CN1984924B - 提高蛋白质与聚乙二醇（peg）结合度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及高结合度蛋白以及生成此类蛋白的方法。具体地讲，本发明涉及使用具有活性的聚乙二醇(PEG)连接剂连接蛋白质更多部位(但不使蛋白质变性)的方法。本发明还涉及免疫原性更弱，循环半衰期更长的高结合度蛋白质。

Description

提高蛋白质与聚乙二醇(PEG)结合度的方法
相关申请交互参照
本申请涉及2004年3月17日提交的临时申请60/554,310。本申请以参照方式包含该文档。 
技术领域
本发明涉及蛋白(特别是高结合度蛋白)疗法领域以及生成此类蛋白的方法。
背景技术
聚乙二醇(PEG)化的蛋白药物已经显示出不可小看的治疗优势，包括血清半衰期的延长和抗原性的降低(Kozlowski，A.，et al.，J.ControlledRelease(2001)72：217-224)。PEG的每个环氧乙烷(ethylene oxide)单元与两个或三个水分子结合，因此，从其活动来看，该分子大小似乎是分子量相近的普通蛋白大小的五至十倍(Kozlowski，A.，supra)。聚乙二醇化蛋白的清除率与分子量成反比(Yamaoka，T.，et al.，J.Pharm.Sci.(1994)83：601-606)。分子量低于20,000的分子通过尿液清除。具有更高分子量的PEG蛋白通过尿液和粪便以更缓慢的速度清除(Yamaoka，T.，supra)。聚乙二醇化蛋白溶解度更高、抗原性更低、水解稳定性更高，而且其肾清除率得到了降低，肿瘤导向性更强。
当前，聚乙二醇化的腺苷脱氨酶、天(门)冬酰胺酶、α-IFN和生长激素拮抗剂已经通过药品注册审批。(Maeda，H.，et al.(eds.)，Advances inexperimental medicine and biology：polymer drugs in the clinical stage，(2003)Vol.519，Dordrecht，The Netherlands：Kluwer Academic/Plenum Publishers)。两种PEG-α-IFN被批准用于丙型肝炎治疗。(Kozlowski，A.，supra和Gilbert，C.W.，et al.，U.S.patent 5,951,974(1999))。对顽固性或复发性急性淋巴细胞白血病(ALL)患者采用聚乙二醇化天(门)冬酰胺酶与氨甲叶酸、长春新碱和波尼松相结合的方式进行治疗(Aguayo，A.，et al.，Cancer(1999)86：1203-1209)。研究还表明，PEG-ADA可以显著增强腺苷脱氨酶(ADA) 缺乏症患者的免疫系统，此类病人由于免疫系统的发育受到抑制，几乎对各种传染病都缺乏抵抗力。(Pool，R.，Science(1990)248：305；和Hershfield，M.S.，Clin.Immunol.Immunopathol.(1995)76：S228-S232)。虽然聚乙二醇化蛋白表现出了理想的治疗特性，但蛋白质上可结合PEG的位点的数目和分布却限制了蛋白质的PEG化。
发明公开
本发明涉及高结合度蛋白以及生成此类蛋白的方法。具体来说，本发明涉及聚氧亚烷基(polyoxyalkylene)与治疗蛋白的化学偶联方法，该方法可生成免疫原性更低、循环半衰期更长的高结合度蛋白。
一方面，本发明涉及使用非蛋白聚合链修饰蛋白质的方法，包括：a)将蛋白质与非蛋白聚合物偶联，生成初级修饰蛋白，此时该蛋白具有一条或多条非蛋白聚合链；b)将初级修饰蛋白(具有一条或多条非蛋白聚合链)与具有至少两个氨基的多官能氨偶联，生成具有一个或多个附加氨基的修饰蛋白；c)将含有一个或多个附加氨基的修饰蛋白与另一种非蛋白聚合物偶联，生成次级修饰蛋白，它比初级修饰蛋白含有更多的非蛋白聚合链。
在一个示例中，使用能与蛋白质的N端氨基反应的官能团，对非蛋白聚合物进行衍生化反应。例如，非蛋白聚合物可与N-羟基丁二酰亚胺进行衍生化反应。在一个示例中，非蛋白聚合物为聚氧亚烷基，例如聚乙二醇。在特殊示例中，官能化的非蛋白聚合物为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸。通常，非蛋白聚合物的分子量大约为5000。
在步骤a)中，初级修饰蛋白可通过蛋白质N端氨基与非蛋白聚合物的酯基偶联来形成。在步骤2中，修饰蛋白(含有一个或多个附加氨基)可通过将初级修饰蛋白的C端羧基与多官能胺中的氨基团相偶联来形成。多官能胺可以是二氨基丁烷。在一个示例中，羧基在催化剂(例如碳二亚胺)存在时，与多官能胺进行偶联。在特殊示例中，羧基在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺存在时与多官能胺偶合。在另一示例中，第二次偶联生成修饰蛋白时，初级修饰蛋白之间没有发生交联。
