长1531bp的一段序列作为同源臂序列，左侧同源臂(LHA)长度为935bp，右侧同源臂(RHA)为596bp。载体两同源臂之间包含一个两侧有一对loxP序列的无启动子的筛选基因NEO表达框。本发明将CMV启动子驱动的ILZ-TRAIL(AA.114-281)表达框插入到mini-pHrneo的BamH1酶切位点处，构建minipHrneo-ILZ-TRAIL,最终产物由Sanger测序鉴定。载体主要元件示意图如图1所示。同时将CMV启动子驱动的flTRAIL表达框插入到mini-pHrneo的BamH1酶切位点处，构建mini-pHrneo-flTRAIL。外源表达框可以插入至mini-pHrneo的限制性多克隆位点(图18)中，多克隆位点可以由操作者自行设计选择。

(2)构建好的质粒转染HEK293T细胞并通过Western blot检测细胞培养上清中TRAIL蛋白表达

2.1取一6孔细胞培养板，每孔接种8×10⁵个HEK293T细胞，十字摇匀，放入细胞培养箱中培养，隔天换液。

2.2待细胞长至汇合度为90％时，利用lipo2000将minipHrneo-ILZ-TRAIL质粒与mini-pHrneo-flTRAIL质粒分别转染至HEK293T细胞中；

2.3转染72h后收集细胞上清，通过Western Blot检测细胞上清液中TRAIL蛋白表达水平，结果如图2所示，在细胞培养上清中，转染minipHrneo-ILZ-TRAIL质粒组表达TRAIL蛋白量显著高于转染mini-pHrneo-flTRAIL质粒组，因此，后续实验中我们采用minipHrneo-ILZ-TRAIL质粒。

(3)iPSCs的培养和iPSCs打靶(mini-pHrneo-ILZ-TRAIL、TALEN/TALENickase介导的)

人iPSCs养在预先铺被了Matrigel的孔板中，用Stem Cell公司的mTeSR1维持日常培养。用于核转打靶的iPSCs应选择代次低，形态好的，正常培养的hiPSCs形态如图3所示。

利用LONZA公司Amaxa Human Stem Cell Nucleofector Starter Kit核转试剂盒对iPSCs进行单细胞核转，rDNA区打靶示意图如图4所示。核转前先将试剂盒置于室温预温30min。

3.1核转前2h，将iPSCs培养皿中更换新鲜培养基，并加入终浓度10μM的Y27632。

3.2吸弃mTeSR1培养基，用1×DPBS洗涤细胞2次。

3.3加入1-2mL TrypLE Express室温消化细胞3分钟，轻轻拍打培养皿，在镜下观察发现细胞变圆降贴不贴时，吸弃TrypLE Express，加入3mL mTesR1培养基吹下细胞。

3.4充分吹下细胞并重悬成单细胞悬液，细胞计数后于室温175g离心5min。

3.5吸弃上清后加入1×DPBS重悬细胞，取3×10⁶细胞分装入15mL离心管中，再次于室温175g离心5min。

3.6离心的同时配制核转液，在1.5mL EP管中加入82μL Solution2和18μLSupplement1，并将5μg的打靶质粒mini-pHrneo-ILZ-TRAIL和靶向rDNA位点设计的核酸工具酶TALEN/TAlENickases^[12]各5ug加入其中混匀，室温静置5min。

3.7吸弃离心管中上清，用含有混合质粒的核转液重悬iPSCs，并将其转移至LONZA核转杯中，注意转移时在杯中不能产生气泡。

3.8将核转杯盖紧并放至核转仪中，选择核转程序B-016进行核转。

3.9核转完成后，立即将500uL mTeSR1加入核转杯中，并用一次性塑料吸头轻柔混匀以中和细胞，37℃孵育5min。

3.10将核转的iPSCs接种至预先铺被了Matrigel的孔板中，加入新鲜mTeSR1培养基，并加入终浓度10μM的Y27632，十字摇匀后置于37℃5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养。

