TW202206591A - 體外增殖自然殺手細胞及自然殺手t細胞之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種體外增殖自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法,由周邊血液單核細胞中培養並增殖自然殺手細胞及自然殺手T細胞,包括使用微量介白素-2促進細胞增殖並活化自然殺手細胞及自然殺手T細胞,該方法可明顯提高細胞生長倍數及自然殺手細胞及自然殺手T細胞所占比例,並且所得到之自然殺手細胞及自然殺手T細胞可用於製備腫瘤疫苗等醫藥組成物。
Description
本發明係關於一種體外增殖自然殺手細胞(natural killer cell, NK cell)及自然殺手T細胞(natural killer T cell, NKT cell)之方法,特別是一種使用低濃度介白素-2之自然殺手細胞及自然殺手T細胞增殖方法。
癌症是有關細胞異常增生的複雜疾病。癌細胞與正常細胞有許多不同之處,包含:(1)細胞訊息傳遞:相較於正常細胞,癌細胞對於調控細胞生長或死亡的訊息較不具反應性;(2)侵犯能力:有些癌細胞會表現較少量之細胞黏附分子,因此較不受限制,可藉由血液或淋巴系統輕易轉移或擴散至身體其他部位;(3)細胞特化:相較於正常細胞,癌細胞為未特化或分化程度較低的細胞;及(4)免疫抑制:癌細胞可藉由活化免疫抑制細胞及/或刺激免疫抑制因子的表現來抑制免疫反應。
常見的抗癌療法包含外科手術、放射治療及化學治療。然而,除了抑制腫瘤生長,該些治療方法往往伴隨著傷害或毒殺正常組織的風險。此外,用於毒殺癌細胞而不產生副作用的替代性療法尚在研究及臨床前試驗階段,其中免疫治療是最具潛力的治療策略之一,其藉由活化腫瘤專一性免疫細胞(例如T細胞、B細胞、樹突細胞、自然殺手細胞及自然殺手T細胞)及/或刺激抗腫瘤因子的表現/釋放來達到清除腫瘤的目的。該些經活化之免疫細胞可藉由辨識及結合至過量或僅表現於癌細胞的腫瘤相關抗原,而專一地標的癌細胞。特別的是,自然殺手細胞表面缺乏專一性抗原受體,因此其引發之免疫反應為非專一性防禦。自然殺手細胞位於周邊血液中,可攻擊腫瘤細胞及受病毒感染之細胞,當自然殺手細胞與這些異質細胞接觸後,即驅動其活化受體而活化其自身,並釋出穿孔素及顆粒溶解酶等因子;穿孔素將在標的異質細胞膜形成孔洞,接著顆粒溶解酶進入該標的異質細胞後,改變粒線體膜之通透性,並活化細胞凋亡相關之蛋白質以啟動細胞凋亡反應。自然殺手T細胞為類異質T細胞,與自然殺手細胞及T細胞有部分相同的特徵。許多自然殺手T細胞可識別非多型的CD1d分子;CD1d分子為類抗原呈現分子,可與自體及異體的脂質及糖脂結合,而自然殺手T細胞只佔周邊血液中的T細胞約0.1%。
利用自然殺手細胞及自然殺手T細胞治療癌症有各種優勢:(1)可毒殺癌細胞,抑制腫瘤的生長及擴散;(2)抑制腫瘤附近新血管的增生,限制腫瘤取得所需養分,進而限制腫瘤生長;(3)直接改善並調節患者之免疫力及神經系統;(4)副作用低或幾乎無副作用。研究指出,自然殺手細胞及自然殺手T細胞之毒殺範圍除了黑色素瘤、頭頸癌,還包括肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、攝護腺癌、肝癌、胰臟癌、食道癌、乳癌及許多合併的癌症,尤其對肺、淋巴組織、食道、乳房、肝等血流旺盛且血管較密集部位之癌症較有效。
然而,自然殺手細胞及自然殺手T細胞僅占人體周邊血液中淋巴細胞的5%至10%,因此於體外高效率擴增自然殺手細胞及自然殺手T細胞係一重大課題,目前研究者仍極力於提升自然殺手細胞及自然殺手T細胞之體外擴增效率、其細胞存活率、細胞純度及細胞毒殺活性,進而提升其於醫療上的應用性。
有鑑於此,發明人致力於研究如何提升體外增殖自然殺手細胞及自然殺手T細胞的效率。介白素-2、介白素-12、介白素-15、介白素-18及介白素-21等具有刺激自然殺手細胞及自然殺手T細胞增殖,並活化自然殺手細胞及自然殺手T細胞的作用,目前已應用於自然殺手細胞及自然殺手T細胞的體外增殖技術,發明人從中進一步探討較有效增進自然殺手細胞及自然殺手T細胞增殖的選項及其條件,因而研發出本發明之方法。
