CN107974431B - 一种自然杀伤细胞的快速扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自然杀伤细胞快速扩增方法，包括以下步骤：步骤A：自然杀伤细胞培养基的制备；步骤B：自然杀伤细胞的分离培养；步骤B1：将抗凝外周血移至离心管中，离心，吸取上层血浆至另一离心管中备用；步骤B2：利用血浆体积的0.5‑2倍的生理盐水稀释所述血浆，获得稀释血液；步骤B3：将所述稀释血液用Ficoll‑Paque分离外周血单个核细胞PBMCs；步骤B4：将3‑5×107/ml的外周血单个核细胞PBMCs重悬于40‑60ml完全活化培养基的培养容器中，置于35‑40℃，2‑8％CO2培养箱中培养2‑4天；步骤B5：在所述完全活化培养基中补加细胞扩增培养基，继续培养，获得自然杀伤细胞。本发明中的培养方法可短时间内扩增大量自然杀伤细胞，培养基用量少，且培养简便、安全。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术，具体的涉及一种人自然杀伤细胞快速扩增方法。
背景技术
自然杀伤细胞(Natural killer cell，简称自然杀伤细胞)由Herberman等发现，由于自然杀伤细胞表达诸多淋巴细胞表面标记物及其来源于骨髓中淋巴样祖细胞，所以将其归为淋巴细胞。自然杀伤细胞属于白细胞的一个亚群，不需要抗原刺激即可杀伤靶细胞，可通过免疫清除和免疫监视的功能发挥抗肿瘤功能。
自然杀伤细胞清除肿瘤细胞的机制可以分为三大类：一是通过释放细胞毒性颗粒杀伤肿瘤细胞；二是通过细胞表面合成的蛋白激活肿瘤细胞凋亡系统杀伤肿瘤细胞；三是通过与肿瘤细胞表面抗体结合发挥细胞毒性作用进而杀伤靶细胞。
自然杀伤细胞具有在杀伤靶细胞的过程中无MHC限制性，可有效杀伤多种肿瘤细胞等优点。自然杀伤细胞治疗取得了一定的临床疗效，但是正常人体外周血中自然杀伤细胞数量较少，仅占外周血淋巴细胞的10％-20％。因此，如何获得高质量、高纯度的自然杀伤细胞成为自然杀伤细胞临床应用最为关键的问题之一。
目前自然杀伤细胞扩增的方法大部分是在培养体系中添加各种细胞因子，这些培养方法可以一定程度的刺激自然杀伤细胞生长，但是跟人体中自然杀伤细胞激活的方式有所区别，分离的自然杀伤细胞增殖速率与纯度都无法达到要求。有的方法虽然可以扩增1000倍左右，但是对于自然杀伤细胞比例较低或者自然杀伤细胞活性不强的人群，无法满足要求。另外，现有的培养方法比较繁琐，培养液用量大，不利于人员的培训以及方法的产品化，同时还造成了培养液的浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自然杀伤细胞快速扩增方法，用以解决现有培养方法培养的细胞效果差，培养过程复杂，培养液使用量大的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种自然杀伤细胞快速扩增方法，其包括以下步骤：
步骤A：自然杀伤细胞培养基的制备；
步骤B：自然杀伤细胞的分离培养；
步骤B1：将抗凝外周血移至离心管中，离心，吸取上层血浆至另一离心管中备用；
步骤B2：利用血浆体积的0.5-2倍的生理盐水稀释所述血浆，获得稀释血液；
步骤B3：将所述稀释血液用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞PBMCs；
步骤B4：将3-5×107/ml的外周血单个核细胞PBMCs重悬于40-60ml完全活化培养基的培养容器中，置于35-40℃，2-8％CO2培养箱中培养2-4天；
步骤B5：在所述完全活化培养基中补加细胞扩增培养基，继续培养8-12天，获得自然杀伤细胞。
本发明的一个实施例中，所述步骤A中，准备的培养基包括：完全活化培养基以及细胞扩增培养基；
所述完全活化培养基包括：浓度为800-1200U/ml的IL-12，800-1200U/ml的IL-15，800-1200U/ml的IFN-γ的DMEM培养基；
所述细胞扩增培养基包括：浓度为800-1200U/ml的IL-2，800-1200U/ml的IL-15的RPMI-1640培养基。
本发明的一个实施例中，所述完全活化培养基的用量为40-50ml；
