CN1477126A - 长效生长激素及药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用大分子量聚乙二醇修饰生长激素的方法，得到了能够显著延长生长激素半衰期的修饰产物，此修饰产物的结构单一，生产工艺简单，可进行严格质量控制，具有强的实用性。
Description
技术领域
本发明属生物制剂技术领域。具体涉及长效生长激素，其制备方法，功能和用途。
背景技术
人生长激素是人脑垂体分泌的蛋白质激素，是人体正常生长发育所不可缺少的调节激素。生长激素最早的来源是从人脑垂体提取，但由于来源有限，且质量保证困难，此产品难以广泛使用。基因工程技术的出现，使得人生长激素的大规模生产成为可能，而重组人生长激素成为生物工程制药行业的第二项产品而得到广泛应用，目前主要用于侏儒症、大面积创伤恢复、成人生长激素缺乏症、艾滋病人瘦弱恢复等。
由于人生长激素是蛋白质，其体内半衰期低于2小时，因此用药手段主要局限于频繁的注射方法，常规方法为每天注射，用药周期在六个月到一年，这种频繁的注射，给病人带来严重的不便，并且提高了用药成本。因此，改善生长激素的用药方法，减少用药频率，降低用药成本，提高病人医从性，增加疗效的重要课题。
美国Genentech公司与Alkermers公司合作开发了用PLGA包埋技术形成的释放微粒，可以将用药频率由每天注射降低一次到每个月注射一次，并得到FDA批准上市。但此产品生产工艺复杂，疗效比原产品稍差。
利用聚乙二醇修饰蛋白质，可以延长其半衰期，减少免疫原性，增加稳定性，是一项已成功得到应用的技术。目前利用此技术开发的产品，已经上市的包括PEG-门冬酰胺酶，PEG-ADA(腺苷脱氨酶)，PEG-干扰素和PEG-GCSF(粒细胞集落刺激因子)。其中PEG-干扰素由原来的每2天或每天注射一次降低到每周注射一次，而且疗效显著改善。PEG-GCSF也由每天注射一次改善为每个化疗疗程注射一次。
Clark等(J.Biol.Chem.，271：21969-21977，1996)对聚乙二醇修饰生长激素进行了研究，并得到了能够将生长激素半衰期延长到超过15小时以上的产品，在去除脑垂体的大鼠模型中，注射频率可以降低到每5天注射一次。此研究采用分子量为5000的聚乙二醇，因此需要多个聚乙二醇分子修饰才能达到理想的半衰期延长效果，但过度修饰对生长激素的活性影响较大，此研究表明，5个聚乙二醇分子修饰的效果最理想。尽管这种方法证明了用聚乙二醇修饰生长激素的可行性，但是由于活性的降低，可能需要增加剂量来补偿，而产品的不均一性使得大规模生产时工艺和质量控制难以保证，因此，此项研究的实用性不强。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种采用大分子量聚乙二醇修饰生长激素的方法，从而得到能够延长生长激素半衰期的修饰产物。
本发明解决技术问题的方案是：
1、聚乙二醇和人生长激素的偶联物及生产方法
生长激素在体内的半衰期取决于多方面的因素，如蛋白质的稳定性、结合蛋白的结合和分离、非特异性吸附和降解、抗体的形成、肾脏排除、与受体结合并内吞等等，这些因素决定了生长激素在体内的分布、停留时间和代谢，同时也决定了外源性生长激素的药物动力学特点。将蛋白质与亲水性的高分子如聚乙二醇偶联，可增加蛋白稳定性、减少非特异性吸附和抗原性，达到一定分子量时，可大大降低肾脏的排除效率，是延长蛋白质药物体内半衰期的有效方法。
人生长激素的分子量为20kDa，含有10个一级氨功能团，其中1个阿拉法氨基，9个为赖氨酸侧链氨基。阿拉法氨基和140位的赖氨酸侧链均非常活跃，可以与活化的羧基反应形成肽键。N-羟基琥珀酰胺(NHS)活化聚乙二醇分子是目前大分子偶联常用的方法。
Clark等人(J.Biol.Chem.，271：21969-77，1996)采用了分子量为5000的聚乙二醇与人生长激素偶联，结果表明多个聚乙二醇分子可以联接到人生长激素分子上，随着联接聚乙二醇分子数目增大，分子量增大，偶联物半衰期也延长，但同时多个聚乙二醇分子联接后对生长激素活性造成严重负面影响，聚乙二醇分子联接越多，活性损失就越大。这种半衰期延长或活性损失的中和结果使作者得出结论为每个生长激素分子联接五个聚乙二醇分子得到最理想的长效结果。
