JP2019504632A - Ｎｋ細胞培養用培地添加キット、及びキットを用いるｎｋ細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫療法に適用されるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の培養方法、より詳細には、ヒト末梢血由来のリンパ球を培養して、悪性腫瘍に対する顕著な治療効果を有するＮＫ細胞の割合を顕著に高めつつ、ＮＫ細胞を効果的に増幅且つ活性化できるＮＫ細胞培養用培地添加キット、及び前記キットを用いるＮＫ細胞培養方法に関する。【選択図】図３

Description

本発明は、免疫療法に適用されるナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を培養する方法、より詳細には、効率的にＮＫ細胞を増幅及び活性化することができ、ＮＫ細胞の割合を著しく増加させることができるヒト末梢血由来のリンパ球を培養することにより、悪性腫瘍の治療に有効なＮＫ細胞を培養する方法、及びキットを用いるＮＫ細胞を培養する方法に関する。

免疫療法は、患者の血液から得られたナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞などの強力な作用免疫細胞を患者に注入する方法である。患者の血液を使用するので、副作用は従来の化学療法よりも少なく、投与方法が単純であり、最近、積極的に研究されている。

免疫療法によって活性化される免疫細胞の中で、ＮＫ細胞は、感染したウイルス及び腫瘍細胞を死滅させることに優れるが、大部分の正常細胞は死滅させない、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）としての特徴を有する。ＮＫ細胞の抗癌メカニズムは、壊死、アポトーシス、又はその両方である。ＮＫ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びインターフェロンなどのサイトカインに応答することによって細胞毒性、分泌、及び増殖機能を高める。ヒトにおけるＮＫ細胞の表現型は、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）とＣＤ５６であり、これらは、ＴＲＣ（Ｔ細胞受容体複合体）を細胞表面に発現しないので、ＮＫ細胞のマーカーとして使用されている。

このようなＮＫ細胞は、人体の初期の防御機構及び腫瘍免疫において重要な役割を果たすことが知られている。ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現のために、免疫学的獲得なしに、特定の自己細胞、同種細胞、及び異種癌細胞さえも死滅させる。特に、ＮＫ細胞は、クラス１ＭＨＣの発現が低いか又はそれを発現しない標的細胞をより良好に死滅させる。したがって、ＮＫ細胞は、ＭＨＣを発現しない大部分の癌細胞と、幾つかのウイルス感染細胞及びサルモネラ・チフィなどの細菌を効果的に死滅させることができる。

上述したように、ＮＫ細胞は、癌細胞に対して優れた効果を発揮する。しかし、健常人においては、末梢血リンパ球の僅か５％〜１５％だけがＮＫ細胞である。そのパーセンテージは、癌患者では１％未満にまで減少し、別の増幅工程なしに癌細胞を効果的に攻撃するには限界がある。

ＩＬ−２などのサイトカイン及びＣＤ３などの抗体は、免疫細胞、特にＮＫ細胞の活性化及び増殖に用いられる。現在の技術においては、ＣＤ３抗体が、免疫細胞の増殖において非常に重要な役割を果たす。問題は、この抗体を用いて免疫細胞を活性化することが非常に困難であるということである。即ち、免疫細胞培養における現在の一般的な技術は、ＣＤ３抗体をフラスコ内に固定化し、それを所定時間刺激することである。しかしながら、各個体は免疫細胞に対する感受性が異なり、細胞培養条件さえも作業者の技能レベルで異なる。例えば、ＣＤ３抗体の刺激が低いか又は殆どない場合、免疫細胞は良好に増殖しない。また、刺激が強過ぎると、ＮＫ細胞が殆ど増殖しない一方で、ＮＫＴ細胞又はＴ細胞が増殖する。この場合、Ｔ細胞が特に増殖するため、多数のＮＫ細胞を得ることは容易ではない。

ＣＤ３抗体の強い刺激が最初から適用されると、未成熟の前駆細胞が成熟し、Ｔ細胞になる。したがって、ＣＤ３抗体を僅かに刺激する現在一般的に用いられている方法は、個体差や周囲環境の影響を強く受けるため、大量に増殖した活性化ＮＫ細胞を得ることが困難である。

したがって、固定化されたＣＤ３抗体をフラスコから反応させる際の、現在の方法の困難性を排除しつつ、ＮＫ細胞を安定的に増幅させ、且つ大量増殖させることができる新規な培養培地組成物及び培養方法を開発する必要性がある。

技術的課題
上記問題点を解決する努力の結果、本発明者は、刺激後の固定化ＣＤ３抗体を除去することなく、リンパ球培養溶液中のＮＫ細胞を安定的に増幅する方法を開発した。

したがって、本発明の目的は、リンパ球を刺激するために培養容器中で固定化された抗ＣＤ３抗体をインキュベートしつつリンパ球（免疫細胞）を所定時間培養するという煩雑なプロセスを排除して、最終リンパ球培養溶液でＮＫ細胞を安定的に増幅するための組成物を含む培養培地添加キットを提供することにある。

本発明の別の目的は、リンパ球が刺激される順序を特定することによって、培養培地添加キットに含まれるユニットを構成する添加剤を順次用いることにより、Ｔ細胞の比率が低くＮＫ細胞の比率が著しく高い、安定なＮＫ細胞の培養方法を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、リンパ球培養中にＮＫ細胞が著しく高い比率で増殖できるように培養工程中に添加すべき培養培地添加剤を標準化することにより、ＮＫ細胞を非常に容易に培養することができる培養培地添加キット及びその培養方法を提供することにある。

