CN104174015A - 疫苗组合物及其在肿瘤治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种治疗肿瘤的疫苗组合物，具体地，是包含E75肽和gp96蛋白的疫苗组合物。本申请还涉及制备上述疫苗组合物的方法以及上述疫苗组合物在治疗肿瘤中的用途。
Description
技术领域
本申请涉及一种治疗肿瘤的疫苗组合物，具体地，是包含E75肽和gp96蛋白的疫苗组合物。
背景技术
随着对免疫应答分子机制的深入研究，人们已经意识到机体的免疫细胞并不是一一对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位，蛋白质抗原通过其表位来体现其免疫特异性。基于抗原分子的免疫干预手段已不再停留在病原体或天然抗原的整体水平，而是开始向表位水平过渡。腺病毒和慢病毒载体目前已广泛应用于肿瘤的免疫治疗中，并且取得不错的抗肿瘤免疫效应，但是这类疫苗最大问题在于病毒载体本身所带来的一系列安全性问题。相对于病毒载体疫苗，多肽疫苗具有便于设计合成，价格低廉，安全性能好等优点。
HER2/neu是表皮生长因子受体家族的成员并且编码185kd参与调节细胞生长及繁殖的酪氨酸激酶受体。在很多类型的肿瘤细胞中发现了HER/neu的过表达和/或扩增。通过临床研究，发现可以靶向HER2/neu的肿瘤相关抗原(TAA)上的表位的细胞免疫应答的接种疫苗和有效免疫治疗。E75(KIFGSLAFL，HER2/neu，369-377)是HER2/neu原癌基因家族肽序列，能够刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)来破坏癌细胞，已用作预防和治疗肿瘤的疫苗，特别适用于乳腺癌。但是E75属于短肽，分子量小，表位单一，并不能很有效地刺激免疫系统诱导诱导免疫反应。
热休克蛋白gp96(又称GRP94)是位于细胞内质网膜上的热休克蛋白90家族中的一员，在天然免疫和获得性免疫中发挥着重要作用。正常情况下，gp96在 细胞中呈持续性低水平表达，应激条件下其表达明显增加。在肿瘤的发生发展过程中，由于肿瘤组织生长快，致使肿瘤缺血、缺氧及局部酸中毒，这些应激条件诱使肿瘤组织产生热休克蛋白，高水平的热休克蛋白可保护肿瘤细胞战胜机体内各种不利的生理环境，在肿瘤的发生、发展中起重要作用。加热、放疗等刺激因素可使gp96等HSP的表达水平提高，同时也使肿瘤的免疫原性增加，且表达量随肿瘤免疫原性增强而增强，因此gp96能作为分子伴侣结合细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原，并将结合的抗原表位呈递给抗原递呈细胞的MHCI类和II类分子，从而启动特异性T细胞CD8+和CD4+T细胞免疫应答。另一方面，gp96分子本身作为免疫活性分子通过与Toll样受体(TLR)作用，促进CD8+和CD4+T细胞细胞增殖和分泌细胞因子，并促进抗原呈递细胞成熟并增强其功能。已有实验室研究gp96的生物学功能和其作为疫苗佐剂开发的潜能。但目前尚未公开过有关包含E75肽和gp96蛋白的疫苗组合物的研究。
发明内容
本发明为了解决现有E75肽在用作肿瘤疫苗时表位单一、免疫原性不强，治疗效果不好的缺点，开发研制了包含E75肽和gp96蛋白的疫苗组合物。
本发明的一个技术方案涉及一种疫苗组合物，包含E75肽和gp96蛋白。
如上所述的疫苗组合物，其中E75的含量为1-1000微克/毫升。并且E75肽与gp96蛋白的含量比例为1:1。
本发明的另一个技术方案涉及制备上述疫苗组合物的方法。
本发明的另一个技术方案涉及上述疫苗组合物在治疗肿瘤中的用途。肿瘤类型包括乳腺癌，前列腺癌，肺癌和淋巴癌。优选肺癌和前列腺癌。
附图说明
附图1：测定各组成熟树突细胞对不同细胞株的杀伤作用，以无关多肽C01 组为对照，由图可知，分别使用C01、gp96以及C01+gp96诱导成熟的树突细胞对各种细胞均无明显的杀伤作用；E75和E75+gp96组表现出了杀伤肿瘤细胞株的效果，而E75+gp96组的杀伤作用远高于E75组。同时，所有组的树突细胞对非肿瘤细胞HEK293均无明显的杀伤作用。(相对于C01组，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)
具体实施方式
本发明的具体实施方式通过下面的实施例体现。但需要注意的是，尽管出于理解的清楚通过具体实施方式描述了本发明但对于本领域普通技术人员显而易见的是，鉴于这一发明的教导，可以对其进行某些改变和修饰而不悖离本发明权利要求的精神和范围。
实施例1E75肽的制备
E75肽通过多肽合成仪合成，经RP-HPLC纯化，HPLC-质谱联用鉴定产生分子量为995，与本多肽理论分子量相符，纯度达95％以上。另合成一段随机短肽C01作为对照。
实施例2gp9蛋白的制备
已有研究证明，肿瘤细胞在热应激诱导下，gp96蛋白将迅速表达，细胞内gp96浓度迅速增加，而其他蛋白表达趋于停止。将肿瘤细胞置于42℃环境中培养25min，检测gp96的浓度。利用反复冻融使肿瘤细胞裂解释放gp96蛋白，采用ConA-Sepharose亲和层析、G25过滤层析和DEAE-Sepharose离子交换层析收集，NaCl盐溶液洗脱脱盐分离纯化gp96蛋白，并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。
