CN101906162A - 成纤维细胞生长因子-1及其突变体的聚乙二醇修饰产物 - Google Patents
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Abstract
成纤维细胞生长因子-1具有广泛的生物学功能,在治疗多种疾病上具有重要潜在价值,但是存在稳定性差、体内半衰期短、可能存在免疫原性等缺点。本发明采用聚乙二醇对FGF-1及其突变体进行化学修饰,获得FGF-1及其突变体的聚乙二醇修饰产物,修饰产物均一性好、分离纯化工艺简单、活性回收率高,同时,提高了稳定性、延长了体内半衰期、降低了免疫原性。该成纤维细胞生长因子-1及其突变体的修饰产物可用于心脑血管、神经系统、内脏缺血性等疾病的预防和治疗,以及体表创伤、烧烫伤、溃疡和骨损伤等的治疗。
Description
一、发明领域
本发明涉及一类用聚乙二醇修饰的成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)及其突变体的修饰产物。
二、发明背景:
1.成纤维生长因子-1
成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)是一种对来源于中胚层和神经外胚层的多种类型的细胞具有广泛的生物学活性的细胞生长因子,研究表明,FGF-1的生物学效应包括:
(1)参与新生血管的形成。FGF-1对血管内皮细胞有较强的趋化作用和促增殖作用,并刺激血管内皮细胞产生胶原酶和纤维蛋白溶解酶原激活物(t-PA),进一步降解基底膜,同时诱导毛细血管内皮细胞形成管腔样结构;
(2)促进表皮细胞的增殖。体内体外实验表明,在烧伤创面应用FGF-1后,免疫组化染色及显微镜观察显示,FGF-1组的表皮细胞和全厚层皮肤组织的DNA含量高于生理盐水对照组,S期细胞数也明显高于对照组,表明FGF-1可促进表皮细胞的有丝分裂,从而促进表皮细胞的增殖,加速创面的愈合。
(3)FGF-1对中胚层及神经外胚层细胞的分化有明显的刺激作用。神经细胞的分裂受FGF-1的调节,分裂过程中出现轴突突起生长出生长锥、神经递质合成、递质小泡的转运等神经元特征。
(4)参与血管张力与血压调节
给动物注射FGF,可显示出扩张血管和降压效应。FGF的降压效应有3个特点:a.有或无肝素作为载体时均表现出降压作用,但血中一定浓度的肝素盐能增加其降压效果;b.FGF诱导的降压反应包括快相与慢相两个阶段,ATP敏感的K+通道可能在早期(快相)血压下降中起一定作用;c.从中枢(脑室内)给予FGF无降压作用,亦不影响从外周静脉血给予FGF的降压效应。FGF诱导的降压效应可能是与它能诱导内皮细胞释放松驰因子(EDRF),进而产生血管扩张效应有关。因此有人认为FGF的这一药理作用有可能给高血压的治疗带来突破。
(5)FGF-1对缺血性损伤保护作用
FGF能显著减少脑缺血导致的海马神经元死亡率;可防止再灌注损伤中心肌细胞外和线粒体内钙的沉积,减轻组织水肿,降低毛细血管损伤率以及肌酸磷酸激酶(CK)的释放;对急性肢体缺血性损伤,FGF除能显著减轻组织水肿外,还能部分恢复组织活力,减少细胞内钙依赖性ATP酶以及脱氢酶类的损失。其抗缺血损伤效应机制可能包括:A.FGF降低血管阻力,有助于开放小动脉与毛细血管而减少组织缺血后的“无再灌流(no reflow)”现象;B.FGF有助于开放K+-ATP通道,促进内皮细胞分泌释放血浆纤维蛋白溶酶原激活物(PA),进而有助于清除心血管系统的栓塞;C.FGF能调节细胞Ca2+浓度,有助于维持Ca2+依赖性ATP酶的活性,减少自由基的产生。
(6)对神经系统的作用
实验表明,许多神经元受慢性神经退化变性疾病的影响,如:肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS),影响运动神经元;帕金森疾病,影响黒质中的神经元;早老性痴呆,影响基底前脑副交感神经元。这些神经元中都有大量的FGF-1分布,FGF-1可作为自分泌神经营养因子,感受细胞质膜哪怕是瞬间的渗漏,并立即启动修复,促进神经细胞的迁移和纤溶酶激活剂的释放,增加髓磷脂相关蛋白和类脂的含量,改变神经细胞的典型的细胞进程和细胞膜结构,使神经元免受神经退化变性疾病的影响。
FGF-1能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活,使神经元成活时间增加和其轴突延长。Koshinaga等研究脊髓损伤后FGF-1的表达情况后,发现前角运动神经元的FGF-1含量增加,表明机体自身产生大量FGF-1,在脊髓损伤的自我修复和再生中起作用,这是机体的一种自我保护机制。