本発明の目的は、上記の目的に限定されるものではなく、当業者であれば、記載されていない他の目的を以下の説明から明確に理解できよう。

課題解決手段
本発明の目的を達成するために、本発明は、ＮＫ細胞培養用培地添加キットであって、
ＩＬ−２、Ｌ−グルタミン、及び細胞培養培地を含む基本溶液を含むＢユニット（約３６００ＩＵのＩＬ−２と５μＭ／ｍＬのＬ−グルタミン）と；
ＩＬ−１２とＩＬ−１８を前記基本溶液に含み、ＩＬ−１２の濃度が０．５〜５ｎｇ／ｍＬであり、ＩＬ−１８の濃度が２〜５０ｎｇ／ｍＬであるサイトカイン１溶液を含むＣ１ユニットと；
前記基本溶液に溶解されたＩＬ−１５を含み、ＩＬ−１５の濃度が１０〜３５ｎｇ／ｍＬであるサイトカイン２溶液を含むＣ２ユニットと；
前記基本溶液に溶解された抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体を含み、抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体の濃度が０．１〜１５μｇ／ｍＬである抗体１溶液を含むＡ１ユニットと；
前記抗体１溶液と前記基本溶液とを１：６〜１０の体積比で含む抗体２溶液を含むＡ２ユニットと；
前記サイトカイン１溶液に溶解された抗ＣＤ３抗体を含み、抗ＣＤ３抗体の濃度が１〜１２μｇ／ｍＬである抗体−サイトカイン混合溶液を含むＤユニットとを含むＮＫ細胞培養用培地添加キットを提供する。

好ましい実施形態では、前記Ａ１ユニットは、前記Ｄユニットよりも先にリンパ球培養培地に添加される。

好ましい実施形態では、前記Ａ１ユニットに含まれる前記抗ＣＤ１６、前記抗ＣＤ５６、及び前記基本溶液を別々にパッケージングし、培地添加工程で混合する。

好ましい実施形態では、前記抗体１溶液の抗ＣＤ１６、抗ＣＤ５６、及び前記基本溶液、並びにＡ２ユニットに含まれる前記基本溶液を別々にパッケージングし、培地添加工程で混合する。

好ましい実施形態では、前記Ｄユニットに含まれる抗ＣＤ３及びサイトカイン１溶液を別々にパッケージングし、培地添加工程で混合する。

好ましい実施形態では、前記ユニットは、Ａ１ユニット、Ｄユニット、Ｃ１ユニット、Ａ２ユニット、Ｃ２ユニット、Ａ２ユニット、及びＢユニットの順にリンパ球培養培地に添加されるように構成される。

本発明は、ＮＫ細胞を培養する方法であって、
分離されたリンパ球にＡ１ユニットの抗体１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第１の工程と；
前記第１の工程から回収された培地にＤユニットの抗体−サイトカイン混合溶液を添加する第２の工程と；
前記第２の工程から回収された培地にＣ１ユニットのサイトカイン１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第３の工程と；
前記第３の工程から回収された培地にＡ１ユニットの抗体２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第４の工程と；
前記第４の工程から回収された培地にＣ２ユニットのサイトカイン２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第５の工程と；
前記第５の工程から回収された培地に抗体３溶液及び自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第６の工程と；
工程６から回収された培地にＢユニットの前記基本溶液と自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第７の工程とを含む方法を提供する。

好ましい実施形態では、前記抗体３溶液は、前記Ａ２ユニットを構成する前記抗体２溶液の一部を用いる。

好ましい実施形態では、前記自己血漿は、血液１ｍＬ当たり４０超のｕｓｐ単位のヘパリンを含む。

好ましい実施形態では、自己血漿又はＦＢＳなどの添加量は、全培地の１０体積％未満である。

好ましい実施形態では、前記第１の工程と前記第２の工程との間の間隔が、２４時間以上である。

好ましい実施形態では、前記第４の工程と前記第６の工程はそれぞれ、前の工程よりも大きな体積を有する培養容器内で培養される。

本発明は、また、前記培養方法によって又は前記培地添加キットのいずれか１つで培養されたＮＫ細胞培養培地のいずれか１つで培養されたＮＫ細胞培養溶液を提供する。

好ましい実施形態では、前記ＮＫ細胞培養溶液に含まれる細胞の数が３．１×１０^９以上であり、ＮＫ細胞の比率が８０％以上である。

本発明の効果
本発明は以下の利点を有する。

第１に、本発明のＮＫ細胞培養培地添加キットは、固定化された抗ＣＤ３抗体と共に細胞を培養して所定時間リンパ球を刺激する煩雑なプロセスを排除しつつ、ＮＫ細胞をリンパ球培養培地から安定的に増幅するための組成物を提供する。

更に、本発明のＮＫ細胞培養方法は、リンパ球が刺激される順序を特定して、前記培地添加キットに含まれるユニットを構成する添加剤を順次用いることによって、Ｔ細胞の比率が低く、ＮＫ細胞の比率が著しく高い、安定且つ活性なリンパ球を提供する。

また、本発明によれば、リンパ球の培養中にＮＫ細胞が著しく高い速度で増殖することができるように、培養工程中に添加すべき培養培地添加剤を標準化することにより、ＮＫ細胞を容易に培養することができる。

図１は、本発明の実施形態にかかるＮＫ細胞培養培地添加キットを用いたＮＫ細胞培養法により得られた活性化リンパ球の表現型変化を示すグラフである。 図２は、本発明の他の実施形態にかかるＮＫ細胞培養培地添加キットを用いたＮＫ細胞培養法により得られた活性化リンパ球の表現型変化を示すグラフである。 図３は、本発明の他の実施形態にかかるＮＫ細胞培養培地添加キットを用いたＮＫ細胞培養法により得られた活性化リンパ球の表現型変化を示すグラフである。

本発明を実施するための形態
本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の表現は、文脈上、複数を含まないことが明示されない限り、複数の表現を含む。本願において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」は、明細書に記載される特徴、数字、及び構造、工程、操作、成分、部品、又はそれらの組合せに言及するために用いられ、１つ以上の他の特徴又は数字の存在を特定することが意図されており、本発明が、工程、操作、成分、部品、又はそれらの組合せの存在又は付加を排除するものではないことを理解されたい。

本明細書中、第１、第２などの用語が、各種要素を説明するために使用され得るが、これらの要素は、これらの用語によって限定されるべきではないことが理解されよう。これらの用語は、ある要素を別の要素と区別するために使用される。例えば、第１の成分は、本発明の範囲から逸脱することなく、第２の成分と称することができ、同様に、前記第２の成分は、第１の成分と称することができる。

