KR20230078501A - Hla-e를 발현하도록 유전적으로 조작된 배양보조세포주, 및 그의 용도 - Google Patents

Hla-e를 발현하도록 유전적으로 조작된 배양보조세포주, 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

NK 세포의 활성화를 위해 유전적으로 조작된 세포에 관한 것으로, 일 양상에 따른 NK 세포의 활성화를 위해 유전적으로 조작된 세포에 의하면 시료로부터 NK 세포의 증식 및 활성화를 상승적으로 유도할 수 있어, NK 세포를 증식하는 방법, 또는 그에 의해 증식된 NK 세포를 항체 치료제 등으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

HLA-E를 발현하도록 유전적으로 조작된 배양보조세포주, 및 그의 용도{Genetically engineered cell line for expressing HLA-E, and uses thereof}
HLA-E를 발현하도록 유전적으로 조작된 배양보조세포주, 및 그의 용도, 구체적으로, 그를 이용한 NK 세포를 증식하는 방법, 또는 그를 이용한 NK 세포의 활성도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
NK 세포(natural killer cell)는 선천적 면역에 중요한 세포독성 림프구의 한 종류이다. NK 세포는 바이러스 감염된 세포나 암세포에 반응하는데, 이들 반응은 NK 세포의 여러 활성 수용체(activating receptor)와 억제 수용체 (inhibitory receptor)가 대상 세포가 갖는 각각의 리간드(ligand)와 반응하여 내는 시그널(signal)에 의해 좌우된다. 통상적으로 활성시그널이 억제 시그널 보다 강하면 NK 세포는 대상 세포를 공격할 수 있지만, 억제시그널이 더 강하면 공격하지 않는다. 따라서, 정상세포는 NK 세포의 억제 수용체 리간드(MHC, major histocompatibility complex)가 존재하여 억제시그널을 내므로 NK 세포에게 공격당하지 않는다.
암세포 중 일부는 세포 표면에 MHC의 이상이 발생하여 감소할 수 있다. 이러한 경우에는 NK 세포의 억제시그널이 없어 NK 세포가 대상 세포를 공격하게 된다. 퍼포린(perforin)을 분비해 감염 세포나 암세포의 세포막에 구멍을 내고, 여기에 그랜자임(granzyme)을 내어 이 세포들을 사멸시키는 세포독성을 갖는다. B 세포 림프종 및 많은 암환자의 경우 NK 세포의 수나 항암활성에 결함이 발견되고 있으며 NK 세포의 기능 이상은 이러한 암의 발생과 밀접한 관련을 가지고 있음이 알려져 있다. 따라서, 건강인의 말초혈액에서 유래한 고성능의 NK 세포를 체외에서 다량 배양한 후, 항암력을 극대화하여 암 환자에게 투여하는 입양세포치료(Adoptive cell therapy, ACT)가 대두되고 있으며, 상기 치료법은 다량의 고 성능의 NK 세포를 확보하기 위하여 증폭법의 개발이 필수적이다.
종래 보고된 NK 세포의 증식 방법은 거의 대부분 NK 세포(conventional NK cell) 증폭을 위한 방법들이었다. 그러나, 최근 면역학적 기억(immunological memory)을 형성할 수 있는 특수화된 자연 살해 세포로서, 적응면역체계에 관여하는 NK 세포의 아형 중 하나인 적응(adaptive) NK 세포의 임상적 의의가 강조되었는데, 미미한 증폭력을 보여준 하나의 연구(Cancer Immunol. Res. 2017, 5, 654-665.)를 제외하고 전무한 상태이다.
따라서, 적응(adaptive) NK 세포를 선택적으로 증폭시키는 획기적인 방법을 개발할 필요가 있다.
일 양상은 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포의 배양을 위한 배양보조세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 배양보조세포를 포함하는 NK 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 NK 세포의 집단을 함유하는 혈액 시료를 수득하는 단계; 및 상기 혼합된 NK 세포의 집단의 적어도 일부분을 NK 세포를 활성화하기 위해 유전적으로 조작된 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 세포는 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 것인 단계를 포함하는, NK 세포를 증식시키는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포주를 제공한다.
상기 세포주는 NK 세포만을 선택적으로 증폭하게 하는 배양보조세포인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "배양보조세포(feeder cells, 지지세포)"는 방사선 조사에 의해 분열 증식하는 능력은 없지만 대사 활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 NK 세포의 증식을 돕는 세포를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 수 있는 배양보조세포로는 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)로서, 인간만성골수백혈병세포주(예를 들어, K562 세포), RPMI8866, EBV_LCL, HFWT 등인 것일 수 있다. 일반적으로, NK 세포 증식에 사용되는 대표적인 영양보조세포인 K562 세포주는 NK 세포의 증식을 위해 사용될 뿐이므로 K562 세포주 자체가 증식 해서는 안된다. 따라서, NK 세포와 배양하기 전, 상기 K562 세포주에 강력한 방사선(예를 들어, 50~100 Gy)의 조사를 통한 전처리를 수행하여 상기 K562 세포주 자체는 전혀 증식하지 않고, NK 세포의 증식만을 돕도록 한다. 한편, NK 세포의 효율적인 증식을 위해서는 IL-2, IL-15 등과 같은 대부분의 사이토카인이 NK 세포에 지속적으로 노출되어야 한다. 따라서, 암 세포주 기반 영양보조세포에 IL-2 및/또는 IL-15 등과 같은 사이토카인을 발현하도록 유전적으로 조작하는 경우, 방사선 조사 등으로 전처리한 암 세포주 자체가 배양 과정에서 장시간 생존할 수 없는 바 NK 세포의 선택적 증식 효율이 떨어진다는 문제점이 있다. 그러나, 일 양상에 따른 세포주는 인간 백혈구 항원을 발현하도록 유전적으로 조작함으로써 NK 세포를 선택적이고, 보다 효율적으로 획득할 수 있다.
