BRPI0822530B1 - Método de preparação de um hormônio de crescimento humano glicolado por polietileno (modificado por peg), hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu uso, preparação de hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu método de preparação e composição - Google Patents
Método de preparação de um hormônio de crescimento humano glicolado por polietileno (modificado por peg), hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu uso, preparação de hormônio do crescimento humano modificado por peg de menor peso molecular aparente e seu método de preparação e composição Download PDFInfo
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Abstract
HORMÔNIO DO CRESCIMENTO MODIFICADO POR POLIETILENO GLICOL DE FITA DUPLA, MÉTODO DE PREPARAÇÃO E SUA APLICAÇÃO. A presente invenção refere-se ao hormônio do crescimento com atividade biológica elevada modificado pelo polietileno glicol de fita dupla em um sítio único e o seu método de preparação são fornecidos. O hormônio do crescimento modificado por PEG possui uma atividade biológica mais elevada e uma meia-vida mais longa do que o hormônio de crescimento não modificado. A composição compreendendo o hormônio de crescimento modificado por PEG é útil no tratamento do distúrbio de crescimento ou desenvolvimento tal como a deficiência de hormônio do crescimento, síndrome de Turner, etc.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo da tecnologia de preparação biológica, em particular a um hormônio do crescimento (GH) modificado por polietileno glicol de fita dupla (PEG) com alta atividade biológica, e o seu método de preparação, assim como a utilização do hormônio do crescimento submetido a PEG obtido no campo farmacêutico.
[002] O hormônio do crescimento humano (HuGH) é um hormônio protéico secretado pela glândula pituitária anterior humana, o precursor do que consiste em 217 resíduos de aminoácido, em que os primeiros 26 resíduos de aminoácido compõem um peptídeo de sinal, e os 191 resíduos de aminoácido restantes compõem a molécula madura. Existem duas ligações de dissulfeto intramolecular (Cys79 e Cys191, Cys208 e Cys215), e a molécula não é glicosilada com um peso molecular de 22 kD. A sequência do HuGH é apresentada na SEQ ID NO: 1 (NCBI: P01241, AAA72260; Denoto F M, et al. Human growth hormone DNA sequence and mRNA structure: possible alternative splicing. Nucleic Acids Res., 9: 3719-3730, 1981; Roskam W, et al. Molecular cloning and nucleotide sequence of the human growth hormone structural gene. Nucleic Acids Res., 7: 305-320, 1979; Martial J A, et al. Human growth hormone: Complementary DNA cloning and expression in bacteria. Science, 205: 602-607, 1979; Chen E Y, et al. The human growth hormone locus: nucleotide sequence, biology and evolution. Genomics, 4: 479-497, 1989). As funções primárias do HuGH incluem a promoção do crescimento de uma célula, órgão ou osso, e são estritamente relacionadas com o anabolismo do corpo (Iglesias P, et al. Recombinant human growth hormone therapy in malnourished dialysis patients: a randomized controlled study. Am. J. Kidney Dis., 32(3): 454-463, 1998; Neely E K, Use and abuse of human growth hormone. Annu. Rev. Med., 45:407-410, 1994). Após mais do que 20 anos de aplicação clínica do hormônio do crescimento humano recombinante (rHuGH) produzido pela tecnologia de DNA recombinante, a eficácia clínica e a segurança do rHuGH foram demonstradas.
[003] Os resultados de muitas pesquisas indicaram que o rHuGH apresenta efeitos terapêuticos significativos no tratamento de nanismo, queimadura, ferida, fratura óssea, hemorragia da úlcera, insuficiência renal, AIDS, distúrbios anabólicos, nanismo por deficiência do hormônio do crescimento endógeno, síndrome de Turner e deficiência de hormônio de crescimento em adultos, e também apresenta efeito significativo na terapia antienvelhecimento. Atualmente o rHuGH é a único medicamento eficaz para o tratamento de nanismo. Em Março de 2001, as indicações que foram aprovadas pela FDA para introduzir a pesquisa clínica de rHuGH incluem: tratamento intensivo de retenção de nitrogênio de queimadura grave, síndrome intestinal de curta duração (administrada isoladamente ou em combinação com glutamina), AIDS relacionada com a interrupção do crescimento. Atualmente, as indicações de rHuGH que foram aprovadas para a comercialização incluem: nanismo por deficiência de hormônio do crescimento endógeno do adolescente, nanismo relacionado com a síndrome de Turner, nanismo por deficiência de hormônio de crescimento espontâneo ou orgânico do adolescente, síndrome de Prader-Willi, transtorno de crescimento precoce, transtorno catabólico relacionado com a AIDS, retardo do crescimento relacionado com a insuficiência renal crônica e deficiência de hormônio de crescimento em adultos etc.
[004] O polietileno glicol é um polímero orgânico inerte, não tóxico e biodegradável, e é importante nos campos da tanto da biotecnologia quanto dos produtos farmacêuticos. A técnica de modificação por PEG é ligar o PEG a uma proteína ativa através de ligação covalente. Após glicolação de polietileno (PEGilação), as propriedades da proteína podem ser significativamente melhoradas, por exemplo, o prolongamento da meia-vida metabólica do medicamento, a redução da imunogenicidade, o aumento da segurança, a melhora da eficácia terapêutica, a diminuição da frequência da dosagem, o aumento da solubilidade do medicamento/solubilidade em água, o aumento da resistência contra a proteólise, a facilitação da liberação controlada do medicamento e assim por diante (Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990; Delgado, et al. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992; Katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993 and Davis et al. U.S. Patente N° 4179337). É descrito na Patente US no 4179337 que após ligar o PEG a uma proteína tal como uma enzima ou insulina, a imunogenicidade da proteína foi reduzida, enquanto simultaneamente as atividades da proteína foram reduzidas igualmente, mas ao mesmo tempo a proteína modificada reteve uma certa proporção das atividades da proteína original sem modificações. Tal efeito também foi observado em G-CSF (Satake- Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1487, 1987), TNF-α (Tsutsumi et al. Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) e CD4-IgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).
[005] É descrito na Patente US no 5824784 que um modificador de PEG com um grupo aldeído na extremidade foi usado para obter um PEG-G-CSF, que foi modificado por um único PEG em um local fixo (aminoácido N-terminal da proteína). O modificador de PEG-NHS sintetizado pela ativação de N-hidroxissucanimida (NHS) pode formar uma ligação de amido com o grupo de ε-amino da lisina em G-CSF. O PEG-NHS possui uma atividade química elevada, mas seletividade fraca, e assim fica difícil obter um produto modificado por uma PEG único em um local fixo. Comparando-se a um produto modificado por múltiplos PEGs, o produto modificado por mono-PEG é mais homogêneo e assim é benéfico para a separação e purificação, que, portanto, facilita o controle de qualidade e garante a estabilidade entre as bateladas na produção em grande escala.
[006] Atualmente algumas espécies de medicamentos protéicos terapêuticos submetidos a PEG, tais como adenosina deaminase submetida a PEG da (Adagen.RTM, Enzon Pharmaceuticals), L- asparaginase submetida a PEG (Oncapspar.RTM, Enzon Pharmaceuticals), interferon-α2b submetido a PEG (PEG-Intron.RTM, Schering- Plough) e interferon-α2a submetido a PEG (Pegasys, Roche), fator estimulante da colônias de granulócitos submetido a PEG (Neulasta.RTM, Amgen), foram aplicadas clinicamente. O metabolismo in vivo do componente de PEG em um medicamento (ou o próprio PEG) já foi claramente compreendido, e o PEG foi provado de ser um bom e seguro modificador de medicamentos sem qualquer efeito adverso.
[007] O PEG que pode ser ligado a um medicamento protéico normalmente necessita ser derivatizado, de modo que um ou dois grupos terminais nas extremidades do PEG possam ser ativados quimicamente para possuir um grupo funcional apropriado que apresente atividade em, e assim possa formar uma ligação covalente estável ligação com, pelo menos um grupo funcional do medicamento a ser ligado. Por exemplo, o PEG pode ser ligado a ε-NH2 de um resíduo de Lys dentro da cadeia peptídica da proteína, ou a α-NH2 do resíduo de aminoácido N-terminal da cadeia peptídica da proteína. Normalmente existem três formas de polietileno glicóis que foram utilizados para modificar uma proteína: uma molécula de cadeia linear (EP 0593868; Yu-Sen Wang et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002; Yu-Sen Wang et al. Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000.), U-shaped branched molecule (EP 0809996) and Y-shaped branched molecule (CN1243779C, EP1496076). A patente da Europa n° EP0809996 descreve o PEGuilação de IFN-α.
[008] Acredita-se de uma forma geral na técnica que, após a modificação por PEG, as propriedades da maioria das proteínas sofrerão as seguintes alterações: 1. a diminuição da imunogenicidade e antigenicidade; 2. a meia-vida cíclica é prolongada; 3. a solubilidade é aumentada; 4. a proteína é tolerante à proteólise; 5. a disponibilidade biológica é aumentada; 6. a toxicidade é reduzida; 7. a estabilidade térmica e estabilidade mecânica são aumentadas; 8. o ponto isoelétrico, comportamento eletroforético e propriedades dinâmicas são alteradas, etc. Além do mais, um dos pontos mais importantes é que a modificação por PEG irá resultar na diminuição das atividades celulares de uma proteína, que é principalmente devido aos grupos que foram introduzidos no produto final, incluindo PEG e as ligações entre a PEG e a proteína a ser modificada, e também relacionado com as condições de acoplamento assim como os produto colaterais gerados. Doris Brugger et al. (Publ. da Patente dos US N°: US 2004/0223950 A1) descreve que os produtos de modificação do interferon-α2a mono- modificado por um UPEG único de fita dupla em um dos sítios diferentes apresentam diferença significativa nas atividades anti-virais in vitro, em que o produto de modificação mono-modificado por UPEG no sítio Lys31 possui a atividade específica mais elevada, enquanto que o produto mono-modificado por UPEG no sítio Lys121 possui a atividade específica mais baixa, em que a diferença entre ambos pode ser até 5 vezes.
