CN106148282B - 一种自然杀伤细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医用生物细胞培养方法，特别涉及一种自然杀伤细胞的培养方法。所述方法，包括以下步骤：步骤1、白细胞分离：从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；步骤2、细胞培养：单核细胞中加入培养基培养，得到自然杀伤细胞。

Description

一种自然杀伤细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及医用生物细胞培养方法，特别涉及一种自然杀伤细胞的培养方法。
背景技术
自然杀伤性细胞(Natural killer cell，NK)细胞是一种广泛存在于外周血，脾脏，淋巴结等组织和器官中，包浆内含有大颗粒成分的淋巴样细胞，是参与人体天然免疫反应和抗肿瘤免疫的主要效应细胞。NK细胞主要通过直接和间接两种方式发挥免疫活性。其中直接途径主要是NK细胞通过其表面的特异的活化性或者/和抑制性受体对体内的“自我”与“非我”细胞进行区分，识别后这些表面受体与靶细胞表面的相应分子进行特异性结合，进而NK细胞释放穿孔素，颗粒酶以及IL-2，IL-15，INF-γ等多种细胞因子对靶细胞进行杀伤和清除。间接方式又称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody DependentCell-mediated Cytotoxicity,ADCC)。该途径主要是通过NK细胞表面的CD16分子与IgG抗体的Fc段结合，进而可对该抗体俘获的靶细胞发挥杀伤作用，诱导已被抗体结合的靶细胞发生凋亡或者裂解。
随着近年来肿瘤免疫治疗技术突飞猛进的发展，NK已在免疫抗肿瘤临床应用中表现出越来越突出的优势和潜力。目前，临床上获得NK的方法主要是从病人或者健康供者外周血中分离PBMC，利用包括IL-2，IL-15，IL-21等在内的多种细胞因子进行诱导，扩增，使NK细胞在体外扩增到一定数量后回输给患者，达到治疗的目的。但是，依然有诸多障碍阻碍了NK的临床应用：1)NK体外扩增效率低，增殖能力较弱；2)培养后的NK细胞纯度不高；3)NK细胞在体外培养过程中无法得到充分的刺激与活化，导致其进入体内后对肿瘤细胞的杀伤效率低下；4)NK细胞进入体内后由于缺乏归巢，趋化等细胞因子信号分子，无法有效的迁移至肿瘤病灶部位，发挥其杀伤活性。
OK432(A群溶血性链球菌灭活制剂)是一种作用于肿瘤的药物。是将A群溶血性链球菌(Su株)以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用。
0K432系取自人化脓性链球菌的Su株(A群)，经减毒、培养，基质中加入青雷索G盐，然后真空冷冻干燥制成。加入生理盐水后并无混浊或稍有混浊。药剂性能稳定，-20℃至5℃时可保存36个月，室温下可保存27个月，40℃下6个月，50℃下3个月，直射日光(每日平均5小时)下1个月。临床计用单位为临床单位(KE)，1KE相当于干燥菌体量0.1mg。
OK432激活的中性粒细胞能够杀死IFN-γ或者TNF-α处理的癌细胞。
OK432诱导的中性粒细胞对自体瘤细胞的杀伤作用通过CD11b/CD18和ICAM-1之间的反应实现的。OK432诱导的单核细胞能够杀死自体瘤细胞。OK432可提高T细胞和NK细胞活性，可调节T细胞亚群使T3、T4、及T4/T8比值全面上升。OK432刺激淋巴细胞后，显示出LAK细胞活性，这种激活的淋巴细胞甚至对抗NK细胞的瘤细胞都显示出活性。
凋亡的肿瘤细胞