在一个示例中，首次偶联步骤中的蛋白质与非蛋白聚合物的比为1∶15。在另一个示例中，第二次偶联时，初级修饰蛋白与非蛋白聚合物的比为1∶60。
本发明还提供了根据上述方法修饰的蛋白质。在一个示例中，蛋白质为高结合度蛋氨酶。此外，本发明提供了使用聚乙二醇链两次修饰的蛋白质，其中首次修饰是将蛋白质的N端氨基与聚乙二醇酯衍生物偶联，形成初级聚乙二醇化蛋白质，然后将初级聚乙二醇化蛋白的C端羧基与多官能胺(至少含有两个氨基)偶联以形成初级修饰蛋白(含有聚乙二醇链和一个或多个附加氨基)；其中第二次修饰是将初级修饰蛋白的一个或多个附加氨基与其它聚乙二醇酯衍生物偶联，以形成次级修饰蛋白，它含有比初级修饰蛋白更多的聚乙二醇链。本发明还提供了包含本发明修饰蛋白及药学上可接受的赋形剂的医药组合物。
此外，本发明提供了调节肿瘤活动的方法，包括让有此需要的受治者使用有效治疗剂量的本发明中提到的修饰蛋白或其医药组合物。受治者可以是人或动物。
本文使用的术语“多官能胺”指至少含有一个氨基官能团的胺。在一个示例中，脂肪多官能胺(最好二胺)被用作偶合剂。含有三个或更多氨基官能团的脂肪多官能胺以及芳香多官能胺也拟用作偶合剂。脂肪多官能胺的示例包括但不限于1，4-二氨基丁烷、1，2-二氨基-2-甲基丙烷、1，5-二氨基戊烷、2，2-二甲基-1，3-丙烷二胺、1，6-已烷二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺。在一个示例中，1，4-二氨基丁烷用作偶合剂。芳香族多官能胺的示例包括但不限于p-苯二胺、p-甲代亚苯基二胺和二氨基萘。
本文使用的术语“偶合剂”指能在两种反应物之间形成聚合连接的所有物质。在一个示例中，碳二亚胺被用于将氨基与羰基(例如酯或酸)偶联。碳二亚胺的示例包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、双(三甲基甲硅烷基)碳二亚胺或N-环己基-N’-(β-[N-马啉代甲基]乙基)碳二亚胺p-甲苯磺酸盐。在一个示例中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺被用于偶联蛋白质的N端氨基与羰基(例如酯或酸)。
本文使用的术语“活化的聚乙二醇”或“活化的PEG”指使用反应活性更强的官能团与聚乙二醇进行衍生反应获得的产物。在特殊示例中，活化的聚乙二醇可以通过使用能够与赖氨酸或蛋白质的N端氨基进行反应的官能团进行衍生反应得到。活化聚乙二醇的方法已为本行业专业人员所熟知。例如，聚乙二醇可以酯化为N-羟基丁二酰亚胺，以形成活化的PEG酯。
绘图简要说明
图1描述制备super-PEG-rMETase的方案。
图2说明NHS/EDC摩尔比对rMETase的羧基酰胺化程度的影响。
图3说明EDC/rMETase摩尔比对rMETase的羧基酰胺化程度的影响。
图4说明二氨基丁烷(DAB)/rMETase摩尔比对rMETase的羧基酰胺化程度的影响。
图5显示rMETase和聚乙二醇化的rMETases的SDS-PAGE。
图6说明rMETase羧基酰胺化期间交联对于初次聚乙二醇化的影响。
图7对天然rMETase(◆)、PEG-rMETase(■)和高结合度PEG-rMETase 
Figure G200580015792920061122D000041
进行免疫原性比较。
实施发明的模式
本发明涉及高结合度蛋白以及生成此类蛋白的方法。具体地讲，本发明涉及使用具有活性的聚乙二醇(PEG)连接剂连接蛋白质更多部位(但不使蛋白质变性)的方法。本发明还涉及免疫原性更弱，循环半衰期更长的高结合度蛋白质。
要使PEG与蛋白质结合，首先将羟(基)端转变为可与赖氨酸和蛋白质N端氨组团进行反应官能团，以此活化聚合物(Kozlowski，A.，supra)。因为PEG修饰基于蛋白质赖氨酸残基中的ε氨基与活化的PEG酯之间发生的反应，所以任何蛋白质的PEG修饰效果主要依赖于PEG结合点的数目和分布(Hershfield，M.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88：7185-7189)。一个增加聚乙二醇化可用点的方法是定点突变，它利用赖氨酸代替蛋白质中的特定氨基酸(Hershfield，M.S.，supra；和He，X.H.，et al.，Life Sci.(1999)65：355-368)。另外可以使用化学耦合法。(Davis，F.F.，et al.，U.S.patent 4,179,337(1979)；Veronese，F.M.，Biomaterials(2001)22：405-417；和Kimura，M.，et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1988)188：364-369)。