[009] Li, Weihua et al. (Publ. da Patente Chinesa N°: CN 1477126A) descreve um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG. É preferível executar a reação de modificação do hormônio de crescimento por PEG ramificado (mPEGn- NHS) em pH 6,5 a 7,0, e a atividade biológica do hormônio do crescimento purificado mono-modificado por PEG ramificado em um sítio único foi medida utilizando ratos com as glândulas pituitárias removidas. Os resultados demonstram que o hormônio de crescimento acoplado a PEG (em que o PEG é PEG-NHS de fita dupla com um peso molecular de 40kD) possui um efeito de aumento de peso comparável à quantidade igual de hormônio de crescimento injetado diariamente.
[0010] A invenção fornece um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, compreendendo: a) em uma solução com um pH não mais baixo do que 6,0, preferivelmente não mais baixo do que 7,0, preferivelmente não mais baixo do que 8,0, de preferência não mais baixo do que 9,0, preferivelmente não mais baixo do que 9,5, de preferência não mais baixo do que 10,0, mais preferivelmente pH 10,5, levando o PEG de fita dupla ramificada em forma de U ou em forma de Y em contato com hormônio do crescimento, preferivelmente o hormônio do crescimento humano, de preferência a relação molar do hormônio do crescimento para o PEG de fita dupla sendo ao redor de 1:2; b) experimentar o produto modificado por PEG em um único sítio obtido na etapa a) em SDS-PAGE de concentração apropriada, preferivelmente 12% SDS-PAGE, em que o produto apresenta duas faixas ou é principalmente uma faixa de peso molecular aparente inferior; c) separar e recuperar o produto de peso molecular aparente inferior em ditas duas faixas que é modificado pelo PEG em um único sítio; opcionalmente compreender uma etapa de purificação, de preferência utilizando cromatografia de gel, tal como cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP.
[0011] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que dito PEG de fita dupla é PEG ramificado em forma de Y da seguinte fórmula estrutural (I),
em que, Pa e Pb são o mesmo PEG ou diferente; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; X1 e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que X1 é (CH2)n, X2 é selecionado do grupo consistindo em: (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, (CH2)nCO, em que n é um número inteiro de 1 a 10; F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo em: hidroxila, carboxila, grupo éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capaz de reagir com um grupo amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente.
[0012] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG em forma de "Y" é da seguinte fórmula estrutural (II):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo de: hidroxila, carboxila, grupo de éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um grupo amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente.
[0013] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG em forma de Y é da seguinte fórmula estrutural (III):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; o peso molecular total médio do PEG em forma de Y é de cerca de 26 kD a 60 kD, preferível 40 kD; j é um número inteiro de 1 a 12.
[0014] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG de fita dupla é PEG em forma de U da seguinte fórmula estrutural (IV),
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4; n e n' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; n + n' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; o peso molecular médio do PEG em forma de U é de cerca de 26 kD a 66 kD, mais preferivelmente ao redor de 40 kD.
[0015] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparação de um hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, compreendendo: a) em uma solução com pH 9,0 ou 10,5, levando o PEG da seguinte fórmula (III) em contato com o hormônio de crescimento humano, em que a relação molar do hormônio do crescimento para o PEG de fita dupla é de cerca de 1:2;
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m + m' é 910; j é um número inteiro de 1 a 12; o peso molecular total médio do PEG é de cerca de 40 kD; b) experimentar o produto modificado pelo PEG em um sítio único obtido na etapa a) em 12% SDS-PAGE, em que o produto apresenta duas faixas; c) purificar, separar e recuperar o produto de peso molecular aparente mais baixo que é modificado em um sítio único, mediante o uso de cromatografia em gel selecionada de cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP.
[0016] A invenção também fornece um hormônio de crescimento modificado por PEG preparado de acordo com o método acima descrito, em que o hormônio do crescimento é extraído de uma fonte natural ou é um hormônio do crescimento recombinante obtido pela biotecnologia recombinante, preferivelmente o hormônio do crescimento possui a sequência de SEQ ID NO: 1.
[0017] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um hormônio de crescimento modificado por PEG da seguinte fórmula (VII), que é preparado de acordo com o método descrito acima e possui o peso molecular de 62 kD:
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m + m' é 910, e j é um número inteiro de 1 a 12.
[0018] A invenção também fornece um método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG, que compreende: a) em uma solução com um pH não mais baixo do que 8,0, preferivelmente não mais baixo do que 9,0, preferivelmente não mais baixo do que 9,5, preferivelmente não mais baixo do que 10,0, mais preferivelmente pH 10,5, levando o PEG de fita dupla ramificado em forma de U ou em forma de Y em contato com o hormônio de crescimento, preferivelmente hormônio de crescimento humano, preferivelmente a relação molar entre o hormônio de crescimento e o PEG de fita dupla sendo de cerca de 1:2; b) experimentar o produto modificado pelo PEG em um sítio único obtido na etapa a) em SDS-PAGE de concentração apropriada, preferivelmente de 12% SDS-PAGE, em que o produto apresenta duas faixas; c) separar e recuperar o produto modificado pelo PEG em um sítio único; dito produto recuperado é uma mistura que predominantemente compreende o produto de peso molecular aparente mais baixo que é modificado pelo PEG em um sítio único, em que o conteúdo do produto de peso molecular aparente mais baixo que é modificado pelo PEG em um sítio único, detectado por SDS-PAGE, não é mais baixo do que 70%, preferivelmente, não mais baixo do que 80%, mais preferivelmente não mais baixo do que 90%, opcionalmente compreendendo uma etapa de purificação, preferivelmente utilizando cromatografia de gel tal como cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP.
[0019] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG de fita dupla é PEG em forma de Y da seguinte fórmula estrutural (I),
em que, Pa e Pb são o mesmo PEG ou diferente; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; X1 e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que X1 é (CH2)n, X2 é selecionado do grupo consistindo em: (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, (CH2)nCO, em que n é um número inteiro de 1 a 10; F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo em: hidroxila, carboxila, grupo éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um grupo amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente.
[0020] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG em forma de Y é da seguinte fórmula estrutural (II):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo de: hidroxila, carboxila, grupo de éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um grupo amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente.
[0021] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG em forma de Y é da seguinte fórmula estrutural (III):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; j é um número inteiro de 1 a 12; preferivelmente o peso molecular total médio do PEG é de cerca de 26 kD a 60 kD, preferivelmente 40 kD.
[0022] Em uma modalidade preferida, a invenção fornece um método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, em que o PEG de fita dupla é PEG em forma de U da seguinte fórmula estrutural (IV),
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4; n e n' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; n + n' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; o peso molecular médio do PEG em forma de U é de cerca de 26kD a 66kD, mais preferivelmente ao redor de 40 kD.
[0023] Em uma modalidade preferida, a invenção também fornece um método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG de fita dupla, compreendendo: a) em uma solução com pH 9,0 ou 10,5, levando o PEG da seguinte fórmula (III) em contato com o hormônio de crescimento humano, em que a relação molar do hormônio de crescimento para o PEG de fita dupla é de cerca de 1:2;
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4; m + m' é 910, j é um número inteiro de 1 a 12; o peso molecular total médio do PEG é de cerca de 40 kD; b) experimentar o produto modificado pelo PEG em um sítio único obtido na etapa a) em 12% SDS-PAGE; c) separar e recuperar o produto modificado pelo PEG em um sítio único mediante o uso de cromatografia em gel selecionada de cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP, e o teor de SDS-PAGE do produto de peso molecular aparente mais baixo, que é modificado pelo PEG em um sítio único, no produto recuperado não é mais baixo do que 70%, preferivelmente não mais baixo do que 80%, mais preferivelmente não mais baixo do que 90%.
[0024] A invenção também fornece uma preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG preparada de acordo com o método acima descrito, em que o hormônio do crescimento é extraído de uma fonte natural ou é um hormônio do crescimento recombinante obtido pela biotecnologia recombinante, preferivelmente o hormônio do crescimento possui a sequência de SEQ ID NO: 1. Preferivelmente, o produto modificado pelo PEG em um sítio único na preparação do hormônio do crescimento modificado por PEG é da seguinte fórmula (VII):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m + m' é 910, j é um número inteiro de 1 a 12, em que o teor de SDS-PAGE do produto de peso molecular aparente mais baixo que é modificado pelo PEG em um sítio único na preparação do hormônio de crescimento modificado por PEG não é mais baixo do que 70%, preferivelmente não mais baixo do que 80%, mais preferivelmente não mais baixo do que 90%.
[0025] Em uma modalidade preferida da invenção, o hormônio de crescimento humano recombinante é artificialmente sintetizado ou expresso de um sistema de expressão selecionado do grupo constituído de: um sistema procariótico tal como E. Coli, um sistema de eucariótico tal como levedura Pichia; um sistema de célula de inseto, e um sistema de célula de mamífero tal como célula de CHO.
[0026] A invenção também fornece uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do hormônio de crescimento modificado por PEG acima descrito ou a preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, preferivelmente compreendendo manitol, um aminoácido, cloreto de sódio, ácido acético ou acetato de sódio, preferivelmente o aminoácido é selecionado do grupo consistindo de aspartato, asparagina, lisina e glicina.
[0027] A invenção também fornece o uso do hormônio de crescimento modificado por PEG acima descrito ou a preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG ou a composição na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença com necessidade do tratamento com hormônio de crescimento ou para o tratamento antienvelhecimento, preferivelmente a doença com necessidade de tratamento com hormonal de crescimento é selecionada do grupo consistindo de nanismo, queimadura, ferida, fratura óssea, hemorragia da úlcera, insuficiência renal, AIDS, nanismo por deficiência do hormônio de crescimento endógeno, síndrome de Turner, distúrbio anabólico e deficiência de hormônio do crescimento em adultos.
[0028] A invenção também fornece um método de tratar um paciente com uma doença com necessidade de tratamento com hormônio de crescimento ou para o tratamento antienvelhecimento, o método compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do hormônio de crescimento modificado por PEG acima descrito ou a preparação de hormônio do crescimento modificado por PEG ou a composição a dito paciente, preferivelmente a doença com necessidade de tratamento com hormônio do crescimento é selecionada do grupo consistindo em nanismo, queimadura, ferida, fratura óssea, hemorragia da úlcera, insuficiência renal, AIDS, nanismo por deficiência do hormônio de crescimento endógeno, síndrome de Turner, distúrbio anabólico e deficiência de hormônio do crescimento em adultos.