此外,FGF-1还具有调节摄食过程,调节激素分泌,诱导促甲状腺激素的释放,同时也增加靶细胞对这种激素的敏感性等非促分裂效应。
FGF-1广泛的生物学活性表明其在医疗上具有良好的应用前景。但是,作为一类蛋白质药物,它也存在稳定性差、体内半衰期短、可能产生免疫反应等缺点。尽管在发现FGF后国内外对其进行了大量研究,但迄今为止只有我国批准成纤维细胞生长因子-2作为外用药物用于外伤、溃疡治疗。
对FGF-1结构与功能的研究表明,人成纤维细胞生长因子-1(hFGF-1)的氨基酸序列中有三个半胱氨酸残基(Cys),分别位于第31、98、132位,其中第31、98位Cys在hFGF-1和hFGF-2(人的FGF-2)中是一致的,而第132位Cys是hFGF-1独有的。用定点突变技术将Cys转变为中性氨基酸,如:丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala),能增加hFGF-1对热、酸及某些蛋白酶的稳定性和生物学活性。Linemeyer等人用点突变的方法将FGF-1的3个Cys逐个换成丝氨酸(Ser),结果发现得到的3个突变体在肝素存在下都保持较高活性。用碘乙酸对FGF-1进行化学修饰,发现具有活性的FGF-1的所有3个Cys都可被修饰,这说明Cys以及由Cys形成的二硫键对FGF-1活性不是必需的。进一步将Ser132突变体的另外2个Cys催化氧化形成一对二硫键,可使FGF-1的活性几乎完全丧失,用DTT还原又可使其活性恢复,表明Cys31和Cys98形成的二硫键对FGF-1来说不仅不是必要的而且是有害的。Ortega等人曾报道了FGF-1的3个Cys双点突变和三点突变研究结果,他们发现这些突变体的活性与野生型和单点突变体比较,都有不同程度的增加,这些结果进一步说明了Cys的存在对FGF-1活性的抑制作用,而这种抑制作用很可能是由于二硫键的形成所致。
2.蛋白质药物化学修饰的研究近况及进展
化学修饰作为一种重要的改善蛋白质的生物特性的技术在上世纪中叶已引起部分生物学家的重视,但直到最近十年,随着化学修饰剂专业性的提高,化学修饰过程分析和计算方法的完善以及结构生物学的发展,化学修饰才真正为人熟知,并且以其灵活多样,简便易行的特点深受生物界的青睐。
化学修饰剂与蛋白质的反应主要有酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等。代表性的修饰剂有醋酸酐、乙酰咪唑、乙二醛、右旋糖酐、肝素、葡聚糖、乙二酸/丙二酸的共聚物、羧甲基纤维、聚乙烯吡咯酮、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙稀顺丁烯二酰肼共聚物、聚氨基酸、多聚唾液酸、环糊精、聚乙二醇等,其中聚乙二醇(PEG)类修饰剂应用最多。
PEG是一种由重复的乙烯氧亚单元聚合而成的大分子化合物,活性低,无毒,并且具有良好的生物相容性。当它与蛋白质的非必需基团共价结合时,分子量明显增加,肾小球滤过滤减少,同时PEG衍生物的屏蔽作用保护了蛋白质,使其不易被蛋白酶水解,从而增加了被修饰药物的体内稳定性,延长了其生物半衰期。PEG可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇,避免抗体的产生,或者阻止抗原与抗体的结合从而抑制免疫反应的产生。
具有重要作用和功能的化学修饰已经在全球的生物制药领域引起越来越多的关注:著名生物制药企业Enzon公司对不同的蛋白质药物进行化学修饰的研究已有数十年历史,其研制的PEG-门冬酰胺酶、PEG-腺苷脱胺酶和PEG-干扰素已通过美国FDA认证并成功上市,其中注射用聚乙二醇结合α-2b干扰素(PEG-IFN)用于无法接受α干扰素(IFN-α)治疗的18岁以上慢性乙肝病人。慢乙肝是美国流行最广的疾病之一,PEG-IFN每周一次皮下注射极为方便,提高了病人的顺应性。斯克利泼斯医院消化科Mchutchison医师认为:IFN-α和利巴韦林联用是慢乙肝的标准疗法,PEG-IFN单剂疗法可作为联合疗法禁忌或不耐受患者的代替疗法。另外,像Roche Holding公司利用PEG修饰粒细胞集落刺激因子(Pegylated G-CSF)用于治疗多种癌症和粒细胞减少症已进入II期临床;Amgen公司研制的肿瘤坏死因子修饰产物(PEG-STNF-R1)也已进入用于治疗风湿性关节炎的II期临床等等。至于国内,最近十年,也开展了利用化学修饰改善蛋白质性质和功能的研究,先后报道了对干扰素α-2b,白介素-2,天冬酰胺酶和天花粉等蛋白类药物的修饰。
本发明利用聚乙二醇对FGF-1进行化学修饰,其产率在一定条件下能够达到52.5%。与未修饰的FGF-1相比,其热稳定性、抗各种蛋白酶水解能力、体内半衰期都有很大程度的提高,在开发适用于各种适应症的FGF-1药物上具有重要应用价值。