增加蛋白质中聚乙二醇结合点的化学耦合方法是基于碳二亚胺介导的水溶反应，该反应可以使蛋白质中的羧基团与多官能胺中的其它氨基反应。因此，该方法可以向蛋白质的羧基添加能进行聚乙二醇化的氨基基团。然 而，该方法受到交联反应的限制；交联反应可产生羧基酰胺化蛋白或肽段的聚合形式(Davis，F.F.，supra)。
本发明的方法使蛋白质具有更多的连接位点，用于与活化的聚乙二醇(PEG)连接剂结合，本方法不会使蛋白质变性。(Li et al.，Anal.Biochem.330：264-271(2004)，特此引用)。高结合度蛋白一直表现出较低的免疫原性和较长的半衰期。(Yang et al.，Cancer Res.64：6673-6678(2004)，特此引用)。一直有迹象表明，高结合度蛋白的循环半衰期对于辅助因子吡哆醛-5’-磷酸盐的量具有很强的依赖性。(Yang et al.，Cancer Res.64：5775-5778(2004)，特此引用)。
该方法总体上包括：a)将蛋白质与非蛋白聚合物偶联，生成初级修饰蛋白，此时该蛋白具有一条或多条非蛋白聚合链；b)将初级修饰蛋白(具有一条或多条非蛋白聚合链)与具有至少两个氨基的多官能氨偶联，生成具有一个或多个附加氨基的修饰蛋白；c)将含有一个或多个附加氨基的修饰蛋白与另一种非蛋白聚合物偶联，生成次级修饰蛋白，它比初级修饰蛋白含有更多的非蛋白聚合链。
本发明方法通过重组蛋白模型L-蛋氨酸-α-脱氨-γ-巯基甲烷裂解酶(rMETase)进行说明。但本发明方法不限于rMETase的结合，它通常还可用于其它蛋白。每个rMETase单体的398个氨基酸中只有9个赖氨酸残基，远远低于这种氨基酸(赖氨酸)在大多数蛋白质中出现的一般频率。相反，每个rMETase亚基含有37个羧基，这些羧基可以偶联更多的氨基，用于聚乙二醇化。
Pseudomonas putida的L-蛋氨酸α-脱氨-γ-巯基甲烷裂解酶(METase)[EC 4.4.1.11]此前已在Escherichia coli中进行过克隆和表达(Tan Y.，et al.，Protein Expr.Purif.(1997)9：233-245；Inoue，H.，et al.，J.Biochem.(1995)117：1120-1125；和Hori，H.，et al.，Cancer Res.(1996)56：2116-2122)。重组蛋氨酸酶(rMETase)在人类癌症的小鼠模型中具有活力。rMETase通过消耗血浆中的蛋氨酸发挥作用，肿瘤通常对蛋氨酸具有异常大需求。此外，短暂的蛋氨酸耗尽可导致肿瘤对几种化学疗法试剂的敏感度显著增加(Tan，Y.，et al.，Clin.Cancer Res.(1999)5：2157-2163；Yoshioka，T.，et al.，CancerRes.(1998)2583-2587；和Kokkinakis，D.M.，et al.，Cancer Res.(2001)61：4017-4023)。
此前，研究人员曾将rMETase与甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸-5000(MEGC-PEG-5000)结合以延长其循环半衰期，进而延长体内血浆和肿瘤中蛋氨酸处于耗尽状态的时间。当rMETase分别以30/1、60/1和120/1的PEG/rMETase摩尔比进行聚乙二醇化修饰时，一个rMETase亚基大约被4、6和8个PEG分子修饰。与未修饰的rMETase相比，PEG-rMETase(120/1)的血清半衰期增加了20倍，蛋氨酸耗尽的时间增加12倍。体内半衰期的增加取决于rMETase聚乙二醇化的程度。聚乙二醇化还降低了rMETase的免疫原性。免疫原性降低的程度取决于聚乙二醇化的残基数量(Sun，X.，et al.，Cancer Research(2003)63：8377-8383)。
表1显示了不造成rMETase分子交联的super-PEGylated rMETase三步制备法，它包括：初级聚乙二醇化、羧基酰胺化以及高级聚乙二醇化。首先，通过甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸(MEGC-PEG-5000)对rMETase进行初级聚乙二醇化。在具体的实施例中，在PEG和rMETase之比为15∶1的情况下进行初级聚乙二醇化。
第二步，初步聚乙二醇化蛋白的羧基随后与多官能胺(例如二氨基丁烷(DAB))结合，从而实现羧基酰胺化。在具体实施例中，羧基酰胺化在催化剂(例如水溶性碳二亚胺)的参与下进行。尽管本发明未受结合机制的限制，但是羧基酰胺化期间rMETase分子之间的交联仍可被已经与蛋白质结合的PEG链所形成的空间位阻所抑制。