3.11核转后12h更换新鲜培养基并再次加入终浓度10μM的Y27632，镜下观察细胞贴壁情况。随后，每天更换新鲜培养基。

(4)打靶iPSCs的筛选与鉴定

4.1 G418抗性细胞克隆的筛选：

4.1.1核转后的iPSCs每天更换新鲜mTeSR1培养基，并于镜下观察细胞形态及密度。

4.1.2核转后第3-4天，待细胞密度长至50-60％时，每天更换含有终浓度为50μg/mL G418的mTeSR1培养基对细胞进行筛选。

4.1.3经过连续4-5天的G418药物筛选，没有NEO基因整合的细胞逐渐脱落死亡，只有小部分抗性克隆能够存活；

4.1.4将存活的细胞用1-2mL TrypLE Express室温消化细胞2-3分钟，轻轻拍打培养皿，在镜下观察发现细胞变圆并逐渐脱落时，加入3-5mL mTesR1培养基终止消化，用大Tip将脱落的细胞吹下并重悬成单细胞悬液，细胞计数后于室温175g离心5min；

4.1.5取1000个细胞接种于预先铺被了Matrigel的6cm dish中，用3mL含有10％CloneR添加剂(Stem Cell公司)的mTesR1培养，后续换液根据CloneR的说明书操作。

4.1.6当6cm dish中的单细胞克隆长至半个10倍镜视野大小时(约10-12天)，用中tip挑取克隆接种于Matrigel预先包被的24孔板中，添加新鲜的mTesR1培养基，摇匀后置于37℃5％CO2饱和湿度恒温培养箱中。。

4.1.7当单细胞克隆长大时，将其从24孔板中传到两个24孔板的孔中，一线用于细胞的扩增培养，另一线用于抽提gDNA备于后续鉴定。

4.2 iPSCs gDNA的手工提取：

4.2.1吸弃细胞克隆培养皿中的培养基，加入1×DPBS洗涤细胞2次。

4.2.2弃尽DPBS后，用适量TrypLE Express室温消化细胞3min，在镜下观察发现细胞变圆并逐渐脱落时，立即吸弃TrypLE Express，加入1mL 1×DPBS将细胞吹下。

4.2.3将细胞悬液转移至1.5mL EP管内后，于室温175g离心5min。

4.2.4吸弃培养基后，再加500μL 1×DPBS洗涤细胞1次，再次于室温175g离心5min。

4.2.5弃尽DPBS后，加0.5mL细胞核裂解液(含20μg/mL RNase)，震荡混匀重悬。

4.2.6每管样品内加入70μL 10％SDS使细胞蛋白变性，轻柔颠倒混匀至粘稠透明状。

4.2.7再向EP管中加入6μL蛋白酶K，颠倒混匀后置于37℃恒温摇床上90rpm消化至液体变澄清即可。

4.2.8向EP管中加入等体积饱和酚，上下颠倒100次混匀后可见乳浊液形成，于室温12800rpm离心10min。

4.2.9将管中上层水相移至新的1.5mL EP管中，加入等体积的饱和酚和三氯甲烷混合液(1:1)上下颠倒100次混匀后，于室温12800rpm离心10min。

4.2.10将上层水相移至新的1.5mL EP管中，加入2倍体积-20℃提前预冷的无水乙醇轻柔颠倒混匀，可观察到白色絮状DNA沉淀析出，于4℃12800rpm离心10min收集DNA沉淀。

4.2.11吸弃上清，加入0.5mL 70％乙醇洗涤一次，于4℃12800rpm离心5min。

4.2.12吸弃上清，点离后吸弃残留液体，于无菌操作台中室温静置干燥15-20min。待白色沉淀看不见后，加入15-30μL灭菌水，混匀后让gDNA充分溶解。

4.2.13测量抽提gDNA的OD值。

4.3PCR鉴定定点G418抗性细胞克隆

以抽提的G418抗性细胞克隆的gDNA为模板，设计跨上游同源臂区引物Screen-F1/R1和跨下游同源臂区引物Screen-F2/R2进行PCR扩增鉴定。若该挑取的单细胞克隆为定点整合克隆则对应引物的PCR产物片段大小分别为1652bp和1492bp。

表1 PCR引物

PCR体系为：

PCR循环条件如图6所示。

结果如图7所示，两对引物PCR产物皆有符合预期条带并经测序确认的克隆即为“ILZ-TRAIL”定点整合克隆，共鉴定出5个ILZ-TRAIL定点整合的hiPSCs克隆。