肿瘤细胞可以来自干不同的来源。在一个特定实施方式中，肿瘤细胞可来自于待治疗患者的原发性肿瘤或转移性肿瘤。可以通过活体解剖或外科手术获得肿瘤细胞。将组织分解，分离和纯化的肿瘤细胞就可以立即使用。同样优选建立一个原发性肿瘤细胞系，和将这样获得的细胞用于肿瘤接种。或者，此类肿瘤细胞系可以用自体肿瘤来制备。或者，也可以使用诸如ATTC的保藏机构商业提供的肿瘤细胞。
肿瘤细胞不具有或只是具有很小的免疫原性，如果在没有强力佐剂的情况下使用，它们通常并不具有诱导肿瘤特异性免疫应答的能力。近期的研究表明，由一些诸如硼替佐米(bortezomib)、奥沙利铂和蒽环类抗生素(anthracyclínes)的化疗方法杀死的肿瘤细胞可以诱导肿瘤特异性兔疫应答。该免疫原性细胞死亡以所述的所有化疗都具备的分子事件为特征。在免疫原性细胞死亡开始之后的几个小时内，凋亡前的肿瘤细胞将使钙网络蛋白和热激蛋白与其他作为“吃我”信号的分子(磷脂酰丝氨酸)一起，从内质网上移动到细胞表面。
同时，经历免疫原性肿瘤细胞死亡的肿瘤细胞会下调“别吃我”信号(例如表面CD47)的表达，以便未成熟的树突状细胞对肿瘤细胞的识别和吞食，从而获得肿瘤抗原。此外，在质膜的通透化之后，细胞会向胞外环境释放细胞凋亡后期的标记高迁移率族蛋白1(HMGB1)。HMGB1能够结合许多模式识别受体(PRRs)，例如Toll样受体2(TLR2)，TLR4以及高级糖基化终产物(RAGE)的受体。该蛋白的释放似乎是优化呈递来自树突细胞引导的死亡肿瘤细胞、T细胞的抗原以及后续的T细胞介导的肿瘤清除所必需的。
让肿瘤细胞具有免疫原性的方式杀死的肿瘤细胞的用途对于癌症免疫治疗方案的设计非常重要。施用免疫原性的肿瘤细胞能够诱导肿瘤特异性的免疫应答，这种应答能够控制肿瘤细胞的生长。这将会减慢甚至停止疾病的进展并且改善癌症患者的预后。同样也认为，在体内循环的肿瘤细胞的分布以及转移癌的形成至少也会被大量地减少。超高压灭菌(下面也称为UHP)就是在密闭的超高压容器内，用水作为介质对软包装食品等物料施以300～600MPa的压力或用高级液压油施加以100～1000MPa的压力。从而杀死其中几乎所有的细菌、霉菌和酵母菌，而且不会像高温杀菌那样造成营养成分破坏和风味变化。超高压灭菌的机理是通过破坏菌体或细胞体蛋白中的非共价键，使蛋白质高级结构破坏，从而导致蛋白质凝固及酶失活。超高压还可造成菌体和细胞体的细胞膜破裂，使菌体内化学组分产生外流等多种细胞损伤，这些因素综合作用导致了微生物和细胞的死亡。高等静压技术在食品保藏中的应用研究最早是由Bert Hite在1899年提出的，Bert Hite首次发现450MPa的高压能延长牛奶的保存期，他和他的同事做了大量研究工作，证实了高压对多种食品及饮料的灭活效果。这以后，有关超高压灭菌技术的研究一直没有间断，Bridgman因发现高静水压下蛋白质发生变性、凝固而获得了1946年诺贝尔物理奖。但直到1990年有关超高压灭菌装备、技术和理论的研究才得到了突破与发展，20世纪90年代由日本明治屋食品公司首先实现了UHP技术在果酱、果汁、沙拉酱、海鲜、果冻等食品的商业化应用。之后，欧洲和北美的大学、公司和研究机构也相继加快了对UHP技术的研究。它同加热杀菌一样，经100MPa以上超高压处理后的食品，可以杀死其中大部分或全部的微生物、钝化酶的活性，并且使细胞程序性凋亡，在加工过程中主要是利用Le Chace－lier原理和帕斯卡原理。由超高压力杀死的肿瘤细胞可以向未成熟的树突状细胞提供有效的活化刺激原，甚至在没有额外的刺激原存在的情况下也如此。由该方法所杀死的肿瘤细胞表达高水平的免疫原性细胞死亡标记，而装载有这些免疫原性肿瘤细胞的未成熟的树突状细胞具有更强的特异性。本发明的实验数据显示，使用超高压力杀死的肿瘤细胞导致肿瘤抗原的有效呈递，从而诱导强烈的抗肿瘤免疫应答。
辐照杀菌自美国食品药品管理局(FDA)1985年批准将辐照杀菌用于杀死猪肉中的旋毛虫后，已在40多个国家获得批准使用，广泛用于食品卫生和医疗领域用以对物品进行可穿透性灭菌及生物物体灭活。在我，辐照杀菌广泛用于医疗器械和药品的灭菌。与热杀菌不同的是，辐照杀菌同UHP技术为不致灭菌物体温度升高的冷杀菌方法。本专利中对经过UHP处理后的肿瘤细胞进行再次灭活，以保证没有有致瘤风险的活肿瘤存在于处理后的样品中，并以克隆形成实验进行质量检测。
