CN106008692A - 一种肿瘤抗原gpc3的ctl识别表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种GPC3来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其氨基酸序列为Lys‑Val‑Phe‑Gly‑Asn‑Phe‑Pro‑Lys‑Leu。本发明还包括上述肽在制备肿瘤治疗性DC‑CIK中的应用。本发明所制备的特异性的DC‑CIK细胞对肝癌细胞Huh‑7显示出一定的杀伤率，可用于制备肝癌特异性自体免疫细胞的制备。本发明公开了GPC3来源的抗肿瘤CTL表位肽及用其肽制备肿瘤治疗性DC‑CIK，对多种GPC3相关肿瘤的治疗具有潜在价值。

Description

一种肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽及其应用

技术领域

本发明涉及表位肽技术领域，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽及其应用，还涉及一种肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤抗原GPC3特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。

背景技术

磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一种66kD的细胞膜蛋白，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的成员。GPC3能够与细胞外基质、多种生长因子、肝素样结合蛋白、粘附分子、蛋白酶等相互作用，参与细胞粘附、分化、增殖与迁徙等过程。其在成熟组织中低表达，在中胚层、多种恶性肿瘤中过表达，如其在肝癌组织中高表达，而在正常肝组织不表达，有可能是目前发现在AFP阴性肝癌中表达率最高的基因。

近年来，细胞免疫治疗飞速发展，成为继手术、化疗、放疗后的第四种肿瘤治疗方法。细胞免疫治疗领域中过继性细胞免疫治疗是研究的热点。肿瘤过继性细胞免疫治疗能够调动机体免疫功能以达到消除和控制肿瘤的目的,具有靶向疗效明显、不良反应轻微等优点。过继性细胞免疫治疗包括CIK及DC-CIK等，其中DC-CIK是将CIK细胞和同源DC细胞共培养后即可获得DC-CIK细胞，它既可促进DC细胞的成熟，更能促进ClK的增殖，并加强其抗肿瘤活性。DC-CIK表现出更好的靶向性和特异性，具有有效的杀瘤作用。

肿瘤治疗常用的方法有手术、放疗、化疗。半数以上的肿瘤患者的主要治疗手段是手术，通过手术可以治愈大部分早期未扩散的肿瘤，但是对多数中晚期肿瘤患者却是疗效有限。放射疗法也是许多肿瘤治疗不可或缺的手段之一，但是其不良反应大，只能作为一种局部疗法。对于转移扩散或全身性的肿瘤，只能依靠化疗和免疫治疗。其中，化疗对多种肿瘤疗效确切，是临床肿瘤治疗的重要手段，但是其作用缺乏特异性，会在杀瘤同时损伤正常细胞，长期使用会产生多种毒副作用。因此，需要更好的肿瘤全身治疗手段。

免疫细胞疗法是肿瘤治疗的新策略，通过从患者外周血肿采集单个核细胞，经体外培养、增值、特异性抗原处理后，赋予其抗瘤特异性并回输到病人体内发挥抗瘤作用。免疫细胞疗法主要包括CK、DC-CIK等。DC是功能强大的抗原提呈细胞，CIK是多种细胞因子诱导的异质性杀伤细胞群，因此DC-CIK技术将两者优点有效结合，具有更好的特异性和靶向性，可确保高效的免疫反应。研究表明，

DC-CIK细胞对化疗后肿瘤细胞的生长具有有效的抑制作用，且DC-CIK细胞不会危害集体免疫系统功能。在当前对肿瘤特异性抗原了解相对较少的情况下，将DC-CIK细胞作为一种辅助疗法与传统肿瘤治疗方法进行联合应用是个有效可行的策略。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明目的在于提供一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽。

本发明目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽的应用。

本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞的制备方法。

本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原GPC3特异性DC-CIK细胞的制备方法。

本发明目的还在于提供上述肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明提出的一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列如下：Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。

上述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90％。

本发明还提出的上述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽在制备具有GPC3表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。

优选地，上述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽在制备肝癌治疗性多肽疫苗中的应用，尤其对肝癌细胞Huh-7具有杀伤力。

本发明还提出的一种肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。

本发明还提出的上述肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明还提出的一种肿瘤抗原GPC3特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽进行诱导得到。

本发明还提出的上述肿瘤抗原GPC3特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明公开了GPC3来源的抗肿瘤CTL表位肽及用其肽制备肿瘤治疗性DC-CIK，对多种GPC3相关肿瘤的治疗具有潜在价值。

本发明巧妙利用GPC3在肝癌中呈现高表达，与肝癌的病理分级明显正相关，随组织病理分级的升高而增加，因此在肝癌的发生和发展中起重要作用。它具有极高的组织器官特异性，而在正常肝脏组织中表达很低，从而采用理论和实验相结合的方法筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽，所得表位肽未见文献报道，为研制基于抗原GPC3的肿瘤疫苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提供理论基础，并为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。

