CN102234331A - Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用，该Exendin-4衍生物的复合物是由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，该Exendin-4衍生物的复合物的生物稳定性高，体内半衰期长，生物利用度高。其制备方法操作简便，原料易得。

Description

Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种修饰的Exendin-4衍生物，确切的说，涉及一种单甲氧基聚乙二醇-Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用，属于肽或蛋白质的修饰复合物及其制备的技术领域。

背景技术

糖尿病是一组由于胰岛素分泌缺陷及其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。目前我国糖尿病的患病率和病死率正在呈快速上升趋势，成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的慢性非传染性疾病，其中90％以上为II型糖尿病。目前，人们主要应用磺酰脲类和双胍类等药物来治疗II型糖尿病，但是这些药物的副作用较大，限制了其的临床应用。

Exendin-4是希拉毒蜥进食后由唾液腺产生的一种39肽的内分泌激素，与哺乳动物胰高血糖素样肽-1(GLP-1)有53％的氨基酸序列重叠。Exendin-4与GLP-1有许多共同的糖代谢调节作用，包括葡萄糖依赖性促进胰岛素分泌和抑制胰高血糖素过多分泌作用、延缓胃排空、减少食物摄取等，Exendin-4与GLP-1相比的最大优点是抗二肽酰基肽酶IV降解。但是Exendin-4在体内也存在半衰期较短的问题，目前Exendin-4治疗糖尿病的研究方向之一是通过对Exendin-4的结构进行改变，得到Exendin-4衍生物，用该衍生物治疗糖尿病，达到延长药物在体内的药效时间的目的。背景技术已经提出一种Exendin-4衍生物及其制备方法，见申请号和发明名称分别为“200910045187.6”和“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”的发明专利，该Exendin-4衍生物的体内降血糖活性较天然的Exendin-4已有所提高。而本发明制备所得的Exendin-4衍生物的复合物在体内的有效降血糖活性要显著高于Exendin-4衍生物。

蛋白/多肽类药物普遍存在体内半衰期短、稳定性差、易被各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物需要在一天之内多次注射，给病人带来痛苦和不便。研究表明，从血浆中清除Exendin-4几乎全部通过肾脏滤过而不是主要通过蛋白酶降解，因此对Exendin-4或其衍生物进行聚乙二醇化或其它修饰以增加分子大小是一种降低肾脏清除率的方法。目前对Exendin-4的修饰大都是多点修饰，产物存在多态性，分离纯化产物较为困难，并且修饰产物的生物学活性有所降低。鉴于Exendin-4及其衍生物存在体内的降血糖活性的时间有待进一步延长，且普通聚乙二醇修饰产物不均一等问题，因此迫切需要研制体内降血糖时间更长，分离纯化快速简便且易于临床应用的新型单点修饰的Exendin-4衍生物复合物产品。

发明内容

本发明的目的是提出一种Exendin-4衍生物的复合物，该复合物由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，其中，所述Exendin-4衍生物为Seq ID No.2，Seq ID No.3，Seq ID No.4，Seq ID No.6，Seq ID No.7或Seq ID No.8，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32或Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸；所述经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量为5～40kD；所述复合物是通过Exendin-4衍生物中的游离巯基和mPEG-MAL基团的双键形成的硫醚键连接而成。

本发明Exendin-4衍生物的复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下六种结构之任何一种：Exendin-4(1-39)-Xaa40(Seq ID No.2)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31(Seq IDNo.6)，Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq-ID-No.7)和Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa40和Xaa31是Cys，Xaa41，Xaa42，Xaa32和Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Set或Thr中的任何一个氨基酸。

更进一步地，该复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下四种结构之任何一种：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41(Seq ID No.3)，Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32(Seq-ID-No.7)和Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa41和Xaa32是Cys，Xaa40，Xaa42，Xaa31和Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸。

更进一步地，该复合物中的Exendin-4衍生物可以是以下两种结构之任何一种：Exendin-4(1-39)-Xaa40-Xaa41-Xaa42(Seq ID No.4)；Exendin-4(1-30)-Xaa31-Xaa32-Xaa33(Seq ID No.8)，其中Xaa42和Xaa33是Cys，Xaa40，Xaa41，Xaa31和Xaa32分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸。