针对上述现有技术领域存在的难点，本发明提供了一种用于PBMC来源的体外扩增NK的培养体系的添加物组合。该组合物由OK432(A群溶血性链球菌灭活制剂)、凋亡的肿瘤细胞组成，使用时直接将两种组合物添加到培养体系中。
发明内容
本发明提供了一种由肿瘤细胞抗原提取物、细菌抗原与细胞因子添加物组合，该添加物组合可大幅提高外周血单个核细胞来源的体外扩增的自然杀伤细胞的纯度、迁移活性和杀伤活性。该发明技术属于生物医学领域，主要应用于原代免疫细胞细胞体外扩增及其相关的生物医学领域。
本发明提供一种自然杀伤细胞的培养方法，所述方法，包括以下步骤：
步骤1、白细胞分离：
从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；
步骤2、细胞培养：
单核细胞中加入培养基培养，得到自然杀伤细胞。
其中，步骤2中所述培养基中包括：OK432，凋亡的肿瘤细胞，
其中，步骤2中所述培养基中还包括：细胞因子OKT-3和重组人白细胞介素-2。
其中，步骤2中所述培养基还包括：细胞培养液(Corning，KBM502)。
其中，所述OK432，配制成液体制剂保存，使用时添加到培养基中。优选的所述OK432，配制方法如下：将OK432 1g溶解于细胞培养级1mlPBS中，配制成终浓度为1g/ml的储存液，按照200ul/支进行分装，保存于-20℃。
其中，所述凋亡的肿瘤细胞，是将自体肿瘤组织经过消化或将肿瘤细胞系制备成细胞悬液，在高压下处理再用Co60辐照得到，使用时加入到培养基中。
优选的，所述凋亡的肿瘤细胞，配制方法如下：将自体肿瘤组织经过消化或将肿瘤细胞系与X-VIVO15培养基制备成1×108个每毫升的细胞悬液。将细胞悬液灌注至双层无菌袋中进行密封，并以水为介质，放置于超高压灭菌处理设备不锈钢腔体内。以300-600MPa，优选方案500-600MPa的压力下处理10-30分钟，优选方案10分钟。在一个优选实施方案方式中，将样品取出后以3000Gy的辐照剂量进行Co60辐照灭菌。
本发明的步骤2：其中，OK432在培养体系中的浓度为0.01KE/ml，凋亡的肿瘤细胞优选为H520肿瘤细胞，添加数量与PBMC计数后的比例为1:5。OKT-3的用量为10ng/ml，IL-2的用量为500IU/ml，培养时间为14天。其中的基础细胞培养液选自KBM502。
为此本发明提供一种培养NK细胞的培养基，培养基中包括OK432，其在培养体系中的浓度为0.01KE/ml，H520肿瘤细胞，数量与PBMC的比例为1:5，OKT-3其在培养体系中的浓度为10ng/ml，IL-2其在培养体系中的浓度为500IU/ml，其余为基础细胞培养液KBM502。
本发明的培养基，用于NK细胞的培养，可以解决以下技术问题：
2.该培养方法提高了NK细胞的体外扩增能力，提高了细胞得率；
3.该培养方法可以增强NK细胞的活化性受体表达，提高NK细胞的杀伤能力；
4.该培养方法提高了NK细胞趋化性受体的表达，提高了NK细胞在体内的迁移能力。
本发明的有益效果：
1.提高了NK细胞的体外扩增能力；
2.提高了NK细胞在细胞终产品中的纯度；
3.提高了NK细胞表面活化性受体的表达水平，增强了NK细胞对靶细胞的杀伤能力；
4.提高了NK细胞表面趋化性受体的表达水平，增强了NK细胞在体内的归巢能力；
附图说明
图1.OK432和H520肿瘤细胞联用可以有效的刺激NK细胞体外的增殖
图2.OK432和H520肿瘤细胞提高了NK细胞亚群在总细胞中的比例
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1.