对这5个ILZ-TRAIL定点整合的hiPSCs克隆的PCR产物进行测序，进一步证实了ILZ-TRAIL在rDNA区的定点整合，结果如图8所示。

4.4 Southern blot鉴定“ILZ-TRAIL”定点整合克隆

利用Roche公司DIG HIGH PRIME DNA LABELING试剂盒做探针标记，将探针设计在NEO基因上。DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I试剂盒检测目的DNA片段。若PCR确定为“ILZ-TRAIL”定点整合克隆无非定点整合的发生，则利用Xho I酶切该细胞gDNA后，通过Southern Blot分析可检测到一条被探针标记的6.5kb大小的片段。

4.4.1探针按如下方式制备：

表2探针引物

名称	序列
		NEO-probe-F	CCGGTCTTGTCGATCAGGATGA(SEQ ID NO.6)
NEO-probe-R	CAGAGTCCCGCTCAGAAGAACT(SEQ ID NO.7)

制备探针的PCR反应体系：

4.4.2Southern blot按标准方案进行。结果如图9所示，5个ILZ-TRAIL定点整合的hiPSCs克隆经Southern Blotting鉴定，仅见单一的6.5kb大小的条带，与理论相符，进一步证实获得的克隆为LZ-TRAIL定点整合的hiPSCs克隆，未发现非定点整合的发生。

4.5 iPSCs细胞核型检测：

为确定外源基因定点整合入rDNA区对细胞遗传学特性不产生影响，故做细胞核性分析，以检测细胞核型是否不发生改变。

4.5.1细胞核型检测前更换新鲜mTeSR1培养基，加入适量秋水仙素使其终浓度为0.6μg/mL处理细胞3h。

4.5.2吸弃培养基，用1×DPBS洗涤细胞2次。

4.5.3加入适量0.25％trypsin-EDTA于37℃消化细胞3min，待细胞变圆并逐渐脱落时，加入3倍体积mTeSR1培养基终止消化，吹下脱落细胞并将悬液收集至15ml离心管中，于室温1500rpm离心10min。

4.5.4吸弃上清，加入37℃预温的0.075M KCl 7mL，用吸管猛烈吹打100次后，置于37℃恒温水浴箱中低渗20min；

4.5.5加入1.5mL由甲醇和乙酸按3∶1比例混合的现配固定剂轻柔混匀悬液，于37℃水浴预固定5min，室温1500rpm离心10min。

4.5.6吸弃上清，加入8mL固定剂轻柔混匀悬液，于37℃水浴固定5min后室温1500rpm离心10min。随后，再重复固定1次。

4.5.7加入适量固定剂重悬后，用-20℃预冷的玻片进行滴片。每片2滴，共滴6张。随后，置于烤箱中75℃烤片3h。

4.5.8 G显带：在立式染缸中加入30mL 0.85％生理盐水和30mL由0.02％EDTA溶液与0.5mL 2.5％trypsin配制的trypsin-EDTA溶液。将配好的trypsin-EDTA溶液pH调至7.0-7.2，于37℃预温5min。将烤好的染色体标本片，放入trypsin-EDTA溶液中轻柔摇动消化20-120s后，立即于生理盐水中终止消化并漂洗2次。再用Giemsa染色3-5min，以自来水冲洗并晾干。

4.5.9于显微镜下进行20个染色体分裂相数目分析和5个分裂相结构分析。

结果如图10所示，未发现核型异常。

(5)TRAIL-iPSCs向TRAIL-iMSCs的定向分化

按照Stem Cell公司的STEMdiff^TMMesenchymal Progenitor Kit(Catalog#05240)使用说明，将整合的TRAIL-iPSC克隆定向分化成TRAIL-iMSC。

5.1提前用Mtrigel包被12孔板：37℃放置过夜，使用前吸弃；

5.2用TrypLE^TMExpress将待分化的TRAIL-iPSCs室温消化3min，用TeSR^TM-E8^TM重悬制备成单细胞悬液，并用血球计数板对细胞总量进行计数；取出约15万细胞接种至12孔板的一个孔中，加入含有10μM Y-27632的mTeSR 1培基进行培养(放入恒温培养箱之前要充分摇匀细胞培养板)；

5.3培养1-2天至TRAIL-iPSCs克隆汇合度达到40-50％(以不超过50％为佳)，吸弃培养基并用DPBS洗两遍，每孔加1ml 15-25℃预温的STEMdiff^TM-ACF MesenchymalInduction Medium开始诱导分化，记P0代；

