CN105693864A - 一种三聚体trail蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三聚体TRAIL蛋白及其应用，所述三聚体TRAIL重组蛋白由TRAIL的114-281氨基酸序列与载体PET进行基因克隆制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因pET23dw-His-ILZ-hTRAIL_114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，所述HZ-TRAIL再经聚乙二醇修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到所述经聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。利用PEGylation技术将TRAIL重组基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生产三聚体的高活性TRAIL蛋白质，并且本发明的三聚体TRAIL蛋白对抗肿瘤和抗类风湿关节炎具有高药效的优点。

Description

一种三聚体TRAIL蛋白及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种三聚体TRAIL蛋白及其应用。

背景技术

近年来，由于生物制药技术的发展使得蛋白质或多肽类药物大量生产成为可能，但是多肽药物存在着体内循环的半衰期短、易在胃肠道内被蛋白水解酶破坏、水溶性差、抗原性较强引起过敏、以及易于引起中和抗体的产生等缺点，限制着它的应用。因此，现有技术中针对具有医疗作用的蛋白质或多肽进行PEG定点修饰来使其走向药物应用的技术被广泛研究。蛋白质或多肽的聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)修饰即PEG化(pegylation)，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。自1977年Davis首次采用PEG修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术迅速发展，并广泛应用于多种蛋白质和多肽的化学修饰，PEG修饰技术也从理论走向实际的药物应用。

PEG修饰能赋予蛋白质和多肽类多种优良性能，具体表现为循环半衰期延长、免疫原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等，在很大程度上扩宽了蛋白质和多肽的的应用范围。其机理可能为：蛋白质PEG修饰后，相对分子质量(Mr)增大，当修饰后的蛋白质的Mr达到或超出肾小球滤过阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球的滤过作用；由于PEG的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高，因而可以在血液循环中停留更长的时间；PEG在溶液中呈无规则卷曲，作为一种屏障，能掩盖蛋白质表面的抗原决定簇，使得蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，降低了蛋白质的免疫原性；PEG与蛋白质偶联后能将其优良的理化性质赋予蛋白质，如能改善蛋白质的生物分布和溶解性能。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactorrelatedapoptosis-inducingligand，TRAIL)也称为凋亡素-2配体(Apo-2L)，是新近发现的肿瘤坏死因子(TNF)基因超家族成员，属于II型跨膜蛋白(transmembraneprotein)。TRAIL是一个由281个氨基酸构成的II型跨膜蛋白，其中从第114个精氨酸(arginine)到第281个甘氨酸(glysine)的序列为诱导癌细胞凋亡的主要功能区域。它能通过与死亡受体结合选择性诱导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡，而对正常组织和细胞几乎没有不良反应。这一特性使得TRAIL在肿瘤的靶向治疗中具有良好的应用前景，被认为是一种非常具有发展潜力的抗肿瘤因子，近年已成为国内外研究的热点。但单体结构的TRAIL不能诱导细胞凋亡，只有三聚体结构的TRAIL才能与死亡受体(DR4，DR5)相结合发挥细胞凋亡的作用。但是在自然情况下TRAIL很难形成三聚体结构，把TRAIL应用到临床上仍有许多问题亟待解决。

发明内容

本发明的目的之一是为解决利用聚乙二醇修饰肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的难题，提供一种三聚体TRAIL蛋白及其应用，利用pET表达载体对人类TRAIL基因(114-281序列)进行基因克隆制作出具有N-末端组氨酸标签(Histidinetag)和异亮氨酸拉链基序(Leucinezipper)的TRAIL重组基因(pET23dw-His-ILZ-hTRAIL(114-281)，简称HZ-TRAIL)。利用PEGylation技术将TRAIL重组基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生产三聚体的高活性TRAIL蛋白质，并且本发明的三聚体TRAIL蛋白对抗肿瘤和抗类风湿关节炎的具有高药效的优点。