OK432(A群溶血性链球菌灭活制剂)的制备
将OK432(A群溶血性链球菌灭活制剂)1KE溶解于细胞培养级1mlPBS中，配制成终浓度为1ke/ml的储存液，按照200ul/支进行分装，保存于-20度。使用时，将添加物OK432储存液取出，根据培养体系的体积按照比例添加到第0天接种培养的细胞体系中混匀即可。
实施例2凋亡的肿瘤细胞的制备
将自体肿瘤组织经过消化或将肿瘤细胞系与X-VIVO15培养基制备成1×108个每毫升的细胞悬液。将细胞悬液灌注至双层无菌袋中进行密封，并以水为介质，放置于超高压灭菌处理设备不锈钢腔体内。以300-600MPa，优选方案500-600MPa的压力下处理10-30分钟，优选方案10分钟。在一个优选实施方案方式中，将样品取出后以3000Gy的辐照剂量进行Co60辐照灭菌。
实施例3.A群溶血性链球菌灭活制剂(OK432)与H520肿瘤细胞对NK细胞体外培养增殖能力的评价
采集健康人外周血30ml，按照文献报道的方法，使用人单个核细胞分离液(北京东方华辉生物医药科技有限公司，Cat.No.25610)进行PBMC的分离。分离后的PBMC利用台盼蓝拒染法进行计数，调整细胞数为0.5x106细胞/ml，用细胞培养液(Corning，KBM502)重悬。按照表1.中实验设计的分组方法，利用不同的培养配方进行NK细胞的体外培养，KBM502培养基购自Corning，人源化CD3单克隆抗体OKT-3购自Takara，重组人白细胞介素-2(IL-2)购自北京双鹭药业。OK432购自山东鲁亚制药。OK432在培养体系中的浓度为0.01KE/ml，H520肿瘤细胞数添加数量与PBMC计数后的比例为1:5。在分离PBMC当天，将细胞接种于6孔培养板中，使用OKT-3，10ng/ml和IL-2，500IU/ml刺激细胞；5天后，每3天根据细胞生长情况，向培养瓶中补加含有IL-2，500IU/ml的培养基，直至培养结束；不同实验组按照表1.的设计，在接种细胞当天，培养体系中添加OK432，或H520肿瘤细胞或者OK432和H520肿瘤细胞的组合物。各组起始培养细胞数为2x106，分别在培养中的第5，7，10，12和14天取样进行细胞计数，根据计数结果绘制细胞增殖曲线。
同时在第14天收获细胞时，利用流式细胞分析技术检测NK细胞占总细胞的百分率，评价NK细胞的纯度。实验方法简述如下：根据细胞计数结果，按照每个样品1x106细胞数从四组收获的NK细胞中进行取样。细胞离心后，重悬于200μl细胞保存液中，检测NK细胞表面标志物，包括CD3和CD56，其中CD3-/CD56+是NK细胞的表面标志性分子。
实验结果图1.显示，与对照组相比，单独添加OK432可以显著提高NK细胞体外的增殖能力；单独添加肿瘤细胞同样可以促进NK细胞体外的增殖，但与对照比比较，差异不明显；而同时向培养体系中添加OK432和H520肿瘤细胞，可以显著的提高NK体外扩增的能力。通过流式细胞分析，检测四组培养体系获得的NK细胞其表面标志性分子，对其纯度进行分析表明，使用OK432和H520肿瘤细胞的培养组中，NK细胞占总细胞的百分率明显高于其他组。
表1.实验分组
Figure BDA0001065340490000101
Figure BDA0001065340490000111
尽管如此，上述优选实施方案并不是限制性的。本发明是在最大范围内，根据肿瘤治疗的特定需求以不同的方法来实施。上述确定的优选实施方式描述了本发明,其中肿瘤细胞既可以从待治疗的愚者中获得，也可以从肿瘤细胞系或肿瘤细胞系库中获得。NK细胞可从待治疗的患者中获得，也可以从健康人中获得。

Claims (2)

1.一种自然杀伤细胞的培养方法，所述方法，包括以下步骤：
步骤1、白细胞分离：
从外周血中收集白细胞，分离单个核细胞(PBMC)；
步骤2、细胞培养：
单核细胞中加入培养基培养，得到自然杀伤细胞；
其中，步骤2中所述培养基中包括：OK432，凋亡的肿瘤细胞，细胞因子OKT-3和重组人白细胞介素-2以及细胞培养液KBM502；
步骤2中，OK432在培养体系中的浓度为0.01KE/ml，凋亡的肿瘤细胞为H520肿瘤细胞，添加数量与PBMC计数后的比例为1:5，OKT-3的用量为10ng/ml，IL-2的用量为500IU/ml，培养时间为14天，其中的基础细胞培养液选自KBM502；
其中，所述凋亡的肿瘤细胞，配制方法如下：将肿瘤细胞系与X-VIVO15培养基制备成1×108个每毫升的细胞悬液，将细胞悬液灌注至双层无菌袋中进行密封，并以水为介质，放置于超高压灭菌处理设备不锈钢腔体内，在300-600MPa的压力下处理10-30分钟，将样品取出后以3000Gy的辐照剂量进行Co60辐照灭菌。
2.一种培养NK细胞的培养基，培养基中包括OK432，其在培养体系中的浓度为0.01KE/ml，凋亡的H520肿瘤细胞，数量与PBMC的比例为1:5，OKT-3其在培养体系中的浓度为10ng/ml，IL-2其在培养体系中的浓度为500IU/ml，其余为基础细胞培养液KBM502；其中，所述凋亡的肿瘤细胞，配制方法如下：将肿瘤细胞系与X-VIVO15培养基制备成1×108个每毫升的细胞悬液，将细胞悬液灌注至双层无菌袋中进行密封，并以水为介质，放置于超高压灭菌处理设备不锈钢腔体内，在300-600MPa的压力下处理10-30分钟，将样品取出后以3000Gy的辐照剂量进行Co60辐照灭菌。
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