5.4用STEMdiff^TM-ACF Mesenchymal Induction Medium连续3天每天换液(换液时千万不要吹洗细胞，很容易将细胞吹掉，一旦将分化成功的细胞吹掉，后期将细胞传至6孔板时细胞会很稀而且细胞的状态活性都不好)(在这4天中细胞会长得很满，这属于正常现象)；

5.5第4天吸弃培基，DPBS洗两遍(千万不要用tip吹洗细胞，避免吹掉细胞)，每孔加1ml 15-25℃预温的MesenCult^TM-ACF Medium，并加入1μL的10mM Y-27632；

5.6第5天换新鲜的MesenCult^TM-ACF Medium继续培养，同时加入1μL的10mM Y-27632。(换液时千万不要吹洗细胞，会将很多分化成功的细胞也吹掉，尽量不要长得太满)。同时用MesenCult^TM-ACF Attachment Substrate包被6孔板，恒温培养箱放过夜；

5.7第6天吸弃培基，DPBS洗孔两遍；用TrypLE^TMExpress室温消化细胞90s即可，吸弃TrypLE^TMExpress用2ml complete MesenCult^TM-ACF Medium吹起细胞，并全部接种至预先包被MesenCult^TM-ACF Attachment Substrat的6孔板孔中，加入2μL的10μM Y-27632，记P1代；

5.8刚传到6孔板的P1代细胞第二天就能长满，按照1:2传代至预先包被MesenCult^TM-ACF Attachment Substrat的6孔板孔中，继续用complete MesenCult^TM-ACFMedium培基并加入终浓度为10μM的Y-27632培养，记P2代；

5.9 P2代细胞每天更换新鲜的complete MesenCult^TM-ACF Medium培基并加入终浓度为10μM的Y-27632，一直培养2-3天(细胞培养时间要达到，否则细胞传到10cm dish上容易老化)再次按照1:2传代，记P3代；

5.10待P3代细胞汇合度达到90％后，将细胞用TrypLE Express室温消化3min(吸弃TrypLE^TMExpress后用培基重悬细胞，此时细胞会比较难吹下来，可以重复3次,每次吸取新鲜培基吹洗细胞，即可将大部分细胞吹起)，将一个6孔板中的细胞传代至预先铺了MesenCult^TM-ACF Attachment Substrate的一个6cm dish中培养，记P4代(此时，1个12孔板孔的细胞已传出4个6cm dish)；

5.11 P4代细胞在6cm dish中会缓慢增殖，此时隔天换液即可，换含有终浓度为10μM的Y-27632的complete MesenCult^TM-ACF Medium，大约等5-6天，6cm dish中的细胞能达到90％的汇合度；

5.12 P4代细胞达到90％的汇合度即可继续传代扩增培养，此时可根据需要传到1个10cm dish中或传到2个6cm dish中；所有培养皿都应预先包被MesenCult^TM-ACFAttachment Substrate，换含有终浓度为10μM的Y-27632的complete MesenCult^TM-ACFMedium，记P5代；

5.13 P5代后细胞增殖速度增快，可根据需要进行冻存或者扩增；往后，细胞可隔天换培养基，更换新鲜complete MesenCult^TM-ACF Medium，不需再加Y-27632；

P6代以后的细胞可用于后续的鉴定和实验。

(6)TRAIL-iMSCs的鉴定

6.1TRAIL-iMSCs的形态鉴定

选择汇合度约80-90％的细胞，换新鲜培养基后置于倒置显微镜下，依次用低倍镜和高倍镜观察细胞形态。

如图11所示，TRAIL-iMSCs具有典型的MSCs形态，呈指纹螺旋状生长，且可在体外进行连续传代。

6.2 iMSCs的表面标志物鉴定

6.2.1吸弃iMSCs的培养基，DPBS洗涤两次，用TrypLE^TMExpress室温消化细胞3min，用适量完全培养基重悬后转入15mL离心管，175g离心5min；