为了达到上述技术效果，本发明的技术方案包括：

一种三聚体TRAIL重组蛋白，所述三聚体TRAIL重组蛋白由TRAIL的114-281氨基酸序列与载体PET进行基因克隆制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因pET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，所述HZ-TRAIL再经聚乙二醇修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到所述经聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。

所述的三聚体TRAIL重组蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

一种经三聚体TRAIL重组蛋白，适用于在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中表达。

所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可诱导癌细胞或炎性淋巴细胞凋亡。

所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于抗肿瘤药物中。

所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于类风湿性关节炎药物中。

本发明的有益效果包括：

1、本发明一种三聚体TRAIL蛋白及其应用，利用PEGylation技术将HZ-TRAIL改良成新的PEG-HZ-TRAIL，改善了TRAIL固有的诸多问题比如减少药物降解及损失，从而延长了TRAIL的半衰期、通过延缓蛋白的排泄，提高其抗酶解的能力，增加其溶解性与稳定性，以及降低其免疫原性，显著

延长TRAIL的体内生物活性。另外，通过进一步研究证明了

PEG-HZ-TRAIL在抗肿瘤和抗类风湿关节炎的药效。

2、本发明一种三聚体TRAIL蛋白及其应用，PEG-HZ-TRAIL可以诱导多种癌细胞的凋亡，而对正常组织和细胞无任何副作用。

3、本发明一种三聚体TRAIL蛋白及其应用，PEG-HZ-TRAIL在RA发病过程中通过诱导炎性淋巴细胞的凋亡，降低炎症反应，对关节起保护作用。

附图说明

图1所示为本发明一种三聚体TRAIL重组蛋白PEG-HZ-TRAIL制备模式图；

图2所示为本发明一种三聚体TRAIL重组蛋白HZ-TRAIL的制备模式图；

图3A所示为在一般生理环境条件下HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图；

图3B所示为在血浆溶液中HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图；

图4所示为本发明实施例5HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的药代动力学比较分析图；

图5所示为本发明实施例6PEG-HZ-TRAIL对大肠癌细胞(HCT116)杀伤能力测定图；

图6所示为本发明实施例6PEG-HZ-TRAIL对结肠癌细胞(HCT116)的凋亡能力测定图；

图7A所示为本发明实施例6HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比较分析图；

图7B所示为本发明实施例6PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比较分析图；

图7C所示为本发明实施例6HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的肝脏组织病理学变化图；

图7D所示为本发明实施例6HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的肿瘤组织病理学变化图。

图8所示为本发明实施例7建立类风湿关节炎动物模型和处理药物流程图；

图9A所示为本发明实施例7PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠(CIA)治疗的浓度依赖性发病率变化图；

图9B所示为本发明实施例7PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠(CIA)治疗的浓度依赖性关节炎指标的变化图；

图10A所示为本发明实施例7野生型小鼠；

图10B所示为本发明实施例7野生型小鼠炎性淋巴细胞；

图10C所示为本发明实施例7处理PBS后的小鼠；

图10D所示为本发明实施例7处理PBS后的小鼠关节的炎性淋巴细胞；

图10E所示为本发明实施例7处理300μg/mouse的PEG-HZ-TRAIL的小鼠；

图10F所示为本发明实施例7处理300μg/mouse的PEG-HZ-TRAIL的小鼠关节的炎性淋巴细胞。

图11A所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质TNF-α水平的变化图；

图11B所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质IL-1β水平的变化图；

图11C所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质IFN-γ水平的变化图；

图11D所示为本发明实施例7处理不同浓度HZ-TRAIL后小鼠血清中促炎介质IL-2水平的变化图。

具体实施方式

下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

一种三聚体TRAIL重组蛋白，所述三聚体TRAIL重组蛋白由TRAIL114-281氨基酸序列与载体PET进行基因克隆制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因。pET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，所述HZ-TRAIL再经聚乙二醇修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到所述经聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。