实施例3树突状细胞的培养
取外周血100ml，低渗破除红细胞后密度梯度离心分离白膜，以含10％小 牛血清的RPMI-1640培养基培养，获得贴壁单个核细胞，将细胞调至1x106/ml后，加入含GM-CSF100ng/ml、IL-420ng/ml的培养液，培养板中培养3天后作细胞形态学观察和S-100染色，获得树突状细胞。
实施例4树突状细胞的诱导
将纯化的C01短肽添加至树突状细胞培养液中至终浓度为500微克/毫升，继续培养3天，将未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞。
将纯化的E75短肽添加至树突状细胞培养液中至终浓度为500微克/毫升，继续培养3天，将未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞。
将纯化的gp96蛋白添加至树突状细胞培养液中至终浓度为500微克/毫升，继续培养3天，将未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞。
将纯化的E75短肽+gp96蛋白添加至树突状细胞培养液中至终浓度均为500微克/毫升，继续培养3天，将未成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞。
实施例5抗肿瘤效应检测
5.1靶细胞的准备
Raji淋巴瘤，MCF-7乳腺癌，PC-3前列腺癌，SBC-5小细胞肺癌，HEK-293购于ATCC。
5.2效应细胞的制备培养
将实施例4制备的各组DC细胞与T淋巴细胞按1:5比例共同培养3天后，收集悬浮细胞作为细胞毒性T细胞(CTL)。
5.3CTL对肿瘤细胞杀伤活性的检测
采用MTT法，取对数生长期的Raji淋巴瘤细胞，MCF7乳腺癌细胞，PC3前列腺癌细胞，SBC5小细胞肺癌细胞，HEK293细胞，细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔细胞培养板，100ul/孔。将上述制备的各组效应细胞按照效靶比(E/T) 为20:1与三组靶细胞混合，同时设置只加入相应T细胞的实验对照组，37℃，5％CO2条件下培养6～8h，吸去上清，加入PBS漂洗除去悬浮细胞后，重新加入200ul新鲜培养基，加入MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4小时后，吸去上清，加入DMSO终止反应，570nm波长处测吸光值(OD)，计算杀伤活性。每组均为5复孔测定。
实验结果显示，按实施例3-5中所述方法测定各组成熟树突细胞对不同细胞株的杀伤作用，以无关多肽C01组为对照，由图可知，分别使用C01、gp96以及C01+gp96诱导成熟的树突细胞对各种细胞均无明显的杀伤作用；E75和E75+gp96组表现出了杀伤肿瘤细胞株的效果，而E75+gp96组的杀伤作用远高于E75组。同时，所有组的树突细胞对非肿瘤细胞HEK293均无明显的杀伤作用。(相对于C01组，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。
Claims (5)
1.一种疫苗组合物，包含E75肽和gp96蛋白。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物，其中E75的含量为1-1000微克/毫升。
3.如权利要求1或2所述的疫苗组合物，其中E75肽与gp96蛋白的含量比例为1:1。
4.制备权利要求1-3任一项所述疫苗组合物的方法。
5.如权利要求1-3所述疫苗组合物在制备治疗肿瘤的制剂中的用途，其中肿瘤类型包括乳腺癌，前列腺癌，肺癌和淋巴癌，优选肺癌和前列腺癌。
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| CN201410419432.6A CN104174015A (zh) | 2014-08-22 | 2014-08-22 | 疫苗组合物及其在肿瘤治疗中的用途 |
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| CN (1) | CN104174015A (zh) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN107141351A (zh) * | 2017-05-15 | 2017-09-08 | 广州领晟医疗科技有限公司 | 一种e75肽的液相合成方法 |
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| CN101002946A (zh) * | 2006-01-20 | 2007-07-25 | 清华大学 | 一种治疗肿瘤的药物及其应用 |
| CN101623498A (zh) * | 2009-08-06 | 2010-01-13 | 中国人民解放军第三军医大学 | 基于肿瘤内皮标记物-8基因的双靶标肿瘤疫苗及其制备方法 |
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