CN104043107B - 一种治疗肿瘤的药物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤药物及含有这种药物的药物组合物和试剂盒，同时也公开了制备这种抗肿瘤药物的方法。本发明中的抗肿瘤药物具有体内代谢的稳定性，可用于治疗肿瘤或制备抗肿瘤药物。

Description

一种治疗肿瘤的药物及其应用
本申请是申请日为2007年1月19日，申请号为200780010122.7，发明名称为“一种治疗肿瘤的药物及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种具有生物活性和代谢稳定性的含有血管内皮抑制素的复合物和缓释制剂以及它的制备方法。本发明还提供含有这种血管内皮抑制素复合物和缓释制剂的药物组合物以及含有这种血管内皮抑制素复合物的试剂盒。本发明还提供使用本发明中的血管内皮抑制素复合物、缓释制剂、药物组合和试剂盒来预防、诊断、治疗肿瘤，及制备抗肿瘤药物的方法。
背景技术
新生血管形成是指新的毛细血管在原有的血管上的生成。肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管的生成，将肿瘤中的微血管内皮细胞作为癌症治疗的靶点为治疗肿瘤提供了一种治疗方式(Folkman J.N Engl J Med1971;285:1182-1186)。
血管内皮抑制素(Endostatin)是胶原ⅩⅧ羧基端的一段分子量大小为20kDa的酶切产物。1997年美国哈佛大学Judah Folkman教授等人在血管内皮瘤细胞的培养基中发现此蛋白，它具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移，和体内血管生成的活性。进一步实验发现重组血管内皮抑制素可以抑制老鼠体内多种肿瘤的生长、转移，甚至能完全治愈肿瘤，而且不产生耐药性。其发挥活性的机理在于它通过抑制血管内皮细胞的生长，抑制了肿瘤组织附近的新生血管的生成，使得肿瘤组织得不到生长所必需的大量营养和氧气，最后停止生长或坏死(Folkman J.et al.Cell1997;88:277-285;Folkman J.et al.Nature1997;390:404-407)。通过基因工程制备的重组人血管内皮抑制素可以作为肿瘤治疗药物，其临床试验表明它可以有效的抑制肿瘤生长。在中国，以非小细胞肺癌为主要适应症的临床试验表明它对于肿瘤的治疗效果比较突出。
多肽和蛋白质类药物相比于化学药具有毒副作用小，不产生耐药性等优点。为了达到最高的体内活性，提高生物利用度，减少药物体内降解，通常蛋白药物采用静脉给药方式。但是对于分子量小的蛋白来说，通常静脉给药以后的体内半衰期很短。除了体内的蛋白降解过程以外，一个重要的方面是小分子蛋白能够通过肾过滤的途径从体内很快的被消除。在血液中，水力半径超过白蛋白或是分子量大于约66,000道尔顿（66kDa）的蛋白通常可以稳定的保留在循环系统中。但是小分子却会通过肾小球过滤被很快的从血液中消除。所以，为了维持小分子量蛋白在血液中的有效治疗浓度，需要进行频繁的注射或点滴。这种治疗方式虽然能达到治疗的目的，但是却给病人带来了严重的不便与痛苦，提高了用药成本，对某些药物长期的使用还有可能产生一些副作用，例如免疫反应。
作为蛋白药物的血管内皮抑制素同样存在半衰期短，体内清除率高的缺点。目前的临床用药手段主要为频繁的静脉注射或点滴，通常为每天给药，而且需要长期用药，这使得病人的精神和经济负担都比较大。本发明的目的就在于改善该蛋白的体内代谢特征，使其具有更高的稳定性和较长的体内半衰期，甚至具有更高疗效，从而达到可以减少用药频率，降低用药成本，减轻病人的经济负担的目的。
用高分子聚合物对蛋白进行修饰，它是改变和控制药物的动力学特性如半衰期、免疫学特征、毒理特性的常用方法。用来修饰蛋白的高分子聚合物具有水溶性好、生物相容性好、无或弱免疫原性等特征。其中聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)是应用最为普遍的一种蛋白修饰分子。聚乙二醇分子具有两亲性，既可以溶解于水，又可以溶解于大多数的有机溶剂，具有无毒、无免疫原性、在水溶液中有高溶解性等性质，是被包括美国FDA、中国SFDA在内的很多国家的药品管理机构批准的可用于药物制备的高分子。将蛋白质与亲水性的高分子如聚乙二醇偶联，可增加蛋白稳定性、减少非特异性吸附和抗原性。当偶联物达到一定分子量时，可大大降低肾脏的排除效率，是延长蛋白质药物体内半衰期的有效方法(Frokjaer S.et al.Nat.Rev.DrugDiscov.2005Apr4(4):298-306;Harris JM.et al.Nat.Rev.Drug Discov.2003Mar2(3):214-21)。最初的聚乙二醇修饰都是以氨基作为反应位点，主要包括蛋白的N端α-氨基和赖氨酸残基侧链上的ε-氨基。这一类反应的产物是一个蛋白分子与一个或多个PEG分子偶联。对于赖氨酸残基侧链ε-氨基上的修饰也往往因为反应位点不特异而产生修饰后的同分异构体。目前，针对蛋白N端α-氨基和赖氨酸残基侧链ε-氨基的等电点差异，又新开发出了只针对蛋白N端修饰的聚乙二醇修饰试剂，使得修饰位点一致，修饰产物组成均一。另一种可用于聚乙二醇修饰的蛋白位点是半胱氨酸的巯基。由于巯基在蛋白中的数目通常少于氨基，所以这类修饰的位点更加特异。利用基因工程技术，现在可以在蛋白任何部位引入半胱氨酸作为特异的修饰位点。但是此类引入半胱氨酸作为修饰位点也是有一定的局限性，因为对某些本身带有半胱氨酸的蛋白可能会造成二硫键的错配或无法复性。另外蛋白的羧基也是一种常用的修饰位点(Veronese FM et al.Drug Discov.Today.2005Nov1;10(21):1451-8.)。聚乙二醇修饰技术已经成功地运用在许多蛋白类药物上，比较成功的包括：PEG-天冬酰胺酶(PEG-asparaginase)(Graham ML Adv.Drug Deliv.Rev.55,1293–1302Avramis Vassilios I.et al.WO9939732andUS6689762)、PEG-腺酐脱氨酶(PEG-adenosine deaminase)(Levy Y et al.J.Pediatr.113,312–317;Davis S et al.ClinExp.Immunol.46:649-652;HershfieldMS et al.N Engl J Med316:589-596)和PEG-干扰素（PEG-interferonα2a、PEG-interferonα2b等）（Bailon P et al.C.Bioconjug.Chem.12,195–202，WangYS et al.Adv.Drug Deliv.Rev.54,547–570，Meng Xiantai et al.WO2005077421,Van Vlasselaer Peter et al.WO2004076474,Ballon PascalSebastlan et al.US2004030101,Karasiewicz Robert et al.EP0593868）等等。
其他代表性的高分子修饰剂有葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、聚丙氨酸、乙二酸和丙二酸的共聚物、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙烯和顺丁烯二酰肼的共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。
将血液蛋白或其片段作为载体，与药用蛋白偶联或融合表达，从而起到增加蛋白分子量的目的，是另一种延长药用半衰期的方法。例如用免疫球蛋白的Fc片段和目的蛋白偶联以延长其半衰期，例如将此方法用在Notch l受体蛋白(Kitajewsky Jan et al.WO2005111072)、促红细胞生成素(EPO)(GilliesStephen D et al.WO2005063808)、人生长激素(Kim Young Min et al.WO2005047337)等蛋白上。血浆白蛋白也是一种常用的偶联载体，可以运用在抗生素类，消炎类，抗氧化物等蛋白上(Ezrin Alan M et al.WO0117568,Otagiri Masaki et al.EP1571212)。