所述的三聚体TRAIL重组蛋白氨基酸序列为如SEQIDNO:1所示。本发明的PEG-HZ-TRAIL蛋白可诱导癌细胞或炎性淋巴细胞凋亡，并且PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于抗肿瘤药物或可应用于类风湿性关节炎药物中。

实施例1

一种三聚体TRAIL重组蛋白，如图1所示PEG-HZ-TRAIL制备模式图，所述诱导配体为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤：

步骤一：HZ-TRAIL的制备：利用pET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因。pET23dwpET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，如图2所示HZ-TRAIL的制备模式图；

步骤二：HZ-TRAIL的提取和纯化：将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中，并在含有1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培养液在25℃，扩繁9个小时，然后将HZ-TRAIL在大肠杆菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后取20ml上清液缓慢注入到镍-氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4℃，离心处理20min，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20℃，备用；

步骤三：PEG-HZ-TRAIL的制备：取重量分数为1份的步骤二制备出的HZ-TRAIL加入到pH为5.0重量份数为0.15份的醋酸盐缓冲液中，加入重量份数为2份的聚乙二醇修饰剂和0.13份NaCNBH3，在低温4℃状态下进行N端氨基修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即为PEG-HZ-TRAIL蛋白，反应时间为10小时，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反应混合物；

步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化：将所述步骤三制备出的反应混合物利用凝胶过滤层析法进行分离纯化，然后通过超滤法浓缩，最终得到PEG-HZ-TRAIL。

实施例2

一种三聚体TRAIL重组蛋白，如图1所示PEG-HZ-TRAIL制备模式图，所述诱导配体为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤：

步骤一：HZ-TRAIL的制备：利用pET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因pET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，如图2所示HZ-TRAIL的制备模式图；

步骤二：HZ-TRAIL的提取和纯化：将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中，并在含有1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培养液在28℃，扩繁8个小时，然后将HZ-TRAIL在大肠杆菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后取20ml上清液缓慢注入到镍-氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4℃，离心处理20min，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20℃，备用；

步骤三：PEG-HZ-TRAIL的制备：取重量分数为1份的步骤二制备出的HZ-TRAIL加入到pH为5.0重量份数为0.15份的醋酸盐缓冲液中，加入重量份数为7.5份的聚乙二醇修饰剂和0.13份NaCNBH3，在低温4℃状态下进行N端氨基修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即为PEG-HZ-TRAIL蛋白，反应时间为8小时，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反应混合物；

步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化：将所述步骤三制备出的反应混合物利用凝胶过滤层析法进行分离纯化，然后通过超滤法浓缩，最终得到PEG-HZ-TRAIL。

实施例3

一种三聚体TRAIL重组蛋白，如图1所示PEG-HZ-TRAIL制备模式图，所述诱导配体为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤：

步骤一：HZ-TRAIL的制备：利用pET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因，pET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL，如图2所示HZ-TRAIL的制备模式图；

步骤二：HZ-TRAIL的提取和纯化：将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中，并在含有1mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培养液在30℃，扩繁6个小时，然后将HZ-TRAIL在大肠杆菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后取20ml上清液缓慢注入到镍-氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4℃，离心处理20min，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20℃，备用；

步骤三：PEG-HZ-TRAIL的制备：取重量分数为1份的步骤二制备出的HZ-TRAIL加入到pH为5.0重量份数为0.15份的醋酸盐缓冲液中，加入重量份数为10份的聚乙二醇修饰剂和0.13份NaCNBH3，在低温4℃状态下进行N端氨基修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即为PEG-HZ-TRAIL蛋白，反应时间为12小时，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反应混合物；

步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化：将所述步骤三制备出的反应混合物利用凝胶过滤层析法进行分离纯化，然后通过超滤法浓缩，最终得到PEG-HZ-TRAIL。

