CN104592382A - 一种peg-长链脂肪烷定点修饰的人生长激素及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种PEG-十六烷定点修饰的人生长激素，其制备方法以及应用。PEG-十六烷定点修饰能够显著提高人生长激素的药代动力学和药效学特性，并降低人生长激素的免疫原性。

Description

一种PEG-长链脂肪烷定点修饰的人生长激素及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种将PEG-长链脂肪烷定点修饰在人生长激素的N-末端，以及其制备方法。
背景技术
人生长激素(human growth hormone,hGH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，有191个氨基酸残基，分子量为22kDa，分子中无糖基，且具有4个α-螺旋和两个链内二硫键。hGH通过与分布于组织细胞表面的生长激素受体结合而发挥其生理功能。hGH的主要生理功能包括间接的促细胞生长作用、直接的代谢调理作用和免疫调节作用。hGH可用于治疗生长激素缺乏儿童矮小症、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤等疾病。由于hGH的分子量小、在体内易被肾小球过滤和酶降解，采取静脉和皮下注射给药会导致其在体内的血浆半衰期短。在临床使用时需要频繁给药才能保持有效的血药浓度和治疗效果，这不仅在生理、心理和经济上对患者造成了极大的负担，且易产生耐受性及免疫排斥等不良反应。因此，开发耐受性好、省钱、且易为患者接受的hGH长效剂型已成为人们关注的焦点之一。
目前，用于延长蛋白质药物血浆半衰期的方法主要基于化学修饰或者基因工程融合表达。其中，聚乙二醇(PEG)修饰和结合人血清白蛋白(HSA)是两种常用的方法，可有效延长hGH的血浆半衰期，达到长效治疗的目的。PEG是中性、无毒，且具有良好生物相容性的高分子聚合物。PEG修饰可有效降低蛋白质的免疫原性和肾小球的过滤作用，从而延长蛋白质在体内的血浆半衰期。然而，PEG对蛋白质药物的空间屏蔽作用会减弱蛋白质药物与其受体的相互作用，从而导致其生物活性的降低，甚至完全丧失。人血清白蛋白(HSA)是人血浆中含量最丰富的蛋白质，分子量约为66.5kDa，在人体内的血浆半衰期约为19天，具有安全无毒、生物相容性好、无免疫原性等特点。通过HSA与蛋白质药物化学偶联或者基因融合表达，可以显著延长蛋白质药物的血浆半衰期，同时降低其免疫原性和抗原性。然而，HSA的空间屏蔽作用极大地降低了蛋白质的生物活性。因此，临床试验结果开始质疑传统蛋白质药物长效剂型的研发策略，即通过增加血浆半衰期来提高药效。
HSA由三个柔性的球形结构域(I、II和III)组成，并拥有5个长链脂肪酸(Myr1-5)结合位点，且解离常数在10-8-10-7M的范围内。最近，人们研发了长链脂肪酸酰基化修饰的多肽药物。其研发策略是通过长链脂肪酸与HSA的结合，延长多肽药物的血浆半衰期；通过长链脂肪酸与HSA的缓慢释放，逐步恢复多肽药物的生物活性。例如，丹麦Novo Nordisk公司通过十四烷酸(肉豆蔻酸)结合胰岛素，开发了一种新型的长效胰岛素(商品名：Levemir)，用于治疗1型和2型糖尿病，并于2004年被美国FDA批准上市。随后，该公司通过十六烷酸(棕榈酸)结合胰高血糖素样肽1(GLP-1)，开发了一种新型的长效GLP-1(商品名：Liraglutide)，其中GLP-1的血浆半衰期从2分钟延长到13小时。Liraglutide主要用于治疗2型糖尿病，已于2010年被美国FDA批准上市。
在PEG修饰和长链脂肪酸酰基化修饰的基础上，Kim等使用分子量为20kDa的分支型PEG，在其4个臂上分别连接了2个Exendin-4(Ex4)多肽分子和2个16碳的长链脂肪烷，用于治疗2型糖尿病。其研究策略是通过修饰的PEG链和结合的HSA来延长Ex4的血浆半衰期。与未修饰的Ex4相比，修饰产物(Ex4-PEG-C16)的血浆半衰期和曲线下面积(AUC)增加了6倍。然而，该研究策略存在以下缺陷：(1)PEG的琥珀酰亚胺(NHS)基团会随机修饰到Ex4赖氨酸残基的ε-氨基和N-末端氨基酸残基的α-氨基，而有些氨基酸残基靠近Ex4的活性中心，修饰这些位点会显著降低Ex4的生物活性；(2)高分子量的PEG(20kDa)由于能高效地结合水分子，会极大地降低HSA与十六烷的结合能力，不利于增加Ex4的血浆半衰期；(3)不能用于蛋白质药物的化学修饰。