JP5995879B2 - 血管生成の抑制剤、並びにその製造方法、修飾方法及び抗腫瘍薬の製造における用途 - Google Patents
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Description
血管生成抑制ポリペプチドIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ES-2と称す)の両端に、少なくともその一端にインテグリンファミリーに親和性又は結合力を有するポリペプチドが接続してあり、前記した「インテグリンファミリーに親和性又は結合力を有するポリペプチド」とは、Arg-Gly-Asp又はArg-Gly-Asp-Linkerを含む配列を指し、上述したリンカー(Linker)及び本出願すべてのリンカーは、一つか又は複数の異なるアミノ酸のことを指すのである。
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P2)、Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-linker-Arg-Gly-Asp(P3)、Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp (P4)、Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Arg-Gly-Asp(P5)、Arg-Gly-Asp-Linker -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker -Arg-Gly-Asp(P6)、
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker- Arg-Gly-Asp(P7)、又はArg-Gly-Asp-Linker -Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp (P8)。
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg -Cly-Asp-Cys-Phs-Cys-Linkerを含む配列は、下記ポリペプチド配列より選び出している。
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro (P10)、Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P11 )、Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P12 )、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys(P13)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro -Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P14 )、
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Va
l-Pro-Linker-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (P15)、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-linker-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-linker-A
la-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ( P16 )。
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの標的性を高めることができる(表1参照)。
はAla-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Linkerを含む配列であり、その中の-Linkerは一つ又は複数の異なるアミノ酸である。
ナノ薬物製造が含み、ポリ乳酸(PLA)ナノ粒子やナノ微粒子、又はポリブチルシアノアクリレート(PBCA)ナノ粒子やナノ微粒子、又はキトサンナノ粒子やナノ微粒子の製造が含まれる。
合成コーデイングされたRGD−EDポリペプチド配列の塩基をテンプレートにする。上流・下流プライマーを設計して、その中、上流プライマーにNdeI酵素切断部位を加え、下流プライマーにはArg-Gly-Asp配列とXhoI部位を有する。PCR増幅し、増幅生成物がアガロースゲル電気泳動回収と純化を経て、NdeIとXhoI制限酵素切断を行い、原核生物の発現ベクターpwにクローニングし、PCR陽性クローンをスクリーニングする。ヌクレオチド配列の分析でその配列に設計上著しい変化が発生したのを確認した。
合成のプライマー1:5’GGAATTCCATATG ATCGTGCGCCGTGCCGACCGC3’
合成のプライマー2:5’CCGCTCGAGGCAGAAGCAGTCACCACGGCA3’
うち、プライマー1はNdeI部位とIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの一部の配列をコーデイングする。プライマー2はXhoI部位とArg-Gly-Asp配列を有する遺伝子をコーデイングした。
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro(ED)。
発現型プラスミドを大腸菌に転換させ、組み換え菌が1mM IPTG誘発3時間後細胞を採取し、超音波破砕し、上清と沈澱に遠心分離し、15%SDS−PAGEの電気泳動、クマシーブリリアンドブルー染色のSDS−PAGEスキャン(UVP White/Ultraviolet transilluminator)を行い、その発現結果を分析する。
超音波破砕と遠心分離をし、封入体沈澱を0.1M trisとデオキシコール酸ナトリウムにて洗滌して、沈澱をラウリルサルコシン酸ナトリウム(SLS)に溶解する。4℃、10000rpmにて5min遠心分離し、上清液4℃にて透析する。透析液はbuffer A(10mM Tris−HCl、0.1mM酸化型グルタチオンと1mM還元型グルタチオン、pH7.4)である。6−8hで一回液体を取り替え、計三回取り替える。最後に一回透析をする。透析液はbuffer B(10mM Tris−HCl、pH7.4)である。サンプルに対して直接SP−Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)−クロマトグラフィーを行う。カラムへの平衡洗滌はbuffer Bを使い、0.6M NaCl、Tris−HCl、pH7.4と1M NaCl、Tris−HCl、pH7.4を使って順番で溶出する。溶出液を混合させ、buffer B透析後、冷凍乾燥して濃縮させる。クロマトグラフィーの結果は図1の示した通りである。