[0029] A invenção fornece hormônio do crescimento modificado por polietileno glicol de fita dupla (PEG) com alta atividade biológica, e o seu método de preparação. O aspecto notável desta invenção consiste em que, após a otimização da condição de reação e do método de separação, o teor do componente de atividade celular baixa no hormônio do crescimento modificado por PEG em um sítio único é significativamente reduzido. Em um exemplo do PEG de fita dupla com um peso molecular de 40 kD, o produto de atividade celular baixa modificado em um site único é caracterizado pelo fato de que este produto e o produto de atividade celular elevado modificado em um sítio único são completamente separados em duas faixas em 12% SDS- PAGE, e o peso molecular aparente do produto da atividade celular baixa modificado em um sítio único é mais elevado do que aquele do produto de atividade celular elevada modificado em um sítio único. Utilizando rato com as suas glândulas pituitárias removidas como um modelo animal e o hormônio de crescimento humano recombinante como um controle positivo, a atividade biológica in vivo do produto de atividade celular elevada modificado em um sítio único é analisada de acordo com o bioensaio de hormônio de crescimento conforme descrito em Pharmacopoeia of the People's Republic of China, version 2005, Volume 2, Appendix XII P. O produto de atividade celular elevada modificado em sítio único possui uma atividade específica biológica significativamente mais elevada do que o hormônio de crescimento normal, apresentando mais do que 1,5 vez de atividade biológica do hormônio de crescimento normal, e é mostrado na pesquisa farmacocinética em macacos comedores de caranguejo (Macaca fascicularis) que possui uma meia-vida metabólica média de medicamento em soro de mais de 20 vezes mais longa do que aquela do hormônio de crescimento normal, e assim possui efeitos a longo prazo.
[0030] Em uma modalidade da invenção, a reação de modificação de PEG-NHS de fita dupla para o hormônio do crescimento é executada em pH 8,0, a eletroforese de SDS-PAGE é utilizada para avaliar os produtos da reação, e o manchamento de prata é usado para visualização. É com surpresa que, o produto de hormônio do crescimento modificado por PEG em um sítio único mostra duas faixas principais, que são diferentes das anteriores (Ross Clark, Kenneth Olson, et al. Long-acting growth hormones produced by conjugation with polyethylene glycol. J. Biol. Chem., 271:21969-21977, 1996. Li, Weihua, Dong Jian et al., Long-term effective growth hormone and the pharmacological composition, China Patent Pub. N°: CN1477126A). Em outras experiências, as modificações do hormônio de crescimento através de PEG-NHS de fita dupla executadas em uma faixa de pH 6,0 a 10,5 têm sido estudadas, e é observado por SDS-PAGE que todos os produtos modificados em um sítio único apresentam duas faixas principais. Quando o pH aumenta, o teor da faixa de peso molecular aparente mais baixo também aumenta. Em pH > 10,0, o produto modificado em um sítio único mostra substancialmente uma faixa de peso molecular aparente mais baixo.
[0031] Em uma modalidade preferida da invenção, algumas técnicas de purificação por cromatografia em gel apropriadas são usadas para preparar o hormônio de crescimento humano recombinante modificado por PEG em um sítio único em pH 10,5 e pH 6,0, respectivamente. O SDS-PAGE com 12% gel de separação é utilizado para a detecção e o manchamento de prata é usado para visualização. O hormônio de crescimento humano recombinante purificado modificado por PEG em um sítio único em pH 6,0 mostra claramente duas faixas. O hormônio de crescimento humano recombinante purificado modificado por PEG em um sítio único em pH 10,5 mostra principalmente a faixa de peso molecular aparente mais baixo, o teor de SDS-PAGE do qual não é mais baixo do que 80%. Apenas pequena quantidade da proteína de substrato é detectada em ambos os casos (não mais do que 0,5%). MALDI-TOF MS confirma que os produtos modificados nas duas condições de pH são substancialmente os produtos de hormônio do crescimento modificado por PEG em um sítio único. O ensaio de atividade celular indica que o produto modificado em um sítio único em pH 10,5 possui uma atividade celular significativamente mais elevada do que o produto modificado em um sítio único em pH 6,0, a atividade específica celular do primeiro é cerca de duas vezes daquela do último.
[0032] Em uma modalidade preferida da invenção, o produto de modificação purificado do hormônio do crescimento humano recombinante, que é modificado por PEG em um sítio único em pH 6,0 e possui um peso molecular aparente mais elevado, é preparado pela purificação de cromatografia Q Sepharose FF ou purificação de cromatografia MacroCap SP etc. A detecção de MALDI-TOF MS confirma que o hormônio do crescimento humano recombinante modificado por PEG é um produto modificado por PEG em um sítio único, e o ensaio de atividade celular mostrou que sua atividade específica celular é significativamente mais baixa do que aquele do hormônio de crescimento humano recombinante purificado modificado em um sítio único (com um peso molecular aparente mais baixo) em pH 10,5. A atividade específica celular do último é até três vezes do primeiro.
[0033] Em uma outra modalidade da invenção, de acordo com o bioensaio para o hormônio de crescimento, conforme descrito em Pharmacopoeia of the People's Republic of China, versão 2005, Volume 3, Appendix XII P, usando o hormônio de crescimento humano recombinante como o controle positivo, o método empregando um rato com a glândula pituitária removida é utilizado para avaliar a atividade biológica in vivo dos produtos de modificação do hormônio de crescimento humano recombinante modificado pelo PEG-NHS de 40 kD em um sítio único em pH 10,5. O hormônio de crescimento humano recombinante é administrado uma vez por dia, 6 vezes no total. O produto do hormônio de crescimento humano recombinante modificado por PEG em um sítio único é administrado uma vez em uma dose igual à soma de 6 vezes a administração do hormônio de crescimento humano recombinante. O hormônio de crescimento humano recombinante modificado por PEG em um sítio único possui uma atividade biológica significativamente mais elevada do que o hormônio de crescimento humano recombinante, e pode alcançar até uma atividade específica biológica de mais do que 1,5 vez da última. Sua farmacologia tem um efeito a longo prazo. A pesquisa farmacocinética em macacos comedores de caranguejo tem mostrado que a meia-vida metabólica do medicamento do hormônio de crescimento humano recombinante modificado por PEG em um sítio único é alongada mais 20 vezes do que a do hormônio de crescimento recombinante normal.
[0034] A invenção emprega derivados de PEG ramificados (ramificados em forma de U e ramificados em forma de Y) para modificar o hormônio de crescimento. O derivado de PEG ramificado em forma de Y empregado na invenção é um novo derivado de PEG ramificado, cuja estrutura é diferente do PEG linear ou PEG ramificado em forma de U, e sua principal diferença do PEG ramificado em forma de U consiste em que as duas cadeias de PEG ramificado do derivado de PEG em forma de Y da presente invenção são ligadas entre si através do átomo de N, enquanto que as duas cadeias de PEG ramificado do derivado de PEG em forma de U são ligadas entre si através do átomo de C. A modificação com PEG em forma de U ou em forma de Y ocorre principalmente no α-amino livre de N-terminal de uma proteína ou peptídeo ou em ε-amino da cadeia lateral de um resíduo de Lys. O derivado de PEG em forma de Y é da seguinte fórmula molecular (I):
em que, Pa e Pb são o mesmo PEG ou diferente; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; X1 e X2 são independentemente um grupo de ligação, respectivamente, em que X1 é (CH2)n, X2 é selecionado do grupo consistindo em: (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, (CH2)nCO, em que n é um número inteiro de 1 a 10; F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo em: hidroxila, carboxila, grupo de éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um grupo de amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente.
[0035] Em uma modalidade preferida da invenção, os Pa e Pb do derivado de PEG em forma de Y podem ser o mesmo PEG ou diferente, como mostrado na fórmula (II):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; j é um número inteiro de 1 a 12. F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo de: hidroxila, carboxila, grupo de éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um grupo de amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente. Preferivelmente, o peso molecular total médio do PEG é de cerca de 26 kD a 60 kD, mais preferivelmente 40k D.
[0036] Em uma modalidade, a invenção fornece um hormônio de crescimento modificado por PEG da seguinte fórmula estrutural (VI):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500; Ri é H, alquila C1-12 substituída ou não substituída, arila, aralquila ou heteroalquila substituída; F é um grupo terminal selecionado do grupo consistindo em: hidroxila, carboxila, grupo éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um grupo amino, hidroxila ou hidrossulfeto de um agente terapêutico ou substrato para formar uma ligação covalente. Em uma modalidade preferida da invenção, a estrutura da molécula de derivado de PEG em forma de Y (YPEG-NHS) é mostrada na seguinte fórmula (III): 
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910.
[0037] Em uma modalidade preferida da invenção, a estrutura da molécula de derivado de PEG em forma de U (UPEG-NHS) é mostrada na seguinte fórmula (IV):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4; n e n' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; n + n' é preferivelmente de 600 a 1500, mais preferivelmente 910; o peso molecular médio do PEG é de cerca de 26 kD a 66 kD, mais preferivelmente ao redor de 40 kD.
[0038] Em uma modalidade da invenção, para obter GH modificado por YPEG ou UPEG, o componente de PEG de um derivado de YPEG e UPEG ativado tal como éster PEG succinimidílico (YPEG-NHS) é covalentemente ligado a um amino (-NH2) de uma proteína através da substituição nucleofílica, o -NH2 inclui o α-NH2 N-terminal da proteína e ε-NH2 de um resíduo de Lys. A equação de reação da produção de YPEG-GH a partir de GH e YPEG-NHS é conforme abaixo:
[0039] A equação de reação da produção de UPEG-GH de GH e UPEG-NHS é conforme abaixo:
[0040] Preferivelmente, o peso molecular total médio do PEG é de cerca de 26 kD a 66 kD, mais preferivelmente ao redor de 40 kD.
[0041] Em uma outra modalidade preferida da invenção, o GH modificado por PEG da invenção é da seguinte fórmula estrutural (VII):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferivelmente de 600 a 1500. Na estrutura, o PEG ramificado em forma de Y é ligado à molécula de GH em um sítio único. m e m' podem ser o mesmo número inteiro ou diferente. O peso molecular do YPEG-GH na fórmula acima depende do grau de polimerização m e m'. Onde m + m' for preferivelmente de 600 a 1500, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de cerca de 26 kD a cerca de 66 kD. Onde m + m' for preferivelmente de 795 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de cerca de 35 kD a cerca de 45 kD. Onde m + m' for particularmente preferível de 885 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de cerca de 39 kD a 45 kD. Onde m + m' for mais preferivelmente 910, o peso molecular médio correspondente do YPEG é ao redor de 40 kD. A relação de m para m' pode estar em uma faixa de 0,5 a 1,5, preferivelmente de 0,8 a 1,2.