对于某些血液载体蛋白除了在体外将其与药物蛋白偶联在一起外，还可以先将蛋白药物在体外进行修饰，使之具有化学反应的活性或是对体内其他分子具有较高的亲和力，能够在进入体内以后和血液某些成分进行反应，形成半衰期较长的大分子或是复合物。一个实例是将此技术运用在抗病毒的小肽分子anti-RSV上，将其修饰上带有马来酰亚胺的活性基团，它可以和血液蛋白或是细胞表面蛋白中的巯基反应(Bridon Dominique P et al.WO0069902)。另一个实例是利用酰化反应，在蛋白表面的氨基酸残基上引入脂肪酸，增加蛋白对体内白蛋白的亲和力，使得蛋白进入血液后可以和白蛋白形成较大的复合物，从而达到延长半衰期的目的，这一方法曾用于长效胰岛素上(Kurtzhals P et al.Biochem.J.(1995)312,725-731;Frokjaer S et al.Nat Rev Drug Discov.2005Apr;4(4):298-306)。
另一种延长蛋白体内半衰期的方法是将蛋白做成缓释剂型。将蛋白药物放入一种药用载体中，使得蛋白从载体中缓慢释放，在体内维持一种稳定的药物浓度。常用的方法有水凝胶、微胶囊、微球、微型渗透泵、脂质体等(PeppasNA et al.Eur.J.Pharm.Biopharm.50,27–46(2000)；Packhaeuser CB et al.Eur.J.Pharm.Biopharm.58,445–455(2004)；Metselaar JM et al.Mini Rev.Med.Chem.4,319–329(2002))。脂质体是一种具有双层膜结构的空球形态的超显微粒子。该双层膜由两亲分子多为磷脂构成并有水性的内腔。将亲水性的蛋白药物包裹在脂质体的内腔中，在体内缓慢释放，可以维持蛋白的血药浓度，达到增加半衰期的作用。一些实例包括用在神经生长因子(Hou Xinpu et al.CN1616087)、血红蛋白(Farmer Martha C et al.US4911929)等。
发明概述
本发明提供一种修饰物与血管内皮抑制素形成的复合物，其中所述修饰物能够延长血管内皮抑制素的体内半衰期。用于本发明的修饰物可与血管内皮抑制素通过共价键连接。这些修饰物可选自高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、小分子或其他化学物质。可用于本发明的高分子聚合物例如为聚乙二醇，所述聚乙二醇分子的平均分子量位于1,000到100,000道尔顿之间，优选5,000到40,000道尔顿之间。
根据本发明的一个实施方式，所述复合物的特征为一个血管内皮抑制素分子和一个或多个聚乙二醇分子偶联。
在本发明的由聚乙二醇与血管内皮抑制素形成的复合物中，偶联的位点是血管内皮抑制素的N端α-氨基、赖氨酸残基侧链的ε-氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一种或是他们的组合。优选地，所述偶联位点为血管内皮抑制素N端的α-氨基。
根据本发明的复合物的一个实施方式，血管内皮抑制素分子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管内皮抑制素N端α-氨基或野生型人血管内皮抑制素75、95、106、117、183位的赖氨酸残基侧链上的ε-氨基或其组合。
根据本发明的复合物的一个实施方式，血管内皮抑制素分子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联方法为在血管内皮抑制素分子内部或其N末端或C末端附加半胱氨酸或是含有半胱氨酸的肽链，使得偶联位点为附加的半胱氨酸残基侧链上的巯基。
根据本发明的复合物的一个实施方式，血管内皮抑制素分子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，偶联的位点是血管内皮抑制素天冬氨酸或谷氨酸残基侧链上的羧基。
用于本发明的复合物的蛋白选自白蛋白、免疫球蛋白、甲状腺结合蛋白、转甲状腺蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原或它们的片段。
根据本发明的一个实施方式，所述复合物是白蛋白偶联的血管内皮抑制素，其特征为一个血管内皮抑制素分子和一个或多个白蛋白偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的白蛋白优选人血清白蛋白或其片段。根据本发明的另一个实施方式，所述复合物是免疫球蛋白Fc片段偶联的血管内皮抑制素，其特征为一个血管内皮抑制素分子和一个或多个免疫球蛋白Fc片段偶联，该偶联物可以是通过化学修饰得到的，或是通过融合表达得到的，或是通过其他方法得到的，其中的Fc片段优选人免疫球蛋白IgG中的Fc区域的片段。
本发明的复合物还包括小分子或是小肽或是其他化合物修饰的血管内皮抑制素，其特征是该复合物具有同体内其他分子或成分反应或结合的活性，使得该聚合物可以在体内和其他成分形成更大的复合物。所述具有反应活性的基团可以和血液成分的氨基、羟基、巯基反应形成共价键。这些具有反应活性的基团例如是是马来酰亚胺，它可以和血液成分，例如白蛋白中的巯基反应。这样，本发明的复合物将与血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白有较强的亲和力，能相互形成更大的复合物。
本发明的复合物还包括其他分子或是小肽修饰的血管内皮抑制素，例如血管内皮抑制素被糖基化、磷酸化或酰基化的产物，其中修饰的位点是原来蛋白序列中存在的氨基酸残基，或是通过突变产生的氨基酸残基。
本发明的修饰物与血管内皮抑制素形成的复合物还可以是修饰物与血管内皮抑制素通过非共价键相互作用形成的复合物，其中的修饰物可以是蛋白、小分子或其他化学物质。
本发明的复合物可与生物相容性载体形成缓释制剂。所述缓释制剂的形式可选自微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵或脂质体。
用于本发明的复合物或缓释制剂的血管内皮抑制素可来源于人、鼠、或其他哺乳动物。
根据本发明的一个具体实施方式，复合物或缓释制剂中含有的血管内皮抑制素是野生型的人血管内皮抑制素，其天然形式具有SEQ ID NO.1所示的序列。本发明的复合物或缓释制剂中含有的血管内皮抑制素当由大肠肝菌表达时，其野生型的重组人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.2的序列，其中N末端的Met在大肠肝菌表达时有时会被部分删除，因此相应的重组人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.1的序列。
在本发明的复合物或缓释制剂中，血管内皮抑制素可以是血管内皮抑制素的具有活性的片段、突变体、衍生物、异构体或是它们的组合。优选地，在本发明的复合物或缓释制剂中，血管内皮抑制素片段是具有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、或SEQ ID NO.5序列的肽链。在本发明的一个实施方式中，所述复合物或缓释制剂中的血管内皮抑制素衍生物是在野生型血管内皮抑制素的N端或C端附加一段长度为1-15个氨基酸的肽链形成的。例如，在本发明的复合物或缓释制剂中，血管内皮抑制素衍生物是在野生型人血管内皮抑制素的N端附加一段9个氨基酸组成的含有His-tag的肽链MGGSHHHHH，该衍生物具有SEQ ID NO.6的序列，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met有时会被部分删除，因此相应的衍生物具有SEQ ID NO.7的序列。
本发明还提供药物组合物，其包含本发明的复合物或缓释制剂和药学上可接受的载体。本发明还包括试剂盒，其含有本发明的复合物、组合物或缓释制剂和使用说明。
本发明还提供制备权利要求上述复合物的方法，其特征是用活化的聚乙二醇与血管内皮抑制素混合，在适当的溶液、温度、pH、摩尔比下反应。优选地，该方法中所用的pH为pH3-10。在上述方法中，可将偶联产物例如用阳离子柱纯化或者用分子筛纯化。
本发明也包括上述复合物、缓释制剂、药物组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗肿瘤中的用途，以及其在预防、诊断或治疗其他疾病中的用途，所述疾病的特征为新生血管异常生成而导致人的组织或器官病变。
本发明还提供延长血管内皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含将能够延长血管内皮抑制素的体内半衰期的修饰物与血管内皮抑制素形成复合物的步骤或者包含将血管内皮抑制素或含有血管内皮抑制素的复合物与生物相容的物质形成缓释制剂的步骤。
