KR102236011B1

KR102236011B1 - Nk 세포의 대량증식 배양방법

Info

Publication number: KR102236011B1
Application number: KR1020200150118A
Authority: KR
Inventors: 강다윗; 강현철
Original assignee: 한바이오 주식회사; 강다윗
Priority date: 2020-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2021-04-05
Also published as: EP4245847A1; CA3198511A1; CN116745404A; JP2023548969A; US20240002801A1; WO2022102887A1

Abstract

본 발명은 NK 세포의 배양방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 혈액에서 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 면역세포의 펠렛(pellet)을 분리하는 단계; 2) 상기 PBMC를 항CD16 항체로 코팅된 배양기에서 RPMI 배양배지에서 배양하는 단계; 3) 상기 PBMC를 계대배양하는 단계; 및 4) 상기 PBMC를 IL-2, IL-15 및 IL-2+IL-15으로 이루어진 사이토카인 군으로부터 선택된 사이토카인을 처리함으로써 NK 세포를 활성화시키는 단계;를 포함하는 NK 세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명은 다양한 사이토카인 중 IL-2, IL-15를 이용하여 NK 세포에 처리하였을 때 효과적으로 세포를 활성화시킬 수 있는 최적의 조합으로서, IL-2+IL-15로 처리시에 NK 세포를 대량 배양이 가능하며, 이를 이용하는 경우, 암세포의 세포사멸 또는 살상능이 촉진될 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 효과적인 면역세포 치료제로 사용할 수 있다.

Description

NK 세포의 대량증식 배양방법{Mass proliferation culture method of NK cell}

본 발명은 면역요법에 적용되는 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포) 대량증식 배양방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간의 말초 혈액에서 유래된 림프구를 배양하여 악성종양 치료에 효과가 뛰어난 NK 세포를 효율적으로 증폭 및 활성화시키는 동시에 NK 세포가 차지하는 비율을 현저하게 증가시킬 수 있는 NK 세포의 대량증식 배양방법에 관한 것이다.

면역요법은 자연살해세포(Natural Killer cell; NK 세포), 수지상세포(DC), B 세포, T 세포 등 암 치료에 가장 중요한 면역세포를 환자의 혈액에서 추출한 후 여러 종류의 자극제를 이용하여 암에 강하게 작용하는 면역세포로 키운 뒤 다시 환자에게 주입하는 방법으로서, 환자 자신의 혈액을 사용하기 때문에 종래의 화학요법 등에 비해 부작용도 적고 투여법도 간편하여 최근 들어 활발하게 연구되고 있다.

면역요법에서 활성화시키는 면역세포 중에서 특히 NK 세포는 림프구의 일종인 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 감염된 바이러스, 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가지고 있는데, 그 항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK 세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.

이와 같은 NK 세포는 초기 생체방어 기구와 인체의 종양면역에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

즉, NK 세포는 주요조직적합유전자 복합체(Major Histocompatibility Complex : MHC)의 발현에 따른 면역 획득 과정 없이도 특정자기세포, 동종세포, 심지어 이종 암세포도 살상할 수 있으며, 특히 Class1 MHC를 적게 발현하거나 발현하지 않는 표적 세포들을 더 잘 죽일 수 있다. 따라서, NK 세포는 MHC가 발현되지 않는 대부분의 암세포를 효과적으로 죽일 수 있으며, 그 외에도 몇몇 바이러스에 감염된 세포와 장티프스균(salmonella typhi)과 같은 세균들을 죽일 수 있다.

이와 같은 NK 세포는 선천면역(innate immunity)을 담당하는 중요한 세포로써, T 세포와 달리 간(liver), 골수(bone marrow)에서 성숙된다. 특히, 바이러스(virus)에 감염된 세포나 종양세포(tumor cells) 등 비정상세포를 스스로 식별하여 사멸시키는 기능을 가진다. 지난 10 여 년 동안 환자들의 면역 시스템을 이용한 종양 면역치료가 꾸준히 발전되어 왔고, 이를 이용한 '세포 치료제(cell therapy product)'도 상업화되고 있다. 세포 치료제는 자가(autologous), 동종(allogeneic), 혹은 이종(xenogeneic)의 세포를 체외(in vitro)에서 증식, 선별하는 방법을 통해서, 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 일련의 행위를 통하여 치료, 진단, 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다(식품의약안전청 고시 제2003-26호 제2조).