第三步，将羧基酰胺化的聚乙二醇化rMETase与甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸结合，形成高级聚乙二醇化的rMETase。在具体实施例中，高级聚乙二醇化在PEG与PEG-rMETase比为60∶1时进行。生化分析表明，高级聚乙二醇化后有13条PEG链结合到每个rMETase亚基，而对于非羧基酰胺化PEG-rMETase来说，这一数字仅为6～8。高级聚乙二醇化后的分子仍保留着非聚乙二醇化rMETase活性的大约15-20％。与PEG-rMETase和rMETase相比，super-PEG-rMETase的免疫原性显著降低。初期结果表明，高级聚乙二醇化可能成为蛋白质生物制剂聚乙二醇化的一个全新策略。
表1显示每步反应对rMETase比活力的影响。表1中，起始物为200mg的rMETase，它具有56U/mg的比活力。活力回收率根据比较裸rMETase与每种经过修饰的rMETase的比活力计算得出。如表1所示，羧基酰胺化反应是导致比活力降低的最重要原因。
表一
在羧基酰胺化介导的重组蛋氨酸酶(rMETase)高级PEG化过程中蛋白质和rMETase活力的回收率
 步骤   总容量   (ml)   总活力   (U)   蛋白质总   量(mg)   比活力   (U/mg)   回收率   ％
 第一步 初级 PEG化   8   9280   200   46.4   82.8
 第二步 羧基  酰胺化   2   2538   152   16.7   29.8
 第三步 高级PEG化   5.1   884.8   112   7.9   14.1
不同反应条件对于rMETase羧基酰胺化的作用。
图2表明N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔比(NHS/EDC)对于rMETase的羧基酰胺化程度的影响。rMETase的羧基酰胺化在不同的NHS/EDC比下进行。用荧光胺法和非变性凝胶电泳(native PAGE)评估羧基酰胺化程度。475nm波长激发下的荧光强度和475nm波长的放射反映蛋白质中自由氨基的数量。凝胶(塞剂)表明羧基酰胺化造成了rMETase的MW上升。rMETase与丁二胺(DAB)之比和rMETase与EDC之比分别为1∶600和1∶800。将羧基酰胺化的rMETase与rMETase的荧光强度和电泳迁移率进行对比，得出差异。
NHS/EDC为0.2时，DAB和rMETase的结合程度最高。更小或更大的DAB比都会降低结合程度。NHS可增强EDC介导的羧基酰胺化反应。然而，最佳增强效果取决于NHS/EDC的最佳比。此项研究的结果与其他研究者所获得的结果相似(Kuijpers，A.J.，et al.，J.Biomater.Sci.Polym.(2000)11：225-243)。
将DAB的浓度固定为9.4mg/ml，并保持NHS与EDC的比为0.2，以此确定EDC/rMETase对于羧基酰胺化反应的影响。结果表明rMETase与DAB的结合程度取决于EDC与rMETase的比(图3)。rMETase的羧基酰胺化在不同的EDC与rMETase摩尔比下进行。使用荧光胺法和非 变性凝胶电泳分析羧基酰胺化r-METase(见图2)。NHS与EDC的比和rMETase与DAB的比分别为0.2和1∶600。将羧基酰胺化的rMETase与rMETase的荧光强度和电泳迁移率进行对比，得出差异。EDC与rMETase的比越高，rMETase羧基酰胺化的程度越高。在具体实施例中，EDC与rMETase的摩尔比不会超过800。
图4表明DAB和rMETase之比对于羧基酰胺化程度的作用。rMETase的羧基酰胺化在不同的EDC与rMETase摩尔比率下进行。NHS与EDC的摩尔比和rMETase与EDC的摩尔比分别为0.2和1∶800。用荧光胺法和非变性凝胶电泳对羧基酰胺化r-METase进行分析，并与rMETase对比。当DAB与rMETase之比增加到600时，羧基酰胺化的程度开始进入稳定水平。在具体实施例中，DAB与rMETase在羧基酰胺化反应中的摩尔比不超过600。
EDC介导的rMETase羧基酰胺化在30分钟内完成。这个反应能生成高级PEG-rMETase，产物中PEG与羧基酰胺化PEG-rMETase的比为60∶1(图5)。因此，在某些实施例中，如早些时候的报道所称，不必将蛋白质长时间保留在反应系统中(Kimura，M.，supra)。相反，较短的培养时间可以降低苛刻的反应条件造成的rMETase活力损失。
高PEG化PEG-rMETase鉴定
用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析天然rMETase、PEG-rMETase和高级PEG化rMETase。图5表明新的高级PEG化rMETase具有最低的迁移率和最高的分子量。在图5中，泳道1、泳道2和泳道3分别代表天然rMETase、高级PEG-rMETase和PEG-rMETase。用考马斯亮蓝染色10％SS凝胶。这些数据表明高级PEG化的PEG-rMETase结合的PEG链数量比PEG-rMETase更多。