所述细胞扩增培养基的用量为800-1200ml。
本发明的一个实施例中，所述步骤B4中，所述培养容器在重悬浮外周血单个核细胞之前，使用细胞活化液冲洗培养容器；
所述细胞活化液含有0.5-2ug/mlCD3单抗，0.5-2ug/mlCD16单抗，40-60ng/ml的SCF的pH7.2的PBS。
本发明的一个实施例中，所述培养容器为75cm3的细胞培养瓶，所述细胞活化液的用量为8-12ml。
本发明的一个实施例中，所述步骤B4中，所述培养容器中细胞的培养浓度为1-2×106/ml
本发明的一个实施例中，所述步骤B5中，培养的细胞浓度达到0.6-1.2×105/ml。
本发明具有如下优点：
本发明中细胞培养以培养瓶为例，也可以使用细胞培养袋、细胞培养皿、六孔板等各种加入了细胞因子的细胞培养容器。本发明的新型的自然杀伤细胞扩增方法，自然杀伤细胞培养耗时短、培养液用量小、操作简单，培养的自然杀伤细胞的应用效果好。
附图说明
图1为本发明的NK细胞对K562细胞杀伤比较图，结果有显著差异，P＜0.05。
图2为本发明的图NK细胞不同培养方法对K562细胞的杀伤作用比较图，比较结果有显著差异，P＜0.05。
图3为自然杀伤细胞经典培养方法获得的自然杀伤细胞流式检测图。
图4为本发明的自然杀伤细胞培养方法获得的自然杀伤细胞流式检测图。
图5为自然杀伤细胞经典培养方法获得的自然杀伤细胞流式检测图。
图6为本发明的自然杀伤细胞经典培养方法获得的自然杀伤细胞流式检测图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例的自然杀伤细胞快速扩增方法，其包括以下步骤：
步骤A：自然杀伤细胞培养基的制备，准备的培养基包括：完全活化培养基以及细胞扩增培养基；完全活化培养基包括：浓度为800U/ml的IL-12，800U/ml的IL-15，800U/ml的IFN-γ的DMEM培养基；细胞扩增培养基包括：浓度为800U/ml的IL-2，800U/ml的IL-15的RPMI-1640培养基。完全活化培养基的用量为40ml；细胞扩增培养基的用量为800ml。
步骤B：自然杀伤细胞的分离培养；
步骤B1：将50ml抗凝外周血移至50ml离心管中，700g离心，吸取上层血浆至另一离心管中，备用；
步骤B2：利用血浆体积的0.5倍的生理盐水稀释血浆，获得稀释血液；
步骤B3：将稀释血液用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞PBMCs；
步骤B4：将3×107/ml的外周血单个核细胞PBMCs重悬于40ml完全活化培养基的培养容器中，置于35℃，2％CO2培养箱中培养2天；培养容器中细胞的培养浓度为1×106/ml
培养容器在重悬浮外周血单个核细胞之前，使用细胞活化液冲洗培养容器；细胞活化液含有0.5ug/mlCD3单抗，0.5ug/mlCD16单抗，40ng/ml的干细胞因子SCF的pH7.2的PBS。培养容器为75cm3的细胞培养瓶，细胞活化液的用量为8ml，处理细胞培养瓶时，需放置在冰箱，4℃过夜。
步骤B5：在完全活化培养基中补加细胞扩增培养基，继续培养8天，培养的细胞浓度达到0.6×105/ml，获得自然杀伤细胞。
实施例2
本实施例的自然杀伤细胞快速扩增方法，其包括以下步骤：
步骤A：自然杀伤细胞培养基的制备，准备的培养基包括：完全活化培养基以及细胞扩增培养基；完全活化培养基包括：浓度为1000U/ml的IL-12，1000U/ml的IL-15，1000U/ml的IFN-γ的DMEM培养基；细胞扩增培养基包括：浓度为1000U/ml的IL-2，1000U/ml的IL-15的RPMI-1640培养基。完全活化培养基的用量为45ml；细胞扩增培养基的用量为1000ml。
步骤B：自然杀伤细胞的分离培养；
步骤B1：将80ml抗凝外周血移至50ml离心管中，700g离心，吸取上层血浆至另一离心管中，备用；
步骤B2：利用血浆体积的1倍的生理盐水稀释血浆，获得稀释血液；
步骤B3：将稀释血液用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞PBMCs；
步骤B4：将4×107/ml的外周血单个核细胞PBMCs重悬于50ml完全活化培养基的培养容器中，置于37℃，2-8％CO2培养箱中培养3天；培养容器中细胞的培养浓度为1.5×106/ml
培养容器在重悬浮外周血单个核细胞之前，使用细胞活化液冲洗培养容器；细胞活化液含有1ug/mlCD3单抗，1ug/mlCD16单抗，50ng/ml的SCF的pH7.2的PBS。培养容器为75cm3的细胞培养瓶，细胞活化液的用量为10ml，处理细胞培养瓶时，需放置在冰箱，4℃过夜。
步骤B5：在完全活化培养基中补加细胞扩增培养基，继续培养10天，培养的细胞浓度达到1×105/ml，获得自然杀伤细胞。
实施例3
本实施例的自然杀伤细胞快速扩增方法，其包括以下步骤：
步骤A：自然杀伤细胞培养基的制备，准备的培养基包括：完全活化培养基以及细胞扩增培养基；完全活化培养基包括：浓度为1200U/ml的IL-12，1200U/ml的IL-15，1200U/ml的IFN-γ的DMEM培养基；细胞扩增培养基包括：浓度为1200U/ml的IL-2，1200U/ml的IL-15的RPMI-1640培养基。完全活化培养基的用量为50ml；细胞扩增培养基的用量为1200ml。
步骤B：自然杀伤细胞的分离培养；
步骤B1：将100ml抗凝外周血移至50ml离心管中，700g离心，吸取上层血浆至另一离心管中，备用；
步骤B2：利用血浆体积的2倍的生理盐水稀释血浆，获得稀释血液；
步骤B3：将稀释血液用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞PBMCs；
步骤B4：将5×107/ml的外周血单个核细胞PBMCs重悬于60ml完全活化培养基的培养容器中，置于40℃，8％CO2培养箱中培养2-4天；培养容器中细胞的培养浓度为2×106/ml。
培养容器在重悬浮外周血单个核细胞之前，使用细胞活化液冲洗培养容器；细胞活化液含有2ug/mlCD3单抗，2ug/mlCD16单抗，60ng/ml的干细胞因子SCF的pH7.2的PBS。培养容器为75cm3的细胞培养瓶，细胞活化液的用量为12ml，处理细胞培养瓶时，需放置在冰箱，4℃过夜。
步骤B5：在完全活化培养基中补加细胞扩增培养基，继续培养12天，培养的细胞浓度达到1.2×105/ml，获得自然杀伤细胞。
试验例1本发明实施例2制备的自然杀伤细胞(NK细胞)对K562细胞的杀伤作用
应用乳酸脱氢酶试剂盒检测对K562肿瘤细胞的杀伤效果，方法为：培养第11天调整NK细胞密度至1×106/ml，以肿瘤细胞株K562作为靶细胞，按20:1、10:1、5:1和1:1靶效比加入到96孔板，每孔最终体积为200μL，并设置3个副孔为实验组。根据实验说明设立只加入靶细胞的自发释放组、只加入靶细胞并在检测前40min加入10μL/mL的Triton-100的最大释放组和只加入效应细胞的自发释放组，在37℃培养箱培养4h。1000rpm，离心5min，洗出上清50μL，再加50μL LDH反应液。室温避光放置30min后，测定492nm的吸光度值A，用下面公式计算杀伤活性。
经过分析结果如图1所示，不同靶效比情况下两种培养方法均有差别，本发明提供的方法培养的NK细胞对K562细胞的杀伤作用更强。
试验例2本发明的实施例1自然杀伤细胞(NK细胞)增殖倍数比较
将两种不同培养方法的细胞在3天、5天、7天、9天、11天分别计数算出扩增倍数，并进行统计分析。结果如下表：
NK增殖倍数比较统计表
*：与经典方法相比有差异(P＜0.05)，本发明可以让NK细胞扩增速度更快。
试验例3本发明的实施例2自然杀伤细胞(NK细胞)对K562细胞的杀伤作用
应用乳酸脱氢酶试剂盒检测对K562肿瘤细胞的杀伤效果，方法为：培养第11天调整NK细胞密度至1×106/ml,以肿瘤细胞株K562作为靶细胞，按20:1、10:1、5:1和1:1靶效比加入到96孔板，每孔最终体积为200μL，并设置3个副孔为实验组。根据实验说明设立只加入靶细胞的自发释放组、只加入靶细胞并在检测前40min加入10μL/mL的Triton-100的最大释放组和只加入效应细胞的自发释放组，在37℃培养箱培养4h。1000rpm，离心5min，洗出上清50μL，再加50μL LDH反应液。室温避光放置30min后，测定492nm的吸光度值A，用下面公式计算杀伤活性。