암과 같은 난치성 질환의 치료를 위한 세포 치료제로서 면역 거부 반응을 해소할 수 있으며, 환자 맞춤형 세포 치료를 제공할 수 있는, NK 세포를 대량으로 증식하는 방법 및 활성이 강화된 NK 세포를 배양하는 방법이 요구된다.

그러나, 이와 같이 암세포 살상에 탁월한 작용을 하는 NK 세포는 정상적인 사람인 경우에도 말초혈액 림프구의 5 ~ 15% 만을 차지하고 있으며, 특히 암환자의 경우에는 그 비율이 1% 미만으로 저하되기 때문에, 면역요법을 통한 별도의 증폭 과정 없이는 암세포를 효과적으로 공격하는 데에 한계가 있다.

NK 세포의 분화와 증식, 생존은 기능적인 측면에서 사이토카인에 영향을 많이 받으며, 종래의 여러 연구에 따르면 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 등의 사이토카인이 세포의 독성 및 활성화를 증가시킨다고 알려져 있다. 현재 면역세포 특히 NK 세포를 활성화하고 증식시키는데 있어서 IL-2 등의 사이토카인과 CD3 등의 항체가 사용된다. 현행 기술은 면역세포의 증식에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것이 CD3 항체인데, 문제는 이 항체를 이용해서 면역세포를 활성화 시키는 것이 매우 까다롭다는 것이다.

특히, 처음부터 CD3 항체의 강한 자극이 가해지면 미성숙 전구세포들은 T세포로 성숙하게 되므로 일반적으로 행해지고 있는 현행 방법은 처음에 CD3 항체를 살짝 자극하는 방법을 사용하는데, 개인 차 등 주변 환경 요건에 의해 많이 좌우되어 활성화된 많은 양으로 증식된 NK 세포를 얻는데 어려움이 있다.

따라서, 현행 방법에서 반드시 플라스크에 CD3 항체를 고정한 후 일정시간 반응시켜야 하는 까다로움을 제거하면서도 NK 세포를 안정적으로 증폭시켜 대량으로 증식시킬 수 있는 새로운 배양배지 조성물 및 배양방법에 대한 개발 필요성이 대두되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 사이토카인을 이용한 NK 세포의 대량증식 배양방법을 고민하던 중 인간의 말초 혈액에서 유래된 면역세포인 림프구를 분리, 배양하고, 항CD3 항체가 아닌 항CD16 항체가 코팅된 배양기에서 다양한 사이토카인, 특히 IL-2과 IL-15을 함께 처리하였을 때 NK 세포가 대량증식되고 활성화됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사이토카인을 이용한 NK 세포의 대량증식 배양방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 피콜(ficoll)과 원심분리를 사용하여 혈액으로부터 면역세포를 함유한 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 펠렛(pellet)을 분리하는 단계; 2) 상기 분리된 PBMC를 항CD16 항체가 코팅된 배양기에서 RPMI 배양배지, 혈장, IL-2, IL-15, 항CD56, 항NKp46 및 항NKp30을 함유한 배지에서 배양하는 단계; 3) 상기 배양된 PBMC를 RPMI 배지, 알부민, IL-2, IL-15, 항CD56, 항NKp46, 항NKp30에서 계대배양하는 단계; 및 4) 상기 계대배양된 PBMC를 RPMI 및 항NKp30, 항NKp46, 항CD56 항체 첨가를 기본으로 한 배지조성물에 IL-2, IL-15 및 IL-2+IL-15으로 이루어진 사이토카인 군으로부터 선택된 사이토카인을 처리함으로써 NK 세포를 활성화시키는 단계;를 포함하는 NK 세포의 배양방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

NK 세포는 림프구의 일종인 거대 과립형 림프구(Large granular lymphocytes: LGL)로서, 감염된 바이러스 및 종양세포를 죽이는 능력이 뛰어나고, 대부분의 정상 세포는 죽이지 않는 특성을 가진다. 따라서, NK 세포는 활성 세포 독성 T 림프구가 다량으로 생성되기 전에 바이러스 감염 혹은 종양 형성 초기 단계에서 중요한 역할을 한다. 예를 들면, NK 세포가 표적 세포와 접촉하는 경우, 몇몇 분자는 표적 세포의 막에 구멍을 형성하여 세포를 용해시키며, 또 다른 분자는 표적 세포에 들어가서 핵 DNA의 분절을 증가시켜, 괴사(necrosis), 세포사멸(Apotosis) 또는 세포 예정사(Programmed cell death)를 야기한다.