PEG-rMETase和高级PEG-rMETase最终产品中游离和结合的PEG的含量都可以用比色法定量测定(Li，S.，et al.，Anal.Biochem.(2003)313：335-337)，大约13个PEG链与super-PEG-rMETase的每个亚基结合而大约7个PEG链与PEG-rMETase结合。这些结果表明羧基酰胺化引入了更多的氨基基团。
作为对照，在没有中间羧基酰胺化步骤的情况下，对一些rMETase进行了两个步骤的PEG化。在PEG∶rMETase为15∶1的条件下，进行初级PEG化，制备super-PEG-rMETase，接着进行羧基酰胺化，然后在 PEG∶rMETase的条件下进行高级PEG化。如表2所示，这只能使每个rMETase亚基结合6个PEG，表明了羧基酰胺化对于rMETase高级酰胺化的作用。
表2
蛋白质羧基酰胺化对rMETase的PEG化程度的影响
 PEG化rMETase  结合PEG的 rMETase (mg/mg)   修饰程度(摩尔PEG/  摩尔rMETase亚基)
 未羧基酰胺化的  PEG-rMETase  0.82   6.9
 羧基酰胺化的  Super-PEG-rMETase  1.54   13.2
羧基酰胺化反应中，初级PEG化对于减少rMETase交联所起得作用
如果不进行初级PEG化，直接让未修饰的rMETase与DAB反应，由于交联，rMETase明显地在反应溶液中形成沉淀，导致rMETase活力的严重损失。因此，使用羧基酰胺将氨基加入蛋白质的主要限制是反应蛋白质的交联。初级PEG化可以显著降低羧基酰胺化反应过程中的交联。如果进行了初级PEG化，则在通过碱水解去除所有PEG链后，PEG-rMETase和super-PEG-rMETase的分子量没有区别(图6)。对天然rMETase和PEG-rMETase进行碱性水解，并在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。
在图6中，泳道1-4与以下描述相对应：1)天然rMETase；2)非PEG化rMETase进行羧基酰胺化后的Super-PEG-rMETase；3)通过三个步骤(初级PEG化、羧基酰胺化和高级PEG化)制备的superPEG-rMETase；4)对照PEG-rMETase。所有检测样品，包括天然rMETase，都以4mg/ml的比例溶于100μl蒸馏水。将2μl氢氧化钠(10N)添加到每个样品中。30分钟后，添加1.8μg盐酸(HCl)(10N)中止碱性水解反应。在凝胶的每个点样孔中加入约12μg的rMETase。
这些数据表明在羧基酰胺化反应中，未检测到交联。反之，如果没有在羧基酰胺化之前进行初级PEG化，则高级PEG化过程中有显著的交联现象，进行碱水解后，对rMETase进行的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)显示，交联的rMETase位于凝胶顶端(图6，泳道2)， 正好说明了这一点。尽管如此，在实施本发明时，利用初级PEG化来防止羧基酰胺化过程中出现交联的做法并非必不可少，研究人员认为，活化的PEG总是与rMETase分子表面最易接近的氨基基团反应，从而显著降低它们与其它rMETase分子羧基基团反应的几率。此外，PEG链具有很大的排斥体积(Knoll，D.，et al.，J.Biol.Chem.(1983)258：5710-5715)，因而可以防止其它大分子与初级PEG化的rMETase反应。因此，在初级PEG化过程中，rMETase结合的PEG链可以避免随后的羧基酰胺化过程中的交联。
rMETase、PEG-rMETase和super-PEG-rMETase免疫反应性对比
PEG化最重要的特点之一是降低PEG蛋白的抗原性和免疫原性降低。抗原-抗体(Ag-Ab)识别的程度是蛋白质免疫原性的重要衡量标准。因此，通过测量裸rMETase、PEG-rMETase和super-PEG-rMETase与小鼠抗rMETase血清的结合能力来评估它们的免疫反应性。
图7将天然rMETase和这两种PEG化rMETase与抗体结合的能力作为其浓度的函数进行表示。用三明治型酶联免疫吸附实验(ELISA)进行免疫反应性分析。兔抗-rMETase抗血清用于涂抹酶标盘表面。捕获天然rMETase、PEG-rMETase和super-PEG-rMETase，然后使之与小鼠抗-rMETase抗血清反应。使用结合辣根过氧化酶的羊抗小鼠多价免疫球蛋白检测反应后的小鼠抗-rMETase抗血清。OD 492的吸收值确定天然rMETase或PEG-rMETase与抗-rMETase抗体的结合。比较三种稀释程度下的结果。(◆)Native rMETase、(■)PEG-rMETase和 SuperPEG-rMETase。