상기 NK 세포는 적응 NK(adaptive NK) 세포인 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어, "적응(adaptive) NK 세포"는 면역학적 기억(immunological memory)을 형성할 수 있는 특수화된 자연 살해 세포로서, 적응면역체계에 관여한다. 또한, 상기 적응 NK 세포는 항원 특이성을 가지고 있지 않으며, NK 세포들 중 체내에서 보다 오래 생존하고, 항체의존세포매개 세포독성작용(Ab-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 등이 더 강한 세포 아형(subgroup)이다. 일 구체예에 있어서, 상기 NK 세포는 NKG2C+NK 세포인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)"은 사람의 유핵세포 표면에 발현되는 세포막 당단백 분자로, T 림프구에 항원을 제시하여 침입한 항원에 대하여 적응면역반응(adaptive immune)을 유발시키고 또한 NK 세포에 의한 사멸작용으로부터 정상세포를 보호한다. 일 구체예에 있어서, 상기 HLA는 예를 들어, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 등인 것일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 상기 HLA-E는 서열번호 1의 핵산 서열 또는 그의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전적 조작(genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된(genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 의미한다.
상세하게는 상기 유전적으로 조작된 세포는 상기 언급된 유전자를 코딩하는 외인성 유전자 (exogenous gene)를 포함하는 것일 수 있다. 용어 "외인성(exogenous)"은 언급된 분자(referenced molecule) 또는 언급된 활성(referenced activity)이 숙주 세포로 도입된 것을 의미한다. 분자는 예를 들면, 숙주 염색체 내로의 삽입에 의하는 것과 같은 코딩 핵산(encoding nucleic acid)의 숙주 유전 물질 내로의 도입 또는 플라스미드와 같은 비염색체 유전물질로서 도입될 수 있다. 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 상기 코딩 핵산이 개체 내로 발현 가능한 형태로 도입된 것을 나타낸다. 생합성 활성과 관련하여, 상기 용어 "외인성"은 숙주 모세포에 도입된 활성을 나타낸다. 그 기원(source)은 예를 들면, 숙주 모세포에 도입된 후 언급된 활성을 발현하는 동질성(homologous) 또는 이질성(heterologous) 코딩 핵산일 수 있다. 그러므로, 용어 "내인성(endogenous)"은 상기 숙주 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 나타낸다. 비슷하게, 코딩 핵산의 발현과 관련하여, 상기 용어 "내인성"은 개체 내에 포함된 코딩 핵산의 발현을 나타낸다. 용어 "이질성(heterologous)"은 언급된 종 외의 다른 기원으로부터의 분자 또는 활성을 나타내고 용어 "동질성(homologous)"은 숙주 모세포로부터의 분자 또는 활성을 나타낸다. 따라서, 코딩 핵산의 외인성 발현은 이질성(heterologous) 또는 동질성(homologous) 코딩 핵산 중 어느 하나 또는 둘 다를 이용할 수 있다.
따라서, 상기 세포는 HLA를 암호화하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다. 더욱 상세하게 상기 세포는 HLA를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질 전환된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 지칭한다. 일 실시예에 따른 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 및/또는 인핸서와 같은 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 상기 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 벡터를 함유 하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우, 복제 기원을 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 도입될 수 있으며, 상기 벡터는 플라스미드, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 배시니아 바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 상기 벡터에서, 전술한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.
다른 양상은 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 NK 세포 배양용 조성물을 제공한다.