그러므로, NK 세포는 특정 바이러스에 감염된 세포와 암세포를 선 자극 없이 용해시킬 수 있다. TCR의 발현을 통해 항원-특이적으로 인식하는 세포독성 T 림프구와 다르게, NK 세포는 항원-특이적 수용체가 결여되어 있다.

NK 세포는 정상 세포의 MHC 유형 I과 결합하는 살해 세포 억제 수용체(killer cell immunoglobulin-like receptor: KIR)를 발현한다. 살해 세포 억제 수용체는 MHC 유형 I과 결합하면 특정 전사 인자의 억제를 유도하는 세포 내 신호가 생성된다. 이 결과 NK 세포의 활성화, 표적 세포의 분해 및 파괴가 억제된다. 바이러스 감염 세포 또는 암 세포는 그들의 표면에 MHC 유형 I 분자가 크게 감소되어 있다. 따라서 이런 세포가 NK 세포를 만나면, 효과적으로 살해 세포 억제 수용체와 결합하지 못하기 때문에 NK 세포-매개 세포 독성에 노출되어 용해된다.

상기 NK 세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로 부터 유래한 것일 수 있다. 상기 NK 세포는 정상인 또는 암환자로부터 수득한 것일 수 있다. 상기 NK 세포는 혈액, 말초혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 분리된 것일 수 있다. 혈액을 분리하는 방법, 이로부터 PBMC를 분리하는 방법, 이로부터 NK 세포를 분리하는 방법은 공지된 방법으로 수행되는 것 일 수 있다.

본 발명의 NK 세포의 배양방법에 있어서, 상기 4) 단계의 사이토카인은 IL-2+IL-15로 처리하는 것이 바람직하고, 이때 IL-2 20ng/ml과 IL-15 50ng/ml을 처리하는 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명의 NK 세포의 배양방법에 있어서, 상기 1) 단계의 면역세포 분리시에 면역세포의 펠렛(pellet)에 RBC 분해용 완충액(lysis buffer)을 처리함으로써 적혈구를 제거하는 것이 바람직하고, 상기 2) 단계의 배양은 세포수가 3 × 10⁷이하일 경우 항CD16 항체가 코팅된 T25 플라스크에서, 세포수가 3 × 10⁷이상일 경우 항CD16 항체가 코팅된 T75 플라스크에서 RPMI 8ml, 혈장 2ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml을 넣고 PBMC 펠렛을 RPMI 10ml로 부유하여 추가로 넣어준 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 3-4일 동안 배양하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 NK 세포의 배양방법에 있어서, 상기 3) 단계의 계대배양은 2) 단계의 세포 배양 현탁액 20ml RPMI 72ml, 알부민 8ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항NKp30 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항CD56 5ng/ml을 넣고 37℃, 5% CO₂배양기에서 3~5일 동안 1차 계대배양과 1차 계대배양 현탁액 50ml, RPMI 180ml, 알부민 20ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항NKp30 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항CD56 5ng/ml을 넣고 37℃, 5% CO₂배양기에서 5~7일 동안 2차 계대배양하는 것이 바람직하다.

이상과 같이, 본 발명은 다양한 사이토카인 중 IL-2, IL-15를 이용하여 NK 세포에 처리하였을 때 효과적으로 세포를 활성화시킬 수 있는 최적의 조합으로서, IL-2+IL-15로 처리시에 NK 세포를 대량 배양이 가능하며, 특히, IL-2 20ng/ml과 IL-15 50ng/ml을 처리시에 가장 효과적이다. 이를 이용하는 경우, 암세포의 세포사멸 또는 살상능이 촉진될 수 있어, 암의 예방 또는 치료에 효과적인 면역세포 치료제로 사용할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 분리된 면역세포 PBMC의 3 종류의 시료별 CD3, CD56 항체에 따른 분포도(NK 세포, NKT 세포, T 세포의 분포)를 따른 유세포 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 그래프 X축은 CD3(T 림프구 표지자)을 표지하는 것이고 Y축은 CD56(NK 림프구 표지자)을 표지한다.
도 2는 NK 세포에 IL-2 및 IL-15 사이토카인 처리 농도에 따른 IFN-γ의 분비량을 측정한 그래프이다.
도 3은 상기 도 2에 의한 IL-2 및 IL-15 사이토카인의 최적의 농도를 설정하고 상기 설정한 농도를 처리한 후에 따른 IFN-γ의 분비량에 따른 활성도를 측정한 그래프이다.
도 4는 조건별 항체 및 IL-2 및 IL-15 사이토카인 처리에 따른 면역세포 분포를 측정한 그래프이다.
도 5는 조건별 항체 및 IL-2 및 IL-15 사이토카인 처리에 따른 면역세포의 총 세포수와 세포 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 설정된 조건으로 NK 세포 14일 배양 후 측정한 세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 7은 설정된 조건으로 NK 세포 대량배양 조성에 따른 FACs 분석 시험 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 혈액으로부터 면역세포 분리