本發明提供一種體外增殖周邊血液單核細胞中自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法,包括下列步驟:(a)取得一個體之一周邊血液樣本;(b)由該周邊血液樣本取得一血漿及一周邊血液單核細胞;(c)使用一第一培養基將該周邊血液單核細胞之濃度調整為一第一濃度後接種並培養5天,其中該第一培養基包含該個體之一血漿 ;(d)去除上一步驟之培養基,使用一第二培養基將該周邊血液單核細胞之濃度調整為該第一濃度後接種並培養2天,其中,該第二培養基包含該血漿及一介白素-2,該介白素-2之濃度為0.3 μg/mL至0.5 μg/mL;及(e)重複步驟(d)約2至5次,直至該周邊血液單核細胞增殖至所需數量。
於一較佳實施例,該個體係人類。
於一較佳實施例,該個體係健康個體或腫瘤患者。
於一較佳實施例,該血漿於使用前係經滅活。
於一較佳實施例,該第一濃度為1x106
細胞/mL。
於一較佳實施例,該介白素-2之濃度為0.368 μg/mL。
於一較佳實施例,步驟(d)係接種於一細胞培養袋或一培養皿。
於一較佳實施例,經步驟(e)增殖之該周邊血液單核細胞中,該自然殺手細胞及自然殺手T細胞之數量占94.3%或以上。
於一較佳實施例,由該方法得到之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞於細胞培養第10至14天可用於製備一醫藥組成物。
相較於習知技術,本發明使用濃度低約500倍之介白素-2於自然殺手細胞及自然殺手T細胞增殖,可明顯提高細胞生長倍數及自然殺手細胞及自然殺手T細胞在周邊血液單核細胞中所占比例,亦即,本發明大幅減少介白素-2用量,不僅降低體外培養之成本外,且可於較短的時間內獲得更理想之細胞增殖效果,有利於改善自然殺手細胞及自然殺手T細胞在醫療上的應用。
本領域具通常知識者透過以下敘述可輕易明瞭此發明之必要技術,且只要不違反其中的精神及範圍,即可多樣地改變及修飾此發明來適應不同用途及狀況。如此,其他的實施例亦包含於申請專利範圍中。
本文中術語「一」及「一種」代表於本文中之語法對象有一個或多於一個(即至少一個)。
本文中字詞「包括」、「包含」、「具有」或「含有」係包含性或開放性,並不排除其他未闡述之元素或方法步驟。
本發明提供一種體外增殖周邊血液單核細胞中自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法,包括下列步驟:(a)取得一個體之一周邊血液樣本;(b)由該周邊血液樣本取得一血漿及一周邊血液單核細胞;(c)使用一第一培養基將該周邊血液單核細胞之濃度調整為一第一濃度後接種並培養5天,其中該第一培養基包含該個體之一血漿 ;(d)去除上一步驟之培養基,使用一第二培養基將該周邊血液單核細胞之濃度調整為該第一濃度後接種並培養2天,其中,該第二培養基包含該血漿及一介白素-2,該介白素-2之濃度為0.3 μg/mL至0.5 μg/mL;及(e)重複步驟(d)約2至5次,直至該周邊血液單核細胞增殖至所需數量。本文所稱之「介白素-2之濃度」係指於培養基之總體積中,所含的介白素-2的量而換算出之濃度。
所述個體係哺乳類,哺乳動物包括(但不限於)鼠科、嚙齒類、猿猴、人類、農用動物和寵物。於一較佳實施例,該個體係人類。
所述個體可為健康個體或腫瘤患者。於一較佳實施例,該個體係健康個體,以確保自然殺手細胞及自然殺手T細胞之品質及活性處於健康有效的狀態。
所述血漿於使用前係經滅活,以免妨礙該周邊血液單核細胞增殖。該血漿係該個體之自體血漿,對於自然殺手細胞及自然殺手T細胞腫瘤治療方案較具安全性。
所述第一培養基及第二培養基分別為NKCC-1培養基及NKCC-2培養基(取自人類NK細胞培養套組(KBM NK Kit),捷昇生物科技有限公司),然而,亦可使用本領域技術人員所知任何適用之培養基或培養套組,本發明不予限制,在此先行敘明。
於一實施例,步驟(d)係接種於一細胞培養角瓶。於一更佳實施例,步驟(d)係接種於一細胞培養袋或一培養皿。