实施例4HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的理化特性比较分析

取实施例2制备出的HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL置于一般生理环境条件下，即于PBS溶液中，pH7.4，37℃环境下，得出HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图，见图3A所示的一般生理环境条件下HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图；

取实施例2制备出的HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL置于PBS：血浆＝1:1的血浆溶液中，调节pH7.4，保持温度37℃环境下，得出HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图，见图3B所示的血浆溶液中HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图；

由图3A可以看出，HZ-TRAIL在一般的生理环境条件下迅速沉积，但是PEG-HZ-TRAIL表现出良好的溶解性和稳定性。在图3B中可以看出，用50％大鼠血浆溶液(血浆：PBS＝1:1)处理24h后，PEG-HZ-TRAIL与HZ-TRAIL相比对大肠癌细胞(HCT116)表现出更好的细胞凋亡能力，说明PEG-HZ-TRAIL与HZ-TRAIL相比具有更好的稳定性。

实施例5HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的药代动力学比较分析

取10μg实施例2制备出的HZ-TRAIL和10μg实施例2制备出的PEG-HZ-TRAIL分别注入到大鼠(n＝10)体内，并利用ELISA方法分析血样。其结果见图4所示的HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的药代动力学比较分析图。由图4可以看PEG-HZ-TRAIL与HZ-TRAIL相比半衰期从1.5h增加到19.8h，而且生物活性也增加了26倍左右(HZ-TRAIL:40.1ng·h/min；PEG-HZ-TRAIL:1044.2ng·h/min)。

实施例6PEG-HZ-TRAIL的抗肿瘤活性测定

(1)PEG-HZ-TRAIL对癌细胞的杀伤作用

实验方法：(MTT实验)

①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积为200μl。

②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底。

③血清饥饿：加药2h以前换培养液(含1％FBS的培养液)。

④药物处理：将实施例2制备出的HZ-TRAIL与PEG-HZ-TRAIL分别取终浓度为0，1，3，10，30，100，300，1000ng/ml处理CCD-986sk细胞和HCT116细胞24h。

⑤呈色反应：每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH7.4)20μl。继续孵育2-4h后，小心吸弃孔内培养上清液，小心用PBS洗涤2次，然后每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10分钟，使结晶充分溶解。

①比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。测定结果见图5所示PEG-HZ-TRAIL对大肠癌细胞(HCT116)杀伤能力。结果分析：在图5中可以看出HZ-TRAIL(IC50:3.35ng/ml)与PEG-HZ-TRAIL(IC50:14.83ng/ml)对结肠癌细胞(HCT1116)都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高但是对正常人皮肤成纤维细胞(CCD-986sk)没有任何副作用。

(2)PEG-HZ-TRAIL对癌细胞的凋亡作用

(3)实验方法：(体外实验-Annexin-V染色法)

①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml。

②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底。

③药物处理：加入实施例2制备出的终浓度为100ng/ml的PEG-HZ-TRAIL，处理不同时间(0，3，6，12，24h)。

④用PBS洗涤2次，加入195μlAnnexinV-FITC结合液，再加入5μlAnnexinV-FITC轻轻混匀。

⑤加入10μl碘化丙啶(PropidiumIodide，PI)染色液，轻轻混匀。

⑥室温(20-25℃)避光孵育15分钟。

⑦在荧光显微镜下观察细胞的形态及颜色的改变，绿色荧光为AnnexinV-FITC染色阳性细胞，红色荧光为碘化丙啶阳性细胞。仅被绿色荧光染色，且体积小的细胞为凋亡细胞；被红色或绿色和红色双染，且体积较大的细胞为坏死细胞；未被染色的细胞为正常细胞。随机观察200个细胞，求得各种细胞所占的百分比，每个样本计数3次取平均。测定结果见图6所示PEG-HZ-TRAIL对结肠癌细胞(HCT116)的凋亡能力测定图。黑色为细胞凋亡，白色为细胞坏死。由图6实施例6PEG-HZ-TRAIL对结肠癌细胞(HCT116)的凋亡能力测定图可知实施例结果分析PEG-HZ-TRAIL(300ng/ml)可以诱导结肠癌细胞(HCT116)的凋亡，其癌细胞凋亡能力随着时间的增加而逐渐升高。