附图说明

图1为本发明提出的一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽的质谱分析图。

图2为本发明实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌INF-γ的能力对比图。

图3为本发明实施例1所得P4、P6、P15、P16各自诱导得到的特异性CTL细胞对肝癌细胞Huh-7杀伤能力对比图。

图4为由本发明提出的一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽所制备得到的特异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1：合成表位肽

采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段，运用SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对GPC3的抗原CTL表位进行预测分析，选取评分前20的多肽序列进行试验筛选，一次命名为P1、P2、P3......P20。

基本流程如下：首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；其次将第二个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯度大于90％，质谱分析证实其分子量符合理论值。

本发明提出的一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法进行合成，所述CTL识别表位肽为九肽，编号为P15，其氨基酸序列如下：Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。对P15进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子量为1049.26g/mol，符合理论值。

实施例2：多肽功能检测

上述所得P15和其余19个表位肽可用于制备具有GPC3表达的肿瘤治疗性多肽疫苗，其应用实验如下：

1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN-γ分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实验检测：抽取患者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加细胞因子培养DC细胞和CTL细胞，进一步采用DC细胞负载本发明的GPC3表位肽，与CTL共培养刺激特异的CTL扩增，进一步在体外采用ELISA和LDH实验检测特异的CTL在特异抗原刺激下INF-γ的分泌及对肝癌细胞Huh-7的杀伤作用。

具体方法如下：

(I)、PBMC的分离与诱导：

1)将50mL抗凝处理的外周血，2000rpm离心10min；

2)收集上层血浆冻存，用PBS(pH＝7.4)稀释剩下的血细胞；

3)将稀释的血细胞加入到等体积的淋巴分离液液面上；

4)20℃离心20min，关闭离心机刹车；

5)离心后，分为四层，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜层(即第二层)；

6)取出的白膜层用PBS洗涤两遍；

7)将细胞以2～5×10⁶/mL接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被anti-CD3IgG和anti-CD28IgG的培养板进行激活培养；

8)贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液；

9)第5天，收集DC细胞，将10μg实施例1所得目的表位肽精肽加入DC细胞中，1h后，将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL2及IL-15；

10)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的杀伤实验。

(II)、IFN-γ细胞因子分泌检测：Human IFN-gamma Platinum ELISA(IFN-γELISA检测试剂盒，eBioscience公司)检测CTL细胞分泌的IFN-γ，步骤如下：

1)将CTL细胞去除细胞因子培养24h后，接种到96孔板内；

2)细胞中加入刺激对应的多肽再次刺激24h后，离心去除细胞，收集细胞上清；

3)采用ELISA检测上清中IFN-γ的表达，选择IFN-γ分泌较多的CTL表位肽进行杀伤实验。

结果如图2所示，P15和P4、P6、P16负载的DC细胞均能够较好诱导出特异性CTL细胞，分泌较高量的IFN-γ。

(III)、肿瘤细胞杀伤实验：采用乳酸脱氢酶(LDH)释放检测法，使用CytoTox 96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司)进行LDH试验检测细胞杀伤能力。步骤如下：

1)设立检测培养板(100μL/孔)

a.设立实验组：以GPC3阳性表达的肝癌细胞Huh-7为靶细胞，按效应细胞和靶细胞比为5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL细胞

b.设立效应细胞自发释放组

c.设立靶细胞自发释放组

d.设立靶细胞最大释放组

e.设立背景对照组

2)细胞裂解及收获上清

a.37℃5％CO₂共培养5h

b.靶细胞最大释放组中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min离心收集上清

3)LDH检测

a.转移50μL上清至另一个96孔板

b.每孔加入50μL稀释的底物混合物，室温避光孵育30min

c.每孔添加50μL终止液

d.在490nm下检测吸光值OD

细胞杀伤率计算公式如下：

杀伤率(％)＝[(OD_实验组-OD_{效应细胞自发释放组}-OD_{靶细胞自发释放组})/(OD_{靶细胞最大释放组}-OD_{靶细胞自 发释放组})]×100％

结果如图3所示，图3为本发明实施例1所得P4、P6、P15、P16各自诱导得到的特异性CTL细胞对肝癌细胞Huh-7杀伤能力对比图；由图3可知，P15诱导的CTL细胞对肿瘤细胞Huh-7杀伤效果最好。

2、采用流式分析获得的特异CTL中各种免疫细胞所占的百分比，结果如图4所示。由图4可知，本发明由P15制备获得的免疫细胞群中含有大量的CTL细胞，同时也含有一定比例的NKT细胞，即该免疫细胞群具有较好的免疫活性，具有强大的杀伤特定肿瘤细胞的能力。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九肽，其氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。

2.权利要求1所述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽在制备具有GPC3表达的肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。

3.权利要求1所述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽在制备肝癌治疗性多肽疫苗中的应用。

4.一种肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。

5.根据权利要求4所述肿瘤抗原GPC3特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。

6.一种肿瘤抗原GPC3特异性DC-CIK细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述特异性肿瘤抗原GPC3的CTL识别表位肽进行诱导得到。

7.根据权利要求6所述肿瘤抗原GPC3特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗肝癌药物中的应用。