特段の断りがない限り、技術的又は科学的用語を含む、本明細書で使用される用語はいずれも、本発明が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義されている用語などの用語は、関連技術の文脈におけるそれらの意味に合致した意味を有するものと解釈され、本明細書中で明示的にそうであることが定義されない限り、理想と考えられる又は過度に形式的な意味では解釈されないと解釈されるべきである。

以下、本発明の技術的構成を、添付の図面及び好ましい実施形態を参照して詳細に説明する

しかしながら、本発明は、本明細書に記載された実施形態に限定されず、他の形態で実施されてもよい。本明細書を通して本発明を説明するために使用される同一参照番号は、同一要素を示す。

本発明の技術的特徴は、リンパ球を刺激するために培養容器中で固定化された抗ＣＤ３抗体をインキュベートしつつリンパ球（免疫細胞）を所定時間培養するという煩雑なプロセスを排除して、最終リンパ球培養溶液でＮＫ細胞を安定的に増幅するための組成物を含むＮＫ細胞培養培地添加キット、及びこれを用いる培養方法である。

即ち、本発明においては、抗ＣＤ１６抗体と抗ＣＤ５６抗体で予め刺激し、次いで、約２４〜４８時間後に、抗ＣＤ３抗体を培地に添加することによって、ＮＫ細胞が最低５００倍、最大５，０００倍以上に安定的に増殖することができる。

実験結果によれば、未成熟な前駆細胞をＮＫ細胞に分化するように誘導し、成熟前のＮＫ細胞を抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体で活性化し、その後、抗ＣＤ３抗体により刺激されたＴ細胞によるＮＫ細胞の活性化を行うと、抗ＣＤ３抗体が培養培地中で分解されるまで、更なる刺激があっても、ＮＫ細胞が大量に増殖した。リンパ球を刺激するために、培養容器中で固定化された抗ＣＤ３抗体をインキュベートしつつ、リンパ球（免疫細胞）を所定時間培養するという煩雑なプロセスなしで、非常に高いＮＫ細胞の比率でリンパ球を培養することが可能である。

本発明は、培養の各段階において培地に添加することができるように個別にパッケージングされているＮＫ細胞培養用培地添加キットであって、前記Ｂユニット、前記Ｃ１ユニット、前記Ｃ２ユニット、前記Ａ１ユニット、前記Ａ２ユニット、及び前記Ｄユニットなどの異なる成分を含むキットに関する。ここで、リンパ球培養物中で培養された細胞の大部分がＮＫ細胞であり得るように、リンパ球培養培地への影響を考慮してこれらのユニットが含まれることが決定される。リンパ球培養培地に対して前記Ａ１ユニット、前記Ｄユニット、前記Ｃ１ユニット、前記Ａ２ユニット、前記Ａ２ユニット、及び前記Ｂユニットの順で、ＮＫ細胞を従来の培養法に比べて少なくとも５００〜５０００倍に安定的に増殖させることができる。

第１に、Ｂユニットは基本溶液を含み、前記基本溶液は、ＩＬ−２、Ｌ−グルタミン、及び細胞培養培地を含む。ＩＬ−２の量は、約１００ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約２００〜２５０ｎｇ／ｍＬ（３２４０ＩＵ／ｍＬ〜４０００ＩＵ／ｍＬ）である。

ＩＬ−２は、Ｔ細胞が抗原を認識することによって活性化されたときに作られる１４〜１７ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質である。ＩＬ−２は、Ｔ細胞から分泌され、産生されたＴ細胞と反応し、Ｔ細胞の増殖を促進する。ＩＬ−２は、また、増殖を促進し、ＮＫ細胞の殺滅能力を向上し、Ｂ細胞の増殖を促進する。Ｌ−グルタミンは、免疫細胞培養のための栄養素として作用する成分である。細胞培養培地は、浮遊細胞用基本培養培地となり得る。

Ｂユニットの具体的な実施形態としては、２ｍｇのＩＬ−２及び１００ｍｌの５００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液を、前記浮遊細胞用基本培養培地（市販の細胞培養培地、ＩＬ−２又はＬ−グルタミンが既に前記基本培地に存在する場合、その量は、最終濃度を調整することで調整する）に添加し、１０Ｌの最終溶液を得て、前記基本溶液（Ｂユニット）を調製する。

Ｃ１ユニットは、サイトカイン１溶液を含み、サイトカイン１溶液は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び基本溶液を含む。ここで、サイトカイン１溶液中のＩＬ−１２の量は、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３ｎｇ／ｍｌ濃度、より好ましくは１．５〜２．５μｇ／ｍＬである。サイトカイン１溶液中のＩＬ−１８の量は、約２〜５０ｎｇ／ｍｌであり、好ましくは８〜２０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１１〜１５ｎｇ／ｍＬである。

ＩＬ−１２は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、及びＢ細胞において産生される。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞及びＴリンパ球からのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生を誘導し、ＩＦＮ−γを阻害するＩＬ−４の産生を低減する。更に、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害性を増加させる。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞におけるＩＬ−２シグナル伝達系と密接な関係を有する。また、ＩＬ−２は、ＮＫ細胞におけるＩＬ−１２β１受容体及びＩＬ−１２β２受容体の発現を誘導し、ＩＬ−１２シグナル伝達系に関連するタンパク質を発現及び活性化する。このメカニズムは、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ産生能及び標的細胞殺滅能力において十分に記載されている。ＩＬ−１２β２受容体は、ＩＬ−１２の機能に重要な役割を果たすと見られ、Ｔｈ２の産生を抑制し、Ｔｈ１の産生を刺激する研究が報告されている。Ｔ細胞及びＮＫ細胞におけるＩＬ−１２シグナル伝達は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に関与し、ＩＬ−１２β２受容体の活性は、転写因子ＳＴＡＴ４のリン酸化を誘導及び活性化する上で重要な役割を果たす。

ＩＬ−１８は、マクロファージからも産生される炎症促進性サイトカイン遺伝子である。ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８受容体に結合し、ＩＬ−１２と共に、細菌又はウイルス感染細胞に対する免疫応答を引き起こし、ＮＫ細胞及びＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を増加させる。