人生长激素的半衰期取决于多项因素，其中肾脏排除是重要的一项，为了减少肾脏排除，分子量要超过一定的临界值(大约70kDa)，因此要偶联大分子聚乙二醇。而为了减少活性损失，最好只偶联一个聚乙二醇分子。这种方法在长效干扰素中已得到成功应用(Bailon etal.，Bioconjugate Chem.，12：195-202，2001)。要做到只在生长激素分子偶联一个聚乙二醇分子，较可能的位点是阿拉法氨基，其pKa在7.6-8.0(比赖氨酸侧链氨基的pKa(10.0-10.2)要低)。采用醛基与阿拉法氨基在低pH偶联的方法可以特异地将聚乙二醇偶联在G-CSF蛋白的N端(Kinstler et al.，US Patent 5985265，1999；Kinstler et al.，Pharm.Res.，13：996-1002，1995)。但在同样条件下，生长激素的偶联效率很低。
本发明一方面是提供一种生长激素与高分子聚乙二醇的偶联物，二者的摩尔比为1∶1，另一方面是提供其相应的偶联方法，这种方法是将生长激素与NHS活化后的聚乙二醇在缓冲液中混合反应并形成偶联物。
用NHS活化的聚乙二醇分子量可以是20,000到120,000，更理想的是40,000到80,000之间。所有聚乙二醇可以是线性的，也可以是分叉的。活化的40kDa分叉型聚乙二醇(mPEG2-NHS)购自美国Shearwater公司，80kDa分叉型聚乙二醇(mPEG4-NHS)及活化方法在本发明中公布。缓冲体系、pH、摩尔比例、反应温度和时间等是反应过程重要的控制条件。磷酸缓冲液为本发明首选缓冲体系，其它缓冲液，如碳酸、柠檬酸、琥铂酸等、只要满足pH在6至7.5之间有足够的缓冲能力，并对偶联反应没有干扰也可以使用。缓冲液浓度在50-200mM之间。
传统的NHS偶联方法为了增加偶联效率，一般选择偶联缓冲液的pH控制在7.5到9.0之间。为了增强选择性，我们在偶联生长激素时将pH降低到6.0到7.5之间，更理想的是6.5到7.0之间。在这种条件下，一般认为NHS偶联方法效率很低。聚乙二醇与生长激素的摩尔比可以在1∶1到10∶1的范围内，更为适用的范围是3∶1到7∶1。反应pH对摩尔比有一定影响，pH越高，则需要的聚乙二醇与生长激素的摩尔比可以降低。反应的温度和时间有一定关系，一般在室温条件下一个小时反应可以完成，而在4℃下，一般采用过夜反应。在本发明所采用的低pH条件下，NHS活性基团的水溶液稳定性大大增加，因此时间延长有助于反应完全。此外，蛋白质在低温下一般具有更好的稳定性。因此，首选的条件是2-8℃过夜反应。满足上述条件后，聚乙二醇与生长激素偶联反应的主要产物是一个聚乙二醇与一个生长激素分子偶联。尽管确切的偶联位点并没有通过试验证实，在这些条件下，最可能的偶联位点是N-端的阿拉法氨基。
本发明的另外一个方面是提供了纯化聚乙二醇生长激素偶联物的方法。在本发明条件下需要与偶联物分离的主要组份是未偶联的生长激素，两者之间的差别为一个聚乙二醇分子，由于聚乙二醇的分子量在20,000以上，采用Superdex 75(Pharmacia Biotech)的分子筛柱将偶联物与未偶联生长激素分离，偶联物在排空体积出现，而未偶联生长激素具有更长的滞留时间。进行层析时对缓冲液和pH限制不多，可根据下一步工艺需要进行调整。
本方法可以有效地将偶联物与未偶联生长激素分离，但不能将游离的聚乙二醇与偶联物分开。对于其他与生长激素分子量相近的蛋白质，如红细胞生长素、G-CSF、干扰素、GM-CSF、白介素等，可以采用同样的方法。需要满足的条件是聚乙二醇分子量在20,000以上，蛋白质分子量低于40,000。
本发明的另一方面是提供了同时将聚乙二醇生长激素偶联物与未偶联生长激素和聚乙二醇分离的方法。这种方法是将偶联反应后的产物首先置换到最低离子强度的阳离子性缓冲液中，如Tris，然后将反应产物在阴离子交换柱中分离并用不同离子强度的缓冲液洗脱。在此条件下，游离聚乙二醇结合能力很低，首先被分离，聚乙二醇生长激素偶联物与阴离子柱的结合能力与游离生长激素相比降低，因此在较低的离子强度条件下洗脱，而游离的生长激素在较高的离子强度下洗脱。更为具体地说，偶联反应混合物在反应完成后首先用脱盐层析，如Sephadex G25，进行缓冲液交换，适用的缓冲液体系为阳离子缓冲液，如Tris。缓冲液pH值应该高于6.5，一般采用pH7.4，浓度通常为20mM。将缓冲液置换后的反应混合物在Q阴离子交换柱(如Mono-Q或Q-Sepharose，Pharmacia Biotech)上进行纯化，游离聚乙二醇在上样和用平衡液洗涤时便被分离，而聚乙二醇生长激素偶联物和游离生长激素则结合在柱上。上样后，用与上样相同的平衡液(20mM Tris，PH7.4)洗涤，然后用同样的缓冲体系，逐步增加离子强度来洗脱。聚乙二醇生长激素偶联物与阴离子柱结合的能力被减弱，因此在含有50mM氯化钠的洗脱液(50mM氯化钠，20mM Tris，PH7.4)中洗脱聚乙二醇生长激素偶联物。未偶联生长激素在超过65mM氯化钠的洗脱液(并含有20mM Tris，PH7.4)中洗脱。本方法可以在同一步有效地将游离聚乙二醇和生长激素从需要的偶联产物中分离出来，得到高纯度的适于药用的聚乙二醇生长激素偶联物。