将蛋白质直接加入混有有机溶剂的PEG化十六烷，有机溶剂会引起蛋白质沉淀，导致其生物活性的丧失；PEG链上的NHS基团在有机溶剂中稳定，而在水溶液中极易水解，在去除有机溶剂的过程中因NHS基团的水解而无法修饰蛋白质。因此，我们迫切需要研发针对蛋白质药物的PEG-长链脂肪烷修饰技术，优化PEG连接桥的分子量，并将PEG-长链脂肪烷定点修饰到远离蛋白质药物活性中心的位点。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种将PEG-十六烷定点修饰到hGH的N-末端的方法。最终修饰产物的成分单一，易于修饰产物的分离纯化和质量控制，并能减少hGH生物活性的损失。
本发明以PEG-十六烷定点单修饰人生长激素的N末端，包括以下步骤：
(1)制备PEG-十六烷修饰的人生长激素。分别采用分子量为3.5kDa和10kDa的马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺酯(mal-PEG-NHS)与十六胺反应，引入十六烷；修饰产物(mal-PEG-HD)的马来酰亚胺基团与1-硫代甘油反应，引入邻位羟基，采用高碘酸钠(NaIO4)氧化邻位羟基生成醛基。而后根据醛化学反应原理将带醛基的PEG-十六烷定点修饰在hGH的N-末端的α-氨基，即每个hGH分子的N-末端结合1个PEG-十六烷分子。其中，分子量为3.5kDa的PEG-十六烷(mal-P3.5-HD)修饰产物由hGH-P3.5-HD代表；分子量为10kDa的PEG-十六烷(mal-P10-HD)修饰产物由hGH-P10-HD代表。
(2)制备PEG修饰的人生长激素。按照一定的反应条件，将分子量为10kDa的PEG-醛定点修饰在hGH的N-末端的α-氨基，即每个hGH分子的1个PEG分子。PEG修饰产物由hGH-P10代表，作为hGH-P10-HD的对照。
(3)修饰产物的分离纯化与鉴定。hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD由mono Q阴离子交换柱(0.5cm×5cm,美国GE Healthcare公司)进行纯化。hGH-P10由Q Sepharose HighPerformance阴离子交换柱(1.6cm×2.5cm,美国GE Healthcare公司)进行纯化。洗脱物均采用280nm的紫外波长进行检测，进行收集。浓缩后纯化产物采用SDS-PAGE和凝胶过滤色谱鉴定。
(4)hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD修饰位点的鉴定。将hGH、hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD置换到含2.0M脲的0.05M的NH4HCO3(pH 8.2)的缓冲液中，将蛋白浓度调整为1.0毫克/毫升。将胰蛋白酶和蛋白以质量比为1:50的比例，于37℃下孵育14小时，酶解产物由C4反相色谱柱进行分离和鉴定。
(5)修饰产物的免疫原性分析：将24只6-8周的BALB/c雌鼠随机分为4组，每组6只，A组为hGH组，B组为hGH-P3.5-HD组，C组为hGH-P10-HD组，D组为hGH-P10组。于0、7、14天行皮下注射，21天处死后，收集血清。血清中hGH特异的IgG抗体采用酶联免疫吸附法(ELISA)进行测定。
(6)修饰产物的体外活性分析：采用表面等离子共振技术测定hGH及其修饰产物与生长激素结合蛋白(GHBP)的体外结合活性。将GHBP固定在CM5芯片上，结合过程采用不用的样品浓度进行测定，使用1:1朗缪尔结合模型进行分析。测定样品的结合速率(ka)、解离速率(kd)以及解离常数(KD)。
(7)修饰产物的药代动力学分析：选取250～300克雄性SD大鼠24只，随机分为4组。其中，A组为hGH、B组为hGH-P3.5-HD、C组为hGH-P10-HD、D组为hGH-P10组，经皮下注射，注射剂量为1毫克hGH/公斤大鼠，体积为500微升。经皮下注射后，在不同的时间范围内进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中hGH及其修饰样品的含量。
(8)修饰产物的药效动力学分析：选取250～300克雄性SD大鼠30只，随机分为5组。其中，A组为对照组，皮下注射500微升0.15mol/L的磷酸缓冲液；B组为hGH、C组为hGH-P3.5-HD、D组为hGH-P10k-HD、E组为hGH-P10组，经皮下注射，注射剂量为1毫克hGH/公斤大鼠，体积为500微升。经皮下注射后，在不同的时间范围内进行眼眶采血，离心收集血浆。用ELISA试剂盒测定血浆中IGF-1的含量。