[0042] Opcionalmente, o GH da invenção pode ser extraído de uma fonte natural ou obtido pela biotecnologia recombinante. Preferivelmente, o GH é GH humano tendo a sequência de SEQ ID NO: 1, que é extraído de uma fonte natural ou obtido pela biotecnologia recombinante. Mais preferivelmente, o GH humano é GH humano recombinante. O GH pode ser artificialmente sintetizado, ou ser expressa de um sistema procariótico como E. coli, ou ser expresso de um sistema de levedura como Pichia pastoris, ou ser expresso de um sistema de células de inseto ou sistema de células de mamífero como CHO. O método de preparação do GH natural ou recombinante e os testes de atividade do GH e produtos modificados por PEG são bem- conhecidos na técnica.
[0043] Semelhante ao GH, o YPEG-GH e UPEG-GH da invenção podem ser usados clinicamente para tratar nanismo, queimadura, ferida, fratura óssea, hemorragia da úlcera, insuficiência renal, AIDS, distúrbio anabólico, deficiência de hormônio de crescimento em adultos e para o tratamento anti-envelhecimento. O YPEG-GH e UPEG-GH da invenção podem ser administrados a um paciente em uma forma de uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do YPEG-GH ou UPEG-GH, e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Portanto, em outro aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz do GH modificado por PEG da invenção e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. O portador farmaceuticamente aceitável utilizado na invenção compreende um portador, excipiente ou estabilizante farmaceuticamente aceitável que não é tóxico para a célula ou mamífero a ser colocado em contato com ele na dose ou concentração utilizada. Normalmente uma portador fisiologicamente aceitável é um tampão de pH aquoso. Exemplos de um portador fisiologicamente aceitável compreende um tampão tal como fosfato, citrato, e outro tampão de ácido orgânico, um antioxidante tais como ácido ascórbico, um polipeptídeo de peso molecular baixo (não mais do que 10 resíduos), uma proteína tal como seralbumina, gelatina, ou imunoglobulina, um polímero hidrófilo tal como polivinil pirrolidona, um aminoácido tal como glicina, aspartato, glutamina, asparagina, arginina ou lisina, um monossacarídeo tal como glicose e manose, outros sacarídeos como dissacarídeo e dextrina etc., um quelante como EDTA, um álcool de açúcar tal como manitol e sorbitol, um contraíon formador de sal tal como sódio, e/ou um tensoativo não iônico tal como TWEEN, PEG e PLURONICS. O excipiente é preferivelmente estéril e normalmente é livre de uma substância nociva. A composição pode ser esterilizada através de técnicas de esterilização rotineiras. Em uma modalidade da invenção, a composição ainda compreende manitol, um aminoácido, cloreto de sódio, ácido acético e acetato de sódio, em que o aminoácido é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em lisina, aspartato, asparagina e glicina.
[0044] Em outro aspecto, a invenção também fornece o uso do GH modificado por PEG da invenção ou da composição compreendendo o GH modificado por PEG da invenção na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença com necessidade de tratamento com GH e para o tratamento antienvelhecimento. Preferivelmente, a doença com necessidade de tratamento com GH é selecionada do grupo consistindo em nanismo, queimadura, ferida, fratura óssea, hemorragia da úlcera, insuficiência renal, AIDS, nanismo por deficiência de hormônio do crescimento endógeno, síndrome de Turner, distúrbio anabólico e deficiência do hormônio de crescimento em adultos.
[0045] Figura 1: os resultados de SDS-PAGE não redutivo das amostras de rHuGH modificadas por YPEG-NHS 40 kD ou UPEG-NHS 40 kD em pH 8,0. A concentração do gel de separação é de 12%, e o manchamento de prata é usado para visualização. Raia 1: marcador, LMW, GE Healthcare; Raia 2: amostra de rHuGH modificada por YPEG- NHS em pH 8,0, quantidade de carga 2 μg; Raia 3: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 8,0, quantidade de carga 5 μg; Raia 4: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 8,0, quantidade de carga 5μg.
[0046] Figura 2: os resultados de SDS-PAGE não redutivo das amostras de rHuGH modificadas por YPEG-NHS 40 kD em pHs diferentes. A concentração do gel de separação é de 12%, e o manchamento de prata é usado para visualização. Raia 1: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 6,0; Rais 2: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 7,0; Raia 3: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 8,0; Raia 4: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 9,0; Raia 5: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 9,5; Raia 6: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 10,0; Raia 7: amostra de rHuGH modificada por YPEG-NHS em pH 10,5; Raia 8: marcador, LMW, GE Healthcare. A quantidade de carga de todas as amostras é 5 μg.
[0047] Figura 3: os resultados SDS-PAGE não redutivo das amostras de rHuGH modificadas por UPEG-NHS em pHs diferentes. A concentração do gel de separação é de 12%, e o manchamento de prata é usado para visualização. Raia 1: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 6,0; Raia 2: Amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 7,0; Raia 3: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 8,0; Raia 4: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 9,0; Raia 5: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 9,5; Raia 6: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 10,0; Raia 7: amostra de rHuGH modificada por UPEG-NHS em pH 10,5; Raia 8: marcador, LMW, GE Healthcare. A quantidade de carga de todas as amostras é 5 μg.
[0048] Figura 4: os resultados SDS-PAGE não redutivo dos produtos de modificação de rHuGH purificado modificados por YPEG- NHS 40 kD ou UPEG-NHS 40 kD em um sítio único em pH 6,0 ou pH 10,5. A concentração do gel de separação é de 12%, e o manchamento de prata é usado para visualização. Raia 1: UPEG-rHuGH U10.5, quantidade de carga 10 μg; Raia 2: UPEG-rHuGH U10.5, quantidade de carga 2 μg; Raia 3: UPEG-rHuGH U6.0, quantidade de carga 10 μg; Raia 4: UPEG-rHuGH U6.0, quantidade de carga 2 μg; Raia 5: marcador, LMW, GE Healthcare; Raia 6: YPEG-rHuGH Y10.5, quantidade de carga 10 μg; Raia 7: YPEG-rHuGH Y10.5, quantidade de carga 2 μg; Raia 8: YPEG-rHuGH Y6.0, quantidade de carga 10 μg; Raia 9: YPEG-rHuGH Y6.0, quantidade de carga 2 μg; Raia 10: rHuGH, quantidade de carga 100 ng; Raia 11: rHuGH, quantidade de carga 50 ng.
[0049] Figura 5: os resultados do ensaio da atividade celular dos produtos de modificação de rHuGH purificado modificados por UPEG- NHS 40 kD em um sítio único em pH 6,0 ou pH 10,5, placas duplicadas.
[0050] Figura 6: os resultados do ensaio da atividade celular dos produtos de modificação de rHuGH purificado modificados por YPEG- NHS 40 kD em um sítio único em pH 6,0 ou pH 10,5, placas duplicadas.
[0051] Figura 7: os pesos moleculares dos produtos de modificação de rHuGH purificado modificados por YPEG-NHS 40 kD e UPEG-NHS 40 kD em um sítio único em pH 6,0, pH 9,0 ou pH 10,5, detectado por MALDI-TOF MS. a: YPEG-rHuGH, Y6; b: YPEG-rHuGH, Y9 c: YPEG- rHuGH, Y10.5; d: YPEG-rHuGH, Y6-1; e: UPEG-rHuGH, U6, f: UPEG- rHuGH, U9; g: UPEG-rHuGH, U10.5; h: UPEG-rHuGH, U6-1; i: YPEG- NHS, 40 kD, j: UPEG-NHS, 40 kD, k: Protein Calibrate Standard II, BRUKER; l: rHuGH; m: Protein Calibrate Standard I, BRUKER.
[0052] Figura 8: os resultados de SDS-PAGE não redutivo do produto de modificação de rHuGH purificado de peso molecular aparente mais elevado modificado por PEG-NHS 40 kD em um sítio único em pH 6,0, e do produto de modificação de rHuGH purificado modificado por PEG-NHS 40 kD em um sítio único em pH 10,5. A concentração do gel de separação é de 12%, e o manchamento de prata é usado para visualização. Raia 1: YPEG-rHuGH Y10.5, quantidade de carga 2 μg; Raia 2: YPEG-rHuGH Y6.0-1, quantidade de carga 2 μg; Raia 3: UPEG-rHuGH U10.5, quantidade de carga 2 μg; Raia 4: UPEG- rHuGH U6.0-1, quantidade de carga 2 μg; Raia 5: rHuGH, quantidade de carga 50 ng; Raia 6: rHuGH, quantidade de carga 100 ng; Raia 7: marcador, LMW, GE Healthcare; Raia 8: YPEG-rHuGH Y10.5, quantidade de carga 10 μg; Raia 9: YPEG-rHuGH Y6.0-1, quantidade de carga 10 μg; Raia 10: UPEG-rHuGH U10.5, quantidade de carga 10 μg; Raia 11: UPEG-rHuGH U6.0-1, quantidade de carga 10 μg.
[0053] Figura 9: os pesos moleculares aparentes detectados por SDS-PAGE não redutivo dos produtos de modificação de rHuGH purificado (Y6-1, U6-1) de peso molecular aparente mais elevado modificados por PEG-NHS 40 kD em um sítio único em pH 6,0 e dos produtos de modificação de rHuGH purificado (Y10.5, U10.5) modificados por PEG-NHS 40kD em um sítio único em pH 10,5. Raia 1: YPEG-rHuGH Y6-1 + YPEG-rHuGH Y10.5, cada um 25 ng; Raia 2: YPEG-rHuGH Y6-1, 50 ng; Raia 3: YPEG-rHuGH Y10.5, 50 ng; Raia 4, 6: em branco; Raia 5: marcador, HMW, GE Healthcare; Raia 7: UPEG- rHuGH U6-1 + UPEG-rHuGH U10.5, cada um 25 ng; Raia 8: UPEG- rHuGH U6-1, 50 ng; Raia 9: UPEG-rHuGH U10.5, 50 ng.