상기 유전적으로 조작된 세포의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
일 구체예에 따른 HLA를 발현하도록 유전적으로 조작된 세포를 포함하는 NK 세포 배양용 조성물은 NK 세포(예를 들면, 자연살해세포)의 증폭 및/또는 활성화를 유도할 수 있어 NK 세포의 배양, 분리, 또는 증식 등에 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 양상은 혼합된 NK 세포(mixed immune cells)의 집단을 함유하는 혈액 시료를 수득하는 단계; 및 상기 혼합된 NK 세포의 집단의 적어도 일부분을 NK 세포를 활성화하기 위해 유전적으로 조작된 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 세포는 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 것인 단계를 포함하는, NK 세포를 증식시키는 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 유전적으로 조작된 세포와 혼합된 NK 세포의 집단을 공배양하여 상기 NK 세포의 서브 집단(subpopulation)을 자극, 활성화 또는 증폭(expanding)시키는 것인 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "NK 세포의 자극"은 시험관 내 또는 생체 내에서 자연살해세포의 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 증가시키거나, 활성화된 자연살해세포가 생성, 증가, 증폭, 또는 증식되는 것을 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 NK 세포의 비-제한적 예에는 대식세포, B 림프구, T 림프구, 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연 살해 세포, 호염기구, 호중구가 포함된다. 따라서, 특정 구체예들에서, 상기 NK 세포는, 대식세포, B 림프구, T 림프구(CD8+ CTL), 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연살해세포, 호염기구, 또는 호중구로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 특정 구체예에서, NK 세포는 자연살해세포 또는 T 림프구일 수 있다. 상기 혼합된 NK 세포는 대식세포, B 림프구, T 림프구, 비만 세포, 단핵구, 수지상 세포, 호산구, 자연살해세포, 호염기구, 및 호중구로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "자연살해세포(Natural Killer cells)" 또는 "NK 세포"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 상기 "자연살해세포" 또는 "NK 세포"는 임의의 조직 공급원(source)으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포를 포함하고, 성숙한 자연살해세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해 세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다. 자연살해세포는 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체로부터 생성될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 자연살해세포는 활성화된 자연살해세포 일 수 있다. 상기 활성화된 자연살해세포는 모세포, 예를 들면, 조혈 세포, 또는 자연살해전구세포에 비해, 세포 독성, 또는 자연살해세포의 본연의 면역조절능이 활성화된 세포를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 활성화된 자연살해세포 또는 활성화된 자연살해세포가 풍부한(enriched) 집단은 1종 이상의 기능적으로 관련된 마커, 예를 들어 CD16, CD57, CD69, CD94, CD161, CD158a, CD158b, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1, 2B4, NKp46, CD94, KIR(예를 들어, KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1), 및 활성화 수용체의 NKG2 패밀리(예를 들어, NKG2A, NKG2C, NKG2D)를 검출함으로써 평가될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 공배양은 사이토카인의 존재 하에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "사이토카인"은 세포 신호전달의 역할을 하는 단백질(~5-20 kDa)을 의미할 수 있다. 사이토카인은 세포에 의해 방출되고 사이토카인을 방출하는 세포들 및/또는 다른 세포들의 거동에 영향을 준다. 사이토카인의 비-제한적 예들에는 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 종양 괴사 인자, 모노카인, 및 콜로니 자극 인자들이 포함된다. 사이토카인은 면역 세포 들, 가령, 대식세포, B 림프구들, T 림프구들, 비만 세포 및 단핵구, 내피 세포, 섬유모세포 및 간질 세포들을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 광범위한 세포들에 의해 생성될 수 있다. 사이토카인은 하나 이상의 유형의 세포에 의해 생성될 수 있다. 사이토카인은 수용체들을 통해 작용하며 면역계에서 특히 중요하고, 체액성 및 세포계 면역 반응들 사이의 균형을 조절하며, 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성 (responsiveness)을 조절한다. 본 명세서의 사이토카인은 자연 발생 사이토카인일 수 있거나 또는 자연 발생 사이토카인의 돌연변이 버전일 수 있다. 본 출원에서 사용되는, "자연 발생"은 또한 야생형으로도 지칭될 수 있으며, 대립유전자 변종들을 포함한다. 자연 발생 사이토카인의 돌연변이된 버전 또는 "돌연변이"는 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 변화시키기 위하여 자연 발생 서열에 대해 이루어진 특정 돌연변이들을 지칭한다. 한 구체예에서, 돌연변이들은 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 향상시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 돌연변이들은 사이토카인의 기능, 활성 및/또는 특이성을 감소시킬 수 있다. 돌연변이는 사이토카인의 하나 이상의 아미노산 잔기들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
상기 사이토카인은 BMP(Bone morphogenetic protein) 패밀리, CCL(Cheomkine ligands) 패밀리, CMTM(CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing member) 패밀리, CXCL(C-X-C motif ligand ligand) 패밀리, GDF (Growth/differentiation factor) 패밀리, 성장 호르몬, IFN(Interferon) 패밀리, IL(Interleukin) 패밀리, TNF(Tumor necrosis factors) 패밀리, GPI(glycophosphatidylinositol), SLUPR-1(Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 1), SLUPR-2(Secreted Ly-6/uPAR-Related Protein 2) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사이토카인은 인터루킨 또는 이의 돌연변이인 것일 수 있다. 다수의 인터루킨들은 보조 CD4 T 림프구들, 뿐만 아니라 단핵구, 대식세포, 및 내피 세포에 의해 합성된다. 인터루킨들은 T 및 B 림프구들 및 조혈 세포들의 발달 및 분화를 촉진시킬 수 있다. 인터루킨은 예를 들어, IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8 (CXCL8), IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, 또는 IL36 등인 것일 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에서, 상기 사이토카인은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8 (CXCL8), IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, 또는 IL36의 야생형 및 돌연변이 형태들을 비롯한(그러나 이에 제한되는 것은 아니다) 인터루킨 또는 이의 돌연변이인 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 공배양에 첨가되는 사이토카인은 IL-2 및 IL-15일 수 있다. 상기 IL-2은 1 내지 20 ng/㎖, 1 내지 15 ng/㎖, 1 내지 10 ng/㎖, 또는 2 내지 8 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 상기 IL-15은 10 내지 200 ng/㎖, 10 내지 180 ng/㎖, 20 내지 160 ng/㎖, 20 내지 120 ng/㎖, 20 내지 40 ng/㎖, 20 내지 80 ng/㎖, 40 내지 160 ng/㎖, 40 내지 120 ng/㎖, 40 내지 80 ng/㎖, 80 내지 160 ng/㎖, 또는 80 내지 120 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 공배양시 상기 IL-2 및 IL-15에 세포를 노출시킴으로써, NK 세포의 증식을 더욱 상승적으로 증가시킬 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 공배양은 2일 내지 100일 동안 수행되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 유전적으로 조작된 세포는 50 Gy 내지 300 Gy 방사선 처리된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 시료는 개체, 예를 들면, 인간을 포함한 포유류 등으로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 개체로부터 분리된 것일 수 있으며, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있다. 또한 상기 생물학적 시료는 PBMC, 정제된 NK 세포 또는 일차성 휴지기의 세포(primary resting cell) (즉, 혈액에서 바로 분리한)를 포함하는 것일 수 있다.
