JP2011507913A - Y型ポリエチレングリコール修飾したg−csfならびにその製造方法および使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
ここで、RおよびR’は独立して関係のない低分子量アルキル基で、nおよびn’は600から1500までである。
ここで、PaおよびPbは同一または異なる親水性ポリマーである。ポリエチレングリコール、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンモルホリンあるいはそれらの共重合体で、特別に好ましくはポリエチレングリコールおよびその共重合体であり、
jは1〜12の整数であり、
Riは水素、置換あるいは無置換のC1〜12アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、
X1およびX2は独立して連結基であり、X1は(CH2)nであり、X2は(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCOからなる群から選ばれる基であり、nは1〜10の整数であり、
Fはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療薬あるいはタンパクにあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成してもよい。
ここで、
PaおよびPbは同一または異なるポリエチレングリコールであり、
jは1〜12の整数であり、
Riは水素、置換あるいは無置換のC1〜12アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、
X1およびX2は独立して連結基であり、X1は(CH2)nであり、X2は(CH2)n、(CH2)nOCO、(CH2)nNHCO、(CH2)nCOからなる群から選ばれる基であり、nは1〜10の整数であり、
Fはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、G−CSFにあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成してもよい。
ここで、RおよびR’は、独立して低分子量のアルキル基、好ましくはメチル基であり、jは1〜12の整数であり、mおよびm’は重合度を表し、任意の整数であり、好ましくはm=m’、かつ、m+m’は好ましくは600から1500までである。この構造式中、Y型分岐PEGはアミド結合によってシングルポイントでG−CSF分子に連結する。
ここで、YPEG−NHSはEP1496076によって造られる。
400mgの9.58mg/ml G−CSF原液のバッファー系を50mMホウ酸ナトリウムバッファー溶液(pH8.0)に替え、2mM HClで40KDのNHS−YPEG(北京鍵凱科技有限公司(Jenkem Technology Co., Ltd.))3.2gを溶解し、タンパク:PEG=1:6(質量比)の比例で両者を混合した。4℃において3時間反応させ、生成物を10mM NaAc pH4.0で15倍希釈し、10mM NaAc/HAc pH4.0で平衡化した陽イオン交換カラム(GE社)に加え、10mM NaAc/HAc +NaCl 160mM pH4.0バッファー溶液で勾配溶出し、四つ目の活性ピークを収集した(図2)。10mMリン酸ナトリウムバッファー溶液(pH7.0)で平衡化したSephacryl S−400HRカラム(GE社)を使って大分子ポリマーを除去し、活性ピークを収集した(図3)。限外ろ過し10mM NaAc pH4.0バッファー系に替え、スキャンによって合計してサンプル73mgを収めた。
MALDI−TOFで実施例1に製造したPEG−G−CSFの分子量を測定した。ドイツBRUKER社のautoflex TOF/TOFマススペクトロメトリーを採用し、TOF/TOF MS法でYPEG−rHuG−CSFおよびrHuG−CSFの分子量を測った。シナピン酸(Sinapinic acid,SA,C11H12O5,MW 224.22)を基質として用い、分析ソフトはflexAnalysis Ver.3.0.54.0.であった。
実施例1で製造したPEG−G−CSFのPEG化修飾部位を分析した。
G−CSFおよびPEG−G−CSFのバッファー溶液を50mM (NH4)HCO3、pH8.0に替え、1:20の比例でエンドプロテアーゼ(Endoproteinase)Glu−Cを加え、G−CSFおよびYPEG−G−CSFを酵素切断し、得られたペプチド断片に対してMaldi−Tof法で分子量ペプチド断片フィンガープリントを描き、結果はそれぞれ図5および図6に示す。
1 試薬の調整と細胞培養
1.1 1640培養液:RPMI1640液体培地、4℃に保存した。あるいは培地説明書の調整方法によって調整した。使う前に毎リットルの培地にペニシリンおよびストレプトマイシンを105IU/Lまで追加した。