[0054] Figura 10: a curva de concentração média de medicamento no soro vs. tempo de injeção subcutânea única em macaco comedor de caranguejo de 300 μg.kg-1 de rHuGH e YPEG-rHuGH (Y10.5), respectivamente. Formas de realização Concretas para Realizar a Invenção
[0055] A presente invenção será ainda descrita através dos seguintes exemplos, mas nenhum exemplo ou suas combinações não devem ser considerados como limitativos do escopo e formas de realização desta invenção. O escopo desta invenção é apenas limitado pelas reivindicações anexas. A combinação desta descrição mais a técnica anterior no ofício, uma pessoa versada na técnica pode compreender claramente o escopo limitado pelas reivindicações. Exemplo 1
[0056] A modificação do GH humano recombinante por PEG ramificado em forma de U ou em forma de Y
[0057] 200 mg de cada um dos UPEG-NHS e YPEG-NHS (M.W. médio 40 kD, subdivisão igual; lotes n° ZZ004P182 e ZZ004P167, respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram pesados e dissolvidos em 2 ml de HCl 2 mM (Guangdong Guanghua Chemical Fctory Co., Ltd.), respectivamente. 50 mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e 50 mM tampão de ácido bórico-bórax, pH 8,0 (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) foram adicionados, respectivamente, para um volume de reação total final de 10 ml. No sistema de reação, a concentração de reação final de rHuGH foi 5 mg/ml, e a relação molar de reação de rHuGH para PEG-NHS foi de cerca de 1:2. A incubação foi feita em < 10 oC durante 2 h com agitação, e ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) foi adicionado para tornar o pH < 4,0 para interromper a reação. A amostra foi colhida para SDS-PAGE e manchamento de prata foi utilizado para visualização. Os resultados de SDS-PAGE são mostrados na figura 1. A partir dos resultados de SDS-PAGE na figura 1, os produtos de modificação em pH 8.0 apresentam duas faixas principais, e as amostras modificadas por UPEG-NHS e YPEG-NHS apresentam as mesmas características de eletroforese de SDS-PAGE. Exemplo 2
[0058] As modificações do GH humano recombinante por PEG ramificado em forma de U e em forma de Y em diferentes pHs
[0059] 200 mg de cada um dos UPEG-NHS e YPEG-NHS (MW médio 40 kD, subdivisão igual; lotes N° ZZ004P182 e ZZ004P167, respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram pesados e dissolvidos em 2 ml de HCl a 2 mM (Guangdong Guanghua Chemical Fctory Co., Ltd.), respectivamente. 50 mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e o tampão correspondente foram adicionados, respectivamente, para um volume de reação total final de 10 ml. 10 mM tampão de PBNa (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) do pH correspondente para a reação em pH 6,0, 7,0 ou 8,0 foi usado, e 50 mM tampão de bórax (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) do pH correspondente para a reação em pH 9,0, 9,5, 10,0 ou 10,5 foi utilizado. No sistema de reação, a concentração de reação final foi 5 mg/ml de rHuGH, e a relação molar de reação de rHuGH para PEG- NHS foi de cerca de 1:2. A incubação foi feita em < 10 oC durante 2 horas com agitação, e ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) foi adicionado para tornar o pH < 4,0 para interromper a reação. A amostra foi colhida para SDS-PAGE, e manchamento de prata foi utilizado para visualização. O sistema de visualização em gel (Model N°: FR-200, Shanghai FURI Science & Technology Co., Ltd.) foi utilizado para analisar os resultados de eletroforese. Os resultados de eletroforese de SDS-PAGE são mostrados na figura 2 e figura 3, e os resultados de análise pelo sistema de visualização em gel são apresentados na tabela 1. A partir dos resultados de eletroforese, os produtos modificados em pH 6,0 a 9,5 mostram claramente duas faixas principais, e quando o pH da reação aumenta, o teor da faixa de peso molecular aparente mais baixo também aumenta proporcionalmente. Os produtos modificados em pH 10,0 e 10,5 são substancialmente a faixa de peso molecular aparente mais baixo. As amostras de UPEG-NHS e YPEG-NHS modificados apresentam as mesmas características de eletroforese de SDS-PAGE. Tabela 1: A análise do sistema de visualização em gel sobre os resultados de SDS-PAGE dos GHs humanos recombinantes modificado por PEG ramificado em forma de U e em forma de Y em diferentes pHs.
Observação: "teor" refere-se ao teor de porcentagem relativa da faixa 1 (M.W. aparente mais elevado) até a faixa 2 (M.W. aparente mais baixo) dos produtos de rHuGH modificados por PEG em um sítio único. Exemplo 3
[0060] A preparação, atividade celular e M.W. do GH humano recombinante modificado por PEG ramificado em forma de U ou em forma de Y em um sítio único em pH 6,0, pH 9,0 ou 10,5 1. Modificação
[0061] Três amostras de 1200 mg de cada um dos UPEG-NHS e YPEG-NHS (M.W. médio 40 kD, subdivisão igual; lotes ZZ004P182 e ZZ004P167, respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram pesados e dissolvidos em 12 ml de HCl 2 mm (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.), respectivamente. 300 mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e 50 mM tampão de bórax (pH 10,5) ou 50 mM ácido bórico/tampão de bórax (pH 9,0) ou 10 mm PBNa (pH 6,0) (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) foram adicionados, respectivamente para um volume de reação total final de 60 ml. No sistema de reação, a concentração de reação final de rHuGH foi 5 mg/ml, a relação molar de reação entre o rHuGH e o PEG-NHS foi de cerca de 1:2, e os pHs de reação foram 10,5, 9,0 e 6,0, respectivamente. A incubação foi feita em < 10 °C durante 2 horas com agitação, e ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) foi adicionado para tornar o pH < 4,0 para interromper a reação. A amostra foi colhida para SDS-PAGE, e o manchamento de prata foi utilizado para visualização. 2 Purificação 2.1 Purificação através de cromatografia Q Sepharose FF
[0062] A amostra de modificação por PEG de rHuGH foi diluída 3 vezes usando água ultrapura, e o pH da amostra diluída foi ajustado para 9,0 com NaOH ou HCl. 2.1.1 A purificação através de cromatografia Q Sepharose FF das amostras de modificação por PEG (pH 6,0) de rHuGH
[0063] A coluna de cromatografia (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) foi Φ 18 mm x 400 mm, a especificação de acondicionamento do material de acondicionamento Q Sepharose FF (GE Healthcare) foi Φ 18 mm x 240 mm, e o volume do leito da coluna (CV) foi de 61 ml. A coluna de cromatografia Q Sepharose FF foi submetida a limpeza no local com 0,5 M NaOH em 5 ml/min durante 30 min, eluída com 3 CV de ddH2O em 5ml/min, regenerada com 3 CV de NaCl a 1M em 5 ml/min, e eluída com 5CV 20 mM ácido de bórico/bórax- 17 mM NaCl (pH 9,0, solução A) em 5ml/min. As amostras diluídas em água ultrapura do rHuGH modificado por PEG foram carregadas em uma taxa de fluxo de 3 ml/min, e o eluente foi detectado em 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). A eluição foi feita usando solução A em 5 ml/min até que o primeiro pico fosse completamente detectado; e 20 mM ácido bórico/bórax-100 mM NaCl (pH 9,0, solução B) foi depois utilizado para eluir em 5 ml/min até que o segundo pico fosse completamente detectado. 20 mM ácido bórico/bórax-200 mM NaCl (pH 9,0, solução C) foi depois utilizado para eluir em 5 ml/min até que o terceiro pico fosse completamente detectado. A amostra do segundo pico foi coletada como a amostra alvo. O sistema tampão da amostra alvo foi alterado para 20 mM ácido bórico/bórax (pH 9,0) através da ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona). 2.1.2 A purificação através de cromatografia Q Sepharose FF das amostras de modificação por PEG (pH 9,0 ou 10,5) de rHuGH
[0064] A coluna de cromatografia (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) foi Φ 18 mm x 400 mm, a especificação de acondicionamento do material de acondicionamento Q Sepharose FF (GE Healthcare) foi Φ 18 mm x 240 mm, e o volume do leito da coluna (CV) foi de 61 ml. A coluna de cromatografia Q Sepharose FF foi submetida a limpeza no local com 0,5 M NaOH em 5 ml/min durante 30 min, eluída com 3 CV de ddH2O em 5ml/min, regenerada com 3CV de 1M NaCl em 5 ml/min, e eluída com 5 CV 20 mM ácido de bórico/bórax- 17 mM NaCl (pH 9,0, solução A) em 5 ml/min. As amostras diluídas em água ultrapura do rHuGH modificado por PEG foram carregadas em uma taxa de fluxo de 3 ml/min, e o eluente foi detectado em 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). A eluição foi feita usando solução A em 5 ml/min até que o primeiro pico fosse completamente detectado; e 20 mM ácido bórico/bórax-40 mM NaCl (pH 9,0, solução B) foi depois utilizado para eluir em 5 ml/min até que o segundo pico fosse completamente detectado. 20 mM ácido bórico/bórax-100 mM NaCl (pH 9,0, solução C) foi depois utilizado para eluir em 5 ml/min até que o terceiro pico fosse completamente detectado, e 20 mM ácido bórico/bórax-200mM NaCl (pH 9,0, solução D) foi utilizado para eluir em 5 ml/min até que o quarto pico fosse completamente detectado. A amostra do terceiro pico foi coletada como a amostra alvo. O sistema tampão da amostra alvo foi alterado para 20 mM ácido bórico/bórax (pH 9,0) através da ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona). 2.2 . Purificação através de cromatografia DEAE Sepharose FF
[0065] A coluna de cromatografia (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) foi Φ 18 mm x 400 mm, a especificação de acondicionamento do material de acondicionamento DEAE Sepharose FF (GE Healthcare) foi Φ 18 mm x 235 mm, 1 CV = 60 ml.