数据表明PEG-rMETase与anti-rMETase的结合能力有一定程度的降低。高级PEG-rMETase与anti-rMETas抗血清的结合能力比正常的PEG-rMETase要低很多。这一结果表明super-PEG-rMETase具有较低的抗原性。抗原性的显著降低证实了通过羧基酰胺化增加rMETase的PEG化程度的有效性。今后的实验将确定super-PEG-rMETase的体内效力。
示例
下面的示例旨在阐明本发明，但本发明的用途不限于此。在以下示例中，重组蛋氨酸酶(rMETase)由E.coli发酵产生(Tan，Y.，supra)。丙烯葡聚糖凝胶S-300，交联葡聚糖凝胶G-25采购自Amersham Pharmacia Biotech公司(Piscateway，N.J)。预制Tris-甘氨酸凝胶购自NOVEX(SanDiego，CA)。兔抗-rMETase抗血清从H.T.I Bio-Products，Inc.，San Diego，CA获得。羊抗小鼠多价免疫球蛋白与辣根过氧化酶聚合购自Sigma(St.Louis，MO)。荧光胺、1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、1，4-丁二胺(DAB)二盐酸、N-羟基丁二酰亚胺和硫氰酸铵皆购自FisherScientific(Fairlawn，NJ)。单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸-5000(MEGC-5000)PEG由NOF corporation(Tokyo，Japan)馈赠。
示例1
荧光胺法评估rMETase中羧基酰胺化程度
通常使用荧光胺法评估蛋白质的PEG程度，其依据是蛋白质的氨基结合活化的PEG后，荧光强度将降低。在这里，使用荧光胺法检测rMETase与丁二胺(DAB)结合后荧光胺强度的增加，进而评估rMETase羧基酰胺化的程度。分析过程基本上遵照Stocks描述的方法(Stocks，S.J.，et al.，Anal.Biochem.(1986)154：232-234)。简言之，不同数量的rMETase和PEG化的rMETase在2ml 0.1MH8.0的磷酸钠缓冲液中与1ml荧光胺溶液(0.3mg/ml丙酮中)混合，并在室温下反应5分钟。接下来，用荧光分光光度计测量样本在390纳米波长激发下的475纳米发射强度。结果以荧光胺强度与rMETase浓度的关系曲线图显示，通过线性回归确定曲线的斜率。
荧光强度增加的百分比(％)表示为：[(与DAB结合后的荧光强度斜率-裸rMETase荧光强度斜率)/裸rMETase荧光强度斜率]x100。
蛋白质测定
根据说明手册，用Wako Protein Assay Kit(Wako Pure Chemical，Osaka，Japan)测量天然rMETase的蛋白质浓度。牛血清白蛋白(BSA)作为标准使用。通过(UV)280nm处的紫外线吸收值确定PEG-rMETase结合物的物质比例。裸rMETase用于绘制标准曲线。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
所有的电泳实验根据说明手册在Xcell II系统上进行，该系统使用10％NOVX预制凝胶。在SDS-PAGE实验中，使用包含SDS的tris-glycine电泳缓冲液。凝胶中的蛋白质用考马斯亮蓝染色。将所有修饰rMETase与裸rMETase进行比较。
示例2
r-METase羧基酰胺化的反应条件
A.最优化N-羟基丁二酰亚胺(NHS)与1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的比例
保持rMETase/DAB和rMETase/EDC的摩尔比分别为1∶600和1∶800，确定NHS/EDC的最佳摩尔比。取四份质量均为14.1mg的DAB，将它们与质量分别为4.0mg、2.7mg、1.3mg和0mg的NHS(分别对应0.6、0.4、0.2、0的NHS/EDC比例)溶解到蒸馏水中。使用0.5N NaOH将每种溶液的pH值调整至6.5，使最终溶液体积为1ml。将这些溶液分别转移至组织培养板的四个点样孔中。然后将溶于0.5ml的0.2M磷酸钠缓冲液的rMETase 25mg添加至每个孔中。添加22.2mg EDC后，羧基酰胺化反应即开始。在室温下搅拌4小时后，将产物置于事先用浓度为0.1M、pH值为7.4的PBS平衡过的Sephadex G-25柱上，去除小分子杂质。然后，使用凝胶电泳和荧光法测定rMETase与DAB的结合程度。