1.药物组合物
去除大鼠脑垂体造成人为的生长激素缺乏症。如果不给外源性生长激素，去除脑垂体的大鼠体重将保持不变，此模型是检测生长激素生物活性的标准方法。人生长激素在大鼠中的半衰期小于30分钟(Jorgensen et al.Pharmacol.Toxicol.，63：129-134，1988)，要观察人生长激素的活性需要给每天大鼠注射人生长激素。长效效果是指延长了生长激素的生物学活性，这种长效结果不能通过简单的剂量增加来获得。例如，在脑垂体去除大鼠中，增加生长激素的剂量可以相应增加体重增加的程度，但无论剂量如何，其增重效应不超过24小时。长效的生长激素则应该在同样或更少的剂量下，在单位时间内用药次数减少的条件下，达到同样的体重增加的目的。
本发明提供了治疗哺乳动物各种疾病的方法。方法包括给需要治疗的哺乳动物提供本发明中有效剂量的聚乙二醇生长激素偶联物。这种偶联物可以用于治疗生长激素缺乏症或者使用生长激素后可以产生有利效果的病症。用于治疗上述病症所需聚乙二醇生长激素偶联物的剂量一般取决于偶联物所含生长激素的活性。这种剂量的要求是能够产生有效的和有利的临床反应，其最大剂量取决于药物不产生临床上重要的副作用。一般来讲，所用偶联物的剂量可以单位时间内累计用常规生长激素的剂量为参考。这种参考剂量只是用于说明目的，最佳剂量的选定要根据临床经验和治疗适应症具体确定。本发明的高纯度的聚乙二醇生长激素偶联物可以用于生产可用于治疗哺乳动物的药物组合物。这种药物组合物可以是溶液、悬浮液、冻干粉剂、片剂、胶囊等等常规的药物剂型，用药方法主要采用非肠胃给药方法，但口服或呼吸剂型也可使用。
2.高分子量分叉型聚乙二醇的合成
本发明的另外一个方面是提供一种合成高分子量分叉型的聚乙二醇分子的方法。这种聚乙二醇的分子定义为下列结构代表：Rx-B-R1
其中R是接在分叉连接物B上的聚乙二醇支链，可以是直线型分子，也可以是分叉型分子。X为在分叉连接物上的聚乙二醇支链数目，可以是在2-4之间。聚乙二醇支链可以是同样大小或形状，也可以是不同大小或形状，分子量可以在2000到20,000之间。
B是含有至少两个亲核功能团的分叉连接物，并通过亲核基团的反应与聚乙二醇支链相邻。B并与另外一个聚乙二醇支链R1相连。亲核基团可以是氨基，另一基团可以是羧基或羟基。赖氨酸是连接物B的典型代表。
R1是一个线性的具有不同功能团的聚乙二醇，其中一头连接在B连接物上，另一头为可后继活化的集团，如羧酸或羟基。R1的分子量在200到20,000之间。合成时，首先将R1支链与活化的B反应，形成分叉，反应物B的亲核基团采用同样或不同的保护基团保护。以赖氨酸为例，如采用同样的保护基团，如Fmoc-Lys(Fmoc)或者Boc-Lys(Boc)，在保护基团去除后，可以连接相同大小或形状的聚乙二醇分子。如采用不同的保护基团，如Fmoc-Lys(Boc)或相反的保护，可连接不同大小或形状的聚乙二醇分子。B的活化采用形成对硝基苯基(p-nitrophenyl)或琥珀酸亚胺基(succinimidyl)功能团，并与R1的亲核基团反应。
在反应完成并将保护基团去除后，所得产物B-R1的结构为一头具有两个亲核基团(氨基)，另一头带有羧酸或羟基以便最终活化。
聚乙二醇支链R一般为甲氧基-聚乙二醇，可以用常规方法活化，活化的聚乙二醇也可以从Shearwater公司购买商业产品。对硝基苯基或NHS活化后的聚乙二醇可以与B-R1上的亲核基团(氨基)反应，形成共价键相连接的稳定的终产物Rx-B-R1。
本发明与文献中其它形成分叉聚乙二醇的方法相比(Monfardiniet al.，Bioconjugate Chem.，6：62-69，1995；Nathan et al.，Macromolecules，25：4476-84，1992)，优点在于所有的反应都在有机溶剂中进行，以利反应效率的提高。反应产物在与蛋白质连接时，在蛋白质反应位点和大分子之间拥有空间，利于反应完成，同时侧链的数目、大小和形状可以自由选择。