(3)PEG-HZ-TRAIL的抗肿瘤效能

实验方法：(体内实验)

①实验动物：BALB/c(nu/nu)小鼠，7-8周龄，体重20±0.34g，雌雄各半，饲养于SPF屏障系统动物室。

②人结肠癌裸鼠移植瘤模型建立：用含10％胎小牛血清的培养液配成3×106细胞/200μl的浓度的单个细胞(HCT116)悬液。将HCT116细胞株接种于BALB/c裸鼠的背部皮下部位(s.c.)建立人结肠癌裸鼠移植瘤模型。

③药物处理：a)为了比较HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRIL的抗肿瘤能力，接种两天后，每组(n＝10)小鼠分别处理(i.p.)HZ-TRAIL(150μg/小鼠/天)和PEG-HZ-TRAIL(150μg/小鼠/天)10天。b)为了查看PEG-HZ-TRAIL的浓度依赖性抗肿瘤能力，接种两天后，每组(n＝10)小鼠分别处理(i.p.)不同浓度(50、150及500μg/小鼠/天)的PEG-HZ-TRAIL10天。上述HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL为实施例2制备出的HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL。

④检测分析：a)检测瘤体积变化：接种细胞后，每日观察小鼠的活动、进食及饮水情况，并记录异常情况。每隔1-2天，用卡尺测量各组用药前后皮下移植瘤的最大长径(a)和横径(b)，按公式计算瘤体积(V)＝ab2/2。b)组织病理学检查：小鼠处死后，各组织以4％多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。进行TUNEL染色，光镜下观察组织病理变化及细胞凋亡情况。

测定结果见图7所示HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能和组织病理学比较分析。图7A为TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比较分析图，图7B为PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比较分析图；图7C为TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的肝脏组织病理学变化图；图7D为TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的肿瘤组织病理学变化图。图7A中可以看出PEG-HZ-TRAIL与HZ-TRAIL相比更有效地抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长，呈剂量依赖性(图7B)。在图7C中可以看出HZ-TRAIL诱导肝脏细胞的凋亡，而PEG-HZ-TRAIL对肝脏细胞无任何副作用。另外，图7D中可看出PEG-HZ-TRAIL与HZ-TRAIL相比具有更好的肿瘤细胞凋亡能力。

实施例7PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎的治疗效果测定

(1)PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发病过程中对临床指数的影响

实验方法：(类风湿关节炎动物模型)

①实验动物：DBA/1J小鼠，雄性，7-8周龄，体重20±0.34g，饲养于SPF屏障系统动物室。

②CIA小鼠模型建立：a)将II型胶原(CII)溶于0.05mol/L的冰醋酸中，浓度为2mg/ml，将溶解的胶原与CFA等体积混合，冰浴中使用匀浆器充分乳化。b)免疫动物时，在小鼠尾根部多点皮内注射0.1ml乳剂(含100mgCII和200mg结核分枝杆菌)。基础免疫后第21天以同样方法重复，避开初次免疫部位，进行加强免疫。

③药物处理：a)分为5个实验组，即野生型小鼠(对照组)10只，阳性对照组(PBS)

10只，以及处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL的小鼠(50μg/mouse，150μg/mouse，300μg/mouse)各10只，总共50只。b)对于处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL的小鼠，加强免疫后第21天开始每3天或每1周处理1次(i.p，50μl)药物，直到实验结束(初次免疫后第51天)为止。如图8所示建立类风湿关节炎动物模型和处理药物流程。