本发明所涉及的“Exendin-4”包括Exendin-4(1-39)。其序列(Seq ID No.1)如下：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser。

本发明所涉及的“Exendin-4”还包括Exendin-4的截短形式Exendin(1-30)，其序列(Seq ID No.5)如下：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly。

上述Exendin-4衍生物，见本申请人的发明专利申请：申请号为“200910045187.6”，发明名称为“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”中提出的Exendin-4衍生物。

本发明提供的Exendin-4衍生物的复合物，其中，经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，其分子量为5～40kD；该Exendin-4衍生物的复合物是通过Exendin-4衍生物中游离巯基(-SH)和单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺mPEG-MAL基团的末端双键进行加成反应形成的硫醚键连接而成(结构如下图所示)。该Exendin-4衍生物中游离巯基(-SH)可以实现mPEG-MAL的定点修饰，从而得到均一的修饰产物。

本发明另一发明目的是提供一种Exendin-4衍生物的复合物的制备方法，具体步骤如下：

第一步，将Exendin-4衍生物溶解于磷酸盐缓冲液中；

第二步，再加入mPEG-MAL；

第三步，在4～40℃，pH3.0～9.0条件下进行mPEG修饰反应0.5～24小时；

第四步，置于-20℃终止上述mPEG修饰反应，制得所述Exendin-4衍生物的复合物的粗品溶液；

第五步，取以上粗品溶液用Tris-HCl缓冲液稀释，上Sepharose-Q-XL层析柱，梯度洗脱，收集穿透峰和洗脱峰的洗脱溶液；

第六步，将以上洗脱液用截留分子量为1～10kD的超滤管浓缩，冷冻干燥，得到产物即所述Exendin-4衍生物的复合物的纯品，所述产物的分子量介于8.5～44.3kD。

本发明的制备方法，采用mPEG-MAL对Exendin-4衍生物进行特异性的定点修饰，所得修饰产物均一，分离方法采用阴离子亲和层析，快速简便。

现详细说明本发明的技术方案，本发明的Exendin-4的复合物的制备方法，具体操作步骤如下：

第一步，将1份重量的Exendin-4衍生物溶解于1000份重量的10mM，pH3.0-9.0的磷酸盐缓冲液中；

第二步，向第一步的溶液中加入2.8～91.2份重量的含经马来酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇，混合均匀，所述的单甲氧基聚乙二醇为5～40kD的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，即mPEG-MAL；

第三步，将第二步的溶液置于4～40℃下进行mPEG修饰反应0.5～24小时；

第四步，将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应，至此，制得Exendin-4衍生物的复合物粗品溶液；

第五步，取经第四步制得的粗品溶液用20mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释10倍，上Sepharose-Q-XL层析柱，用含1-500-mM-NaCl的20-mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.2～1ml/min，在波长为280nm处收集穿透峰和洗脱峰的洗脱溶液；

第六步，将第五步收集到的洗脱液用截留分子量为1～10kD的Millipore-Amicon-Ultra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.85～4.43份重量的产物，即Exendin-4衍生物的复合物纯品，所述产物的分子量介于8.5～44.3kD。

所得产物的复合物结构为：由Exendin-4衍生物和含马来酰亚胺活化的活性基团的单甲氧基聚乙二醇组成，两者通过Exendin-4衍生物的氨基酸的巯基(-SH)与单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺(mPEG-MAL)的末端双键进行加成反应制备得到。

本发明制备方法的第一步中Exendin-4衍生物，其结构见发明专利[申请号为“200910045187.6”；发明名称为“一种Exendin-4衍生物及其固相化学合成”，其中特指带有Cys的Exendin-4衍生物。

本发明所用的mPEG-MAL，即分子量介于5～40-KD的单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺，可从Nektar公司或北京凯正公司购得。

