CN103224557B - 一种长效型成纤维细胞生长因子-23拮抗剂的开发 - Google Patents

Abstract

本发明涉及长效型成纤维细胞生长因子-23（FGF-23)变体肽的缀合物，其制备及应用。该缀合物的活性是等摩尔量的未缀合的FGF-23变体肽的活性的40%以上，优选60%以上，更优选70%以上，如80%以上。

Description

一种长效型成纤维细胞生长因子-23拮抗剂的开发

技术领域

本发明属于蛋白质技术领域，具体而言，本发明涉及长效型成纤维细胞生长因子23（FGF-23) 变体肽的制备及应用。

背景技术

  成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23 ,FGF-23) 是最近发现的一种极为重要的调节血液中磷代谢的细胞因子，它最初是作为常染色体显性遗传性低磷血症 ( autosomal dominant hypophosphatemic rickets, ADHR)和肿瘤诱发性骨软化症( tumor -induced osteomalacia, TIO)等低磷血症的共同致病因子被定义的 。FGF-23在其靶器官肾中对磷代谢的调节主要是通过抑制近曲小管上皮细胞的刷状膜上的钠-磷协同转运蛋白NPT2a和NPT2c 表达，减少肾小管对磷重吸收而降低血磷；通过抑制1,25(OH)2D3 而抑制NPT2b 表达，减少肠道磷的重吸收；FGF-23 还通过抑制近端肾小管上皮细胞1-а羟化酶活性而抑制1,25(OH)2D3的合成；同时增加25-羟基维生素D-24-羟化酶的活性,诱导1,25(OH)2D3 的破坏, 加速其降解。由于1,25(OH)2D3 具有促进肠道磷吸收的作用，因此1,25(OH)2D3 合成减少后血磷下降。重组FGF-23蛋白注射小鼠后，可致小鼠发生严重的低磷血症、骨骼脱钙化及较低的1,25(OH)2D3水平。研究人员同时发现小鼠注射重组FGF-23 10分钟后，MAPK 信号通路被快速激活，引起 PTH 分泌减少。但与对肾小管作用不同的是，FGF-23可剂量依赖性地促进牛甲状旁腺细胞1-α羟化酶表达，减少PTH合成。阻断小鼠FGF-23 合成可致高磷、高1,25(OH)2D3、高钙血症、软组织钙化、衰老加速和肺气肿。因此，FGF-23在许多疾病中表现出的生物学功能使得它成为一个非常有前景的治疗靶标。

由于耐抗利尿激素性糖尿病 （antidiuretic hormone resistant diabetes，ADHR）、由肿瘤所导致的低磷软骨病（Tumor-induced Osteomalacia，TIO） 、X-连锁低血磷性佝偻病（X-Linked Hypophosphatemic Rickets, XLH）都是以肾小管磷重吸收障碍为基础和以低磷血症为特征的疾病，同样，肾移植和肠外离子治疗引起的低磷血症也与血液中增加的FGF-23水平相关。 这就决定了FGF-23拮抗剂具有非常广泛的治疗群体，而不仅限于由于遗传性或肿瘤介导的磷重吸收减少的代谢紊乱患者。本发明人发现了一系列FGF-23 变体肽能够起到FGF-23拮抗剂的作用。

        但大量研究表明FGF-23 变体肽存在稳定性差、体内半衰期短等缺陷，需要频繁给药方能发挥其显著的调磷作用，而且频繁的给药还会引起较强的体内免疫原性，这都给该蛋白的功能研究及向临床转化带来了严重的障碍。因此如何提高FGF-23 变体肽的稳定性、延长其体内半衰期并降低其体内免疫原性显得非常迫切而重要，而关于这方面的研究目前尚未见任何报道。