所述第一濃度可為2x105
細胞/mL至1.5x106
細胞/mL,例如但不限於2x105
細胞/mL、2.5x105
細胞/mL、3x105
細胞/mL、3.5x105
細胞/mL、4x105
細胞/mL、4.5x105
細胞/mL、5x105
細胞/mL、5.5x105
細胞/mL、6x105
細胞/mL、6.5x105
細胞/mL、7x105
細胞/mL、7.5x105
細胞/mL、8x105
細胞/mL、8.5x105
細胞/mL、9x105
細胞/mL、9.5x105
細胞/mL、1x106
細胞/mL或1.5x106
細胞/mL。於一較佳實施例,該第一濃度為1x106
細胞/mL。
所述介白素-2之濃度為0.3 μg/mL至0.5 μg/mL,例如但不限於0.3 μg/mL、0.31 μg/mL、0.32 μg/mL、0.33 μg/mL、0.34 μg/mL、0.35 μg/mL、0.36 μg/mL、0.37 μg/mL、0.38 μg/mL、0.39 μg/mL、0.4 μg/mL、0.41 μg/mL、0.42 μg/mL、0.43 μg/mL、0.44 μg/mL、0.45 μg/mL、0.46 μg/mL、0.47 μg/mL、0.48 μg/mL、0.49 μg/mL或0.5 μg/mL。於一較佳實施例,該介白素-2之濃度為0.368 μg/mL。
由該方法得到之自然殺手細胞及自然殺手T細胞,於細胞培養第10至14天,不僅達到所需數量或稱有效量,並且據發明人觀察,此時自然殺手細胞及自然殺手T細胞處於最佳狀態,因此,可用於製備醫藥組成物。例如,該自然殺手細胞及自然殺手T細胞可連同適當體積之該血清及生理食鹽水,用於製備腫瘤疫苗等醫藥組成物,透過靜脈注射等方式回輸至該個體體內。該自然殺手細胞及自然殺手T細胞亦可與其他癌症治療手段(如手術、放射治療、細胞毒性藥物)聯合給藥或應用。依照物種、年齡和患者的一般症狀、所欲治療症狀之嚴重度以及相關的特給藥模式等等,所需確切的自然殺手細胞有效量及自然殺手T細胞有效量在患者間各不相同。就任何個別的案例,適當的「有效」量可由熟習本項技術之一般技術者使用例行的實驗來決定。
[實施例]
樣本來源:
周邊血液來自7名健康獻血者,獻血者經臨床診斷無血液系統惡性腫瘤和嚴重自身免疫性疾病。發明人獲得研究倫理委員會同意,同時與所有獻血者簽署知情書。
以下為體外增殖周邊血液單核細胞中自然殺手細胞及自然殺手T細胞之示例步驟:
(1)由該7名獻血者分別取得100 mL周邊血液,分別為7組(實施例一至三及比較例一至四)進行細胞增殖。
(2)採血後2 小時內以離心力 1800 rpm 將周邊血液離心10分鐘。離心後,上層為血漿,中間層為單核細胞。將血漿滅活並保存於-20℃以備使用。使用人類NK細胞培養套組(KBM NK Kit),將其中的NKCC-c取1 mL加入13 mL的DPBS(不含鈣鎂)中,將此14 mL之塗佈液加入培養皿中,搖晃使其分佈均勻,並將培養皿靜置於37℃4小時後,移除該塗佈液並用 DPBS(不含鈣鎂)洗滌兩次備用。
(3)藉由密度梯度離心分離出上述中間層之單核細胞,以緩衝溶液清洗二次後使用台盼藍/死細胞染色劑 (Trypan Blue)計算細胞數量,接著以NKCC-1培養基(經加入10%獻血者之自體血漿 ,該血漿係經滅活) 將細胞濃度調整至1x106
細胞/mL後接種於經塗佈後之培養皿,靜置於37℃、5% CO2
培養箱中培養5天。
(4)取樣計算細胞數量後以1200 rpm 離心5分鐘,去除上清液(舊培養基),以NKCC-2培養基(經加入介白素-2、滅活之自體血漿 )將細胞濃度調整至1x106
細胞/mL後接種,於37℃、5% CO2
培養2天。其中,實施例一至三之培養基所含介白素-2濃度為0.368 μg/mL(1000 IU/ml);比較例一至四之培養基所含介白素-2濃度為200 μg/mL(543478 IU/ml),此為習知體外增殖技術常採用之濃度。
(5)重複步驟(4)數次,直至細胞培養總天數達14天。利用流式細胞儀進行細胞表面抗原分析,檢測NK細胞(CD3-/CD56+)及NKT細胞(CD3+/CD56+)之數量,比較細胞培養結果如表1。