B.最优化rMETase/EDC和rMETase/DAB的比例
上例实验A中所确定的最佳NHS/EDC的摩尔比为0.2，通过此最佳值，再结合1∶600的rMETase/DAB，可确定EDC对羧基酰胺化反应的影响。向五个分别装有1.5ml的PBS(0.2M，pH 6.5)混合液(含有25mgrMETase、14.1mg DAB、1.3mg NHS)的孔中，按rMETase/EDC为1∶200、1∶400、1∶600、1∶800和1∶1000的摩尔比，分别取相应量的EDC添加到每个孔中。其它反应条件、处理方法和最终结合产品的测定方法与实验A相同。为获得rMETase/DAB的最佳摩尔比，保持NHS/EDC的摩尔比为0.2，同时保持已确定的rMETase/EDC的最佳摩尔比1∶800，执行与上述相同的过程。
C.羧基酰胺化反应的时程变化
时程反应实验使用2ml含有33mg rMETase的PBS(0.2M，pH 6.5)溶液，并保持NHS/EDC为0.2、rMETase/DAB为1∶800、rMETase/EDC为1∶800。添加EDC开始发生反应后，以不同的时间间隔，去除0.4ml的反应物并进行净化。按上述方法对rMETase和DAB结合的程度进行分析。
示例3
高级乙二醇化rMETase的制备
按照图1所示的三个步骤制备高级PEG化的rMETase(具有比此前通过非羧基酰胺化rMETase所获得的产物更多的PEG链)。为了引入更多的伯胺而不引起rMETase分子间的交联，首先对天然rMETase进行PEG化，该步骤防止羧基酰胺化过程中发生交联。最后，对羧基酰胺化了的r-METase进行“超”聚乙二醇化修饰。进行初级聚乙二醇化时，首先使用0.5N NaOH将含有2ml(200mg)rMETase的PBS(0.1M，pH 7.4)溶液的pH值调整至8.5，然后使其与87.2mg的MEGC-5000PEG(PEG与rMETase的摩尔比为15∶1)发生反应，在室温下搅拌1小时。
为了将DAB结合到进行了初级聚乙二醇化修饰的rMETase，先使用4ml的PBS(0.2M，pH 6.5)将上一步骤中所得的反应物稀释为8ml的溶液，该溶液中含有21.3mg NHS(NHS/EDC为0.2)、149.8mg DAB(rMETase/DAB为1∶600)、178.3mg EDC(rMETase/EDC为1∶800)。搅动30分钟后，将此混合液置于采用PBS(0.05M，pH 7.4)洗提过的Sephacryl S-300柱(26×60)上，以去除游离的PEG和其它的小分子杂质。然后，按照如下方法对羧基酰胺化的PEG-rMETase进行高级聚乙二醇化：
进行高级聚乙二醇化反应时，先将152mg新添加了伯胺的PEG-rMETase浓缩为2ml。要开始高级聚乙二醇化反应，添加0.2ml硼酸盐缓冲液(1M，pH 9.0)，同时添加265.1mg MEGC-PEG-5000(PEG/PEG-rMETase的摩尔比为60∶1)，将pH值调整为8.5。经过净化和浓缩后，获得112mg高级聚乙二醇化rMETase。作为对照，同时通过两步模式制备了PEG-rMETase，其中PEG∶rMETase分别采用15∶1和60∶1，方法如上，只是没有进行羧基酰胺化这一步。
示例4
rMETase聚乙二醇化程度的确定
rMETase聚乙二醇化的程度根据每个rMETase亚基中PEG的平均含量来确定。经净化的最终PEG-rMETase结合物中所含PEG的量采用碱水解比色法确定，Li，S.，et al.，supra对该方法进行过说明。简言之，就是将要进行分析的PEG-rMETase分成两份样品；对其中一份进行碱水解30分钟，以释放与rMETase结合的PEG。而对另一份PEG-rMETase则不进行 碱水解。然后，将两份样品分别放入含有1ml三氯甲烷和1ml硫氰酸铵的两相系统。将它们高速旋转30分钟，并在3500g离心力下进行3分钟的离心分离，然后去除三氯甲烷的下层。通过510nm处的光密度确定三氯甲烷层中游离或所释放的PEG的含量。从没有执行碱水解处理的样品确定PEG-rMETase中游离PEG的含量。从执行了碱水解处理的样品中确定出PEG-rMETase中所含PEG的总量。PEG的总量减去游离的量便可得与rMETase结合的PEG的量(Li，S.，supra)。
示例5
IrMETase、PEG-rMETase以及Super-PEGylated rMETase的免疫反应性