以下结合附图进一步阐述本发明。应当理解的是，无论是前面的一般性描述还是随后的详细描述以及具体的实施例，均仅用于示例和解释本发明，而无意于对要求保护的发明进行限制。
附图说明：
图1：显示野生型人血管内皮抑制素的氨基酸序列SEQ ID NO.1。
图2：显示一种大肠杆菌表达的野生型重组人血管内皮抑制素的氨基酸序列SEQ ID NO.2。这里N末端的Met在表达后有时会被部分删除。若此情况发生，N末端的Met删除后的重组人血管内皮抑制素将具有SEQ ID NO.1的序列。
图3：显示一种具有活性的血管内皮抑制素片段的序列SEQ ID NO.3。
图4：显示一种具有活性的血管内皮抑制素片段的序列SEQ ID NO.4。
图5：显示一种具有活性的血管内皮抑制素片段的序列SEQ ID NO.5。
图6：显示一种具有活性的N端附加氨基酸的重组人血管内皮抑制素的氨基酸序列SEQ ID NO.6(图6A)。这里N末端的Met在表达后有时会被部分删除。若此情况发生，N末端的Met删除后的重组人血管内皮抑制素将具有SEQ ID NO.7的序列(图6B)。
图7：20kDa聚乙二醇与具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素的N端的偶联。反应前后溶液用SDS-PAGE检测，泳道1：20kDa聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素；泳道2：未修饰的血管内皮抑制素；泳道3：蛋白分子量标准。
图8：20kDa聚乙二醇与具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素的N端的偶联。修饰前后溶液用SDS-PAGE检测，泳道1：未修饰血管内皮抑制素；泳道2：20kDa聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素；泳道3：蛋白分子量标准。
图9：20kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素的N端后用阳离子柱SP纯化。使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果。泳道1：纯化前；泳道2：上样穿透的溶液；泳道3～10：分布收集的洗脱液。
图10：20kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素的N端后用阳离子柱SP纯化。使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果。泳道1：纯化前；泳道2：上样穿透的溶液；泳道3～8：分布收集的洗脱液。
图11：40kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素的N端后用阳离子柱SP纯化。使用阳离子柱SP吸附蛋白，再用氯化钠梯度溶液洗脱，最后用还原SDS-PAGE检测纯化效果。泳道1：纯化前；泳道2：上样穿透的溶液；泳道3～10：分布收集的洗脱液。
图12：20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物抑制血管内皮细胞迁移的活性。SEQ2：具有SEQ ID NO.2的血管内皮抑制素；PEG-SEQ2：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.2的血管内皮抑制素；SEQ6：具有SEQ ID NO.6的血管内皮抑制素；PEG-SEQ6：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.6的血管内皮抑制素。
图13：20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物抑制小鼠S180肉瘤的活性。SEQ2：具有SEQ ID NO.2的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ2-1：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.2序列的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ2-2：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ IDNO.2序列的血管内皮抑制素每两天给药；PEG-SEQ2-3：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.2序列的血管内皮抑制素每三天给药；SEQ6：具有SEQ ID NO.6的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ6-1：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.6序列的血管内皮抑制素每天给药；PEG-SEQ6-2：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.6序列的血管内皮抑制素每两天给药；PEG-SEQ6-3：20kDa聚乙二醇修饰的具有SEQ ID NO.6序列的血管内皮抑制素每三天给药。
图14：20kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基侧链的ε-氨基后用分子筛纯化。泳道1：上样；泳道2～10：分布收集的洗脱液。
图15：20kDa聚乙二醇修饰具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基侧链的ε-氨基后用阳离子柱CM纯化。泳道1：上样；泳道2：穿透；泳道3～8：分布收集的洗脱液。
发明详述
本发明提供一种具有较长半衰期的血管内皮抑制素产品，其在保持抑制血管生成的活性的同时，比未修饰的血管内皮抑制素在代谢上具有更高的稳定性和更长的体内半衰期。本发明中的血管内皮抑制素优选人血管内皮抑制素。
本发明的一个具体实施方案涉及一种修饰物与血管内皮抑制素形成的复合物。术语“复合物”在本发明中是指修饰的血管内皮抑制素。血管内皮抑制素与修饰物通过共价键相连，或是通过非共价键相互作用形成稳定的复合物。因此，术语“修饰”既可以是共价键方式的连接，也可以是非共价键方式的连接。修饰物可以是通过化学偶联的方法连接到血管内皮抑制素上的，也可以是通过融合表达的方式和血管内皮抑制素连接到一起的。优选的方案中这种修饰是位点特异性的，不会影响血管内皮抑制素的生物活性，例如与受体的结合。该修饰产物具有抗新生血管生成的活性但相比于未修饰的血管内皮抑制素在代谢上更稳定，具有更长的血液半衰期，可以作为抗新生血管生成或抗肿瘤的药物。用于修饰的分子可以是一种或多种生物相容，能增加血管内皮抑制素的血液半衰期的高分子聚合物、蛋白质分子或其片段、肽链、或者是其他化学物质。
这里的高分子聚合物，可以有它自己的生物活性，也可以没有生物活性。合适的聚合物包括，但不仅限于聚烯醇类化合物、聚醚类化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、二乙烯基醚与马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基-甲基丙烯酰胺(N-(2-Hydroxypropyl)-methacrylamide)、多聚糖类、聚氧乙基多醇(polyoxyethylated polyol)、肝素或肝素片段、聚烃基乙二醇及其衍生物、聚烃基乙二醇及其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚、聚羟乙基天冬酰胺(a,P-Poly((2-hydroxyethyl)-DL-aspartamide))、聚羧酸脂(polycarboxylates)、氧化乙烯和甲醛的共聚物(poly oxyethylene-oxymethylenes)、聚丙烯酰吗啉(polyacryloylmorpholines)、氨基化合物与氧化烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧化物(polyoxiranes)、乙二酸与丙二酸的共聚物、聚1,3-乙二醇次甲基醚、乙烯/顺丁烯二酰肼共聚物、多聚唾液酸、环糊精等。