本发明的优点是：利用Exendin-4衍生物的氨基酸Cys的游离巯基与单甲氧基聚乙二醇的活化末端双键在温和的生理状态下进行反应，形成硫醚键，从而使得到的单甲氧基聚乙二醇-Exendin-4衍生物的复合物的性质十分稳定，不易被水解分离；由于使用的修饰剂mPEG-MAL为高亲水性的线性无毒的高分子化合物，当其与Exendin-4衍生物稳定结合后能在Exendin-4衍生物分子表面形成一种屏障，使得Exendin-4衍生物更加不易被体内的蛋白酶降解，从而进一步提高其生物稳定性；同时由于经mPEG-MAL修饰的Exendin-4衍生物分子量增大，因而在体内的降血糖活性显著延长，提高了Exendin-4衍生物的生物利用度。用本方法制备Exendin-4衍生物的复合物，方法简便，原料易得，生产成本低。

本发明另一发明目的是Exendin-4衍生物的复合物在制备预防或治疗糖尿病的药物中作药物活性成分的应用。

本发明另一发明目的是提供含有有效量Exendin-4衍生物的复合物以及药学可接受的成分的组合物。

本发明所述的聚乙二醇修饰的Exendin-4衍生物可以与各种无机和有机酸和碱形成盐，这类盐包括用有机酸和无机酸制备的盐，所述的有机酸和无机酸包括但不限于盐酸、溴化氢、硫酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸，用碱制备的盐包括但不限于铵盐、碱金属盐和碱土金属盐。所述要求保护的化合物也可配制成药学上可以接受的盐，或它们的络合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，如含有硫酸盐、盐酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐等。药学上可接受的盐可得自各种无机和有机酸。可以使用载体或赋形剂，包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖或各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理上相容的溶剂。可通过静脉注射、腹腔注射或皮下注射等方式给药。

按需要，可在上述组合物的溶液中加入增稠剂增，可以使用各种药学上可接受的任一种。

本发明的Exendin-4衍生物的复合物优选以无菌冻干物形式储存。所述组合物可以含有需要的近似生理条件的药学上可接受的辅助物质，如pH缓冲剂。可以使用栓剂形式和缓释剂形式，使得治疗有效量的制剂在经皮下注射或传递后许多小事或许多天内被传递至血液中。可以添加氯化钠或其他药学上可接受的试剂，如甘露醇、山梨糖醇、葡萄糖、丙二醇或其他有机和无机溶质，达到所需的等渗条件。

附图说明

现结合附图和实施例对本发明的内容作进一步说明。

图1为Exendin-4衍生物的复合物的Sepharose-Q-XL层析分离纯化图。其中，穿透峰，含单点修饰的Exendin-4衍生物的复合物；洗脱峰，含极少量未修饰的Exendin-4衍生物。

图2为图1的SDS-PAGE电泳图。其中，对照品为Exendin-4衍生物的复合物粗品，1是穿透峰，即单点修饰的Exendin-4衍生物的复合物，2是洗脱峰，即未修饰的Exendin-4衍生物。

具体实施方式

下面通过具体实施例，进一步详述本发明。以下实施例中所用mPEG-MAL、化学试剂等，以及未注明具体条件的实验方法，按常规或按商品供货商所建议的条件进行。

实施例1Exendin-4衍生物的复合物的制备。

第一步，将1.0mg Exendin-4衍生物溶解于1000份重量的10mM，pH3.0～9.0的磷酸盐缓冲液中；

第二步，向第一步的溶液中加入5.7mg分子量为5KD的mPEG-MAL，混和均匀；

第三步，将第二步的溶液置于4～40℃下进行mPEG修饰反应0.5～24小时；

第四步，将经第三步处理的溶液置于-20℃终止反应，至此，制得Exendin-4衍生物的复合物粗品溶液；

第五步，取经第四步制得的粗品溶液用20mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液稀释10倍，上Sepharose Q XL层析柱，用含1～500mM NaCl的20mM，pH7.4的Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，流速为0.2～1ml/min，在波长为280nm处收集穿透峰和洗脱峰的洗脱溶液；

说明：参见图1，图中，2个吸收峰中的第一个吸收峰，即穿透峰，含单点修饰的Exendin-4衍生物的复合物吸收峰；吸收峰中的第二个吸收峰，即洗脱峰，含极少量未修饰的Exendin-4衍生物。