④检测分析：通过观察关节和关节外病变及利用关节炎评分方法，比较分析各组之间

RA的各种指标包括关节炎临床指数(Clinicalscore)，发病率(Incidence)等。评分方法：《0》无红肿；《1》关节红不肿；《2》关节轻度红肿；《3》关节中度红肿；《4》关节重度红肿伴功能障碍。关节炎分数为每只小鼠所有病变关节分数的总和，最高分为16分。测定结果见图9APEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠(CIA)治疗的浓度依赖性关节炎指标的变化图，图9BPEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠(CIA)治疗的浓度依赖性发病率变化图。由图9结果可知，PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎具有良好的治疗效果。CIA的临床指数也随药物浓度的增加而逐渐减少。同样其CIA发病率随药物浓度的增加而逐渐降低。

(2)PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发病过程中对炎症反应的调控作用

实验方法：

①采样：将上述药物处理③野生型小鼠(对照组)、阳性对照组(PBS)、以及处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL的小鼠(初次免疫后第51天)，利用乙醚麻醉脱颈处死小鼠并采样，包括肘关节、膝关节，外周血清，以及组织脏器等。关节除去病变关节的皮毛和多余的皮下组织、保留跖趾关节，并用4％多聚甲醛固定，10％EDTA脱钙，常规脱水，石蜡包埋，切片。

②检测分析：a)利用组织病理学方法(H/Estaining)比较分析各组之间肘关节和膝关节的炎症程度(滑膜细胞与炎性淋巴细胞浸润)。b)利用EILSA方法和免疫染色方法比较分析各组之间外周血请以及关节腔中的炎性介子(TNF-α，IL-1β，IL-2，IFN-γ)的水平。

测定结果见图10对类风湿关节炎小鼠模型(CIA)处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL后关节组织病理学变化图，由图10结果可知，PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发病过程中对炎症具有良好的抑制效果，炎性淋巴细胞和滑膜细胞的浸润程度随药物浓度的增加而逐渐降低。

图11对类风湿关节炎小鼠模型(CIA)处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL后，血清中促炎

介质水平的变化图。图11A、图11B、图11C和图11D所示可知PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发病过程中对炎症具有良好的抑制效果，血清中促炎介质(TNF-α，IL-1β，IFN-γ，IL-2)的水平随药物浓度的增加而逐渐降低。

由上述内容可知，本发明提供的一种三聚体TRAIL蛋白及其应用，利用pET表达载体对人类TRAIL基因(114-281序列)进行基因克隆制作出具有N-末端组氨酸标签(Histidinetag)和异亮氨酸拉链基序(Leucinezipper)的TRAIL重组基因(pET23dw-His-ILZ-hTRAIL(114-281)，简称HZ-TRAIL)。利用PEGylation技术将TRAIL重组基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生产三聚体的高活性TRAIL蛋白质，并且本发

明的利用聚乙二醇修饰肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对抗肿瘤和抗类风湿关节炎的具有高药效的优点。

上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。

另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做出的各种各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (6)

1.一种三聚体TRAIL重组蛋白，其特征在于，所述三聚体TRAIL重组蛋白由TRAIL_114-281氨基酸序列与载体PET进行基因克隆制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因PET23dw-His-ILZ-hTRAIL_114-281的TRAIL重组蛋白，简称重组蛋白HZ-TRAIL，所述重组蛋白HZ-TRAIL再经聚乙二醇修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到所述经聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种三聚体TRAIL重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白HZ-TRAIL的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

3.根据权利要求1所述的一种经三聚体TRAIL重组蛋白，其特征在于，所述三聚体TRAIL重组蛋白适用于在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中表达。

4.权利要求1～3任一项所述的一种三聚体TRAIL重组蛋白的应用，其特征在于，所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可诱导癌细胞或炎性淋巴细胞凋亡。

5.根据权利要求4所述的一种三聚体TRAIL重组蛋白的应用，其特征在于，所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于抗肿瘤药物中。

6.根据权利要求4所述的一种三聚体TRAIL重组蛋白的应用，其特征在于，所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于类风湿性关节炎药物中。