与传统的修饰策略相比，本发明的优势在于提供了一种以低分子量的双功能PEG为连接桥，PEG的一端可定点结合hGH的N末端，另一端结合十六烷，并提高十六烷的水溶性；十六烷在体内与白蛋白进行非共价结合，可提高hGH的血浆半衰期；白蛋白与十六烷的缓慢解离可逐渐恢复hGH的生物活性；PEG能保护解离的hGH并减小其生物活性的损失，同时调节白蛋白从结合物中解离的速率。此外，将十六烷定点修饰在hGH的N-末端，从而得到均一且定点的单修饰产物，使hGH的活性中心不被PEG-十六烷修饰，减少hGH生物活性的损失。
附图说明
图1hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD的制备反应示意图。
图2PEG-十六烷修饰产物纯化的色谱图。图a为mono Q阴离子交换柱(0.5厘米×5厘米)纯化hGH-P3.5-HD；图b为mono Q阴离子交换柱(0.5厘米×5厘米)纯化hGH-P10-HD；图c为Q Sepharose HP阴离子交换柱(1.6cm×2.5cm)纯化hGH-P10。上述各种修饰产物分别按箭头所示收集的洗脱峰，即对应于纯化的三种修饰产物。
图3SDS-PAGE电泳分析PEG-十六烷修饰产物。第1-5泳道分别对应标准蛋白、hGH、hGH-P3.5-HD、hGH-P10-HD和hGH-P10。
图4鉴定PEG-十六烷的修饰位点。使用C4反相色谱柱(0.46厘米×25厘米)对PEG-十六烷修饰产物的胰蛋白酶酶切片段进行分离。流速为0.5毫升/分钟。
图5PEG-十六烷修饰产物免疫原性的分析。BALB/c小鼠经皮下注射PEG-十六烷修饰产物，血浆中抗hGH的IgG通过ELISA方法进行检测。
图6注射PEG-十六烷修饰产物后SD大鼠血浆中的hGH浓度变化曲线。SD大鼠经腹腔注射修饰产物，血浆中的hGH浓度由hGH的ELISA定量试剂盒测定。
图7注射PEG-十六烷修饰产物后SD大鼠血浆中的IGF-I浓度变化曲线。SD大鼠经腹腔注射修饰产物，血浆中的IGF-I浓度由IGF-I的ELISA定量试剂盒测定。
具体实施方式
实施例1修饰产物hGH-P3.5-HD、hGH-P10-HD和hGH-P10的制备
(1)制备hGH-P3.5-HD
将十六胺与分子量为3.5kDa的马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺酯(mal-P3.5-NHS)分别溶于N,N-二甲基亚砜中。随后，2mM的十六胺和1mM的mal-P3.5-NHS等体积混合，于室温下反应5小时(图1)，反应生成mal-P3.5-十六烷。按5倍体积比加入pH 7.2的20mM磷酸缓冲液进行稀释，静置1小时。随后，mal-P3.5-十六烷与1-硫代甘油按摩尔比为1:200的比例进行混合，于室温反应过夜(图1)。用截留分子量为10kDa的透析袋透析除去未反应的1-硫代甘油并将缓冲液置换为20mM乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 5.8)。将高碘酸钠(NaIO4)与上述反应产物混合，NaIO4终浓度为4mM，于室温下反应1小时，反应生成带醛基的P3.5-十六烷(P3.5醛-十六烷，图1)。用截留分子量为10kDa的透析袋透析除去未反应的NaIO4，并将缓冲液置换为含0.2M甘露醇BisTris-盐酸缓冲液(pH 6.5)。将P3.5醛-十六烷、hGH和NaCNBH3混合，于4℃反应过夜，生成hGH-P3.5-HD。其中，P3.5醛-十六烷、hGH和NaCNBH3的摩尔比为1:10:200。
(2)制备hGH-P10-HD
将十六胺与分子量为10kDa的马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺酯(mal-P10-NHS)分别溶于N,N-二甲基亚砜中。随后，2mM的十六胺和1mM的mal-P10-NHS等体积混合，于室温下反应5小时(图1)，反应生成mal-P10-十六烷。按5倍体积比加入pH 7.2的20mM磷酸缓冲液进行稀释，静置1小时。随后，mal-P10-十六烷与1-硫代甘油按摩尔比为1:200的比例进行混合，于室温反应过夜(图1)。用截留分子量为10kDa的透析袋透析除去未反应的1-硫代甘油并将缓冲液置换为20mM乙酸钠-乙酸缓冲液(pH 5.8)。将高碘酸钠(NaIO4)与上述反应产物混合，NaIO4终浓度为4mM，于室温下反应1小时，反应生成带醛基的P10-十六烷(P10醛-十六烷，图1)。用截留分子量为10kDa的透析袋透析除去未反应的NaIO4，并将缓冲液置换为含0.2M甘露醇BisTris-盐酸缓冲液(pH 6.5)。将P10醛-十六烷、hGH和NaCNBH3混合，于4℃反应过夜，生成hGH-P3.5-HD。其中，P10醛-十六烷、hGH和NaCNBH3的摩尔比为1:10:200。