BCE細胞とNIH 3T3細胞を培養する。その方法:培養液DMEに10%の不活化牛胎児血清(BCS)、1%の抗生物質及び3ng/ml bFGFが含まれる。細胞増殖分析方法は下記の通りである。PBSにて細胞を洗滌してトリプシンを消化する。浮遊細胞培養液を加え、遠心分離して細胞を採取する。細胞の濃度を25,000cells/mlに調整する。細胞を6オリフィス(0.5ml/well)に移入して24h培養し、培養液を1ml DMEMに交換する。5%BCS5、1%抗生物質、1ng/ml bFGF、各ホールに異なる投与量を入れてさらに48h培養する。トリプシンにて細胞を消化してPBSに再浮遊させる。70%の冷たいエタメールにて30min固定させ、7−AAD染色する。細胞流量計測器で分析を行う。
体内の抗血管生成活性を測定するため、CAM分析をする。すべての実験がクリーンベンチに無菌操作で行われる。消毒した六日間の鶏胚を37℃、90%湿度の条件下で培養する。二日間後、各卵の上部に穴を開けて試薬を滅菌のWhatman濾紙に滴加し、CAMsの血管集中部位に入れる。48時間培養した後、鶏胚とCAMsを観察して写真を撮る。図2の示したように、RGD−ED体内抗新生血管生成活性を評価するため、用量の異なるRGD−EDを使ってCAM実験を行った。うち、0.05μg、0.1μgと0.2μgのRGD−EDが明らかに新生血管と血管生成を抑制できるのである。0.5μg RGD−EDは完全に血管生成を抑制でき、鶏胚の死亡に至るのである。RGD−EDは血管生成抑制の潜在的作用を有する。
約1−70重量%のポリペプチドを最適約20−50%にして、約20−95重量%のポリエチレングリコールSC−mPEG(メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート、平均分子量5000)又はSS−PEG(スクシンイミジルスクシネート)又はPEG−イソシアン酸塩(PEG-lsocyanate)の溶液と混合する。約50−93重量%の上記修飾物を取って充分混合し、4℃−40℃の間、最適25℃−37℃のシェーカーで10分以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーでN末端修飾される生成物を分離する。
約1−70重量%のポリペプチドを最適約20−50%にして、約20−95重量%のmPEG−NH2(平均分子量5000)、少量のDCCI(ジシクロヘキシルカルボジイミド)溶液と混合する。最適約50−93重量%の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適23℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適90分、カルボキシがmPEG−NH2の中のアミノ酸と結合してアミドを形成する。RP−HPLC分離でN末端の修飾される生成物を得る。
約1−70重量%のポリペプチドを最適約1−30%にして、約20−95重量%のmPEG−MAL(mPEG−マレイミド、平均分子量5000)溶液と混合する。最適約70−94%の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適20℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適60分、イオン交換クロマトグラフィーでN末端の修飾される生成物を得る。
その他の修飾方法はすべてPEG修飾を参照する。最良修飾効果はPEG修飾とリポソーム修飾である(図4参照)。
培養したB16F10悪性黒色腫細胞を0.05%のトリプシンで消化し、1000rpm 5分遠心分離し、PBSに再浮遊させる。C57BL/6マウス(6−8週)の外側皮下に5×105細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が200mm3−300mm3に達した際、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。中の一組はRGD−ED治療を受け、もう一組はRGD−EDの含まない治療を受ける。上記二組の線量は皆5mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積=長さ×幅2×0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、(1−T/C)×100%で、T=治療組の腫瘍体積、C=対照組の腫瘍体積。
プライマー2コーデイングするXhoI部位に有する遺伝子配列Arg-Gly-AspはArg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly配列に変わる。増幅してIle-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列を得て、クローニングする。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-の遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-の遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Aspの遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Arg-Gly-Asp遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Proの遺伝子配列をクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysの遺伝子配列を得てクローニングする。
全体の遺伝子合成である
Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro- Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cysの遺伝子配列をクローニングする。
約1−70重量%のポリペプチドを最適約20−50%にして、約20−95重量%のポリエチレングリコールSC−mPEG(メトキシ化PEGスクシンイミジルカーボネート、平均分子量5000)又はSS−PEG(スクシンイミジルスクシネート)又はPEG−イソシアン酸エステル(PEG−Isocyanate)の溶液と混合する。約50−93重量%の上記修飾物を取って充分混合し、4℃−40℃の間、最適25℃−37℃のシェーカーで10分以上振とう反応させ、イオン交換クロマトグラフィーでN末端修飾される生成物を分離する。
約1−70重量%のポリペプチドを最適約20−50%にして、約20−95重量%のmPEG−NH2(平均分子量5000)、少量のDCCI(ジシクロヘキシルカルボジイミド)溶液と混合する。最適約50−93重量%の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適22℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適90分。カルボキシル基はmPEG−NH2の中のアミノ基と結合してアミド結合を形成し、RP−HPLC分離でN末端の修飾される生成物が得られる。
約1−70重量%のポリペプチドを最適約1−30重量%にして、約20−95重量%のmPEG−MAL(mPEG−マレアミド、平均分子量5000)の溶液と混合する。最適約70−94%の上記修飾物を充分混合し、4℃−40℃の間、最適20℃−37℃のシエーカーで10分以上振とう反応させる。最適60分。イオン交換分離でN末端の修飾される生成物を得る。