本发明公开了一种采用大分子量聚乙二醇修饰生长激素的方法，得到了能够显著延长在大鼠中疗效的修饰产物，此修饰产物的结构单一，生产工艺简单，可进行严格质量控制，具有强的实用性。
附图说明
图1：人生长激素及聚乙二醇偶联物在脑垂体去除大鼠中的增重效果
脑垂体去除大鼠用溶媒(AQ缓冲液，实心正方)、每天10微克人生长激素(空心正方)、每7天70微克PEG40-hGH偶联物(实心圆圈)和每7天70微克PEG80-hGH偶联物(空心圆圈)治疗。图中显示为治疗后每天体重增加的平均值，数据表示为平均值±标准方差。
图2：人生长激素聚乙二醇偶联物在脑垂体去除大鼠中的增重效果的量效关系
脑垂体去除大鼠用溶媒(AQ缓冲液，实心正方)，每天10微克人生长激素(空心正方)，每7天30微克PEG80-hGH偶联物(实心圆圈)和每7天70微克PEG80-hGH偶联物(空心圆圈)治疗。图中显示为治疗后每天体重增加的平均值，数据表示为平均值±标准方差。
图3：人生长激素聚乙二醇偶联物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶预制胶在电泳完成后用考马斯亮蓝染色后照相，本图为染色后胶的照片。
第1道，人生长激素；
第2道，比例为1∶3的人生长激素∶聚乙二醇反应产物；
第3道，比例为1∶5的人生长激素∶聚乙二醇反应产物；
第4道，比例为1∶7.5的人生长激素∶聚乙二醇反应产物；
第5道，比例为1∶10的人生长激素∶聚乙二醇反应产物；
第6道，低蛋白质分子量标准；
第7道，Mono-Q柱50mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶3)；
第8道，Mono-Q柱65mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶3)；
第9道，Mono-Q柱500mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶3)。
图4：人生长激素聚乙二醇偶联物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶预制胶在电泳完成后用考马斯亮蓝染色后照相，本图为染色后胶的照片。
第1道，Mono-Q柱50mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶5)；
第2道，Mono-Q柱65mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶5)；
第3道，Mono-Q柱500mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶5)；
第4道，Mono-Q柱50mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶7.5)；
第5道，Mono-Q柱65mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶7.5)；
第6道，Mono-Q柱500mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶7.5)；
第7道，Mono-Q柱50mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶10)；
第8道，Mono-Q柱65mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶10)；
第9道，Mono-Q柱500mM氯化钠洗脱峰(人生长激素∶聚乙二醇比例1∶10)；
第10道，低蛋白质分子量标准。
图5：人生长激素及40KDA聚乙二醇人生长激素偶联物在脑垂体去除大鼠中的增重效果
脑垂体去除大鼠用溶媒(AQ缓冲液，实心正方)，每天20微克人生长激素(空心圆圈)，每7天70微克PEG40-hGH偶联物(实心圆圈)和每7天140微克PEG80-hGH偶联物(空心正方)治疗。图中显示为治疗后每天体重增加的平均值，数据表示为平均值±标准方差。
图6：人生长激素及聚乙二醇偶联物同剂量一次注射在脑垂体去除大鼠中的增重效果