6.2.2吸弃上清后，用DPBS洗涤细胞一遍，175g再次离心5min；

6.2.3离心完成后吸弃上清，加入100μL 5％FBS-DPBS重悬细胞，然后分别加入BV421-CD45,BV421-HLA-DR,APC-CD105,BV421-CD34,PE-Cy7-CD90,BB515-CD44,Precp-Cy5.5-CD73各5μL,同时加入0.1μL死活染料APC-Cy7，室温避光孵育20min；

6.2.4孵育完成后加入2倍体积5％FBS-DPBS终止孵育，175g离心5min，弃上清，每管加150μL 5％FBS-DPBS重悬细胞，1h之内流式细胞仪检测。

TRAIL-iMSCs表面标志物鉴定显示为,CD44+,CD73+,CD90+,CD105+，CD34-/CD45-/HLA-DR-,与人骨髓来源的MSC的特征一致，符合ISCT的鉴定标准。结果如图12所示。

6.3 iMSCs的多谱系分化潜能鉴定

6.3.1向成骨细胞分化

本实验使用的MesenCult Osteogenic Diff Kit(Human)来自Stem CellTechnologies公司，可将MSCs诱导向成骨细胞分化。

6.3.1.1将成骨分化完全培养基按照说明书配制，混匀后4℃保存；

6.3.1.2提前一天将iMSCs接种至包被了MesenCult^TM-ACF Attachment Substrate的六孔板中。每个孔接种约3×105个细胞，加新鲜complete MesenCult^TM-ACF Medium置于37℃、5％CO2、温箱中培养24h；

6.3.1.3第二天细胞能长汇合，吸弃旧培养基，用DPBS洗两遍孔，然后换2mL MSC成骨分化培养基进行分化培养。

6.3.1.4每隔2天换液一次。经过2周的分化培养后，用茜素红对细胞进行染色鉴定。鉴定结果如图13所示。

6.3.2向脂肪细胞分化

本研究采用Stem Cell Technologies公司的MesenCult^TMAdipogenicDifferentiation Kit将MSCs向脂肪细胞分化。

6.3.2.1首先按照说明书配制MSC脂肪分化培养基，混匀后4℃保存；

6.3.2.2提前一天将iMSCs接种至包被了MesenCult^TM-ACF Attachment Substrate的六孔板中。每个孔接种约3×105个细胞，加新鲜complete MesenCult^TM-ACF Medium置于37℃、5％CO2、温箱中培养24h；

6.3.2.3第二天细胞能长汇合，吸弃旧培养基，用DPBS洗两遍孔，然后换MSC脂肪分化培养基进行培养。

6.3.2.4每隔2天换液一次。经过3周的分化培养后，用油红O对细胞进行染色鉴定。鉴定结果如图13所示。

6.3.3向软骨细胞分化

本研究采用Stem Cell Technologies公司的MesenCult^TM-ACF ChondrogenicDifferentiation Kit将MSCs向软骨细胞分化。

6.3.3.1首先按照说明书配制MSC脂肪分化培养基，混匀后4℃保存；

6.3.3.2 3D培养系统用于软骨细胞的分化：待iMSCs生长至汇合，用TrypLE^TMExpress室温消化3min，重悬后进行细胞进行计数，取5×105个细胞室温175g离心5min；

6.3.3.3吸弃上清，用150μL MSC软骨分化培养基重悬细胞，以每滴20-30μL的体积，一滴滴地接种于6孔板中，小心地置于37℃5％CO2饱和湿度恒温培养箱中培养过夜。

6.3.3.4第二天，可见孔底有液滴的区域有肉眼可见的细胞微球形成。每孔补充2mL新鲜MSC软骨分化培养基进行分化培养。每隔2天更换新鲜分化培养基。

6.3.3.5经过2周的分化培养后，用阿利辛蓝对细胞进行染色以检测MSCs向软骨分化的情况。鉴定结果如图13所示。

6.3.4分化细胞染色鉴定

6.3.4.1吸弃培养基，用DPBS洗涤细胞两2遍，加入适量4％多聚甲醛对细胞进行固定，室温固定30min；

6.3.4.2固定完毕，用DPBS洗涤细胞2遍，然后对分化的脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分别加入适量的油红O、茜素红、阿利辛蓝染液，室温避光染色20min；