上述的聚烯醇类化合物包括，但不仅限于聚乙二醇（包括单甲基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇等）、聚乙烯醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇等以及它们的衍生物。在一个优选的方案中，修饰物是聚乙二醇。一个更优选的方案中，聚乙二醇选用单甲基聚乙二醇。
上述的聚醚类化合物包括，但不仅限于聚烷撑二醇(HO((CH2)xO)nH)、聚丙二醇、聚氧化乙烯(HO((CH2)2O)nH)、聚乙烯醇((CH2CHOH)n)等以及它们的衍生物。
上述的聚氨基酸包括，但不仅限于同种氨基酸的聚合物，两种或两种以上的氨基酸的共聚物，例如：聚丙氨酸。
上述的多聚糖类包括，但不仅限于葡聚糖及葡聚糖衍生物如硫酸葡聚糖、纤维素及纤维素的衍生物（包括甲基纤维素和羧甲基纤维素）、淀粉及淀粉衍生物、聚蔗糖等。
这里适合用作修饰载体的蛋白分子优选天然存在的蛋白或是其片段，包括但不仅限于甲状腺结合蛋白（thyroxine-binding protein）、转甲状腺蛋白（transthyretin）、转铁蛋白（transferrin）、纤维蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白等以及它们的片段。上述的载体蛋白优选为人源的。上述蛋白的片段是指任何比该蛋白小但是保持了载体功能的部分。
血管内皮抑制素与上述修饰物直接或间接共价相连，直接连接指的是血管内皮抑制素的某一个氨基酸和载体蛋白的某一氨基酸直接相连，可以通过肽键或二硫键。间接相连指的血管内皮抑制素和载体蛋白通过一定的化学基团或几个基团的组合连接。
对于血管内皮抑制素曾有文章公开了使用聚乙二醇修饰的方案。牟国营等（2005）和杨胜林等（2005）提到采用平均分子量为6或10kDa的PEG分子修饰血管内皮抑制素，其修饰物是偶联在血管内皮抑制素赖氨酸残基侧链ε-氨基上的，并且为多个位点修饰的混合产物。在使用中虽然可以通过分子筛或是离子交换柱纯化得到某一分子量范围的产物但是产物也存在修饰位点不均一，蛋白构象不均一的缺点，这是由这类修饰试剂的反应特性所决定的。而且这种对蛋白的多点修饰，会使得某些内部氨基酸的构像发生变化，造成蛋白活性的降低。对于生物制品药物来说，产物的均一性对于药物毒性，免疫原型的降低都是十分重要的，而且在质量控制上，混合物很难保证药物每批生产质量均一，药效稳定。因此保证药物成分固定，构像均一，活性稳定，是在设计和生产药物是需要重要考虑和亟待解决的问题。
本发明的一个具体实施方案涉及聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素，其特征为一个血管内皮抑制素分子和一个或多个聚乙二醇分子偶联。偶联的位点是蛋白的N端α-氨基、赖氨酸残基侧链的ε-氨基、半胱氨酸的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一种或是他们的组合。所有用于偶联的聚乙二醇分子可以是线性的，也可以是分叉的，分子量位于1,000到100,000道尔顿之间，优选5,000到40,000道尔顿。本发明中所述的聚乙二醇的分子量是指大约的平均的分子量。
聚乙二醇修饰虽然改变药物代谢特性的优势，但是通常这种修饰也会使得大分子药物的生物活性降低，主要原因是在于不同的修饰位点对药物本身的结构的改变和对活性部位的屏蔽[Veronese F.,et al.Drug Discovery Today,10,21,2005]。例如用不同的PEG化修饰试剂对干扰素β-1b进行修饰后，不同修饰手段均导致修饰后的干扰素的活性的降低，最优的方案也仅仅达到原蛋白活性的71%，有些修饰方式甚至使得蛋白几乎没有活性（Filpula D.,et al.Bioconjugate Chem.2006,17,618-630）。所以虽然修饰改变了药代学特征，但是对药物本身的活性保持却不利，所以通常在选择修饰方法和修饰试剂时，都需要综合考虑这两方面的因素，使得药物在体内的综合效果最好。在本发明的一个优选方案中，使用蛋白N端特异的聚乙二醇修饰试剂(mPEG-ButyrALD，Nektar)来修饰重组人血管内皮抑制素。其产物为一个聚乙二醇与一个重组人血管内皮抑制素相连，连接位点为蛋白的N端α-氨基。在文献（Filpula D.,et al.Bioconjugate Chem.2006,17,618-630）中，使用相同的该试剂，得到的N端修饰的聚乙二醇干扰素β-1b的体外活性只有原始蛋白活性的70%左右。在本发明中，我们惊奇的发现N端修饰的重组人血管内皮抑制素其产物在体外细胞学实验中，对内皮细胞的迁移的抑制率是未修饰蛋白的2倍或以上，既蛋白的生物活性有了很大的提高，这种体外活性明显增加的现象尚未见报道。而牟国营等（2005）得到的多修饰的内皮抑制素的体外活性明显的随着修饰反应的进行而逐渐降低。这说明利用本发明涉及到反应和纯化方法所的得到的产物比相关报道有更好的体外活性。而另一方面，通过对人血管内皮抑制素进行结构分析人们发现，在人血管内皮抑制素的N末端有一个锌离子的结合位点，由野生型人血管内皮抑制素中的第1，3，11，76位的氨基酸组成，据文献（Ding,Y.H.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,10443-10448；Hohenester,E.,EMBO J.17,1656-1664；Boehm,T.,Biochem.Biophys.Res.Commun.252,190-194；Ricard-Blum,S.,J.Biol.Chem.279,2927-2936；Tjin Tham Sjin,R.M.,Cancer Res.65(9):3656-63。）报道，该结合位点对人血管内皮抑制素的稳定性和活性至关重要，甚至是人血管内皮抑制素发挥活性时与受体相结合的部位。由于PEG是一个分子量很大的分子，空间位阻很大，通常认为对蛋白的化学修饰不宜在蛋白的活性位点进行，因为这样对蛋白结构的破坏作用很大，进而对蛋白的活性会有很大的影响。但是本发明的这个产物不但没有活性的丧失，反而出乎意料的显示出更高的活性，这在现有的知识背景下很难预测。
本发明的一个具体实施方案涉及血管内皮抑制素和蛋白或肽链的偶联，其特征为血管内皮抑制素与一个或多个蛋白或肽链直接或间接相连，当与多个载体蛋白相连时，所选的载体蛋白之间可以相同也可以是不同的。其中的载体蛋白优选天然存在的蛋白或是其片段。一个优选的方案中用于修饰的载体蛋白为人血清白蛋白或其片段。在另一个优选的方案中的载体蛋白为人免疫球蛋白IgG的Fc片段。
本发明的另一个具体实施方案中的修饰物为小分子或是小肽或是其他化合物，其特征为能使含有内皮抑制素的复合物具有和血液某些成分反应的能力或是和血液某些成分有较强的亲和力。一种具体化的产物是它具有一个反应活性的基团，可以和血液成分的氨基、羟基、巯基反应形成共价键。另一个具体化产物的活性基团是一个马来酰亚胺，它可以和血液蛋白，例如白蛋白中的巯基反应。另一个具体化产物是具有和血液某些成分，例如白蛋白、免疫球蛋白等有较强的亲和力，可以与之形成一种更大的复合体。
本发明的另一个具体实施方案中的复合物，是其他小分子或是小肽修饰的血管内皮抑制素，可以是血管内皮抑制素被糖基化、磷酸化、酰基化等后的产物。其中修饰的位点可以是原来蛋白序列中存在的氨基酸，也可以是通过突变产生的氨基酸残基。该复合物虽然没有很大的分子量，但是因为修饰改变了血管内皮抑制素的性质从而延长了其半衰期。
本发明的另一个具体的实施方案涉及一种含有内皮抑制素的复合物，它是由血管内皮抑制素和其他分子通过非共价键形成的具有特定组成的复合物分子，其中的修饰物可以是蛋白，小分子等。该复合物具有抑制血管生成的活性，并且在体内有比血管内皮抑制素更长的半衰期。
本发明的另一个具体的实施方案涉及一种含有血管内皮抑制素的缓释制剂，它是由血管内皮抑制素或上述的任一复合物和生物相容的物质形成的。该组合物中的血管内皮抑制素仍然具有生物活性，但是却可以依靠该载体改变药物代谢特征达到延长体内保留时间的目的。所述的缓释制剂为但不仅限于微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵、脂质体等。
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物或缓释制剂与药学上可接受的载体形成的药物组合物。本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物或缓释制剂和使用说明组成的试剂盒。