为了改善蛋白药物的稳定性差、半衰期短以及体内较强的免疫原性等问题，几种较为常见的策略是：

1)        通过基因工程手段对天然蛋白的氨基酸进行突变改造以减少其免疫原性并增加其抗蛋白酶降解的能力；

2)        通过化学或基因工程手段将其与免疫球蛋白或血清蛋白偶联或者融合；

3)        通过药物释放载体实现药物蛋白质的保护和缓释；

4)        通过化学手段将药物蛋白质与天然或者合成的高分子想偶联。用高分子增加蛋白质的表观分子量，遮蔽蛋白质表面以达到减少其免疫原性和抗原以及增加其抗蛋白酶降解的能力。

归因于第4）种方法的操作方便、成功率高等优势，是目前最为常用的方法，

该方法又被成为化学修饰法，而化学修饰法中所采用的化学修饰制剂又以聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）应用得最为普遍和成熟，当然，近年来，一种人体适应性更强得多糖修饰制剂也开始成为新的研究热点。然而，由于PEG化使得蛋白质在连接处形成空间位阻或者导致结构翻转，从而使得蛋白质本身活性降低，乃至失活（参见Harris等.Clinical Pharmocokinetics,2001,40(7):539-551等文献），因此对于PEG化得到的产物的活性，是难以预料的。

 本发明人经过长期努力，筛选并建立了稳定的FGF-23 变体肽修饰工艺，这些工艺获得了活性保持良好，体外稳定性显著提高、体内半衰期显著延长、体内免疫原性显著降低的FGF-23 变体肽修饰产物，而且我们获得的修饰产物具备均一性好、分离纯化工艺简单的特点，细胞和动物实验表明，修饰产物在低磷血症方面显示出良好的治疗效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的缀合物，其能用于拮抗FGF-23。

具体而言，在第一方面，本发明提供了成纤维细胞生长因子-23变体的聚乙二醇或葡聚糖的缀合物，其特征在于，所述缀合物的活性是等摩尔量的未缀合的FGF-23 变体肽的活性的40%以上，优选60%以上，更优选70%以上，如80%以上。

优选本发明第一方面的缀合物中，成纤维细胞生长因子-23变体的氨基酸序列如SEQ ID No：2、4或6所示，优选为SEQ ID No：2。

      优选本发明第一方面的缀合物中，mPEG或葡聚糖的分子量介于2kDa-22kDa，优选为5kDa、10kDa、15kDa、或20kDa。

      优选本发明第一方面的缀合物是由包括以下步骤的制备方法制备而得的：

（1）FGF-23 变体肽与马来酰亚胺或丁醛官能团化的PEG或葡聚糖混合，避光反应后，终止反应；

（2）将步骤（1）中的反应产物过Sephedax G-25柱除盐，然后上样于Resource S 阳离子交换柱并用0-1.0 M NaCl的哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰。

      优选本发明第一方面的缀合物中，FGF-23 变体肽与马来酰亚胺或丁醛官能团化的PEG或葡聚糖的摩尔比介于1：2-1：50，优选为1：5、1：10、1：20、1:30。

      在第二方面，本发明提供了制备本发明第一方面的缀合物的方法，其包括：

（1）FGF-23 变体肽与马来酰亚胺或丁醛官能团化的PEG或葡聚糖混合，避光反应后，终止反应；

（2）将步骤（1）中的反应产物过Sephedax G-25柱除盐，然后上样于Resource S 阳离子交换柱并用0-1.0 M NaCl的哌嗪-N,N'-二(2-乙磺酸)缓冲液梯度洗脱，收集洗脱峰。

 优选本发明第二方面的方法中，FGF-23 变体肽与马来酰亚胺或丁醛官能团化的PEG或葡聚糖的摩尔比介于1：2-1：50，优选为1：5、1：10、1：20、1:30。

在第三方面，本发明提供了药物组合物，其包括本发明第一方面的缀合物和药学上可接受的载体。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位给药剂量形式，如冻干剂、片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、水针剂或喷雾剂，更优选该药物组合物为注射剂型（如，冻干粉针剂），用于注射给药。

 在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的缀合物在制备用于拮抗FGF-23的药物中的应用。

  优选本发明第四方面的应用中，药物是预防或治疗低磷血症的药物。

本发明取得的有益效果在于：缀合物的活性保持良好，体外稳定性显著提高、体内半衰期显著延长、体内免疫原性显著降低；制备工艺简单，缀合物均一性好；能用于治疗包括低磷血症在内的疾病。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