脑垂体去除大鼠每天用140微克人生长激素(实心圆圈)和每7天用140微克PEG40-hGH偶联物(空心圆圈)注射一次治疗。图中显示为治疗后每天体重增加的平均值，数据表示为平均值±标准方差。
具体实施方式
实施例1高分子量分叉型聚乙二醇的制备
为延长生长激素的半衰期，高分子量分叉型聚乙二醇较为适用。以下叙述了一种合成多分叉分子量为80,000的聚乙二醇的方法，而这个方法同样可用于合成其他不同分子量或形状的聚乙二醇。
将11.8mg Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(MW590，20μmol，AdvancedChemTech)溶解在120μl含有24μmol NHS(Sigma)的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入3.8μl二异丙基碳二亚胺(DIC，MW126，d＝0.8，24μmol，Advanced ChemTech)，反应在室温下振荡两小时。将68mgNH2-PEG-COOH(MW3400，20μmol，Shearwater)溶解在100μl二氯甲烷(DCM)中，加入6.9μl二异丙基乙胺(DIPEA，MW129，d＝0.74，40μmol，Sigma)，并与前部反应混合，室温下振荡一小时后，加入10％六氢吡啶，室温下振荡5分钟，将反应产物以超过体积比1∶10(混合物∶乙醚)的比例沉淀在乙醚中并真空干燥。得到78mg(NH2)2-PEG-COOH终产品。
将8.8mg(NH2)2-PEG-COOH(5μmol氨基)溶于100μl DCM，然后加入200mg mPEG2-40K-NHS(MW42500，5μmol，Shearwater)和1.7μlDIPEA(10μmol)，反应在室温下振荡一夜。产物在乙醚中沉淀并真空干燥。
合成的80kDa聚乙二醇在Superdex 200层析柱上纯化(2.6×40cm)，将柱用水平衡，并将要纯化的产物溶于5ml水中。上样后用水洗脱，并在214nm观察，并将第一个峰混合，真空干燥。
纯化后的80kDa聚乙二醇采用DIC进行活化。将100mg 80kDamPEG4-COOH(1.25μmol)溶于0.5ml干燥DCM中，加入1.3μmol NHS和0.25μl DIC(1.5μmol)。反应在室温下振荡过夜。将产物用乙醚沉淀并真空干燥。回收产物103mg，干燥保存在-20℃。
实施例2生长激素与80kDa和40kDa聚乙二醇偶联
将234mg生长激素冻干粉剂溶于4ml 0.1M磷酸钠，pH7.0。将HiTrap Sephadex G25脱盐柱(2.5×15cm，Pharmacia Biotech)用人0.1M磷酸钠(pH7.0)平衡，并将生长激素样品上样，在280nm观察，收集第一个峰(18ml)。测定280nm光密度并用消光系数0.68计算生长激素浓度，结果为280nm光密度1.2，蛋白质浓度1.76mg/ml，总蛋白32mg。
与80kDa聚乙二醇偶联时，称取60mg活化后的80kDamPEG4-NHS(0.7μmol)，加入到1.1ml含6mg生长激素(0.3μmol)的磷酸钠(pH7.0)溶液中，反应在4℃过夜振荡。
与40kDa聚乙二醇偶联时，称取60mg活化后的40kDamPEG2-NHS(1.5μmol)，加入到2ml含10mg生长激素(0.3μmol)的磷酸钠(pH7.0)溶液中，反应在4℃过夜振荡。
实施例380kDa和40kDa聚乙二醇生长激素偶联物用Superdex75纯化
80kDa和40kDa聚乙二醇生长激素偶联物用Superdex 75层析柱(1.5×40cm，Pharmacia Biotech)纯化。将层析柱用150mM氯化钠，10mM柠檬酸钠，0.2％吐温20，pH6.0的溶液平衡后上样，上样体积低于柱体积的5％，用280nm观察蛋白峰，并收集第一个洗脱峰。共收集了35ml浓度为0.16mg/ml的40kDa聚乙二醇人生长激素偶联物，总蛋白量5.6mg。共收集了28ml浓度为0.08mg/ml 80kDa聚乙二醇人生长激素偶联物，总蛋白量2.6mg。
实施例440kDa和80kDa聚乙二醇人生长激素偶联物在脑垂体去除大鼠中的长效效应
六十只八周龄脑垂体去除的雌性Sprague Dawley大鼠购买于Taconic Farms公司，四只大鼠因健康不佳剔除。分组前10天，观察每个大鼠体重变化，并将体重增加超过所有小鼠平均值一个标准方差的大鼠剔除。其余大鼠(53只)随机分为以下5组：