6.3.4.3吸弃染液，用DPBS漂洗细胞多次，注意不要吹打细胞；

6.3.4.4最后加入适量DPBS保持湿润，镜下观察细胞染色情况,并选择合适放大倍数拍照。鉴定结果如图13所示。

(7)TRAIL在TRAIL-iPSCs、TRAIL-iMSCs中的表达检测

7.1Western Blot检测细胞裂解液中TRAIL蛋白表达水平

7.1.1待细胞汇合度达90％，吸弃培养基，1×DPBS洗涤细胞两次；

7.1.2 12孔板每孔加100μL RIPA和1μL PMSF/6孔板每孔加200μL RIPA和2μLPMSF，Tip轻轻刮下细胞，于冰上裂解30min；

7.1.3裂解完后，将细胞裂解液转移至EP管中，(整个操作尽量在冰上进行)。冰上超声裂解，2-3s/次，每次间隔5s，共7-8次；

7.1.4于4℃下12000g离心10min(提前开离心机预冷)；

7.1.5将离心后的上清转移到新的EP管中，然后利用Thermo公司的Pierce^TMBCAProtein Assay Kit试剂盒进行BCA蛋白定量；

7.1.6制备SDS-PAGE胶：清洗玻璃板，用洗洁精清洗制胶玻璃板，然后用清水冲洗，再用ddH2O冲洗，最后用电吹风吹干，制备12％分离胶和4％浓缩胶的SDS-PAGE胶；

7.1.7上样：将制好的SDS-PAGE胶置于电泳槽中(小玻璃板面向内，大玻璃板朝外)，并配制新鲜的1×running buffer加入电泳槽中，将事先准备好的蛋白样品按照顺序加入到孔中，每孔上样量10μg蛋白；

7.1.8选择合适电压进行恒压电泳，直至样品中的loading全部跑出PAGE胶；

7.1.9转膜：预先配制好1×transfer buffer置于-20℃冰箱预冷，切去浓缩胶，量好分离胶的长和宽，用直尺裁剪出大小合适的PVDF膜，并用甲醇浸泡活化，再置于转膜液中平衡。然后按照：“三明治顺序”黑色槽端：海绵垫+滤纸+分离胶+膜+滤纸+海绵垫红色槽端，整个操作过程在转膜液中进行，并不断排除气泡；

7.1.10恒流转膜90min，此过程注意体系降温；

7.1.11封闭：转膜完成后，将膜用TBST从上向下浸润后，移至5％脱脂牛奶中室温封闭1h(此步置于水平摇床上)；

7.1.12抗体孵育：将一抗用一抗稀释液稀释至适当浓度，倒入合适的孵育盒中，将膜置于4℃水平摇床上孵育过夜。

7.1.13吸弃一抗，TBST洗3次，每次10min；

7.1.14在抗体盒内加入相应1:10000稀释的二抗，摇床孵育1h，TBST洗3次，每次10min；

7.1.15蛋白条带显影。

结果如图14-15所示，可见整合克隆TRAIL-iPSCs的TRAIL显著高表达，TRAIL-iMSCs的TRAIL表达水平不受体外传代次数的影响，进一步揭示了TRAIL-iMSCs是一种理想的稳定表达TRAIL的细胞治疗剂。

7.2 ELISA检测细胞培养上清中的TRAIL含量：

细胞计数后于相应的培养基中培养24h，收集培养基上清，并注意去除死细胞及细胞碎片

7.2.1用coating buffer将Capture antibody以1:100稀释，在96孔酶标板中每孔加100μL，室温静置孵育12h。

7.2.2按照12.5、25、50、100、200ng/L浓度稀释标准品。

7.2.3分别设置空白孔、标准孔、待测样品孔，其中空白孔不加入样品和酶标试剂。先将40μl样品稀释液加入待测样品孔中，然后再加入10μL将待测样品轻柔混匀，标准品孔中加入50μL标准品。酶标包被板加样过程中因将样品直接加至板孔底部不触及孔壁。