 附图说明

图1为20kD PEG（连接丁醛反应基团的PEG修饰制剂，mPEG-丁醛）修饰产物的SDS-PAGE分析图，其中A为实施例三的修饰的FGF-23 变体肽的分离纯化产物，B为实施例三的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品，C为实施例四的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品，D为实施例五的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品。

图2为20kD 葡聚糖(连接丁醛反应基团的葡聚糖修饰制剂，葡聚糖-丁醛)修饰产物的SDS-PAGE分析图，其中A为未修饰的FGF-23 变体肽，B为实施例六的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品，C为实施例七的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品，D为实施例八的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品，E为实施例九的修饰的FGF-23 变体肽和回收的未修饰的FGF-23 变体肽的混合样品。

图3显示了20kD mPEG-丁醛修饰对FGF-23 变体肽抗胰蛋白酶解能力的影响，空心圆圈表示PEG修饰的FGF-23 变体肽随保温时间的延长而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，实心方框表示未经葡聚糖修饰的FGF-23 变体肽随保温时间的延长而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，结果表明表明FGF-23 变体肽经PEG修饰后抗胰蛋白酶稳定性显著提高。

图4显示了20kD 葡聚糖-马来酸酰亚胺修饰对FGF-23 变体肽抗酸水解能力的影响，黑色柱表示葡聚糖修饰的FGF-23 变体肽在相应pH缓冲溶液中于室温孵育12小时后的活性百分比（以pH 7.0为基准），灰色柱表示未经葡聚糖修饰的FGF-23 变体肽在相应pH缓冲溶液中于室温孵育12小时后的活性百分比，结果表明表明FGF-23 变体肽经葡聚糖修饰后抗酸水解能力显著提高。

图5和图6显示了20kD PEG-丁醛和20kD 葡聚糖-丁醛修饰后的FGF-23 变体肽对X连锁佝偻病小鼠(X-linked hypophosphatemic rickets mice, XLH)的低磷血症的血磷水平的调节情况。其中图5表示给予相关药物4小时后小鼠尿液和血液钟含磷量的变化情况，其中图5a黑色柱表示给药前尿液中磷元素的含量，灰色柱表示给药4小时后尿液中磷元素的含量，图5b黑色柱表示给药前血液中磷元素的含量，灰色柱表示给药4小时后血液中磷元素的含量；图6a黑色柱表示给药前尿液中磷元素的含量，灰色柱表示给药16小时后尿液中磷元素的含量，图6b黑色柱表示给药前血液中磷元素的含量，灰色柱表示给药16小时后血液中磷元素的含量。上述结果充分显示FGF-23 变体肽在经过PEG或者葡聚糖修饰后，保持了很好的调节体内磷含量的功能，更重要的是，由于FGF-23 变体肽经过修饰后其稳定性显著提高，因此其在体内保持调磷的功能显著延长，在给药16个小时其调磷作用要显著优于未修饰的FGF-23 变体肽。

 具体实施方式

 本发明实施例所用的FGF-23 变体肽为如 SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，委托浙江格鲁斯特生物科技有限公司合成；其中所用的试剂均为可以购买的商品化试剂，如带有活性接头分子的PEG可购自美国Shearwater公司，带有活性接头的葡聚糖可购自浙江格鲁斯特生物科技有限公司。

 实施例一 聚乙二醇-FGF-23变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：5000Da）以摩尔比1：5混合，放置于4℃，避光反应12小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.5）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰。将第一个洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为5mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据Goetz等人（Isolated C-terminal tail of FGF-23 alleviates hypophosphatemia by inhibiting FGF-23-FGFR-Klotho complex formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010 Jan;107(1):407-412）报道的方法测定FGF-23 变体肽以及上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物学活性，将修饰产物活性与修饰前变体肽相除得到生物活性保存率，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为82.1 %。