第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～10KD的Millipore AmiconUltra-15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到0.85mg的、分子量为8.5KD的Exendin-4衍生物的复合物纯品。

说明：将第六步制得的Exendin-4衍生物的复合物纯品用蒸馏水复溶，制备成1mg/ml的溶液，取20μl进行SDS-PAGE电泳，结果示于图2，图中，2是单点修饰的Exendin-4衍生物的复合物。

实施例2Exendin-4衍生物的复合物的制备。在本实施例中，mPEG-MAL的分子量为10KD。

第一步，将1.0mg Exendin-4衍生物溶解于1000份重量的10mM，pH3.0～9.0的磷酸盐缓冲液中；

第二步，向第一步的溶液中加入11.4mg分子量为10KD的mPEG-MAL，混和均匀；

第三步至第五步按实施例1中相应操作步骤进行。

第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～10KD的Millipore Amicon Ultra15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到1.35mg的、分子量为13.5KD的Exendin-4衍生物的复合物纯品。

实施例3Exendin-4衍生物的制备。在本实施例中，mPEG-MAL的分子量为20KD。

第一步，将1.0mg Exendin-4衍生物溶解于1000份重量的10mM，pH3.0～9.0的磷酸盐缓冲液中；

第二步，向第一步的溶液中加入22.8mg分子量为20KD的mPEG-MAL，混和均匀；

第三步至第五步按实施例1中相应操作步骤进行。

第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～10KD的Millipore Amicon Ultra15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到2.35mg的、分子量为23.5KD的Exendin-4衍生物的复合物纯品。

实施例4Exendin-4衍生物的制备。在本实施例中，mPEG-MAL的分子量为40KD。

第一步，将1.0mg Exendin-4衍生物溶解于1000份重量的10mM，pH3.0～9.0的磷酸盐缓冲液中；

第二步，向第一步的溶液中加入45.6mg分子量为40KD的mPEG-MAL，混和均匀；

第三步至第五步按实施例1中相应操作步骤进行。

第六步，将第五步收集到的洗脱溶液用截留分子量为1～10KD的Millipore Amicon Ultra15超滤管浓缩，冷冻干燥，得到4.35mg的、分子量为23.5KD的Exendin-4衍生物的复合物纯品。

实施例5Exendin-4衍生物的复合物的降血糖作用。

实验材料与方法：

雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；

16％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，Exendin-4衍生物，Exendin-4衍生物的复合物；血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)。

雌性健康昆明小鼠禁食过夜，分为3组，每组10只。第1组，葡萄糖对照组；第2组，Exendin-4衍生物给药组；第3组，Exendin-4衍生物的复合物衍生物给药组，所述的Exendin-4衍生物的复合物是实施例3的制备产物。

第1组腹腔注射200μl 0.9％NaCl溶液(NS)；第2组腹腔注射200μl 0.9％NaCl溶液和1.4μg的Exendin-4衍生物；第3组腹腔注射200μl 0.9％NaCl溶液和9.4μg的Exendin-4衍生物的复合物衍生物。给药时间记为零时刻，每次测血糖前30min开始给各组补充400ul 16％葡萄糖溶液，分别于2、5、8、11、21、24h进行小鼠尾静脉取血10ul，用血糖测试仪测定血糖浓度。

结果如表1所示，所示数值均为10只小鼠的血糖平均值。与葡萄糖组小鼠相比，在给药后5h之内，Exendin-4衍生物给药组和Exendin-4衍生物的复合物给药组均能降低小鼠血糖，说明按本发明方法制备出的Exendin-4衍生物的复合物保留了Exendin-4衍生物的生物学活性。5h后，Exendin-4衍生物组小鼠与葡萄糖组小鼠的血糖值没有区别，提示Exendin-4衍生物已代谢完，不再具有降血糖作用。而Exendin-4衍生物的复合物给药组的小鼠血糖一直低于葡萄糖组，且基本保持稳定，说明Exendin-4衍生物的复合物的半衰期延长，仍能有效地控制血糖浓度，有效降血糖时间持续至少21h。