Ｃ１ユニットの具体例としては、１０μｇのＩＬ−１２と５０μｇのＩＬ−１８を水に溶解して１０ｍｌのサイトカイン溶液（ＩＬ−１２濃度：１μｇ／ｍＬ、ＩＬ−１８濃度：５μｇ／ｍＬ）を作製する。サイトカイン１溶液（Ｃ１ユニット）は、前記サイトカイン溶液１ｍＬを基本溶液５００ｍＬに溶解することによって調製され、ＩＬ−１２が２ｎｇ／ｍＬの濃度で含有され、ＩＬ−１８が１０ｎｇ／ｍＬの濃度で含有される。

Ｃ２ユニットは、サイトカイン２溶液を含む、サイトカイン２溶液は、ＩＬ−１５及び基本溶液を含む。サイトカイン２溶液中のＩＬ−１５の濃度は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１５〜２５ｎｇ／ｍＬであり得る。

よく知られているように、ＩＬ−１５は、４つのヘリックスバンドルサイトカインファミリーに属する多機能サイトカインであり、増殖、生存、及び分化において重要な役割を果たすことが知られている。更に、ＩＬ−１５は、より多様な細胞において発現し、したがって、ＩＬ−２よりもより広く調節され得る。それは免疫応答の各フェーズに影響し、各ステージでの免疫応答に関与する多くのタイプの細胞に作用する。一連の研究により、ＩＬ−１５が記憶Ｔ細胞の形成に直接関与していることが示されている。

Ｃ２ユニットの特定の実施形態としては、ＩＬ−１５を基本溶液に２０ｎｇ／ｍＬの濃度で溶解することによって、サイトカイン２溶液（Ｃ２ユニット）を調製することができる。

Ａ１ユニットは、抗体１溶液を含み、前記抗体１溶液は、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ５６、及び基本溶液を含む。Ａ１ユニットを構成する抗体１溶液中の抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６の濃度は、それぞれ０．１〜２．０μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜０．７μｇ／ｍＬであることができる。

よく知られているように、ＣＤ１６及びＣＤ５６は、ＮＫ細胞の表面タンパク質である。抗ＣＤ１６抗体又は抗原抗体複合体の存在下でリンパ球を培養すると、ＣＤ１６抗原は、ＮＫ細胞に添加されてシグナル伝達を引き起こす。ＮＫ細胞から、ＩＬ−２受容体のα−鎖などのトランスフェリン受容体を発現させることができる、又は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）又はＩＦＮ−γを産生することができる。抗ＣＤ５６抗体はまた、抗ＣＤ１６抗体と同様の機能を果たす。

Ａ１ユニットの具体例としては、６μＬの各抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を、１０ｍＬの基本溶液に溶解して抗体１溶液（Ａ１ユニット）を調製する。

Ａ２ユニットは、抗体２溶液を含み、前記抗体２溶液は、抗体溶液１：基本溶液を１：６〜１０の体積比で含有する。Ａ２ユニットの特定の実施形態では、６．５ｍｌの抗体１溶液に３０ｍｌの基本溶液を混合することによって、抗体溶液２を調製することができる。抗体２溶液の一部は、Ａ２ユニットを構成することができ、一部は、Ａ３ユニットを構成することができる。

Ａ１ユニット〜Ａ３ユニットは、抗体が既に基本溶液に添加されている場合、冷蔵保存で１〜２ヶ月間使用することができる。貯蔵寿命を延ばすために、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ５６、及び基本溶液を別々にパッケージングし、培地添加工程中で混合して、抗体１溶液、抗体２溶液、及び抗体３溶液をそれぞれ生成する。

Ｄユニットは、抗体−サイトカイン混合溶液を含み、前記抗体−サイトカイン混合溶液は、抗ＣＤ３及びサイトカイン１溶液を含む。この場合、抗ＣＤ３の含有量は、１〜１２μｇ／ｍＬ、好ましくは３〜８μｇ／ｍＬ、より好ましくは４〜５μｇ／ｍＬである。

Ｔ細胞はＴＣＲを介してシグナルを受け取ると活性化されるが、ＴＣＲα又はβ鎖は、それ自体で活性化シグナルを運び、ＴＣＲの周りのＣＤ３鎖を介してシグナルを伝達することはできない。換言すれば、ＴＣＲが抗原を認識すると、ＣＤ３抗原はシグナルを細胞に伝達する。例えば、ＴＲＣがＭＨＣ＋抗原に結合すると、ＴＣＲがＣＤ３抗原（γ、δ、ε、ζ、又はη）に結合し、ＣＤ３抗原が細胞にシグナルを与える。

Ｄユニットの具体例としては、１ｍＬのサイトカイン１溶液に５μＬの抗ＣＤ３溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を溶解することによって、抗体−サイトカイン混合溶液（Ｄユニット）を調製することができる。

Ｄユニットは、抗体が既にサイトカイン１溶液に添加されている場合、冷蔵保存で１〜２ヶ月間使用することができる。したがって、貯蔵寿命を延ばすために、Ｄユニットを構成する抗ＣＤ３及びサイトカイン１溶液を別々にパッケージングし、培地添加工程で混合して抗体−サイトカイン混合溶液を生成することができる。この場合、貯蔵寿命を６ヶ月間超に延ばすことができる。

次に、本発明は、ＮＫ細胞培養用培地添加キットを用いたＮＫ細胞培養方法を提供し、前記方法は、
分離されたリンパ球にＡ１ユニットの抗体１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第１の工程と；
前記第１の工程からの培地にＤユニットの抗体−サイトカイン混合溶液を添加する第２の工程と；
前記第２の工程からの培地にＣ１のサイトカイン１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第３の工程と；
前記第３の工程からの培地にＡ２ユニットの抗体２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳを添加する第４の工程と；
前記第４の工程からの培地にＣ２のサイトカイン２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳを添加する第５の工程と；
前記第５の工程からの培地に抗体３溶液及び自己血漿又はＦＢＳを添加する第６の工程と；
前記第６の工程からの培地にＢユニットの基本溶液と自己血漿又はＦＢＳを添加する第７の工程とを含む。
ここで、抗体３溶液は、Ａ２ユニットを構成する抗体２溶液の一部を用い、自己血漿又はＦＢＳなどの添加量は、培地全体の１０体積％未満である。第４及び第６の工程は、増殖の妨げとならないように、前の工程よりも大きな容量の培養容器中で培養することができる。