(3)制备hGH-P10
将分子量为10kDa的PEG醛(P10-醛)、NaCNBH3和hGH分别溶于0.2M甘露醇BisTris-盐酸缓冲液(pH 6.5)。将三者按照1:4:200的摩尔比进行混合，于4℃反应过夜，反应生成hGH-P10。
实施例2修饰产物hGH-P3.5-HD、hGH-P10-HD和hGH-P10的分离纯化
(1)hGH-P3.5-HD的分离纯化
用mono Q阴离子交换柱(0.5厘米×5厘米，美国GE Healthcare公司)纯化hGH-P3.5-HD。Mono Q柱由20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡与洗脱，除去未反应的修饰剂。然后用0-50％的含0.5M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 6.5)进行梯度洗脱，以0.5毫升/分钟的流速洗脱30分钟(图2a)。洗脱物用280nm的紫外波长进行检测，收集含有hGH-P3.5-HD的洗脱峰，并置换成20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)。
(2)hGH-P10-HD的分离纯化
用mono Q阴离子交换柱(0.5厘米×5厘米，美国GE Healthcare公司)纯化hGH-P10-HD。Mono Q柱由20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡与洗脱，除去未反应的修饰剂。然后用0-50％的含0.5M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 6.5)进行梯度洗脱，以0.5毫升/分钟的流速洗脱30分钟(图2b)。洗脱物用280nm的紫外波长进行检测，收集含有hGH-P10-HD的洗脱峰，并置换成20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)。
(3)hGH-P10的分离纯化
用Q Sepharose HP阴离子交换柱(1.6厘米×2.5厘米，美国GE Healthcare公司)纯化hGH-P10。Q Sepharose HP柱由20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)平衡与洗脱，除去未反应的PEG修饰剂和NaCNBH3。然后用0-30％的含1.0M NaCl的20mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0)进行梯度洗脱，以2.5毫升/分钟的流速洗脱30分钟(图2c)。洗脱物用280nm的紫外波长进行检测，收集含有hGH-P10的洗脱峰，并置换成20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)。
实施例3SDS-PAGE电泳鉴定修饰产物
如图3所示，hGH-P3.5-HD、hGH-P10-HD和hGH-P10在SDS-PAGE电泳图上均表现出一条带，这表明修饰产物具有较高的纯度。电泳带的迁移速率不同，表明分子量不同。迁移速率越慢，表明修饰产物分子量越大。
实施例4鉴定修饰产物hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD的修饰位点