[0066] A coluna de cromatografia DEAE Sepharose FF foi submetida a limpeza no local com 0,5 M NaOH em 5 ml/min durante 30 min, eluída com 3 CV de ddH2O em 5ml/min, regenerada com 3CV de NaCl a 1M em 5 ml/min, e eluída com 3 CV de 20 mM ácido de bórico/bórax (pH 9,0, solução A) em 5 ml/min. A amostra de PEG- rHuGH purificado por Q Sepharose FF foi carregada em uma taxa de fluxo de 3 ml/min, eluída com 3 CV com solução A em 5 ml/min, e eluída com 6 CV de 20 mm ácido bórico/bórax-30 mM NaCl (pH 9,0, solução B) 5 ml/min. 20 mM ácido bórico/bórax-100 mM NaCl (pH 9,0, solução C) foi utilizado para eluir em 5 ml/min até que o primeiro e o segundo picos fossem completamente detectados. O eluente foi detectado em 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). A amostra do segundo pico foi coletada como a amostra-alvo. O sistema tampão da amostra alvo foi alterado para 5 mM PBNa (pH 8,5) e devidamente concentrado através da ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona). 2.3 Purificação refinada utilizando cromatografia Q Sepharose FF
[0067] A coluna de cromatografia (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) foi Φ 25 mm x 400 mm, a especificação de acondicionamento do material de acondicionamento Q Sepharose FF (GE Healthcare) foi Φ 25 mm x 200 mm, 1 CV = 98 ml.
[0068] A coluna de cromatografia Q Sepharose FF foi submetida a limpeza no local com NaOH a 0,5 M em 10 ml/min durante 30 min, eluída com 3 CV de ddH2O em 10 ml/min, regenerada com 3 CV de NaCl a 1M em 10 ml/min, e eluída com 3 CV de 5 mM PBNa (pH 9,0, solução A) em 10 ml/min. A amostra de PEG-rHuGH purificado por DEAE Sepharose FF foi carregada em uma taxa de fluxo de 6 ml/min, e eluída com 3 CV de solução A em 10 ml/min. 5 mM PBNa-90 mM NaCl (pH 8,5, solução B) foi utilizado para eluir em 10 ml/min até que o primeiro pico fosse completamente detectado, e 5 mM PBNa-300 mM NaCl (pH 8,5, solução C) foi utilizado para eluir em 10 ml/min até que o segundo pico fosse completamente detectado. O eluente foi detectado em 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). A amostra do primeiro pico foi coletada como a amostra-alvo. O sistema tampão da amostra- alvo foi alterado para 3 mM NaAc/HAc-7 mM NaCl-5 mM Lys (pH 5,0) através da ultrafiltração usando ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona), e manitol foi completado para a concentração final de 45 mg/ml. A amostra foi esterilizada através de filtração 0,2 μm. A amostra foi colhida para eletroforese SDS-PAGE, e o manchamento de prata foi utilizado para visualização. A amostra remanescente foi armazenado em -70 oC. O produto de modificação modificado em pH 6,0 foi designado como Y6 ou U6, em que a faixa de M.W. aparente mais elevado foi designada como Y6-1 ou U6-1, enquanto que a faixa de M.W. aparente mais baixo foi designada como Y6-2 ou U6-2. O produto de modificação em pH 9.0 foi designado como Y9 ou U9, e o produto de modificação em pH 10,5 foi designado como Y10,5 ou U10,5.
[0069] Os resultados de SDS-PAGE são mostrados na fig. 4. A partir dos resultados de eletroforese, os produtos de modificação em pH 6,0 mostram claramente duas faixas, mas os produtos de modificação em pH 10,5 foram principalmente a faixa de M.W. aparente mais baixo com um teor de SDS-PAGE de não mais baixo do que 80%. 3 Atividade Celular
[0070] Usando o padrão nacional de GH como o controle, a linhagem celular de rato dependente de HuGH Nb2-11 foi empregada para analisar a atividade celular de cada amostra de PEG-rHuGH.
[0071] As células Nb2-11 foram diluídas para a concentração final de 5 x 104 células/ml. O padrão nacional de GH (lot. N°: 35-20002, 1mg/ml/tubo, 3IU/tubo; adquirido do National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products) foi pré-diluído para 100 ng/ml (0,0003 IU/ml), e cada amostra de PEG-rHuGH a ser analisada foi pré- diluída para 0,0003 IU/ml de acordo com os resultados das pré- experiências. Com base na pré-diluição, cada amostra foi analisada após a diluição gradiente de uma vez e meia. A atividade da amostra foi calculada de acordo com a seguinte equação: Atividades das ostras para exame = Atividades dos Padrões x C1 x D1 C2 D2 em que: C1 é a diluição em dobro da amostra a ser analisada equivalente à quantidade de meio efeito do padrão C2 é a diluição em dobro do padrão de meio efeito D1 é a pré-diluição em dobro da amostra a ser analisada D2 é a pré-diluição em dobro do padrão Método de Ensaio: (1) As células na fase de crescimento logarítmica foram tomadas, repetidamente pipetadas, centrifugadas e lavadas. As células foram colocadas novamente em suspensão no diluente, e foram ajustadas para uma concentração de 5 x 104 células/ml. (2) Cada amostra pré-diluída a ser analisada foi diluída em gradiente duplo respectivamente sobre a placa de células (placa de 96 reservatórios, Corning), 10 gradientes no total, e reservatórios em duplicata foram produzidos para cada gradiente, 50 μl/reservat0rio. O controle positivo foi feito em 8 gradientes da mesma forma. O diluente foi utilizado como o controle negativo. (3) As células foram adicionados em uma densidade de 100 μl/reservat0rio, colocadas em incubadora de CO2 e incubadas a 37 °C durante cerca de 70 horas. AlamarBlue® solution (BioSource) foi adicionada em 30 μl/reservatório, misturada com agitação durante 1 min. A incubação foi feita em incubadora de CO2 a 37 °C durante 5 horas. Após agitação em temperatura ambiente durante 5 min, a placa foi lida (comprimento de onda da luz animada 530 nm; comprimento de onda da luz de emissão 590 nm). (4) Método de regressão de quatro parâmetros foi utilizado para traçar o padrão e a amostra a ser analisada. Os títulos de cada amostra a ser analisada foram calculados de acordo com a equação das parcelas do padrão e das amostras a serem analisadas.
[0072] Os resultados da atividade celular são apresentados na tabela 2 e fig. 5 assim como na figura 6. As amostras em duplicata foram analisadas para cada amostra. A atividade específica celular de rHuGH modificado por YPEG-NHS em pH 6,0 (Y6) é de 1,08 x 10-1 IU/mg, a atividade específica celular do produto modificado em pH 9,0 (Y9) é de 1,66 x 10-1 IU/mg, e a atividade específica celular do produto modificado em pH 10,5 (Y10.5) é 2,09 x 10-1 IU/mg, em que a atividade específica celular de Y10.5 é de cerca de 2 vezes aquela do Y6. A atividade específica celular de rHuGH modificado por UPEG-NHS em pH 6,0 (U6) é 8,85 x 10-2 UI/mg, a atividade específica celular do produto modificado em pH 9,0 (U9) é 1,42 x 10-1 UI/mg; e a atividade específica celular do produto modificado em pH 10,5 (U10.5) é 1,82 x 10-1 UI/mg, em que a atividade específica celular de U10.5 é cerca de duas vezes daquela do U6. Quando o pH da reação de modificação aumenta, a atividade celular do produto modificado por PEG em um sítio único (2 faixas principais) também aumenta proporcionalmente. Tabela 2: A atividade celular de cada amostra de YPEG-rHuGH e UPEG-rHuGH *
Nota: * o padrão nacional de GH foi utilizado como o padrão. Lote N° do padrão: 35-20002, 1 mg/ml/tubo, 3 IU/tubo, adquirido do National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. 4. O peso molecular determinado por MALDI-TOF MS
[0073] Usando espectrômetro de massa Autoflex □ TOF/TOF (Bruker, Alemanha), o método MALDI-TOF MS foi empregado para determinar o peso molecular de cada amostra de PEG-rHuGH. O ácido sinapínico (SA, C11H12O5, M.W. 224,22, número de lote: 2006 236870 002, BRUKER) foi utilizado como a matriz, Protein Calibration Standard I (Parte N°206355) e Protein Calibration Standard II (Parte N°207234) da BRUKER foram utilizados como o padrão de peso molecular da proteína, e o software de análise foi flexAnalysis Ver.3.0.54.0. Os resultados são mostrados na figura 7.
[0074] Os rHuGHs modificados por YPEG-NHS em pH 6,0 (Y6), pH 9,0 (Y9) e pH 10,5 (Y10.5) possuem um peso molecular MS em um faixa de 62012 Dalton ± 10%, que é consistente com a peso molecular teórico do rHuGH modificado por YPEG em um sítio único (o peso molecular de YPEG-NHS é 40 kD ± 10%), indicando que Y6, Y9 e Y10.5 são o produto de modificação do rHuGH modificado por YPEG em um sítio único. Os rHuGHs modificados por UPEG-NHS em pH 6,0 (U6), pH 9,0 (U9) e pH 10,5 (U10.5) todos possuem um peso molecular MS em uma faixa de 62012 Dalton ± 10%, que é consistente com o peso molecular teórico dos produtos de modificação de rHuGH modificados por UPEG em um sítio único (o peso molecular de UPEG-NHS é 40 kD ± 10%), indicando que U6, U9 e U10.5 são o produto de modificação de rHuGH modificado por UPEG em um sítio único. Exemplo 4
[0075] A preparação assim como a atividade celular e ensaio de M.W. do produto de modificação do GH humano recombinante de peso molecular aparente mais elevado modificado por PEG ramificado em forma de U ou em forma de Y em um sítio único em pH 6,0 (Y6-1, U6-1) 1. Modificação:
[0076] Duas amostras de 1200 mg de cada um dos UPEG-NHS e YPEG-NHS (M.W. médio 40 kD, subdivisão igual; lotes ZZ004P182 e ZZ004P167, respectivamente) (Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram pesados e dissolvidos em 12 ml de HCl 2 mm (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.), respectivamente. 300 mg de rHuGH (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e 10 mM PBNa (pH 6,0) (Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) foram adicionados respectivamente para um volume de reação total final de 60 ml. No sistema de reação, a concentração de reação final de rHuGH foi 5 mg/ml, a relação molar de reação entre o rHuGH e o PEG-NHS foi de cerca de 1:2, e o pH de reação foi 6,0. A incubação foi feita em < 10 °C durante 2 horas com agitação, e ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) foi adicionado para tornar o pH < 4,0 para interromper a reação. 2. A purificação do produto de peso molecular aparente mais elevado modificado por PEG em um sítio único (Y6-1, U6-1) 2.1 Purificação através de cromatografia Q Sepharose FF
[0077] A amostra de rHuGH modificada por PEG foi diluída 3 vezes usando água ultrapura, e o pH foi ajustado para 9,0 com NaOH.