本発明の培養工程中に添加される自己血漿は、知られた培養方法において含まれる量よりも少なくとも３倍以上多いヘパリンを含有する。換言すれば、血液１０ｍＬ当たり１５８ｕｓｐ単位の濃度でヘパリンを使用すると、血液採取時に血液が凝固しないが、ヘパリンが血漿５ｍｌ当たり１５８ｕｓｐ単位で細胞培養液に添加されると、凝固により細胞が十分に増殖しない。しかし、本発明において、通常量より少なくとも３倍以上多いヘパリン濃度を用いても、凝固することなく良好に細胞を培養でき、それぞれ知られているよりも３〜４倍以上のヘパリンを使用しても培養に問題がないことが確認された。また、一般的な血漿不活化法において５６℃で３０分間加熱することにより、補体などのタンパク質や細胞培養のための有効成分が除去される。しかし、本発明は、血漿不活化法なしで約３倍以上のヘパリン濃度を用いるため、培養のための活性成分の損失がないので、ごく少量の血漿を使用することができる。例えば、従来の方法は、培養溶液の１０体積％以上の血漿を用いているが、本発明では、１０体積％未満の血漿、更には３〜７体積％の血漿で十分であり、培養を行うことができることが確認された。したがって、本発明の培養方法に用いられる自己血漿は、血液１ｍｌ当たり４０ｕｓｐ単位以上、好ましくは５０〜６０ｕｓｐ単位以上のヘパリンを含むことができる。

また、ＩＬ−２の存在下で抗体１溶液の抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６でリンパ球を十分に刺激するためには、少なくとも２４時間の間隔が、第１の工程と第２の工程との間に必要である。第２の工程が行われ、したがって、Ｄ溶液に含まれる抗ＣＤ３は、固定化されずに培地に添加される。更なる刺激があっても、ＮＫ細胞は、抗ＣＤ３抗体が培養培地中でそれぞれ分解されるまで問題なく増殖する。

一方、従来の免疫細胞培養物は、最も増殖した免疫細胞を得ることができる１４日間〜１７日間培養することがよく知られている。本発明においては、１４日間〜１７日間の培養後、細胞を１Ｌのバッグに移し、免疫細胞の刺激に追加のサイトカイン又は抗体は添加しない。即ち、免疫細胞は既に十分に刺激されているので、１Ｌバッグ中で増殖し続ける。免疫細胞が十分に増殖した後は、増殖限界があるので、アポトーシスが生じる。したがって、約１４日間に亘って免疫細胞の数を最大限に増加させることによって、抗癌作用を期待することが可能である。しかし、１Ｌのバッグに移す前に、抗体を回収する方法を検討することも可能である。この場合、患者に投与された免疫細胞の数（５×１０^７〜２５×１０^７）は、１４日目の免疫細胞の数よりも少ないが、増殖限界に達していない多くの若い免疫細胞が存在するので、長期間生存し、限界に達するまで増殖することが可能であり、従前の方法とは異なる効果を期待することができる。抗癌作用又は癌予防効果は、癌の種類、期間、又は個人の免疫系の特性によって変わり得るので、フラスコ中で、一部の人にとっては、１４日間培養することが好ましい場合があり、約７日間〜８日間培養することが好ましい場合もある。

実施例１．
ＮＫ細胞培養培地添加キットを、以下のように調製した。
１．Ｂユニットの調製
２．２ｍｇのＩＬ−２と１００ｍＬの５００ｍＭ Ｌ−グルタミン溶液を浮遊細胞用基本培養培地（ＩＬ−２又はＬ−グルタミンが既に前記基本培地に存在する場合、その量は、最終濃度を調整することで調整する）に添加し、基本溶液（Ｂ溶液）を調製した。Ｂユニットは、この溶液を３．８Ｌ用いて調製し、各３６ｍＬのＢ溶液を容器に入れ、「Ｂ溶液、７日目」とラベルし、冷蔵庫に保存した。残りの６．２Ｌは、その他のユニットの調製に使用した。

２．Ｃ１ユニットの調製
２０μｇのＩＬ−１２及び１２５μｇのＩＬ−１８を蒸留水に添加して、１０ｍＬのサイトカイン溶液（Ｃ溶液）を作製した。Ｃ溶液（１ｍＬ）を５００ｍＬの基本溶液（Ｂ溶液）に添加し、サイトカイン１溶液（Ｃ１溶液）を調製した。Ｃ１ユニットは、このＣ１溶液を４９０ｍＬ用いて調製し、各４．５ｍＬの溶液を容器に入れ、「Ｃ１溶液、３日目」とラベルして、冷蔵庫に保存した。残りの１１０ｍＬは、Ｄユニットの調製に使用した。

３．Ｃ２ユニットの調製
２０μｇのＩＬ−１５をＢ溶液に溶解して、１０００ｍｌのサイトカイン２溶液（Ｃ２溶液）を作製した。Ｃ２溶液は、溶液各９ｍＬを容器に入れ、「Ｃ２溶液、５日目」とラベルして、冷蔵庫に保存した。

４．Ａ１ユニットの調製
抗ＣＤ１６抗体及び抗ＣＤ５６抗体をそれぞれ０．５ｍｇを、Ｂ溶液８３０ｍＬに溶解して、抗体１溶液（Ａ１溶液）を調製した。Ａ１ユニットは、容器に抗体１溶液３．５ｍＬを入れることによって調製し、「Ａ１溶液、０日目」とラベルして、冷蔵庫に保存した。残りの溶液は、Ａ２及びＡ３ユニットの調製に使用した。