또 다른 양상은 혼합된 NK 세포의 집단을 함유하는 혈액 시료를 수득하는 단계; 상기 혼합된 NK 세포의 집단의 적어도 일부분을 NK 세포를 활성화하기 위해 유전적으로 조작된 세포와 접촉시켜 NK 세포를 활성화시키는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 세포는 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 것인 단계; 및 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 분석하는 단계를 포함하는 NK 세포의 활성도를 검사하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은, 혼합된 NK 세포의 집단을 함유하는 혈액 시료를 수득하는 단계; 상기 혼합된 NK 세포의 집단의 적어도 일부분을 NK 세포를 활성화하기 위해 유전적으로 조작된 세포와 접촉시켜 NK 세포를 활성화시키는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 세포는 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 것인 단계; 및 상기 활성화된 NK 세포의 활성화 정도를 분석하는 단계를 포함하는 NK 세포 관련 질환을 진단하는 방법 또는 진단에 관한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 NK 세포의 활성도를 검사하는 방법에서, 정상 NK 세포 대비 상기 NK 세포의 활성화를 비교하는 단계는, 구체적으로 정상적인 NK 세포를 대조군으로 실험군과 동등한 조건에서 상기 언급된 유전적으로 조작된 세포로 자극하였을 때, 정상적인 NK 세포에서 나타나는 활성화 현상이 실험군에서 현저하게 높거나, 나타나지 않거나 그 정도가 현저하게 적은 경우 비정상으로 판단하는 것을 포함한다. 상기 단계에 의하여 비정상적인 NK 세포와 관련한 질환의 병리학적 징후, 바이러스 감염, 암 세포의 존재, 및 특정 암을 판단하고 상기 질병들에 대해 예후 예측 할 수 있다. 상기 "정상 NK 세포"는 질병을 갖지 않는 개체가 갖는 또는 그러한 개체로부터 유래된 NK 세포를 말하며, 상기 질병을 갖지 않는 개체는 적어도 NK 세포 활성에 영향을 미치는 것이라 알려진 신체적, 유전적, 또는 외래적 조건을 갖지 않는다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 시료 중 필요로 하는 NK 세포를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 필요에 따라 다른 혈구 또는 림프구와 함께 존재하는 중에 자극 후 상기 단계가 이루어질 수 있고, 림프구로서 NK 세포만을 포함하는 시료로 하기 위해 상기 단계가 이루어진 후 상기 자극하는 단계가 이루어질 수 있다. 분리된 NK 세포의 정제도 및 그 시료의 구성은 실험에 필요한 정도로 다양할 수 있다. NK 세포는 필요에 따라 시료에서 정제된 그대로를 사용할 수 있고, 실험에 적합한 조건 또는 세포량을 확보하기 위하여 증식시킨 후 사용할 수 있다.
그러나, 특정 인자의 조합의 경우 NK 세포에 특이적이므로, 본 발명의 방법에서 상기 NK 세포에 특이적인 인자의 조합을 이용하는 경우, 상기 NK 세포를 분리하는 단계는 필수적이지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 활성화 정도를 측정하는 단계는 탈과립화(degranulation) 활성, 세포독성(cytotoxicity) 활성 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 사이토카인의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 탈과립화 활성은 예를 들어, 퍼포린(perforin) 또는 그랜자임(granzyme) 분비로 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 의미할 수 있고, 이를 FACS를 이용해 분석할 수 있다. 구체적으로, 전혈 시료에서 분리한 PBMC 혹은 순수 분리된 NK 세포를 자극한 후, 탈과립화와 비례하는 CD107a 발현을 플루오로크롬-접합된 항체를 이용하여 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
상기 세포독성 활성은 예를 들어, 유로피움(europium) 형광 염료로 표지된 NK 세포를 활성화시킬 수 있는 표적 세포를 포함하는 배양물과 배양한 후, 표적 세포 용해를 통해 배출된 형광 염료의 양을 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 측정할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α, TNF-β, MIP-1α, MIP-1β, PANTES, IL-8 및 IL-10 중 선택되는 것일 수 있다. 상기와 같은 NK 세포의 면역활성인자 발현 분석은 FACS, 세포 내 시토킨 염색 또는 ELISA 등을 이용하여 이루어질 수 있다. 구체적으로 플루오로크롬-접합된 특정 항체를 이용하여 NK 세포 표면을 염색한 후 세포를 투과성화(permeabilization)하고 플로오로크롬-접합된 다른 특정 면역활성인자(예를 들어, IFN-γ 항체로 상기 사이토카인 등을 염색하여 NK 세포 내의 면역활성인자의 발현을 측정하는 방법을 이용할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 NK 세포의 활성과 관련된 질환은 비정상적인 NK 세포의 활성도를 보이는 것으로서, 예를 들어, 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역거부반응, 면역결핍질환, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 질환일 수 있다. 상기 과민성 면역질환은 천식 및 축농증 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 상기 자가면역질환은 루푸스, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병 및 류마티스 관절염 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 또는 상기 조직구증은 HLH, XLP1, 및 XLP2에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 혈구탐식성 림프조직구증(HLH)은 제 2군 랑게르한스 세포 조직구증, 적혈구탐식성 림프조직구증식증 (가족성, 산발성), 감염연관성 혈구탐식증후군, 바이러스 연관성 혈구탐식증후군, 거대한 림프절병증을 동반한 조직구증, 또는 망상조직구증의 의미를 포함할 수 있다. 상기 "암"은 종양, 혈액암 또는 고형암을 포함하는 의미으로서, 개체의 NK 세포의 시너지 활성을 손상시키거나 또는 특정 조건에서 표적 세포로서 NK 세포의 시너지 활성을 일으키지 않는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 췌장암 또는 B 세포 림프종(B cell lymphoma)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 면역결핍질환은 디조지증후군(DiGeorge synderome) 또는 체디악히가시증후군(Chedial-Higashi syndrome)일 수 있다.