本文使用的药学上可接受的载体包括对于以所用剂量和浓度与其接触的细胞或哺乳动物无毒的药用上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂。通常生理学上可接受的载体是含水的pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的例子包括诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸在内的缓冲液；包括抗坏血酸在内的抗氧化剂；低分子量(不超过10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白等蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性多聚体；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；单糖、二糖和包括葡萄糖、甘露糖、或糊精等其他糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇等糖醇；诸如钠等成盐反离子；和/或诸如聚乙二醇(PEG)、和等非离子表面活性剂。赋形剂优选是无菌的且一般不含不良物质。这些组合物可通过常规的熟知灭菌技术进行灭菌。
本发明还涉及到制备上述血管内皮抑制素产品的方法。特别的，制备聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素的方法，即将活化的聚乙二醇与血管内皮抑制素混合，在适当的溶液、温度、pH、摩尔比下反应，并用阳离子柱或是分子筛纯化偶联产物。其中反应的pH优选pH3-10之间。
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物、缓释制剂、药物组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗肿瘤中的用途。本方法适合的癌症包括但不仅限于肺癌、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、胆癌、恶性黑色素肿瘤等。
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物、药物组合物或缓释制剂在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明还提供一种上述含有血管内皮抑制素的复合物、缓释制剂、药物组合物或试剂盒在预防、诊断或治疗其他疾病和制备治疗这些疾病的药物中的用途，所述疾病的特征为但不限于新生血管异常生成而导致人的组织或器官病变。
在上述的治疗肿瘤或其他疾病的用途中，其中的给药方式选自静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、透皮吸收、皮下包埋、肝动脉注射、口服、鼻粘膜给药、口腔粘膜给药、眼部给药、直肠给药、阴道给药或其他临床给药方式。
本发明还提供一种延长血管内皮抑制素半衰期的方法，所述方法包含将修饰物与血管内皮抑制素形成复合物的步骤和制备含有血管内皮抑制素的缓释制剂的步骤。
实验表明，本发明中的一个产品聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的复合物，具有抑制血管内皮细胞迁移和小鼠肿瘤生长的活性，与未修饰的人血管内皮抑制素相比，活性明显提高，并且体内药代学研究表明修饰产物能有效的减缓药物在体内的代谢，延长体内半衰期。
本发明中提到的血管内皮抑制素，除了特别说明以外，其来源可以是人，鼠，或其他哺乳动物，其中的优选方案是人血管内皮抑制素。发明中提到的血管内皮抑制素，除特殊说明以外，包括野生型的血管内皮抑制素，即体内自然存在的形式，或是其具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物等或是它们的组合。血管内皮抑制素的来源可以是但不仅限于动物细胞表达的，也可以是从酵母或大肠肝菌中发酵纯化而来的。其中来源于动物细胞表达的野生型的人血管内皮抑制素的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；来源于酵母表达的重组人血管抑制素具有SEQ ID NO.1的序列，或是在此序列的N端有10个氨基酸以内的增加或缺失；来源于大肠肝菌表达的重组人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.2的序列，但其N末端的Met在表达后有时会被部分删除。若此情况发生，N末端的Met删除后的重组人血管内皮抑制素将具有SEQ ID NO.1的序列。
血管内皮抑制素的突变体指的是通过氨基酸的取代、缺失、增加而得到的血管内皮抑制素分子。血管内皮抑制素的片段是指序列属于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的任何更小的部分，可以是但不限于通过酶切得到的，或是基因工程表达的，或是通过多肽合成的方法得到的。例如具有SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5序列的片段曾被报道具有抑制小鼠实体瘤的活性（Cattaneo MG et al.Experimental Cell Research283(2003)230–236；TjinTham Sjin RM et al.Cancer Research(2005)65(9)3656-3663）。血管内皮抑制素的异构体是指具有和野生型血管内皮抑制素相同的氨基酸序列或分子式，但是却有不一样的构象，包括蛋白二级或三级结构的不同或是局部氨基酸旋光性的改变，异构体的来源可以是天然存在的突变或是通过人为设计而得到的。血管内皮抑制素的衍生物是指在野生型血管内皮抑制素的基础上进行修饰的产物，其中的修饰是指在蛋白上共价连接一个或多个其他小分子，例如磷酸分子、糖分子等，或是20个氨基酸以内的小肽链，连接位点可以是蛋白内的任意一个氨基酸。在一个优选的方案中，可以是N端附加一段9个氨基酸组成的含有His-tag的肽链MGGSHHHHH的人血管内皮抑制素，其具有SEQ ID NO.6的序列(Luo Yongzhang et al.US2004110671)，当由大肠杆菌表达时其N末端的Met在表达后有时会被部分删除。若此情况发生，N末端的Met删除后的重组人血管内皮抑制素衍生物将具有SEQ ID NO.7的序列。血管内皮抑制素具有活性的突变体、片段、异构体、衍生物的组合是指同时具有两种或两种以上上述特征的变化的产物，例如但不仅限于片段的突变体、突变体的修饰产物等。
实施例
实施例1、20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端的偶联
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体为将重组人血管内皮抑制素（北京普罗吉生物科技发展有限公司）透析到pH5.5的30mM醋酸钠溶液中。用紫外分光光度计（Agilent Technologies）在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到2mg/ml。与20kDa的特异修饰蛋白N端的聚乙二醇(mPEG-ButyrALD20kDa,Nektar)偶联时，取20ml上述蛋白溶液（含蛋白40mg），加入20kDa聚乙二醇固体80mg，并室温搅拌，直到完全溶解，使得聚乙二醇与血管内皮抑制素的摩尔比为2:1。加入还原剂CH3BNNa（Sigma）,浓度为20mM，并最后调节溶液的pH值为5。室温静置10小时以后大于80%的血管内皮抑制素被单一聚乙二醇修饰，即一个聚乙二醇与一个血管内皮抑制素分子偶联，并且偶联的位点是血管内皮抑制素N端的α-氨基，少量血管内皮抑制素会被非特异性的多位点修饰。这时反应液可直接用于上柱纯化。反应前后溶液电泳结果如附图7和8所示。
实施例2、20kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素N端后用阳离子柱SP纯化