 实施例二 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与mPEG-马来酰亚胺（PEG分子量：10000Da）以摩尔比1：10混合，放置于4℃，避光反应12小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.5）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为5mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为71.3 %。

 实施三 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：10混合，放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为62.2%。

 实施四 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.5）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为5mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为64.6%。

 实施五 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于4℃，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为72.8%。

实施六 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与葡聚糖-丁醛（葡聚糖分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于4℃，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为68.3%。

 实施七 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与葡聚糖-丁醛（葡聚糖分子量：20000Da）以摩尔比1：10混合，放置于4℃，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为66.1%。

 实施八 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与葡聚糖-丁醛（葡聚糖分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为59.1%。

 实施九 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg人源化FGF-23 变体肽与葡聚糖-丁醛（葡聚糖分子量：20000Da）以摩尔比1：10混合，放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为57.8%。

 实施例十 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg鼠源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于4℃，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephadex G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为52.3%。

 实施例十一 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg鼠源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：10混合，放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为50.1%。

 实施例十二 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg鼠源化FGF-23 变体肽与葡聚糖-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于4℃，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephedax G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为55.7%。

 实施例十三 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg鼠源化FGF-23 变体肽与葡聚糖-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：10混合，放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephadex G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为45.9%。

 实施例十四 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.5）中的10mg猴源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：5混合，放置于放置于4℃，避光反应48小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephadex G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为64.5%。

 实施例十五 葡聚糖-FGF-23 变体肽的制备

1、修饰反应：将溶解于10mLPipes缓冲液（25mM，PH=6.0）中的10mg猴源化FGF-23 变体肽与mPEG-丁醛（PEG分子量：20000Da）以摩尔比1：10混合，放置于放置于室温，避光反应24小时。加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应。

、修饰产物的分离纯化：将步骤1中的反应液，过Sephadex G-25柱（20cm×1.5cm）除盐：采用25mM Pipes缓冲液（pH=6.0）平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集洗脱峰。将洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为3mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

、聚乙二醇-FGF-23 变体肽的活性鉴定：根据实施例一所述的方法，测得上述聚乙二醇-FGF-23 变体肽的生物活性保存率为47.7%。

 实施例十六 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的SDS-PAGE分析

将上述实施例一、二、三、四、五、十、十一和十四收集到的修饰纯品，采用SDS-PAGE电泳法检测，分离胶12％，浓缩胶5％。电泳结束后，将胶体放入装有50ml固定液的培养皿中（甲醇16ml，甲醛20μl,重蒸水24ml），在摇动下固定10-30分钟；取出胶体，水洗两次，每次5分钟;再放入0.02％的硫代硫酸钠溶液中，1分钟;水洗两次，每次20秒；放入装有30ml左右的0.1％的硝酸银溶液中，在摇动下染色10-30分钟；取出胶体，水洗一次，加入小体积的硫代显影液（无水碳酸钠1.5g,2％硫代硫酸钠200μl，甲醛25μl），再转入30-50ml的硫代显影液中，缓慢摇动至足够的显影强度。结果如图1所示 。

 实施例十七 葡聚糖-FGF-23 变体肽的SDS-PAGE分析

       将上述实施例六、七、八、九 、十二、十三和十五收集到的修饰纯品，采用SDS-PAGE电泳法检测，分离胶12％，浓缩胶5％。电泳结束后，采用考马斯亮蓝进行染色并采用由甲醛和乙酸配置的脱色液进行脱色，结果如图2所示。

 实施例十八 聚乙二醇-FGF-23 变体肽的抗酶解能力检测

分别取含等物质量的人源FGF-23 变体肽和实施例三制备的PEG-FGF-23 变体肽各0.5 mL，与1mmol/L胰蛋白酶溶液混匀，最终蛋白与胰蛋白酶的物质量比为10 : 1，37℃保温，于0、2、5、10、20、30、60和120 min取混合样0.05 ml，立即与无血清RPMI 1640培养基混匀（样品体积：培养基体积 = 1 : 10），以终止胰蛋白酶的作用。