1.2 基本培養液:1640液に2.5%のウシ胎児血清(FBS,v/v)および12.5%の馬血清(ES,v/v)を添加し、4℃に保存した。
1.3 完全培養液:基本培養液に最終濃度が20ng(2000U)/mlに達するまでにrhG−CSFを添加し、4℃に保存した。
1.4 NFS−60細胞株:完全培養液で37℃,5%CO2の条件で培養し、48〜72時間において継代し、細胞濃度を2.0×105〜10.0×105/mlの間にコントロールし、前回継代の後24〜36時間にrhG−CSF効力測定に用いられた。
1.5 リン酸塩バッファー溶液(Hyclone):塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2g、リン酸水素ジナトリウム1.44g、リン酸ジ水素カリウム0.24gを取り、超純水で1000mlの溶液を調節し、121℃において15分間高圧滅菌をした。
1.6 チアゾリルブルーMTT溶液:MTT粉剤(Sigma)をリン酸塩バッファー溶液に溶け、5.0mg/mlの溶液を調節し、0.22μmメンブランフィルターでろ過除菌を行い、4℃で日陰のところに保存した。
1.7 溶解液
溶解液1:1%の濃塩酸、5%のTritonX−100を含むイソプロピル溶液であり、室温で日陰のところに保存した。
溶解液2:2.8%の濃塩酸、10%のTritonX−100を含むイソプロピル溶液であり、室温で日陰のところに保存した。
2.1 細胞懸濁液の調製
充分のNFS−60細胞培養物を取り、遠心しNFS−60細胞を収集し、リン酸塩バッファー溶液で3回洗い、再び基本培養液の中に懸濁した。細胞濃度は約2.0×105/mlに調節し、37℃で放置した。
2.2 G−CSF標準物質(標準物質または中検所より提供されたrhG−CSF国家標準物質;国際標準物質が参照として照合に使われ得る)および検査用サンプルは、タンパクの含有量を基準に基本培養液で2ng/mlになるように希釈し、いずれのステップの希釈も10倍を超えるべきでない。
2.3 96ウェル細胞培養プレートに前もって基本培養液を50μl/ウェル加えた。2.2項の溶液を続けて2倍の勾配で希釈し、対照品および検査用サンプルについて8つの希釈度(1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml……)を有する希釈液を作り、50μl/ウェルであった。別に陰性対照(rhG−CSFを含まない)ならびに陽性対照(2ng/mlのrhG−CSFを含む)を調製し、それぞれ少なくとも3ウェルずつであった。
2.4 細胞懸濁液を50μl/ウェルで加え、37℃において、5%CO2で40〜48時間培養した。陰性細胞がほぼ破砕した(95%)後、MTT溶液を20μl/ウェルで加え、37℃において、5%CO2で4〜6時間培養した。
2.5 溶解液1を180μl/ウェルあるいは溶解液2を100μl/ウェル加え、均一に混合してから酵素標識メーターで比色し、検出波長を570nm、参照波長を630nmに設定した
OD570nm〜630nmをY軸にし、プレートの希釈勾配の対数をX軸にし、標準物質および検査用サンプルの用量効果関係図を描いた。実験データは4つのパラメータ曲線回帰計算法で処理した。標準物質の最高勾配OD570nm〜630nm値ならび最低勾配OD570nm〜630nm値の平均値を半有効OD570nm〜630nm値にした。各サンプルの曲線に半有効OD570nm〜630nm値に当たる希釈勾配対数はこのサンプルのC値である。以下の式によって結果を計算した。
検査用サンプルの力価(IU/本)=標準物質の力価×C1/C2×D1/D2×V
ここで、C1が標準物質の半有効量に相当する検査用サンプルの希釈倍数を、C2が標準物質の半有効希釈倍数を、D1が検査用サンプルの予備希釈倍数を、D2が標準物質の予備希釈倍数を、Vが包装量(ml)を、それぞれ表す。
検査の結果、実施例で製造したYPEG−G−CSFの生物学的比活性が2.96×107IU/mg(図10)。
一. ポリエチレングリコール化顆粒球コロニー刺激因子(YPEG−G−CSF)が5−フルオロウラシル(5−FU)によるマウス顆粒球減少症に対する治療効果
1. 材料及び方法
サンプル:YPEG−G−CSF、規格:1ml/本、アンプルに包装された液体注射剤であり、2〜8℃において保存した。アモイ伯賽遺伝子転写技術有限公司より提供された。
陽性対照:グラン(G−CSF)、300μg/本、麒麟鯤鵬(中国)生物薬業有限公司(Kirin Kunpeng(China)Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.)製品。保存:遮光、2〜8℃。