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方式为将20kDa聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素用SP层析柱（Amersham）纯化。将反应后的混合液调节pH为6。层析柱用含有10mM磷酸盐，pH值为6.0的平衡缓冲液平衡后上样。上样后再用含有10mM磷酸盐，1M氯化钠，pH6.0的洗脱缓冲液梯度洗脱，未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和冲洗的过程中出现，洗脱出峰的顺序为多修饰的血管内皮抑制素、单修饰的血管内皮抑制素、未修饰的血管内皮抑制素。根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组分。纯化结果如附图9和10所示。
实施例3、40kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端的偶联
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方式为将重组人血管内皮抑制素透析到pH5.5的30mM醋酸钠溶液中。用紫外分光光度计在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到2.5mg/ml。与40kDa的特异修饰蛋白N端的聚乙二醇(mPEG-ButyrALD40kDa,Nektar)偶联时，取20ml上述蛋白溶液（含蛋白40mg），加入40kDa聚乙二醇固体160mg，并室温搅拌，直到完全溶解，使得聚乙二醇与血管内皮抑制素的摩尔比为2:1。加入还原剂CH3BNNa（Sigma）,浓度为20mM，并最后调节溶液的pH值为5。室温静置10小时以后大于80%的血管内皮抑制素被单一聚乙二醇修饰，即一个聚乙二醇与一个血管内皮抑制素分子偶联，并且偶联的位点是蛋白N端的α-氨基，少量血管内皮抑制素会被非特异性的多位点修饰。这时反应液可直接用于上柱纯化。
实施例4、40kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素N端后用阳离子柱SP纯化
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方式为将40kDa聚乙二醇血管内皮抑制素偶联物用SP层析柱（Amersham）纯化。将反应后的混合液调节pH为6。层析柱用含有10mM磷酸盐，pH值为6.0的平衡缓冲液平衡后上样。上样后再用含有10mM磷酸盐，1M氯化钠，pH6.0的洗脱缓冲液梯度洗脱，未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和冲洗的过程中出现，洗脱出峰的顺序为多修饰的血管内皮抑制素、单修饰的血管内皮抑制素、未修饰的血管内皮抑制素。根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组分。具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素纯化结果如附图11所示，具有SEQ ID NO.6序列的纯化结果与SEQ ID NO.2序列的纯化结果类似，在此省略。
实施例5、20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物在血液中的长效效应
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。测量聚乙二醇修饰和未修饰的重组人血管内皮抑制素在小鼠体内的半衰期来检验聚乙二醇修饰后的长效效益。选用6只25g左右体重的健康昆明种小鼠（维通利华实验动物中心），分为两组，每组3只，分别尾静脉注射未修饰的重组人血管内皮抑制素（北京普罗吉生物科技发展有限公司）和20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物，剂量为15mg/kg体重。按照2、10、30分钟、1、2、4、8、16、24、36、48、72小时的时间间隔尾静脉取血。收集血浆，用夹心法ELISA分别测血管内皮抑制素和聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素的浓度。体内药代动力学显示20kD聚乙二醇修饰后，具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素在小鼠体内的半衰期从平均4.8小时增加到平均16小时。具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素经修饰以后在小鼠体内的半衰期从平均7.5小时增加到平均16小时这表明偶联高分子量的聚乙二醇能有效的增加重组人血管内皮抑制素的体内代谢的半衰期，达到长效的目的。
实施例6、20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物抑制血管内皮细胞迁移的活性
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方案为将人血管内皮细胞（HMEC）在含10%血清的DMEM培养基（Hyclone）中培养至对数生长期。然后饥饿细胞12小时。将细胞用胰酶（Sigma）消化以后，加入测细胞迁移的皿中，每孔细胞数10000个。迁移条件为DMEM培养基、1%血清、10ng/mlbFGF（Sigma）和双抗（链霉素和氨苄青霉素各自10μg/ml,Sigma）。对于加药组分别加入血管内皮抑制素和修饰后的血管内皮抑制素，浓度为30μg/ml。37℃培养8小时以后，取出小皿，用1%戊二醛固定细胞，刮掉膜上层的未迁移细胞，用苏木精对下层细胞染色。最后在显微镜（Olympus）下，取相同大小视野数细胞数。同一块皿中选取三个不同视野，最后算出抑制率。结果显示具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素对细胞迁移的抑制率为42%，修饰后对细胞迁移的抑制率达到90%。具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素对细胞迁移的抑制率为45%，修饰后对细胞迁移的抑制率达到88%。以上结果表明经过聚乙二醇修饰后的血管内皮抑制素不仅保持而且还大大增强了生物活性。实验结果如图12所示。
实施例7、20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物在小鼠肿瘤模型治疗中的活性
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。实验观察了20kDa聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素对小鼠S180肿瘤的体内抑制活性。实验材料选用20g体重的昆明小鼠，分别腋下接入S180肉瘤细胞（中国细胞库QK10952），每只接入细胞数2×106个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（血管内皮抑制素1.5mg/kg体重，每天给药）、三组给药组（聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素1.5mg/kg体重，分别为每天，每两天，每三天给药）。分组后开始给药，给药方式为尾静脉注射。给药周期为10天，第11天处死小鼠，称瘤重，以抑瘤率来评价药效，计算方法为：抑瘤率=（阴性对照组瘤重-给药组瘤重）/阴性对照组瘤重×100%。对于具有SEQ ID NO.2序列的重组人血管内皮抑制素，实验结果显示：阳性对照组的抑瘤率为34%，给药组每天，每两天，每三天给药的抑瘤率分别为：47%，53%，40%。对于具有SEQ ID NO.6序列的N端附加氨基酸的重组人血管内皮抑制素，实验结果显示：阳性对照组的抑瘤率为40%，给药组每天，每两天，每三天给药的抑瘤率分别为：45%，57%，50%。表明修饰后的重组人血管内皮抑制素具有体内的抑瘤活性，而且由于其体内代谢速度减慢，使得药效优于未修饰的重组人血管内皮抑制素，并且在延长给药间隔的情况下仍能保持药效优于未修饰的重组人血管内皮抑制素。实验结果如图13所示。
实施例8、20kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基侧链的ε-氨基
