CN114507640B - 一种高增殖能力和高细胞毒性cik细胞的培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用，涉及免疫细胞培养的技术领域，其中，一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞，本申请具有提高CIK细胞体外扩增的细胞增殖效果以及CIK细胞的细胞毒性的效果。

Description

一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用
技术领域
本申请涉及免疫细胞培养的技术领域，尤其是涉及一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗指的是通过恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法，包括单克隆抗体类免疫检查点抑制剂、治疗性抗体、癌症疫苗、细胞治疗以及小分子抑制剂等方法。
其中，细胞过继免疫治疗是肿瘤免疫疗法中的一种，具有疗效好、毒副作用小以及无耐药性问题等优点；其通过体外活化或扩增得到自体或异体免疫效应细胞，接着将免疫效应细胞输注至患者体内，免疫效应细胞在体内特异性识别并杀灭血液及组织中的癌细胞以及突变的细胞；从而达到肿瘤治疗的效果。
细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)是由人体外周血单个核细胞(PBMCs)诱导产生的异质细胞群，具有杀瘤效果，是肿瘤过继细胞免疫疗法中首选的细胞。CIK细胞不仅对肿瘤细胞有杀伤作用，而且能够增强患者的免疫功能，增强患者的免疫力。
治疗用CIK细胞通常来源于患者外周血单个核细胞，但是，外周血中杀伤细胞的数量有限，无法满足治疗过程中对于CIK细胞的大量需求，因此需要对CIK细胞进行体外扩增。
目前，最常使用CD3单克隆抗体、白细胞介素-1白细胞介素-2以及γ-干扰素等因子对PBMC细胞进行活化、扩增，存在着CIK细胞生长缓慢、增殖效果差以及对于肿瘤细胞的细胞毒性弱等问题。
发明内容
为了提高CIK细胞体外扩增的细胞增殖效果以及CIK细胞的细胞毒性，本申请提供一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法及其应用。
第一方面，本申请提供的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法采用如下的技术方案：
一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；
所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；
所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞。
优选的，所述第一组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
蒲公英甾醇：1.0-2.5μg/mL；
菊苣酸：1.5-4.0μg/mL；
五味子醇：0.3-1.5μg/mL。
通过采用上述技术方案，在进行CIK细胞体外扩增的过程中添加蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇，可提高CIK细胞的增殖能力，进而提高了CIK细胞的体外扩增效果。
优选的，所述第二组分包括干扰素-γ、鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
优选的，所述基础培养基独立地选自1640培养基、GT-T551培养基以及RMPI-1640培养基中的一种。
优选的，所述CIK细胞培养基还包括添加在基础培养基中的第三组分，所述第三组分还包括人参皂苷以及揽香烯。
优选的，所述第三组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
人参皂苷：5.0-7.5μg/mL；
揽香烯：0.3-2.0μg/mL。
通过采用上述技术方案，经过添加有人参皂苷和榄香烯的基础培养基培养得到的CIK细胞中，CD3+CD56+细胞亚群在CIK细胞群体中的比例提高，同时也提高了细胞内穿孔素和颗粒酶B的含量，从而提高了CIK细胞对肿瘤细胞的毒性，尤其是对血液恶心肿瘤细胞的毒性。
优选的，具体包括以下培养步骤：
S1、从新鲜的静脉外周血中分离得到PBMC细胞；
S2、将得到的PBMC细胞加入含有第一组分的基础培养基中，接着加入干扰素-γ，于37℃、5％CO2的培养环境中进行培养；
S3、在培养24h后加入鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
优选的，所述步骤S2中，添加完干扰素-γ后，补加添加有人参皂苷和揽香烯的基础培养基。
优选的，所述步骤S2和S3，保持PBMC细胞的密度为2-4×106个/mL。
第二方面，本申请还提供了一种如上述任一所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方式在造血干细胞恶性克隆性疾病治疗中的应用。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