溶媒组，10只大鼠，连续14天每天皮注1毫升AQ缓冲液(0.2％吐温-20，150mM氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0)；
生长激素组，10只大鼠，连续14天每天皮注1毫升含10微克人生长激素的AQ缓冲液；
80N-70组，11只大鼠，第0天和第8天皮注1毫升含70微克80kDa聚乙二醇人生长激素偶联物的AQ缓冲液；
80N-30组，11只大鼠，第0天和第8天皮注1毫升含30微克80kDa聚乙二醇人生长激素偶联物的AQ缓冲液；
40N-70组，11只大鼠，第0天和第8天皮注1毫升含70微克40kDa聚乙二醇人生长激素偶联物的AQ缓冲液。
每天测定大鼠体重，图1和图2显示了各组大鼠在治疗过程中体重变化的曲线，第7天和第14天各组大鼠体重变化的平均值及统计学分析列在表1和表2中。统计学分析采用EXCEL软件的t检验功能，指标为双尾和不等方差。
表1 治疗后第7天脑垂体去除大鼠的平均体重增加
| 组 | n | 体重增加(g)(mean±sd) | P(比溶媒) | P(比生长激素) |
| 溶媒 | 10 | 0.6±1.8 | ||
| 生长激素 | 10 | 14.2±2.1 | ＜0.0001 | |
| 40N-70 | 11 | 13.0±2.2 | ＜0.0001 | ＞0.05 |
| 80N-30 | 11 | 9.9±2.2 | ＜0.001 | ＜0.01 |
| 80N-70 | 11 | 13.2±2.0 | ＜0.0001 | ＞0.05 |
表2 治疗后第14天脑垂体去除大鼠的平均体重增加
| 组 | n | 体重增加(g)(mean±sd) | P(比溶媒) | p(比生长激素) |
| 溶媒 | 10 | 1.0±2.7 | ||
| 生长激素 | 10 | 19.8±2.8 | ＜0.0001 | |
| 40N-70 | 11 | 20.0±3.2 | ＜0.0001 | ＞0.05 |
| 80N-30 | 11 | 14.5±4.1 | ＜0.0001 | ＜0.01 |
| 80N-70 | 11 | 19.5±4.4 | ＜0.0001 | 0.05 |
结果表明，40N-70和80N-70组大鼠的平均体重增加与阳性对照生长激素组没有区别，即高分子量分叉型聚乙二醇生长激素的偶联物每7天一针，起到了常规生长激素每日注射同样的增重效果。这种增重效果与所用偶联物的剂量有量效关系。
实施例5聚乙二醇与生长激素偶联及偶联物的纯化
将43.5mg人生长激素冻干粉剂溶于1.0ml水中，上样到HiTrapG25脱盐柱将缓冲液置换到50mM磷酸钠，pH6.5。测定280nm的光密度，并用0.68的消光系数计算蛋白浓度。回收的总生长激素量为5.7毫克，将其分为四份，每份含1.4mg蛋白，体积0.75ml。
按下表称取四份适量的mPEG2-NHS(MW40,000，Shearwater)，并分别加入到生长激素样品中，反应在4℃过夜进行。
| PEG∶hGH(摩尔比) | 3∶1 | 5∶1 | 7.5∶1 | 10∶1 |
| hGH(nmol) | 71.62 | 71.62 | 71.62 | 71.62 |
| PEG(mg/nmol) | 8.6/214.9 | 14.3/358.1 | 21.4/537.2 | 28.6/716.2 |
以上反应完成后，分别采用HiTrap G25脱盐柱将缓冲液置换为20mM Tris，pH7.4。每个样品分别上样到已用20mM Tris，pH7.4缓冲液平衡的Mono-Q HR5/5层析柱(Pharmacia Biotech)，并用阶梯增加离子强度的方式进行洗脱，洗脱峰在280nm观察，洗脱液为：
洗脱液1：50mM氯化钠，20mM Tris，pH7.4；
洗脱液2：65mM氯化钠，20mM Tris，pH7.4；
洗脱液1：500mM氯化钠，20mM Tris，pH7.4。
将洗脱后的各洗脱峰收集，每个样品取80微升，加入5微升5倍的SDS-聚丙烯酰胺凝胶样品处理缓冲液，在100℃加热到总体积低于30微升，将所有样品上到4-20％的预制的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后用考马斯亮蓝染色并照相。图3和图4是电泳后的照片。