상기 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보는, 정상 NK 세포 대비 실험군 NK 세포의 활성화가 검출되지 않는 경우 비정상적인 NK 세포로 판단할 수 있고, 또는 특정 수용체에 대해 활성을 상실한 NK 세포가 표적 세포에 대해 비정상적으로 활성을 일으키거나 일으키지 않는 경우 상기 표적 세포가 특정한 질병과 관련이 있음을 판단할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 NK 세포의 증식 방법에 의해 제조된 NK 세포를 제공한다. 상기 NK 세포는 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
또 다른 양상은 상기 면역세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 면역세포 또는 그의 세포 집단을 유효성분으로 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 면역세포 또는 그의 세포 집단을 의약의 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 면역세포 또는 그의 세포 집단을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질환 치료 방법을 제공한다.
본 명세서에서 있어서 용어 "질환"은 하나의 병리적 상태, 특히 암, 감염성 질환, 염증성 질환, 대사성 질환, 자가면역성 장애, 퇴행성 질환, 세포사멸 관련 질환 및 이식편 거부를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하거나, 그를 포함하며, "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "투여하는," "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 세포 또는 세포 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 개체 투여 후 세포의 생존 기간은 짧으면 수 시간, 예를 들면 24시간 내지 수일 내지 길면 수년일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "분리된 세포", 예컨대, "분리된 면역세포" 등은 세포가 기원하는 조직, 예컨대, 조혈 세포로부터 실질적으로 분리된 세포를 의미한다.
일 구체예에 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 정맥내, 피하, 복강 내, 흡입 또는 국소적용과 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로서 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 일 양상에 따른 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 일 양상에 따른 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다. 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
'개체'란 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 면역세포, 면역세포, 또는 그의 활성을 증가시키는 물질은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다. 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.
일 양상에 따른 유전적으로 조작된 세포에 의하면, 유전적으로 조작되지 않은 세포에 비해, 적응(adaptive) NK 세포의 증식 및 활성을 적어도 2배 내지 수배 증가시킬 수 있는바, 적응(adaptive) NK 세포를 증식시켜 세포 치료제로 사용할 수 있다.
도 1a는 유전적으로 조작된 K562 세포에서 HLA-E의 발현 여부를 RT-qPCR을 이용해 분석한 결과이다.
도 1b는 HLA-E의 발현 여부를 유세포분석기(FACS)를 이용해 분석한 결과이다.
도 2a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 활성화도를 측정한 결과이다.
도 2b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 Fold expansion을 나타낸 그래프이다.
도 2c는 일 양상에 따른 배양보조세포의 장기간 배양 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 특성을 확인한 결과이다(녹색: K562-HLA-E, 빨간색: K562).
도 3b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 발현 수준을 비교한 그래프이다(녹색: K562-HLA-E, 빨간색: K562).
도 3c는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 발현 수준을 평?幣奐ㅀ?도(mean flurescence intensity, MFI)로 비교한 그래프이다(녹색: K562-HLA-E, 빨간색: K562).
도 4a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ-NK 세포 및 NKG2C+NK 세포 빈도 상관관계를 확인한 결과이다.
도 4b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ- 발현율을 비교한 결과이다.
도 4c는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ 세포 및 NKG2C 발현을 확인한 결과이다.
도 5a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 K562 세포 및 Raji 세포에 대한 세포독성(ADCC)을 확인한 그래프이다.
도 5b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 HLA-C 타입에 따른 세포 독성을 확인한 그래프이다.
도 6a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 CD107a 발현을 측정한 그래프이다.
도 6b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 IFN-γ 발현을 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 유전적으로 조작된 배양보조세포(Feeder cell)의 제조
인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하는 배양보조세포를 제조하였다. 구체적으로, 인간 유래 HLA-E 유전자(서열번호 1)을 렌티바이러스 벡터인 pCDH-CMV-EF1-GFP에 클로닝하여 재조합 렌티바이러스 생산용 벡터를 제작하였다. 이후, 바이러스 생산을 위해 상기 제작된 재조합 유전자 (pCDH-CMV- HLA-E-EF1-GFP)를 293FT 세포에 패키징 벡터와 함께 lipofectamin3000 (Invitrogen)을 이용하여 형질주입 시켰다. 시간이 지난 뒤, 새로운 배지로 교환하여 48 시간 동안 세포를 배양 한 후, 바이러스가 함유된 배지를 회수하였다. 회수된 배지는 500 Х g에서 10 분간 원심분리하고, 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 바이러스가 함유된 순수한 배지만을 분리하여 HLA-E 발현 렌티바이러스를 생산하였다. 이후, K562 세포를 포함하는 배지 9 ㎖에 HLA-E 발현 렌티바이러스 1 ㎖를 녹여 폴리브렌(polybrene) (8 ㎍/ml)과 함께 첨가하여, 48 시간 동안 세포 배양을 진행하였다. 이후, RT-qPCR(Quantitative reverse transcription PCR) 및 유세포분석기(FACS)를 이용하여 감염된 세포를 선별하였다.