5−FUの作用によって、マウスの好中球の数が減少し、3日間後ならびに9日間以内に多数の動物の全血好中球は極めて低く、機器で検出できなかった。そのため、本実験は、実験前、3日後ならびに9日後の好中球百分率をそれぞれ測り、好中球の絶対値(ANC)を計算した。結果を表4に示す。結果によると、5−FUの作用後、モデル対照群ならび15μg/kg群の動物は投与の3日にANCが顕著に降下し、同時の正常対照群に比べて、顕著な差異が認められた(p<0.05およびp<0.01)が、50−500μg/kg群および陽性対照群のANCは降下せず、正常動物のWBC値ならび正常対照群に比べて、差異が認められなかった。サンプルは50〜500μg/kgの投与量でANCの降下を緩和させられることがわかった。9日目の検査のとき、モデル対照群対照群はまた正常対照群より低く、150および500μg/kg群は正常対照群を超え、陽性対照群は正常対照群のレベルに達した。11日目におけるモデル対照群は正常対照群のレベルに達した。サンプルあるいは陽性対照品はいずれも動物の好中球をできるだけ早く正常レベルに回復できることが示唆された。
本発明者らは、YPEG−G−CSFは、明らかな持続効果のほかに、5−フルオロウラシルによるマウス好中球減少症に現れる外周血の好中球減少に対して、明らかに増強された保護促進効果を有することを発現した。YPEG−G−CSFはマウス好中球減少症モデルの好中球低下の持続時間を明らかに短縮させ、外周血の好中球の数を迅速に回復させた。さらに、グランの1日に1回の投与で、11回投与したこと(グラン50μg/kg×11)に比べて、YPEG−G−CSFは4日間1回の投与で、3回投与したこと(低用量YPEG−G−CSF 50μg/kg×3、中用量YPEG−G−CSF 150μg/kg×3)を考慮すれば、本発明のYPEG−G−CSF総投与量が明らかに減少したにもかかわらず、好中球の増加促進効果はグランと同程度またはより優れることが明らかである。
1.材料および方法
サンプル:YPEG−G−CSF、規格:1mg/本、アンプルに包装された液体注射剤であり、2〜8℃において保存した。アモイ伯賽遺伝子転写技術有限公司(Biosteed Gene Expression Tech. Co. Ltd.)より提供された。
陽性対照品:グラン(G−CSF)、300μg/本、麒麟鯤鵬(中国)生物薬業有限公司製品。保存:遮光、2〜8℃。
実験中、毎日動物の血液生化学検査を行い、好中球を計算した。その結果、YPEG−rHuG−CSF低、中、高用量群および陽性対照群のANC平均値は同期のモデル対照群より高く、多くの時刻における投与群はモデル対照群に比べて統計学の差異がすべて認められた(p<0.05あるいはp<0.01)。実験の結果を表6及び図11に示す。
Y型PEG化組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子(YPEG−rHuG−CSF)が60Co 3.0Gy照射によるサル顆粒球減少症に対して治療効果を有する。
1.実験方法と順序
1.1薬品および試薬
サンプル:YPEG−G−CSF、規格:1mg/本、アンプルに包装された液体注射剤であり、2〜8℃において保存した。アモイ伯賽遺伝子転写技術有限公司より提供された。
陽性対照品:グラン(G−CSF)、300μg/本、麒麟鯤鵬(中国)生物薬業有限公司製品。保存:遮光、2〜8℃。
1.2実験動物
カニクイザル6匹、雌3匹雄3匹。広西営林開発中心サル飼育基地製(合格証番号:SCXK(桂)2005−0005)、体重3.11〜5.62kg、ケージ別に飼育され、標準サル餌を与え、水を自由に与え、毎日新鮮な果物二回与えた。
1.3実験計画
実験は2群に分けて行われた。それぞれはYPEG−G−CSFを300μg/kg皮下注射する群と普通G−CSF(グラン300μg/kg)群であった。
2.1血液サンプルの採集
YPEG−rHuG−CSFを単回皮下注射した投与前、投与後0.25、0.5、1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h、168h、240h、312h、384hおよび480hに投与した後肢の対側の後肢から静脈血を1mL採血した。グラン(G−CSF)群は投与前、投与後5分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、24時間に静脈血を1mL採血した。血液サンプルを4℃において30分放置した後、3000回転で10分低温遠心分離してからすぐ分離した血清を−20℃において保存し分析に供する。
免疫定量キット(ELISA法)でカニクイザル血清中のG−CSFあるいはYPEG−rHuG−CSFの薬物濃度を測った。Ray Biotech社のHuman G−CSF ELISAキットで血清中のG−CSFならびYPEG−rHuG−CSFの濃度を測るELISA方法を立てた。
このキットの分析に定量サンドイッチ技術を利用する。予め組み換えヒトG−CSF特異的なモノクローナル抗体をミクロウェルプレートにコーテイングした。標準品およびサンプルをウェルに吸い入れ、その中のG−CSFあるいはYPEG−G−CSFは固定化抗体と結合した。結合しない物質を洗い、ペルオキシダーゼ(HRP)を結びついたアンチヒトG−CSFのIgGをウェルに加え、結合しない抗体―酵素試薬を洗い、ウェルにHRPの基質溶液を加え呈した色は最初の結合したG−CSFあるいはYPEG−G−CSFの量と比例関係を持っている。反応を終止させ、色の強度を測定する。吸光度O.D.値が高ければ高いほど、サンプルの中のG−CSFあるいはYPEG−G−CSFの濃度が高い。