7.2.4用封板膜封板后，置于37℃孵育2h。

7.2.5揭开封板膜后吸尽液体。每孔加入100μL 1×washing buffer静置30s后吸弃，反复洗涤孔板5次。

7.2.6每孔加入50μL detecting antibody，空白孔除外。用封板膜封板后，置于37℃孵育2h。

7.2.7同步骤5)再次洗涤孔板5次。

7.2.8在每个样品孔中按1:1比例先后分别加入50μL显色剂A和B，轻柔震荡混匀后置于37℃避光孵育显色20min。

7.2.9每孔加50μl stopping solution，终止显色反应。

7.2.10终止显色后15min内于酶标仪中490nm波长下检测各样品孔的OD值，绘制标准曲线并计算样品中TRAIL蛋白含量。

结果如图16所示：与hiPSCs、BMSC、iMSCs比较，观察到TRAIL-iMSCs细胞培养上清中TRAIL的高表达，揭示了TRAIL-iMSCs可作为一种治疗细胞通过分泌治疗因子远距离发挥抑瘤活性的潜力。

(8)TRAIL-iMSCs的促凋亡效果检测

将整合TRAIL-iMSC和未整合iMSC用荧光染料(CFSE)标记后，与肿瘤细胞混合共培养48h，然后检测肿瘤细胞的凋亡比例。本研究所用的细胞凋亡检测试剂盒是Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit。Annexin V与磷酯酰丝氨酸(PS)具有高度亲和力是检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。7-氨基放线菌素D(7-AAD)是一种核酸染料，7-AAD不能透过正常细胞或早期凋亡细胞完整的细胞膜，但可穿透膜损伤细胞如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜并与其内的DNA结合，可用来区分早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞或坏死细胞。因此将Annexin V-PE与7-AAD进行共染，就可以区分不同凋亡时期的细胞。用正常肿瘤细胞作标准组(7-AAD、Annexin V、双标、空白)和对照实验组(sTRAIL-iMSCs和iMSCs)。

8.1将30万CFSE标记的TRAIL-iMSC或iMSCs与10万肿瘤细胞共同接种在一个六孔板中，设置一个空白对照(仅有肿瘤细胞)，换MSC medium连续培养72h；

8.2 72h后，将培养皿中培养基收集到一个15mL离心管中，用1×DPBS洗涤细胞1遍，然后用适量TrypLE Express消化细胞2min，消化时应避免消化时间过长，收集细胞于同一个15mL离心管，然后室温175g离心5min；

8.3弃上清，用1×DPBS再洗涤细胞1遍；再次离心弃上清后，每个样品加入100μL1×Binding Buffer，轻轻吹匀至单细胞悬液；

8.4细胞染色：加入5μL 7-AAD Staining Solution和5μL Annexin V-PE，轻轻吹匀，避光、室温孵育10min，加入200-400μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀；

8.5染色后样品尽快用流式细胞仪进行检测。

结果如图17所示，TRAIL-iMSCs显著增加了了A375、A549、MCF-7和HepG2细胞的凋亡率。

上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学

<120> 质粒、干细胞及应用

<130> 21

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7627

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat 60

cgcggttcta ttttgttggt tttcggaact gaggccatga ttaagaggga cggccggggg 120

cattcgtatt gcgccgctag aggtgaaatt cttggaccgg cgcaagacgg accagagcga 180

aagcatttgc caagaatgtt ttcattaatc aagaacgaaa gtcggaggtt cgaagacgat 240

cagataccgt cgtagttccg accataaacg atgccgaccg gcgatgcggc ggcgttattc 300

ccatgacccg ccgggcagct tccgggaaac caaagtcttt gggttccggg gggagtatgg 360

ttgcaaagct gaaacttaaa ggaattgacg gaagggcacc accaggagtg gagcctgcgg 420

cttaatttga ctcaacacgg gaaacctcac ccggcccgga cacggacagg attgacagat 480

tgatagctct ttctcgattc cgtgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagcg 540

atttgtctgg ttaattccga taacgaacga gactctggca tgctaactag ttacgcgacc 600

cccgagcggt cggcgtcccc caacttctta gagggacaag tggcgttcag ccacccgaga 660

ttgagcaata acaggtctgt gatgccctta gatgtccggg gctgcacgcg cgctacactg 720

actggctcag cgtgtgccta ccctacgccg gcaggcgcgg gtaacccgtt gaaccccatt 780

cgtgatgggg atcggggatt gcaattattc cccatgaacg agggaattcc cgagtaagtg 840

cgggtcataa gcttgcgttg attaagtccc tgccctttgt acacaccgcc cgtcgctact 900

accgattgga tggtttagtg aggccctcgg atcggccccg ccggggtcgg cccacggccc 960

tggcggagcg ctgagaagac ggtcgaactt gactatctag tgctagaccg gtcttaagat 1020

aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt ataattcccc cctctccctc ccccccccct 1080

aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt 1140

tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg 1200

acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc 1260

gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt 1320

tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta 1380

taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg 1440

gaaagagtca aatggctctc ctaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 1500

taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 1560

cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 1620

cacgatgata atccatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 1680

tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 1740

tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 1800

ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 1860

cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 1920

aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 1980

tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 2040

aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 2100

atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 2160

cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 2220

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 2280

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 2340

gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 2400

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca 2460

agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt 2520

gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat 2580

gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 2640

caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 2700

gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataact tcgtataatg tatgctatac 2760

gaagttatgc tagggctaga gatcttctag accgtcatta gttcatagcc catatatgga 2820

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 2880

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 2940

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 3000

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 3060

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 3120

tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 3180

acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 3240

tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 3300

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gatgaagcag atcgaggaca aaattgagga aatcctgtcc aagatttacc acatcgagaa 3420

cgagatcgcc cggattaaga aactcattgg cgagagggaa ttcgtgagag aaagaggtcc 3480

tcagagagta gcagctcaca taactgggac cagaggaaga agcaacacat tgtcttctcc 3540

aaactccaag aatgaaaagg ctctgggccg caaaataaac tcctgggaat catcaaggag 3600

tgggcattca ttcctgagca acttgcactt gaggaatggt gaactggtca tccatgaaaa 3660

agggttttac tacatctatt cccaaacata ctttcgattt caggaggaaa taaaagaaaa 3720

cacaaagaac gacaaacaaa tggtccaata tatttacaaa tacacaagtt atcctgaccc 3780

tatattgttg atgaaaagtg ctagaaatag ttgttggtct aaagatgcag aatatggact 3840

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tgtaacaaat gagcacttga tagacatgga ccatgaagcc agttttttcg gggccttttt 3960

agttggctaa caattgaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 4020

catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgctc tagaggatcc ctagcactag 4080

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gctcgttcgt tcgccgcccg gccccgccgc cgcgagagcc gagaactcgg gagggagacg 4320

ggggggagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagaaag aagggcgtgt 4380

cgttggtgtg cgcgtgtcgt ggggccggcg ggcggcgggg agcggtcccc ggccgcggcc 4440

ccgacgacgt gggtgtcggc gggcgcgggg gcggttctcg gcggcgtcgc ggcgggtctg 4500

ggggggtctc ggtgccctcc tccccgccgg ggcccgtcgt ccggccccgc cgcgccggct 4560

ccccgtcttc ggggccggcc ggattcccgt cgcctccgcc gcgccgctcc gcgccgccgg 4620

gcacggcccc gctcgctctc cccggccttc ccgctagggc gtctcgaggg tcatcactag 4680

tgaattcgcg gccgcctgca ggtcgaccat atgggagagc tcccaacgcg ttggatgcat 4740

agcttgagta ttctatagtg tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 4800

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 4860

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 4920

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 4980

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 5040

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 5100

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 5160

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 5220

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 5280

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 5340

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 5400

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 5460

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 5520

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 5580

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 5640

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 5700

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atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 5940

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tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 6060

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 6120

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 6180

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 6240

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 6300

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 6360

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 6420

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 6480

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 6540

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ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 6720

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agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 6840

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 6900

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg atgcggtgtg aaataccgca 6960

cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gaaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa 7020

ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 7080

atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 7140

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ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 7260

aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 7320

gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 7380

agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 7440

ggcgcgtcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 7500

cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 7560

cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg taatacgact 7620

cactata 7627

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttgcacttga ggaatggtga actg 24

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ccagacgaga cagcaaacgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cctgagaaac ggctaccaca 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaactgcttc cttcacgaca t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccggtcttgt cgatcaggat ga 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cagagtcccg ctcagaagaa ct 22

Claims (2)

1.一种人诱导多潜能干细胞衍生的间充质干细胞TRAIL-iMSCs，其特征在于，所述TRAIL-iMSCs的保藏号为CCTCC NO:2021121。

2.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物包括如权利要求1所述的干细胞TRAIL-iMSCs；所述肿瘤为肿瘤细胞A375、A549、MCF-7和HepG2引发的肿瘤。

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