５．Ａ２ユニット及びＡ３ユニットの調製
約５３０ｍＬのＡ１溶液と３０００ｍＬのＢ溶液を混合して、抗体２溶液（Ａ２溶液）を調製した。Ａ２ユニットは、Ａ２溶液９ｍＬを容器に入れることによって調製し、「Ａ２溶液、４日目」とラベルして、冷蔵庫に保存した。Ａ３ユニットは、Ａ２溶液２７ｍｌを別の容器に入れて調製し、「Ａ３溶液、６日目」とラベルして、冷蔵庫に保存した。Ａ１溶液とＡ２溶液は１ヶ月間以下の短い貯蔵寿命を有するので、以下のように調製することができる。

各６μＬの抗ＣＤ１６（１ｍｇ／ｍＬ）及び抗ＣＤ５６（１ｍｇ／ｍＬ）抗体溶液と、１０ｍＬ及び３０ｍＬのＢ溶液を、別々に入れてＡ１〜Ａ３ユニットを調製し、使用時にこれらの全てを混合することによってＡ１〜Ａ３溶液を調製することができる。まず、Ａ１ユニットを、６μＬの抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６抗体を１０ｍＬのＢ溶液に溶解することによって調製する。Ａ１溶液３．５ｍＬを容器に入れ、「Ａ１溶液、０日目」とラベルし、冷蔵庫に保存する。残りのＡ１溶液約６．５ｍＬを、Ｂ溶液３０ｍＬと混合して、Ａ２溶液を調製した。調製したＡ２溶液９ｍＬを「Ａ２溶液、４日目」とラベルして、冷蔵庫に保存し、Ａ２ユニットを調製した。残りの３７ｍＬを「Ａ３溶液、６日目」とラベルして、Ａ３ユニットを調製し、冷蔵庫に保存した。この場合、それらの貯蔵寿命は、６ヶ月間超に延ばすことができる。

６．Ｄユニットの調製
Ｃ１溶液に抗ＣＤ３抗体５００μｇを溶解し１０５ｍＬとし、抗体−サイトカイン混合液（Ｄ溶液）を調製した。Ｄユニットは、１ｍＬの溶液をそれぞれ容器に入れることによって調製し、「Ｄ溶液、１日目」とラベルして、冷蔵庫に保存した。溶液Ｄは、１ヶ月間以下の短い貯蔵寿命を有するので、以下のように調製することができる。

５μＬの抗ＣＤ３抗体溶液（１ｍｇ／ｍＬ）と１ｍＬのＣ１溶液を、Ｄユニットを調製するために別々の容器に入れた。Ｄ溶液は、使用時にそれらを混合することによって調製することができる。換言すれば、Ｄユニットは、使用前に、５μＬの抗ＣＤ３抗体を１ｍＬのＣ１溶液に溶解することによって調製し、「Ｄ１溶液、１日目」とラベルして、Ｄユニットにして冷蔵庫に保存した。この場合、貯蔵寿命は、６ヶ月間以上に延ばすことができる。

７．ＮＫ細胞培養培地の調製
ＮＫ細胞培養培地添加キットは、Ｂユニット、Ｃ１ユニット、Ｃ２ユニット、Ａ１ユニット、Ａ２ユニット（必要に応じて、Ａ２ユニットとＡ３ユニットに分けることができる）、及びＤユニットの培地を配することによって調製することができる。必要に応じて、培地の順序は、Ａ１ユニット、Ｄユニット、Ｃ１ユニット、Ａ２ユニット、Ｃ２ユニット、Ａ２ユニット（Ａ３ユニット）、及びＢユニットとすることができる。

実施例２．
患者の血液からリンパ球及び自己血漿を調製した後、実施例１で得られたＮＫ細胞培養用培養培地添加キットを用いて、以下のようにしてＮＫ細胞を培養した。

１．リンパ球抽出及び自己血漿調製
処置される患者の血液を、比重１．０７７のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ溶液に重層し、一定の遠心力で遠心分離する。ヒトリンパ球又は単核細胞の比重は１．０７７未満であるので、１．０７７を超える比重を有する赤血球及び顆粒球層は沈降し、１．０７７未満の比重を有する単核細胞層及び血小板が分離されて、リンパ球を含有する単核細胞層が得られ、分離した単核細胞層からリンパ球のみ抽出した。

より具体的には、患者Ａの末梢血３０ｍｌを、５０ｍｌコニカルチューブに入れ、遠心分離し、自己血漿の上部血漿をヘパリンチューブに入れ、次いで、新しい５０ｍｌコニカルチューブに入れ、再び遠心分離した。セグメントを自己血漿として調製した。

その後、血漿を除いた血液チューブにＰＢＳを添加し、容量を３０ｍｌに調整した。次いで、混合物を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓを含むチューブに移し、８００×ｇで１５分間遠心分離した。バフィーコート層を５０ｍｌコニカルチューブに分取し、ＰＢＳで５０ｍｌの体積に調整した後、混合した。次いで、遠心分離により上清を２〜３回捨て、リンパ球を分離した。このとき得られたリンパ球の数は、１．０〜２．０×１０７であった。

２．単離されたリンパ球にＡ１ユニットの抗体１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第１の工程を、以下のように行った。
調製したリンパ球をＡ１溶液（０日目）のバイアル（３．５ｍＬ）に溶解し、Ｔ２５フラスコに入れ、調製した自己血漿０．２５〜０．５ｍＬを添加し、インキュベーター中でインキュベートした。

３．第１の工程からの培地にＤユニットの抗体−サイトカイン混合溶液を添加する第２の工程を、以下のように行った。
顕微鏡で細胞を観察した後、１バイアル（１ｍＬ）のＤ溶液（１日目）を、Ｔ２５フラスコに穏やかに振とうしつつ添加し、インキュベーター中でインキュベートした。

４．第２の工程からの培地にＣ１ユニットサイトカイン１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第３の工程を、以下のように行った。
細胞の状態を観察した後、１バイアル（４．５ｍＬ）のＣ１溶液（３日目）を添加し、０．２５〜０．５ｍＬの自己血漿を添加し、その後、インキュベーター中で培養を続けた。