结果表明，生长激素和40kDa分叉型聚乙二醇(mPEG2-NHS)可有效形成一个聚乙二醇与一个生长激素分子结合的偶联物。生长激素和聚乙二醇二者的摩尔数比例在1∶5-1∶7.5时偶联效率较高，而且有较少的多个聚乙二醇分子与生长激素偶联的现象，效果最佳。
阴离子交换柱Mono-Q可以有效地将聚乙二醇生长激素偶联物与游离人生长激素和游离聚乙二醇分离。游离聚乙二醇在上样和平衡液洗脱时就被分开，而聚乙二醇生长激素偶联物在50mM氯化钠的洗脱液中洗脱，游离的生长激素在65mM以上的氯化钠洗脱液中洗脱。
将从Mono-Q柱洗脱的所有50mM氯化钠洗脱峰混合，并用HiTrap G25脱盐柱将缓冲液交换到AQ缓冲液中(150mM氯化钠，0.2％吐温-20，10mM柠檬酸钠，pH6.0)。置换缓冲液后的样品用0.22μm滤器除菌过滤(CAMEO 25AS)并保存在2-8℃用于动物活性试验。
实施例6用阴离子交换柱制备聚乙二醇生长激素偶联物
将88.4mg人生长激素冻干粉剂溶于1.0ml水中，上样到两个连接的HiTrap G25脱盐柱将缓冲液置换到50mM磷酸钠，pH6.5。测定280nm的光密度，并用0.68的消光系数计算蛋白浓度。回收的总生长激素量为14毫克，体积5.5毫升，将体积用50mM磷酸钠，pH6.5溶液调整到8毫升，分为八份，每份含1.75mg蛋白，体积1ml。按下表称取八份26.25毫克的mPEG2-NHS(MW40,000，Shearwater)，并分别加入到生长激素样品中，反应在4℃过夜进行。
| PEG∶hGH(摩尔比) | 7.5∶1 |
| HGH(nmol) | 87.5/份 |
| PEG(mg/nmol) | 26.25/656.25/份 |
以上反应完成后，采用HiTrap G25脱盐柱将缓冲液置换为20mMTris，pH7.4，并将样品上样到已用20mM Tris，pH7.4缓冲液平衡的Mono-Q HR5/5层析柱(Pharmacia Biotech)，并用阶梯增加离子强度的方式进行洗脱，洗脱峰在280nm观察，洗脱液为：
洗脱液1：50mM氯化钠，20mM Tris，pH7.4；
洗脱液2：65mM氯化钠，20mM Tris，pH7.4；
洗脱液1：500mM氯化钠，20mM Tris，pH7.4。
将洗脱后的各洗脱峰收集，每个样品取80微升，加入5微升5倍的SDS-聚丙烯酰胺凝胶样品处理缓冲液，在100℃加热到总体积低于30微升，将所有样品上到4-20％的预制的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完成后用考马斯亮蓝染色并照相。
结果表明，阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow与Mono-Q柱的分离效果相同，聚乙二醇生长激素的偶联物在含50mM氯化钠的洗脱液中洗脱。
将从Q-Sepharose柱洗脱的所有50mM氯化钠洗脱峰混合，并用HiTrap G25脱盐柱将缓冲液交换到AQ缓冲液中(150mM氯化钠，0.2％吐温-20，10mM柠檬酸钠，pH6.0)。置换缓冲液后的样品用0.22μm滤器除菌过滤(CAMEO 25AS)并保存在2-8℃用于动物活性试验。
实施例7聚乙二醇生长激素偶联物在脑垂体去除大鼠中的活性
四十只8周龄脑垂体去除雌性Sprague Dawley大鼠购买于Taconic Farms公司，两只大鼠因健康不佳剔除。分组前12天，观察每个大鼠体重变化，并将体重增加超过所有小鼠平均值一个标准方差的三只大鼠剔除。其余大鼠(35只)随机分为以下5组：
溶媒组，9只大鼠，连续14天每天皮注1毫升AQ缓冲液(0.2％吐温-20，150mM氯化钠，10mM柠檬酸钠，pH6.0)；
生长激素组，6只大鼠，连续14天每天皮注1毫升含20微克人生长激素的AQ缓冲液；
PEGhGH-70组，10只大鼠，第0天和第7天皮注1毫升含70微克40kDa聚乙二醇人生长激素偶联物的AQ缓冲液；
PEGhGH-140组，10只大鼠，第0天和第7天皮注1毫升含30微克80kDa聚乙二醇人生长激素偶联物的AQ缓冲液。
每天测定大鼠体重，图5显示了各组大鼠在治疗过程中体重变化的曲线，第7天和第14天各组大鼠体重变化的平均值及统计学分析列在表3和表4中。统计学分析采用EXCEL软件的t检验功能，指标为双尾和不等方差。
表3 治疗后第7天脑垂体去除大鼠体重增加的平均值
| 组 | n | 体重增加(g)(mean±sd) | P(比溶媒) | P(比生长激素) |
| 溶媒 | 9 | 1.93±2.10 | ||