三、附图说明
图1:修饰前后蛋白热稳定性比
图2:修饰前后蛋白抗胰酶水解能力
四、本发明的实现
实施例一聚乙二醇-hFGF-1ser98,ser132的制备
1.mPEG20kD-maleimide的合成:等物质量6-氨基己酸与马来酸酐在足量冰乙酸中加热回流24小时后减压除去冰乙酸,所得产物过硅胶柱分离,分布收集做薄层检测。将含有相同组分的样品合并后减压浓缩,室温条件下,将浓缩样以1∶5到1∶20(摩尔比)的比例与mPEG20kD二氯甲烷溶液混合。向其中加入1‰-2%的DCCI和DMAP作催化剂,反应4-24小时,加入1/3至1/2体积的乙醚作沉淀剂,静置4-8小时,8000rmp离心,收集沉淀,得灰白色固体,即为所要活化酯mPEG20kD-maleimide。
2.修饰反应:将溶解于PB缓冲液(10-50mM,pH=6.0-7.5)中的人成纤维细胞生长因子-1的突变体(hFGF-1ser98,ser132,第98、132位Cys突变为Ser)与mPEG20kD-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合,放置于4℃-37℃,反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化:取步骤2中反应液,过Sephedax G-25柱除盐后,上CL-6B肝素亲和层析柱分离,分离条件为:CL-6B制备型亲和层析柱(20cm×1.5cm),采用10-50mM PB缓冲液平衡柱,1mL/min流速上样,用10-50mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后,10-50mM PB+0.1-1.2MNaCl缓冲液洗脱,洗脱液流速为1mL/min,收集第-个洗脱峰,过Sephedax G-25柱除盐后,即得聚乙二醇-hFGF-1ser98,ser132纯品。
实施例二聚乙二醇-hFGF-1ser31,ser132的制备
1.mPEG20kD-maleimide的合成:与实施例一相同。
2.修饰反应:将溶解于10-50mM的PB缓冲液(pH=6.0-7.5)中的人成纤维细胞生长因子-1的突变体(hFGF-1ser31,ser132,第31、132位Cys突变为Ser)与mPEG20kD-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合,放置于4℃-37℃,反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化:与实施例一相同。
实施例三聚乙二醇-hFGF-1ser31,ser98的制备
1.mPEG20kD-maleimide的合成:与实施例一相同。
2.修饰反应:将溶解于10-50mM的PB缓冲液(pH=6.0-7.5)中的人成纤维细胞生长因子-1的突变体(hFGF-1ser31,ser98,第31、98位Cys突变为Ser)与mPEG20kD-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合,放置于4℃-37℃,反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化:与实施例一相同。
实施例四聚乙二醇-FGF-1的制备
1.mPEG20kD-maleimide的合成:与实施例一相同。
2.修饰反应:将溶解于10-50mM的PB缓冲液(pH=6.0-7.5)中的FGF-1与mPEG20kD-maleimide以摩尔比1∶5-1∶50混合,放置于4℃-37℃,反应2-72小时。
3.修饰产物的分离纯化:取步骤2中反应液,过Sephedax G-25柱除盐后,上CL-6B肝素亲和层析柱分离,分离条件为:CL-6B制备型亲和层析柱(6cm×1.5cm),采用10-50mM PB缓冲液平衡柱,上样,10-50mM PB缓冲液洗柱至基线平稳后,10-50mM PB+0.1-1.2M NaCl缓冲液洗脱,洗脱液流速为1-10mL/min,收集洗脱峰,SDS-PAGE检验,分别过Sephedax G-25柱除盐后,即得不同修饰度的聚乙二醇-hFGF-1纯品。
实施例五聚乙二醇-FGF-1生物学活性检测
活性测定采用MTT法。将3T3细胞在37℃,细胞浓度为2×104/mL,加入至96孔微量板的培养板中(100μL/孔),通入5%CO2培养48h。每孔各加入MTT(5mg/mL)20μL,继续培养4h,去培养液,每孔加入二甲基亚砜100μL,室温放置30min,MK-3酶标仪波长(570nm)检测各孔样品的OD值。