혈액으로부터 면역세포를 분리하기 위하여, 먼저 피콜(ficoll)(GE Healthcare), PBS(WELGENE), 여과튜브(filter tube)(Greiner bio-one)(2개), 50ml 튜브(VWR)(4개), EDTA 튜브(BD biosciences), 혈구계수기(hematocytometer)(MARIENFELD)를 준비하였다.

멸균된 EDTA 튜브에 채취된 50~100ml의 혈액을 제조실로 운반하고, 상기 혈액을 50ml 튜브에 나누어 담았다. 여과튜브 2개에 피콜(ficoll) 15ml씩을 넣고 2000rpm에서 1분 동안 원심분리하여 준비된 상기 피콜이 함유된 여과튜브에 상기 혈액을 나누어 넣었다. 이것을 2500rpm에서 25분 동안 원심분리하였다. 여기서 PBMC(peripheral blood mononuclear cell; 단핵구)층만 분리하여 새 50ml 튜브에 모으고 PBS로 부피를 50ml로 맞춘 후 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 만일 펠렛(pellet)에 RBC(적혈구)가 많은 경우 RBC 분해용 완충액(lysis buffer)을 사용하였다.

원심분리 후 상기 상층액을 제거한 후 RPMI(배양배지)(Hyclone) 10ml로 펠렛을 풀어준 뒤 현탁액을 적당량 채취하여 세포수 계수에 사용하고 나머지는 RPMI 배양배지로 부피를 50ml로 맞춘 후 2000rpm에서 10분 동안 원심분리하였다.

이때, RBC 분해용 완충액의 사용은 다음과 같다.

1 × 10⁸~ 2 × 10⁸ cell당 RBC 분해용 완충액 1ml을 넣어 주었다. 1분 동안 태핑(tapping) 하였다. 여기에 RPMI(배양배지) 15~20ml을 넣어준 후, 1500rpm (250~500 ×G)에서 7분 동안 원심분리하였다. 만일, RBC 제거가 더 필요한 경우 상기 과정을 2~3번 반복하였다.

<실시예 2> 시료 PBMC(peripheral blood mononuclear cell) 면역세포 분포

상기 실시예 1에 기재된 바와 같이, 말초혈액 40-60cc를 피콜이 들어있는 여과튜브 2개에 나누어 분주한 뒤에 2500rpm에서 25분 동안 원심분리하였다. 층 분리된 말초혈액에서부터 PBMC(peripheral blood mononuclear cell) 층만 분리하여 새 50ml 튜브에 모으고 PBS로 세척한 뒤에 상층액을 버리고 얻어진 세포에 형광물질을 포함하는 항체(CD56-PE, CD3-BV421)를 반응시킨 후 유세포 분석(Flow cytometry)을 이용하여 분석하였다. 항체에 따른 면역세포 분포 결과를 하기 표 1과 도 1에 나타내었다.

	T (CD3+CD56-)	NK (CD3-CD56+)	NKT (CD3+CD56+)
1 시료 A	61.4	6.39	2.6
2 시료 B	73.3	5.63	6.72
3 시료 C	76.5	5.54	5.89

상기 표 1과 도 1에 기재된 바와 같이, 전체적으로 혈액으로부터 분리된 PBMC 면역세포 분포는 NK 세포 5-6%, NKT 세포 2-7%, T 세포 60-80% 분포를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> IL-2 및 IL-15 사이토카인 농도 설정을 위한 NK 활성도 측정시험(IFN-γ측정)

예비실험으로 IL-2 및 IL-15 사이토카인의 효과와 농도 설정을 위해, 상기 실시예 1에 따른 말초혈액에서로부터 얻어진 단핵구에 항CD16 항체가 코팅된 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml, 항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml 함유 배지에서 IL-2 및 IL-15 사이토카인의 각각의 농도를 처리하여 7일 동안 배양한 후 세포를 모두 수거하였다. 수집된 세포를 2000rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상층액 1㎖를 새로운 튜브로 옮긴 후 세포의 활성도를 측정하였다. 세포활성도 측정은 IFN-γELISA 키트를 이용하여 IFN-γ 분비량으로 확인하였다.