도 1a는 유전적으로 조작된 K562 세포에서 HLA-E의 발현 여부를 RT-qPCR을 이용해 분석한 결과이다.
도 1b는 HLA-E의 발현 여부를 유세포분석기(FACS)를 이용해 분석한 결과이다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 기존의 K562 세포와 비교하여 유전적으로 조작된 K562 세포에서의 HLA-E를 발현량은 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 기존의 K562 세포는 HLA-E를 발현하지 않았으나, 유전적으로 조작된 K562 세포는 HLA-E를 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, HLA-E을 발현하는 K562 세포주를 "K562-HLA-E"로 명명하였다.
실시예 2. 말초혈액 단핵구로부터 적응(adaptive) NK 세포의 선택적 증폭
일 양상에 따른 유전적으로 조작된 배양보조세포의 적응(adaptive) NK 세포 증폭 효과를 확인하기 위하여, K562-HLA-E 세포와 NK 세포를 배양한 후 NK 세포의 NKG2C+ 및 KIR 발현을 확인하였다.
구체적으로, 건강한 성인 기증자로부터 Ficoll-Hypaque (d = 1.077, LymphoprepTM; Axis-Shield, Oslo, Norway)를 이용하여 말초혈액 단핵구(Human peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리한 후, PBS로 2회 세척하였다. 이후, 상기 PBMC를 10 U/mL 재조합 인간 IL-2를 포함하는 RPMI 1640 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 4 mmol/L L-글루타민 함유)가 있는 24-웰 플레이트에서 100 Gy 감마선을 조사한 K562 및 K562-HLA-E 세포(실시예 1)와 각각 공배양하였다. 7일 후, IL-2 농도를 10 U/mL에서 100 U/mL로 증가시키고, 5 ng/mL의 수용성 IL-5를 추가하였다. 7일 및 14일에 재-자극을 위하여 감마선을 조사한 배양보조세포(K562 및 K562-HLA-E)를 추가하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 98일까지 배양하였다. 배양 0일, 14일 및 28일차에 유세포분석기(FACS)를 이용하여 NKG2C, NKG2A, KIR2DL1, 및 KIR2DL2/3의 발현 정도를 확인하였다. 또한, 배양 일수에 따른 NKG2C, KIR2DL1, KIR2DL2/3 및 KIR3DL1의 발현을 측정하였다. 또한, 배양 일수에 따른 NK 세포 수를 0일차 대비 NK 세포의 절대 개수로 나누어 Fold expansion으로 나타내었다.
도 2a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 활성화도를 측정한 결과이다.
도 2b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 Fold expansion을 나타낸 그래프이다.
도 2c는 일 양상에 따른 배양보조세포의 장기간 배양 효과를 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 배양 14일 째에 실시예 1의 배양보조세포는 K562 배양보조세포와 비교하여 자가특이적 KIR2DL2/3 발현을 갖는 NKG2C+ NK 세포가 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 배양보조세포와 K562 배양보조세포는 배양 21일차에 NK 세포의 fold expansion이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 배양 42~49일 째에 실시예 1의 배양보조세포는 K562 배양보조세포와 비교하여 fold expansion이 약 2배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, IL-2 및 IL-15의 존재 하에, 실시예 1의 배양보조세포와 함께 배양된 NK 세포의 경우, 배양 14일 째 및 배양 42일 째에 각각 169±94 배, 10311±6676 배 증폭한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2c에 나타낸 바와 같이, K562 배양보조세포의 경우, 42~49일 째까지 NKG2C, KIR2DL1, KIR2DL2/3 및 KIR3DL1을 발현하는 NK 세포를 증폭시켰으나, 이후 더 이상 증폭이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 실시예 1의 배양보조세포의 경우, 90일 이후에도 NKG2C, KIR2DL1, KIR2DL2/3 및 KIR3DL1을 발현하는 NK세포를 증폭시키는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 배양보조세포는 적응(adaptive) NK 세포의 활성을 현저하게 증가시킬 뿐만 아니라, NK 세포의 장기 배양이 가능하므로, NK 세포를 대량 증식하여 세포 치료제로 이용할 수 있다.
실시예 3. K562-HLA-E 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 특성
3-1. NK 세포의 표면 항원 확인
일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 특성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 증폭된 NK 세포 2 Х 105 개를 FACS 버퍼(FBS 1% 포함 PBS)로 세척한 후, APC-Cyanine7-접합 마우스 항-인간 CD3 및 PE-Cyanine7 접합 항-인간 CD56 멤브레인 항체로 15분간 처리하였다. 이후, 세포를 수득하고 각각 다른 형광-접합된 항-인간 CD16, CD57, CD69, NKp30, NKp46, DNAM-1, NKG2D, NKG2A 및 FcRγ멤브레인 항체로 30분 동안 추가 염색하였다. 이후, 상기 세포를 FACS 버퍼로 세척한 뒤, FACS Verse(BD Biosciences)를 이용하여 데이터를 획득하고 Kaluza로 분석하였다. 대조군으로는 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포를 사용하였다.