(1)本申请提供了一种CIK细胞培养基，其在基础培养基中加入第一组分，第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇，使用该CIK细胞培养基对PBMC细胞刺激培养，经过一段时间的培养后，细胞扩增倍数相较于仅使用基础培养基有显著的提高，上述成分可促进CIK细胞的增殖，提高CIK细胞的增殖能力，进而提高了CIK细胞体外扩增效果；
(2)本申请提供的CIK细胞培养基中还加入了第三组分，第三组分包括人参皂苷和揽香烯，使用该CIK细胞培养基对PBMC细胞刺激培养，经过一段时间的培养后，CIK细胞中CD3+CD56+细胞亚群的比例提高，且CIK细胞中表达颗粒酶以及穿孔素的细胞比例提高，说明加入第三组分进行CIK细胞的体外培养可提高CIK细胞的细胞毒性。
具体实施方式
本申请涉及的试剂或试剂盒及其来源如下：
蒲公英甾醇(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS0704)；
菊苣酸(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS0514)；
五味子醇(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS0879)；
人参皂苷(成都植标化纯生物技术有限公司，货号为PCS2777)；
揽香烯(Merck公司，货号为63965-25MG)；
干扰素-γ(Merck公司，货号为I17001)；
鼠抗人CD3单克隆抗体(欧凯生物公司，货号为K103e6)；
重组人白细胞介素2(Merck公司，货号为HIL2-RO)；
重组人白细胞介素1α(Merck公司，货号为SRP3084)；
植物血凝素(Merck公司，货号为11249738001)。
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请提供了一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；
所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；
所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞。
在一个实施例中，所述第一组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
蒲公英甾醇：1.0-2.5μg/mL；
菊苣酸：1.5-4.0μg/mL；
五味子醇：0.3-1.5μg/mL。
本发明中，在基础培养基中添加第一组分蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇在提高CIK细胞的细胞增殖能力，进而提高了CIK细胞体外扩增的细胞增殖效果，并且当蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇在基础培养基中的终浓度为1.5μg/mL、2.0μg/mL以及1.0μg/mL时，CIK细胞的增殖能力高。
在一个实施例中，所述第二组分包括干扰素-γ、鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
本发明中，第二组分各物质在基础培养基中的终浓度为：
干扰素-γ：1000U/mL；
鼠抗人CD3单克隆抗体：50ng/mL；
重组人白细胞介素2：500U/mL；
重组人白细胞介素1α：100U/mL；
植物血凝素：500ng/mL。
在一个实施例中，所述基础培养基独立地选自GT-T551培养基和RMPI-1640培养基中的一种。
在一个实施例中，所述CIK细胞培养基还包括添加在基础培养基中的第三组分，所述第三组分还包括人参皂苷以及揽香烯。
在一个实施例中，所述第三组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
人参皂苷：5.0-7.5μg/mL；
揽香烯：0.3-2.0μg/mL。
本发明中，通过在基础培养基中加入第三组分人参皂苷以及揽香烯，可提高CIK细胞中效应细胞CD3+CD56+的比例，并且提高CIK细胞中表达颗粒酶B和穿孔素的细胞比例，进而实现提高CIK细胞毒性的效果。
在一个实施例中，具体包括以下培养步骤：
S1、从新鲜的静脉外周血中分离得到PBMC细胞；
S2、将得到的PBMC细胞加入含有第一组分的基础培养基中，接着加入干扰素-γ，于37℃、5％CO2的培养环境中进行培养；
S3、在培养24h后加入鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
在一个实施例中，所述步骤S2中，添加完干扰素-γ后，补加添加有人参皂苷和揽香烯的基础培养基。
在一个实施例中，所述步骤S2和S3中，保持PBMC细胞的密度为2-4×106个/mL。
本申请还提供了如上述任一所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法在造血干细胞恶性克隆性疾病治疗的应用。
实施例1：CIK细胞培养基
细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)，是一种以CD3+CD56+为主的淋巴细胞群，其是NK细胞样特性的T淋巴细胞，既有T淋巴细胞抵御肿瘤细胞的功能，还可以表现出NK细胞非MHC限制肿瘤细胞毒性。CIK细胞的体外扩增是通过从外周血中提取PBMC细胞，并且在培养基中添加干扰素-γ、CD3抗体以及重组人白细胞介素2共同刺激培养得到。