表1
第 0 天 細胞數量 (x106 ) | 第 14 天 細胞數量 (x106 ) | 細胞生長倍數 (X) | NK 細胞比例 | NKT 細胞比例 | NK +NKT 細胞總數比例 | |
實施例一 | 40.5 | 1700 | 42.5 | 61.20% | 33.40% | 94.60% |
實施例二 | 46.56 | 1895 | 42.63 | 75.90% | 18.40% | 94.30% |
實施例三 | 14.45 | 1071.36 | 74 | 73.9% | 21.3% | 95.20% |
比較例一 | 16 | 65.4 | 4.08 | 4.19% | 5.27% | 9.46% |
比較例二 | 5.9 | 41.36 | 7 | 4.54% | 17.77% | 22.31% |
比較例三 | 14.3 | 73.7 | 5.15 | 7.83% | 28.01% | 35.84% |
比較例四 | 14.7 | 71.2 | 4.84 | 8.91% | 20.28% | 29.19% |
如表1所示,使用0.368 μg/mL介白素-2之實施例一至三,經14天增殖後,細胞生長倍數達到40倍以上,實施例三甚至高達74倍;而使用200 μg/mL介白素-2之比較例一至四,其細胞生長倍數皆低於7倍,與實施例有明顯落差。此外,增殖後自然殺手細胞及自然殺手T細胞在周邊血液單核細胞中所占比例,實施例一至三為94.3%以上,而比較例一至四僅有35.84%以下。可見,實施例所用介白素-2濃度較比較例低五百多倍,但顯然更有利於細胞增殖。
綜上所述,相較於習知技術,本發明使用濃度低約500倍之介白素-2於自然殺手細胞及自然殺手T細胞增殖,可明顯提高細胞生長倍數及自然殺手細胞在周邊血液單核細胞中所占比例,亦即,本發明大幅減少介白素-2用量,反而獲得更理想之細胞增殖效果,有利於改善自然殺手細胞及自然殺手T細胞在醫療上的應用。
以上已將本發明做一詳細說明,惟以上所述者,僅惟本發明之一較佳實施例而已,當不能以此限定本發明實施之範圍,即凡一本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾,皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。
無。
無。
無。
無。
Claims (9)
- 一種體外增殖周邊血液單核細胞中自然殺手細胞及自然殺手T細胞之方法,包括下列步驟: (a) 取得一個體之一周邊血液樣本; (b) 由該周邊血液樣本取得一血漿及一周邊血液單核細胞; (c) 使用一第一培養基將該周邊血液單核細胞之濃度調整為一第一濃度後接種並培養5天,其中該第一培養基包含該個體之一血漿; (d) 去除上一步驟之培養基,使用一第二培養基將該周邊血液單核細胞之濃度調整為該第一濃度後接種並培養2天,其中,該第二培養基包含該血漿及一介白素-2,該介白素-2之濃度為0.3 μg/mL至0.5 μg/mL;及 (e) 重複步驟(d)約2至5次,直至該周邊血液單核細胞增殖至所需數量。
- 如請求項1所述之方法,其中該個體係人類。
- 如請求項1所述之方法,其中該個體係健康個體或腫瘤患者。
- 如請求項1所述之方法,其中該血漿於使用前係經滅活。
- 如請求項1所述之方法,其中該第一濃度為1x106 細胞/mL。
- 如請求項1所述之方法,其中該介白素-2之濃度為0.368 μg/mL。
- 如請求項1所述之方法,其中步驟(d)係接種於一細胞培養袋或一培養皿。
- 如請求項1所述之方法,其中經步驟(e)增殖之該周邊血液單核細胞中,該自然殺手細胞及自然殺手T細胞之數量占94.3%或以上。
- 如請求項1至8任一項所述之方法,其中,由該方法得到之該自然殺手細胞及自然殺手T細胞於細胞培養第10至14天可用於製備一醫藥組成物。
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