５．第３の工程からの培地に抗体２のＡ２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳを添加する第４の工程を、以下のように行った。
インキュベートしたＴ２５フラスコの底をスクレーパーでこすり、全ての細胞をＴ７５フラスコに移した。１バイアル（９ｍＬ）のＡ２溶液（４日目）と、０．５〜１ｍＬの自己血漿又はＦＢＳ（又は類似物質）を穏やかに振とうしつつ添加し、インキュベーター中で培養を続けた。

６．第４の工程からの培地にサイトカイン２溶液のＣ２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳを添加する第５の工程を、以下のように行った。
インキュベートしたＴ７５フラスコに、１バイアル（９ｍＬ）のＣ２溶液（５日目）及び０．５〜１ｍＬの自己血漿又はＦＢＳ（又は類似物質）を穏やかに振とうしつつ添加し、インキュベーター中で培養を続けた。

７．第５の工程からの培地に抗体３溶液及び自己血漿又はＦＢＳを添加する第６の工程を、以下のように行った。
インキュベートしたＴ７５フラスコの底をスクレーパーでこすり、全ての細胞をＴ１５０フラスコに移した。１バイアル（２７ｍＬ）のＡ３溶液（４日目）と、１．５ｍＬ〜３ｍＬの自己血漿又はＦＢＳ（又は類似物質）を穏やかに振とうしつつ添加し、インキュベーター中で培養を続けた。

８．第６の工程からの培地にＢユニットの基本溶液と自己血漿又はＦＢＳを添加する第７の工程を、以下のように行った。
インキュベートしたＴ１５０フラスコに、１バイアル（３６ｍＬ）のＢ溶液（７日目）と、２〜４ｍＬの自己血漿又はＦＢＳ（又は類似物質）を穏やかに振とうしつつ添加し、インキュベーター中で培養を続けた。

９．大量培養後の細胞回収工程
培養したＴ１５０フラスコの底をこすり落とした。細胞を確認した後、細胞及び培養培地中の残っている全ての血漿又はＦＢＳ（又は類似物質）１０ｍｌを添加して細胞懸濁液を作製した。細胞懸濁液を１ＬのＣＯ_２透過性培養バッグに添加した後、細胞を培養培地とよく混合されるようにマッサージし、次いで、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター中で均一に広げ、４〜５日間インキュベートした。インキュベート後、最終培養物を遠心チューブに入れ、細胞を数回、遠心分離により回収する。回収した細胞は、生理食塩水バッグに保存し、冷蔵又は凍結することができる。患者Ａの血液３０ｍＬから単離したリンパ球を培養することによって得られた細胞の最終的な数は、３．１４×１０^９個であった。

ある場合には、大量培養せずにこの段階で細胞を直ちに回収することができる。培養８日後に得られた免疫細胞の数は、１２．７×１０^７個であった。

実施例３．
患者Ａの血液ではなく患者Ｂの血液を用いたこと以外は、実施例２と同一の手続を行った。培養８日後に得られた免疫細胞の数は、１７．５×１０^７であり、患者の血液から単離されたリンパ球の最終的な数は、４．３３×１０^９個であった。

実施例４．
患者Ａの血液ではなく患者Ｃの血液を用いたこと以外は、実施例２と同一の手続を行った。培養８日後に得られた免疫細胞の数は、８．５×１０^７であり、患者Ｃの３０ｍＬから単離されたリンパ球の最終的な数は、３．５３×１０^９個であった。

実験例１．
図１〜図３は、実施例２〜４と同様にして培養したリンパ球の表面抗原をフローサイトメトリーを用いて分析した結果を示す。図１〜図３は、実施例２〜４で得られた培養前後のリンパ球の表現型変化を示すグラフであり、Ｈ１領域はＮＫ細胞の分布を示し、Ｈ４領域はＴ細胞の分布を示し、Ｈ２領域はＮＫＴ細胞の分布を示し、Ｈ３領域は、他の免疫細胞の分布を示す。

図１に示すように、患者Ａの血液を用いた本発明の培養方法で増殖させた細胞の数は、３．１４×１０^９、ＮＫ細胞の比率は８１．６７％、ＮＫＴ細胞の比率は５．８２％、ｇｄＴ細胞の比率は５．８％であり、増殖細胞の約９４％以上が治療効果を示すことができる活性キラー細胞であることを示す。

図２に示すように、患者Ｂの血液を用いた本発明の培養方法で増殖させた細胞の数は、４．３３×１０^９、ＮＫ細胞の比率は８６．８５％、ＮＫＴ細胞の比率は３．４５％、ｇｄＴ細胞の比率は０．８２％であり、増殖細胞の約９２％以上が治療効果を示すことができる活性キラー細胞であることを示す。

図３に示すように、患者Ｃの血液を用いた本発明の培養方法で増殖させた細胞の数は、３．５３×１０^９、ＮＫ細胞の比率は９７．８１％、ＮＫＴ細胞の比率は０．３７％、ｇｄＴ細胞の比率は０．０６％であり、増殖細胞の約９８％以上が治療効果を示すことができる活性キラー細胞であることを示す。

図１〜３に示すように、リンパ球培養中に患者の遺伝的特性が変化する場合でも、増殖細胞のほぼ８０％超がＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、及びｇｄＴ細胞であった。これは、活性キラー細胞の９２％超を均一に培養することができることを示す。

一方、図４に示す従来技術（特許第１０−１０３９８４３号公報）によれば、表面抗原は、グラフ（ａ）に示されるように、培養前は、Ｈ４領域において最も多く分布していた。一方、グラフ（ｂ）に示されるように、培養後は、Ｈ１領域に大部分が分布していた。しかし、図１〜図３と比較すると増殖細胞の数が少なかったことがはっきりと理解できる。

実験例２．
実施例２〜４と同様に培養したリンパ球をエフェクター細胞として用い、血液癌細胞株（Ｋ５６２）を標的細胞として用いた。活性化されたリンパ球の癌細胞に対する比は１０：１であり、活性化されたリンパ球の血液癌細胞株に対する殺滅能力を測定するために効力アッセイを行った。