将hGH、hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD于含2.0M脲的0.05M的NH4HCO3(pH 8.2)的缓冲液中充分透析，而后经超滤浓缩至浓度为1.0毫克/毫升。取胰蛋白酶，用超纯水配置浓度为1.0毫克/毫升的储液。按照hGH、hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD分别与胰蛋白酶质量比为1:50的比例，加入胰蛋白酶储液，于37℃孵育14小时。采用三氟乙酸(TFA)终止上述反应，使体系中三氟乙酸的终浓度为1％。酶解产物使用C4反相色谱柱(0.46厘米×25厘米)肽段分离。色谱柱由95％的溶液A(含0.1％TFA的超纯水)和5％的溶液B(含0.1％TFA的乙腈)充分平衡，流速为0.5毫升/分钟。采用线性梯度洗脱的方式，在100分钟内从5％溶液B线性升至50％溶液B，检测214纳米的吸收值。如图4所示，胰蛋白酶可以将修饰产物切成不同的肽段。其中，hGH-P3.5-HD的肽图表明，以T2肽段作为参照，与未修饰的hGH相比，由17个氨基酸残基组成带有N末端的T1肽段消失。这是因为T1段的N-末端经PEG-十六烷修饰后，出峰位置发生改变。这说明了hGH-P3.5-HD的修饰位点为hGH的N-末端。同理可知，hGH-P10-HD的修饰位点也为hGH的N-末端。
实施例5修饰产物的免疫原性分析
将24只6-8周的BALB/c雌鼠随机分为4组，每组6只。A组为hGH组，B组为hGH-P3.5-HD组，C组为hGH-P10-HD组，D组为hGH-P10组。每组注射相对应的样品其中，样品均经皮下注射，分别于第0、7、14天注射一次，注射剂量为50微克(按hGH质量计算)，体积为100微升。第21天后处死小鼠，采集全部血液，于4000rpm离心10分钟，收集血浆。血浆中hGH特异的IgG抗体采用酶联免疫吸附法进行测定，抗体采用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体测定。如图5所示，hGH-P3.5-HD、hGH-P10-HD和hGH-P10组血浆中hGH特异的IgG抗体均低于hGH组，这表明PEG修饰能降低hGH的免疫原性。此外，血清中hGH-P10组hGH特异的IgG抗体低于hGH-P10-HD组，这是由于十六烷为疏水性的脂肪烷，能提高hGH-P10-HD组的免疫原性。
实施例6修饰产物的体外活性分析
表面等离子共振技术可以用来检测修饰产物与生长激素结合蛋白(GHBP)的体外结合活性。首先，将修饰产物置换到20mM磷酸缓冲液(pH 7.2)中。将GHBP溶于10mM醋酸-醋酸钠缓冲液中，固定在CM5芯片上。然后使用BIAcore 3000仪(瑞典Biacore公司)进行测定，测定温度为20℃。结合过程采用不用浓度梯度的样品进行测定，结合过程为3分钟，解离过程为6分钟，流动相的流速为40微升/分钟。再生过程使用15mM NaOH洗脱结合的样品。由1:1朗缪尔结合模型进行分析。hGH的解离速率(kd)值、结合速率(ka)值与解离常数(KD)值分别为8.65×10-4s-1、3.06×104Ms-1和28.3pM。hGH-P10、hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD的kd值分别为9.64×10-4Ms-1、9.98×10-4Ms-1和9.58×10-4s-1，与hGH相比无显著变化。hGH-P10、hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD的ka值分别为1.62×103Ms-1、7.84×103Ms-1和5.10×103Ms-1，与hGH相比分别下降了18.9倍、3.9倍和6.0倍。这表明由于PEG的空间屏蔽作用，PEG修饰降低了hGH与GHBP的结合能力。hGH-P10、hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD的KD值分别为597pM、127pM和188pM，与hGH相比分别增加了21.1倍、4.5倍和8.6倍。这表明十六烷能通过改变PEG的构象来降低PEG对hGH的空间屏蔽作用，从而提高hGH的生物活性。此外，分子量为3.5kDa的PEG的空间屏蔽作用要小于分子量为10kDa的PEG。
实施例7修饰产物药代动力学分析
选取250～300克雄性SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只大鼠。其中，A组为hGH、B组为hGH-P3.5-HD、C组为hGH-P10-HD、D组为hGH-P10组。4组大鼠经皮下单针注射，注射剂量为1毫克hGH/公斤大鼠，体积为500微升。在不同时间范围内进行眼眶采血，离心收集血浆。血浆中的hGH浓度由hGH ELISA定量试剂盒来测定。药代动力学参数，包括半衰期(t1/2)，血浆峰值浓度(Cmax)，峰值出现时间(Tmax)和药物曲线下面积(AUC0-t)等参数使用PKsolver 2.0软件(中国药科大学)进行分析。