NK 세포에 IL-2 및 IL-15 처리 농도에 따른 IFN-γ의 분비량을 도 2에, 상기 도 2에 의한 IL-2 및 IL-15의 최적의 농도를 설정하고 상기 설정한 농도를 처리한 후에 따른 IFN-γ의 분비량에 따른 활성도를 도 3에 기재하였다.

구체적으로, 도 2로부터 IL-2의 경우에는 농도를 5, 10, 15, 20, 40(ng/ml) 처리하였을 때 점차적으로 IFN-γ의 분비량이 증가하였다가 20ng/ml에서 최고 농도를 나타내었으며 40ng/ml에서는 더 이상 증가하지 않았다. 한편, IL-15의 경우에는 10, 30, 50, 100(ng/ml) 농도를 비교하였을 때 IFN-γ의 분비량은 50ng/ml에서 최고 농도를 나타내었으며 100ng/ml에서 더 이상 증가하지 않았다. 2가지 실험 결과, IL-2는 20ng/ml, IL-15는 50ng/ml에서 세포 활성도가 가장 효과적인 농도라는 것을 확인하였다.

도 3으로부터 IL-2 및 IL-15를 각각 처리해준 세포의 IFN-γ 분비량 보다 IL-2 + IL-15를 함께 처리해서 배양된 세포가 IFN-γ 분비량이 확연하게 증가되어 세포의 활성도가 증가되었음을 확인하였다.

<실시예 4> IL-2 및 IL-15 처리에 따른 면역세포 분포 및 세포 생존율 및 세포수 측정

NK 세포 대량배양을 하기 위한 예비실험으로 항체 및 IL-2 및 IL-15의 각각의 조건으로 NK 세포 비율 및 세포 생존율 또는 세포수의 효과를 보기위해, 상기 실시예 1에 따른 말초혈액에서로부터 얻어진 단핵구에 항CD16 항체가 코팅된 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml을 포함한 상태에서 각각의 조건을 처리하여 7일 동안 배양한 후 세포를 모두 수거하여 NK 세포의 표면 항원을 분석하였다. 항CD16 항체 코팅 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml을 기본으로 포함한 상태에서 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)만 첨가한 군, 항CD16 항체 코팅 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml을 기본으로 포함한 상태에서 IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml) 사이토카인만 첨가한 군, 항CD16 항체 코팅 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml을 기본으로 포함한 상태에서 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)+IL-2(20ng/ml)만 첨가한 군, 항CD16 항체 코팅 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml을 기본으로 포함한 상태에서 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)+IL-15(50ng/ml)만 첨가한 군, 항CD16 항체 코팅 플라스크와 RPMI 18ml, 혈장 2ml을 기본으로 포함한 상태에서 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)+ IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)를 첨가한 군으로 나누어서 각각 처리하여 7일 동안 배양하였고 2000rpm 10분동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 얻어진 세포에 형광물질을 포함하는 항체 (CD56-PE, CD3-BV421)를 반응시킨 후 유세포 분석(Flow cytometry)을 이용하여 분석하였다. 세포 수 측정은 원심분리하고 얻어진 세포를 PBS로 부유한 후 10㎕을 취하여 트리판블루 10㎕과 섞은 후 혈구계수기(hemocytometer)를 이용하여 측정하였다. 항체에 따른 면역세포 분포 결과를 하기 표 2과 도 4에 나타내었고, 총세포수와 세포 생존율은 도 5에 기재하였다.