Ｋ５６２細胞株の活性を試験するための方法は、エフェクター細胞の標的細胞に対する比が１０：１で、これらの２種の細胞を４時間反応させることによって癌細胞を死滅させる程度を評価することである。しかし、本発明における培養したリンパ球の力価は、殆ど全ての癌細胞を死滅させるほど高かったので、識別性を高め且つ分析時間を短縮するために、２時間だけ反応させた。結果を以下の表１に示す。

表１に示すように、本発明の技術分野における従来の培養方法で培養されたリンパ球の平均効力である４０〜５０％と、反応時間が２時間の場合（通常の反応時間よりも５０％短い）であっても６５％以上である本発明の方法で培養されたリンパ球の効力とを比較すると、本発明の方法で培養されたリンパ球の癌細胞殺滅能力が非常に優れていることが分かる。

本発明の方法にしたがって培養されたリンパ球の反応時間が短くても高い効力は、リンパ球中のＮＫ細胞の比率が高いためである。

これらの結果は、本発明の方法が、顕著な癌細胞殺滅能と治療効果を有するＮＫ細胞を高い比率でリンパ球に与えることを示す。

本発明を、その例示的な実施形態を参照しつつ具体的に示し、説明してきたが、これらは、単なる説明、例示に過ぎず、例示によって限定されず、様々な変化及び変更が可能であることが明確に理解される。

Claims (14)

1. ＩＬ−２、Ｌ−グルタミン、及び細胞培養用培地を含む基本溶液を含むＢユニットと；
   ＩＬ−１２とＩＬ−１８を前記基本溶液に溶解することによって生成され、ＩＬ−１２の濃度が約０．５〜５ｎｇ／ｍＬであり、ＩＬ−１８の濃度が約２〜５０ｎｇであるサイトカイン１溶液を含むＣ１ユニットと；
   ＩＬ−１５を前記基本溶液に溶解することによって生成され、ＩＬ−１５の濃度が約１０〜５０ｎｇ／ｍＬであるサイトカイン２溶液を含むＣ２ユニットと；
   抗ＣＤ１６と抗ＣＤ５６を前記基本溶液に溶解することによって生成され、抗ＣＤ１６及び抗ＣＤ５６の濃度がそれぞれ、０．１〜１５μｇ／ｍＬである抗体１溶液を含むＡ１ユニットと；
   前記抗体１溶液と前記基本溶液とを１：６〜１０の体積比で含有する抗体２溶液を含むＡ２ユニットと；
   抗ＣＤ３を前記サイトカイン１溶液に溶解することによって生成され、前記抗ＣＤ３の濃度が約１〜１２μｇ／ｍＬである抗体−サイトカイン混合溶液を含むＤユニットと；
   を含むことを特徴とするＮＫ細胞培養用培養培地添加キット。
2. 前記Ａ１ユニットが、前記Ｄユニットよりも先にリンパ球培養培地に添加される請求項１に記載のキット。
3. 前記Ａ１ユニットに含まれる前記抗ＣＤ１６、前記抗ＣＤ５６、及び前記基本溶液が別々にパッケージングされ、培地添加工程で混合されて前記抗体１溶液が生成される請求項１に記載のキット。
4. 前記Ａ２ユニットに含まれる前記抗体１溶液の前記抗ＣＤ１６、前記抗ＣＤ５６、及び前記基本溶液が別々にパッケージングされ、培地添加工程で混合されて前記抗体２溶液が生成される請求項１に記載のキット。
5. 前記Ｄユニットに含まれる抗ＣＤ３及び前記サイトカイン１溶液が別々にパッケージングされ、培地添加工程で混合されて前記抗体−サイトカイン混合溶液が生成される請求項１に記載のキット。
6. 前記ユニットが、前記Ａ１ユニット、前記Ｄユニット、前記Ｃ１ユニット、前記Ａ２ユニット、前記Ｃ２ユニット、前記Ａ２ユニット、及び前記Ｂユニットの順にリンパ球培養培地に添加されるように構成される請求項１に記載のキット。
7. ＮＫ細胞を培養する方法であって、以下の工程：
   分離されたリンパ球にＡ１ユニットの抗体１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第１の工程と；
   前記第１の工程からの培地にＤユニットの抗体−サイトカイン混合溶液を添加する第２の工程と；
   前記第２の工程からの培地にＣ１ユニットのサイトカイン１溶液を添加し、その後、自己血漿を添加する第３の工程と；
   前記第３の工程からの培地にＡ１ユニットの抗体２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第４の工程と；
   前記第４の工程からの培地にＣ２ユニットのサイトカイン２溶液を添加し、その後、自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第５の工程と；
   前記第５の工程からの培地に抗体３溶液及び自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第６の工程と；
   工程６からの培地にＢユニットの基本溶液及び自己血漿又はＦＢＳなどを添加する第７の工程と；
   を含むことを特徴とする方法。
8. 前記抗体３溶液が、前記Ａ２ユニットを構成する前記抗体２溶液の一部を用いる請求項７に記載の方法。
9. 自己血漿が、血液１ｍＬ当たり４０ｕｓｐ単位超のヘパリンを含む請求項７に記載の方法。
10. 添加された前記自己血漿又はＦＢＳの量が、全培地の１０体積％未満である請求項７に記載の方法。
11. 前記ＮＫ細胞が、前記第１の工程の後に前記第２の工程が行われる前に、２４時間以上培養される請求項７に記載の方法。
12. 請求項１〜６のいずれかに記載の前記培地添加キット又は請求項７〜１２のいずれかに記載の方法で調製されるＮＫ細胞培養用培養培地。
13. 前記ＮＫ細胞培養培地が８日間以下の間培養することによって得られ、前記ＮＫ細胞培養培地に含まれる細胞の数が、５×１０^７以上である請求項１２に記載の培地。
14. 前記ＮＫ細胞培養培地に含まれる細胞の数が２×１０^９以上であり、ＮＫ細胞の比率が８０％以上である請求項１２に記載の培地。