 将处理后的各样品进行12％ SDS-PAGE电泳分析，并将获得的凝胶采用凝胶扫描分析，观察蛋白质被胰蛋白酶的降解情况。结果如图3所示，表明保温30min后，修饰产物PEG- FGF-23 变体肽的含量与酶解前相比仍然存留31.3%，而未修饰产物基本被降解，仅剩余6.3%，由此可见，修饰后的FGF-23 变体肽抗胰蛋白酶水解能力明显增加。

 实施例十九 葡聚糖-FGF-23 变体肽的抗酸水解能力检测

分别取含等物质量的人源FGF-23 变体肽和实施例九制备的PEG-FGF-23 变体肽各0.5 mL，分别调节修饰前后的蛋白溶液的pH值从6降低为5，4，3，2。于37℃保温24h后收集样品进行12％ SDS-PAGE电泳分析，将获得的凝胶采用凝胶扫描分析，以pH为6时的FGF-23 变体肽的含量为基础，计算变体肽被酸水解的情况。结果如图4所示，表明在pH 3.0条件下，葡聚糖修饰产物FGF-23 变体肽的含量与pH 6.0相比仍然存留42 %，而未修饰产物 仅剩余9.1%，由此可见，经过葡聚糖修饰后的FGF-23 变体肽抗酸水解能力明显增加。

实施例二十 聚乙二醇-FGF-23 变体肽及葡聚糖-FGF-23 变体肽对XLH小鼠血磷调节的作用分析

       为了观察修饰前后人源FGF-23 变体肽对体内肾脏部位磷含量的影响，我们选择X连锁佝偻病（XLH)小鼠作为动物模型，该小鼠模型是研究低磷血症的经典动物模型，由于FGF-23的异常升高造成了该动物模型的肾部磷代谢升高，进而引起低磷血症，抑制FGF-23的异常活性是解决这一疾病的关键手段，FGF-23 变体肽能竞争性的与FGF-23相应的FGF受体结合，从而抑制FGF-23的异常活性。本发明人比较研究修饰前后FGF-23 变体肽对XLH小鼠的体内含磷量影响，具体方法是，将24只XLH小鼠分为四组：空白对照组（给予生理盐水），FGF-23 变体肽给药组，实施例三制备的聚乙二醇-FGF-23 变体肽治疗组，实施例九制备的葡聚糖-FGF-23 变体肽治疗组，每组含6只小鼠，给药前测定各小鼠尿液及血液含磷水平，给药4小时后测定各小鼠尿液和血液含磷水平，给药16小时后再测定各小鼠尿液及血液中含磷水平。结果表明，给药4小时后，修饰前后FGF-23 变体肽对尿液中含磷水平有显著降低(图5a)；而对血液中含磷水平则有显著提高(图5b)，这说明FGF-23 变体肽能显著降低磷的代谢，提高体内含磷水平，从而有效抑制FGF-23引起的体内低磷症状，更重要的是，研究还发现，在给药时间达16小时后，修饰的FGF-23 变体肽仍然较好的保留了上述调磷效应(图6a)，而未修饰的FGF-23 变体肽效果却显著下降(图6b)，这很好的说明了FGF-23 变体肽经过本发明提出的聚乙二醇PEG或葡聚糖修饰，稳定性及体内持续作用效果显著改善，这为相关药物的研究与开发提供了重要的新思路和途径。

<110>  温州医学院， 黄志锋

<120>  一种长效型成纤维细胞生长因子-23拮抗剂的开发

<160>  6    

 

<210>  1

<211>  251

<212>  PRT

<213>  Homo sapiens

 

<400>  1

 

Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val

1               5                   10                  15     

 

 

Cys Ser Met Ser Val Leu Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg

        35                  40                  45              

 

 

Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala

    50                  55                  60                 

 

 

Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met

                85                  90                  95     

 

 

Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asp Pro Glu Asn

            100                 105                 110        

 

 

Cys Arg Phe Gln His Gln Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His

        115                 120                 125            

 

 

Ser Pro Gln Tyr His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala

    130                 135                 140                

 

 

Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Ile Pro Arg Arg

                165                 170                 175    

 