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方式为将重组人血管内皮抑制素透析到pH7.8的30mM磷酸缓冲液中。用紫外分光光度计在280nm波长下测量蛋白浓度，然后将浓度调节到2mg/ml。加入20kDa的修饰赖氨酸残基侧链ε-氨基的聚乙二醇(mPEG-SPA20kDa,Nektar)分子，使得聚乙二醇分子与蛋白的摩尔比分别为8：1。室温放置。重组人血管内皮抑制素能被较快的修饰，30分钟以后80%的血管内皮抑制剂能被修饰，随着反应时间增长，修饰物产量增多，但反应速度在1小时以后减慢。反应产物主要有单分子聚乙二醇修饰和多分子聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素。这时反应液可直接用于上柱纯化。
实施例9、20kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基侧链的ε-氨基后用分子筛纯化
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方式为将20kDa聚乙二醇血管内皮抑制素偶联物用分子筛纯化。将反应后的混合液调节pH为7.4。层析柱用含有20mM磷酸盐，100mM氯化钠，pH值为7.4的平衡缓冲液平衡后上样。根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组分。具有SEQ IDNO.6序列的血管内皮抑制素的修饰产物的纯化结果如附图14所示。
实施例10、20kDa聚乙二醇修饰重组人血管内皮抑制素赖氨酸残基侧链的ε-氨基后用离子柱纯化
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素包括具有SEQ ID NO.2和SEQID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。具体实施方式为将20kDa聚乙二醇血管内皮抑制素偶联物用CM层析柱纯化。将反应后的混合液调节pH为6.5。层析柱用含有10mM磷酸盐，pH值为6.5的平衡缓冲液平衡后上样。上样后再用含有10mM磷酸盐，1M氯化钠，pH6.5的洗脱缓冲液梯度洗脱。未反应的聚乙二醇由于带电荷极少，所以在穿透和冲洗的过程中出现，洗脱出峰的顺序为多修饰的血管内皮抑制素，单修饰的血管内皮抑制素，未修饰的血管内皮抑制素。根据280nm的紫外检测可以收集不同的分离组分。具有SEQ ID NO.6序列的血管内皮抑制素的修饰产物的纯化结果如附图15所示。
实施例11、20kDa聚乙二醇与重组人血管内皮抑制素N端偶联的产物在小鼠肿瘤模型治疗中的活性
本实施例涉及的重组人血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.6序列的重组人血管内皮抑制素。实验观察了20kDa聚乙二醇(mPEG-ButyrALD20kDa,Nektar)修饰的血管内皮抑制素增加给药间隔时间的条件下对小鼠S180肿瘤的体内抑制活性。实验材料选用20g体重的昆明小鼠，分别腋下接入S180肉瘤细胞，每只接入细胞数2×106个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（血管内皮抑制素1.5mg/kg体重，每5天给药）、四组给药组（聚乙二醇修饰的血管内皮抑制素1.5mg/kg体重，分别为每5天，每7天，每10天，每14天给药）。接瘤后次日开始给药，给药方式为尾静脉注射。给药周期为14天，第15天处死小鼠，称瘤重，以抑瘤率来评价药效，计算方法为：抑瘤率=（阴性对照组瘤重-给药组瘤重）/阴性对照组瘤重×100%。对于具有SEQ ID NO.6序列的N端附加氨基酸的重组人血管内皮抑制素，实验结果显示：阳性对照组的抑瘤率为34%，给药组每5天，每7天，每10天，每14天给药的抑瘤率分别为：56.4%，37.1%，31.8%，0%。表明修饰后的重组人血管内皮抑制素在该剂量下延长时间到每10天给药仍然具有一定的体内抑瘤活性。

Claims (14)

1.制备具有延长的体内代谢半衰期和提高的抗肿瘤疗效的血管内皮抑制素复合物的方法，其包括将活化的聚乙二醇分子与血管内皮抑制素在溶液中混合，使得聚乙二醇分子与血管内皮抑制素的摩尔比为2:1，从而将一个血管内皮抑制素与一个聚乙二醇分子通过偶联反应形成复合物，其偶联位点为血管内皮抑制素N端的α-氨基，其中所述聚乙二醇为平均分子量为5kDa至40kDa的单甲基聚乙二醇，且其中偶联反应的pH在3-10之间。
2.权利要求1的方法，其中血管内皮抑制素是哺乳动物来源的。
3.权利要求2的方法，其中血管内皮抑制素是人或鼠来源的。
4.权利要求2的方法，其中血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2所示的序列。
5.权利要求2的方法，其中血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、或SEQ ID NO.5的序列。
6.权利要求2的方法，其中血管内皮抑制素具有SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7的序列。
7.权利要求1的方法，其中聚乙二醇为线性聚乙二醇或分叉聚乙二醇。
8.权利要求1的方法，其中聚乙二醇分子的平均分子量为20kDa至40kDa。
9.权利要求8的方法，其中聚乙二醇为mPEG-ButyrALD。
10.权利要求1-9中任一项的方法，进一步包括用阳离子柱或是分子筛纯化所述复合物。
11.通过权利要求1-10中任一项的方法制备的血管内皮抑制素复合物。
12.一种药物组合物，其包含权利要求11的血管内皮抑制素复合物以及药学上可接受的载体。
13.权利要求11的血管内皮抑制素复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述肿瘤选自肺癌、神经内分泌瘤、结肠癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、肉瘤、肾癌、胆癌和恶性黑色素肿瘤。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104961831B (zh) * 2007-09-05 2020-06-23 江苏先声药业有限公司 一种修饰的重组人内皮抑素及其应用
CN101396347B (zh) * 2007-09-27 2011-12-14 江苏先声药物研究有限公司 一种重组人血管内皮抑制素缓释微球的制备方法
CN101265298B (zh) * 2008-04-30 2011-11-09 中国药科大学 含有非天然氨基酸的内皮抑素突变体及其衍生物
CN101642559B (zh) * 2008-06-30 2012-08-01 江苏先声药物研究有限公司 含微粉化人血管内皮抑制素的药物组合物
US8507441B2 (en) 2009-10-22 2013-08-13 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Systems of Higher Education Use of endostatin peptides for the treatment of fibrosis
JP2013523726A (ja) * 2010-04-01 2013-06-17 オンコレナ エービー 腎細胞癌の改良された治療
CN101890155B (zh) * 2010-05-25 2012-07-25 江苏先声药物研究有限公司 一种药物组合物及其应用
CN102698270B (zh) * 2011-03-28 2016-02-03 清华大学 一种增强靶细胞摄取治疗剂的方法和药物组合物
AU2012306826B2 (en) * 2011-09-09 2018-01-04 Beijing Protgen Ltd. Endostatin mutants with mutations at ATP binding sites
CN104926933B (zh) * 2014-03-19 2018-09-07 北京仁和天通生物科技有限公司 Endostatin突变体、Endostatin突变体与聚乙二醇的交联物以及它们的应用
CN104031261B (zh) * 2014-06-20 2017-10-27 电子科技大学 温敏性共聚物及其水凝胶体系
CN104174015A (zh) * 2014-08-22 2014-12-03 广州安辰医药科技有限公司 疫苗组合物及其在肿瘤治疗中的用途
CN104515768B (zh) * 2014-08-29 2017-01-25 湖南新大陆生物技术有限公司 一种肿瘤特异性生长因子检测试剂盒
CN104771603B (zh) * 2015-04-17 2018-05-18 张坤镛 一种改善唾液酸异常的中药口服药及制备方法