도 3a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 특성을 확인한 결과이다(녹색: K562-HLA-E, 빨간색: K562).
도 3b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 발현 수준을 비교한 그래프이다(녹색: K562-HLA-E, 빨간색: K562).
도 3c는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 표현형 발현 수준을 평?幣奐ㅀ?도(mean flurescence intensity, MFI)로 비교한 그래프이다(녹색: K562-HLA-E, 빨간색: K562).
그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 CD16, CD57, CD69, NKp30, NKp46, DNAM-1, NKG2D, NKG2A 및 FcRγ와 같은 표면 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, NKp30, NKG2A, 및 NKp46 의 경우, K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포보다 낮은 발현 수준을 나타내었으며, 적응(adaptive) NK 세포의 표면 마커인 CD57, 및 세포내 수용체(intracellular receptor)인 FcRγ의 경우, K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포보다 높은 발현 수준을 나타내었다. 반면, CD16의 경우, K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포보다 낮은 발현 수준을 나타내었다(도 3b 및 도 3c 참조). 이는 적응 NK 세포가 FcγRIIIa 트리거(triggering)에 의한 반응으로 IFN-γ를 포함한 사이토카인을 우선적으로 생성하기 때문인 것으로 사료된다.
즉, 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 적응(adaptive) NK 세포의 완전한 기능적 특성을 가질 수 있다.
3-2. NK 세포의 FcεRIγ 및 NKG2C 발현 확인
적응 NK 세포의 경우, FcεRIγ-결핍된 표현형을 가진다. 따라서, 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포 역시 동일한 표현형을 가지는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 증폭된 NK 세포 2 Х 105 개를 FACS 버퍼(FBS 1% 포함 PBS)로 세척한 후, APC-Cyanine7-접합 마우스 항-인간 CD3 및 PE-Cyanine7 접합 항-인간 CD56 멤브레인 항체로 20분간 처리하였다. 이후, 상기 세포를 FACS 버퍼로 세척한 뒤 세포 내 신호전달 수용체(intracellular signal receptor)인 FcεRIγ 발현을 확인하기 위하여 투과(permeabilization) 및 고정(fixation)을 진행한 후 FITC-접합 마우스 항-인간 FcεRIγ 항체로 30분간 처리하였다. 이후, FACS 버퍼로 세척한뒤 FACS Verse(BD Biosciences)를 이용하여 데이터를 획득하고 Kaluza로 분석하였다.
도 4a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ-NK 세포 및 NKG2C+NK 세포 빈도 상관관계를 확인한 결과이다.
도 4b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ- 발현율을 비교한 결과이다.
도 4c는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ 세포 및 NKG2C 발현을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 0일째에 NKG2C 양성인 NK 세포는 FcεRIγ- 와의 상관관계가 확인되었으나, 배양을 28일 이상 유지하였을 때, NKG2C 발현율과 FcεRIγ- 간에 상관관계가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이, NK 세포의 배양을 배양 28일 이상 지속하였을 때, NKG2C 양성 세포와 FcεRIγ- 간에 상관관계가 나타나지 않았다. 그러나, 실시예 1의 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 FcεRIγ- 비율은 K562 배양보조세포로 배양된 NK 세포의 FcεRIγ- 비율 보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 4c에 나타낸 바와 같이, K562-HLA-E 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 배양 0일째부터 28일째까지 NKG2C 양성 FcεRIγ+ NK 세포로 증폭되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. K562-HLA-E 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 세포 독성 확인
4-1. K562 세포 및 Raji 세포에 대한 NK 세포의 세포 독성 확인
일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 항체 치료제로서의 효능을 확인하기 위하여 표적 세포에 대한 NK 세포의 14일 및 49일 째 세포 독성을 CFSE-기반 분석에 의해 4시간 동안 측정하였다. 구체적으로, FACS 버퍼에서 표적 세포를 37℃에서 10분 동안 0.5 μM CFSE로 염색하고, 완전 배지로 2회 세척하였다. 이후, 세포독성 분석을 위하여 CFSE로 염색된 K562 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트(96-well U-bottom plate)에 배치하고 K562-HLA-E에 의해 증폭된 NK 세포 및 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포를 각각 effector-to-target (E:T) 비율 1:1, 0.5:1 및 0.25:1로 혼합하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 또한, ADCC 분석을 수행하기 위하여, CFSE로 염색된 Raji 세포를 1㎍/㎖의 리툭시맙(rituximab)과 함께 배양한 후, 상기와 동일한 방법으로 배양하였다. 이후, 혼합된 세포를 FACD 튜브로 옮기고 각각의 튜브에 1㎎/㎖의 PI(Invitrogen) 1㎍을 첨가한 후, FACS Verse에서 세포를 획득하고, Kaluza 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 5a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 배양 14일째 및 49일째의 K562 세포 직접 세포독성(direct cytotoxicity) 및 Raji 세포와 Rituximab 첨가에 의한 세포독성(ADCC)을 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 K562 및 Rituximab에 결합된 Raji 세포에 대하여 유사한 세포 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 세포 독성을 나타냄에 따라 항체 치료제로 활용 가능하다.