	T (CD3+CD56-)	NK (CD3-CD56+)	NKT (CD3+CD56+)
항체	67.0	11.2	7.10
IL-2+IL-15	65.8	18.1	14.6
항체+IL-2	60.1	19.7	16.6
항체+IL-15	57.6	23.0	11.1
항체+IL-2+IL-15	38.2	40.4	20.1

상기 표 2와 도 4에 기재된 바와 같이, 항체만 처리한 시료보다 IL-2+IL-15사이토카인 처리한 혼합물에서 NK 세포 비율이 증가하였지만, 항체+IL-2+IL-15 조합한 혼합물을 처리하였을 때 NK 및 NKT 세포를 증가시키는데 효과적인 것을 확인하였다. 또한, 도 5에서와 같이, 항체+IL-2+IL-15 혼합물이 다른 비교군 보다 2~4배 증식효과를 나타내었으며 생존율 또한 높게 유지되는 것을 확인하였다.

<실시예 5> 설정된 농도로 NK 면역세포 대량 배양방법

<5-1> 항CD16 코팅

T75 플라스크에 PBS 10ml과 항CD16 5ng/ml을 혼합하고, 상온에서 6시간 방치한 후 냉장에서 하룻밤 동안(24h) 보관함으로써 항CD16을 코팅하였다. 상기 코팅된 플라스크는 일주일 이내에 사용하여야 하며 사용하기 전에 PBS를 제거하고 PBS로 한번 세척한 후 사용하였다. 코팅이 되어있으므로 바닥에 마르지 않도록 해야 하며, 플라스크 바닥에 직접적으로 파이펫팅하지 않도록 주의하였다.

<5-2> 면역세포 배양

먼저, 상기 실시예 5-1에서 준비한 항CD16 코팅된 T75 플라스크 이외에 RPMI 배지, 혈장, IL-2, IL-15, 항CD56, 항NKp46, 항NKp30을 준비하였다.

세포현탁액의 세포 수가 3 × 10⁷이하일 경우 항CD16 항체로 코팅된 T25 플라스크를, 3 × 10⁷이상일 경우는 항CD16 항체로 코팅된 T75 플라스크에 세포를 배양하였다. 구체적으로, 코팅된 T75 플라스크에 RPMI 8ml, 혈장 2ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml을 넣고 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 세포를 상층액을 제거하고 RPMI 10ml로 파이펫팅 후 상기 플라스크에 넣어 주었다. 37℃, 5% CO₂배양기에서 세포의 상태에 맞게 3-4일 동안 배양하였다.

<5-3> 계대 배양

계대 배양을 위해서 T175 또는 T225 플라스크, RPMI 배지, 알부민, IL-2, IL-15, 항CD56, 항NKp46, 항NKp30을 준비하였다.

<5-3-1> 1차 계대 배양 (T75 플라스크에서 T175 플라스크로 계대배양)

상기 실시예 5-2의 T75 플라스크에서 배양된 면역세포를 T175 플라스크로 계대배양하였다. 구체적으로, T75 플라스크를 스크래퍼(scraper)로 긁어서 바닥에 붙은 세포를 떼어주고 파이펫팅하여 뭉친 세포를 풀어주었다. 이렇게 준비한 세포 현탁액 20ml을, 새로운 T175 플라스크에 RPMI 72ml, 알부민 8ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항NKp30 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항CD56 5ng/ml에 넣고 배양배지와 섞어준 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 세포의 상태에 맞게 3~5일 동안 배양하였다.

<5-3-2> 2차 계대 배양 (T175 플라스크에서 T225 플라스크 2개로 계대 배양)

T175 플라스크에서 T225 플라스크 2개로 계대 배양하였다. 구체적으로, T175 플라스크를 스크래퍼로 긁어서 바닥에 붙은 세포를 떼어주고 파이펫팅하여 뭉친 세포를 풀어주었다. 이렇게 준비한 세포 현탁액 100ml을 각각 50ml 씩, 새로운 T225 플라스크 2개에 각각 RPMI 180ml, 알부민 20ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml에 넣고 상기 배양배지와 섞어준 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 세포의 상태에 맞게 5~7일 동안 배양하였다. 이때, 세포상태에 맞게 배지를 추가하여 T225 플라스크 개당 최종 400ml이 넘지 않도록 주의하였다.