CN106928454B (zh) * 2015-12-30 2021-07-20 北京大学 聚氨基酸化合物
CN105646701B (zh) * 2016-03-29 2019-03-05 徐根兴 不同氨基酸结构的重组人内皮抑素蛋白及其制备方法和应用
CN107865824B (zh) * 2016-09-28 2020-04-03 山东先声生物制药有限公司 一种稳定的重组人血管内皮抑制素皮下注射组合物
WO2018086603A1 (zh) * 2016-11-10 2018-05-17 北京普罗吉生物科技发展有限公司 聚乙二醇化血管内皮抑制素类似物及其应用
WO2019024814A1 (zh) 2017-07-30 2019-02-07 清华大学 抑制dna依赖蛋白激酶催化亚基的药物
CN109503700A (zh) * 2017-09-14 2019-03-22 南京安吉生物科技有限公司 马来酰亚胺基团修饰的血管生成抑制剂hm-1及其应用
CN110870869A (zh) * 2018-08-31 2020-03-10 成都夸常奥普医疗科技有限公司 包含糖类营养素和常规无效化合物的药物组合物及其应用
CN117460533A (zh) * 2021-01-26 2024-01-26 清华大学 血管内皮抑制素在治疗和预防冠状病毒相关疾病中的应用
CN113350576A (zh) * 2021-05-21 2021-09-07 上海大学 快慢交联互补的双网络自愈合可注射水凝胶及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1443194A (zh) * 2000-05-16 2003-09-17 博尔德生物技术公司 含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4911929A (en) 1986-08-29 1990-03-27 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Blood substitute comprising liposome-encapsulated hemoglobin
AU5858690A (en) * 1989-06-14 1991-01-08 Cetus Corporation Polymer/antibiotic conjugate
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US6689762B1 (en) 1998-02-09 2004-02-10 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for treatment of HIV infection
ZA991029B (en) 1998-02-09 1999-09-30 Rhone Poulenc Rorer Pharma Composition and methods for treatment of hiv infections.
EP2599503B1 (en) * 1998-10-16 2017-05-17 Biogen MA Inc. Polymer conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
US7582301B1 (en) 1999-05-17 2009-09-01 Conjuchem Biotechnologies, Inc. Long-lasting antiviral fusion inhibitor peptide conjugates comprising albumin and human immunodeficiency virus (HIV) peptides
CA2383798A1 (en) 1999-09-07 2001-03-15 Conjuchem Inc. Pulmonary delivery for bioconjugation
KR20040004449A (ko) * 2000-11-28 2004-01-13 휘닉스 파머컬러직스, 인크. 변형된 아르기닌 데이미나제
JP4381302B2 (ja) * 2002-07-24 2009-12-09 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー Ｐｅｇ化ｔ１２４９ポリペプチド
WO2004020469A2 (en) * 2002-08-28 2004-03-11 Novartis Ag Ocular gene therapy
US7078485B2 (en) * 2002-12-05 2006-07-18 Yantai Medgenn Ltd. N-terminal modified recombinant human endostatin and its production
CA2516552A1 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Intermune, Inc. Polyethylene glycol modified interferon compositions and methods of use thereof
US7524811B2 (en) * 2003-08-29 2009-04-28 Children's Medical Center Corporation Anti-angiogenic peptides from the N-terminus of endostatin
DE602004017487D1 (de) * 2003-08-29 2008-12-11 Childrens Medical Center Antiangiogene peptide vom n-terminus von endostatin
WO2005047334A1 (en) 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co., Ltd. Igg fc fragment for a drug carrier and method for the preparation thereof
JP2008504008A (ja) 2003-12-31 2008-02-14 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 改良された薬物動態を有するＦｃ−エリスロポエチン融合タンパク質
CN100355784C (zh) 2004-02-12 2007-12-19 江苏恒瑞医药股份有限公司 聚乙二醇修饰α－干扰素1b的制备方法
JP2005245269A (ja) 2004-03-03 2005-09-15 Nipro Corp 血清アルブミン多量体を含む遺伝子組換え型蛋白質
WO2005111072A2 (en) 2004-04-29 2005-11-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Notch-based fusion proteins and uses thereof
CN1311867C (zh) 2004-09-27 2007-04-25 侯新朴 一种用于鼻腔给药的神经生长因子制剂

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1443194A (zh) * 2000-05-16 2003-09-17 博尔德生物技术公司 含游离半胱氨酸残基的蛋白重折叠的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemistry for peptide and protein PEGylation;Roberts MJ et al.;《Adv Drug Deliv Rev》;20020617;第54卷(第4期);459-476 *
Peptide and protein PEGylation:a review of problems and solutions;Veronese FM;《Biomaterials》;20010331;第22卷(第5期);405-417 *

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