[0078] A coluna de cromatografia (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) foi Φ 25 mm x 500 mm, a especificação de acondicionamento do material de acondicionamento Q Sepharose FF (GE Healthcare) foi Φ 25 mm x 310 mm, 1 CV = 152 ml. A coluna de cromatografia Q Sepharose FF foi submetida a limpeza no local usando 0,5 M NaOH em 10 ml/min durante 30 min, eluída com 3 CV de ddH2O em 10 ml/min, regenerada com 3 CV de 1M NaCl em 10 ml/min, e eluída com 5 CV 20 mM ácido de bórico/bórax-17 mM NaCl (pH 9,0, solução A) em 10 ml/min. A amostra diluída em água ultrapura do rHuGH modificado por PEG foi carregada em uma taxa de fluxo de 6 ml/min, e eluída usando a solução A em 10 ml/min até que o primeiro pico fosse completamente detectado. 20 mM ácido bórico/bórax-100 mM NaCl (pH 9,0, solução B) foi depois utilizado para eluir em 10 ml/min até que o segundo pico fosse completamente detectado, e 20 mM ácido bórico/bórax-200 mM NaCl (pH 9,0, solução C) foi utilizado para eluir em 10 ml/min até que o terceiro pico fosse completamente detectado. O eluente foi detectado em 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). A amostra do segundo pico foi coletada como a amostra alvo. O sistema tampão da amostra alvo foi alterado para 5 mM NaAc/HAc (pH 4,5) através da ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona). 2.2 . Purificação através de cromatografia MacroCap SP
[0079] A coluna de cromatografia (Shanhai Jinhua Chromatography Equipment Factory) foi Φ 12 mm x 300 mm, a especificação de acondicionamento do material de acondicionamento MacroCap SP (GE Healthcare) foi Φ 12 mm x 180 mm, 1 CV = 20 ml. A coluna de cromatografia MacroCap SP foi submetida a limpeza no local usando 0,5 M NaOH em 1 ml/min durante 30 min, eluída com 3 CV de ddH2O em 1 ml/min, regenerada com 3 CV de 1M NaCl em 1 ml/min, e eluída com 5 CV de 5 mM NaAc/HAc (pH 4,5, solução A) em 1 ml/min. A amostra de PEG-rHuGH purificado por Q Sepharose FF foi carregada em uma taxa de fluxo de 1 ml/min, e eluída com 3 CV de solução A em 1 ml/min. 5 mM NaAc/HAc-100 mM NaCl (pH 4,5, solução B) foi utilizado para eluir com 5 CV em um gradiente de 0% a 30% solução B em 1 ml/min, eluído com 10 CV em um gradiente de 30% a 45% B, e depois eluído com 5 mM NaAc/HAc-1 M NaCl (pH 4,5, solução C) em 1 ml/min até que o primeiro e o segundo picos fossem completamente detectados. O eluente foi detectado em 280 nm (AKTA Basic100, GE Healthcare). O eluente entre o quinto e o oitavo CV durante a eluição com um gradiente de 30% a 45% solução B foi coletado como amostra alvo. O sistema tampão da amostra alvo foi alterado em 3 mM NaAc/HAc-7mM NaCl-5mM Lys (pH 5,0) através da ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona), e manitol foi completado para uma concentração final de 45 mg/ml. A amostra foi esterilizada através de filtração 0,2 μm. A amostra foi colhida por eletroforese de SDS-PAGE e o manchamento de prata foi utilizado para visualização. A amostra remanescente foi armazenada em -70 oC. Os números da amostra foram: U6-1, Y6-1. Os resultados da eletroforese de SDS-PAGE são mostrados na fig. 8, e os resultados de peso molecular aparente da eletroforese de SDS-PAGE são mostrados na figura 9.
[0080] No caso do carregamento de amostra de PEG-rHuGH 10 μg, uma pequena quantidade do produto modificado em mais de um sítio foi detectada em cada amostra de PEG-rHuGH, e o teor da proteína de substrato (rHuGH) em cada amostra não era mais do que 0,5% (fig. 8), em que o teor da faixa principal não é mais baixo do que 80%. O peso molecular aparente de cada amostra de PEG-rHuGH determinado pela eletroforese de SDS-PAGE mostra uma faixa principal, em que o peso molecular aparente de Y6-1 é claramente mais elevado do que aquele do Y10.5, e o peso molecular aparente de U6-1 é claramente mais elevado do que aquele do U10.5 (fig. 9). 3. O peso molecular detectado por MALDI-TOF MS
[0081] Usando espectrômetro de massa Autoflex TOF/TOF (Bruker, Alemanha), o método MALDI-TOF MS foi utilizado para avaliar o peso molecular de cada amostra de PEG-rHuGH. O método de detecção foi o mesmo como aquele do Exemplo 3. Os resultados são mostrados na figura 7.
[0082] Os pesos moleculares MS de Y6-1 e U6-1 estão ambos em uma faixa de 62012 Dalton ± 10%, o que é consistente com o peso molecular teórico do rHuGH modificado por PEG em um sítio único (os pesos moleculares de YPEG-NHS e UPEG-NHS são 40 kD ± 10%), indicando que ambos são os produtos modificados por PEG em um sítio único. 4. Ensaio da atividade celular
[0083] Usando o padrão nacional de GH como o controle, a linhagem celular de linfoma de rato dependente de HuGH Nb2-11 foi usada para analisar a atividade celular de cada amostra de PEG- rHuGH, comparando a diferença de atividade celular entre Y6-1 e Y10.5, U6 e U10-1 .5. O método de ensaio foi o mesmo como aquele do Exemplo 3. Os resultados são mostrados na tabela 3, em triplicado para cada amostra.
[0084] A atividade específica celular média de Y10.5 é 2,08 x 10-1 IU/mg, a atividade específica celular média de Y6-1 é 5,50 x 10-2 lU/mg; a atividade específica celular média de U10,5 é 2,28 x 10-1 IU/mg, e a atividade específica celular média de U6-1 é 5,00 x 10-2 IU/mg. A atividade específica celular média de Y10.5/U10.5 é claramente mais elevada do que aquela do Y6-1/U6-1, e pode atingir até 3 vezes esta. Tabela 3: A atividade celular de cada amostra de YPEG-rHuGH ou UPEG-rHuGH 1
Nota: 1 utilizando o padrão nacional de GH como o padrão. Lote N° do padrão: 35-20002, 1 mg/ml/tubo, 3 IU/tubo, adquirido do National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. 2 média das amostras em triplicata. Exemplo 5 O ensaio de atividade biológica in vivo de YPEG-rHuGH (Y10.5) e UPEG-rHuGH (U10.5)
[0085] Utilizando ratos com as glândulas pituitárias removidas como modelos animais, a atividade biológica promotora do crescimento animal in vivo do YPEG-rHuGH (Y10.5) e UPEG-rHuGH (U10.5) foi analisada de acordo com o bioensaio de hormônio de crescimento conforme descrito na Pharmacopoeia of the People's Republic of China, versão 2005, Volume 3, Appendix XII P, isto é, observando o efeito sobre o crescimento e desenvolvimento de ratos com as glândulas pituitárias removidas (sem GH endógeno) uma semana após uma única administração.
[0086] Ratos Wistar, nível SPF, do sexo masculino, nascidos 26- 28d, peso corporal de 60 a 80g, fornecidos pelo centro de animais de laboratório do National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products ( certificação animal N°: SCXK(Jing)2005-0004), foram utilizados. 2 a 3 semanas antes da experiência, as glândulas pituitárias dos ratos foram removidas assepticamente por cirurgia, e os ratos foram então normalmente criados em um laboratório S-2 para se recuperarem para outra experiência. Os ratos qualificados com as glândulas pituitárias removidas foram selecionados e divididos uniformemente em 10 grupos de 10 ratos de acordo com o peso corporal, especificamente: grupo controle negativo (solvente em branco); controle positivo de rHuGH (padrão nacional de GH, preparado pelo National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Product, 3IU^mg-'Ltubo-'1), grupos de dose baixa (2,7 IU^kg-1), dose média (5,3 IU^kg-1) e dose alta (10,7 IU^kg-1), administrados em 6 vezes, uma vez por dia, 6 administrações consecutivas; grupos de dose baixa (2,7 IU^kg-1), dose média (5,3 IU^kg-1) e dose alta (10,7 IU^kg-1) da amostra teste Y10.5, grupos de dose baixa (2,7 IU^kg-1), dose média (5,3 IU^kg—1) e dose alta (10,7 IU^kg-1) de amostra de teste U10.5, administração única de uma vez no primeiro dia quando o padrão foi aplicado. Y10.5 e U10.5 foram formulados de acordo com o título de estimativa de 3 IU/mg. A administração foi executada por injeção subcutânea de 0,5 ml no pescoço do animal. O grupo controle negativo foi apenas administrado o solvente, uma vez por dia, 6 vezes no total. Os ratos foram sacrificados 24 h após a última administração no grupo de controle positivo, e os pesos corporais e a largura das placas de crescimento da tíbia foram medidos. Os dados foram processados de acordo com o ensaio de hormônio de crescimento no Appendix XII P e o método estatístico para o ensaio biológico no Appendix XIV da Pharmacopoeia of the People's Republic of China, versão 2005.
[0087] O título biológico de YPEG-rHuGH (Y10.5) é de 5,0 IU-mg--1, o título biológico de UPEG-rHuGH (U10.5) é de 5,2 IU^mg-1, ambos mais do que 1,5 vez do rHuGH normal. A administração isolada de YPEG- rHuGH (Y10.5) ou UPEG-rHuGH (U10.5) possui uma atividade biológica mais elevada para promover o crescimento corporal em animais e um efeito farmacêutico por mais tempo do que a soma de rHuGH injetado diariamente. Exemplo 6
[0088] A meia-vida metabólica do medicamento no soro de YPEG- rHuGH (Y10.5) em macaco comedor de caranguejo
[0089] 6 macacos comedores de caranguejo foram selecionados, 3 fêmeas e 3 machos, peso corporal de 3,24 a 5,48 kg (Guangxi Beihai Yu Qi Experiment Animal technology co. Ltd., certification N°: SCXK(Gui)2005-0005). A experiência incluiu dois grupos de três macacos comedores de caranguejo: um grupo com injeção subcutânea de YPEG-rHuGH (Y10.5) em 300 μg^kg-1 (2$, 1?) e o outro grupo com injeção subcutânea de rHuGH (Saizen, Laboratoires Serono S.A. Switzerland) a 300 μg^kg-1 (1$, 2?), administração única. Após a administração, o sangue venoso foi tirado regularmente da perna traseira oposta ao lado injetado, e o soro foi separado. O kit ELISA de Hormônio do Crescimento Humano da R & D foi utilizado para avaliar a concentração de medicamentos no sangue através de ELISA, e a curva de concentração de medicamentos no sangue foi traçado em gráfico para calcular a meia-vida metabólica do medicamento. Os resultados são mostrados na figura 10.