裸rMETas和聚乙二醇化rMETases的免疫反应性是通过它们与抗rMETase抗血清的结合能力确定的。使用ELISA和夹心法进行免疫反应性分析。将100μl采用0.1M碳酸钠包埋缓冲液(pH 9.5)稀释过的兔抗rMETase抗血清添加到酶标板中的每个点样孔中，在4℃下培养一整夜。使用含有0.05％吐温20活性剂的PBS(pH 7.4)对酶标板进行三次清洗，使用200μl含有10％FBS的pH 7.4PBS分析缓冲液在室温下封闭酶标板2小时，然后再次清洗酶标板。将各100μl的rMETase、聚乙二醇化rMETase和super-PEGylated rMETase(均已采用PBS分析缓冲液将浓度从25μg/ml稀释到0.25μg/ml)添加至酶标板上相应的孔中，并在室温下培养1小时。清洗酶标板后，将100μl的小鼠抗rMETase抗血清添加至酶标板的每个孔中，并在室温下培养1小时，然后进行清洗。将100μl具有最佳稀释度的羊抗小鼠多价免疫球蛋白和辣根过氧化酶聚合物添加到每个孔中。在室温下培养酶标板1小时，然后清洗3次。将100μl的底物溶液(O-苯二胺二盐酸盐+过氧化氢)添加至每个孔中，然后在室温下培养30分钟。将50μl的2N硫酸添加至每个孔中以停止显色反应。测量492nm处每个孔的吸光度值。
上述详细说明和附随的示例仅是说明性的，不应将它们视为是对发明范围的限制，请务必理解这一点。对精通此技术的人而言，已公布的方案明显可以进行各种更改和修改。这类更改和修改-包括但不限于涉及化学结构、取代基、诱导法、中间物、合成法、配方和/或发明使用方法的更改和修改-可以在不背离本发明精神和脱离发明范围的情况下进行。在此通过引用包含本文涉及的美国专利案和出版物。

Claims (23)

1.使用非蛋白质聚合链修饰蛋白质的方法，包括：
a)将蛋白质与非蛋白质聚合物结合，以形成具有一个或多个非蛋白质聚合链的初级修饰蛋白，
b)将上述所得的具有一个或多个非蛋白质聚合链的初级修饰蛋白与至少具有两个氨基基团的多官能胺结合，以形成具有一个或多个附加氨基基团的修饰蛋白质，
c)将上述所得的具有一个或多个附加氨基团的修饰蛋白质与另外的非蛋白质聚合物结合，以形成比初级修饰蛋白质具有更多非蛋白质聚合链的次级修饰蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中所述的非蛋白质聚合物是由可与上述蛋白质的N端氨基团发生反应的官能团衍生而来。
3.权利要求2的方法，其中所述的非蛋白质聚合物为聚氧亚烷基。
4.权利要求3的方法，其中所述的聚氧亚烷基为聚乙二醇。
5.权利要求2的方法，其中所述的官能团为N-羟基丁二酰亚胺。
6.权利要求5的方法，其中所述的非蛋白质聚合物为甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸。
7.权利要求2的方法，其中所述的非蛋白质聚合物分子量约为5000。
8.权利要求1的方法，其中所述的多官能胺为丁二胺。
9.权利要求1的方法，其中步骤a)中所述的初级修饰蛋白质是通过将所述蛋白质中的N端氨基团与所述非蛋白质聚合物中的酯基相结合而形成。
10.权利要求1的方法，其中步骤b)中所述的具有一个或多个附加氨基团的修饰蛋白质，是通过将上一步骤中所述的初级修饰蛋白质中的C端羧基与所述多官能胺中的氨基基团相结合而生成。
11.权利要求10的方法，其中所述的羧基是在催化剂的作用下与上述氨基结合的。
12.权利要求11的方法，其中所述的催化剂为碳二亚胺。
13.权利要求12的方法，其中所述的碳二亚胺为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
14.权利要求10的方法，在生成其中所述的步骤b)中的修饰蛋白质时，没有发生初级修饰蛋白质之间的交联。
15.权利要求1的方法，其中所述蛋白质与所述非蛋白质聚合物之间的摩尔比在首次结合步骤中为1∶1 5。
16.权利要求1的方法，其中所述的初级修饰蛋白质与所述的非蛋白质聚合物之间的摩尔比在再次聚合步骤中为1∶60。
17.根据权利要求1的方法进行修饰的蛋白质。
18.根据权利要求1 7中所述的蛋白质，其为蛋氨酶。
19.使用聚乙二醇链两次进行修饰的蛋白质，其中首次修饰包含将蛋白质的N端氨基与聚乙二醇脂衍生物结合，从而形成初级聚乙二醇化蛋白质，以及将最初形成的聚乙二醇化蛋白质的C端羧基与多官能胺结合以形成初级修饰蛋白质，所述的多官能胺至少含有两个氨基，所述的初级修饰蛋白质含有聚乙二醇链和一个或多个附加的氨基团；其中再次修饰包含将再次修饰蛋白质中的一个或多个附加氨基与其它聚乙二醇脂衍生物结合，以形成次级修饰蛋白质，它含有比第一次修饰的蛋白质更多的聚乙二醇链。
20.根据权利要求19中所述的蛋白质，其为蛋氨酶。
21.一种医药组合物，包含权利要求1 7-20任一项中所述蛋白质，以及药学上可接受的一种赋形剂。
22.使用有效治疗剂量的权利要求17-20任一项中的化合物或权利要求21的医药组合物在制备调节有此类需要的受治者体内的肿瘤活动的药物中的用途。
23.权利要求22描述的用途，其中所述的受治者为人或动物。
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