<실시예 6> 설정된 농도로 NK 세포 14일 배양후 세포 수 측정시험

대량 증식을 위해 설정된 조성이 14일간 배양에도 NK 세포 대량 증식 및 분포가 증가 가능한지를 알아보았다. 구체적으로, 실시예 1의 방법으로 분리된 림프구세포 5 × 10⁷ cell을 각각 시료의 배양배지에 첨가하였으며 설정된 조성인 RPMI + 알부민+ 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)+IL-2(20ng/ml) + IL-15(50ng/ml)를 추가적으로 처리하여 14일 배양하였다. 또한 대조군으로는 RPMI+알부민+IL-2(20ng/ml) + IL-15(50ng/ml) 사이토카인만 처리한 군, RPMI+알부민+항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)만 첨가한 군으로 나누었다. 또한 세포수에 따라 계대배양 하여 배양배지를 첨가하여 14일 배양하였다. 세포수 측정을 위해 각 날짜마다 배양한 세포를 수거한 후, 부유한 세포에서 10㎕을 취하여 트리판블루 10㎕과 섞은 후 혈구계수기로 측정하였다. 그 결과를 도 6에 기재하였다. 도 6에 기재된 바와 같이, 조성된 배양배지에서 14일 배양시 2 × 10⁹ cell 이상 세포 증식 결과를 보였다.

<실시예 7> 설정된 농도로 NK 세포 대량배양 조성에 따른 FACs 분석시험

상기 실시예 5-3-2에 따라 배양된 림프구 면역세포 분포(FACs) 실험은 RPMI + 알부민 + 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)+ IL-2(20ng/ml)+IL-15(50ng/ml)를 처리하여 14일 배양하였고 대조군으로 한 실험은 RPMI + 알부민 + IL-2(20ng/ml) + IL-15 (50ng/ml) 사이토카인만 처리한 군, RPMI+알부민 + 항체(항CD56 5ng/ml, 항NKp46 5ng/ml, 항NKp30 5ng/ml)만 처리한 군, 각각 세포수에 따라 계대배양하여 14일 배양하여 비교하였다. 2000rpm 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 얻어진 세포에 형광물질을 포함하는 항체 (CD56-PE, CD3-BV421)를 반응시킨 후 유세포 분석(Flow cytometry)을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 도 7에 기재하였다.

	T (CD3+CD56-)	NK (CD3-CD56+)	NKT (CD3+CD56+)
항체+IL-2+IL15	8.43	83.2	1.53
IL-2+IL15	35.1	42.4	21.1
항체	52.5	33.2	13.5

상기 표 3 및 도 7에 기재된 바와 같이, 대량증식을 위해 설정된 조성이 14일 대량배양 후에도 NK 및 NKT 세포가 85%, T세포가 8.5% 조성되어 NK 세포 비율이 다른 대조군에 비해 확연하게 증가되는 결과를 확인할 수 있었다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims

1) 피콜(ficoll)과 원심분리를 사용하여 혈액으로부터 면역세포를 함유한 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)의 펠렛(pellet)을 분리하고, 상기 펠렛에 RBC 분해용 완충액(lysis buffer)을 처리함으로써 적혈구를 제거하는 단계;
2) 상기 분리된 PBMC 세포수가 3 ×10⁷이하일 경우 항CD16항체로 코팅된 T25 플라스크에서, 세포수가 3 ×10⁷이상일 경우 항CD16항체로 코팅된 T75 플라스크에서 RPMI 8ml, 혈장 2ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항CD56항체 5ng/ml, 항NKp46항체 5ng/ml 및 항NKp30항체 5ng/ml을 넣고 상기 PBMC 펠렛을 RPMI 10ml로 부유하여 추가로 넣어준 후, 37℃, 5% CO₂배양기에서 3-4일 동안 배양하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 세포 배양 현탁액 20ml, RPMI 72ml, 알부민 8ml, IL-2 20ng/ml, IL-15 50ng/ml, 항NKp30항체 5ng/ml, 항NKp46항체 5ng/ml 및 항CD56항체 5ng/ml을 넣고 37℃, 5% CO₂배양기에서 3~5일 동안 1차 계대배양과 1차 계대배양 현탁액 50ml, RPMI 180ml, 알부민 20ml, IL-2 20ng/ml 및 IL-15 50ng/ml을 넣고 37℃, 5% CO₂배양기에서 5~7일 동안 2차 계대배양하는 단계; 및
4) 상기 계대배양된 PBMC를 RPMI 및 알부민, 항NKp30항체, 항NKp46항체 및 항CD56항체 첨가를 기본으로 한 배지조성물에 IL-2 20ng/ml과 IL-15 50ng/ml 사이토카인을 처리함으로써 NK 세포를 활성화시키는 단계;를 포함하는 NK 세포의 배양방법.

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