| 生长激素 | 6 | 17.07±1.94 | ＜0.0001 | |
| PEGhGH-70 | 10 | 12.99±2.66 | ＜0.001 | ＜0.05 |
| PEGhGH-140 | 10 | 16.21±1.56 | ＜0.0001 | ＞0.05 |
表4 治疗后第14天脑垂体去除大鼠体重增加的平均值
| 组 | n | 体重增加(g)(mean±sd) | P(比溶媒) | P(比生长激素) |
| 溶媒 | 9 | 2.77±1.66 | ||
| 生长激素 | 6 | 27.12±2.95 | ＜0.0001 | |
| PEGhGH-70 | 10 | 20.79±3.00 | ＜0.0001 | ＜0.001 |
| PEGhGH-140 | 10 | 28.59±2.81 | ＜0.0001 | ＞0.05 |
结果表明，经140微克聚乙二醇生长激素偶联物(PEGhGH-140组)每7天用药一次的增重效果与每天注射20微克常规生长激素相当，并且大鼠的增重与所用偶联物剂量呈量效关系。
实施例8在脑垂体去除大鼠中同剂量一次用药的生长激素和聚乙二醇生长激素偶联物药效比较
九只11周龄雌性脑垂体去除的Sprague Dawley大鼠购自TaconicFarms公司，并随机分为以下两组：
生长激素组，4只大鼠，一次皮注1ml含140μg/ml人生长激素的AQ缓冲液；
PEG-hGH组，5只大鼠，一次皮注1ml含140μg/ml聚乙二醇人生长激素偶联物的AQ缓冲液；
各组大鼠每天体重增加的变化曲线显示在图6中，第7天各组大鼠体重增加的平均值列在表5中。
表5.治疗后第7天脑垂体去除大鼠体重增加的平均值
| 组 | n | 体重增加(g)(mean±sd) | p |
| 生长激素 | 4 | 3.43±1.79 | |
| PEGHGH | 5 | 16.28±1.22 | ＜0.0001 |
结果表明，采用140微克聚乙二醇人生长激素偶联物治疗的大鼠体重增加显著高于用140微克常规人生长激素组，即聚乙二醇人生长激素达到的长效目标，单纯增加生长激素剂量无法达到同样效果。
Claims (19)
1.高纯度的聚乙二醇生长激素偶联物，其中聚乙二醇和生长激素的摩尔比是1∶1；
2.权利要求1中的偶联物，其中聚乙二醇的分子量在20,000到120,000之间；
3.权利要求2中的偶联物，其中聚乙二醇的分子量在40,000到80,000之间；
4.权利要求1中的偶联物，其中聚乙二醇含有两个到四个分叉支链；
5.权利要求4中的偶联物，其中每个聚乙二醇支链的分子量在5,000到20,000之间；
6.权利要求1中的偶联物，其中偶联物的纯度大于95％；
7.权利要求1中的偶联物，其中偶联物能起到长效作用；
8.一种生产权利要求1-7偶联物的方法，其特点是单功能团活化的聚乙二醇与生长激素在pH值5.5到7.5之间的水溶液进行偶联反应；
9.一种生产权利要求8偶联物的方法，其特点是单功能团活化的聚乙二醇与生长激素在pH值6.5到7.0之间的水溶液进行偶联反应；
10.一种生产权利要求1-7中偶联物的方法，其特点是将偶联混合物用Superdex 75分子筛层析进行分离纯化；
11.一种生产权利要求1-7中偶联物的方法，其特点是将偶联混合物用阴离子交换层析柱进行分离纯化；
12.一种根据权利要求11的方法，其中阴离子交换柱是Q；
13.一种根据权利要求12的方法，其中权利要求1-6的偶联物在含50毫摩尔氯化钠的缓冲液中洗脱；
14.一种含有权利要求1-7中偶联物的有效剂量的药物组合物，以及药物接受的稀释剂、稳定剂或其它辅料；
15.一种根据权利要求14的药物组合物，其特点是此药物组合物具有长效的功能；
16.一种高分子的分叉型聚乙二醇分子，结构式表达为：Rx-B-R1其中R为连在连接物B上的聚乙二醇支链，x为此支链的数目，在2-4之间，R1是个双功能聚乙二醇分子，一头连接在连接物B上，另一头具有游离的羧基或羟基；
17.一种根据权利要求16的高分子的分叉型聚乙二醇分子，其分子量在20,000到120,000之间；
18.一种根据权利要求17的高分子的分叉型聚乙二醇分子，其分子量在40,000到80,000之间；
19.一种聚乙二醇偶联物，其特点是权利要求16到18的聚乙二醇分子与蛋白质或其他分子形成偶联物。
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