4-2. HLA-불일치 MCF7 세포에 대한 NK 세포의 세포 독성 확인
일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 HLA-C 타입에 따른 세포 독성을 확인하였다.
구체적으로, PCR-SSP(PCR amplification with sequence-specific primers) 실험 방법으로 HLA-C SSP PCR kit를 이용하여 HLA-C1과 HLA-C2 타입을 분석하였다. 공여자의 공여자의 CMV 혈청학(serology) 및 HLA-C 유전자형은 하기 표 1에 나타내었다. 이후, 상기 유전자형에 따른 세포 독성을 확인하였다.
공여자 CMV 혈청학 HLA-C 유전자형
공여자 1 양성(positive) C1C1
공여자 2 양성(positive) C2C2
공여자 3 양성(positive) C1C1
공여자 4 양성(positive) C1C1
공여자 5 양성(positive) C2C2
공여자 6 양성(positive) C2C2
도 5b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 HLA-C 타입에 따른 세포 독성을 확인한 그래프이다.
그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 HLA-C 유전자형이 C2C2인 NK 세포와 비교하여, C1C1인 NK 세포에서 MCF7 암세포에 대한 세포 독성이 향상된 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 HLA-C 불일치 타겟 암세포에 대하여 향상된 살상 효능을 가진 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 5. K562-HLA-E 세포에 의해 증폭된 NK 세포의 활성화도 확인
5-1. CD107a 탈과립화에 의한 NK 세포 활성화
일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 활성화도를 측정하기 위하여 NK 세포의 CD107a 탈과립화에 비례하는 NK 세포 표면에서 CD107a 발현 정도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 증폭된 NK 세포 2 Х 105, 표적 세포(K562 및 MCF7) 2 Х 105 개 및 PE-접합된 항-인간 CD107a 5μM를 95-웰 둥근 바닥 플레이트에서 배양하였다. 1시간 후, Monensin 및 brefeldin A (BD Biosciences)를 추가한 후, 4시간 동안 추가 배양하였다. 이후, NK 세포를 항-인간 CD3 및 CD56 항체로 염색하여 수득하였다.
도 6a는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 CD107a 발현을 측정한 그래프이다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 K562 배양보조세포 또는 MCF7 표적 세포에 의해 증폭된 NK 세포와 유사한 CD107a 발현 특성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 활성이 증가된 NK 세포가 정상인 공여자의 말초혈액 단핵구에서 성공적으로 생성되었음을 의미한다. 따라서, 일 양상에 따른 배양보조세포는 활성이 증가된 NK 세포의 제조에 효과적이다.
5-2. IFN-γ 생성에 의한 NK 세포 활성화
일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 면역조절 활성을 평가하기 위하여 세포 내 IFN-γ 생성에 의한 NK 세포의 세포독성을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 증폭된 NK 세포를 brefeldin A (BD Biosciences) 및 Monensin(BD Biosciences)의 존재 하에 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 37℃, 5% CO2에서 5시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 수득하고 FACS로 세척한 후, 항-인간 CD3 및 CD56 멤브레인 항체로 20분 동안 염색하였다. 세척, 고정 및 투과한 후, NK 세포를 얼음에서 PE-접합된 항-인간 IFN-γ 항체로 30분 동안 추가로 염색하였다. 이후, 상기 세포를 세척한 뒤 FACS Verse에서 세포를 획득하고, Kaluza 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
도 6b는 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포의 IFN-γ 발현을 측정한 그래프이다.
그 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 K562 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포와 유사한 수준의 IFN-γ 발현을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 활성이 증가된 NK 세포가 정상인 공여자의 말초혈액단핵구에서 성공적으로 생성된 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 양상에 따른 배양보조세포에 의해 증폭된 NK 세포는 사이토카인에 의한 면역조절 활성이 높은 NK 세포의 제조에 효과적이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포의 배양을 위한 배양보조세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 배양보조세포는 K562, RPMI8866, EBV_LCL, 및 HFWT 세포로 구성된 군에서 선택되는 것인 배양보조세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 인간 백혈구 항원을 암호화하는 핵산을 포함하는 것인 배양보조세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 인간 백혈구 항원은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 및 HLA-G로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 것인 배양보조세포.
  5. 청구항 1의 배양보조세포를 포함하는 NK 세포 배양용 조성물.
  6. NK 세포의 집단을 함유하는 혈액 시료를 수득하는 단계; 및
    상기 혼합된 NK 세포의 집단의 적어도 일부분을 NK 세포를 활성화하기 위해 유전적으로 조작된 세포와 접촉시키는 단계로서, 상기 유전적으로 조작된 세포는 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 것인 단계를 포함하는, NK 세포를 증식시키는 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 상기 유전적으로 조작된 세포와 혼합된 NK 세포의 집단을 공배양하여 상기 NK 세포의 서브 집단(subpopulation)을 증폭(expanding)시키는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 공배양은 사이토카인의 존재 하에서 이루어지는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 사이토카인은 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8 (CXCL8), IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL21, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, 및 IL36로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상인 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-2 및 IL-15인 것인 방법.
  11. 청구항 7에 있어서, 상기 공배양은 2일 내지 100일 동안 수행되는 것인 방법.
  12. 청구항 6에 있어서, 상기 혈액 시료는 전혈 시료인 것인 방법.
  13. 인간 백혈구 항원(Human leukocyte antigen, HLA)을 발현하도록 유전적으로 조작된 NK 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제.
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