 

His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val

            180                 185                 190        

 

 

Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln

        195                 200                 205            

 

 

Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu

    210                 215                 220                

 

 

Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly

225                 230                 235                 240

 

 

Pro Glu Gly Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile

                245                 250    

 

 

<210>  2

<211>  72

<212>  PRT

<213>  Homo sapiens

 

<400>  2

 

Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val

        35                  40                  45             

 

 

Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Gly

    50                  55                  60                 

 

 

Cys Arg Pro Phe Ala Lys Phe Ile

65                  70         

 

 

<210>  3

<211>  251

<212>  PRT

<213>  Mus sp.

 

<400>  3

 

Met Leu Gly Thr Cys Leu Arg Leu Leu Val Gly Val Leu Cys Thr Val

1               5                   10                  15     

 

 

Cys Ser Leu Gly Thr Ala Arg Ala Tyr Pro Asp Thr Ser Pro Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Gly Ser Asn Trp Gly Ser Leu Thr His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg

        35                  40                  45             

 

 

Thr Ser Tyr His Leu Gln Ile His Arg Asp Gly His Val Asp Gly Thr

    50                  55                  60                 

 

 

Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Thr Ser Glu Asp Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Ser Val Val Ile Thr Gly Ala Met Thr Arg Arg Phe Leu Cys Met

                85                  90                  95     

 

 

Asp Leu His Gly Asn Ile Phe Gly Ser Leu His Phe Ser Pro Glu Asn

            100                 105                 110        

 

 

Cys Lys Phe Arg Gln Trp Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr Leu

        115                 120                 125            

 

 

Ser Gln Lys His His Tyr Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ile

    130                 135                 140                 

 

 

Phe Gln Pro Gly Thr Asn Pro Pro Pro Phe Ser Gln Phe Leu Ala Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Arg Asn Glu Val Pro Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Arg Pro Arg Arg

                165                 170                 175    

 

 

His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Pro Pro Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val

            180                 185                 190        

 

 

Leu Lys Pro Arg Pro Arg Ala Thr Pro Val Pro Val Ser Cys Ser Arg

        195                 200                 205            

 

 

Glu Leu Pro Ser Ala Glu Glu Gly Gly Pro Ala Ala Ser Asp Pro Leu

    210                 215                 220                

 

 

Gly Val Leu Arg Arg Gly Arg Gly Asp Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly

225                 230                 235                 240

 

 

Ala Asp Arg Cys Arg Pro Phe Pro Arg Phe Val

                245                 250    

 

 

<210>  4

<211>  72

<212>  PRT

<213>  Mus sp.

 

<400>  4

 

Ser Ala Glu Asp Pro Pro Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Arg Pro Arg Ala Thr Pro Val Pro Val Ser Cys Ser Arg Glu Leu Pro

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ala Glu Glu Gly Gly Pro Ala Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Leu

        35                  40                  45             

 

 

Arg Arg Gly Arg Gly Asp Ala Arg Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asp Arg

    50                  55                  60                 

 

 

Cys Arg Pro Phe Pro Arg Phe Val

65                  70          

 

 

<210>  5

<211>  251

<212>  PRT

<213>  Macaca sp.

 

<400>  5

 

Met Leu Gly Ala Arg Leu Arg Leu Trp Val Cys Ala Leu Cys Ser Val

1               5                   10                  15     

 

 

Cys Ser Met Ser Val Ile Arg Ala Tyr Pro Asn Ala Ser Pro Leu Leu

            20                  25                  30         

 

 

Gly Ser Ser Trp Gly Gly Leu Ile His Leu Tyr Thr Ala Thr Ala Arg

        35                  40                  45             

 

 

Asn Ser Tyr His Leu Gln Ile His Lys Asn Gly His Val Asp Gly Ala

    50                  55                  60                 

 

 

Pro His Gln Thr Ile Tyr Ser Ala Leu Met Ile Arg Ser Glu Asp Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Phe Val Val Ile Thr Gly Val Met Ser Arg Arg Tyr Leu Cys Met

                85                  90                  95     

 

 