经过分析结果如图2所示，不同靶效比情况下两种培养方法均有差别，本发明提供的方法培养的NK细胞对K562细胞的杀伤作用更强。
试验例4本发明的实施例2的NK细胞增殖倍数比较
将两种不同培养方法的细胞在3天、5天、7天、9天、11天分别计数算出扩增倍数，并进行统计分析。结果如下表：
NK增殖倍数比较统计表
*：与经典培养方法相比有差异(P＜0.05)，本发明可以让NK细胞快速扩增。
本发明的NK细胞流式检测，取培养第9天的NK细胞用CD56-PE、CD3-FITC进行标记，流式检测结果如下：结果表明，如图3所示，L1区域为传统方法培养的自然杀伤细胞，如图4所示，L1区域为本发明方法培养的自然杀伤细胞，本发明的方法培养的NK细胞第九天时阳性率明显高于经典培养方法。
本发明的NK细胞流式检测，取培养第9天的NK细胞用CD56-PE、CD3-FITC进行标记，流式检测结果如下：如图5所示，L1区域为传统方法培养的自然杀伤细胞，如图6所示，L1区域为本发明方法培养的自然杀伤细胞，结果表明，本方法培养的NK细胞第九天时阳性率明显高于经典培养方法。
本发明中细胞培养以培养瓶为例，也可以使用细胞培养袋、细胞培养皿、六孔板等各种加入了细胞因子的细胞培养容器。本发明的新型的自然杀伤细胞扩增方法，自然杀伤细胞培养耗时短、培养液用量小、操作简单，培养的自然杀伤细胞的应用效果好。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种自然杀伤细胞快速扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤A：自然杀伤细胞培养基的制备，所述步骤A中，制备的培养基包括：完全活化培养基以及细胞扩增培养基；
所述完全活化培养基包括：浓度为800-1200U/ml的IL-12，800-1200U/ml的IL-15，800-1200U/ml的IFN-γ的DMEM培养基；
所述细胞扩增培养基包括：浓度为800-1200U/ml的IL-2，800-1200U/ml的IL-15的RPMI-1640培养基；
步骤B：自然杀伤细胞的分离培养；
步骤B1：将抗凝外周血移至离心管中，离心，吸取上层血浆至另一离心管中备用；
步骤B2：利用血浆体积的0.5-2倍的生理盐水稀释所述血浆，获得稀释血液；
步骤B3：将所述稀释血液用Ficoll-Paque分离外周血单个核细胞PBMCs；
步骤B4：将3-5×107/ml的外周血单个核细胞PBMCs重悬于40-60ml完全活化培养基的培养容器中，置于35-40℃，2-8％CO2培养箱中培养2-4天；
步骤B5：在所述完全活化培养基中补加细胞扩增培养基，继续培养8-12天，获得自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞快速扩增方法，其特在于，
所述完全活化培养基的用量为40-50ml；
所述细胞扩增培养基的用量为800-1200ml。
3.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞快速扩增方法，其特在于，
所述步骤B4中，所述培养容器在重悬浮外周血单个核细胞之前，使用细胞活化液冲洗培养容器；
所述细胞活化液含有0.5-2ug/mlCD3单抗，0.5-2ug/mlCD16单抗，40-60ng/ml的SCF的pH7.2的PBS。
4.根据权利要求3所述的自然杀伤细胞快速扩增方法，其特在于，
所述培养容器为75cm3的细胞培养瓶，所述细胞活化液的用量为8-12ml。
5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞快速扩增方法，其特在于，
所述步骤B4中，所述培养容器中细胞的培养浓度为1-2×106/ml。
6.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞快速扩增方法，其特在于，
所述步骤B5中，培养的细胞浓度达到0.6-1.2×105/ml。
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