在CIK细胞体外扩增的过程中，使用到的培养基对CIK细胞的增殖能力以及细胞毒性有较大的影响，本实施例中提供了一种CIK细胞培养基，其组分以及含量如下所示：RMPI-1640培养基；
蒲公英甾醇：1.0μg/mL；
菊苣酸：1.5μg/mL；
五味子醇：0.3μg/mL；
干扰素-γ：1000U/mL；
鼠抗人CD3单克隆抗体：50ng/mL；
重组人白细胞介素2：500U/mL；
重组人白细胞介素1α：100U/mL；
植物血凝素：500ng/mL；
其中，蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇为第一组分，可提高CIK细胞的增殖能力；干扰素-γ、鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝为第二组分，诱导PBMC细胞分化为CIK细胞。
实施例2：CIK细胞培养基
本实施例与实施例1不同之处在于，CIK细胞培养基中加入的第一组分的浓度不同，其浓度如下所示：
蒲公英甾醇：1.5μg/mL；
菊苣酸：2.0μg/mL；
五味子醇：1.0μg/mL。
实施例3:CIK细胞培养基
本实施例与实施例1不同之处在于，CIK细胞培养基中加入的第一组分的浓度不同，其浓度如下所示：
蒲公英甾醇：2.5μg/mL；
菊苣酸：4.0μg/mL；
五味子醇：1.5μg/mL。
实施例4：CIK细胞培养基
本实施例与实施2不同之处在于，CIK细胞培养基中还加入的第三组分，可提高CIK细胞的细胞毒性，其成分以及浓度如下所示：
人参皂苷：5.0μg/mL；
揽香烯：0.3μg/mL。
实施例5：CIK细胞培养基
本实施例与实施4不同之处在于，CIK细胞培养基中加入的第三组分的浓度不同，其浓度如下所示：
人参皂苷：6.5μg/mL；
揽香烯：1.5μg/mL。
实施例6：CIK细胞培养基
本实施例与实施4不同之处在于，CIK细胞培养基中加入的第三组分的浓度不同，其浓度如下所示：
人参皂苷：7.5μg/mL；
揽香烯：2.0μg/mL。
实施例7：一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法
在本实施例中提供可CIK细胞的培养，具体包括以下步骤：
S1、取新鲜静脉外周血20mL，加入肝素抗凝；
S2、加入Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心，吸取白膜层，获取PBMC细胞，PBS溶液洗涤2次；
S3、往RMPI-1640培养基中加入1.5μg/mL蒲公英甾醇、2.5μg/mL菊苣酸以及0.3μg/mL五味子醇，取新鲜分离的PBMC加入上述培养基中，并加入干扰素-γ，于37℃、5％CO2下培养；
S4、在培养24h后，加入鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
其中，步骤S3和S4中干扰素-γ在RMPI-1640培养基中的终浓度为1000U/mL，鼠抗人CD3单克隆抗体在RMPI-1640培养基中的终浓度为50ng/mL，重组人白细胞介素2在RMPI-1640培养基中的终浓度为500U/mL；重组人白细胞介素1α在RMPI-1640培养基中的终浓度为100U/mL；植物血凝素在RMPI-1640培养基中的终浓度为500ng/mL。
并且，在上述步骤中，保持CIK细胞培养基中PBMC细胞的密度为3×106个/mL。
实施例8：一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法本实施例与实施例5的不同之处在于，在步骤S3中，添加完干扰素-γ后2h，补加添加有人参皂苷和揽香烯的RMPI-1640培养基，且人参皂苷和揽香烯的终浓度为6.5μg/mL和1.5μg/mL。
实验1：CIK细胞的增殖能力
取新鲜分离的PBMC，使用RMPI-1640培养基、以及实施例1-6提供的CIK细胞培养基，使用实施例7和8提供的培养方法进行CIK细胞的体外诱导扩增，并在培养14天时取一部分细胞悬液，500g离心5min，弃上清，再用生理盐水稀释至细胞密度在3×106个/mL左右，并在细胞计数仪上用AOPI染料进行细胞浓度的检测，平行测定3组，并计算细胞扩殖倍数，结果如表1所示：
表1.
由表1可知，在CIK细胞体外扩增的过程中引入蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇后相较于仅使用RMPI-1640培养基，经过14天培养后细胞扩增倍数明显增大，说明加入公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇可提高CIK细胞的增殖能力；且当蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇在培养基中的终浓度分别为1.5μg/mL、2.0μg/mL以及1.0μg/mL时，CIK细胞的细胞扩增倍数最大，此时CIK细胞具有较强的细胞扩增能力。
并且，加入人参皂苷以及揽香烯后，CIK细胞的细胞扩增倍数增大，说明人参皂苷以及揽香烯可增强CIK细胞的细胞增殖能力。
实验2：CIK细胞的细胞表型
取新鲜分离的PBMC，使用RMPI-1640培养基、以及实施例1-6提供的CIK细胞培养基，使用实施例7和8提供的培养方法进行CIK细胞的体外诱导扩增，并在培养14天时收取(5-10)×105个细胞，分别采用FITC-CD3、PE-CD56、PerCP-CD8荧光抗体标记细胞，4℃孵育30min后应用FACS Aria流式细胞仪对细胞的表型进行检测，并使用软件对数据进行分析，结果如表2所示：
表2.