測定操作は完全にキットの説明書に準じて行われた。ウェルに100μLの標準品あるいは血清サンプルを加え、プレートミキサーで軽く均一に混合し、未知サンプルの予期濃度によって、希釈液で標準校正曲線の濃度範囲に希釈した。各プレートに組み換えG−CSFあるいはYPEG−G−CSFの標準校正曲線を設定し、このプレートにある未知サンプルの濃度を計算した。室温で1hインキュベーションした。プレートを洗液で3回洗った。ウェルに100μLの二次抗体を加え、続けて室温で1h反応させ、ウェルに100TMB基質を加え、室温で15分遮光放置した。ウェルに100終止液を加え、軽く均一に混合し、反応を終止させた。5分以内にマイクロプレートリーダーで450nm波長の吸光度ODを測った。
Originソフトで濃度の対数ならび光吸収OD値の対数を標準曲線に描いた。未知サンプルの96ウェルプレートに設計された標準曲線を利用して、直線性回帰でサンプルの中の組み換えG−CSFあるいはYPEG−G−CSFの濃度を計算し、希釈倍数で校正してから薬物血中濃度を求めた。
非コンパートメントモデルの統計学的モーメント法で各薬物動態学のパラメータを計算する。計算用のソフトが3P97であった。サル自身データの比較にはStudent’sペアt−検定法で統計し、異なるサルに対して、群別t−検定法で統計し、すべてMicrosoft Office Execl(バージョンXP)に提供された統計ソフトで計算した。実験結果の直線性回帰にはOriginソフトで回帰方程式および関連統計パラメータを求め、薬物動態学曲線の比較を図12に示す。
Claims (8)
- 一般式(I)の構造を有するY型ポリエチレングリコール化G−CSF。
(ここで、RおよびR’は、独立して低分子量のアルキル基、好ましくはメチル基であり、
mおよびm’は重合度を表し、任意の整数であり、m+m’は好ましくは600から1500までであり、
Riは水素、置換あるいは無置換のC1〜12アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、
jは1〜12の整数であり、
Fはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、G−CSFにあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成する。) - 前記アミノ基がG−CSFにおいて配列番号1の17番目のリジンに対応する側鎖εアミノ基である、請求項2に記載のY型ポリエチレングリコール化G−CSF。
- 前記ポリエチレングリコールの総平均分子量が約10000〜60000ダルトンであり、好ましくは40000±4000(10%)ダルトンである、請求項1〜3のいずれか一項に記載のY型ポリエチレングリコール化G−CSF。
- 前記G−CSFは天然物から抽出、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたG−CSFであり、好ましくは、配列番号1に示す配列を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載のY型ポリエチレングリコール化G−CSF。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載のY型ポリエチレングリコール化G−CSFまたは請求項6に記載の組成物の、G−CSF治療を必要とする疾患の治療薬の製造における使用であって、前記G−CSF治療を必要とする疾患は、例えば重度の感染、白血病、幹細胞移植および悪性固形腫瘍の化学放射線療法等による顆粒球減少症である、使用。
- 請求項3に記載のY型ポリエチレングリコール化G−CSFを製造および精製する方法であって、
(a)一般式(III)の構造を有するY型分岐構造のPEGとG−CSFとの両者をタンパク:PEG=1:6(質量比)の比例で混合し、4℃において反応させYPEG化G−CSFを得るステップと、
(b)生成物を10mM NaAc pH4.0で希釈し、10mM NaAc/HAc pH4.0で平衡化した陽イオン交換カラムに加え、10mM NaAc/HAc+NaCl 160mM pH4.0バッファー溶液で勾配溶出し、四つ目の活性ピークを収集し、10mMリン酸ナトリウムバッファー溶液(pH7.0)で平衡化したSephacryl S−400HRカラム(GE社)を使って大分子ポリマーを除去し、活性ピークを収集しK17位に修飾したY型ポリエチレングリコール化G−CSFを得るステップと
を含む、方法。 - 請求項3に記載のY型ポリエチレングリコール化G−CSFを投与することを含む、顆粒球減少症を治療する方法。
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