如图6所示，hGH实验组的hGH水平在1小时达到峰值，随后被快速清除，24小时以后检测不到hGH。相比之下，hGH-P10,hGH-P3.5-HD和hGH-P10-HD实验组的hGH水平在4小时达到峰值，随后浓度缓慢下降，在72小时以后还能检测到hGH。这表明PEG-十六烷修饰能显著降低hGH的清除速率。hGH实验组的血浆半衰期(T1/2)为1.9小时、血浆浓度峰值(Cmax)为160纳克/毫升、曲线下面积(AUC0-96h)为915(纳克/毫升)/小时。与hGH实验组相比，hGH-P10实验组的Cmax与前者相当，而T1/2增加了3.3倍，AUC0-96h增加了3.1倍。这表明PEG分子能提高hGH的药代动力学特性。与hGH-P10实验组相比，hGH-P10-HD实验组的T1/2增加了2.5倍，Cmax增加了1.2倍，AUC0-96h增加了2.3倍。这表明结合的十六烷能进一步提高hGH的药代动力学特性。与hGH-P10-HD实验组相比，hGH-P3.5-HD实验组的T1/2、Cmax和AUC0-96h均有所下降。这表明PEG分子提高药代动力学特性的能力与其分子量大小呈正相关。
实施例8修饰产物药效动力学分析
选取250～300克雄性SD大鼠30只，随机分为5组，每组6只大鼠。其中，A组为对照组，皮下注射500微升0.15M磷酸缓冲液(pH 7.4)；B组为hGH、C组为hGH-P3.5-HD、D组为hGH-P10-HD、E组为hGH-P10组。B-E组经皮下单针注射，注射剂量为1毫克hGH/公斤大鼠，体积为500微升。在不同时间范围内进行眼眶采血，离心收集血浆。血浆中的胰岛素类生长因子-1(IGF-1)浓度由IGF-1ELISA定量试剂盒来测定。药效动力学参数，包括血浆峰值浓度(Cmax)，峰值出现时间(Tmax)和药物曲线下面积(AUC0-t)等参数使用PKsolver2.0软件(中国药科大学)进行分析。
如图7所示，对照组血浆中显示出一定的IGF-1水平。由于内源IGF-1的存在，修饰产物诱导产生的AUC值减去对照组值的剩余值(ΔAUC)用于评价修饰产物的药效动力学特性。hGH实验组的IGF-1水平在8小时达到峰值，随后逐渐下降；其血浆浓度峰值(Cmax)为1530纳克/毫升、ΔAUC0-96h值为22908(纳克/毫升)/小时。与hGH实验组相比，hGH-P10实验组的IGF-1水平在24小时达到峰值，且其Cmax值增加了1.24倍，ΔAUC值增加了1.56倍。这表明PEG分子能增加hGH的药效动力学性质。与hGH-P10实验组相比，hGH-P10-HD实验组的IGF-1水平在32小时达到峰值，这表明十六烷分子能进一步增加hGH的药效动力学性质。与hGH-P10-HD实验组相比，hGH-P3.5-HD实验组的Cmax值和ΔAUC值均有所下降。这表明PEG分子提高药效动力学特性的能力与其分子量大小呈正相关。

Claims (6)

1.一种聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素，其特征在于，每个人生长激素分子的N-末端定点共价结合且仅结合了1个聚乙二醇-十六烷分子。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素，其特征在于，以聚乙二醇为连接桥，一端连接十六烷，另一端通过醛基基团定点结合在人生长激素的N-末端。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素，其特征在于，其中聚乙二醇的分子量为3.5kDa和10kDa。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素的制备方法，其特征在于聚乙二醇-十六烷与人生长激素发生修饰反应，反应时间为6-48小时，反应温度在4-37℃，反应pH为4.0-7.0，缓冲体系为含0.2M甘露醇的20mM BisTris-盐酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素的制备方法，其特征在于聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素的分离纯化条件为使用mono Q阴离子交换柱进行分离纯化。
6.权利要求1所述的聚乙二醇-十六烷定点修饰的人生长激素应用于治疗儿童矮小症、Turner氏综合症、艾滋病消瘦、大面积创伤等疾病。
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