培養した人肝細胞癌SGC7901を0.05%のトリプシンで消化し、1000rpmで5分遠心分離してPBSに再浮遊させ、6−8週間の裸マウスの外側皮下に5×105細胞0.1mlを接種する。腫瘍の平均体積が100mm3−200mm3に達した時、マウスをランダムに組を分け、一組7匹にする。うち、一組はRGD−ED治療を受け、もう一組はリポソーム修飾のRGD−EDで治療し、あとの一組はポリエチレングリコール修飾のRGD−EDで治療する。上記三組の線量は皆3mg/kg/dであり、対照しながらPBSを注射する。治療は腫瘍接種の反対側に皮下注射方法を用いる。毎日ノギスで腫瘍の大きさを測定して腫瘍の体積を計算する。使用公式は腫瘍体積=長さ×幅2×0.52で、治療効果は限定時間内腫瘍の抑制率で表現、即ち、(1−T/C)×100%で、T=治療組の腫瘍体積、C=対照組の腫瘍体積。
約10−90重量%のポリペプチドを最適約25−50重量%にして、約10−90重量%の活性化低分子量ヘパリンと混合し、最適約43−75重量%。pH=7−9の緩衝液に4℃、18時間以上軽く振とう反応させ、イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
80mg−120mgのPEG−PLAと15mg−30mgのポリペプチドを取り、40mlのN,N−ジメチルホルムアミドに溶解して混合物をMWCO 3500の透析袋に移す。3L−4Lの蒸留水に48時間透析し、遠心分離して沈澱を取り除く。上清を0.45μmで膜濾過してポリマーのミセル溶液を得る。
1gのデキストラン(分子量35000)を取って活性化させ、10mg−60mgのポリペプチドを入れる。最適20mg−45mg。4℃のシエーカーで15時間以上ゆっくりと振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
約5−90重量%のポリペプチドを最適約25−60重量%にして、約10−95重量%の活性化パルミチン酸と混合する。最適約43−90重量%、4℃−40℃の間、最適25℃−37℃のシエーカーで30分以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
約1−90重量%のポリペプチドを最適約7−50重量%にして、約10−95重量%の活性化ポリシアル酸と混合する。最適約50%−93重量%、4℃−40℃の間、最適25℃−37℃のシエーカーで15時間以上振とう反応させる。イオン交換クロマトグラフィーで遊離アミノ基の修飾される生成物を分離する。
10mg−50mgのキトサンを取って20ml−40mlの水と混合し、20−40分超音波して微粒子分散液を獲得する。3.5mg−6mgのポリペプチドを入れて2ml−5mlの無水メタナールに溶解し、超音波の過程においてゆっくりと微粒子分散液に滴加してポリペプチドを封じておく。遠心分離でナノ微粒子を得る。
Claims (5)
- Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Proの少なくとも一端にインテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドが接続されたポリペプチドを含む高性能血管生成抑制剤であって、
前記インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドは、
Arg−Gly−Asp若しくはそのいずれか一端に(Gly)nで表されるリンカーを有するポリペプチド(n=1〜4の整数)、又は
Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys若しくはそのいずれか一端に(Gly)nで表されるリンカーを有するポリペプチド(n=1〜4の整数)であり、
前記インテグリンファミリーに親和性と結合力を有するポリペプチドがポリビニルピロリドン又はパルミチン酸で修飾されている、高性能血管生成抑制剤。 - 前記ポリペプチドが、以下のポリペプチドより選ばれたものである(n;1〜4の整数)、請求項1記載の高性能血管生成抑制剤。
Arg−Gly−Asp−(Gly)n−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro
Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−(Gly)n−Arg−Gly−Asp
Arg−Gly−Asp−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−Arg−Gly−Asp
Arg−Gly−Asp−(Gly)n−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−(Gly)n−Arg−Gly−Asp
Arg−Gly−Asp−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−(Gly)n−Arg−Gly−Asp
Arg−Gly−Asp−(Gly)n−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−Arg−Gly−Asp
Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys−(Gly)n−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro
Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−(Gly)n−Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys
Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys
Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys−(Gly)n−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys
Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−(Gly)n−Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys
Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys−(Gly)n−Ile−Val−Arg−Arg−Ala−Asp−Arg−Ala−Ala−Val−Pro−(Gly)n−Ala−Cys−Asp−Cys−Arg−Gly−Asp−Cys−Phe−Cys - 請求項1又は2記載の高性能血管生成抑制剤の製造方法であって、
前記ポリペプチドの修飾ステップを含み、該修飾ステップは、前記ポリペプチド配列に対し、ポリビニルピロリドン修飾又はパルミチン酸修飾である、高性能血管生成抑制剤の製造方法。 - 前記ポリペプチドの修飾ステップは、
(1)1〜70重量%のポリペプチドを用いて、20〜95重量%のポリビニルピロリドン又はパルミチン酸溶液と混合する;
(2)4℃〜40℃の間、シェーカーで10分以上振とう反応させる;
(3)修飾された生成物を分離する、
である、請求項3記載の高性能血管生成抑制剤の製造方法。 - 抗腫瘍薬物を製造するための、請求項1又は2記載の高性能血管生成抑制剤の使用。
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