由表1可知,突变体rhFGF-1ser98,ser132经PEG修饰后,最高活性为修饰前的52.5%。一般来说,PEG偶合生物大分子与未修饰的分子相比,呈现出不同的物理、化学性质。与受体连接的亲和力经常收到这些物理化学性质变化的影响,因而以细胞为基础的体外活性检测测得值有所降低。另外,以细胞为基础的体外活性检测时,由于培养时间是固定的,PEG修饰后的生物分子半衰期的提高并不能得到显示。在相对较短的时间内,PEG修饰后的蛋白质与受体间的亲和力较低,也是导致蛋白体外生物活性降低的原因之一,本实验结果与上述阐述是完全相符合的。
表1修饰前后rhFGF-1的生物学活性
实施例六聚乙二醇-FGF-1稳定性研究
热稳定性:分别取野生型,突变型和聚乙二醇化的hFGF-10.01mM与大鼠血清混匀,37℃保温。于不同时间点取样0.3mL,用MT法测定个样品的存留生物活性。
抗酶水解能力:体外实验,分别取2mL胰蛋白酶与野生型,突变型和聚乙二醇化的hFGF-1混合(两者摩尔比为1∶60),37℃保温,在不同时间点取样0.1mL,将各样品进行SDS-PAGE电泳实验以检测。
从图1和图2可以看出,在37℃时,PEG-hFGF-1的活性在100h内保留了70%左右,而未修饰的突变性和野生型均仅为20%左右,由此可以得出,在体温环境下,修饰产物的热稳定要高于野生型和突变型。从右图可以看出,保温20min后,修饰产物仍然存留40%左右,而未修饰产物基本被完全降解,可以得出,修饰后hFGF-1抗胰蛋白酶水解能力明显增加。原因主要有两个:(一)由于PEG长链的空间位阻屏蔽了胰蛋白酶的水解位点,(二)PEG本身具有排斥大分子的特性,阻挡了胰蛋白酶的接近。
实施例七聚乙二醇-FGF-1体内半衰期检测
取正常雌性BALB/c小鼠(18-21克)15只,分成三组,每组5只。第一组腹腔注射野生型hFGF-1,剂量采用100ug/kg,第二组腹腔注射突变型hFGF-1,剂量采用100ug/kg,第三组腹腔注射聚乙二醇化hFGF-1,剂量采用100ug/kg。然后在不同的时间点取血液样本。通过酶联免疫吸附试验(ABC-ELISA)测定hFGF-1的浓度。野生型hFGF-1,突变体hFGF-1和聚乙二醇化rhFGF-1的半衰期由国家食品药品监督管理局(SFDA)制定的药代动力学分析软件测定分析。
ABC-ELISA法由以下几个步骤:将不同浓度(0.4、4、40、80、800ng/mL)的野生型,突变体和聚乙二醇化的hFGF-1的加入到96孔板作为标准品,另取一板每孔涂100μL小鼠血清样本作为样品,在4℃过夜孵育。标准品和样品均用洗涤液PBST洗板3次后,每个孔加入100μL的抗hFGF兔抗体。在37℃孵育1小时,用PBST洗板3次后,在每孔中加入100μL按滴度1∶2000进行稀释的生物素化抗体。在37℃孵育1小时,用PBST洗板三次后,再加入按滴度1∶2000稀释的HRP,随后洗干。每孔加入100μL底物显色液,37℃培养20min,每孔加终止液100μL。酶标仪测定每孔样品的OD值,波长设定为492nm。以抗体浓度为横坐标、OD值为纵坐标,绘制出标准曲线。
通过上述方法测定出修饰前蛋白rhFGF-1的体内半衰期t1/2为7.25min,突变体rhFGF-1ser98,132的体内半衰期t1/2为7.43min,而修饰产物PEG-rhFGF-1的体内半衰期t1/2达到41.38min,与修饰前蛋白相比提高了将近6倍。
Claims (5)
1.成纤维细胞生长因子-1(FGF-1)及其各种突变体的聚乙二醇化学修饰物。
2.权利要求1中所说的FGF-1聚乙二醇化学修饰包括用聚乙二醇对全长154个氨基酸残基的FGF-1进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰产物。
3.权利要求1中所说的FGF-1聚乙二醇化学修饰包括用聚乙二醇对N端截短1-30个氨基酸残基的FGF-1突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰产物。
4.权利要求1中所说的FGF-1聚乙二醇化学修饰包括用聚乙二醇对FGF-1序列中一个或两个半胱氨酸(Cys)残基突变为丝氨酸(Ser)的FGF-1突变体进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰产物。
5.权利要求1中所说的FGF-1聚乙二醇化学修饰包括用聚乙二醇对N端截短1-30个氨基酸残基的FGF-1序列中的一个或两个Cys残基突变为Ser的FGF-1进行修饰所得的聚乙二醇化学修饰产物。
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