由表2可知，在RMPI-1640培养基中添加第一组分后培养得到的CIK细胞各类效应细胞的比例与仅用RMPI-1640培养基无显著性差异，说明在培养的过程中加入蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇不影响各类效应细胞的比例。
同时，在RMPI-1640培养基中添加第三组分后培养得到的CIK细胞各类效应细胞的比例与仅用RMPI-1640培养基差异较大，其中，CD3+CD56+细胞的比例增加，且当且人参皂苷和揽香烯的浓度为6.5μg/mL、1.5μg/mL时，CD3+CD56+细胞的比例最高。
在CIK细胞中，CD3+CD56+双阳性细胞是最具有细胞毒性的，在CIK细胞体外扩增的过程中加入人参皂苷和揽香烯，可提高CD3+CD56+细胞亚群的比例，进而增大CIK细胞的细胞毒性。
实验3：CIK细胞的颗粒酶B以及穿孔素表达
取新鲜分离的PBMC，使用RMPI-1640培养基、以及实施例1-6提供的CIK细胞培养基，使用实施例7和8提供的培养方法进行CIK细胞的体外诱导扩增，并在培养14天时收取CIK细胞，500g离心5min，弃上清，用生理盐水清洗1遍，并且用生理盐水稀释至细胞密度为1×107个/mL，取50μL细胞悬液，并加入FITC标记的V450-颗粒酶B荧光抗体和APC标记的BV421-穿孔素流式荧光抗体，避光孵育15-20min，加入1mL PBS 300g离心5min，然后加入1mL PBS重悬，再300g离心5min，洗涤后用0.35mL PBS重悬细胞，通过流式细胞术检测和分析细胞，结果如表3所示：
表3.
由表3可知，使用添加了第一组分的RMPI-1640培养基进行扩增得到的CIK细胞中表达颗粒酶B以及穿孔素的细胞比例提高，且再添加第二组分，可进一步提高CIK细胞中表达颗粒酶B以及穿孔素的细胞比例。
CIK细胞通过穿孔素和颗粒酶B的释放来发挥其的细胞毒性，在CIK细胞体外扩增的过程中添加第一组分和第二组分，提高CIK细胞中表达颗粒酶B以及穿孔素的细胞比例，进而实现提高CIK细胞毒性的效果。
实验4：CIK细胞的细胞毒性
取新鲜分离的PBMC，使用RMPI-1640培养基、以及实施例1-6提供的CIK细胞培养基，使用实施例7和8提供的培养方法进行CIK细胞的体外诱导扩增，并在培养14天时收取CIK细胞，以CIK细胞作为效应细胞(E)，HepG2、A549、MCF-7、HL-60以及SKM-1细胞作为靶细胞(T)，将1×105CIK细胞和1×104靶细胞按照效靶比10：1接种于100μL含10％胎牛血清的RMPI-1640培养基中，置于37℃，5％CO2下培养箱中孵育24h。之后每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2-4h，最后用酶标仪测出各孔培养液在450nm处的OD值，设置空白对照，计算得到杀伤活性，结果如表4所示：
表4.
由表4可知，添加了第一组分和第二组分所扩增得到的CIK细胞的杀伤活性相较于通过RMPI-1640培养基培养扩增得到的CIK细胞显著提高，说明在CIK细胞扩增的过程中添加第一组分和第二组分可增强CIK细胞的细胞毒性。
并且，添加了第二组分所扩增得到的CIK细胞对于HL-60和SKM-1细胞的杀伤活性最高可达到39.62％，在造血干细胞恶性克隆性疾病治疗的细胞过继免疫治疗中具有较大的应用前景。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (7)

1.一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，使用CIK细胞培养基进行CIK细胞体外扩增，所述CIK细胞培养基包括基础培养基和添加在基础培养基中的第一组分和第二组分；
所述第一组分包括蒲公英甾醇、菊苣酸以及五味子醇；
所述第一组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
蒲公英甾醇：1.0-2.5μg/mL；
菊苣酸：1.5-4.0μg/mL；
五味子醇：0.3-1.5μg/mL；
所述第二组分可诱导PBMC细胞分化为CIK细胞；
所述第二组分包括干扰素-γ、鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素；
所述第二组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
干扰素-γ：1000U/mL；
鼠抗人CD3单克隆抗体：50ng/mL；
重组人白细胞介素2：500U/mL；
重组人白细胞介素1α：100U/mL；
植物血凝素：500ng/mL。
2.根据权利要求1所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述基础培养基独立地选自1640培养基、GT-T551培养基以及RMPI-1640培养基中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述CIK细胞培养基还包括添加在基础培养基中的第三组分，所述第三组分还包括人参皂苷以及揽香烯。
4.根据权利要求3所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述第三组分中各物质在基础培养基中的终浓度为：
人参皂苷：5.0-7.5μg/mL；
揽香烯：0.3-2.0μg/mL。
5.根据权利要求3所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，具体包括以下培养步骤：
S1、从新鲜的静脉外周血中分离得到PBMC细胞；
S2、将得到的PBMC细胞加入含有第一组分的基础培养基中，接着加入干扰素-γ，于37℃、5％CO2的培养环境中进行培养；
S3、在培养24h后加入鼠抗人CD3单克隆抗体、重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素1α以及植物血凝素。
6.根据权利要求5所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2中，添加完干扰素-γ后2h，补加添加有人参皂苷和揽香烯的基础培养基。
7.根据权利要求5所述的一种高增殖能力和高细胞毒性CIK细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤S2和S3中，保持PBMC细胞的密度为2-4×106个/mL。
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