表1Exendin-4衍生物的复合物衍生物的降血糖作用

*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001vs NS组

#，P＜0.05；##，P＜0.01；###，P＜0.001vs Exendin-4衍生物组

本实施例中所用的Exendin-4衍生物的复合物也可是实施例1，实施例2和实施例4所制备的产物。它们按照本实施例的方法进行活性测定，均得到了类似的实验结果。

实施例6包含Exendin-4衍生物的复合物的组合物

取1mg经mPEG-MAL修饰的Exendin-4衍生物所得的Exendin-4衍生物的复合物，溶解于0.5ml去离子水中；另取50mg甘露醇，溶解于0.5ml去离子水中；将两者混匀即为Exendin-4衍生物的复合物与甘露醇的组合物，其中含有1mg/ml的Exendin-4衍生物的复合物及501mg/ml的甘露醇。可按需要加入必要的调节pH的缓冲液。

序列表

<110>华东师范大学

<120>Exendin-4衍生物的复合物及其制备方法和应用

<160>8

<210>1

<211>39

<212>PRT

<213>希拉毒蜥(Heloderma suspecyum)

<400>1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

                 35

<210>2

<211>40

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<222>(40)

<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr

<400>2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa

                 35                  40

<210>3

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<222>(40，41)

<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr

<400>3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa Xaa

                 35                  40

<210>4

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<222>(40，41，42)

<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr

<400>4

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Xaa Xaa Xaa

                 35                  40

<210>5

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                20                  25                  30

<210>6

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<222>(31)

<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr

<400>6

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Xaa

<210>7

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<222>(31，32)

<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr

<400>7

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Xaa Xaa

<210>8

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>合成构建体

<222>(31，32，33)

<223>Xaa＝Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr

<400>8

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

                 5                  10                  15

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

                 20                  25                  30

Xaa Xaa Xaa

Claims (6)

1.一种Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，该复合物由Exendin-4衍生物与经马来酰亚胺活化的单甲氧基聚乙二醇组成，其中，所述Exendin-4衍生物为Seq ID No.2，Seq IDNo.3，Seq ID No.4，Seq ID No.6，Seq ID No.7或Seq ID No.8，其中Xaa40，Xaa41，Xaa42，Xaa31，Xaa32或Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸；所述经活化的单甲氧基聚乙二醇是mPEG-MAL，分子量为5～40kD；所述复合物是通过Exendin-4衍生物中的游离巯基和mPEG-MAL基团的双键形成的硫醚键连接而成。

2.如权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物为Seq ID No.3，Seq ID No.4，Seq ID No.7或Seq ID No.8；其中，Xaa41和Xaa32是Cys；Xaa40，Xaa42，Xaa31和Xaa33分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸。

3.如权利要求2所述的Exendin-4衍生物的复合物，其特征在于，所述Exendin-4衍生物为Seq ID No.4或Seq ID No.8；其中，Xaa42和Xaa33是Cys；Xaa40，Xaa41，Xaa31和Xaa32分别是Cys，Ala，Gly，His，Ser或Thr中的任何一个氨基酸。

4.如权利要求1所述Exendin-4衍生物的复合物的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

第一步，将Exendin-4衍生物溶解于磷酸盐缓冲液中；

第二步，再加入mPEG-MAL；

第三步，在4～40℃，pH3.0～9.0条件下进行mPEG修饰反应0.5～24小时；

第四步，置于-20℃终止上述mPEG修饰反应，制得所述Exendin-4衍生物的复合物的粗品溶液；

第五步，取以上粗品溶液用Tris-HCl缓冲液稀释，上Sepharose Q XL层析柱，梯度洗脱，收集穿透峰和洗脱峰的洗脱溶液；

第六步，将以上洗脱液用截留分子量为1～10kD的超滤管浓缩，冷冻干燥，得到产物即所述Exendin-4衍生物的复合物的纯品，所述产物的分子量介于8.5～44.3kD。

5.权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有有效量的权利要求1所述的Exendin-4衍生物的复合物，以及药学可接受的成分。

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