[0090] Após a injeção subcutânea de YPEG-rHuGH (Y10.5) em 300 μg.kg-1 em macacos comedores de caranguejo, o momento máximo de concentração de medicamento no soro é de 8 a 24 h. O medicamento foi eliminado lentamente. A meia-vida média metabólica do medicamento no soro é de 41,33 h. Após a injeção subcutânea de rHuGH (Saizen) em 300 μg.kg-1 em macacos comedores de caranguejo, o momento máximo de concentração de medicamento no soro é de 1 a 2 h, e em 24 h a concentração diminui ao nível anterior à administração. A eliminação é claramente mais rápida do que o YPEG-rHuGH (Y10.5). A meia-vida metabólica média do medicamento no soro é de 1,80 h. A meia-vida metabólica média do medicamento no soro de YPEG-rHuGH (Y10.5) é mais do que 20 vezes do rHuGH.
Claims (11)
1. Método de preparação de um hormônio de crescimento humano glicolado por polietileno (modificado por PEG), caracterizado pelo fato de que compreende: a) em uma solução com um pH não mais baixo do que 6,0, preferivelmente não mais baixo do que 7,0, preferivelmente não mais baixo do que 8,0, de preferência não mais baixo do que 9,0, preferivelmente não mais baixo do que 9,5, de preferência não mais baixo do que 10,0, mais preferivelmente pH 10,5, levar o polietileno glicol (PEG) de fita dupla ramificado em forma de U ou em forma de Y em contato com hormônio do crescimento humano, de preferência a relação molar do hormônio do crescimento para o PEG de fita dupla é ao redor de 1:2; b) experimentar o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um único sítio obtido na etapa a) em SDS-PAGE de concentração apropriada, preferivelmente 12% SDS-PAGE, em que o produto apresenta duas faixas; c) separar e recuperar o produto de peso molecular aparente mais baixo nas duas faixas modificadas pelo PEG de fita dupla em um único sítio; opcionalmente purificar o produto recuperado, preferivelmente utilizando cromatografia de gel tal como cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP, em que o PEG de fita dupla ramificado em forma de U tem a seguinte fórmula (IV),
em que, R e R' são independentemente alquila de baixo peso molecular, preferencialmente alquila C1-C4; n e n' denotam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; n + n' é de 600 a 1500, mais preferencialmente 910; o peso molecular médio do PEG ramificado em forma de U é de 26 kD a 66 kD, de preferência 40 kD, mais preferencialmente o PEG ramificado em forma de U é de braço igual, ou em que o PEG de fita dupla ramificado em forma de Y tem a seguinte fórmula (III): 
em que R e R' são independentemente alquila de baixo peso molecular, preferencialmente alquila C1-C4, mais preferencialmente metil; m e m' denotam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferencialmente de 600 a 1500, mais preferencialmente 910; e o peso molecular médio total do PEG ramificado em forma de Y é de 26 kD a 60 kD, preferencialmente 40 kD, mais preferencialmente o PEG ramificado em forma de Y é de braço igual.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) em uma solução com pH 9,0 ou 10,5, levando um PEG de fita dupla da seguinte fórmula (III) em contato com o hormônio de crescimento humano, em que a relação molar do hormônio do crescimento para o PEG de fita dupla é de 1:2;
em que m + m' é 910, o peso molecular total médio do PEG de fita dupla é de 40 kD; b) experimentar o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único obtido na etapa a) em 12% SDS-PAGE, em que o produto é principalmente uma faixa de peso molecular aparente mais baixo; c) separar e recuperar o produto de peso molecular aparente mais baixo modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único usando a cromatografia em gel selecionada de cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP.
3. Hormônio do crescimento humano modificado por PEG de menor peso molecular aparente, caracterizado pelo fato de ser preparado de acordo com o método como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o hormônio do crescimento é extraído de uma fonte natural ou obtido pela biotecnologia recombinante, preferivelmente tendo a sequência de SEQ ID NO: 1.
4. Hormônio de crescimento humano modificado por PEG de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que seu peso molecular de 62 kD, como mostrado na seguinte fórmula (VII):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m + m' é 910, j é um número inteiro de 1 a 12.
5. Método de preparar uma preparação de hormônio do crescimento humano modificado por PEG, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) em uma solução com um pH não mais baixo do que 8,0, preferivelmente não mais baixo do que 9,0, preferivelmente não mais baixo do que 9,5, preferivelmente não mais baixo do que 10,0, mais preferivelmente pH 10,5, levar o PEG de fita dupla ramificado em forma de U ou em forma de Y em contato com o hormônio de crescimento humano, preferivelmente a relação molar do hormônio de crescimento para o PEG de fita dupla é de 1:2; b) experimentar o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único obtido na etapa a) em SDS-PAGE de concentração apropriada, preferivelmente de 12% SDS-PAGE, em que o produto apresenta duas faixas; c) separar e recuperar o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único; em que o produto recuperado é uma mistura predominantemente contendo o produto de peso molecular aparente mais baixo modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único, em que o teor de SDS-PAGE do produto de peso molecular aparente mais baixo modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único não é mais baixo do que 70%, preferivelmente não mais baixo do que 80%, mais preferivelmente não mais baixo do que 90%, opcionalmente compreendendo uma etapa de purificação, preferivelmente utilizando cromatografia de gel tal como cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP, em que o PEG de fita dupla ramificado em forma de U tem a seguinte fórmula (IV),
em que, R e R' são independentemente alquila de baixo peso molecular, preferencialmente alquila C1-C4; n e n' denotam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; n + n' é de 600 a 1500, mais preferencialmente 910; o peso molecular médio do PEG ramificado em forma de U é de 26 kD a 66 kD, de preferência 40 kD, mais preferencialmente o PEG ramificado em forma de U é de braço igual, ou em que o PEG de fita dupla ramificado em forma de Y tem a seguinte fórmula (III): 
em que R e R' são independentemente alquila de baixo peso molecular, preferencialmente alquila C1-C4, mais preferencialmente metil; m e m' denotam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m + m' é preferencialmente de 600 a 1500, mais preferencialmente 910; e o peso molecular médio total do PEG ramificado em forma de Y é de 26 kD a 60 kD, preferencialmente 40 kD, mais preferencialmente o PEG ramificado em forma de Y é de braço igual.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) em uma solução com pH 9,0 ou 10,5, levar um PEG de fita dupla da seguinte fórmula estrutural (III) em contato com o hormônio de crescimento humano, em que a relação molar do hormônio de crescimento para o PEG de fita dupla é de 1:2;
em que m + m' é 910, o peso molecular total médio do PEG de fita dupla é de 40 kD; b) experimentar o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único obtido na etapa a) em 12% SDS-PAGE; c) separar e recuperar o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único usando cromatografia em gel selecionada de cromatografia Q Sepharose FF, cromatografia DEAE Sepharose FF ou cromatografia MacroCap SP, em que o teor de SDS-PAGE do produto de peso molecular aparente mais baixo no produto recuperado modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único não é mais baixo do que 70%, preferivelmente não mais baixo do que 80%, mais preferivelmente não mais baixo do que 90%.
7. Preparação de hormônio do crescimento humano modifi-cado por PEG de menor peso molecular aparente, caracterizada pelo fato de ser preparada de acordo com o método como definido na reivindicação 5 ou 6, em que o hormônio do crescimento é extraído de uma fonte natural ou obtido pela biotecnologia recombinante, preferivelmente possui a sequência de SEQ ID NO: 1.
8. Preparação do hormônio do crescimento humano modifi-cado por PEG de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o produto modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único é mostrado como a seguinte fórmula (VII):
em que, R e R' são independentemente alquila de peso molecular baixo, preferivelmente alquila C1-C4, mais preferivelmente metila; m + m' é 910, j é um número inteiro de 1 a 12, em que o teor de SDS-PAGE do hormônio de crescimento modificado por PEG de peso molecular aparente mais baixo modificado pelo PEG de fita dupla em um sítio único na preparação do hormônio modificado por PEG não é mais baixo do que 70%, preferivelmente não mais baixo do que 80%, mais preferivelmente não mais baixo do que 90%.
9. Hormônio de crescimento humano modificado por PEG de acordo com a reivindicação 3 ou 4, ou preparação de hormônio do crescimento humano modificado por PEG de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado(a) pelo fato de que que o hormônio do crescimento recombinante é artificialmente sintetizado ou expresso por um sistema de expressão selecionado do grupo constituído de: um sistema procariótico tal como E. Coli; um sistema de eucariótico tal como Pichia; um sistema celular de inseto, e um sistema celular de mamífero tal como célula de CHO.
10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do hormônio de crescimento humano modificado por PEG como definido em qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9, ou da preparação de hormônio do crescimento humano modificado por PEG como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, preferivelmente compreendendo manitol, um aminoácido, cloreto de sódio, ácido acético e acetato de sódio, em que o aminoácido é preferivelmente selecionado do grupo consistindo em aspartato, asparagina, lisina e glicina.
11. Uso do hormônio de crescimento humano modificado por PEG como definido em qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 9, ou da preparação de hormônio do crescimento humano modificado por PEG como definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 9, ou da composição como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença com necessidade do tratamento com hormônio de crescimento ou para o tratamento antienvelhecimento, preferivelmente a doença com necessidade de tratamento com hormônio de crescimento é selecionada do grupo consistindo em nanismo, queimadura, ferida, fratura óssea, hemorragia da úlcera, insuficiência renal, AIDS, nanismo por deficiência do hormônio de crescimento endógeno, síndrome de Turner, distúrbio anabólico e deficiência de hormônio do crescimento em adultos.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 03/04/2008, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO. |