Asp Phe Arg Gly Asn Ile Phe Gly Ser His Tyr Phe Asn Pro Glu Asn

            100                 105                 110        

 

 

Cys Arg Phe Arg His Trp Thr Leu Glu Asn Gly Tyr Asp Val Tyr His

        115                 120                 125            

 

 

Ser Pro Gln His His Phe Leu Val Ser Leu Gly Arg Ala Lys Arg Ala

    130                 135                 140                

 

 

Phe Leu Pro Gly Met Asn Pro Pro Pro Tyr Ser Gln Phe Leu Ser Arg

145                 150                 155                 160

 

 

Arg Asn Glu Ile Pro Leu Ile His Phe Asn Thr Pro Arg Pro Arg Arg

                165                 170                 175    

 

 

His Thr Arg Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val

            180                 185                 190        

 

 

Leu Lys Pro Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln

        195                 200                 205            

 

 

Glu Leu Pro Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Val Ala Ser Asp Pro Leu

    210                 215                 220                

 

 

Gly Val Val Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly

225                 230                 235                 240

 

 

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Phe Pro Lys Phe Ile

                245                 250    

 

 

<210>  6

<211>  72

<212>  PRT

<213>  Macaca sp.

 

<400>  6

 

Ser Ala Glu Asp Asp Ser Glu Arg Asp Pro Leu Asn Val Leu Lys Pro

1               5                   10                  15     

 

 

Arg Ala Arg Met Thr Pro Ala Pro Ala Ser Cys Ser Gln Glu Leu Pro

            20                  25                  30         

 

 

Ser Ala Glu Asp Asn Ser Pro Val Ala Ser Asp Pro Leu Gly Val Val

        35                  40                  45             

 

 

Arg Gly Gly Arg Val Asn Thr His Ala Gly Gly Thr Gly Pro Glu Ala

    50                  55                  60                 

 

 

Cys Arg Pro Phe Pro Lys Phe Ile

65                  70         

 

 

 

Claims (5)

1.成纤维细胞生长因子-23变体的聚乙二醇的缀合物，其特征在于，其是由如下方法制备而成的：

（1）修饰反应：将溶解于10mL 25mM、PH=6.5的Pipes缓冲液中的10mg人源化FGF-23变体肽与PEG分子量为5000Da的mPEG-马来酰亚胺以摩尔比1：5混合，其中FGF-23变体肽为如 SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，放置于4℃，避光反应12小时，加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应； 

（2）修饰产物的分离纯化：将步骤（1）中的反应液，过20cm×1.5cm 的Sephedax G-25柱除盐：采用25mM pH=6.5的Pipes缓冲液平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；

将第一个洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为5mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

2.制备权利要求1所述的缀合物的方法，其包括：

（1）修饰反应：将溶解于10mL 25mM、PH=6.5的Pipes缓冲液中的10mg人源化FGF-23变体肽与PEG分子量为5000Da的mPEG-马来酰亚胺以摩尔比1：5混合，其中FGF-23变体肽为如 SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质，放置于4℃，避光反应12小时，加入1M甘氨酸1mL终止修饰反应； 

（2）修饰产物的分离纯化：将步骤（1）中的反应液，过20cm×1.5cm 的Sephedax G-25柱除盐：采用25mM pH=6.5的Pipes缓冲液平衡柱至基线平稳后，1mL/min流速上样，25mM Pipes缓冲液洗脱，收集第一个洗脱峰；

将第一个洗脱峰对应样品上Resource S 阳离子交换柱并用含0-1.0 M NaCl的Pipes缓冲液梯度洗脱，流速为5mL/min, 收集各洗脱峰，并采用12％的SDS-PAGE电泳分析洗脱峰，结果表明第一个洗脱峰对应的为FGF-23 变体肽PEG修饰产物。

3.药物组合物，其包括权利要求1所述的缀合物和药学上可接受的载体。

4.权利要求1所述的缀合物在制备用于拮抗FGF-23的疾病的药物中的应用。

5.权利要求4所述的应用，其中药物是预防或治疗低磷血症的药物。